JP2001503258A - 遺伝子発現および搬送系および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 単一のプラスミドから多数のコード配列の発現を与える、ＤＮＡコード配列を哺乳動物に搬送するためのプラスミド発現系が記載される。また、サイズ、電荷比、およびスーパーコイル型ＤＮＡの比率の有利な特性を有する特定の脂質／ＤＮＡ搬送系、ならびにそのような搬送系を製造し、および治療にまたは免疫アジュバントとして使用する方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子発現および搬送系および用途発明の背景 背景および本発明に関する以下の議論は、読者が本発明を理解する補助として 提供され、本発明の先行技術を記載し、または構成すると認めるものではない。 本発明は遺伝子搬送（delivery）および遺伝子治療に関し、そして哺乳動物内 で真核遺伝子を発現するための新規核酸構築物、発現用の核酸構築物を取りこん だ搬送に適した処方、およびこうした構築物および処方を調製し、そして使用す る方法を提供する。特に、本発明は、治療用核酸を細胞に搬送するプラスミド構 築物、およびサイトカイン活性の調節に関する。さらに、本発明は、これら構築 物を使用する方法、ならびにこれらの構築物を調製する方法に関する。 プラスミドは、遺伝子操作および遺伝子治療に必須な要素である。プラスミド は環状ＤＮＡ分子であり、形質転換により細菌細胞に導入することが可能で、該 細胞中で自律的に複製する。プラスミドは、クローンされたＤＮＡの増幅を可能 にする。細胞増殖中に、20から50のコピー数で存在するプラスミドもあり、タン パク質合成抑制の後、細胞当たり1000ものプラスミドが生成される可能性がある （Suzukiら,Genetic Analysis,p.404,(1989)）。 現在、ウイルスを用いないヒト遺伝子治療法には、治療効果を有する可能性が ある遺伝子をプラスミドにクローンすることが必要である。プラスミドを含有す る大量の細菌宿主を発酵させ、プラスミドＤＮＡを精製して引き続き使用しても よい。プラスミドを用いる、現行のヒト臨床試験は、この方法を利用している（ Recombinant DNA Advisory Committee Data Management Report，December，199 4，Human Gene Therapy 6:535-548）。研究は通常、遺伝子療法プラスミドを設 計し、構築する際、治療用遺伝子および患者においてその発現を調節する要素に 重点を置いている。一般的に、治療用遺伝子および制御要素は、便利でそして容 易に入手可能な現存のクローニングベクターに単純に挿入される。 プラスミド設計および構築は、いくつかの重要な要因を利用する。第一に、プ ラスミド複製起点がプラスミドのコピー数を決定し、これが産生収量を左右する 。より多いコピー数を複製するプラスミドは、既定の量の培養物からのプラスミ ド収量を増加させることが可能であるが、過剰なコピー数は細菌にとって有害で あり、そして望ましくない影響を与える可能性がある（Fitzwaterら，EMBO J．7 :3289-3297(1988);Uhlinら，Mol．Gen．Genet．165:167-179(1979)）。人工的に 構築されたプラスミドは、時に、安定して保持されず、プラスミドを含まない細 胞の集積および産生収量の減少につながる。 プラスミド不含細胞のこの問題を克服するため、抗生物質耐性表現型をコード する遺伝子がプラスミド上に含まれ、そしてプラスミド不含細胞を殺すかまたは 阻害するために、抗生物質が添加される。一般的な使用目的のクローニングベク ターのほとんどは、アンピシリン耐性（β−ラクタマーゼまたはbla)遺伝子を含 む。アンピシリンの使用は、精製ＤＮＡに抗生物質が残存する可能性があり、処 置される患者にアレルギー反応を引き起こす可能性があるため、問題がある可能 性がある。さらに、β−ラクタム抗生物質は、疾患処置に際し、臨床的に重要で ある。抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドが使用される際、潜在的病原体に抗 生物質耐性遺伝子が移行する可能性が存在する。 他の研究では、細菌トランスポゾンTn5由来のneo遺伝子を使用している。neo 遺伝子は、カナマイシンおよびネオマイシンに対する耐性をコードする（Smith ，Vaccine 12:1515-1519(1994)）。本遺伝子は、いくつかのヒト臨床試験を含む 、多くの遺伝子治療研究に用いられてきている（Recombinant DNA Advisory Com mittee Data Management Report，December，1994，Human Gene Therapy 6:535- 548）。耐性が与えられる機構のために、残存抗生物質および潜在的病原体への 耐性の譲渡はβ−ラクタムの場合より問題が少ない可能性がある。 大腸菌（E．coli）などの宿主細菌内のプラスミドの振る舞いに影響する要素 に加え、プラスミドベクターは、真核細胞へのトランスフェクションおよび真核 細胞での発現に影響することもまた示されてきた。ある種のプラスミド配列は、 シス（cis）に置かれた際、真核細胞において真核遺伝子の発現を減少させるこ とが示されている（Petersonら，Mol．Cell．Biol．7:1563-1567(1987);Yoderお よ びGanesan，Mol．Cell．Biol．3:956-959(1983);LuskyおよびBotchan，Nature29 3:79-81(1981);およびLeiteら，Gene 82:351-356(1989)）。プラスミド配列はま た、偶発的に、転写調節タンパク質の結合部位を含むことが示されてきている（ Ghersaら，Gene 151:331-332(1994);TullyおよびCidlowski，Biochem．Biophys ．Res．Comm．144:1-10(1987);およびKushnerら，Mol．Endocrinol．8:405-407( 1994)）。これにより、処置患者において、不適切なレベルの遺伝子発現が引き 起こされる可能性がある。発明の概要 本発明は、機能的組換えコード配列を哺乳動物に搬送する組成物および方法を 提供する。これらの組成物は、組成物が投与される哺乳動物において、コードさ れる遺伝子産物が発現されるような様式で調製されかつ投与される。該コード配 列が治療に効果的な機能を有する分子をコードしていてもよいため、結果として 、これら組成物および方法は、遺伝子治療に有用である。これら組成物には発現 系、搬送系、そしてある種のコード配列が含まれる。該発現系は、複数のコード 配列の協調した発現を提供するよう構築される。 該搬送系は、陽イオン脂質（cationic lipid）、捕脂質（co-lipid）（好まし くは中性脂質）およびＤＮＡ分子の、特に有益な処方である。こうした処方は、 哺乳動物に、例えば肺への搬送により、ＤＮＡ上の１つまたはそれ以上のコード 配列がその哺乳動物で発現されるように投与することができる。 したがって、第一の側面において、本発明は、２つの転写単位を含む組換え真 核遺伝子の発現用プラスミドを提供する。