JPH10513362A - 生体活性な融合タンパク質および先在する腫瘍の治療 - Google Patents

生体活性な融合タンパク質および先在する腫瘍の治療

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JPH10513362A JP8524449A JP52444996A JPH10513362A JP H10513362 A JPH10513362 A JP H10513362A JP 8524449 A JP8524449 A JP 8524449A JP 52444996 A JP52444996 A JP 52444996A JP H10513362 A JPH10513362 A JP H10513362A
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Abstract

(57)【要約】 異種ポリペプチドリンカーにより結合された少なくとも2つのポリペプチドモノマー(アミノ酸鎖)を含み、そして生体活性である、融合タンパク質(例えば、生体活性IL-12ポリペプチド)、およびその生産を記載する。この融合タンパク質を発現するように形質導入された腫瘍細胞および確立された腫瘍によって特徴付けられる疾患を処置する方法もまた記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 生体活性な融合タンパク質および先在する腫瘍の治療 関連出願 本出願は、米国特許出願第08/385,335号(1995年2月8日出願)の一部継続出 願であり、その技術は本明細書中に参考として援用される。発明の背景 治療用タンパク質(例えば、二量体である治療用タンパク質)の産生は、しば しば困難であり、効率が悪く、そして費用がかかる。二量体の産生には、2つの 成分を別々に発現させ、続いてこれらの成分を結合して機能的な二量体を形成さ せることが必要とされ得る。機能的な二量体タンパク質の別の産生方法が有効で ある。発明の要旨 本発明は、ポリペプチドリンカーを通して結合した少なくとも2つのポリペプ チド単量体(アミノ酸鎖)を含み、生体活性である融合タンパク質、ならびにそ の産生に関する。1つの実施態様において、本発明の生体活性な融合タンパク質 は、対応する生体活性な天然の二量体タンパク質においてサブユニットまたは単 量体として生じ、ならびに異種のアミノ酸残基(このアミノ酸残基は天然のタン パク質において2つのサブユニットの間には存在しない)を介して結合する2以 上のポリペプチドを含む。自然に存在するように、サイトカインIL-12は、40kDa サブユニット(p40)が35kDaサブユニット(p35)にジスフィルド結合により結合さ れて精製されるヘテロ二量体である。Gillessen,S.ら、Eur.J.Immunology,25:20 0-206(1995);Ozmenら、J.Exp.Med.,180:907-915(1995);Heinsel ら、Inf .& Imm un. ,62(10):4244-4249(1994)。例えば、融合タンパク質は、ポリペプチドリンカ ーにより結合されたp35およびp40と称される2つのサブユニットを含む生体活性 なインターロイキン-12(IL-12)融合タンパ ク質である。さらなる実施態様において、この融合タンパク質は、ペプチドリン カーにより結合された他の二量体造血増殖因子のサブユニットを含むか、または ペプチドリンカーにより結合された他の二量体サイトカインタンパク質のサブユ ニットを含む。別の実施態様において、生体活性な融合タンパク質は、天然の形 態において生体活性な単量体(例えば、インターロイキン-2、GMCSF)であり、 そしてポリペプチドリンカーを介して結合されて天然のタンパク質では共には生 じない、少なくとも2つの成分またはサブユニットを含む点では天然においてキ メラまたはハイブリッドである融合タンパク質(例えば、インターロイキン-2 /GMCSF融合タンパク質)を産生する2つのサブユニットを含む。 本発明はまた、本発明の融合タンパク質、それらの産生に有用な構築物、およ びコードされた融合タンパク質が発現される構築物を含む宿主細胞を作製する方 法に関連する。本発明の融合タンパク質は、適切な発現系において(例えば、適 切な宿主細胞(例えば、哺乳動物細胞)内で、所望の融合タンパク質のサブユニ ットまたは単量体およびポリペプチドリンカーをコードするDNAを含有しそして 発現するレトロウイルスベクターにより)発現される。本発明は、さらに、本発 明のIL-12融合タンパク質を分泌するように形質導入された細胞、特に、IL-12融 合タンパク質を分泌するように形質導入された腫瘍細胞に関する。本発明は、ま た、形質導入された腫瘍細胞の使用(特に腫瘍の処置における)に関連する。 本発明の融合タンパク質は、対応する天然のタンパク質と同じ目的(例えば、 治療または診断使用)について有用である。例えば、IL-12融合タンパク質は、 キラー細胞で活性化されるNK/リンフォカインの溶解活性を増強し、活性化され たヒトT細胞およびNK細胞に対する増殖因子として作用し、そして末梢血単核細 胞(PBMC)を休止させることによりIFN-γの産生を刺激するために使用され得る。 IL-12はまた、多様なガンの処置に有用である。例えば、IL-12は抗腫瘍免疫の増 強に有用であり、そして本明細書中で記載するように、天然のIL-12または本発 明のIL-12融合タンパク質のいずれかを分泌する腫瘍細胞は、確立した(establis hed)腫瘍を処置(例えば、腫瘍のさらなる発達を妨げる)するのに使用され得、 確立した腫瘍の退行、生存の延長、またはそれらの組み合わせを生じるのに使用 され得る。融合タンパク質は、本明細書中に記載の方法により効果的 におよび再生可能に作製され得る点で、対応する天然のタンパク質よりも特定の 有利性を有する。さらに、本発明の融合タンパク質はまた、改変されたまたは増 強された活性に関して、対応する天然のタンパク質よりも有利性を有し、より好 ましい生物利用性および改善された薬物動力学を有する。図面の簡単な説明 図1は、インターロイキン-12の産生のためのSFGベースのレトロウイルス構築 物の構造を示す(SD=スプライスドナー;IRES=内部リボゾーム侵入部位;SA= スプライスアクセプター;LTR=長末端反復)。 図2は、本発明のインターロイキン-12融合タンパク質内のリンカー配列をコ ードする核酸配列、およびそれに隣接するIL-12 p35およびIL-12 p40配列(配列 番号1〜4および35)、ならびにコードされたアミノ酸配列(配列番号5〜7お よび36)を示す。 図3A〜3Uは、pUC19-SGFの完全な制限地図および核酸配列(配列番号8および 9)を示す。 図4A〜4Cは、マウスIL-12 p35サブユニットをコードする核酸配列(配列番号10 および11)およびIL-12 p35サブユニットのアミノ酸配列(配列番号12)を示す。 図5A〜5Dは、マウスIL-12 p40サブユニットをコードする核酸配列(配列番号13 および14)およびマウスIL-12 p40サブユニットのアミノ酸配列(配列番号15)を 示す。 図6は、組換えマウスIL-12を用いて作製した標準曲線を示す。 図7A〜7Dは、野生型分泌CMS-5細胞、GM-CSF分泌CMS-5細胞およびIL-12分泌CMS -5細胞でのCMS-5腫瘍所持マウスの免疫療法の効果のグラフ描写を示す。処置を 、腫瘍チャレンジ後7日目(7Aおよび7B)または14日目(7Cおよび7D)のいずれかで 開始した。終点は生存(7Aおよび7C)または腫瘍を有しない生存(7Bおよび7D)のい ずれかであった。腫瘍は、処置されなかった(a)か、またはGM-CSF分泌CMS-5細胞 (b)、IL-12分泌CMS-5細胞(c)、あるいは野生型CMS-5細胞(d)で処置された。 図8は、免疫療法の型による確立されたCMS-5腫瘍の退行の発生率を示すグラ フ描写である。腫瘍を以下のように処置した;1列目は免疫療法を施さなかった ;2列目は野生型腫瘍細胞で処置した;3列目はGM-CSF分泌腫瘍細胞で処置した ;4列目はIL-12分泌腫瘍細胞で処置した。 図9は、全身性IL-12で処置されたマウスにおける腫瘍の退行のグラフ描写で ある。白四角、および黒四角、三角、丸、および菱形は、0.1μg/dの全身性IL-1 2を1週間につき5日、4週間投与して処置された5匹の個々のマウスを表す。 図10A〜10Bは、全身性IL-12投与または未処置(nil)を比較したIL-12分泌CMS-5 細胞での免疫療法から得られた優れた生存性のグラフ描写である。図10Aは、2 ×105個の細胞の腫瘍接種物を用いた結果を示す。図10Bは、4×105個の細胞の 腫瘍接種物を用いた結果を示す。 図11A〜11Bは、確立されたCMS-5腫瘍に対する免疫療法として異なる形態のIL- 12を分泌するCMS-5細胞の効果(マウスの生存率)の比較のグラフ描写を示す。 図11Aは、14日目に開始した処置での2×105個のCMS-5細胞により創始された腫 瘍を用いた結果を示す(2回の実験からプールされた1群あたり20匹のマウス) 。図11Bは、14日目に開始した処置での4×105個のCMS-5細胞により創始された 腫瘍を用いた結果を示す(1群は10匹のマウス)。腫瘍は、処置されなかった (a)か、または野生型CMS-5細胞(b)、GM-CSF分泌CMS-5細胞(c)、天然のIL-12分泌 CMS-5細胞(d)、あるいはIL-12融合タンパク質分泌CMS-5細胞(e)で処置されたか のいずれかであった。 図12A〜12Cは、サイトカイン分泌腫瘍細胞でのB16(メラノーマ)腫瘍の免疫 療法の結果のグラフ例示である。先在する(pre-existing)腫瘍のモデルについ て、腫瘍を4×105個のB16細胞で創始し、そして免疫療法を7日目(図12A)ま たは14日目(図12B)に開始した。チャレンジモデル(図12C)について、5×105個 の放射線照射細胞をワクチンとして14日間投与し、次いで1×106個の細胞で腫 瘍をチャレンジした。腫瘍は処置されなかった(a)か、または野生型B16細胞(b) 、GM-CSF分泌B16細胞(c)、天然のIL-12分泌B16細胞(d)、あるいはIL-12融合タン パク質分泌B16細胞(e)で処置されたかのいずれかであった。 