JP3990736B2

JP3990736B2 - 制がん剤

Info

Publication number: JP3990736B2
Application number: JP51416599A
Authority: JP
Inventors: 敏祐川嵜
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1997-08-21
Filing date: 1998-08-19
Publication date: 2007-10-17
Anticipated expiration: 2018-08-19
Also published as: EP1008351A1; WO1999010001A1; US20020086817A1; CN1106846C; DE69836428T2; AU8748198A; CN1267223A; EP1008351B1; KR20010021768A; EP1008351A4; ATE345139T1; DE69836428D1; US7410953B2; KR100497849B1

Description

発明の属する技術分野
本発明は、がん細胞、その周辺組織又は非患部組織の特定のタンパク質濃度を増強させることにより、がんの増殖を抑制する、医薬の分野に有用な薬剤に関する。
従来の技術
近年、がん化学療法などを始めとするがん治療法の進歩にはめざましいものがあるが、それでもなお世界中でがんはいまだに死因の主要な位置を占める疾病である。したがって、真に有効な新しいがん治療法の開発が強く望まれている。
動物組織や体液中には、血液型認識抗体のような免疫グロブリン以外に糖を認識するタンパク質として「動物レクチン」と総称される一群の機能性タンパク質が存在する。
本発明者は、この動物レクチンに関する研究過程で、カルシウム依存的にマンノース（Man）やＮ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）に結合するＣ型レクチンを哺乳動物肝臓及び血清中に見出し、マンナン結合タンパク質（ＭＢＰ）と命名している［バイオケミカルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）、第８１巻、第３号、第１０１８〜１０２４頁（１９７８）、バイオケミカルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーションズ、第９５巻、第２号、第６５８〜６６４頁（１９８０）ほか］。
更に、ヒト肝臓及びヒト血清ＭＢＰ、並びにその遺伝子を獲得することに成功している［ジャーナルオブバイオケミストリー（Journal of Biochemistry）、第１１５巻、第６号、第１１４８〜１１５４頁（１９９４）］。なお、マンナン結合タンパク質は、マンノース結合タンパク質あるいはマンナンバインディングレクチンと呼ばれることがある。
本発明者は、このＭＢＰの構造と機能に関する研究を進める中で、血清ＭＢＰが抗体や補体成分であるＣ１ｑに依存することなく、古典経路、あるいはレクチン経路を介して補体系を活性化していることを明らかにしている。更に、血清ＭＢＰは直接的な生体防御作用を有していることが知られている。例えば、ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ糖タンパク質上のハイマンノース型糖鎖に結合することによって感染を抑制したり、酵母やある種のグラム陰性細菌に対してファゴサイトによる除去を促進することが知られている。
しかしながら、ＭＢＰのがん細胞あるいはがん組織に対する作用はこれまで全く知られていなかった。
発明が解決しようとする課題
本発明の目的は、がん細胞、その周辺組織又は非患部組織のがんの増殖を抑制させる薬剤を提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明者は、上記目的を達成するために、ＭＢＰの構造並びに機能について、種々研究を行っていたところ、驚くべきことに、ＭＢＰをコードする遺伝子を投与した担がん動物と、ＭＢＰをコードする遺伝子を投与していない担がん動物とでは、明らかにＭＢＰをコードする遺伝子を投与した担がん動物のがん細胞の増殖能が抑制されていることを見出し、本発明を完成した。
本発明を概説すれば、本発明は、マンナン結合タンパク質又はその遺伝子を有効成分とすることを特徴とする制がん剤に関する。
【図面の簡単な説明】
