CN1315871C - 一种肿瘤相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤相关蛋白及其编码基因与应用。该肿瘤相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：2；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤相关的蛋白质。抑制该肿瘤相关蛋白表达的小干扰RNA，是由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成的任一个互补双链RNA：1)正义链具有序列表中序列3的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列4的核苷酸序列；2)正义链具有序列表中序列5的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列6的核苷酸序列。本发明为进一步研究该肿瘤相关蛋白与NF-κB之间的调控关系，以及开发治疗炎症，肿瘤新药物提供了一个新的基础。

Description

一种肿瘤相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种肿瘤相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种可刺激细胞核因子NF-κB活化的肿瘤相关蛋白及其编码基因，与抑制该肿瘤相关蛋白表达的小干扰RNA。

背景技术

肿瘤已经成为严重威胁人类生存健康的重大疾病之一，其发病率及死亡率均呈上升趋势。发现和研究肿瘤差异表达基因有助于阐明肿瘤发生的分子机制，有助于肿瘤的诊断，预后，并可以为肿瘤的治疗提供新的靶点，从而成为基因药物和基因治疗的基础。寻找差异表达基因的方法很多，近年来发展的高通量的筛选方法为这方面的研究注入了新的活力，近年来文献报道的疾病相关基因的研究成果，其中很大一部分是用高通量的方法筛选出来，并在后续的研究中得到验证的。高通量的方法主要有基因表达的系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)，cDNA芯片(cDNA microarray)，寡核苷酸芯片(oligo-nucleotidesmicroarray)，以及抑制性差减杂交(suppression subtractive hybrydization，SSH)，差异显示(differential display，DD)等。

细胞核因子NF-κB是人体最重要的转录因子之一，它参与诱导多种多样的细胞及病毒化基因的表达，在多种类型细胞的基因表达调节中起多效性作用。这些基因对炎症、生长和凋亡信号进行应答而被激活，包括许多细胞因子、趋化因子、受体、粘附分子。

哺乳动物的NF-κB包含5种蛋白：p65(RelA)、p50(NF-κB-1)、RelB、c-Rel、p52(NF-κB-2、p50B)，它们在氨基末端区有300个氨基酸相似，称为Rel同源区。5种NF-κB蛋白质分子可以形成同源或异源二聚体，以不同的结合特异性与特定的DNA识别部位结合，具有不同的反式激活活性。

由于NF-κB的活化能够促进许多前炎症因子的转录表达，所以，NF-κB的过度活化会引起炎症的发生、过敏性疾病以及自身免疫病；NF-κB的活化能够阻断一些细胞的凋亡，所以其在调节细胞的生长分化方面也具有重要的功能。目前，NF-κB的活化与肿瘤发生发展过程的密切关系已经相当确立，特别是最近Nature上发表的一篇论文，进一步肯定了NF-κB活化与炎症性肿瘤的关系(Eli Pikarskyet al.(2004)NF-κB functions as a tumour promoter ininflammation-associated cancer.Nature 431，461-466)。NF-κB的活化与肿瘤的关系首先表现在，它能启动一些抗凋亡基因的表达，如Bcl-xL，XIAP和IEX-1L；另外一个方面就是促进肿瘤细胞的生长和生存，如启动cyclin D1，c-Myc的表达；还有就是通过调节一些细胞黏附分子的表达，如ICAM-1，VCAM-1，基质金属蛋白酶，如MMP-9，趋化因子受体，如CXCR4，尿激酶型血纤维蛋白溶酶原，血浆酶原活化因子(uPA)，从而参与肿瘤的侵袭与转移，NF-κB还可以通过启动血管内皮生长因子VEGF的表达来促进肿瘤新生血管的形成，而参与肿瘤的转移；NF-κB还通过调控Mdm2表达来抑制抑癌基因p53的功能。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失。这一现象属于转录后的基因沉默机制(Posttranscriptional genesilencing，PTGS)。1998年，在线虫中首次发现RNAi现象以来，陆续有报导在植物和果蝇等其他各种生物中也发现了RNAi现象，但在哺乳动物细胞中，较长的dsRNA因能诱导IFN(干扰素)生成，mRNA能够发生非特异性降解，不存在特异性的RNAi现象。但在2001年，哺乳动物中也存在特异性RNAi现象被报道，介导RNAi的中间物质是双链小RNA(Small interfering RNA，siRNA)，只要dsRNA短于30bp，就不会促发干扰素效应，能够特异性地降解靶mRNA，导致基因沉默，21nt siRNA可以特异性抑制靶基因的表达，从而为RNAi在哺乳动物的研究开辟了新的方向。这一结果开辟了RNAi现象研究与应用的新领域。研究表明，RNAi可能的作用途径大致可分为两种：一种是以线虫、真菌和植物为代表的RdRp(RNA-dependent RNApolymerase)途径。RNAi现象有一个靶RNA的大量产生过程，产生的靶RNA进一步在Dicer酶的作用下，产生大量的siRNA，达到有效浓度的siRNA能够启动RNAi机制，降解目标mRNA；另一种途径以果蝇和哺乳动物细胞为代表，外源或内源的双链RNA在Dicer酶的切割下生成siRNA，这些siRNA与其他蛋白质形成RISC(RNA-induced silencing complex)结构，能够识别切割靶mRNA分子。作为一种有效的基因封闭工具，siRNA在肿瘤研究中立即得到广泛应用，用其干扰某些癌基因的表达可以抑制肿瘤的生长，从而开辟了癌症治疗的新领域。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种肿瘤相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的肿瘤相关蛋白，名称为NAOP，来源于人，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤相关的蛋白质。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

其中，序列表中的序列2由364个氨基酸残基组成，蛋白分子量为39.75kD，等电点为5.22。

上述肿瘤相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

NAOP的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的序列1由1133个脱氧核苷酸组成，它的编码序列为自序列1的5′端第19位至1113位脱氧核苷酸。

NAOP的基因组基因染色体定位16q22.2，由10个外显子和9个内含子组成。

含有NAOP编码基因的表达载体、细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的NAOP编码基因可插入到现有的原核或真核表达载体，适宜的载体包括细菌质粒，腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒等。含有本发明的NAOP编码基因的载体可以用来转化适当宿主细胞，如大肠杆菌，酵母菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞等，以使宿主表达此多肽。