図13A〜13Bは、先在する腎臓細胞ガン腫(RENCA)腫瘍を有するマウスにおける 異なる細胞型によるIL-12送達の免疫療法に対する効果のグラフ例示である。図1 3Aは、RENCA腫瘍が、放射線照射された野生型CMS-5腫瘍細胞(c-wt)または天然の IL-12(C-nIL-12)またはIL-12融合タンパク質(C-scIL-12)分泌ように形質導入さ れた、CMS-5腫瘍細胞のいずれかで処置された場合の結果を示す。図13Bは、RENC A腫瘍が、野生型CMS-5とRENCA細胞との組み合わせ(c-wt+R-wt)か、IL-12融合タ ンパク質分泌RENCA細胞と野生型CMS-5細胞との組み合わせ(C-wt+R-IL-12)、また はIL-12融合タンパク質分泌CMS-5細胞と野生型RENCA細胞との組み合わせ(C-IL-1 2+R-wt)のいずれかで処置された場合の結果を示す。 図14A〜14Bは、IL-12融合タンパク質分泌RENCA腫瘍細胞での先在するCMS-5腫 瘍の免疫療法に対する効果のグラフ描写である。図14Aは、CMS-5腫瘍が、野生型 RENCA細胞またはIL-12融合タンパク質分泌ように形質導入されたRENCA細胞のい ずれかで処置された場合の結果を示す。図14Bは、CMS-5腫瘍が、野生型RENCA細 胞と野生型CMS-5との組み合わせ(c-wt+R-wt)、IL-12融合タンパク質分泌RENCA細 胞と野生型CMS-5細胞との組み合わせ(C-wt+R-IL-12)、またはIL-12融合タンパク 質分泌CMS-5細胞と野生型RENCA細胞との組み合わせ(C-IL-12+R-wt)のいずれかで 処置された場合の結果を示す。発明の詳細な説明 本明細書中には、介在アミノ酸リンカーに連結されるか、またはそれに結合し た少なくとも2つのサブユニットを含む生体活性融合タンパク質、この生体活性 融合タンパク質を産生する方法、宿主細胞内で発現され得るこの融合タンパク質 を産生するために有用な構築物、およびこの構築物を含む宿主細胞が記載される 。 1つの実施態様において、本発明の生体活性融合タンパク質は、以下のものを 含む:1)特定の生体活性を有する天然の二量体タンパク質中に存在するポリペ プチドサブユニットに対応する少なくとも2つのポリペプチドサブユニットまた は一量体、および2)得られる融合タンパク質が生体活性である様式で、これら のサブユニットを結合する少なくとも1つのポリペプチドリンカー。得られる融 合タンパク質が二量体(2つのサブユニットまたは一量体を含む)である場合、 この2つの成分は、同一の天然二量体タンパク質(例えば、2つのIL-12サブユ ニット)内に存在するサブユニット;異なる2つの天然の二量体タンパク質内に 存在するサブユニット(例えば、1つのサブユニットはIL-12由来であり、そし て1つのサブユニットはIL-3由来である)、または個々に生体活性である一量体 (例えば、IL-2、GMCSF)であり得る。ポリペプチドリンカーによって結合され る3つ以上のサブユニットを含む多量体融合タンパク質は、例えば、同一の天然 二量体タンパク質内に存在する3つ以上のサブユニット(例えば、3つ以上のIL -12サブユニット)、異なる天然の二量体タンパク質内に存在する3つ以上のサ ブユニット(例えば、2つのIL-12サブユニットおよび1つのIL-3サブユニット )、3つ以上の生体活性な一量体(例えば、3つのIL-2一量体、2つのIL-2一量 体および1つのGMCSF一量体)、または天然の二量体タンパク質に由来するサブ ユニットと生体活性一量体との組み合わせ(例えば、2つのIL-12サブユニット および1つのGMCSF一量体)を含み得る。それぞれの場合において、ポリペプチ ドリンカーは、2つのサブユニットの間に存在する(例えば、その順番は、サブ ユニット-リンカー-サブユニット-リンカー-サブユニットである)。本明細書中 で用いられる用語、サブユニットおよび一量体は、二量体または多量体タンパク 質の成分、および一量体タンパク質の単一の成分をいうために互換可能に用いら れる。本発明の融合タンパク質中のサブユニットの順番は、p35-Linker-p40また はp40-Linker-p35であり得る。いずれの場合も、ポリペプチドリンカーは、2つ のサブユニットの間に配置される。本発明の生体活性融合タンパク質(これは、 同一の天然二量体タンパク質中に存在するサブユニットを含む)は、本明細書中 でその生体活性に関して、対応する天然の二量体タンパク質といわれるものを「 模倣する」か、またはそれに類似するが、この融合タンパク質が対応する天然の タンパク質内に存在しないリンカーアミノ酸残基(異種アミノ酸残基)をポリペ プチドサブユニットの各対の間に含むという点で、対応する天然の二量体タンパ ク質とは異なる。対応する天然のタンパク質は、この融合タンパク質に存在する サブユニットを含み、そしてこの融合タンパク質によっても示される生物学的活 性を示すものである。 例えば、生体活性IL-12融合タンパク質の場合、哺乳動物の天然IL-12タンパ ク質(例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、また はブタのIL-12タンパク質)の2つのサブユニット(p35およびp40と呼ばれる) は、ポリペプチドリンカーを介して結合される。ここで、対応する天然のタンパ ク質は、哺乳動物の天然IL-12タンパク質である。同様に、IL-3のような別の生 体活性融合タンパク質の場合、対応する天然タンパク質はIL-3である。この生体 活性融合タンパク質のサブユニットのアミノ酸残基は、対応する天然のタンパク 質のサブユニットのアミノ酸残基と同じか、または異なり得るが、ただし、得ら れる融合タンパク質は所望の生体活性を示す。例えば、サブユニットは、天然タ ンパク質の対応するサブユニットのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し 得る(すなわち、天然のサブユニットの配列は、1つ以上のアミノ酸残基が欠失 されているか、または天然に存在するアミノ酸残基もしくは天然に存在しないア ミノ酸残基で置換されているか、さらなるアミノ酸残基が挿入されているか、あ るいはアミノ酸残基が修飾されている点で異なり得る)。所望の生体活性は、対 応する天然タンパク質の活性と同様の活性である(例えば、それは、対応する天 然タンパク質の活性からも生じる生理学的応答を引き起こす)。融合タンパク質 の生体活性(例えば、その効果の持続期間、得られる応答の程度)は、対応する 天然タンパク質の生体活性より大きくても小さくてもよい。 融合タンパク質中に存在するポリペプチドリンカーは、得られる融合タンパク 質が所望の生物学的活性を有し、かつ二量体または多量体としてのその完全性を 保持するような様式で2つのサブユニットを結合するのに適切な任意の長さおよ び組成であり得る。リンカーの適切な長さおよび組成は、産生されるべき特定の 融合タンパク質について経験的に決定され得る。一般的に、ポリペプチドリンカ ーは、少なくとも7アミノ酸残基であるが、より短くてもよい(例えば、2〜6 アミノ酸残基)。典型的には、リンカーは、30アミノ酸残基未満の長さである( 例えば、7〜25 アミノ酸残基の長さまたは7〜20アミノ酸残基の長さ)。1つ の実施態様では、ポリペプチドリンカーは、7〜16アミノ酸残基であり、そして 特定の実施態様では、7、11、15、または16アミノ酸残基である。生体活性IL-1 2融合タンパク質の生産において用いられる特定のリンカーを、図2に示し、そ して実施例4に記載する。特定の実施態様において、ポリペプチドリンカ ーは、配列(Gly4Ser)3;(Gly4Ser)3Ser;(Gly4Ser)2Ser;およびGly6Ser によって示され、そしてこれらのリンカーはまた、本発明のIL-12融合タンパク 質に加えて他の融合タンパク質のサブユニットを結合するためにも用いられ得る 。あるいは、他のポリペプチドリンカーが、生体活性IL-12融合タンパク質を産 生するための2つのIL-12サブユニットを結合するのに用いられ得る。 生体活性融合タンパク質をコードするDNAは、cDNAもしくはゲノムDNAであり得 、そして種々の動物、特に哺乳動物由来であり得る。例えば、このDNAはヒト、 マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ブタ、またはフェレット( ferret)のDNAであり得る。このDNAは、完全もしくは全サブユニット(例えば、 完全なIL-12 p35サブユニットおよび完全なIL-12 p40サブユニット)、またはサ ブユニットのフラグメントまたは一部をコードし得るが、ただし、コードされる 融合タンパク質は発現される際に所望の生物学的活性を有する。マウスIL-12 p3 5およびp40サブユニットをコードするDNAの核酸配列を、それぞれ図4および図 5に示す。ヒトIL-12p35およびp40サブユニットをコードするDNAの核酸配列は、 公表されている(Gublerら、Proceedings of the National Academy of Science s ,USA88:4143(1991); 図4A〜4Cおよび5A〜5D)。IL-12 DNAの全て または一部は、本発明のIL-12融合タンパク質を産生するために用いられ得るが 、ただし、コードされる融合タンパク質は生体活性である(IL-12活性を有する )。 哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫の発現系のようなタンパク質を発現するた めに適切な発現系が、本発明の融合タンパク質を発現するために用いられ得る。 例えば、本明細書中に記載するように、哺乳動物宿主細胞内で所望の融合タンパ ク質をコードするDNA(例えば、cDNA)を発現するウイルス(例えば、レトロウ イルス)ベクターが用いられている。本明細書中でも記載されるように、IL-12 のp35およびp40サブユニットならびに介在するポリペプチドリンカー(IL-12融 合タンパク質)をコードするcDNAを含むレトロウイルスが、構築され、そしてパ ッケージング細胞(例えば、BOSC23パッケージング細胞)にトランスフェクトさ れている。