JP4319227B2

JP4319227B2 - マクロファージ炎症蛋白変種をコードするポリヌクレオチド

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Publication number: JP4319227B2
Application number: JP2007029147A
Authority: JP
Inventors: ジェラード・グレアム; イアン・プラグネル
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 1993-04-19
Filing date: 2007-02-08
Publication date: 2009-08-26
Anticipated expiration: 2024-08-26
Also published as: JP2004203890A; GB9308060D0; US20010010935A1; EP0696321A1; JPH08508884A; JP2005336202A; JP2007181465A; US5936067A; JP3722819B2; WO1994024285A1; US6558925B2

Description

本発明は、幹細胞阻害剤の変種、それをコードするポリヌクレオチド、ならびにその製造方法に関する。

化学療法剤での癌の治療は、体内で分裂している細胞を攻撃し、破壊するように計画されている。よって、かかる治療の副作用は、正常細胞、特に造血系の幹細胞および頭皮ならびに腸に並んでいる上皮幹細胞の破壊である。放射線照射も、かかる細胞に対して同様の破壊を引き起こす可能性がある。

化学療法による癌の治療を改良するためには、細胞周期特異的細胞毒性薬剤からの幹細胞の保護が望ましいであろうということが提案されている。幹細胞阻害剤がすでに開示されており、癌の治療における該阻害剤の使用が記載されている（特許文献１参照）。化学療法を行っている間、該阻害剤を患者に投与して幹細胞を保護することができる。

ＭＩＰＩ−αとしても知られる幹細胞阻害剤（ＳＣＩ）は、大型の自己凝集体を形成し、分子量がＳＣＩ／ＭＩＰＩ−α単量体の濃度に依存する、約８ｋＤのペプチドである（非特許文献１参照）。ＳＣＩ／ＭＩＰＩ−αは、ＰＢＳのごとき生理学的緩衝液中０．１ｍｇ／ｍｌにおいて、生の（native）状態で凝集した場合の分子量が約１００ｋＤであることがわかっている。ＳＣＩ／ＭＩＰＩ−αを約２０〜１００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以下にまで希釈すると、この蛋白は凝集しなくなることがわかっている。

ヒト・ＳＣＩ／ＭＩＰＩ−αは、我々によりクローン化された（非特許文献２参照）。そのｃＤＮＡもクローン化され、ＬＤ７８βと呼ばれている（非特許文献３参照）。非常に類似した配列を有する変種ｃＤＮＡであるＬＤ７８αも見いだされている。それは、わずか４個のアミノ酸残基が異なるだけである。我々によってクローン化されたヒトの該因子のｃＤＮＡおよび蛋白配列を配列番号：１に示す。最初の２７個のアミノ酸はリーダー配列である。成熟蛋白は、残基２８（Ａｌａ）から開始する。ナカオらにより見いだされた変種のアミノ酸配列を配列番号：３に示す。該蛋白のリーダー配列はアミノ酸１個だけ短く、よって、成熟蛋白は残基２７（Ａｌａ）から開始する。我々が研究したネズミ・相同体の配列も知られており、非常に類似したものである（非特許文献４参照）。

単量体のＳＣＩ／ＭＩＰＩ−αは、インビトロおよびインビボにおける幹細胞の増殖を阻害することにおいて、その凝集形態よりも活性があることが報告されている（非特許文献５参照）。ヒトの治療におけるＳＣＩ／ＭＩＰＩ−αの使用に際しては、活性の観点からでなく、信頼性があり、再生産可能な処方を提供するために、単量体蛋白を投与することが望ましいであろう。しかしながら、単量体蛋白を提供するために調製されるＳＣＩ／ＭＩＰＩ−αの低い濃度が実用にはあまりに低すぎるであろう。
国際公開ＷＯ８９／１０１３３号公報グラハム（Graham）ら，１９９０年，ネイチャー（Nature）第３４４巻：４４２頁；ウォルプ（Wolpe）およびセラミ（Cerami），１９８９年，ＦＡＳＥＢＪ，第３巻：２６５６頁グラハム（Graham）ら，１９９２年，グロウス・ファクターズ（Growth Factors）第７巻：１５１〜１６０頁ナカオ（Nakao）ら，１９９０年，モレキュラー・アンド・セル・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）第１０巻：３６４６〜３６５８頁グラハム（Garham）ら，１９９４年，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第２６９巻：４９７４〜４９７８頁マンテル（Mantel）ら，１９９３年，ＰＮＡＳ第９０巻：２２３２頁