本发明的NAOP，或保守变异多肽或片段，或表达它们的细胞可以作为抗原用来生产抗体，在临床上用于炎症性疾病、肿瘤的临床诊断、治疗、疗效评价等，还可用于NAOP刺激NF-κB活化分子机制的研究。所述抗体可以是单克隆抗体，或多克隆抗体，还包括嵌和、单链和人源化的抗体以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。可用现有的方法，如免疫动物、培养杂交瘤方法，制备NAOP单克隆和多克隆抗体。该抗体可以用于检测本发明NAOP的存在或水平，或用于检测NAOP基因。

本发明的另一个目的是提供可抑制该NAOP表达的小干扰RNA。

本发明所提供的抑制NAOP表达的小干扰RNA，是由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成的任一个互补双链RNA：

1)正义链具有序列表中序列3的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列4的核苷酸序列；将该小干扰RNA命名为NAOP^SiRNA1；

2)正义链具有序列表中序列5的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列6的核苷酸序列；将该小干扰RNA命名为NAOP^SiRNA2。

序列表中的序列3、4、5和6均由21个核苷酸组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，自5′端的1-19位为核糖核苷酸，5′端的20-21位为脱氧胸苷酸。

本发明的第三个目的是提供一种抗肿瘤药物。

本发明所提供的抗肿瘤药物，它的活性成分是上述抗肿瘤相关蛋白编码基因的反义寡核苷酸或上述抑制NAOP表达的小干扰RNA中的一种或两种。

所述抗肿瘤药物适合于肺癌，食管癌，喉癌等上呼吸消化道肿瘤。

上述药物中还可含有佐剂DDA和/或MPL和/或Quil-A和/或RIBI佐剂和/或saline(生理盐水)或其它佐剂，如铝佐剂，福氏佐剂等。

本发明的药物可制成注射液、粉剂、膏剂、纳米制剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照基因药物/寡核苷酸药物领域的方法制备。

上述药物的用量一般为20-200μg上述小干扰RNA/kg体重/天，疗程为10至20天，或在每次放射治疗或化疗前12-24小时用一次。

本发明的肿瘤相关蛋白NAOP具有刺激NF-κB活化的功能；在小鼠成纤维细胞内稳定高表达NAOP可以明显导致该细胞的恶性转化；在蛋白水平检测其在细胞系中的表达结果表明，肺癌细胞系中的表达水平显著高于正常转化细胞系；在肺癌临床组织标本中检测其表达水平结果表明，肺癌组织的表达水平明显高于其周边的正常组织，且在正常组织，癌前病变，原位癌和肿瘤组织中有表达量从无到有，逐渐上升的趋势。肿瘤相关蛋白NAOP及其编码基因和NAOP抗体可用于炎症和肿瘤的体外诊断、预后。肿瘤相关蛋白NAOP及其编码基因可以作为消炎、抗肿瘤药物的靶标，如用体外表达的NAOP建立药物筛选模型，筛选可抑制NAOP表达的药物，如小分子化合物；将NAOP编码基因构建入腺病毒，逆转录病毒，或慢病毒载体中，感染细胞或实验动物，建立肿瘤的体内外模型等。本发明以NAOP编码基因为靶标设计的小干扰RNA在导入肺癌细胞系中后，能单独引起肺癌细胞系的凋亡和生长变缓，因此，其它NAOP抑制剂，如NAOP的反义寡核苷酸，均可用于治疗肿瘤。

本发明为进一步研究NAOP与NF-κB之间的调控关系，以及开发治疗炎症，肿瘤新药物，开创新的临床诊断、疗效评价及预后指标提供了一个新的基础。

附图说明

图1为pGEM-T Easy载体克隆NAOP基因的示意图

图2a和图2b为pGEM-T Easy-NAOP载体的T7正向测序结果

图2c和图2d为pGEM-T Easy-NAOP载体的BGH反向测序结果

图3为真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B的结构示意图

图4为pNF-κB-luc荧光素酶基因报告质粒的结构示意图

图5为双荧光素酶报告基因法检测NAOP对NF-κB的活化作用

图6为凝胶阻滞实验(EMSA)验证NAOP对NF-κB的活化作用

图7为稳定表达NAOP蛋白的NIH3T3细胞的western blot鉴定

图8为NIH3T3稳定转染细胞的MTT细胞增殖实验

图9为NIH3T3稳定转染细胞的软琼脂集落形成实验中×20光镜下的代表图

图10为NIH3T3稳定转染细胞的软琼脂集落形成实验中集落形成数目的比较

图11为注射NIH3T3稳定转染细胞后的裸鼠成瘤照片

图12为皮下注射30天内NAOP-C1组8只裸鼠的成瘤情况

图13为Western Blot检测NAOP在肺癌相关细胞系中的表达水平

图14为NAOP在肺鳞癌组织中的免疫组织化学染色

图15为NAOP在肺鳞癌组织芯片中的免疫组织化学染色

图16为NAOP在肺鳞癌组织大片中的免疫组织化学染色的统计图表

图17为NAOP在肺鳞癌组织芯片中的免疫组织化学染色的统计图表

图18为siRNA转染48小时后的半定量RT-PCR结果

图19为siRNA转染72小时后的western blot结果

图20为H1299细胞在NAOP^SiRNA1和NAOP^SiRNA2转染24和72小时的光镜照片

图21a为NAOP^SiRNA1和NAOP^SiRNA2转染H520 72小时后的流式细胞仪检测细胞凋亡情况

图21b为NAOP^SiRNA1和NAOP^SiRNA2转染H1299 72小时后的流式细胞仪检测细胞凋亡情况

图22为H520，H1299在NAOP^SiRNA1和NAOP^SiRNA2转染后的克隆形成实验

具体实施方式

实施例1、NAOP基因的cDNA的克隆

通过生物信息学分析，发现发明人实验室肺鳞癌的抑制性消减杂交文库的临床新鲜肿瘤组织高表达文库中rlcrt0-000220，rlcrt0-000196两个独立的EST克隆同属于UniGene：Hs.232194，其对应基因为KIAA0174，Ref：NM_014761，LocusID：9798，为一未知功能人类新基因，利用Human_est数据库通过BLASTn方法进行序列校正无误，最终得到的序列设定为序列1。根据序列1设计NAOP基因全长阅读框架的特异引物：