第一の転写単位は、第一の転写調節配 列を有し、該配列は、合成5'非翻訳領域、合成イントロン、第一のコード配列、 および合成3'非翻訳領域／ポリＡシグナルと転写的に連結している。第二の転写 単位は、第二の転写調節配列を有し、該配列は、合成5'非翻訳領域、合成イント ロン、第二のコード配列、および別の合成3'非翻訳領域／ポリＡシグナルと転写 的に連結している。プラスミド上に、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシ ン耐性遺伝子）などの選択マーカーを提供するのは、しばしば有益である。 こうしたプラスミドが遺伝子発現に適した環境に置かれた場合、第一および第 二の転写単位は、コードされた遺伝子産物を両方とも発現するであろう。２つの 遺伝子産物の相対的発現レベルは、関与するプロモーターの強度、および関与す るエンハンサー要素の存在および活性化に著しく依存するであろう。したがって 、好ましい態様において、第一および／または第二の転写調節配列には、サイト メガロウイルス（CMV）プロモーター／エンハンサー配列などのプロモーターエ ンハンサー配列が含まれる。しかし、当業者は、真核細胞における発現に適した さまざまな他のプロモータ配列が知られており、そして本発明の構築物に同様に 使用してもよいことを認識するであろう。 本明細書において、「プラスミド」という用語は、遺伝物質（すなわち核酸） からなる構築物を指す。プラスミドには、挿入されたコード配列が真核細胞にお いて転写されることが可能であるように配置された遺伝子要素が含まれる。好ま しくは、プラスミドはまた、真核宿主細胞内で複製されることも可能であり、そ して該プラスミドを産生するため、おそらく非宿主細胞（例えば原核細胞）内で も複製されることが可能である。また、プラスミドはウイルス核酸由来の配列を 含んでもよいが、こうしたウイルス配列は、該プラスミドのウイルス粒子への取 りこみを引き起こさない。 「発現」という用語は、コード配列にコードされる産物の生物学的産生を指す 。ほとんどの場合、コード配列を含むＤＮＡ配列は転写され、メッセンジャーＲ ＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成する。メッセンジャーＲＮＡは翻訳され、相当する生物 学的活性を有するポリペプチド産物を形成する。しかし、ＲＮＡ産物が相当する 活性を有してもよく、したがって遺伝子産物と見なされるであろう場合もある。 また、発現過程には、イントロンを除くためのスプライシングなどの、ＲＮＡ転 写産物に対するさらなるプロセシング段階、および／またはポリペプチド産物の 翻訳後プロセシングが含まれてもよい。 「転写単位」という用語は、少なくとも１つのコード配列を、転写の開始およ び終止を指示する配列要素と共に含むヌクレオチド配列を指す。しかし、転写単 位は付加的な配列を含んでもよく、該配列には、転写後または翻訳後プロセシン グに関与する配列が含まれてもよい。 「転写調節配列」という用語は、転写的に連結されたコード領域の転写速度を 調節する配列を指す。したがって、該用語には、プロモーター、オペレーター、 およびエンハンサーといった要素が含まれてもよい。特定の転写単位については 、転写調節配列は、少なくともプロモーター配列を含むであろう。この文脈にお いて、「転写的に連結した」とは、転写に適した系において、転写が調節配列の 指示の元で開始され、そしてその調節配列と転写的に連結した配列を通して進行 するであろうことを意味する。好ましくは、その結果生じる転写物中に、その結 果生じる翻訳産物を改変するであろう突然変異は生成されない。 本発明の文脈において、5'非翻訳領域（UTR）、3'UTR／ポリＡシグナルおよび イントロンに関連して、「合成」という用語は、配列が元来、そのタイプの天然 発生遺伝子要素から直接提供されたのではなく、人工的に生成された、すなわち 人により、化学合成によって生成された配列であることを意味する。核酸分子の さまざまな化学合成法が当業者に知られている。こうした合成配列が生成された 後、該配列を他の適切なヌクレオチド配列に連結し、そして生物学的手段により 複製および／または転写されてもよい。こうした合成配列の１つまたはそれ以上 の部分は天然発生配列の部分と同じであってもよいが、一般的には特定の遺伝子 要素にわたる全長配列は、そのタイプの既知の天然発生遺伝子要素とは異なるで あろう。こうした合成遺伝子要素の使用により、その要素の機能的な特性が、望 ましい機能に適するように設計されることが可能となる。 したがって、「合成イントロン」は、元来、天然発生イントロン配列から複製 されるのではなく、そして一般的に天然発生配列を有するものでないであろうが 、通常の転写後プロセシングにおいてＲＮＡ転写物から除去されるであろう配列 を指す。こうしたイントロンを、さまざまな異なる特性を有するよう設計しても よく、特にこうしたイントロンを望ましいスプライシング部位強度および望まし い長さを有するよう設計してもよい。 「コード領域」という用語は、通常の塩基対形成およびコドン用法（codon us age）の関係にしたがって、発現が望まれる特定の遺伝子産物をコードする核酸 配列を指す。したがって、コード配列は、転写調節要素および翻訳開始および終 止コドンとの関係が、適切な長さの転写物が産生され、そして機能的に望ましい 産物を産生するような適切な読み枠で翻訳される結果となるように置かれなけ ればならない。こうしたコード配列は多くの異なるタイプであってもよいが、好 ましくは治療用分子、またはＩＬ-12サブユニットのような治療用分子のサブユ ニットをコードする。 「5'非翻訳領域」、または「5'UTR」は、プロモーター領域より3'側にあり、 そして下流コード配列より5'側にある配列を指す。すなわち、こうした配列は、 転写されるが、翻訳開始コドンより上流にあり、したがってポリペプチド産物の 部分には翻訳されない。こうした5'UTRは、その中にイントロンを有してもよい 。 「合成3'非翻訳領域／ポリＡシグナル」または「3'UTR／ポリＡシグナル」は 、成分ポリペプチドをコードする領域の下流（すなわち3'側）に位置する配列で ある。5'UTRと共に、この領域は転写されるが翻訳されないであろう。真核細胞 での発現では、一般的にポリＡテールの付加を伝達する配列が含まれることが好 ましい。他の合成遺伝子要素と共に、3'UTRは元来、天然発生配列から直接産生 されたものではなく、そして一般的に天然発生UTR要素とは異なる配列を有する 。 本発明の遺伝子構築物において、第一および第二の合成イントロン、第一およ び第二のコード配列、第一および第二の5'UTR、または第一および第二の3'UTRは 、望ましい用途または構築効率または至便性に依存して、同一のまたは異なる第 一および第二の要素を有してもよい。 「サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー配列」は、真核細胞で転 写プロモーターおよび上流エンハンサー配列として機能するサイトメガロウイル ス由来の配列を指す。エンハンサー配列は、関連するプロモーターからの転写が より高い頻度で起こることを可能とする。 