図１はワクシニアウイルスベクターｐＢＳＦ２−１６の制限酵素地図を示す図である。
図２はＭＢＰ発現プラスミドｐＢＳＦ２−１６／ＭＢＰの模式図を示す図である。
図３はインビボでの制がん効果評価実験の結果を示す図である。
発明の実施の形態
以下、本発明を具体的に説明する。
本明細書において、ＭＢＰとは、天然型のＭＢＰのみならず、ＭＢＰとしての活性を有する限り天然型のアミノ酸配列中、アミノ酸残基の置換、欠失、付加、挿入等によりアミノ酸配列が改変されたタンパク質をも本発明に含む意味である。また、ここで言う天然型ＭＢＰとしては、例えばヒト又はウサギ由来のものが挙げられるが、本発明においてはこれらに限定されるものではなく、他の動物、植物等の生物体由来のもの、あるいは細菌類、酵母類、放線菌類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来のものも含まれる。
本明細書において、ＭＢＰをコードする遺伝子とは、上述したＭＢＰ及びＭＢＰ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば、特に限定されるものではなく、該遺伝子に対し、遺伝子工学的な置換、欠失、付加、挿入等の変異処理を行ったものでも、ＭＢＰ活性を有しているタンパク質をコードする遺伝子であれば、本発明に含まれる。
本発明においては、がん細胞、その周辺組織又は非患部組織にＭＢＰを導入することによってその目的を達成することができる。ＭＢＰを導入するには、例えばマイクロインジェクション法のような、がん細胞への直接投与法などによってＭＢＰの活性を保持したままで、がん細胞に直接導入してもよいし、皮下投与法あるいは静脈内投与法等によってＭＢＰ活性を保持したままで導入してもよい。また、例えばウイルス等を使ってＭＢＰをコードする遺伝子をがん細胞へ導入してもよいし、皮下投与法等によりＭＢＰをコードする遺伝子をがん細胞へ導入し、ＭＢＰを発現させることによって本発明の目的を達成することができる。
すなわち、本発明の薬剤を用いればＭＢＰ又はＭＢＰをコードする遺伝子をがん細胞、その周辺組織又は非患部組織に導入することができ、がんの増殖を抑制することができる。
ＭＢＰ又はＭＢＰをコードする遺伝子は、組織表面の患部あるいはその周辺組織に直接注入すればよい。また、組織内部の患部、その周辺組織にも直接注入すればよいが、ドラグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を応用することもできる。ＤＤＳとしては、がん細胞に特異的なシステムであれば良く、例えば、がん細胞リセプター、がん特異抗体等を利用した一般的なシステムから選択すれば良い。また、周辺組織の特定の臓器あるいは細胞に特異的なリガンド、リセプターを利用してそれらの臓器にＭＢＰを特異的に導入させることもできる。なお、がん組織を外科手術的に摘出した後、非がん部に本発明の薬剤を適用するのも、微小がんの増殖抑制に極めて有効な方法である。
本発明のＭＢＰ又はＭＢＰをコードする遺伝子を有効成分とする薬剤を、がん細胞、その周辺組織又は非患部組織に使用する場合、上記薬剤が最も効果的に効くようにするのは当然である。本発明の制がん剤は、ＭＢＰ又はＭＢＰをコードする遺伝子を医薬として許容される範囲で含有していれば良く、通常の遺伝子治療剤、タンパク質含有剤と同様に製剤化することができ、製剤中には担体、賦形剤、安定化剤、粘稠化剤等が含有されていても良い。
本発明の制がん剤として用いられるＭＢＰ又はＭＢＰをコードする遺伝子の使用量は、その製剤形態、使用方法及び該薬剤を使用する患者の年齢、体重、疾患の進行度等を考慮した上で、適宜設定、調節すればよい。例えば、タンパク質の場合、成人１回当り０．０１μｇ〜１ｇ／ｋｇである。また、タンパク質発現用組換えウイルスを使用する場合、成人１回当り１×１０²〜１×１０¹²ＰＦＵ（プラーク形成ユニット）を使用する。当然、使用量は種々の条件によって変動するものであるので、上記の使用量より少ない量で十分な場合、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。
本発明の制がん剤に含有されるＭＢＰ又はＭＢＰをコードする遺伝子は、生体内物質であり、毒性は無い。
本発明で用いられるＭＢＰについては、既にその詳細なタンパク質化学的性質が明らかにされており、例えばヒト血清から川嵜らの方法［ジャーナルオブバイオケミストリー、第９４巻、第３号、第９３７〜９４７頁（１９８３）］に従って、下記表１に示す工程により調製することができる。