正向引物    5’TAGGAGGAACAGCACAGCATG3’

反向引物    5’AGTTGCCTGGTTTAAGAGACCTATG3’

用上述引物，以人正常肺组织cDNA文库(Clontech：K1420-1)为模板进行PCR扩增反应，反应条件如下：

反应体积50μl，其中含有：

人正常肺组织cDNA模板       5μl(5ng)

引物                       正向引物、反向引物终浓度各0.2μM

dNTP                       终浓度各200μM

Taq DNA聚合酶              2.5U

10×Taq DNA聚合酶缓冲液    5μl

用双蒸水补足至50μl体积。

反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1分钟，扩增30个循环；最后在72℃下延伸10分钟。

扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用QIAquick胶回收试剂盒(Qiagen，28706)按产品说明书进行纯化，然后与3’有碱基T的线性pGEM-T EASY载体(Promega，A1360)在16℃下连接8小时，使用2mm电极杯，2500V转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM 3700 DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序，获得NAOP基因的cDNA 1133bp(序列如序列1)，其中ORF全长1095bp，编码364个氨基酸，氨基酸序列如序列2所示。将含有序列1的NAOP的cDNA基因的pGEM-T EASY载体命名为pGEM-T-NAOP。图1为pGEM-T Easy载体克隆NAOP基因的示意图，其中三角图标为插入NAOP基因eDNA片段处。pGEM-T Easy-NAOP载体的测序结果如图2a，图2b，图2c和图2d所示。

实施例2、NAOP对NF-κB活化作用的检测

一、双荧光素酶报告基因法测定NAOP对NF-κB活化作用

本实施例采用双荧光素酶报告基因法检测NAOP基因对NF-κB活化功能，该方法采用的是体内信号转导途径顺式报导系统，其中所用的pNF-κB-luc报告质粒载有萤火虫荧光素酶基因，该基因的表达由合成的启动子所调控，其中包含基本的启动子元件(TATA box)，以及转录因子NF-κB的结合位点，pNF-κB-luc报告质粒的结构图如图4所示。当细胞内的NF-κB通过某种信号转导途径而被活化时，NF-κB便会结合于报告质粒pNF-κB-luc的增强子元件，从而启动报告基因萤火虫荧光素酶基因的转录，进一步胞内翻译成荧光素酶，导致细胞内荧光素酶数量增加，活性增强；相反，当细胞内的NF-κB活化受到抑制的时候，荧光素酶的表达量及活性就低。所以，通过检测荧光素酶的活性，便可以反映不同刺激物以及共转染的目的基因对细胞内NF-κB是否具有活化或者抑制活化的功能。pRL-SV40报告质粒载有水母荧光素酶基因，该基因的表达由猿猴病毒40(SV40)增强子/启动子所调控，转染哺乳动物细胞后可以产生较强的基本水平的水母荧光素酶的表达，且表达的活性不受NF-κB活化与否的调节，所以在实验中用作内对照报告基因。

为了检测NAOP对NF-KB的活化功能，首先构建含有NAOP cDNA的真核表达载体：pcDNA3.1B-NAOP(以下缩写为pcDB-NAOP)。采用真核表达载体pcDNA3.1/MycHis(-)B(Invitrogen，V85520，以下缩写为pcDB)与NAOP基因重组构建真核表达载体pcDB-NAOP。pcDB是设计用于重组蛋白在哺乳类动物细胞系中高表达的载体，它含有人巨细胞病毒CMV启动子，可在哺乳类动物细胞系中实现高表达。

1、NAOP基因真核表达载体的构建

用EcoRI(Promega)将NAOP的cDNA基因片段从pGEM-T-NAOP载体上切下，同时用EcoRI酶切真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B(Invitrogen，V85520)(图3)，按照J.Sambrook等，分子克隆实验指南第三版第68至71页的方法，将酶切后的NAOP的cDNA基因片段与载体在16℃下连接8小时，转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选生长的菌落，提取质粒，用EcoRI酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，挑选有插入1133bp片段的阳性克隆，通过序(使用ABI PRISM 3700 DNA分析仪，同上)，选出正确的正向插入序列1的NAOP的cDNA基因质粒，命名为pcDB-NAOP。

2、双荧光素酶报告基因法测定NAOP对NF-κB活化作用

用目的基因pcDB-NAOP和报告基因pNF-κB-luc(Stratagene，#219077)，pRL-SV40(Promega，E2231)共转染Hela细胞，通过分别检测两种荧光素酶活性来测定NF-κB的活性；阳性对照选择MEKK(Stratagene，#219077)，为已知的NF-κB激活基因。共转染的方法为脂质体转染法，采用Lipfectanine^TM2000(Invitrogen，11668027)，按产品说明书所述进行。

转染操作步骤如下：

(1)细胞培养：将Hela细胞(ATCC Number：CCL-2)(2.0×10⁴个)用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基(Hyclone，SH0022.02)铺在96孔细胞培养板(Costar，3599)上，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养16小时。

(2)制备DNA-Lipfectamine^TM2000复合物：用25μl不含血清的DMEM培养基稀释62.5ng pNF-KB-luc，6.25ng pRL-SV40和62.5ng pcDB-NAOP，缓慢混合均匀；同样用25μl DMEM培养基稀释Lipfectamin^TM 2000，缓慢混合均匀，在室温下保温5分钟后，与稀释的DNA缓慢混合，室温放置20分钟，以形成DNA-Lipfectamin^TM 2000复合物。

(3)转染：将DNA-Lipfectamin^TM 2000复合物缓慢滴入细胞培养板(50μl/孔)，轻微摇匀。5％CO₂，37℃的培养箱中培养24小时。

30小时后弃去培养基，加入Reporter Lysis Buffer(Promega，E4030)，在-80℃下放置30分钟，取出后在室温自然融化，使细胞裂解，然后将细胞裂解液移入荧光板(Gronier，655075)，用Dual-Luciferase Reporter Assay System10-Pack(Promaga，E1960)，通过Fluostar OPTIMA(BMG Labtechnologies)检测荧光素酶活性。