「治療用分子」は、疾患または病状を患う哺乳動物に適切に投与された際、薬 理学的活性を有するものを指す。こうした薬理学的特性は、該疾患または病状の 経過または症状への有益な効果と関連すると期待されるものである。治療用分子 の「サブユニット」は、ポリペプチドまたはＲＮＡ分子であり、１つまたはそれ 以上の他の分子と組み合わせて、相当する薬理学的活性を有する複合体を形成す る。こうした複合体の例には、ホモ二量体およびヘテロ二量体、ならびにより多 くの数のサブユニットを有する複合体が含まれる。ヘテロ二量体の特定の例はＩ Ｌ-12であり、ｐ40およびｐ35サブユニットを有する。 「ｐ40サブユニット」は、ＩＬ-12ヘテロ二量体の２つのサブユニットのうち 、大きい方である。したがって、これはｐ35サブユニットと結合してＩＬ-12に 特徴的な活性を有する分子を形成することが可能である。ヒトｐ40は、配列番号 １のアミノ酸配列を有する。当業者は、該分子が、ｐ35と結合した際依然として ＩＬ-12活性を保持しながら、１つまたは２、３のアミノ酸の欠失、挿入または 改変など、この配列からの多くの改変を有しうることを認識するであろう。こう した活性を有する改変分子もまた、ｐ40と見なされる。 逆に、「ｐ35サブユニット」は、ＩＬ-12ヘテロ二量体の２つのサブユニット のうち、小さい方である。ヒトｐ35は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。ｐ 40のように、ｐ35は、その配列から低レルベルの改変を有していても良いが、依 然としてｐ35と見なされる。 本発明のプラスミドにおいて使用されるのに適したコード領域の特定の例は、 ヒトＩＬ-12のｐ40およびｐ35サブユニットをコードする配列である。したがっ て、好ましい態様において、第一および第二のコード領域は、これらの配列のコ ード領域であり、そして好ましくは、5'から3'方向に向け、ｐ40、次にｐ35とい う順序である。 したがって、「ヒトＩＬ-12のｐ40サブユニットをコードする配列」は、通常 の塩基対形成およびコドン用法の関係に基づいて、上記のヒトｐ40サブユニット をコードする核酸配列である。ヒトＩＬ-12のｐ35サブユニットをコードする配 列も同様に定義される。 上記の側面は、別々の転写単位中の２つのコード領域を協調して発現するプラ スミドを記載していたが、本発明はまた、こうした協調発現が単一の転写単位中 に２つのコード配列を有するプラスミドを使用することにより提供されるような プラスミドも提供する。したがって、第二の側面において、本発明は、第一のコ ード配列および第二のコード配列と転写的に連結した転写調節配列を含むプラス ミドを提供する。5'非翻訳領域、第一のコード配列の5'側のイントロン、および 第一のコード配列の3'側であり、そして第二のコード配列の5'側である代 替スプライス部位、ならびに3'非翻訳領域／ポリＡシグナルもまた含まれる。こ うしたプラスミドは２つの異なるｍＲＮＡを提供する。第一のｍＲＮＡは、第一 のコード配列に先行するイントロンが転写後プロセシング中に除去される結果生 じる。このｍＲＮＡには、両方のコード領域が含まれるが、主に第一の（すなわ ち5'側の）コード領域が翻訳される。第二のｍＲＮＡは、代替スプライス部位に おいて、イントロンおよび第一のコード領域がスプライシングにより除去される 結果生じる。したがって、このｍＲＮＡは第二のコード領域のみを含む。この２ つのスプライス部位の強度は、２つのコード配列の適切な発現バランスを与える ように選択することができる。 上記のプラスミドにおけるように、さまざまな特定の遺伝子要素は、合成配列 であってもよい。また、上記のプラスミドにおけるように、好ましい態様におい て、転写調節配列はサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー配列を含 む。やはり好ましい態様において、第一および第二のコード配列は、ヒトＩＬ-1 2のｐ40およびｐ35サブユニットをコードする配列である。 この文脈において、「代替スプライス部位」は、正常なイントロン除去過程が 5'スプライス部位および3'スプライス部位の間のＲＮＡ配列を除去するよう作用 する、ヌクレオチド配列にそった位置を指す。上記のプラスミドは、こうした5' および3'スプライス部位を有する第一のコード配列に先行するイントロンを含む 。しかし、該プラスミドはまた、第一のコード配列および第二のコード配列の間 に位置する第二の3'スプライス部位も含む。したがって、イントロン除去は、第 一のイントロン、または第一のイントロンおよび第一のコード領域のいずれかを 除去することができる。これらの２つの事象の相対頻度は、部分的に、２つの3' スプライス部位の相対強度に依存し、これはこれらの正確なスプライス部位塩基 配列に依存する。 本発明は、単一の転写単位内に２つのコード配列の協調発現を提供するさらに 別のプラスミドを提供する。本プラスミドでは、協調発現調節は翻訳レベルで提 供される。したがって、第三の側面において、本発明は、組換え真核遺伝子を発 現するプラスミドであって、第一のコード配列、ＩＲＥＳ配列、第二のコード配 列、3'非翻訳領域／ポリＡシグナル、およびプロモーターと第一のコード配列と の間のイントロンと転写的に連結した転写調節配列を有する前記プラスミドを提 供する。ＩＲＥＳ配列は、第一のコード配列および第二のコード配列の間にある 。上記の側面のように、好ましい態様において、該転写調節配列には、サイトメ ガロウイルスプロモーターエンハンサー配列が含まれ、または第一および第二の コード配列には、ヒトＩＬ-12のｐ40およびｐ35サブユニットをコードする配列 が含まれる。やはり好ましい態様において、ＩＲＥＳ配列は脳心筋炎ウイルス由 来である。「ＩＲＥＳ配列」は内部リボソーム進入部位である。こうしたＩＲＥ Ｓ配列は、多くの異なるウイルスで記載されている。こうしたＩＲＥＳ配列は、 ＩＲＥＳ配列より3'側のコード領域のキャップに依存しない翻訳を可能にする。 複数のコード領域の協調発現プラスミドに加え、本発明はまた、ヒトＩＬ-12 のヒトｐ40およびｐ35サブユニットをコードする合成コード配列も提供する。し たがって、別の側面において、本発明は、ヒトＩＬ-12サブユニットをコードす る合成ＤＮＡ配列を提供する。こうした合成配列は、天然ヒトＩＬ-12コード配 列と50％未満の同一性を有する。該配列が最適コドン用法を利用していることが 好ましく；好ましくは少なくとも50％、70％または90％のコドンが最適化されて いる。したがって、好ましい態様において、合成ＤＮＡ配列は配列番号３の配列 と、少なくとも80、90、95または99％の配列同一性を有する。より好ましい態様 において、該ＤＮＡは、配列番号３または４の配列と同一の配列を含む。したが って、これらの合成コード配列は、ヒトｐ40 ＩＬ-12サブユニットをコードする 。 同様に、好ましい態様において、本発明はヒトｐ35 ＩＬ-12サブユニットをコ ードする合成ＤＮＡ配列を提供する。該配列は配列番号７の配列と、少なくとも 80、90、95または99％の配列同一性を有する。