かかる事情より、実質的に生の状態の蛋白の活性を保持しているが、それと同様の大型の凝集体を形成しないＳＣＩ／ＭＩＰＩ−α変種、およびそれをコードするポリヌクレオチドを得ることが課題であった。

驚くべきことに、我々は、実質的に生の状態の蛋白の活性を保持しているが、それと同様の大型の凝集体を形成しないＳＣＩ／ＭＩＰＩ−α変種を得ることが可能であることを見いだした。これらの変種は、生の状態のＳＣＩ／ＭＩＰＩ−αよりも何倍も高い濃度において、単量体または小型の集塊（例えば、二量体または四量体）として安定である。よって、生の状態のＳＣＩ／ＭＩＰＩ−αに匹敵する活性を有するそれらの変種については、インビボにおいてそれらは単位重量あたり高い活性を有する可能性がある。

すなわち、本発明は：
（１）幹細胞阻害活性を有し、２９（Ａｓｐ）、４１（Ａｒｇ）、５０（Ａｓｐ）、５３（Ｇｌｕ）、６０（Ｌｙｓ）、６８（Ｌｙｓ）、６９（Ａｒｇ）、７１（Ａｒｇ）、７６（Ａｓｐ）、７９（Ｇｌｕ）、および８０（Ｇｌｕ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までの配列を含むアミノ酸配列を有し、有意には凝集しない蛋白；
（２）配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までのアミノ酸配列を有する蛋白が凝集体として存在する条件下において、四量体、二量体または単量体として存在する（１）記載の蛋白；
（３）２個または３個のアミノ酸置換を含む（１）または（２）記載の蛋白；
（４）（i）ベクター中でプロモーターに作動可能に連結された（１）ないし（３）のいずれか１項記載の蛋白をコードするポリヌクレオチドを、該プロモーターに対して適合性のある宿主細胞にて発現させ；次いで、
（ii）該蛋白を回収する
を特徴とする、（１）ないし（３）のいずれかにおいて定義される蛋白の製造方法；
（５）幹細胞阻害活性を有し、２９（Ａｓｐ）、４１（Ａｒｇ）、５０（Ａｓｐ）、５３（Ｇｌｕ）、６０（Ｌｙｓ）、６８（Ｌｙｓ）、６９（Ａｒｇ）、７１（Ａｒｇ）、７６（Ａｓｐ）、７９（Ｇｌｕ）、および８０（Ｇｌｕ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸９３までの配列を含むアミノ酸配列を有する蛋白；
（６）アミノ酸置換が荷電アミノ酸の消失を引き起こすものである（５）記載の蛋白；
（７）置換が保存的置換である（５）記載の蛋白；
（８）（i）ベクター中でプロモーターに作動可能に連結された（５）ないし（７）のいずれか１項記載の蛋白をコードするポリヌクレオチドを、該プロモーターに対して適合性のある宿主細胞にて発現させ；次いで、
（ii）該蛋白を回収する
ことを特徴とする、（５）ないし（７）のいずれかにおいて定義される蛋白の製造方法；
（９）（i）（１）ないし（７）のいずれか１項にて定義される配列番号：２のアミノ酸配列において変化を起こさせる少なくとも１つの変化を導入するために、該アミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列を修飾し;
（ii）ベクター中でプロモーターに作動可能に連結された該修飾されたＤＮＡを、該プロモーターに適合する宿主細胞中で発現させ；次いで、
（iii）発現により得られた蛋白を回収する
ことを特徴とする、（１）ないし（７）のいずれかにおいて定義される蛋白の製造方法；
（１０）アミノ酸変化が、２９（Ａｓｐ）、４１（Ａｒｇ）、５０（Ａｓｐ）、５３（Ｇｌｕ）、６０（Ｌｙｓ）、６８（Ｌｙｓ）、６９（Ａｒｇ）、７１（Ａｒｇ）、７６（Ａｓｐ）、７９（Ｇｌｕ）、および８０（Ｇｌｕ）の１つまたはそれ以上におけるものである（９）記載の蛋白
を提供する。
さらに本発明は、上で述べた本発明の蛋白をコードするポリヌクレオチド、それを含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明によれば、実質的に生の状態の蛋白の活性を保持しているが、それと同様の大型の凝集体を形成しないＳＣＩ／ＭＩＰＩ−α変種、およびそれをコードするポリヌクレオチドを得ることが可能となり、該変種を用いて幹細胞の増殖により生じる種々の症状を治療および／または予防することができる。