设定转染空载体pcDNA3.1/mycHis(-)B细胞内的荧光素酶活性比值(萤火虫荧光素酶荧光强度/水母荧光素酶荧光强度表示)为1，其他条件下细胞内的荧光素酶活性比值以此为标准，用相对值表示。结果如图5所示，表明转染NAOP之后荧光素酶活性比值达到9.471，刺激阳性对照MEKK为9.087，抑制阳性对照为0.102，说明NAOP能在报告基因水平上激活NF-κB。图5中，图中的数据为三次重复试验所得的结果，vector表示转染空载体pcDNA3.1/mycHis(-)B的细胞，MEKK为转染MEKK的细胞，NAOP为转染pcDB-NAOP的细胞。

二、凝胶阻滞实验(EMSA)，验证NAOP对NF-κB的活化作用

NF-κB活化的特征是入核，与特异的DNA序列结合，从而启动相应基因的转录。凝胶阻滞实验可以检测这种特异性的结合以及量的变化。

(1)细胞转染：前一天在10cm皿铺1.5×10⁶Hela细胞，第二天分别转染空载体pcDNA3.1/mycHis(-)B，pcDB-NAOP，以及阳性对照TNF-α(Peprotech，300-01A)按照100ng/ml直接刺激4小时。转染方法同实施例2的步骤2。

(2)细胞核蛋白的提取：转染24小时后，将细胞置于冰上，倒去培养基，用冰预冷的1×PBS洗两遍，加1mL 1×PBS润湿细胞表面，将细胞收集到1.5mL离心管中，于4℃，500g离心3分钟。去除上清，加入Buffer A(10mM Hepes pH7.9，10mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5mM PMSF)，于涡旋器上2400转/分15秒，冰上放置10分钟。加入非离子型界面活性剂NP-40，于涡旋器上2400转/分5秒，冰上放置1分钟，再于涡旋器上2400转/分5秒，在16,000g，离心5分钟，小心吸出上清，保存于-80℃。在沉淀中加入50微升Buffer C(20mM Hepes pH7.9，0.4M NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，1mM PMSF)，于涡旋器上2400转/分15秒，冰上放置，每十分钟涡旋15秒，共40分钟。16,000g离心10分钟，立刻将上清转入干净新管，此为核蛋白，保存于-80℃。

(3)EMSA以及supershift assay：蛋白、DNA、抗体反应，电泳，电转，交联，显色步骤按照LightShift Chemiluminescent EMSA kit(Pierce，20148)说明书进行，其中，探针的序列为5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’(SantaCruz，正义链)。结果如图6所示，labeled probe为生物素标记的探针；unlabeled为非标记的100倍过量的探针；TNF-alpha作为NF-kappaB通路的活化阳性刺激对照；p65和p50 Ab(Santa Cruz，sc-372X，sc-114X)为NF-kappaB复合物中两种成分的多克隆抗体；Rabbit IgG为正常兔的免疫球蛋白G，作为supershift assay的阴性对照，“+”表示加入，“-”表示未加。结果表明转染NAOP能使NF-κB活化入核，supershift assay表明其活化的特异性。

实施例3、NAOP转化NIH3T3细胞实验

1、NAOP转化NIH3T3细胞的体外实验

NIH3T3细胞系是小鼠成纤维细胞系，是目前研究癌基因恶性转化功能的首选细胞系。故本实施例用它来证明NAOP基因能促进恶性转化的性质。

(1)、建立NAOP稳定转染的NIH3T3细胞系：NIH3T3细胞系按照ATCC培养要求进行培养。转染前一天铺5×10⁴个细胞/孔到24孔板，第二天分别转染空载体pcDNA3.1/mycHis(-)B和pcDB-NAOP，转染按照Lipfectamin^TM 2000说明书进行，过程如实施例2步骤2所述。转染后24小时，消化细胞，按照1∶20传入一新孔，再过24小时后，换上新鲜培养基，加入Geneticin(Gibco^TM)至终浓度800微克/毫升。以后每三天更换新鲜培养基，加Geneticin(Gibco^TM)至终浓度800微克/毫升。三周后消化克隆，扩大培养，培养基中维持400微克/毫升Geneticin，得到含有空载体pcDNA3.1/mycHis(-)B的NIH3T3即稳定转染细胞系NIH3T3-pcDB，含有pcDB-NAOP的NIH3T3即稳定转染细胞系NIH3T3-pcDB-NAOP。

利用Western Blot检测稳定转染细胞系NIH3T3-pcDB-NAOP中NAOP的表达情况。Western Blot检测方法按照实施例4的方法进行。结果如图7所示，表明稳定转染细胞系NIH3T3-pcDB-NAOP已经稳定转入NAOP基因。图7中，Parental为空细胞(未转染的NIH3T3细胞)；vector为稳定转染细胞系NIH3T3-pcDB；NAOP-C1，NAOP-C2，NAOP-C3为三个稳定表达NAOP蛋白的NIH3T3-pcDB-NAOP细胞克隆3T3-NAOP C1，3T3-NAOP C2，3T3-NAOP C3。beta-actin作为上样一致性对照。

以正常肺组织cDNA为模板，以5’TGGTGGTGGTGGGCGCCGTGGGTGTGG3’和5’GTCAGGAGAGCACACACTTGC3’为引物进行第一轮PCR反应，以得到的第一轮PCR产物为模板，以5’GATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGT3’和5’GTCAGGAGAGCACACACTTGC3’为引物，进行第二轮PCR反应，将得到的第二轮PCR扩增产物连入pGEM-T EASY载体(Promega，A1360)，得到引入第12位密码子突变的H-ras^val12的cDNA基因片段的pGEM-T-NAOP12载体。用EcoRI将已引入第12位密码子突变的H-ras^val12的cDNA基因片段从pGEM-T-NAOP12载体上切下，与用EcoRI酶切的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B连接，得到含H-ras^val12基因的表达框架的质粒pcDB-H-ras^val12。将pcDB-H-ras^val12按照上述方法转染NIH3T3细胞系，得到含有pcDB-H-ras^val12的稳定转染细胞系3T3-H-ras(val12)。