より好ましい態様において、該合 成ＤＮＡ配列は、配列番号７または８の配列と同一の配列を含む。 遺伝子発現のためのコード配列の搬送には、一般的に搬送組成物を提供するの が有用である。こうした組成物は、例えばＤＮＡの完全性（integrity）を維持 し、該ＤＮＡの細胞への取りこみを増強することを補助することが可能である。 したがって、別の側面において、本発明は哺乳動物にＤＮＡを搬送する組成物で あって、陽イオン脂質と、好ましくは中性電荷を有する捕脂質を含み、これらの 脂質 は約800ナノメートル（ｎｍ）の押し出し成形（extrusion）サイズを有するリポ ソームとして調製されたもの、およびコード配列を有する相当量のＤＮＡを含む 、前記組成物を提供する。 ＤＮＡの形態が発現効率に影響することから、ＤＮＡのほとんどの割合がスー パーコイル型であることが好ましい。したがって、好ましい態様において、組成 物中のＤＮＡの少なくとも80、90、または95％はスーパーコイル型である。 陽イオン脂質とＤＮＡとの電荷比（charge ratio）もまた重要な因子であるた め、好ましい態様において、ＤＮＡおよび陽イオン脂質は負対正の電荷比が約1: 3であるような量で存在する。好ましくはあるものの、当該比が1:3である必要は ない。したがって、好ましくは、組成物の負対正の電荷比は、約1:1.5および1:2 0の間であり、より好ましくは約1:2および1:6の間である。 別の好ましい態様において、組成物はまた、哺乳動物細胞におおよそ等張であ る炭水化物溶液も含む。より好ましくは該炭水化物は、約10％のラクトースを含 む。また、好ましい態様において、陽イオン脂質はＤＯＴＭＡであり、そして中 性捕脂質はコレステロールである。ＤＯＴＭＡは、1990年１月30日に発行され、 本明細書に援用されるEppsteinらの米国特許第4,897,355号に記載されそして論 じられている。 「陽イオン脂質」という用語は、生理学的なpHで正味の正電荷を有し、そして 好ましくはこうしたpHで負の電荷を持たない脂質を指す。こうした脂質の例はＤ ＯＴＭＡである。同様に、「中性捕脂質」は、生理学的なpHで無電荷の脂質を指 す。こうした脂質の例はコレステロールである。一般的に、捕脂質は中性電荷で あることが好ましいが、ある環境において荷電捕脂質、特に低レベル荷電の脂質 を使用してもよい。 したがって、ＤＮＡおよび陽イオン脂質に関して「負対正の電荷比」とは、陽 イオン脂質の正味の正電荷に比較したＤＮＡの正味の負電荷の間の比を指す。捕 脂質に電荷があるならば、その電荷もまた、該電荷比に含まれる。 密接に関連した態様において、本発明はＤＮＡ分子を搬送するための組成物で あって、中性捕脂質を伴う陽イオン脂質およびコード配列を含む相当量のＤＮＡ を含む前記組成物を提供する。ＤＮＡおよび陽イオン脂質は、負対正の電荷比が 約1:3であるような量で存在する。やはり上記と同様に、スーパーコイル型ＤＮ Ａが、より高い比率であることが好ましい。やはり好ましくは、該組成物には、 等張炭水化物溶液、好ましくは約10％のラクトースが含まれる。再び好ましい態 様において、陽イオン脂質はＤＯＴＭＡであり、そして中性捕脂質はコレステロ ールである。 関連する側面において、本発明は、哺乳動物に搬送するための組成物を調製す る方法であって、搬送されるべきコード配列を含むＤＮＡを調製し、陽イオン脂 質および中性捕脂質を含む、成形サイズが約800ｎｍであるリポソームを調製し 、そして負対正の電荷比が1:3であるようにＤＮＡと陽イオン脂質が存在するよ うな量で、ＤＮＡとリポソームを組み合わせることによる、前記方法を提供する 。好ましくは、該コード配列は、治療用分子をコードする。 別の側面において、本発明は哺乳動物の病状または疾患を治療する方法を提供 する。該方法は、ＤＮＡを哺乳動物に搬送するための相当量の組成物を、病状ま たは疾患を患う哺乳動物に投与することを含む。該組成物には治療用分子のコー ド配列を有するＤＮＡ、陽イオン脂質、および中性捕脂質が含まれる。ＤＮＡお よび陽イオン脂質は、結果として負対正の電荷比が約1:3となるような量で存在 する。好ましくは組成物はまた、約10％のラクトース溶液のような、等張炭水化 物溶液も含む。 投与のための組成物を調製するため、超音波噴霧化（ultrasonic nebulizatio n）は適切なエアロゾルを提供するのに効果的な方法を提供する。したがって、 好ましい態様において、組成物はこうした超音波噴霧による投与のために調製さ れる。 治療用コード配列の搬送は、簡便に行って、多くの特定の疾患に対し治療効果 を生じることが可能であると認識されている。例えば、好ましい態様において、 疾患または病状は喘息または癌である。 上記に示されたように、ヒトＩＬ-12は搬送に適した分子である。したがって 、別の好ましい態様において、ＤＮＡは２つのコード配列を含み、一方はヒトＩ Ｌ-12 ｐ40サブユニットをコードし、もう一方はヒトＩＬ-12 ｐ35サブユニット をコードする。こうしたＤＮＡ構築物を含む組成物を使用して、例えば喘息やさ まざ まな癌を含む、多様な疾患を治療することができる。 ＩＬ-12はＤＮＡ免疫化と組み合わせて投与された際、アジュバントとして機 能することも示されている。この用法において、ＩＬ-12は免疫化の免疫系への 作用を高め、それにより生物学的反応を高める。したがって、別の側面において 、本発明は、陽イオン脂質、中性捕脂質およびＤＮＡを含むワクチンアジュバン トを提供する。該ＤＮＡには、ＩＬ-12のｐ40およびｐ35サブユニットをコード する配列が含まれる。陽イオン脂質およびＤＮＡは負対正の電荷比が約1:3であ るように存在する。 本発明はさらに、上記のようにワクチンおよびアジュバントを投与することに より、哺乳動物のワクチンへの免疫学的反応を高める方法を提供する。 本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい態様の説明および請求項より 明らかになるであろう。図の簡単な説明 図１は、単一の転写単位を示す発現プラスミドの図である。該プラスミドは細 菌要素であるカナマイシン耐性遺伝子（kanR）およびプラスミド複製起点を含む 。該プラスミドはまた、真核要素であるCMVエンハンサー／プロモーター、合成 イントロン、合成3'UTR／ポリＡシグナル、および合成5'UTRも含む。 図２は、典型的発現系のために構築された、合成5'UTR、合成イントロン、お よび合成3'UTR／ポリＡシグナルを取りこんだ典型的転写単位のさらなる特徴を 示す拡大図である。 図３は、ＩＬ-12発現に用いられる４つのプラスミドの構築戦略を図示してい る。パネルＡは２つのプラスミド配置を示す。パネルＢは、間に内部リボソーム 進入部位（ＩＲＥＳ）を持つ２つのコード領域を有するプラスミド構築物を示す 。パネルＣは、代替ＲＮＡスプライシングを有し、２つの異なるｍＲＮＡを産生 するプラスミド構築物を示す。パネルＤは、別々に転写される遺伝子を２つ含む プラスミドを示す。図中、CMVエンハンサー／プロモーターにより特定される転 写開始部位は白抜きの矢印で示し、そしてポリＡ部位は下向きの矢印で示した。 各遺伝子は図１に記載される合成転写後要素、すなわち、合成イントロン（細 線）、合成5'UTR（一緒にスプライスされる5'端の黒い太線）、および合成3'UTR ／ポリＡシグナル（3'端の黒い太線）を含む。