したがって、本発明は、生の状態の形態とは異なる少なくとも１個のアミノ酸の変化を含み、有意には凝集しないが実質的に変化のない幹細胞阻害活性を保持している幹細胞阻害剤蛋白を提供する。該蛋白は、全長の幹細胞阻害剤またはリーダー配列を欠く成熟しプロセッシングされた形態のいずれからなっていてもよい。

さらに本発明は、医薬上許容される担体または希釈剤ならびに所望により他の治療成分と混合された本発明幹細胞阻害剤を含む医薬組成物を提供する。担体は、処方中の他の成分と適合し、それを投与される者に有害でないという意味で「許容される」ものでなくてはならない。

処方は、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、鞘内および硬膜外を含む）投与に適する処方を包含する。便利には、処方を１回分の剤型として提供することができ、処方を製薬の分野においてよく知られたすべての方法によって製造することができる。かかる方法は、１種またはそれ以上の補助的成分を構成する担体と活性成分を混合する工程を包含する。一般的には、活性成分を液体担体と均一かつ十分に混合することにより処方を製造する。

非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝剤、抗細菌剤ならびに処方を対象の血液と等張にする溶質を含有用していてもよい水性ならびに非水性滅菌注射用溶液；および懸濁促進剤および増粘剤を含有していてもよい水性ならびに非水性滅菌懸濁液、さらには化合物を血液成分または１つもしくはそれ以上の器官に送達するように設計されたリポソームまたは他の微粒子系を包含する。適当な液体担体は、ｐＨ７ないし８の間、例えば７．４のリン酸緩衝化セイラインを包含する。処方を１回分または何回分かの容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルに入れて提供してもよく、さらに、使用直前に滅菌担体、例えば、注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵してもよい。

好ましい１回分の処方は、活性成分の１日分の用量、１日分を何回分かに分けた用量、もしくはその適当なフラクションを含有する処方である。

好ましくは、本発明ＳＣＩ／ＭＩＰＩ−１α蛋白処方は０．０５ないし５ｍｇ／ｍｌ、例えば０．１ないし１．０ｍｇ／ｍｌの蛋白を含有する。我々は、当業者による簡単な滴定によりどのような変種の最大溶解度でも決定できるが、本発明変種の溶解度は一様でないということを見いだしている。

さらに本発明は、ヒトまたは動物の身体の治療方法において使用される、かかる蛋白および組成物を提供する。

さらに本発明は、対象に有効量の本発明蛋白または組成物を投与することによる、分裂中または細胞周期を進行中の幹細胞を殺傷しうる因子に曝露されている対象の治療方法を提供する。

化学療法中、または化学療法を行った後、本発明蛋白または組成物で対象を治療してもよい。後者の場合においては、通常、体内から化学療法薬剤が除去されるに十分な期間をおいてからこの治療が行われる。

本発明治療方法を、固形腫瘍または白血病の治療に用いてもよい。白血病の治療の場合には、患者が治療を受けている間、体内から取り出した患者の骨髄試料を治療することができる。本発明組成物の蛋白の存在下において癌細胞を骨髄から除去し、次いで、治療された骨髄を患者に再導入する。

本発明変種蛋白の用量は、治療すべき症状の性質および患者の状態を考慮して、最終的には医師の裁量による。変種蛋白の有効用量は、約１０μｇ／ｋｇ体重ないし約５ｍｇ／ｋｇ体重であり、例えば、約５０ないし約１０００μｇ／ｋｇ、例えば約５００μｇ／ｋｇであってもよい。