(2)、MTT细胞增殖实验：将建成的稳定转染细胞系NIH3T3-pcDB，3T3-NAOPC1，3T3-NAOP C2，3T3-NAOP C3和阳性对照3T3-H-ras(val12)分别按照2×10³/孔传入96孔板，加入400微克/毫升Geneticin，MTT操作方法按照CellTiter 96Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit(Promega，G4000)进行。结果如图8所示，表明转入NAOP基因后细胞生长明显快于未转入的；图8中，3T3-vector表示NIH3T3-pcDB。

(3)、软琼脂集落形成实验：实验用六孔板进行，每孔先加入1.5毫升含10％胎牛血清，0.5％琼脂的DMED培养基，室温冷却后，将建成的稳定转染细胞系(NIH3T3-pcDB，3T3-NAOP C1，3T3-NAOP C2，3T3-NAOP C3和3T3-H-ras(val12)(阳性对照)各5000个细胞加到含10％胎牛血清，0.35％琼脂糖的DMED培养基中，混合后加到上述底层培养基上，培养2-3周，镜下观察照相，计数大于200微米的克隆。每组重复三个孔。光镜下的代表图如图9所示，集落形成数目的比较如图10所示，表明转入NAOP后的细胞能在软琼脂中独立生长，具有恶性表型。图9和图10中，NAOP-C1，NAOP-C2，NAOP-C3分别表示3T3-NAOP C1，3T3-NAOP C2，3T3-NAOP C3；vector表示NIH3T3-pcDB；H-ras(val12)表示3T3-H-ras(val12)；parental表示未转染的NIH3T3；误差线表示三次重复实验各组的标准方差。

2、NAOP转化NIH3T3细胞的体内实验

将建成的稳定转染细胞系NIH3T3-pcDB，3T3-NAOP C1(代表三个稳定克隆)分别按照5×10⁵个细胞/只鼠，稀释于200微升1×PBS，注射于四周龄，Balb/c雌性裸鼠背部皮下。Parental组(未注射细胞)5只，vector组(注射NIH3T3-pcDB)5只，NAOP-C1组(注射3T3-NAOP C1)8只。每三天观察一次动物，测量肿瘤长度和宽度，30天后引颈法处死动物，量取肿瘤重量，肿瘤体积以公式计算：V＝(π/6)×((长度+宽度)/2)³。结果如图11，图12所示，表明只有NAOP-C1组8只均形成肿瘤，而NIH3T3细胞和转入空载体的细胞(NIH3T3-pcDB)不能形成肿瘤。图12为皮下注射30天内NAOP-C1组8只裸鼠的成瘤情况，以8只裸鼠的瘤体积的平均值来表示。

实施例4、Western Blot检测NAOP在肺癌相关细胞系中的表达水平

为了证明NAOP蛋白在肿瘤和正常细胞间的表达差异，本实施例提取了肺癌相关的细胞系的总蛋白，利用anti-NAOP抗体，Western Blot来检测。

1、NAOP蛋白的表达

用引物Sense：5’-TTTT GAA TTC ATG CTG GGC TCT GGA TTT AAA和

Antisense：3’-TTTT CTC GAG CTA TGT TTT CTT TTT CAG CTC以pcDB-NAOP为模板PCR扩增得到含有序列1的片段，分别以EcoRI，XhoI(Promega)酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-1(Amersham)，回收酶切产物，连接得到含有NAOP基因的PGEX-NAOP融合蛋白表达载体(NAOP蛋白的N端融合有GST尾巴)，载体序列经测序验证正确。具体酶切，回收，连接过程同实施例2中NAOP基因真核表达载体的构建。将获得的质粒转化大肠杆菌菌株BL21，37℃，220rpm培养，用IPTG(Takara)0.5mM诱导表达3.5小时，裂解细菌，蛋白用GST纯化柱(Amersham)纯化，获得纯化的融合蛋白大于1mg，以其作为抗原。

2、NAOP兔源多克隆抗体的制备

免疫动物选用成年雄性新西兰兔，初次免疫用200ug抗原(0.1ml)与等体积弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化后，于背部皮下多点注射。初次免疫后21、42、63天，用弗氏不完全佐剂(FIA)完全乳化的抗原蛋白，各加强免疫1次，用量同前。每次免疫后7-10天，ELISA方法检测血清效价，达到1×10^-4时，放血分离血清。Western blot鉴定抗体特异性结果表明，得到NAOP特异的多克隆抗体。

3、Western Blot检测NAOP在肺癌相关细胞系中的表达水平

检测如下肺癌相关细胞系：PAa(人肺腺癌细胞系)，L1(人肺鳞癌细胞系)，pG(人肺大细胞癌细胞系)，H520(人肺鳞癌细胞系)，Yp111(人永生化肺支气管上皮细胞系111代)，C45E1(人永生化胎肺细胞系)，Mp37(人永生化肺支气管上皮细胞系37代)，Tr(人永生化胎肺细胞系)。

(1)肺癌相关细胞的体外培养以及总蛋白的提取：将PAa，L1，pG，H520，Yp111，C45E1，Mp37，Tr细胞按照1.5×10⁶个细胞/皿铺于10cm平皿中，用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基(Hyclone，SH0022.02)(PAa，L1，pG，H520)和无血清条件培养基(Yp111，C45E1，Mp37，Tr)培养，待融合率达到90％时倒去培养基，将细胞置于冰上，用冰预冷的1×PBS洗两遍，加1mL 1×PBS润湿细胞表面，用细胞刮(Greiner)将细胞收集到1.5mL离心管中，于4℃，500g离心3分钟。去除上清，沉淀中加入细胞裂解液(1×PBS(Hyclone)，1％NP40(Fluck)，0.5％脱氧胆酸钠(Sigma)，0.1％SDS(Promega))，于涡旋器上2400转/分15秒，冰上放置30分钟，4℃，16,000g离心10分钟，上清转入新管，存于-80℃备用。