pIN0744中のＩＲＥＳ要素およびp IN0745およびpIN0772中の代替3'スプライス部位は内部の黒い太線で示している 。各ｍＲＮＡは、5'端のキャップ（m⁷G）および3'端のポリＡテール（A_n）で示 されている。 図4A−Ｄは、ヒトＩＬ-12 ｐ40サブユニットのアミノ酸配列を、各アミノ酸を コードすることが可能なコドンと共に示している。 図5A−Ｃは、ヒトＩＬ-12 ｐ35サブユニットのアミノ酸配列を、各アミノ酸を コードすることが可能なコドンと共に示している。 図６は、よく発現されるヒト遺伝子中のコドン用法の頻度を示す表である。 図７は、トランスフェクションされたA549細胞によるヒトＩＬ-12の分泌レベ ルを示す。６ウェルプレート中のヒトA549細胞（3x10⁵細胞／ウェル）を、24μ ｇのリポフェクタミンと共に処方した4μｇのプラスミドでトランスフェクショ ンした。トランスフェクションの40時間後、細胞培養上清をＥＬＩＳＡ(R&D Sys tems）によりヒトＩＬ-12ヘテロ二量体に関して検定した。pIN0773は２つの遺伝 子を有する構築物を示し；２つの遺伝子を有する第二の構築物はpIN0774である 。２つの別々のプラスミドのコトランスフェクションはpIN0728/pIN0755により 示されている。代替スプライシング構築物であるpIN0772は、pIN0773のおよそ1/ 4の効率である。他の代替スプライシング構築物はpIN0745であり、ＩＲＥＳ構築 物はpIN0744である。 図８は、点滴注入の48時間後に行われた検定による、ラット肺中のｐＤＮＡ： 脂質処方由来のクロラムフェニコール・アセチルトランスフエラーゼ（CAT）発 現レベルを示す。２つの異なる陽イオン脂質および２つの異なる中性脂質を、２ つの異なる電荷比（負対正が1:3および1:0.5）で使用した。1:3の電荷比のEDOPC :DOPEおよびDOTMA:Cholにより、高レベル発現が達成された。DOPEはジオレオイ ルホスファチジルエタノールアミンを指し、そしてEDOPCはエチルジオレイルホ スファチジルコリンを指す。 図９は、ラット肺におけるCAT発現の用量応答を、CATをコードするプラスミド ＤＮＡを2、10、または50μｇ含む、点滴注入された典型的処方に対する ＤＮＡ量の関数として示す。期待されたように、搬送されるＤＮＡ量が増加する と、発現が増加する結果となった。 図10は、典型的ＩＬ-12処方の効果を評価するのに用いられる、モルモット（G uinea Pig）抗原誘導気道炎症モデル（モルモット喘息モデルとも称される）の 時間表図である。該時間表は、オボアルブミン（OA）注射およびエアロゾルOA攻 撃（challenge）が行われた日を、ＩＬ-12処方投与のタイミングおよび気管支肺 胞洗浄（BAL）細胞数の測定とともに示す。 図11は、３つの異なる投与量のＤＮＡのＩＬ-12処方の投与に応答した総BAL細 胞数の減少、ならびにBAL細胞中の好酸球数の減少を示すグラフである。減少をC ATをコードする処方（pCT0129：脂質）の効果と比較している。ＩＬ-12処方は、 記載されたように２つの転写単位を含む典型的プラスミドを含んだ。好ましい態様の詳細な説明 Ｉ．概論 上記の概要に記載されたように、本発明は２つまたはそれ以上の遺伝子の協調 発現に適した発現系、およびこうした発現系または別の発現系を哺乳動物に搬送 する処方および方法に関する。さらに、特定の遺伝子構築物であって、ヒトＩＬ -12サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む前記構築物が記載される 。こうした構築物は本明細書に記載されるように、本発明の発現系を利用して、 有益に処方され、そして投与することができる。 多くの分子に関して、２以上のコード配列を提供することが必要であるか、ま たは有益である。これは、細胞に複数の発現ベクターをトランスフェクションす ることにより達成してもよいが、細胞の合同トランスフェクション（joint tran sfection）は単一のベクターのトランスフェクションより低い頻度で起こるであ ろう。これは、活性を現すために２以上の型の構成分子の取りこみが必要である 、複数のサブユニットの分子に関して特に重要である。一般的な例では、該分子 は２つまたはそれ以上の異なるポリペプチド鎖を含み、相当する生物学的活性を 生み出すためには、そのすべてが会合していなければならない。しかし、合同ト ランスフェクションの難しさは、多価プラスミド発現系を用いることによ り、排除することが可能である。 １つのプラスミドからの複数コード配列の合同発現は、多くの方法により達成 することが可能である。これらには、別々のプロモーターの調節下にある複数の 転写単位の使用が含まれる。プロモーターの相対強度は、プラスミドの構築前に 選択し、異なる産物の発現レベルを適切なバランスで提供することが可能である 。 こうしたプラスミドを簡便に産生するために、一般的に、該プラスミドの細胞 内での高コピー数複製が可能であることが好ましい。一般的にこうした産生は、 原核細胞で行われ、特に大腸菌細胞が含まれる。したがって、該プラスミドは、 好ましくは原核細胞において機能する複製起点を含み、そして好ましくは該複製 起点は高コピー数の複製を指示するものである。 また、該プラスミド構築物中で合成遺伝子要素を利用することも好ましい。後 述するように、これらの要素は、真核系における転写後プロセシングに影響する 。したがって、合成配列を使用することにより、特定の適用に望ましいようにプ ロセシング特性を設計することが可能になる。通常は、該要素は迅速および正確 なプロセシングを提供するよう設計されるであろう。 望ましい発現産物をコードするＤＮＡを哺乳動物系に搬送するために、通常、 搬送系を利用することが好ましい。こうした系は複数の利点を提供することが可 能であり、特に該ＤＮＡの完全性を保護する安定化を提供すると共に、細胞への 取りこみを補助する。陽イオン脂質：中性捕脂質混合物（例えば、ＤＯＴＭＡ： コレステロール）が、こうした目的に効果的であることが示されてきているが、 他のこうした配合もまた、効果的である。さらに、脂質配合を調製する方法、お よび存在する脂質およびＤＮＡの相対量が、ＤＮＡコード領域からの発現のレベ ルを決定するのに重要なパラメーターであることが立証されている。 本発明の組成物および方法は、非常に多様な産物をコードする遺伝子を、哺乳 動物に搬送するのに有用である。本明細書に記載されるプラスミド構築物上の遺 伝子によりコードされてもよいタンパク質の特定の例には、免疫系に関与するサ イトカインおよび制御タンパク質が含まれる。 免疫系の細胞間の情報伝達に関与する多数の制御タンパク質が同定されている 。これらの中にはコロニー刺激因子類、インターロイキン類、インターフェロン 類、 および腫瘍壊死因子類がある。 インターロイキン12(ＩＬ-12)は、元来、ナチュラルキラー細胞を刺激し、細 胞障害性Ｔリンパ球（CTL）の成熟を促進する因子として同定された。