ＭＢＰの結合活性は、ジャーナルオブバイオケミストリー、第９４巻、第３号、第９３７〜９４７頁（１９８３）に記載の方法に準じ、¹²⁵Ｉでラベルされたマンナン（¹²⁵Ｉ−mannan）を用いて測定することができる。ＭＢＰの比活性は、結合した¹²⁵Ｉ−mannan（ｎｇ）／タンパク質量（μｇ）で表す。タンパク質量は、牛血清アルブミンを標準物質として、ローリー法で測定する。
ＭＢＰをコードする遺伝子は、例えばヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから倉田らの方法［ジャーナルオブバイオケミストリー、第１１５巻、第６号、第１１４８〜１１５４頁（１９９４）］によって得ることができる。
この方法により得られるヒトＭＢＰの成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に、それらをコードする遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。
これらの遺伝子若しくはその一部をプローブとして用いることにより、該遺伝子にハイブリダイズし、かつ、ＭＢＰ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を調製することができる。また、これらの遺伝子若しくはその一部からプライマーをデザインし、このプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、ＭＢＰ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を調製することもできる。
ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、生物体又は微生物等から得たゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作製し、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ［Denhardt's、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００］、１００μｇサケ精子ＤＮＡ及び６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、³²Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で４時間〜一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとってプローブとハイブリダイズするＤＮＡを検出することができる。また、洗いなどの条件を変えることにより様々な相同性を示す遺伝子を得ることができる。
配列表の配列番号２で表される遺伝子に対し、遺伝子工学的な置換、欠失、付加、挿入等の変異処理等を行うことによっても、配列表の配列番号２で表される遺伝子にハイブリダイズし、かつＭＢＰ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を調製することができる。
変異処理を行う方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法［ギャップドデュプレックス（gapped duplex）法、ヌクレイックアシッズリサーチ（Nucleic Acids Research）、第１２巻、第２４号、第９４４１〜９４５６頁（１９８４）］、制限酵素部位を利用する方法［アナリティカルバイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、第２００巻、第８１〜８８頁（１９９２）、ジーン（Gene）、第１０２巻、第６７〜７０頁（１９９１）］、ｄｕｔ（dUTPase）とｕｎｇ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）変異を利用する方法［クンケル（Kunkel）法、プロシーディングズオブザナショナルアカデミーオブサイエンシーズオブザＵＳＡ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA）、第８２巻、第４８８〜４９２頁（１９８５）］、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法［オリゴヌクレオチド−ダイレクティッドデュアルアンバー（Oligonucleotide-directed Dual Amber、ＯＤＡ）法、ジーン、第１５２巻、第２７１〜２７５頁（１９９５）］、制限酵素の認識部位を付加した２種類の変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法（米国特許第５，５１２，４６３号）等を利用することができる。
また、市販されているキット、例えば、ギャップドデュプレックス法を用いたミュータン−Ｇ［Mutan（登録商標）-G、宝酒造社製］、クンケル法を用いたミュータン−Ｋ［Mutan（登録商標）-K、宝酒造社製］、ＯＤＡ法を用いたミュータン−エキスプレスＫｍ［Mutan（登録商標）-Express Km、宝酒造社製］、変異導入用プライマーとピロコッカスフリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼを用いたクイックチェンジサイト−ダイレクティッドミュータジェネシスキット［QuikChange^TM Site-directed Mutagenesis Kit、ストラタジーン（STRATAGENE）社製］、ＰＣＲ法を利用するＴａＫａＲａＬＡ−ＰＣＲインビトロミュータジェネシスキット（TaKaRa LA-PCR in vitro Mutagenesis Kit、宝酒造社製）、ミュータン−スーパーエキスプレスＫｍ［Mutan（登録商標）-Super Express Km、宝酒造社製］等を利用することができる。