(2)蛋白定量：按照BCA^TM Protein Assay Kit(Pierce，23227)说明书提供的方法进行蛋白定量。

(3)Western Blot：每种细胞蛋白取30微克，加入蛋白上样缓冲液(北京宝赛生物技术有限公司)，于100℃水浴煮5分钟。10％PAGE电泳，380mA电转2小时，TBST液平衡，用5％牛奶室温封闭3小时，按照1∶2000加入步骤2制备的兔源NAOP抗体，鼠源anti-beta-actin(Sigma)按照1∶3000加入，4℃过夜，TBST洗三次，每次10分钟，按照1∶3000分别加入HRP标记的羊抗兔IgG(中衫金桥，ZB-2301)和羊抗鼠IgG(中衫金桥，ZB-2305)，脱色摇床上室温一小时，TBST洗三次，每次10分钟，显色按照SuperSignal West Pico ChemiluminescentSubstrate(Pierce，34080)说明书进行。Kodak X-Omat BT Film感光，显影，定影。结果如图13所示，表明NAOP蛋白在肺癌细胞系(PAa，L1，pG，H520)中的表达量要远远高于相对正常的支气管上皮细胞系(Yp111，C45E1，Mp37，Tr)。图13中，上排为兔源NAOP抗体检测NAOP的结果，下排为anti-beta-actin检测beta-actin的结果。

实施例5、免疫组织化学染色检测NAOP在肺癌及其它组织中的表达水平

1、组织芯片标本来源：收集中国医学科学院肿瘤医院病理科收取的肺鳞癌组织和相应的正常支气管及远端正常肺组织标本，随机选取314例组织标本，用于组织微阵列的构建，免疫组织化学实验。

2、免疫组织化学染色大片标本来源：收集中国医学科学院肿瘤医院病理科收取的肺鳞癌组织34例。

3、免疫组织化学染色(IHC-SP法)

参考文献(Hu，Z.et al.Overexpression of osteopontin is associatedwith more aggressive phenotypes in human non-small cell lung cancer.ClinCancer Res 11，4646-52(2005))的方法，以实施例4步骤2制备的兔源NAOP抗体为一抗，用免疫组化试剂盒PV9000(中衫金桥)进行免疫组织化学染色。结果判断：所有切片均经两位病理医师独立阅片。

4、统计学处理：采用SPSS(Ver10.0)统计软件包进行处理。采用行×列联表，变量的比较采用Kruskal-Wallis非参数统计或进行χ²检验或Fisher确切概率计算。各因素相关关系，采用Spearman等级相关分析。相对危险度应用Logistic回归分析，预后分析采用Kaplan-Meier分析，差异性采用Mantel-Haenszel log-rank检验。显著性检验水准α值等于0.05。结果如图14，图15，图16和图17所示，图14表明NAOP在正常支气管上皮表达水平极低，而在不典型增生，早期浸润癌时期表达量明显升高，原发鳞癌表达量高。图15是NAOP在肺鳞癌组织芯片中的免疫组织化学染色的代表图片，表明在肺鳞癌组织中NAOP表达量明显升高；图15中，上排为肺鳞癌组织，下排为正常肺和支气管上皮。图16是NAOP在肺鳞癌组织大片中的免疫组织化学染色的统计图，也是表明随着肺鳞癌的发生发展，NAOP的表达量逐渐上升；图16中，横坐标分数中的分母为样本总数，分子为表达NAOP的样本数。图17是NAOP在肺鳞癌组织芯片中的免疫组织化学染色的统计图，其中食管癌和喉癌各有19例和15例，结果表明经过在大样本中的检验，NAOP在肺鳞癌中的表达量显著升高，且在食管癌和喉癌中也有高水平表达，说明NAOP可能在上呼吸消化道肿瘤或其他肿瘤形成中发挥重要作用；图17中，横坐标分数中的分母为样本总数，分子为表达NAOP的样本数。

NAOP基因在实验中所有用到的正常组织、胎儿组织、肿瘤组织都有表达，说明其为人体自身重要的NF-κB调控分子；在不同的组织中表达量高低有差别，说明其在不同的组织中发挥功能的程度不同。在肿瘤组织中表达量升高，体内外转化NIH3T3细胞说明其在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。

实施例6、NAOP基因的RNA干扰实验

由于NAOP基因能刺激NF-κB的活化，且外源高表达可以使小鼠成纤维细胞系NIH3T3发生恶性转化。故可以将NAOP基因作为肿瘤治疗的一个靶点，设计siRNA反义核酸，小分子化学药物或特异性抗体来阻断其作用，达到治疗肿瘤的目的。

1、制备小干扰RNA NAOP^SiRNA1和NAOP^SiRNA2：NAOP^SiRNA1和NAOP^SiRNA2由Ambion公司设计，化学合成，经PAGE纯化。NAOP^SiRNA1的正义链为：-5‘GGAAGGAGAUUGCUGACUAtt3’(序列3)；反义链为5’UAGUCAGCAAUCUCCUUCCtt3’(序列4)。NAOP^SiRNA2的正义链为：5‘GGAGAUUGCUGACUAUCUGtt3’(序列5)，反义链为5’CAGAUAGUCAGCAAUCUCCtt3’(序列6)，均位于NAOP基因的第三个外显子。阴性对照siRNA也购自Ambion公司，货号：4611。

2、siRNA的转染：

1)细胞培养：将肺鳞癌细胞系H520(ATCC Number：HTB-182)和非小细胞肺癌细胞系H1299(ATCC Number：CRL-5803)用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’smodified Eagle’s medium)培养基(Hyclone，SH0022.02)按照0.8×10⁵个细胞/孔铺在六孔细胞培养板(Costar，3599)上，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养20-24小时。

2)制备siRNA-Lipfectamine^TM2000复合物：用250μl不含血清的OPTI-MEMI培养基(Invitrogen，31985-070)分别稀释80pmol NAOP^SiRNA1和NAOP^SiRNA2，缓慢混合均匀；同样用250μl不含血清的OPTI-MEMI培养基稀释4μl Lipfectamin^TM 2000，缓慢混合均匀，在室温下保温5分钟后，与稀释的NAOP^SiRNA1和NAOP^SiRNA2缓慢混合，室温放置20分钟，以形成siRNA-Lipfectamin^TM 2000复合物。

3)转染：将Lipfectamin^TM 2000复合物缓慢滴入六孔细胞培养板(500μl/孔)，轻微摇匀。5％CO₂，37℃的培养箱中培养。

4)20小时后，换成新鲜的10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’smedium)培养基(Hyclone，SH0022.02)。