ＩＬ-12は 、マクロファージおよびＢリンパ球により産生される糖タンパク質サイトカイン であり、免疫系の構成要素、特にＴ細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞が関 係するさまざまな生物学的活性を有することが示されている。他の効果の中でも とりわけ、Ｔ細胞およびNK細胞からのIFN-γおよびTFNの産生を誘導し、そして これらの細胞の細胞毒性活性を増強する。ＩＬ-12は細胞媒介性免疫反応の中心 的なメディエーターであることが示されており、したがって、微生物およびウイ ルス感染、ある種の癌、およびアレルギー性喘息を含む、さまざまな場合におけ る免疫反応を刺激する治療用途を有する。 ＩＬ-12は単一のジスルフィド結合により連結したｐ35およびｐ40サブユニッ トからなるヘテロ二量体である。機能的なＩＬ-12ヘテロ二量体を合成するため 、ｐ35およびｐ40の前ポリペプチド（prepolypeptide）は同一の細胞により合成 されなければならない。前ポリペプチドは小胞体／ゴルジ装置によりプロセシン グされ、ヘテロ二量体に組み立てられ、そして機能的分子として分泌される。ｐ 40サブユニットは二量体化することが可能である。こうしたｐ40ホモ二量体はＩ Ｌ-12受容体に非生産的に結合し、それによりＩＬ-12機能を阻害する。II ．プラスミド構築物発現系 Ａ．プラスミド設計および構築 本発明の方法および構築物のため、遺伝子配列の搬送および発現、そして特に ２つの異なるコード配列の協調発現に有用である、多くの異なるプラスミドが構 築された。したがって、これらプラスミドは発現されることが望ましいポリペプ チドのコード領域を、これらのコード領域を発現するのに必要または有用な遺伝 子要素と共に含む。本明細書に記載される典型的な態様において、コード領域は ヒトＩＬ-12の２つのサブユニット（ｐ40およびｐ35サブユニット）をコードす る。 これらの態様は後述の特定の供給源由来のＩＬ-12ｃＤＮＡクローンを利用し て いるが、当業者は容易に、他の供給源からＩＬ-12コード配列を得るか、または 公表されたＩＬ-12サブユニット配列に基づくプローブを用いてライブラリー中 のｃＤＮＡを同定することにより、コード配列を得ることが可能であろう。さら に、本発明のプラスミド構築物はまた、さまざまな他のコード領域の、特に同一 細胞部位での２つのコード領域の発現が望ましい適用における使用にも適してい る。通常、２つのコード領域は異なるであろうが、該領域が同一であって、それ により増加した遺伝子用量を提供してもよい。 ヒトＩＬ-12のｐ35およびｐ40サブユニットのコード配列の供給源は、Gubler ら，1991，PNAS 88:4143-4147に記載されるように、Ueli Gublerにより構築され た全長CLMF ｃＤＮＡクローンであった。これらのコード配列には、ヘテロ二量 体の形成および分泌に必要とされるシグナル配列が含まれる。遺伝子治療に適し た発現プラスミドに取りこむため、該コード配列を、適切な制限酵素部位を持つ プライマーを用いてPCR増幅した。 増幅配列クローンの配列解析により、ｐ35中に点突然変異が見出された。ｐ35 供給源として用いられたプラスミドの配列解析により、同じ突然変異が見出され た。この点突然変異は、Gublerら（1991）に記載された元のｐ35 ｃＤＮＡをPCR 増幅した際に導入されたものらしかった。該突然変異は、UeliGublerより得たPC R増幅の対象となったことがない部分的ｃＤＮＡクローンであるCLMF 35Kdサブユ ニットクローン#3と、制限断片を交換することにより修正した。ＤＮＡ配列決定 により修復作業が完全であったことが証明された。 ｐ40およびｐ35の全長ヌクレオチドおよびアミノ酸配列が知られているため、 ＩＬ-12サブユニットコード配列は、さまざまなルーチン法により得ることが可 能である。例えば、コード配列は、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列のPCR増幅により 得ることが可能である。 ｐ35およびｐ40のコード配列を、図１に図示されるような、真核および細菌遺 伝子要素を含む発現プラスミドに取りこませた。真核遺伝子要素には、CMVエン ハンサー／プロモーター、およびＲＮＡプロセシングの正確さおよび効率、ｍＲ ＮＡの安定性、および翻訳を調節することにより遺伝子発現に影響する、転写後 シグナルの組み合わせ（5'UTR、イントロン、3'ＵＴＲ／ポリＡシグナル） が含まれる。転写後要素はすべて合成であり、合成オリゴヌクレオチドに由来し 、したがって天然遺伝子配列から直接得たものではない。これらの合成要素は、 搬送のためのコード領域を１つしか含まないベクターを含む、多くの異なる発現 ベクターにおいて使用されるのに適しており、したがって、本明細書に記載され る典型的多価プラスミド構築物における使用に限られない。 合成イントロンは、ＲＮＡスプライシングが正確および効率的であることを確 実にするスプライス部位を持つよう設計される。合成3'UTR／ポリＡシグナルは 、ｍＲＮＡ3'端形成およびｍＲＮＡ安定性を容易にするよう設計される。合成5' UTRは翻訳開始を容易にするよう設計される。典型的合成要素の設計は、以下に さらに詳細に記載される。 １．合成要素特徴の概要 後述の、２つの転写単位を持つ典型的プラスミド（pIN0773）の各転写単位は 、図２に図示されるように構成される。合成5'UTR、イントロン、および3'UTR／ ポリＡシグナルは、下記の一般的な特徴を有する。 5'UTR 短い。 二次構造欠如。 コザック配列。 イントロン挿入部位。 イントロン 5'スプライス部位配列はコンセンサスと一致する 5'スプライス部位配列は、正確にU1 snRNAの5'端と相 補的である。 分枝点配列はコンセンサスと一致する。 分枝点配列はU2 snRNAと相補的である。 3'スプライス部位はコンセンサスと一致する。 ポリピリミジントラクトは長さ16塩基であり、そして ７つの連続するＴを含む（該トラクトは好ましくは少 なくとも５つの連続するＴを含む）。 内部制限酵素部位を含む。 BbsIは5'ssで切断し、EarIは3'ssで切断する。 3'UTR／ポリＡ ウサギβ−グロビンの3'UTR／ポリＡシグナルに基づ く。 直列した２つのポリＡシグナルからなる。 ２．合成5'UTR（UT6）の特徴： 5'非翻訳領域（5'UTR）はメッセンジャーＲＮＡの翻訳効率に影響し、したが って、真核遺伝子発現の重要な決定要因である。合成5'UTR配列（UT6）は、治療 目的の遺伝子を発現するベクターによりコードされるｍＲＮＡの翻訳効率を最大 にするよう設計された。 合成5'UTR（UT6）の配列を以下に示す。コザック配列は太字体であり、そして 開始コドンは二重下線で示している。イントロンの位置（残基48および49の間） は、黒塗りの三角で示し、そしてコンセンサススプライス部位のエクソン部分を 形成する配列は一重下線で示している。HindIIIおよびNcoIの制限部位は上線で 示している。 5'非翻訳領域（5'UTR）は、キャップ部位および開始コドンの間に位置し、ｍ ＲＮＡの翻訳効率に影響することが知られている。5'キャップ構造の開始因子へ の接近しやすさに影響するすべての特徴、43S前開始複合体の結合およびそれに 続く移動、または開始コドンの認識が、ｍＲＮＡの翻訳可能性に影響するであろ う。