標的細胞(例えば、CMS-5線維肉腫細胞株)を、ウイルス含有上清で 感染させ、そして培養した;感染細胞で順化した培地を、インターロイキ ン-2およびコンカナバリン-Aで誘導した脾細胞の増殖バイオアッセイを用いて 、IL-12活性についてアッセイした。BOSC23細胞以外のパッケージング細胞株ま たはプロデューサー細胞株が、融合タンパク質をコードするDNAを含む感染性レ トロウイルスを産生するために用いられ得る。さらに、線維肉腫細胞株以外の標 的細胞(例えば、B16メラノーマまたは腎細胞ガン腫細胞株)が、融合タンパク 質を産生するために用いられ得る。IL-12生体活性は、実施例4に記載のように 、レトロウイルスに感染した細胞において実証可能であった。 特定のレトロウイルスを、IL-12融合タンパク質の発現のために構築し(実施 例1および図1)、そしてレトロウイルスに感染した細胞が、生体活性IL-12融 合タンパク質を産生することを示した(実施例4を参照のこと)。用いられたレ トロウイルスは全て、SFGレトロウイルス骨格(その配列を図3に示す)を含ん だ。pSFG.IL-12.p35およびpSFG.IL-12.p40と呼ばれるベクターは、それぞれ、IL -12 p35サブユニットのcDNAまたはIL-12 p40サブユニットのcDNAを含む。pSFG.I L-12.p35-IRES-p40と呼ばれるベクターは、内部リボゾーム侵入部位配列で分離 される、IL-12 p35サブユニットをコードするcDNAおよびIL-12p40サブユニット をコードするcDNAを含む。pSFG.IL-12.p40-IRES-p35と呼ばれるベクターは、示 されるように、プラスミドpSFG.IL-12.p35-IRES-p40と同じ成分を含むが、二量 体は、逆の順序である。pSFG.IL-12.p35-Linker-p40およびpSFG.IL-12.p40-Link er-p35と呼ばれるベクターは、それぞれ、(Gly4Ser)2Serおよび(Gly4Ser)3S erリンカーによって連結された各IL-12サブユニットをコードするcDNAを含む。p SFG.IL-12.p35-Linker-Δ p40およびpSFG.IL-12.p40-Linker-Δ p35と呼ばれる ベクターは、推定の22アミノ酸リーダー配列をコードする配列が2番目のcDNAか ら欠失された、連結されたcDNAを含む。pSFG.hIL-12.p40.Linker.Δ p35は、IL- 12融合タンパク質のヒト型であり、そして、クローニングの間に発生した欠失に のためにリンカーがより短いことを除いては、マウス型pSFG.IL-12.p40.Linker. Δ p35に類似している(図2、構築物Eを参照のこと)。実施例4に記載するよ うに、IL-12生体活性は、レトロウイルスに感染した細胞からの順化培地中で示 された。 記載のベクターによってトランスフェクトされた、原核生物および真核生物宿 主細胞もまた、本発明によって提供される。例えば、本発明のベクターでトラン スフェクトされ得る細胞には、細菌細胞(例えば、E.coli)、昆虫細胞(バキ ュロウイルス)、酵母、または哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター 卵巣細胞(CHO))が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のIL-12融合 タンパク質を分泌するように形質導入される腫瘍細胞は、特に、本発明において 有用である。 従って、本明細書中に記載する発現ベクターは、他の周知のタンパク質の産生 において用いられる標準の手順を用いて、宿主細胞(真核生物(酵母、トリ、昆 虫、または哺乳動物)または原核生物(細菌細胞)のいずれか)の形質転換、ト ランスフェクト、または形質導入のために使用され得る。同様の手順、またはそ の改変が、微生物手段または組織培養技術により、本発明による組換えタンパク 質を調製するために用いられ得る。例えば、線維芽細胞由来3T3細胞は、本発明 のベクターを用いて形質導入され、本発明のIL-12融合タンパク質を発現し、そ して分泌し得る。本発明のIL-12またはIL-12融合タンパク質を分泌するために形 質導入された細胞は、(例えば、精製のための)このタンパク質または融合タン パク質の有用な供給源であるので、腫瘍細胞および3T3細胞は、本発明の状況に おいて有用である。IL-12またはIL-12融合タンパク質を分泌するために形質導入 された腫瘍細胞はまた、本明細書中に記載されるような抗腫瘍剤としても特定の 有用性を有する。 形質導入されるべき腫瘍細胞は、処置されるべき個体、または別の個体から選 択され得る;さらに、形質導入されるべき腫瘍細胞は、処置されるべき腫瘍の腫 瘍細胞と同じタイプであり得るか、もしくは腫瘍細胞は、処置されるべき腫瘍と は別のタイプであり得る。例えば、CMS-5腫瘍は、本発明のIL-12またはIL-12融 合タンパク質を分泌するCMS-5腫瘍細胞、腎細胞ガン腫(RENCA)腫瘍細胞、B16 腫瘍細胞を用いて処置され得る。あるいは、腫瘍は、同じ細胞タイプまたは異な る細胞タイプのIL-12分泌細胞、IL-12融合タンパク質分泌細胞、および野生型細 胞の組み合わせを用いて処置され得る。例えば、RENCA腫瘍は、野生型のRENCA細 胞とIL-12融合タンパク質分泌CMS-5細胞との組み合わせ、または天然のIL-12分 泌CMS-5細胞とIL-12融合タンパク質分泌RENCA腫瘍細胞との組み合 わせを用いて処置され得る。 本発明はまた、天然のIL12または本発明のIL-12融合タンパク質を発現する形 質導入された腫瘍細胞および腫瘍の処置におけるその使用に関する。すなわち、 IL-12またはIL-12融合タンパク質を発現し、そして分泌する形質転換された腫瘍 細胞は、ガンの処置のため、または確立された腫瘍を処置するための治療剤とし て有用であり、そして腫瘍を退行させる(腫瘍のサイズを減少させるか、もしく は腫瘍の完全な退行を引き起こす)、または確立された腫瘍のさらなる増殖を防 止するための手段を提供する。本明細書中に記載するように、IL-12または本発 明のIL-12融合タンパク質を発現する形質導入された腫瘍細胞は、治療上適切な 用量で投与される動物において、確立された腫瘍の退行、腫瘍の確立の防止、生 存の延長、またはそれらの組み合わせを引き起こす。 例えば、IL-12または本発明のIL-12融合タンパク質を分泌する腫瘍細胞は、薬 学的組成物を調製するために生理学的に受容可能な媒体と共に処方され得る。特 定の生理学的媒体としては、水、緩衝化生理食塩水、ポリオール(例えば、グリ セロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール)、およびデキ ストロース溶液が挙げられ得るが、これらに限定されない。選択された媒体中の 有効成分の最適濃度は、薬剤師に周知の手順により経験的に決定され得、それは 、所望される最終的な薬学的処方物に依存する。IL-12分泌またはIL-12融合タン パク質分泌腫瘍細胞の導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下 、経口、および鼻腔内が挙げられるが、これらに限定されない。天然のIL-12ま たはIL-12融合タンパク質を分泌する腫瘍細胞は、処置されるべき腫瘍の部位も しくはその近傍で、または身体の他の任意の部位で投与され得るが、ただし、IL -12またはIL-12融合タンパク質は、所望の治療的効果(確立された腫瘍の退行、 腫瘍確立の防止、または生存の延長)を引き起こす。本明細書中に記載されるよ うに、腫瘍部位と投与部位との近接は、処置の効力には必ずしも必要ではない。 他の適切な導入法にはまた、補給可能なまたは生体分解性のデバイス、および徐 放性重合体デバイスも含まれ得る。本発明の薬学的組成物はまた、他の薬剤との 組み合わせ治療(combinatorial therapy)の一部として投与され得る。処置レ ジメンは、用量、送達経路、組成物が投与される回数、処置されるべき腫 瘍のタイプ、サイズ、および段階、ならびに処置されるべき個体の年齢、健康状 態、および他の身体的特性に依存する。 本発明の1つの方法では、治療有効量(用量)の形質導入された腫瘍細胞(必 要に応じて、生理学的に適切な培地とともに処方される)が、処置(例えば、サ イズを減少させるか、またはサイズの増大を防止する)されるべき腫瘍を有する 個体に投与される。形質導入された腫瘍細胞はまた、腫瘍の確立を防止するため に治療的に適切な用量で個体に投与され得る。例えば、形質導入された腫瘍細胞 は、抗ガン治療を必要とする個体(例えば、確立された腫瘍を有する個体または 腫瘍の確立が妨げられるべきである個体)に投与され得る。あるいは、本発明の IL-12融合タンパク質は、治療有効用量で個体に直接投与され得る;IL-12融合タ ンパク質は、必要に応じて上記のような生理学的に受容可能な培地と組み合わさ れ得る。 本明細書中に記載するように、抗腫瘍性免疫療法としてのIL-12分泌腫瘍細胞 の効力を、確立された腫瘍の負荷を有するマウスにおいて評価した。免疫原性CM S-5(線維肉腫)および非免疫原性B16(メラノーマ)腫瘍を用いた;RENCA腫瘍 をまた、本明細書中に記載するように用いた。 実施例6〜8に示すように、本明細書中に記載される研究は、14日の確立され た明確なCMS-5腫瘍の免疫療法処置について、IL-12分泌およびIL-12融合タンパ ク質分泌腫瘍細胞での免疫療法が腫瘍の退行を誘導することによって生存を延長 したことを示す。さらに、IL-12分泌腫瘍細胞を用いる免疫療法は、明確な腫瘍 の負荷が、体重の5%よりも多くに分配した場合でさえも腫瘍退行を誘導した。 IL-12は全身に投与される場合、CMS-5腫瘍に対して抗腫瘍活性を有するが、治療 の開始においてより大きな腫瘍の負荷を有するマウスについては、全身のIL-12 治療よりもIL-12分泌腫瘍細胞免疫療法に顕著な生存有利性があった。