こうして得られた遺伝子が、ＭＢＰ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、ジャーナルオブバイオケミストリー、第９４巻、第３号、第９３７〜９４７頁（１９８３）又はジャーナルオブバイオケミストリー、第１１５巻、第６号、第１１４８〜１１５４頁（１９９４）記載の方法に従い、ＭＢＰ活性を測定することにより確認することができる。
これらの遺伝子、及び該遺伝子により得られる発現タンパク質も本発明の薬剤として使用することができる。
ＭＢＰをコードする遺伝子そのものを用いて、本発明の薬剤をがん細胞に導入する場合、例えばＭＢＰをコードする遺伝子と、これに関係する調節遺伝子を持つ組換えベクターを使用することで、簡単にＭＢＰをコードする遺伝子を導入することができる。調節遺伝子としては、ＭＢＰをコードする遺伝子そのもののプロモーター以外にも、もちろん他の有効なプロモーター、例えばワクシニアウイルスＡ型封入体（ＡＴＩ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来ＬＴＲプロモーター、ヒートショックプロモーター、メタロチオネインプロモーター、アクチンプロモーター等を有するベクターを使用することができる。
これらベクターは、細胞中の染色体外にとどまるようなベクターの形で、がんあるいはまだがん化していない細胞に導入することができる。このような状態では、遺伝子は染色体外の位置から細胞によって発現され、ＭＢＰを生産し、細胞内のＭＢＰ濃度を増加することができ、本発明の目的を達成することができる。
染色体外保持用ベクターは、当該分野において知られており、適切なベクターが用いられる。該ベクターを細胞内に導入する方法としては、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入法などが当該分野において知られており、どのような方法を選択するかは日常的作業の範囲である。
また、ＭＢＰをコードする遺伝子を染色体内に組込まれるようなベクターの形で、がんあるいはまだがん化していない細胞に導入することができる。このような状態では、遺伝子は染色体中に保持され、細胞によって発現され、ＭＢＰを生産し、細胞内のＭＢＰ濃度を増加することができ、本発明の目的を達成することができる。
細胞へのＭＢＰ遺伝子導入には、ウイルスベクターを使用することにより、当該遺伝子を含むベクターを効率よく導入することができる。これらのベクターとしては、従来から目的のＤＮＡを細胞に輸送することが知られており、かつ感染効率の高いワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターあるいは非増殖性組換えウイルスベクター等を用いることができる。特に、非増殖性組換えウイルスベクターは目的の細胞等に導入後、この組換えウイルスは増殖しないために２週間から２ヶ月ごとに毎回用いる必要はあるが、その際に投与量の調節を行えるという利点もある。また、非ウイルスベクターである、脂質を用いて人工的に作製した球状カプセルのリポソーム、例えば、膜結合リポソームやカチオニックリポソーム等を用いることも可能である。
本発明の薬剤として望ましい組換えウイルスの構築方法としては、例えば次に示すような方法があげられる。ヒトＭＢＰのｃＤＮＡを、アーカイブスオブビロロジー（Archives of Virology）、第１３８巻、第３１５〜３３０頁（１９９４）記載の方法で構築したワクシニアウイルスベクターｐＢＳＦ２−１６（図１）のSmaIとSacIサイトに導入し、ＡＴＩハイブリッドプロモーター（７．５ｋＤａプロモーターを直列に数個並べたものと、ＡＴＩプロモーターを組合せたプロモーター）で制御されるＭＢＰの組換えベクターｐＢＳＦ２−１６／ＭＢＰ（図２）を作製する。この組換えベクターｐＢＳＦ２−１６／ＭＢＰと野生型ワクシニアウイルスＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に、コトランスフェクトし、生じる組換えワクシニアウイルスを、例えばヘマグルチニンフェノタイプ、あるいはＭＢＰの発現量によって選抜することにより、ＭＢＰ発現組換えワクシニアウイルスを得ることができる。
制がん効果に関しては、例えばヒトがん細胞をヌードマウスに接種後、本発明の薬剤を投与し、その後のがん組織の増殖能を測定することによって、がん増殖抑制効果を評価することができる。すなわち、ヒト結腸がん細胞株ＳＷ１１１６をＫＳＮヌードマウスの皮下に接種し、その３週間後に先に述べたＭＢＰ発現組換えワクシニアウイルスを、腫瘍内投与あるいは非患部の皮下に投与する。その２週間後、更にもう一度ＭＢＰ発現組換えワクシニアウイルスを同様の方法で投与し、投与後の腫瘍の大きさを測定することによりがん細胞の増殖抑制能を評価することができる。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
発現ベクター及び組換えワクシニアウイルスの構築