効率的な5'UTRは、長さが適度であり、二次構造を欠き、上流開始コドンを 欠き、そして最適部位前後関係内にAUGを有するものであることが期待される（K ozak，1994，Biochimie 76:815-821;Jansenら，1994）。これらの特性を持つ5'U TRは、5'キャップ構造の効率的な認識と、続いて、リボソームによる迅速かつ妨 げられないリボソームスキャンを可能にし、これにより翻訳開始過 程が容易になるはずである。 合成5'UTR配列は、長さが適度である（54ヌクレオチド（nts））よう設計され 、Ｇを欠くがＣおよびＡ残基が豊富であり、上流ATGを欠き、意図するATGを最適 コザック配列（CCACCATGG）の前後関係内に置き、そして潜在的二次構造を欠く 。合成5'UTR配列はまた、ｍＲＮＡが細胞質で急速に崩壊することを標的とするA Uリッチ配列を欠くよう設計される。 実験により、ｃＤＮＡベクターからの遺伝子発現をイントロンが増加させ、そ して5'UTRに位置するイントロンが、3'UTRに位置するものより、より効果的であ ることが立証されている（HuangおよびGorman，1990，Mol．Cell．Biol．10:180 5-1810;EvansおよびScarpulla，1989，Gene 84:135-142;Brinsterら，1988，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 85:836-840;Palmiterら，1991，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 88:478-482;Choiら，1991，Mol．Cell．Biol．11:3070-3074）。したが って、合成5'UTR配列は、コンセンサススプライス部位配列を持つイントロンを 提供するよう設計された。該イントロンは、例えば、残基48および49の間（後述 のイントロン配列構造を参照されたい）に位置してもよい。46−48位のCAGはコ ンセンサス5'スプライス部位のエクソン部分である。49位のＧはコンセンサス3' スプライス部位のエクソン部分である。 クローニング操作を容易にするため、合成5'UTR配列は、HindIII部位で開始し 、そしてNcoI部位で終結するよう設計した。 ３．合成イントロンの特徴 ＲＮＡスプライシングは、大部分の真核遺伝子の発現に必要とされる。最適な 遺伝子発現のため、ＲＮＡスプライシングは非常に効率的でそして正確でなけれ ばならない。OPTIVS8Bと称される合成イントロンは、最大限効率的でそして正確 であるよう設計された。 典型的合成イントロンである0PTIVS8の構造を以下に示す。5'スプライス部位 （5'ss）、分枝点（bp）、および3'スプライス部位（3'ss）の配列は二重下線で 示す。制限酵素BbsIおよびEarIの認識配列は上線で示す。BbsIの切断部位は5'ss に対応し、そしてEarIの切断部位は3'ssに対応する。 5'スプライス部位（5'ss）配列は、確立されたコンセンサス配列、MAG↓GTRAG T（ＭはＣまたはＡ、そしてＲはＧまたはＡである）に一致する。スプライシン グの機構には、前ｍＲＮＡの5'ssとU1 snRNAとの間の相互作用が関与するため、 OPTIVS8Bの5'ss配列は、U1 snRNAの5'端に正確に相補的であるよう選択された。 哺乳動物において、分枝点のコンセンサス配列（YNYTRAY(ＹはＣまたはＴ、Ｒ はＡまたはＧ、Ｎはいかなる塩基でもよく、そして下線のＡが実際の分枝点であ る））は非常にあいまいである。スプライシングの機構には、前ｍＲＮＡの分枝 点（bp）とU2 snRNAとの間の相互作用が関与するため、OPTIVS8Bの分枝点配列は 、この相互作用が最大になるよう選択された。（分枝点自体は突出することに注 目されたい）。選択された配列はまた、酵母における前ｍＲＮＡスプライシング に必須であることが知られる分枝点配列とも一致する。分枝点は、典型的には、 3'スプライス部位の18−38nts上流に位置する。OPTIVS8Bにおいて、分枝点は3' スプライス部位の24nts上流に位置する。 3'スプライス部位（3'ss）の配列は、確立されたコンセンサス配列、Y₁₁NYAG ↓G（ＹはＣまたはＴであり、Ｎはいかなる塩基であってもよい）に一致する。3 'スプライス部位において、ポリピリミジン・トラクト（Y₁₁）はスプライス部位 強度の主な決定要因である。OPTIVS8Bにおける最適スプライス 部位機能のため、ポリピリミジン・トラクトの長さを16塩基まで伸長し、そして その配列が７つの連続するＴ残基を含むよう調節した。Roscignoら，1993，J．B iol．Chem．268:11222-11229が、最適なスプライシングには、ポリピリミジン・ トラクト中に少なくとも５つの連続するＴ残基が存在することが必要であること を立証したため、この特徴が含まれた。 in vitroスプライシングは、一般的に、イントロン長が80ntsを超える場合に 最適である（Wieringaら，1984;Ulfendahlら，1985，Nucl．Acids Res．13:6299 -6315）。多くのイントロンは、長さが数千塩基である可能性もあるが、ほとん どの天然発生イントロンは長さ90−200ntsである（Hawkins，1988，Nucl．Aclds Res．16:9893-9908）。該合成イントロンの長さ（118nts）は後者の範囲内であ る。 OPTIVS8Bは、内部に３つの制限酵素部位、BbsI、NheIおよびEarIを持つよう設 計された。これらの制限部位は、合成イントロン配列を含む遺伝子のスクリーニ ングおよび同定を容易にする。さらに、BbsIおよびEarI部位は、その切断部位が 正確に5'ss（BbsI）または3'ss（EarI）に対応するよう配置された。ポリピリミ ジン・トラクトの配列は特に、EarI制限部位を提供するように設計された。これ らの部位にBbsIおよびEarI部位を含むのは、これによってイントロンを正確に遺 伝子から欠失させることが可能になるため、有用である。これらはまた、遺伝子 内の別の部位に挿入してもよい「イントロン・カセット」の生成を可能にする。 BbsI部位および分枝点配列の間の77塩基は、NheI制限部位を含む以外は、無作 為配列である。 ３．合成3'UTR／ポリＡシグナルの特徴 真核ｍＲＮＡの3'端は、ポリアデニル化の過程により形成される。この過程に は部位特異的ＲＮＡ切断が関与し、その後ポリＡテールの付加が行われる。ポリ Ａテールを欠くＲＮＡは非常に不安定である。したがって、切断／ポリアデニル 化の効率は、ｍＲＮＡレベル、およびそれによる遺伝子発現レベルの主要な決定 要因である。2XPA1は合成配列であり、ポリアデニル化において最大限の効果を 持つよう設計された、２つの効率的なポリＡシグナルを含む。 ポリＡシグナルは、ほとんどの真核ｍＲＮＡの3'端を形成するのに必要である 。該シグナルは、２つのＲＮＡプロセシング反応を指示する：ＲＮＡ転写物の部 位特異的ヌクレアーゼ的分解切断、およびポリＡテールを形成するための新規生 成3'端への段階的アデニル酸付加（約250）である。