このこと は、単なる全身のサイトカイン治療よりもむしろ形質導入された腫瘍細胞によっ てIL-12を送達することに有利性があることを示す。IL-12融合タンパク質を発現 するように形質導入された腫瘍細胞(SFG.IL-12.p40.linker.Δ p35)からのデ ータは、マウスおよびヒト形態の融合タンパク質がインビトロバイオアッセイに おいて天然の分子と少なくとも等しい比活性を有することを示している。 本明細書に記載される結果は、IL-12分泌B16細胞ワクチン接種がより後期に確 立されたB16腫瘍の増殖の自然経過を変化させたことを示し、そしてそれらはま た、腫瘍増殖を調節し得る免疫学的機構を増強し得るようであることを示す。IL -12分泌B16細胞は、確立されたB16腫瘍のための免疫療法として有用である。な ぜなら、それらは生存を効果的に延長するからである。これらの結果は、マウス の確立された腫瘍の自然経過を調節し得る誘導可能な生得的な機構が存在し、そ して11-12分泌細胞がそれらを誘導することにおいてGM-CSF分泌細胞よりも強力 であることを示す。これらの結果(以下の実施例でより完全に記載される)は、 IL-12分泌腫瘍細胞が、確立された腫瘍の免疫療法として有効性を有することを 示す。 本発明は、以下の実施例によって説明されるが、これらは決して限定されるこ とを意図しない。実施例1 プラスミドの構築 これらの研究で用いられるプラスミドの一般的な構造を、図1に模式的に示す 。各々の融合タンパク質におけるリンカーの確認した配列を図2に示す。 プラスミドの起源 マウスIL-12 p35およびp40サブユニットに関するcDNAを含有するプラスミド( pBS.IL-12.p35およびpBS.IL-12.p40)は、Hoffmann-La Roche(Nutley,NJ)によ り提供された。本明細書中の塩基対の番号付けは、これらの2つのプラスミドの 挿入物のマップに対応する(図4および図5)。SFGレトロウイルス骨格を含有 するプラスミドは、pSFG-TPA(SFGレトロウイルス中のHindIIIとEcoR1部位との 間にSFGレトロウイルス骨格を有し、そして唯一のNco1部位とBamH1部位との間に 組織プラスミノーゲン活性化因子cDNAを含有するpUCプラスミド)としてDr.Dan Ory(Whitehead Institute,Cambridge,MA)によって提供された。SFGレトロ ウイルス骨格のヌクレオチド配列マップを図3に示す。 プラスミドpSFG.IL-12.p35 IL-12p35 cDNAは、Kozakの規則に従ってACCATGGに至適化された転写の開始ATG を取り囲む配列を有するpBluescriptで提供された。IL-12p35 cDNAフラグメント を、Nco1−EcoR1フラグメントとして切り出した。ここでEcoR1の突出部は、E.co li DNAポリメラーゼ1のKlenowフラグメントを用いて充填されている。このフラ グメントを、T4 DNAリガーゼを用いてpSFGのNco1−BamH1部位に連結した。ここ でBamH1突出部は、E.coli DNAポリメラーゼ1のKlenowフラグメントを用いて充 填されている。得られたプラスミドをpSFG.IL-12.p35と称する。 プラスミドpSFG.IL-12.p40 IL-12p40 cDNAは、pBluescriptで提供された。IL-12p40 cDNAを含有するNco1 −BamH1フラグメントを切り出し、そしてpSFGのNco1−BamH1部位に連結して、pS FG.IL-12.p40を作製した。 SFG に基づくベクターの構築のための一般的なストラテジー IL-12融合タンパク質発現のためのSFGに基づくレトロウイルスベクターを構築 するための一般的なストラテジーは以下の通りである:(Gly4Ser)3リンカーフラ グメントのセンスおよびアンチセンス鎖をコードする2つのオリゴヌクレオチド ならびに連結されるべき連続したIL-12 cDNA配列(粘着連結可能突出部の作製の ための末端配列を有する)を、「PCR-mate」391DNA合成機(Applied Biosystems ,Foster City,CA)を用いて合成した。(Gly4Ser)3リンカーの配列は、Huston ら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85: 5879-5883(1988))の通りである。 完全なIL-12 cDNAを用いた2つの融合タンパク質に関して、オリゴヌクレオチ ドを、第1のcDNAの3’末端の唯一の制限酵素部位中にクローン化されるように 設計した。これにより、第1のcDNAの3’末端が再構築され、そして完全なcDNA およびリンカー配列を含むNco1-Nco1フラグメントが他のcDNAを含有するSFGプラ スミドのNco1部位にクローン化され得るようになった。 クローニングストラテジーは、第2のcDNAの最初の22アミノ酸をコードする66 bpの欠失を有する2つの融合タンパク質についても同様であった。リンカー オリゴヌクレオチドを、融合タンパク質構築物中の第2のcDNAの翻訳塩基の66塩 基対の3’に位置する唯一の制限酵素部位中にクローン化されるように設計した 。このことにより、リンカーに結合される第1のcDNAの3’末端を再構築し、そ して第2のcDNAのコドン23に結合されるリンカーを含むフラグメントが、クロー ニングのために切り出され得るようになった。 プラスミド中のリンカーおよび連続したcDNA領域の配列を、「Sequenase」キ ット(Amersham,Cleveland,OH)を用いて決定した。 プラスミドpSFG.IL-12.p35-linker-p40 オリゴヌクレオチドは以下のようであった:センス、 5'- CCGCC.GGT.GGC.GGT.GGC.TCG.GGC.GGT.GGT.GGG.TCG.GGT.GGC.GGC.GGA.TCT.TCCATG GAGCT-3'(配列番号16);およびアンチセンス、 5'- CCATGGA.AGA.TCC.GCC.GCC.ACC.CGA.CCC.ACC.ACC.GCC.CGA.GCC.ACC.GCC.ACC.GGCG GAGCT-3'(配列番号17)。 これらの2つのオリゴヌクレオチドをアニールさせ、T4ポリヌクレオチドキナ ーゼを用いてリン酸化し、そして仔ウシ腸内ホスファターゼを用いて脱リン酸化 してあるpBS.IL-12.p35のSac1部位に連結した。得られた、IL-12p35 cDNAおよび 正しい方向のリンカーを含有するプラスミドNco1-Nco1フラグメントを切り出し 、そしてpSFG.IL-12p40の脱リン酸化したNco1部位に連結して、pSFG.IL-12.p35- linker.p40(この連結されたフラグメントの正しい方向を、Sac1消化によって示 した)を作製した。 このプラスミドを、IL-12p35cDNAの塩基対601〜618および613〜630に対応する 、以下の2つのプライマーを用いて配列決定した:5'-CAGAGTGAAAATGAAGCT-3'( 配列番号18)および5'-GAAGCTCTGCATCCTGCT-3'(配列番号19)。配列決定は、リ ンカー配列から15bpの喪失を生じるが、インタクトなリーディングフレームを維 持する欠失が、クローニングの間に起きたことを示した。このプラスミド中のリ ンカーの配列を図2に示す。 プラスミドpSFG.IL-12.p40.linker.p35 オリゴヌクレオチドは、センス鎖が 5'-GGGTCCGATCC.GGT.GGC.GGT.GGC.TCG.GGC.GGT.GGT.GGG.TCG.GGT.GGC.GGC.GGA.T CT.TCCATG-3'(配列番号20)であり、;そしてアンチセンス鎖が 5'-GATCCATGGA.AGA.TCC.GCC.GCC.ACC.CGA.CCC.ACC.ACC.GCC.CGA.GCC.ACC.GCC.AC C-GGATCGGACCCTGCA-3'(配列番号21)であった。 これら2つのオリゴヌクレオチドを、アニールさせ、そしてpBS.IL-12.p40のS se83871部位およびBamH1部位に連結した。IL-12p40 cDNAおよび正しい方向のリ ンカーを含む、得られたプラスミドのNco1-Nco1フラグメントを切り出し、そし てpSFG.IL-12p35の脱リン酸化Nco1部位に連結してpSFG.IL-12.p40.linker.p35を 作成した(この連結フラグメントの正しい方向をXcm1消化によって示した)。 このプラスミドを、以下の2つのプライマーを用いて配列決定した:5'-CTATT ACAATTCCTCATG-3'(配列番号22)および5'-GAGGGCAAGGGTGGCCAA-3'(配列番号23 )(これらは、IL-12 p40 cDNAの塩基対997〜1014およびIL-12p35 cDNAの塩基対9 1〜74(アンチセンスプライマー)に対応する)。配列決定により、リンカーの配列 および連続するIL-12 cDNA配列が期待通りであることを確認した。 トランスフェクションおよび発現研究を完了後、続くpSFG.IL-12.p40.linker. p35の制限酵素マッピングにより、pSFG.IL-12.p40.linker.p35は、おそらく、最 終のクローニング工程からのNco1-Nco1フラグメントのコンカテマーを含んでい ることが明らかとなった。 プラスミドpSFG.IL-12.p35.linker.Δp40 オリゴヌクレオチドは、センス鎖が 5'-T.TGC.TGG.AGC.TCC.GCC.GGT.GGC.GGT.GGC.TCG.GGC.GGT.GGT.GGG.TCG.GGT.GGC .GGC.GGA.TCT.ATG.TGG-3' (配列番号24)であり、;そしてアンチセンス鎖が 5'-CACAT.AGA.TCC.GCC.GCC.ACC.CGA.CCC.ACC.ACC.GCC.CGA.GCC.ACC.GCC.ACC.GGC GGAGCTCCAGCAAA-3'(配列番号25)であった。 これら2つのオリゴヌクレオチドを、アニールさせ、T4ポリヌクレオチドキナ ーゼを使用してリン酸化し、そして30塩基対の5’Xcm1-Xcm1フラグメントを切り 出したpBS.IL-12.p40に連結した。