ヒトＭＢＰのコーディング領域全長を含むｃＤＮＡクローンＨ−３−１［ジャーナルオブバイオケミストリー、第１１５巻、第６号、第１１４８〜１１５４頁（１９９４）］を、ワクシニアウイルスベクターｐＢＳＦ２−１６［アーカイブスオブビロロジー、第１３８巻、第３１５〜３３０頁（１９９４）］のＡＴＩハイブリッドプロモーター（７．５ｋＤａプロモーターを直列に数個並べたものと、ＡＴＩプロモーターを組合せたプロモーター）のすぐ下流、SmaIとSacIサイトにサブクローニングし、ＡＴＩハイブリッドプロモーターで制御されるＭＢＰ発現プラスミドｐＢＳＦ２−１６／ＭＢＰを作製した。
図１にワクシニアウイルスベクターｐＢＳＦ２−１６の制限酵素地図を示す。また、図２にＭＢＰ発現プラスミドｐＢＳＦ２−１６／ＭＢＰの模式図を示す。
次に、ＩＢＴ（イサチン−β−チオセミカルバゾン）依存性ワクシニアウイルス株［ビロロジー（Virology）、第１５５巻、第９７〜１０５頁（１９８６）］をＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）に感染させた。このＩＢＴ依存性ワクシニアウイルス株を感染させたＣＯＳ−７細胞に、ｐＢＳＦ２−１６／ＭＢＰと野生型ワクシニアウイルスＷＲ株のビリオンから抽出したゲノムＤＮＡを、ＤＯＴＡＰ試薬（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて導入し、ＭＢＰ組換えワクシニアウイルスを作製した。
なお、組換えワクシニアウイルスは、アーカイブスオブヴィロロジー、第１３８巻、第３１５〜３３０頁（１９９４）記載の方法に従い、ヘマグルチニンフェノタイプによって選抜し、ＲＫ−１３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ３７）中でＥＬＩＳＡ法によって検出した。ウイルスのタイターは、プラーク形成法によって測定し、プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）として表した。
実施例２
制がん効果の評価
インビボ（in vivo）での制がん効果の評価は、次のようにして行った。
ヒト結腸がん細胞ＳＷ１１１６株（ＡＴＣＣＣＣＬ２３３）をＫＳＮヌードマウス（日本エスエルシー株式会社製）の皮下に、マウス１匹当り１０⁷個接種し、その３週間後に実施例１で述べたＭＢＰ組換えワクシニアウイルスを、マウス１匹当り５×１０⁶ＰＦＵを患部の腫瘍内、あるいは非患部の皮下に投与した。コントロールとして野生型ワクシニアウイルスＷＲ株を同量、患部の腫瘍内に投与した。
その２週間後、更にもう一度、同量のＭＢＰ組換えワクシニアウイルス、あるいは野生型ワクシニアウイルスＷＲ株を同様の方法で投与し、投与後の腫瘍の大きさを測定することにより、がん細胞の増殖抑制能を評価した。
なお、対照として、生理食塩水を非患部の皮下に投与した群を用いた。その結果を図３に示す。すなわち図３は、インビボでの制がん効果評価実験の結果を示す図であり、縦軸は腫瘍の大きさ（ｍｍ）を、横軸はがん細胞移植後の週数を示す。図中、黒四角印は生理食塩水を非患部の皮下に投与した群を示し、白丸印は野生型ワクシニアウイルスＷＲ株を患部の腫瘍内に投与した群を示し、黒丸印はＭＢＰ組換えワクシニアウイルスを患部の腫瘍内に投与した群を示し、黒三角印はＭＢＰ組換えワクシニアウイルスを非患部の皮下に投与した群を示す。また、図中の矢印は、ＭＢＰワクシニアウイルス、野生型ワクシニアウイルスＷＲ株及び生理食塩水をそれぞれ投与した週を示す。
図３から明らかなように、本発明のＭＢＰ組換えワクシニアウイルスを患部の腫瘍内に投与した場合、腫瘍が明らかに小さくなることが観察され、また、非患部の皮下に投与した場合でも、コントロールの野生型ワクシニアウイルスＷＲ株及び生理食塩水を投与したものと比べると、顕著ながん細胞の増殖抑制が観察された。
発明の効果
本発明によって、がん細胞中、その周辺組織又は非患部組織のＭＢＰ濃度を増強させる、すなわちＭＢＰ又はその遺伝子を有効成分とすることを特徴とする制がん剤が提供された。該制がん剤は、がんの治療の分野で有用である。
配列表
配列番号：1
配列の長さ：228
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：

配列番号：2
配列の長さ：684
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to genomic RNA
配列：

Claims

マンナン結合タンパク質又はその遺伝子を有効成分とすることを特徴とする制がん剤。
マンナン結合タンパク質が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である請求の範囲１記載の制がん剤。
遺伝子が、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、又は該遺伝子を含む遺伝子である請求の範囲１記載の制がん剤。
遺伝子が、配列表の配列番号２で表される遺伝子、又は該遺伝子を含む遺伝子である請求の範囲３記載の制がん剤。
請求の範囲３または４に記載の遺伝子が、ベクターに組込まれていることを特徴とする請求の範囲１に記載の制がん剤。
ベクターが、プラスミドベクターである請求の範囲５記載の制がん剤。
ベクターが、ウイルスベクターである請求の範囲５記載の制がん剤。
ウイルスベクターが、ワクシニアウイルスベクターである請求の範囲７記載の制がん剤。