3、RNA干扰效果的鉴定：

1)RT-PCR：转染48小时后，提取细胞总RNA。实验按照TRIZOL(Invitrogen，15596-026)说明书进行。逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)按照SuperScript IIReverse Transcriptase(Invitrogen，18064-014)试剂盒说明书进行。RT-PCR的引物序列如下：

正向引物：5’GGCTCTGGATTTAAAGCTGAG3’，反向引物：5’CACTTCTGACTGGAGTCGAG3’分别位于NAOP基因的第二和第四外显子，特异性扩增NAOP基因的336碱基对(自序列1的5′端第25位至360位脱氧核苷酸)。GAPDH为内对照，其引物序列为：正向引物：5’TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT3’，反向引物：5’CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC3’特异性扩增GAPDH基因的983碱基对。

20μlPCR体系：

10×Taq DNA聚合酶缓冲液  2μl

dNTP                     2μl    终浓度各200μM

逆转录cDNA模板           2μl    (200ng)

NAOP引物                 1μl    各10μM

GAPDH引物                1μl    各10μM

Taq DNA聚合酶            1U

用双蒸水补足至           20μl

反应温度、时间：94℃，5变性分钟；然后94℃变性30秒，54.6℃退火30秒，72℃延伸1分钟，扩增30个循环；最后在72℃下延伸10分钟。取8μl产物电泳。结果如图18所示，表明在siRNA转染48小时后，NAOP在mRNA水平即已经下降。图18中，mock为空细胞(未转染的H520或H1299)，negative为阴性对照(购自Ambion公司的货号为4611的siRNA转染的H520或H1299)，NAOP-s1、NAOP-s2为针对NAOP的两段siRNA(NAOP^SiRNA1或NAOP^SiRNA2转染的H520或H1299)，GAPDH作为上样一致性对照。

2)Western Blot：转染72小时后，提取细胞总蛋白。按照实施例6步骤3的方法进行Western Blot。结果如图19所示，表明在siRNA转染72小时后，NAOP蛋白明显减少或消失，说明NAOP^SiRNA1和NAOP^SiRNA2均有效地导致了NAOP的沉默。图19中，beta-actin为上样一致性对照，每道上样50μg蛋白，mock为空细胞(未转染的H520或H1299)，negative为阴性对照(购自Ambion公司的货号为4611的siRNA转染的H520或H1299)，s1、s2为针对NAOP的两段siRNA(NAOP^SiRNA1、NAOP^SiRNA2转染的H520或H1299)。

4、细胞凋亡的观察与检测：

1)镜检：分别取转染24，72小时的H1299细胞在倒置相差显微镜下观察，照相，记下代表性的细胞图片。结果如图20所示，表明H1299细胞在NAOP^SiRNA1和NAOP^SiRNA2转染72小时后出现了明显的细胞凋亡现象，而转染24小时时不明显。图20中，mock为空细胞(未转染的H1299)，negative为阴性对照(购自Ambion公司的货号为4611的siRNA转染的H1299)，s1、s2为针对NAOP的两段siRNA(NAOP^SiRNA1、NAOP^SiRNA2转染的H1299)。

2)Annexin V FITC和PI双染，流式细胞仪检测：取转染72小时H520和H1299细胞按照Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit(CALBIOCHEM，PF032)说明进行Annexin V FITC和PI双染，流式细胞仪检测。结果如图21a和图21b所示，表明H520和H1299在NAOP^SiRNA1和NAOP^SiRNA2转染72小时后都出现了明显的细胞凋亡现象。图21a和图21b中，右侧统计图显示凋亡百分比，H520-mock表示未转染的H520细胞，H520-nega表示购自Ambion公司的货号为4611的siRNA转染的H520，H520-s1为NAOP^SiRNA1转染的H520，H520-s2为NAOP^SiNRA2转染的H520；H1299-mock表示未转染的H1299细胞，H1299-nega表示购自Ambion公司的货号为4611的siRNA转染的H1299，H1299-s1为NAOP^SiRNA1转染的H1299，H1299-s2为NAOP^SiRNA2转染的H1299。图21a和图21b中，纵坐标PI表示PI的荧光强度，横坐标ANNEXIN-V-FITC表示FITC的荧光强度。

3)MTT细胞增殖实验：将siRNA转染后48小时的H520和H1299细胞以1×10³/孔传入96孔板，每组重复三个孔。MTT操作方法按照CellTiter 96Non-Radioactive Cell Proliferation Assa y kit(Promega，G4000)进行。结果如图22所示，表明H1299和H520细胞在NAOP^SiRNA1和NAOP^SiRNA2转染后克隆形成能力明显下降。图22中，下方为各组细胞克隆形成数目的统计图，数目为三个复孔的平均值，误差线表示三次重复实验各组的标准方差；mock为空细胞(未转染的H520或H1299)，nega为阴性对照(购自Ambion公司的货号为4611的siRNA转染的H520或H1299)，NAOP-s1、NAOP-s2为针对NAOP的两段siRNA(NAOP^SiRNA1、NAOP^SiRNA2转染的H520或H1299)。

以上实施例说明，NAOP在肿瘤细胞的生长增殖中发挥重要作用，在肿瘤细胞中降低或去除NAOP蛋白的表达会引起肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的生长。