得られたプラスミド由来のSac1-Sac1フラグメ ントを切り出し、そしてウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化したpBS.IL -12.p35のSac1部位に連結した(この連結フラグメントの正しい方向をNco1-EcoR1 消化によって示した)。得られたベクターのNco1-EcoR1フラグメントを切り出し( EcoR1突出部を、E.coli DNAポリメラーゼ1のKlenowフラグメントを使用して充 填した)、そしてpSFGのNco1部位およびKlenow充填BamH1部位に連結してpSFG.IL- 12.p35.linker.Δp40を作成した。 このプラスミドを、以下の2つのプライマーを用いて配列決定した:5'-CAGAG TGAAAATGAAGCT-3'(配列番号18)および5'-GAAGCTCTGCATCCTGCT-3'(配列番号19 )(これらは、IL-12 p35 cDNAの塩基対601〜618および613〜630に対応する); ならびに5'-GTCATCTTCTTCAGGCGT-3'(配列番号34)(IL-12 p40 cDNAの塩基対217 〜200に対応するアンチセンスプライマー)。配列決定により、リンカーの配列お よび連続するIL-12 cDNA配列が期待通りであることを確認した。 プラスミドpSFG.IL-12.p40.linker.Δp35 オリゴヌクレオチドは、センス鎖が 5'-CTG.GCC.TGC.AGG.GTC.CGA.TCC-GGT.GGC.GGT.GGC.TCG.GGC.GGT.GGT.GGG.TCG.G GT.GGC.GGC.GGA.TCT-AGG.GTC.ATT.CCA.GTC.T-3'(配列番号26)であり、;そし てアンチセンス鎖が 5'-CTGGAATGACCCT.AGA.TCC.GCC.GCC.ACC.CGA.CCC.ACC.ACC.GCC.CGA.GCC.ACC.GCC .ACC.GGATCGGACCCTGCAGGCCAGAGA-3'(配列番号27)であった。 これら2つのオリゴヌクレオチドを、アニールさせ、T4ポリヌタレオチドキナ ーゼを使用してリン酸化し、そしてウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化 したpBS.IL-12.p35のPflM1部位に連結した。この連結フラグメントの方向をSse8 3871/EcoR1消化によって確認した。得られたプラスミド由来のSse83871-EcoR1フ ラグメントを切り出し(EcoR1突出部を、E.coli DNAポリメラーゼ1のKlenowフラ グメントを使用して充填した)、そしてpSFG.IL-12.p40のSse83871部位およびKle now充填BamH1部位に連結してpSFG.IL-12.p40.linker.Δp35を作成した。 このプラスミドを、プライマー5'-GCAAAGGCGGGAATGTCT-3'(配列番号28)(こ れは、IL-12.p40 cDNAの塩基対960〜977に対応する)を用いて配列決定した。第 2のリンカーコドンの配列は読み取るのが難しかったが、その配列は、アンチセ ンスプライマー5'-AGGAATAATGTTTCAGTT-3'(配列番号29)および5'-CAGCAGTGCAG GAATAAT-3'(配列番号30)(それぞれ、IL-12p35 cDNAの塩基対224〜207および23 3〜216に対応する)を使用して中間プラスミド中にクローン化されたリンカーを 配列決定することによって決定した。配列決定により、リンカーの配列および連 続するIL-12 cDNA配列が期待通りであることを確認した。 プラスミドpSFG.IL-12.p35.IRES.p40およびpSFG.IL-12.p40.IRES.p35 脳心筋炎(encephalomyelocarditis)ウイルス(ECMV)の内部リボソーム侵入部位 (IRES)フラグメントは、Michael Sadelain博士(Whitehead Institute,Cambridg e,MA)より提供を受けた。このフラグメントについては以前に記載されている(G hattasら、Mol.Cell.Biol.11:5848-5859(1991))。実施例2 細胞および組織培養 BOSC23パッケージング細胞(Pearら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8382-8396( 1993))をDirk Lindemann博士(Whitehead Institute,Cambridge,MA)から入手し た。これらを、10%ウシ血清、50U/ml ペニシリン、および50μg/ml ストレプト マイシンを補充したDulbecco改変Eagles培地(DMEM)で継代した。 CMS-5腫瘍細胞(DeLeoら、J.Exp.Med.146:720-734(1977))をJason Salter(Wh itehead Institute,Cambridge,MA)から入手した。これらを、10%ウシ胎児血 清、50U/ml ペニシリン、および50μg/ml ストレプトマイシンを補充したDMEMで 継代した。同じ培地を、CMS-5馴化培地の回収に使用した。 IL-12アッセイ用のC57BL/6脾細胞を、シーブ(sieve;Falcon 2350,Becton Di ckinson,Franklin Lakes,NJ)によって脾臓を細断し、2%ウシ胎児血清を補充 したIL-12培地(Schoenhautら(J.Immunol.148:3433-3440(1992))に記載のよう な)中に細胞を回収することによって得た。実施例3 BOSC23 由来プロデューサー細胞の生成および馴化培地の回収 BOSC23細胞を6cm組織培養皿あたり2×106細胞で播き、そして既に記載され た(Pearら、Proc .Natl.Acad.Sci.USA90:8382-8396(1993))ような種々の 構築物でのCaPO4トランスフェクションによりトランスフェクトした。トランス フエクションの24時間後、培地を5mlの新鮮な培地で置換した。ウイルス含有上 清を24時間後に回収し、0.45μmフィルターを通して濾過し、そしてポリブレン を8μg/mlの最終濃度で添加した。2.5mlのウイルス含有上清を使用してCMS-5細 胞を迅速に4時間感染させ(この感染のための調製において、前日にCMS-5細胞 を6cm組織培養皿あたり5×104細胞で播いた)、そして残りの2.5mlを-70℃で 凍結した。翌日に、凍結した2.5mlのウイルス含有上清を溶かし、そしてCMS-5細 胞の2回目の4時間の感染に使用した。IL-12含有馴化培地を回収するために、 培地を翌日に5mlの新鮮な培地で置換し、これを24時間後に回収した。これらの 馴化培地を0.2μmフィルターで濾過し、IL-12の生体活性についての後のアッセ イのために-70℃で凍結した。5mlの新鮮な培地をCMS-5細胞に添加し、そして24 時間後に2組の馴化培地を回収した。これらをまた、フィルター濾過し、そして 後のアッセイのために凍結した。次いで、感染したCMS-5細胞を溶解し、そして 後の分析のためにゲノムDNAを調製した。実施例4 マウスインターロイキン-12のバイオアッセイ 生体活性インターロイキン-12のレベルを、コンカナバリン-Aおよびインター ロイキン-2でプライムした脾細胞増殖アッセイを用いて、Schoenhautら、(J Immunol.148:3433-3440(1992))に記載されるように決定した。コンカナバリ ンAをBoehringer(Mannheim,Germany)から購入し、そして組換えヒトインタ ーロイキン-2をChiron Therapeutics(Emeryville,CA)から購入した。細胞内 DNAへの[3H]チミジン取り込みを測定するための細胞を回収するために、Skatron (Sterling,VA)細胞回収機およびフィルターマット(filtermat)(#7031)を使 用した。馴化培地における阻害活性をアッセイするために、50μlのサンプル容 量は、1000pg/mlの組換えマウスIL-12および25μlのテストサンプルを含有した 。馴化培地のサンプルを、2連で、1:1〜1:1000の範囲のいく つかの希釈でアッセイした。標準曲線を20〜10,000pg/mlの範囲の組換えマウスI L-12を用いた各バイオアッセイについて作成した。組換えマウスIL-12をHoffman n-La Roche(Nutley,NJ)から得た。テストサンプル中の生体活性IL-12濃度をp g/mlで算出するために、標準曲線の直線部分を、「KaleidaGraph2.1.1」ソフト ウェアのカーブフィット機能、および計算に使用される得られた式を用いて近似 した。馴化培地が、hIL-12免疫反応性を有することを、hIL-12ELISAアッセイ( 従来のキット、R&D Systems)によって確認した。 以下の構築物(図1)を、生体活性であるIL-12融合タンパク質を発現するそ れらの能力について評価した。 A.pSFG.IL-12.p35.linker.p40; B.pSFG.IL-12.p40.linker.p35; C.pSFG.IL12-p35.linker.Δp40; D.pSFG.IL12-p40.linker.Δp35;および E.pSFG.hIL-12.p40.linker.Δp35。 各構築物におけるリンカーの配列は、配列決定によって確認されたように、以 下のとおりであった(いくつかの隣接する確認されたIL-12配列は方向付けのた めに提供される): 模擬トランスフェクトCMS-5細胞、およびSFGレトロウイルス単独で感染させた CMS-5細胞により、またはlac-z遺伝子を有する関連するレトロウイルス(MFG) により馴化された培地中にIL-12生体活性は検出されなかった。しかし、これら の細胞により馴化された培地は、1:2および1:10の希釈において有意な阻害活性 を有し、500pg/mlのrmIL-12の生体活性の95%と同程度の阻害をする(表1、お よび他のデータは示さず)。馴化培地における阻害活性のこのバックグラウンド にも関わらず、生体活性IL-12の産生は、なお検出可能であることが示された。 