我々はさらに、エクスビボ（ex vivo）でサイトカインにより誘発される幹細胞の増加に関する実験において、ＳＣＩ／ＭＩＰＩ−αが始原造血細胞の増加を促進する働きをしうることを見いだした。かくして、患者から取り出した幹細胞集団をエクスビボにおいて増加させる方法に本発明変種蛋白を用いることもできる。その場合、同一患者または別の患者に再導入する前に、かかる幹細胞を、その増殖および数の増加が可能な条件下において増殖因子および本発明変種蛋白と接触させる。かかる方法を骨髄移植法に用いて、提供者から得られる限られた数の初発細胞を移植の前に増加させることができ、あるいは治療の前に患者から骨髄試料を取り出し、治療後に再導入するある種の療法においてかかる方法を用いることもできる。かかる療法は、白血病の治療、または骨髄への損傷が生じうる固形腫瘍をはじめとする他の腫瘍の治療を包含する。適切な活性を生じさせるに必要な変種蛋白の濃度は、約１ないし約１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１０ないし５０ｎｇ／ｍｌであろう。

本発明蛋白または組成物を、幹細胞の増殖により引き起こされる疾患、例えば乾癬の治療に用いてもよい。

好ましくは、本発明蛋白は、例えば１個またはそれ以上の荷電アミノ酸の置換による生の状態の蛋白とは異なる少なくとも１つの変化であって、蛋白上の１つまたはそれ以上の電荷の消失を引き起こす変化を有する蛋白である。

該変化は、欠失または置換もしくは挿入の結果であってもよい。欠失または挿入の場合、生の状態の蛋白と同様の構造を保持するためには塩基１個だけの欠失または挿入が一般的に好ましい。しかしながら、これ以上、例えば２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸の欠失または挿入が可能である。置換の場合、ＡｓｐのＡｓｎへの置換、またはＧｌｕのＧｌｎへの置換のごとき保存的置換が好ましい。２個または３個のアミノ酸の置換が好ましい。

さらに、その幹細胞阻害活性を保持しているが、凝集しにくい傾向を有する生の状態の蛋白のフラグメントも本発明の範囲内である。

好ましくは、蛋白の変化はＣ末端、例えばその最後の２０個またはその最後の１０個のアミノ酸におけるものである。これにはＣ末端の欠失が包含されてもよい。

生の状態の幹細胞阻害蛋白に対する１つ以上の変化があってもよい。例えば、２、３、４または５つの変化があってもよい。

変更されてもよいＭＩＰＩの他の好ましい領域は、配列番号：１のアミノ酸６８と７１との間の推定上のヘパリン結合領域である。我々は、実験により、そしてこの配列を既知のヘパリン結合領域と比較することにより、ＭＩＰＩのこの部分がヘパリン結合活性を有すると結論した。かくして、本発明により変化されてもよい適当なアミノ酸は、６８（Ｌｙｓ）、６９（Ａｒｇ）および７１（Ａｒｇ）のうちの１個、２個または３個を包含する。所望ならば、上記ＭＩＰＩ蛋白のＣ末端領域に対する変化とともに、かかる変化があってもよい。

本発明の好ましい幹細胞阻害蛋白は、配列番号：２または配列番号：３のヒト・蛋白に基づく蛋白である。かかる蛋白の成熟形態、すなわち残基２８以降も好ましい。

配列番号：２または配列番号：３において変更されうる特定のアミノ酸は、正に荷電したいずれかの残基、例えばＬｙｓまたはＡｒｇおよび／または負に荷電したいずれかの残基、例えばＡｓｐまたはＧｌｕである。よって、変更されてもよい配列番号：２の残基は、２９（Ａｓｐ）、４１（Ａｒｇ）、５０（Ａｓｐ）、５３（Ｇｌｕ）、６０（Ｌｙｓ）、６８（Ｌｙｓ）、６９（Ａｒｇ）、７１（Ａｒｇ）、７６（Ａｓｐ）、７９（Ｇｌｕ）、８０（Ｇｌｕ）、８４(Ｌｙｓ)、８７（Ａｓｐ）または９０（Ｇｌｕ）を包含する。変更されうる好ましい配列番号：２の残基は８０（Ｇｌｕ）、８４(Ｌｙｓ)、８７（Ａｓｐ）または９０（Ｇｌｕ）を包含する。それらの位置に対する変化は上記のごときものであってもよい。

存在してもよい変化の組み合わせは、幹細胞阻害蛋白の最終的な２、３、４、５または６個の荷電残基の変化を包含する。ヒト・蛋白の場合、この変化は、位置９０および／または位置７６、７９、８０、８４または８８のうちの１個またはそれ以上の位置における変化を除き、生の状態の蛋白に相当する蛋白を生じる。好ましくは、すべての変化はアミノ酸１個だけの置換である。好ましくは、すべてのかかる置換は保存的変化である。