序列表

<160>6

<210>1

<211>1133

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

taggaggaac agcacagcat gctgggctct ggatttaaag ctgagcgctt aagagtgaat      60

ttgagattag tcataaatcg ccttaaacta ttggagaaaa agaaaacgga actggcccag     120

aaagcaagga aggagattgc tgactatctg gctgctggga aagatgaacg agctcggatc     180

cgtgtggagc acattatccg ggaagactac ctcgtggagg ccatggagat cctggagctg     240

tactgtgacc tgctgctggc tcggtttggc cttatccagt ctatgaagga actagattct     300

ggtctggctg aatctgtgtc tacattgatc tgggctgctc ctcgactcca gtcagaagtg     360

gctgagttga aaatagttgc tgatcagctc tgtgccaagt atagcaagga atatggcaag     420

ctatgtagga ccaaccagat tggaactgtg aatgacaggc taatgcacaa gctgagtgtg     480

gaagccccac ccaaaatcct ggtggagaga tacctgattg aaattgcaaa gaattacaac     540

gtaccctatg aacctgactc tgtggtcatg gcagaagctc ctcctggggt agagacagat     600

cttattgatg ttggattcac agatgatgtg aagaaaggag gccctggaag aggagggagt     660

ggtggcttca cagcaccagt tggtggacct gatggaacgg tgccaatgcc catgcccatg     720

cctatgccat ctgcaaatac gcctttctca tatccactgc caaagggacc atcagatttc     780

aatggactgc caatggggac ttatcaggcc tttcccaata ttcatccacc tcagatacca     840

gcaactcccc catcgtatga atctgtagat gacattaatg ctgataagaa tatctcttct     900

gcacagattg ttggtcctgg acccaagcca gaagcctctg caaagcttcc ttccagacct     960

gcagataact atgacaactt tgtcctacca gagttgccat ctgtgccaga cacactacca    1020

actgcatctg ctggtgccag cacctcagca tctgaagaca ttgactttga tgatctttcc    1080

cggaggtttg aagagctgaa aaagaaaaca taggtctctt aaaccaggca act           1133

<210>2

<211>364

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

Met Leu Gly Ser Gly Phe Lys Ala Glu Arg Leu Arg Val Asn Leu Arg

1               5                   10                  15

Leu Val Ile Asn Arg Leu Lys Leu Leu Glu Lys Lys Lys Thr Glu Leu

            20                  25                  30

Ala Gln Lys Ala Arg Lys Glu Ile Ala Asp Tyr Leu Ala Ala Gly Lys

        35                  40                  45

Asp Glu Arg Ala Arg Ile Arg Val Glu His Ile Ile Arg Glu Asp Tyr

    50                  55                  60

Leu Val Glu Ala Met Glu Ile Leu Glu Leu Tyr Cys Asp Leu Leu Leu

65                  70                  75                  80

Ala Arg Phe Gly Leu Ile Gln Ser Met Lys Glu Leu Asp Ser Gly Leu

                85                  90                  95

Ala Glu Ser Val Ser Thr Leu Ile Trp Ala Ala Pro Arg Leu Gln Ser

            100                 105                 110

Glu Val Ala Glu Leu Lys Ile Val Ala Asp Gln Leu Cys Ala Lys Tyr

        115                 120                 125

Ser Lys Glu Tyr Gly Lys Leu Cys Arg Thr Asn Gln Ile Gly Thr Val

    130                 135                 140

Asn Asp Arg Leu Met His Lys Leu Ser Val Glu Ala Pro Pro Lys Ile

145                 150                 155                 160

Leu Val Glu Arg Tyr Leu Ile Glu Ile Ala Lys Asn Tyr Asn Val Pro

                165                 170                 175

Tyr Glu Pro Asp Ser Val Val Met Ala Glu Ala Pro Pro Gly Val Glu

            180                 185                 190

Thr Asp Leu Ile Asp Val Gly Phe Thr Asp Asp Val Lys Lys Gly Gly

        195                 200                 205

Pro Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Phe Thr Ala Pro Val Gly Gly Pro

    210                 215                 220

Asp Gly Thr Val Pro Met Pro Met Pro Met Pro Met Pro Ser Ala Asn

225                 230                 235                 240

Thr Pro Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Lys Gly Pro Ser Asp Phe Asn Gly

                245                 250                 255

Leu Pro Met Gly Thr Tyr Gin Ala Phe Pro Asn Ile His Pro Pro Gln

            260                 265                 270

Ile Pro Ala Thr Pro Pro Ser Tyr Glu Ser Val Asp Asp Ile Asn Ala

        275                 280                 285

Asp Lys Asn Ile Ser Ser Ala Gln Ile Val Gly Pro Gly Pro Lys Pro

    290                 295                 300

Glu Ala Ser Ala Lys Leu Pro Ser Arg Pro Ala Asp Asn Tyr Asp Asn

305                 310                 315                 320

Phe Val Leu Pro Glu Leu Pro Ser Val Pro Asp Thr Leu Pro Thr Ala

                325                 330                 335

Ser Ala Gly Ala Ser Thr Ser Ala Ser Glu Asp Ile Asp Phe Asp Asp

            340                 345                 350

Leu Ser Arg Arg Phe Glu Glu Leu Lys Lys Lys Thr

        355                 360

<210>3

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ggaaggagau ugcugacuat t    21

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

uagucagcaa ucuccuucct t    21

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

ggagauugcu gacuaucugt t                                                21

<210>6

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

cagauaguca gcaaucucct t                                                21

Claims (13)

1、肿瘤相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤相关的蛋白质。

2、权利要求1所述的肿瘤相关蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述肿瘤相关蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交，并编码所述与肿瘤相关的蛋白质的核苷酸序列。

4、含有权利要求2或3所述的肿瘤相关蛋白编码基因的表达载体。

5、含有权利要求2或3所述的肿瘤相关蛋白编码基因的转基因细胞系。

6、含有权利要求4所述的载体的宿主菌。

7、以权利要求1所述的肿瘤相关蛋白为抗原制备的多克隆抗体。

8、抑制权利要求1所述的肿瘤相关蛋白表达的小干扰RNA，是由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成的任一个互补双链RNA：

1)正义链具有序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列，反义链具有序列表中SEQ ID №：4的核苷酸序列；

2)正义链具有序列表中SEQ ID №：5的核苷酸序列，反义链具有序列表中SEQ ID №：6的核苷酸序列。

9、一种抗上呼吸消化道肿瘤的药物，它的活性成分为权利要求6所述的两种小干扰RNA中的一种或两种。

10、根据权利要求9所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述肿瘤为肺癌，食管癌或喉癌。

11、权利要求7所述的抗体在上呼吸消化道肿瘤体外检测、预后中的应用。

12、权利要求1所述的肿瘤相关蛋白或权利要求2或3所述的基因在筛选预防和/或治疗上呼吸消化道肿瘤或与人体细胞核因子NF-κB相关疾病的药物中的应用。

13、权利要求1所述的肿瘤相关蛋白或权利要求2或3所述的基因在上呼吸消化道肿瘤的体外诊断、预后中的应用。

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