IL-12タンパク質の単一のサブユニットを発現するための構築物(pSFG.IL-12. p35およびpSFG.IL-12.p40)のそれら自身の生体活性は検出され得なかった。 しかし、これらの構築物の両方を用いたBOSC23細胞の同時トランスフェクション は、感染したCMS-5細胞による生体活性IL-12の分泌をもたらした。同様に、SFG. IL-12.p35レトロウイルスで感染させ、そして24時間後にSFL.IL-12.p40レトロウ イルスで感染させたCMS-5細胞はまた、生体活性IL-12を産生した(表1)。 IL-12サブユニットの両方を発現するようにIRES配列を用いて設計したジシス トロン構築物は、同じレベルの生体活性IL-12産生をもたらした(サザンハイブ リダイゼーション分析により決定された検出不可能なウイルス感染レベルにも関 わらず(以下を参照のこと))(表1)。IRES含有レトロウイルスの生体活性IL-1 2産生をもたらす能力は、これらの構築物の両方を用いた安定なクローン化レト ロウイルス産生細胞株を生成することにより確認された。 全てのIL-12融合タンパク質構築物は、感染CMS-5細胞により、著しい生体活性 IL-12産生をもたらした。SFG.IL-12.p40linker.Δp35構築物の、IL-12生体活性 が未希釈の馴化培地において検出可能であり(実質的な阻害活性のバックグラウ ンドにも関わらず)、そして1:1000希釈の馴化培地が、301pg/mlのrmIL-12と同 等の生体活性を有することが特に留意される(表1)。全ての構築物は、馴化培 地などにおいて明らかな非特異的阻害活性であるにも関わらず、力価測定可能な IL-12生体活性をもたらした。hIL-12の生体活性は、Hoffman-LaRoche(Nutley, NJ,M.Gatery博士の研究室)において確かめられ、そしてhIL-12融合タンパク 質の特異的活性は、組換え天然ヒトIL-12の特異的活性にほぼ等しいことが決定 された。 これらのデータは、IL-12アゴニスト活性が、融合タンパク質レトロウイルス 構築物を用いて感染させた細胞による馴化された培地中に存在したことを示す。 これは、分泌されたそれぞれの融合タンパク質の生体活性からもたらされると想 像される。 融合タンパク質が存在することをウェスタンブロッティングを用いて示した。 野生型CMS-5細胞、または天然IL-12もしくはIL-12融合タンパク質(SFG.IL-12.p 35.IRES.p40またはSFG.IL-12.p40.linker.Δp35)を発現するCMS-5細胞から血清 を含まないCMを回収し、フィルター濾過(0.2μm)し、そして-70℃で保存した 。CMを20〜30倍に濃縮し、そして20μgの総タンパク質サンプルを10%のβ-メ ルカプトエタノールを含むかまたは含まない10%ポリアクリルアミドゲル上で泳 動した。一次抗体は、ポリクローナルヤギ抗-rmIL-12抗体であった(D.Presky ,Hoffman-La Roche,NJにより譲り受けた)。「ルネサンス(Renaissance)」検 出システム(NEN Dupont)を使用した。予備分析は、1本鎖IL-12(SFG.IL-12.p 40.linker.Δp35)融合タンパク質を含有するCMからもたらされる4倍より強い シグナルを示し、それ故に、このCMに由来する5μgの総タンパク質サンプルが ロードされたことを示した。コントロールレーンは、50ngのrmIL-12を用いてス パイク(spike)していないか、またはスパイクした野生型細胞由来のCMであった 。実施例5 感染CMS-5細胞に由来するゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーション 分析 感染CMS-5細胞の母集団由来のゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーション分析 を行い、予想される構造のレトロウイルスによるこれらの細胞の感染に一致する ハイブリダイセーションバンドの存在を示し、そしてウイルス感染の効果を決定 した(ゲノムのレトロウイルスコピー数の決定による)。 ゲノムDNAのこれらのNheI消化物から、SFGのNcoI-BamHI部位にクローン化され た挿入断片の大きさを加えた、985bpのハイブリダイズしているレトロウイルス 由来のバンドを予想した(図1を参照のこと)。種々のクローニングフラグメン トの大きさは以下のとおりである:IL-12.p35 cDNAは0.6kb;IL-12.p40 cDNAは1.0kb;IRESは0.7kb;linkerは0.05kb;2つの構築物において欠失された 推定リーダー配列は0.066bp。 BOSC23細胞上清は、IRES含有構築物を除く全ての構築物について0.1〜1.4コピ ー/ゲノム(ほとんどは、0.1〜0.3コピー/ゲノム)の間のウイルスコピー数を もたらした。ここで、予想されるサイズ(3.2kb)のハイブリダイズしているバ ンドは見られなかった。 感染細胞のこれらの母集団におけるIL-12融合タンパク質レトロウイルス構築 物についての比較の結果が、特に留意される。pSFG.IL-12.p35.linker.p40レト ロウイルスは1.4コピー/ゲノムで存在したが、これは生体活性IL-12産生の比較 的低いレベルに相当する(表2)。しかし、pSFG.IL-12.p40.linker.Δp35レト ロウイルスは、0.2コピー/ゲノムで存在したが、比較的高いレベルのIL-12生体 活性をもたらした。 実施例6 確立された免疫原性CMS-5腫瘍とGM-CSF分泌腫瘍細胞およびIL-12分泌 腫瘍細胞との免疫療法の比較 サイトカイン分泌腫瘍細胞 CREまたはCRIPパッケージング細胞株により生成されたSFGレトロウイルスを、 腫瘍細胞の形質導入のために使用した。これらの研究で使用した腫瘍細胞による インビトロのサイトカイン分泌量は(ng/ml/48時間/106個の放射線照射した細胞 [10ml中の全てを回収した]):CRIPパッケージSFG.GM-CSFで感染させた細胞は、 B16>250、CMS-5>250;CREパッケージSFGp35.IRES.p40.IL-12で感染させた細胞は 、B16が1〜3、CMS-5が60〜400;CREパッケージSFG.IL-12.p40.linker.Δp35. で感染させた細胞はCMS-5が490〜950;CRIPパッケージングSFG.IL-12.P35.IRES. p40で感染させた細胞は、B16が90;ならびにCRIPパッケージSFG.IL-12.p40.1ink er.Δp35で感染させた細胞は、B16が170およびRENCAが45であった。腫瘍細胞を 放射線照射し、注射後のマウスのさらなる肺瘍の形成を防いだ。そして同じ放射 線照射した細胞についてサイトカイン分泌の特徴を決定した。馴化培地(CM)の GM-CSF濃度をELISA(Endogen,Cambrige)により決定し、そしてIL-12レベルを コンカナバリン-Aおよびインターロイキン-2でプライムした脾細胞増殖に基づ くバイオアッセイにより決定した(Schoenhautら、J .Immunol 148:3433(1992) )。 最初の手順において、線維肉腫腫瘍を、同系のBALB/Cマウスの背中に皮下注射 された2×105個のCMS-5腫瘍細胞を用いて生じさせ、そして免疫療法(放射線照 射した野生型、GM-CSF分泌またはIL-12分泌腫瘍細胞)を7日後または14日後の いずれかで開始した。この実験において、マウスを、1×106個または5×106個の 細胞/投与量のいずれかで、1、2、または3週間の免疫療法投与を受けた5〜 10匹のマウスの複数のグループに分類した。しかし、最初の分析は、他のスケジ ュールの多様性に関わらず、免疫療法に使用した細胞のタイプおよび処置を開始 した日のみにより分類した。 放射線照射したIL-12分泌腫瘍細胞を用いて処置したマウスは、腫瘍攻撃後7 日目または14日目のいずれかで開始した処置スケジュールついては、未処置の マウス、または野生型、もしくはGM-CSF分泌腫瘍細胞で処置したマウスと比較し て、明らかにより長期間の腫瘍が存在しない生存を示した(図7Aおよび7B、 IL-12分泌腫瘍細胞免疫療法との全ての比較についてp<0.05)。免疫療法を腫瘍 の移植の7日後に開始した場合、IL-12分泌腫瘍細胞を用いて処置したマウスの 生存の有利な要因のほとんどは、後期腫瘍の発達を妨げることに起因した(図7 C,log階級(rank)試験による全ての比較についてp<0.05)。免疫療法を腫瘍の 移植の14日後に開始した場合、マウスの生存の有利な要因のほとんどは、形成さ れた腫瘍の退行に起因した(図7C、7D、および8、野生型またはGM-CSF分泌 腫瘍細胞免疫療法を受けたマウスと比較してp<0.005)。IL-12分泌腫瘍細胞免疫 療法を受けたマウスにおいて退行する触知可能な腫瘍の範囲は、平均の直径が1 〜8.5mmであり、そして腫瘍の移植の20〜43日(平均30日)後には触知不可能に なる。1グループあたりの動物数は、それぞれ:7Aおよび7Bは、137、40、4 0、38;ならびに7Cおよび7Dは、18、39、40、40であった。所定のP値は、I L-12分泌細胞と他のグループとの間で最小の差異である。全ての効果を決定する ために、いくつかのスケジュールにより類似の免疫療法細胞を受容したグループ からデータをプールした。 14日目に治療を開始したサブグループの分析は、IL-12分泌腫瘍細胞を用いた 免疫療法による優れた生存が、1×106個のIL-12分泌細胞よりもむしろ5×106個 の投与量(p<0.02)で、1週間より長い免疫療法投与(p=0.1)スケジュールに よりもたらされることを示した。それ故、形質導入した腫瘍細胞を利用するその 後の全ての実験において、免疫療法レジメンは1週間毎に4週間投与されるより 高い細胞投与量を包含する。統計的分析 全ての分析を、マウスをグループへ無秩序に配置した時間において処理する目 的にもとづいて行った。記載した統計は、主要な終点について計算された。他に 記載される場合を除いて、生存の終点における相違は、Wilcoxon rank sum試験 により評価した。