本発明蛋白を、当該分野で使用可能なすべての手段により製造することができる。下記実施例において、我々は、ネズミ・ＳＣＩｃＤＮＡのＰＣＲプライマーを用いる部位特異的突然変異法を行い、次いで、ベクター中のその修飾ｃＤＮＡを宿主細胞において発現させて蛋白を得ることにより、修飾された幹細胞抑制蛋白を製造した。自体公知の蛋白精製法を用いて蛋白を回収することができる。類似の方法を用いてヒトまたは他の霊長類のＳＣＩを製造してもよい。例えば、ＷＯ８９／１０１３３を参照することにより、あるいは出版された文献を参照することにより、ネズミ・ｃＤＮＡを得てもよい。さらにヒト・ｃＤＮＡを、出版された文献を参照することにより得てもよく、また、配列番号：１のすべてまたは一部分に基づくプローブを用いてクローニングを行って、ＳＣＩＲＮＡを発現する細胞から作成されたｃＤＮＡライブラリー中のＳＣＩｃＤＮＡを同定することもできる。

したがって、さらに本発明は、
（i）ＳＣＩ蛋白のアミノ酸配列において変化を起こさせる少なくとも１つの変化を導入するためにＳＣＩ蛋白をコードしているＤＮＡ配列を修飾し；
（ii）ベクター中でプロモーターに作動可能に連結された該ＤＮＡを、該プロモーターに適合する宿主細胞中で発現させ；次いで、
（iii）該蛋白を回収する
ことを特徴とする本発明蛋白の製造方法を提供する。

詳細には、
（i）上で定義した配列番号：２のアミノ酸配列において変化を起こさせる少なくとも１つの変化を導入するために、該アミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列を修飾し;
（ii）ベクター中でプロモーターに作動可能に連結された該修飾されたＤＮＡを、該プロモーターに適合する宿主細胞中で発現させ；次いで、
（iii）発現により得られた蛋白を回収する
ことを特徴とする本発明蛋白の製造方法を提供する。

上述した、あるいは実施例で説明する部位特異的突然変異法によりＤＮＡを修飾して、そのアミノ酸配列において挿入、欠失または置換を行ってもよい。

ベクターは、１個またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン遺伝子を、哺乳動物ベクターにはネオマイシン耐性遺伝子を有していてもよい。

本発明のさらなる具体例は、上記のごとく修飾された配列番号：１のＤＮＡをはじめとする上記のごとく得られたＤＮＡの複製および発現のためのベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。細胞は、ベクターに適合するように選択され、例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞であってよい。

さらに本発明は、本発明ペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体であって、生の状態のＳＣＩに対する変化を含んでいるエピトープに指向される抗体を提供する。さらに本発明は、かかるモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法を提供する。蛋白またはそのペプチドフラグメントを免疫原として用いる慣用的なハイブリドーマ法により、モノクローナル抗体を製造してもよい。宿主動物、例えば、ラットまたはウサギに本発明ペプチドを接種し、次いで、免疫血清を回収することがらなる慣用的手段により、ポリクローナル抗体を製造することもできる。

いずれの場合にも、抗体を生成させた生の状態のＳＣＩおよび変化したＳＣＩを用いて変化したエピトープを認識する抗体をスクリーニングし、次いで、変化したＳＣＩのみを認識する抗体を同定することにより、変化したエピトープを認識する抗体を同定することができる。

以下の実施例は本発明を説明する。

図１は、ネズミ・ＳＣＩ／ＭＩＰＩ−αを図式的に示したものであり、荷電アミノ酸の位置を示してある。蛋白をコードしているｃＤＮＡに対するプライマーを野生型５'プライマーとともに用いて一連の変化した蛋白（１）〜（３）を製造した。変化した蛋白はすべて保存的変化、すなわちグルタミン酸のグルタミンへの変化および／またはアスパラギン酸のアスパラギンへの変化を有していた。用いたプライマーは以下のとおり：