生存の分析について、麻酔および処置直後の偶然の死を、一部 削除される事象として処理した。カイ二条試験を用いて無条件の可変性の関係を 測定した。p値が複数のグループ間の比較を要約する場合、最も大きいp値のみ を与える。分析を、Power Macintosch 6100/60コンピューター上のJMPソフトウ ェアを用いて行った。実施例7 IL-12- 誘導腫瘍退行および生存率増進の機構の研究 IL-12分泌腫瘍細胞を用いる免疫療法がより大きな腫瘍負荷に有効であるかど うかを決定するために、腫瘍を4×105個の腫瘍細胞を用いて確立し、2×105個 の細胞と比較して、より高い腫瘍発生率(それぞれ、98/100対83/100の14日目の 触知可能比)、より多いな平均腫瘍サイズ(それぞれ、6.7±3.0対3.7±2.4mmの14 日目での直径)、および処置なしでのより短い生存メジアン(31日対37日)を生じ た。これらのより大きな腫瘍の確立後、14日目からIL-12分泌腫瘍細胞免疫療法 で処置した腫瘍罹患マウスの70%(7/10)は、野生型腫瘍細胞で処置した0/10マウ スと比較して、完全な腫瘍後退を伴って生存した(p≦0.001)。 2×105個のCMS-5細胞によって開始した腫瘍罹患マウスへのIL-12の全身(腹膜 腔内)投与はまた、確立させた腫瘍の退行(図9)および生存率の増進(プラシーボ 処置マウスの0/5と比較して、0.1μg/dで処置したマウスの90日目で4/5)を生じ た。2×105個のCMS-5細胞から確立させた腫瘍を有するマウスについて、腫瘍移 植後の7日目または14日目のいずれかで開始した養生法に関して、0.1μg/dのIL -12用量(4/5生存)は、1μg/d(3/5生存)、0.01μg/d(1/5生存)、および0.001μg /dより優れていた。 従って、IL-12分泌細胞で免疫療法を受けているマウスの腫瘍の退行は、免疫 療法として投与された放射線照射腫瘍細胞部位でのIL-12の局所的放出に依存せ ず、むしろIL-12の全身的な効果に依存することが可能であった。これは、野生 型腫瘍細胞またはIL-12分泌腫瘍細胞のいずれかの免疫療法、およびIL-12、プラ シーボ、または無処置のいずれかでの全身療法を組み合わせた、14日目から開始 する異なるスケジュールを比較することによって評価された。2×105個のCMS-5 細胞で開始した腫瘍を有するマウスにおいて、メジアンおよび全体生存が全身IL -12療法よりもIL-12分泌腫瘍細胞を用いる免疫療法の方が良好であるという傾向 があった(図10A)。この傾向は、4×105個の細胞で開始した腫瘍を用 いたマウスについては統計的に有意であった(図10B、全身IL-12を受けている群( 単独または野生型細胞との組合せのいずれか)対IL-12分泌腫瘍細胞免疫療法を受 けているマウス(単独または希釈物での全身療法のいずれか)を比較してp=0.006) 。より小さく、均等に処理した群(n=10/群、4×105個の細胞で開始した腫瘍)の 比較は、野生型細胞と全身IL-12との組合せ投与は、全身IL-12療法のみと異なる ことなく(p=0.85)、そしてIL-12分泌腫瘍細胞のみを用いたワクチン接種(p=0.04 )、またはプラシーボ全身療法で与えられたワクチン接種(p=0.19)よりも劣るよ うであることを示した。実施例8 IL-12 融合タンパク質の抗腫瘍効果 潜在するCMS-5腫瘍モデルにおいて、IL-12融合タンパク質SFG.IL-12.p.40.lin ker Δp35を発現するCMS-5腫瘍細胞を用いる免疫療法は、天然のIL-12を作製す る腫瘍細胞を用いる療法と同様の効果であった(図11Aおよび図11B)。2×105ま たは4×105個のCMS-5のいずれかで開始した腫瘍を用いるマウスについて、生存 率は、処置なし、あるいは野生型細胞またはGM-CSF分泌細胞での処置のマウスが 40%未満であることと比較して、IL-12のいずれかの形態を分泌するCMS-5細胞で 処置したマウス群の90%より高かった(p≦0.02)。実施例9 GM-CSF 分泌腫瘍細胞およびIL-12分泌腫瘍細胞による、確立した非免 疫原性B16腫瘍の免疫療法の比較 別の腫瘍モデルにおけるIL-12分泌腫瘍細胞を用いる免疫療法の効力を評価す るために、非免疫原性B16メラノーマを研究した。B16腫瘍細胞を形質導入し、90 ng/ml/48時間/106照射細胞での天然のIL-12または170ng/ml/48時間/106照射細胞 での1本鎖IL-12(SFG.IL-12.p40.linker.Δp35)を作製した。B16腫瘍を、4×105 個の細胞で開始し、そして確立した腫瘍の免疫療法は、7日目(25%腫瘍触知可 能性)または14日目(93%触知可能性、平均腫瘍直径5.74±3.23、n=56)のいずれ かで開始した。この手順を31日の追跡後に分析した。この場合、免疫療法として 野生型細胞処置、CM-CSF分泌細胞処置、または未処置のマウスのわずか1/60(2% )が生存した。IL-12分泌細胞で処置したマウスは、比較的、劣っ た全体的な生存を有するにもかかわらず、それらの生存のメジアンは、野生型細 胞で処置したコントロールマウスの生存と比較して、処置を7日目(図12A、24日 対18日、p=0.01)および14日目(図12B、28日対18日、p=0.0005)で開始した場合、 顕著に延長された。同様に、処置を7日目(21日対18日、p=0.08)および14日目(2 4日対18日、p=0.006)で開始した場合、生存のメジアンは、IL-12融合タンパク質 分泌腫瘍細胞を用いる療法で延長された。3/4のシナリオにおいて、IL-12分泌腫 瘍細胞は、GM-CSF分泌細胞よりも優れていた(それぞれ、p値は、0.01、0.14、0 .003、0.02である)。 腫瘍攻撃前のワクチンとして使用される場合、GM-CSF分泌B16細胞の潜在的な 効果により抗腫瘍免疫性を誘導するが、腫瘍確立後に投与される場合、腫瘍成長 にそれらが作用しないとして、IL-12分泌B16細胞およびGM-CSF分泌B16細胞の効 果を、B16腫瘍攻撃モデルにおけるワクチンとして比較した。1〜3ng/ml/48時 間/106照射細胞で天然のIL-12を分泌するIL-12分泌B16細胞を、最初の研究に使 用した。腫瘍移植前のワクチンとして使用した場合、GM-CSF分泌B16細胞は、抗 腫瘍免疫原性を誘導した(図12C、80%の100日生存)。実施例10 処置すべき腫瘍由来の異なる起源の腫瘍細胞によるIL-12送達の免疫 療法的効果 生存における処置すべき腫瘍由来の異なる起源の腫瘍細胞によるIL-12送達の 効果を、腎臓細胞ガン腫(RENCA)腫瘍で評価した。RENCA腫瘍を、4×105個の細 胞で開始し、そして確立した腫瘍の免疫療法を14日目に開始した。1つの手順に おいて、マウスの群を、天然のIL-12または融合タンパク質SFG.IL-12.p40.linke r.Δp35のいずれかを分泌させるために形質導入したCMS-5腫瘍細胞または照射し た野生型CMS-5細胞のいずれかで処置した(図13A)。別の手順において、マウス のさらなる群を、照射CMS-5とRENCA野生型細胞との組合せ、照射野生型CMS-5と 比-12分泌RENCA腫瘍細胞との組合せ、または照射野生型RENCA腫瘍細胞とIL-12分 泌CMS-5腫瘍細胞との組合せで処置した(図13B)。 最初の手順において、天然のIL-12およびIL-12融合タンパク質を分泌するCMS- 5腫瘍細胞の両方を用いる免疫療法は、メジアン生存を延長させた(それぞ れ、p=0.02およびp=0.06のp値)。第2の手順において、照射RENCA腫瘍細胞およ びIL-12分泌CMS-5腫瘍細胞の組合せを用いて処置したマウスは、生存を増加する 傾向を示した。 さらに、CMS-5腫瘍を4×105個の細胞で開始し、そして14日目に確立した腫瘍 の免疫療法を開始した。1つの手順において、確立したCMS-5腫瘍を、天然のIL- 12またはIL-12融合タンパク質SFG.IL-12.p40.リンカー.Δp35のいずれかを分泌 させるために形質導入されたRENCA腫瘍細胞または照射野生型RENCA腫瘍細胞のい ずれかで処置した(図14A)。別の手順において、マウスのさらなる群を、照射CMS -5とRENCA野生型細胞との組合せ、照射野生型CMS-5とIL-12分泌RENCA腫瘍細胞と の組合せ、または照射野生型RENCA腫瘍細胞とIL-12分泌CMS-5腫瘍細胞との組合 せで処置した(図14B)。 最初の手順において、IL-12融合タンパク質を分泌するRENCA細胞を用いる免疫 療法は、野生型RENCA細胞を用いて処置したマウスと比較してマウスの生存を適 度に長くした;その効果は、形質導入RENCA細胞によって送達されたIL-12のより 低い用量と一致した。第2の手順において、IL-12分泌CMS-5細胞と野生型RENCA 細胞との組合せで処置したマウスおよびIL-12分泌CMS-5細胞と野生型RENCA細胞 との組合せで処置したマウスの両方は、野生型RENCAおよび野生型CMS-5細胞を用 いて処置したマウスと比較して、顕著に生存が延長することが示された(p=0.004 およびp=0.04のp値)。等価物 当業者は、日常的な実験以上を用いることなく、本明細書中に記載の本発明の 特定の実施態様に対する多くの等価物を認識するか、または確認し得る。このよ うな等価物は、以下の請求の範囲によって包含されるべきであることを意図する ものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C07K 19/00 C12P 21/02 K C12N 5/10 C12N 5/00 B C12P 21/02 A61K 37/02 ADU //(C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:91) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG ,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN, TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,SZ,U G),UA(AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM ),AL,AM,AT,AU,AZ,BB,BG,BR ,BY,CA,CH,CN,CZ,DE,DK,EE, ES,FI,GB,GE,HU,IS,JP,KE,K G,KP,KR,KZ,LK,LR,LS,LT,LU ,LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO, NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,S I,SK,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US ,UZ,VN (72)発明者 ムリガン,リチャード シー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01773,リンカーン,サンディ ポンド ロード 2

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.IL-12 p35サブユニットをコードするDNA、ポリペプチドリンカーをコードす るDNA、およびIL-12 p40サブユニットをコードするDNAを含むDNAであって、該ポ リペプチドリンカーをコードするDNAが、IL-12 p35サブユニットをコードするDN AとIL-12 p40サブユニットをコードするDNAとの間に位置し、そして該DNAの発現 が、該コードされたポリペプチドリンカーによって結合されているIL-12 p35サ ブユニットおよびIL-12 p40サブユニットを含む、生体活性IL-12融合タンパク質 の産生を生じる、DNA。 2.前記IL-12 p35サブユニットおよび前記IL-12 p40サブユニットが、ヒトまた はマウス起源であり、そして前記ポリペプチドリンカーが、(Gly4Ser)3;(Gly4 Ser)3Ser;Gly6Ser;および(Gly4Ser)2Serからなる群より選択される、請求項1 に記載のDNA。 3.生体活性IL-12タンパク質をコードするDNAであって、該生体活性IL-12タン パク質が、ポリペプチドリンカーによって結合されているIL-12 p35サブユニッ トおよびIL-12 p40サブユニットを含む、DNA。 4.前記ポリペプチドリンカーが、(Gly4Ser)3;(Gly4Ser)3Ser;Gly6Ser;およ び(Gly4Ser)2Serからなる群より選択される、請求項3に記載のDNA。 5.生体活性タンパク質をコードするDNAであって、該生体活性タンパク質は、 対応する天然の二量体タンパク質に存在する2つのサブユニットおよびポリペプ チドリンカーを含み、そして該2つのサブユニットが、該生体活性タンパク質中 で、該ポリペプチドリンカーによって結合されている、DNA。 6.前記ポリペプチドリンカーが、(Gly4Ser)3;(Gly4Ser)3Ser;Gly6Ser;およ び(Gly4Ser)2Serからなる群より選択される、請求項5に記載のDNA。 7.請求項1に記載のDNAによってコードされる、生体活性IL-12融合タンパク質 。 8.請求項2に記載のDNAによってコードされる、生体活性IL-12融合タンパク質 。 9.請求項3に記載のDNAによってコードされる、生体活性IL-12融合タンパク質 。 10.ポリペプチドリンカーによって結合されているIL-12 p35サブユニットお よびIL-12 p40サブユニットを含む、生体活性IL-12タンパク質。 11.前記IL-12 p35サブユニットおよび前記IL-12 p40サブユニットがヒトまた はマウス起源であり、そして前記ポリペプチドリンカーが7から16のアミノ酸 残基である、請求項10に記載の生体活性IL-12タンパク質。 12.前記ポリペプチドリンカーが、(Gly4Ser)3;(Gly4Ser)3Ser;Gly6Ser;お よび(Gly4Ser)2Serからなる群より選択される、請求項11に記載の生体活性IL- 12タンパク質。 13.請求項1に記載のDNAを含む、発現ベクター。 14.レトロウイルスベクターである、請求項13に記載の発現ベクター。 15.SFGベクターである、請求項14に記載の発現ベクター。 16.a)pSFG.IL-12.p35.linker.p40; b)pSFG.IL-12.p40.linker.p35; c)pSFG.IL-12.p35.linker.Δp40; d)pSFG.IL-12.p40.linker.Δp35;および e)pSFG.hIL-12.p40.linker.Δp35 からなる群より選択される、請求項15に記載の発現ベクター。 17.生体活性IL-12タンパク質を生産する方法であって: a)IL-12 p35サブユニットをコードするDNA、ポリペプチドリンカーをコードす るDNA、およびIL-12 p40サブユニットをコードするDNAを含む発現ベクターであ って、該ポリペプチドリンカーをコードするDNAが、IL-12 p35サブユニットをコ ードするDNAとIL-12 p40サブユニットをコードするDNAとの間に位置する、ベク ターを提供する工程; b)該発現ベクターを適切な宿主細胞に導入する工程; c)工程b)より得られる該宿主細胞を、該2つのサブユニットが該ポリペプチ ドリンカーによって結合されている生体活性IL-12タンパク質の産生を生じる、 該発現ベクター中に存在する該DNAの発現に適切な条件下で維持する工程 を包含する、方法。 18.前記IL-12 p35サブユニットおよび前記IL-12 p40サブユニットがヒトまた はマウス起源であり、前記ポリペプチドリンカーが7から16のアミノ酸残基で ある、前記請求項17に記載の方法。 19.前記ポリペプチドリンカーが、(Gly4Ser)3;(Gly4Ser)3Ser;Gly6Ser;お よび(Gly4Ser)2Serからなる群より選択される、請求項18に記載の方法。 20.前記発現ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項17に記載の 方法。 21.前記発現ベクターがSFGベクターである、請求項20に記載の方法。 22.前記SFGベクターが a)pSFG.IL-12.p35.linker.p40; b)pSFG.IL-12.p40.linker.p35; c)pSFG.IL-12.p35.linker.Δp40; d)pSFG.IL-12.p40.linker.Δp35;および e)pSFG.hIL-12.p40.linker.Δp35 からなる群より選択される、請求項21に記載の方法。 23.確立された腫瘍によって特徴付けられる疾患を処置する方法であって、治 療有効用量のIL-12分泌腫瘍細胞を、確立された腫瘍によって特徴付けられる疾 患を有する被験体に投与する工程を包含する、方法。 24.前記処置が、前記腫瘍のサイズの減少、非処置被験体と比較しての該被験 体の生存の延長、またはその両方を生じる、請求項23に記載の方法。 25.前記IL-12分泌腫瘍細胞が、CMS-5腫瘍細胞およびB16腫瘍細胞からなる群 より選択される、請求項23に記載の方法。 26.確立された腫瘍によって特徴付けられる疾患を処置する方法であって、治 療有効用量の、生体活性IL-12タンパク質を分泌する腫瘍細胞を、確立された腫 瘍によって特徴付けられる疾患を有する被験体に投与する工程を包含し、該生体 活性IL-12タンパク質が、ポリペプチドリンカーによって結合されているIL-12 p 35サブユニットおよびIL-12 p40サブユニットを含む、方法。 27.被験体において確立された腫瘍のサイズを減少させる方法であって、治療 有効用量のIL-12分泌腫瘍細胞を、確立された腫瘍を有する被験体に投与し、こ れによって該確立された腫瘍のサイズを減少させる工程を包含する、方法。 28.前記腫瘍のサイズを50%以上減少させる、請求項27に記載の方法。 29.前記確立された腫瘍が、メラノーマ、線維肉腫、または腎臓細胞ガン腫で ある、請求項27に記載の方法。 30.前記IL-12分泌腫瘍細胞が、ポリペプチドリンカーによって結合されてい るIL-12p 35サブユニットおよびIL-12 p40サブユニットを含む生体活性IL-12タ ンパク質を分泌する、請求項27に記載の方法。 31.前記IL-12分泌腫瘍細胞が前記確立された腫瘍と同じタイプである、請求 項27に記載の方法。 32.被験体における腫瘍の確立を防止する方法であって、治療有効用量の、生 体活性IL-12タンパク質を分泌する腫瘍細胞を、該腫瘍の発生後であるが該腫瘍 の確立の前である被験体に投与する工程を包含し、該生体活性IL-12タンパク質 が、ポリペプチドリンカーによって結合されているIL-12 p35サブユニットおよ びIL-12 p40サブユニットを含む、方法。 33.確立された腫瘍を処置するための、IL-12融合タンパク質分泌腫瘍細胞の 使用。 34.前記腫瘍のサイズを減少させる、請求項33に記載の使用。 35.確立された腫瘍を処置するための医薬の製造のための、IL-12分泌腫瘍細 胞の使用。 36.前記IL-12融合タンパク質分泌細胞がCMS-5細胞、B16細胞、または腎臓細 胞ガン腫細胞である、請求項33に記載の使用。 37.前記IL-12融合タンパク質分泌細胞がCMS-5細胞、B16細胞、または腎臓細 胞ガン腫細胞である、請求項35に記載の使用。 38.前記確立された腫瘍が、線維肉腫、メラノーマ、または腎臓細胞ガン腫で ある、請求項33に記載の使用。 39.前記IL融合タンパク質分泌腫瘍細胞が、ポリペプチドリンカーによって結 合されているIL-12 p35サブユニットおよびIL-12 p40サブユニットを含む生体活 性IL-12タンパク質を分泌する、請求項33に記載の使用。 40.被験体において確立された腫瘍を処置する方法であって、治療有効用量の 、ポリペプチドリンカーによって結合されているIL-12p35サブユニットおよびIL -12 p40サブユニットを含む生体活性IL-12タンパク質を投与する工程を包含する 、方法。
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