変種１：

この配列はネズミ・ＭＩＰＩ−α蛋白のＣ末端ＶＱＥＹＩＴＤＬＥＬＮＡ（配列番号：５）をＶＱＥＹＩＴＤＬＱＬＮＡ（配列番号：６）へと変化させる。

変種２：

この配列は、配列番号：５をＶＱＥＹＩＴＮＬＱＬＮＡ（配列番号：８）へと変化させる。
変種３：

この配列は、配列番号：５をＶＱＱＹＩＴＮＬＱＬＮＡ（配列番号：１０）へと変化させる。
変化したｃＤＮＡ分子を融合蛋白発現ベクター中に連結し、変化した蛋白を得た。クロマトグラフィー法および各分子量を推定することにより、３種の変化した蛋白とともに生の状態の蛋白を分析した。
推定分子量は以下のとおり：
生の状態の蛋白１００〜１５０ｋＤ
蛋白（１）３５ｋＤ
蛋白（２）１８ｋＤ
蛋白（３）８ｋＤ

よって、生の状態のＭＩＰＩ−αが凝集蛋白として存在する条件下では、蛋白（１）は四量体として存在し、蛋白（２）は二量体として存在し、蛋白（３）は単量体として存在すると思われる。
標準的方法（プラグネル（Pragnell）ら，ブラッド（blood），１９８８年，第７２巻：１９６頁およびロリモア（Lorimore）ら，１９９０年，リューケミア・リサーチ（Leukaemia Research）第１４巻：４８１頁）を用いて、上記蛋白の生物学的活性を評価し、生物学的に活性があることがわかった。

以下の配列：

および

を用いて２種の３'（カルボキシ末端）プライマーを合成した。
ＢａｍＨＩ認識部位に下線を付してある。
配列番号：１１のプライマーは、配列番号：１のアミノ酸８３から９３までをコードしているが、位置８４のリジン（８４（Ｌｙｓ））がグルタミン（Ｇｌｎ）へ、８８（Ａｓｐ）がＡｓｎへ、９０（Ｇｌｕ）がＧｌｎへと変化している。
配列番号：１２のプライマーは、配列番号：１のアミノ酸７８から９３までをコードしているが、上記の配列番号：１１について説明した３つの変化のほかに、８０（Ｇｌｕ）のＧｌｎへの変化を有している。
上記変化を含んでいるヒト蛋白の変種を製造するために、上記各プライマーを、配列番号：１のアミノ酸２８〜３５をコードしている配列番号：１３

で示されるアミノ末端プライマーとともに用いる。ＮｃｏＩ認識部位に下線を付してある。これは、ネズミ・ＳＣＩ／ＭＩＰＩ−１蛋白の開始部分に対応する。
プライマーをＰＣＲに用いて、上記変化を有する変種の全長クローンを得、変種クローンを発現ベクター中に導入して本発明の凝集していない変種蛋白を得る。上記と同様の方法で変種の活性を試験する。

ネズミ・ＭＩＰＩ−α蛋白の中央部をコードしている内部プライマーを設計した。該内部プライマーは、図１（ａ）に示す３番目と４番目のシステイン残基間の正に荷電した３つの残基のうち２つを点突然変異させる変化を有していた。該プライマーの配列は

であり、ネズミ蛋白の配列：ＦＬＴＫＲＮＲＱＩＣ（配列番号：１５）を
ＦＬＴＮＳＮＲＱＩＣ（配列番号：１６）へと変化させる。
このプライマーおよび野生型アミノ末端プライマーを用い、さらに相補的プライマーを野生型カルボキシ末端プライマーとともに用いて、変異誘発を２つに分けて行った。次いで、該２つの反応生成物を混合し、野生型アミノおよびカルボキシ末端プライマーを用いて全長分子を製造した。その変種の活性も試験する。

本発明によれば、実質的に生の状態の蛋白の活性を保持しているが、それと同様の大型の凝集体を形成しないＳＣＩ／ＭＩＰＩ−α変種、およびそれをコードするポリヌクレオチドを得ることが可能となり、該変種を用いて幹細胞の増殖により生じる種々の症状を治療および／または予防することができる。それゆえ、本発明は生物化学産業、とりわけ医薬品産業において利用することができる。

図１はネズミ・ＳＣＩ／ＭＩＰＩ−αを図式的に示したものである。

Claims

幹細胞阻害活性を有し、
ａ．９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ
ｂ．９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、および８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へ、
ｃ．９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へ、および８４（Ｌｙｓ）から８４（Ｇｌｎ）へ
から選択されるアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までを含み、有意には凝集しない蛋白をコードするポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
ａ．９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ
ｂ．９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、および８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へ、
ｃ．９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へ、および８４（Ｌｙｓ）から８４（Ｇｌｎ）へ
から選択されるアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までを含み、有意には凝集しない蛋白であって、
配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までのアミノ酸配列を有する蛋白が凝集体として存在する条件下において、四量体、二量体または単量体として存在する蛋白をコードするポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、および８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へのアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までを含み、有意には凝集しない蛋白をコードするポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、および８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へのアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までを含み、有意には凝集しない蛋白であって、
配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までのアミノ酸配列を有する蛋白が凝集体として存在する条件下において、四量体、二量体または単量体として存在する蛋白をコードするポリヌクレオチド。
アミノ酸置換が荷電アミノ酸の消失を引き起こすものである請求項１記載のポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
ａ．９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ
ｂ．９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、および８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へ、
ｃ．９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へ、および８４（Ｌｙｓ）から８４（Ｇｌｎ）へ
から選択されるアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸９３までを含む蛋白をコードするポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
ａ．９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ
ｂ．９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、および８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へ、
ｃ．９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へ、および８４（Ｌｙｓ）から８４（Ｇｌｎ）へ
から選択されるアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸９３までを含む蛋白であって、
配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸９３までのアミノ酸配列を有する蛋白が凝集体として存在する条件下において、四量体、二量体または単量体として存在する蛋白をコードするポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、および８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へのアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸９３までを含む蛋白をコードするポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、および８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へのアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸９３までを含む蛋白であって、
配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸９３までのアミノ酸配列を有する蛋白が凝集体として存在する条件下において、四量体、二量体または単量体として存在する蛋白をコードするポリヌクレオチド。
アミノ酸置換が荷電アミノ酸の消失を引き起こすものである請求項６記載のポリヌクレオチド。
請求項１または６のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項１１記載のベクターを含む宿主細胞。
哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞および細菌細胞から選択される請求項１２記載の宿主細胞。
ｐＸＭ、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４およびＰＭＴ２から選択される請求項１１記載のベクター。
ｐＸＭである請求項１４記載のベクター。
哺乳動物細胞である請求項１３記載の宿主細胞。
ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、Ｌ−９２９、３Ｔ３細胞から選択され、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター由来である請求項１６記載の宿主細胞。
ＣＨＯ細胞である請求項１７記載の宿主細胞。
幹細胞阻害活性を有し、
９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へのアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までを含み、有意には凝集しない蛋白をコードするポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へのアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までを含み、有意には凝集しない蛋白であって、
配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までのアミノ酸配列を有する蛋白が凝集体として存在する条件下において、四量体、二量体または単量体として存在する蛋白をコードするポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へのアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸９３までを含む蛋白をコードするポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へのアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸９３までを含む蛋白であって、
配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸９３までのアミノ酸配列を有する蛋白が凝集体として存在する条件下において、四量体、二量体または単量体として存在する蛋白をコードするポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へ、および８４（Ｌｙｓ）から８４（Ｇｌｎ）へのアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までを含み、有意には凝集しない蛋白をコードするポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へ、および８４（Ｌｙｓ）から８４（Ｇｌｎ）へのアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までを含み、有意には凝集しない蛋白であって、
配列番号：２のアミノ酸２８からアミノ酸９３までのアミノ酸配列を有する蛋白が凝集体として存在する条件下において、四量体、二量体または単量体として存在する蛋白をコードするポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へ、および８４（Ｌｙｓ）から８４（Ｇｌｎ）へのアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸９３までを含む蛋白をコードするポリヌクレオチド。
幹細胞阻害活性を有し、
９０（Ｇｌｕ）から９０（Ｇｌｎ）へ、８８（Ａｓｐ）から８８（Ａｓｎ）へ、および８４（Ｌｙｓ）から８４（Ｇｌｎ）へのアミノ酸置換を伴う配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸９３までを含む蛋白であって、
配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸９３までのアミノ酸配列を有する蛋白が凝集体として存在する条件下において、四量体、二量体または単量体として存在する蛋白をコードするポリヌクレオチド。