ポリＡシグナルは３つの部 分を有する：ヘキサヌクレオチド、切断部位、および下流要素である。ヘキサヌ クレオチドは典型的にはAAUAAAであり、そして切断部位はジヌクレオチドCAの3' 側にあることが最も多い（Sheetsら，1987）。下流要素は、ポリＡシグナルの最 適な機能のために必要であり、切断部位の下流に位置する。下流要素の配列必要 性は、いまだに完全には確立されていないが、一般的にはUGまたはＵリッチ配列 と見なされている（Wickens，1990;Proudfoot，1991，Cell64:671-674;Wahle，1 992，Bioessays 14:113-118;ChenおよびNordstorm，1992，Nucl．Acids Res．20 :2565-2572）。 天然発生ポリＡシグナルの効果は非常に多様である（Peterson，1992）。特定 のポリＡシグナルの効果は、主に下流要素の特性によって決定される（Wahle，1 992）。治療目的の遺伝子を発現するよう設計された発現ベクターにおいて、可 能な限り効率的なポリＡシグナルを有することは重要である。 切断およびポリアデニル化を受けなかった転写物は、核区画内で急速に崩壊す るため、ポリＡ効率は遺伝子発現に重要である。実際、生存細胞におけるポリア デニル化効率は、非ポリアデニル化ＲＮＡが非常に不安定であるため、測定が困 難である。ｍＲＮＡの安定性に必要であるのに加え、ポリＡテールはｍＲＮＡの 翻訳可能性にも寄与し、そしてスプライシングまたはＲＮＡ搬送などの他のＲＮ Ａプロセシング反応にも影響する可能性がある（JacksonおよびStandart，1990 ，Cell 62:15-24;Wahle，1992）。 いくつかの真核遺伝子は２以上のポリＡ部位を有し、このことは第一の部位で 切断／ポリアデニル化反応が起こらなければ、より後ろの部位の１つで起こるで あろうことを暗示する。COS細胞トランスフェクション実験において、２つの強 いポリＡ部位を持つ遺伝子は、単一の強いポリＡ部位を持つものの、およそ２倍 のｍＲＮＡを産生した（Bordonaro，1995）。これらのデータにより、転写物の かなりの割合は、単一の「効率的な」ポリＡシグナルがあってもプロ セシングされないままであることが示唆される。したがって、２以上のポリＡ部 位を含むことが好ましいであろう。 典型的な合成ポリＡシグナルの配列を以下に示す。該配列は2XPAと称される。 ヘキサヌクレオチド配列および下流要素配列は二重下線で示し、そして２つのポ リＡ部位はpA♯1およびpA#2と示している。便利な制限部位は上線で示す。全2XP A単位は、クローニング実験において、XbaI-KpnI断片として移し替えてもよい。 内部BspHI断片の欠失により、1XPA単位が形成される。 上記の合成ポリＡ部位の配列はウサギβグロビンポリＡシグナル、すなわち文 献により強いと性質決定されているシグナルの配列に基づいている。（Gilおよ びProudfoot，1987，Cell 49:399-406；GilおよびProudfoot，1984，Nature 312 :473-474）。重要な特徴の１つは、その下流要素の構造であり、UGおよびＵリッ チドメインを両方とも含む。 1XPA配列に対応する二重鎖ＤＮＡ配列は、合成オリゴヌクレオチドから構築し た。1XPA配列の２つのコピーを、その後つなげて、2XPA配列を形成した。該配列 は、第一のポリＡシグナルを含む断片の5'端に唯一のXbaI部位を、そして第二の ポリＡシグナルを含む断片の3'端に唯一のKpnI部位を有するようにつなげた。 ５．典型的プラスミド構築物 ２つのコード配列（例えばヒトＩＬ-12のサブユニット）の合同発現のため、 ４つの発現戦略のプラスミド構築物を構築し、そして試験した。４つの戦略の例 を、４番目の戦略の２つの可能性と共に、図３に図示する。 第一の戦略には２つの発現プラスミドが関与した。ｐ35をコードするもの（pI N0755）、およびｐ40をコードするもの（pIN0728）である。したがって、ＩＬ-1 2ヘテロ二量体を産生するためには、細胞に両方のプラスミドをコトランスフェ クションしなければならない。 第二の戦略には、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）配列を含む、二シスト ロンｍＲＮＡを産生する単一のプラスミドが関与した。ＩＲＥＳ配列の供給源は pCITE2a（Novagen）であり、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳを含む。他のＩＲＥＳ配 列も同様に使用することができる。pIN0744において、配列順序はｐ35−ＩＲＥ Ｓ−ｐ40である。したがって、ｐ35はキャップ依存様式で翻訳され、そしてｐ40 はＩＲＥＳ依存様式で翻訳される。 第三の戦略には、5'スプライシング部位から、２つの代替3'スプライス部位の １つへのスプライシングにより生成される、２つの代替ｍＲＮＡをコードする、 単一のプラスミドが関与した。１つのｍＲＮＡはｐ35およびｐ40をコードし、翻 訳されるのは主にｐ35配列である。もう一方のｍＲＮＡはｐ40をコードする。２ つのｍＲＮＡがバランスよく産生されるために、代替3'スプライス部位の相対強 度のバランスを保つのが有益である。pIN0745において、両方の3'スプライス部 位は同一の配列を有し、したがって同一の強度を有する。pIN0772において、第 一の3'スプライス部位の相対強度は、部位特異的突然変異誘発により、３つの連 続したＴをＡに変化して弱められた。したがって、上記に示されたOPTIVS8イン トロン配列に含まれる配列、5'-CTTTTTTTC-3'は、5'-CTTTAAATC-3'に変化した。 第四の戦略には、それぞれが自身のCMVエンハンサー／プロモーターにより推 進される、２つの別々の転写単位を含む、単一のプラスミドが関与した。pIN077 3において、ｐ40遺伝子はｐ35遺伝子のすぐ上流に位置する。ｐIN0774において 、この順序は逆転し、ｐ35遺伝子がｐ40遺伝子のすぐ上流に位置する。 Ｂ．ＩＬ-12サブユニット配列 天然ヒトＩＬ-12サブユニットコード配列のヌクレオチド配列は既知であり、 そして以下に提供される。 ヒトｐ40サブユニットは306アミノ酸のポリペプチドであり、予測される分子 量はおよそ34.7キロダルトン（kd）である。ヒトＩＬ-12ｐ40サブユニットのア ミノ酸配列は、図４に配列番号１として示されている。以下の配列表１は、３つ のヌクレオチド配列を含み、それぞれがヒトＩＬ-12ｐ40をコードする。第一の 配列（配列番号２）は各３列の最上列により提供される。この配列が天然ｐ40コ ード配列である。 上記に提供される天然配列の代わりに、ｐ40サブユニットをコードする合成配 列を利用するのが有益である。こうした合成配列は、天然配列に代わるコドン用 法を有し、したがって天然配列とは劇的に異なるヌクレオチド配列を有する。特 に、ヒトにおける発現に少なくとも部分的に最適化されたコドン用法を有する合 成配列を利用してもよい。天然配列はこうした最適コドン用法を持たない。好ま しくは、実質的にすべてのコドンが最適化される。 ヒトにおける最適コドン用法は、図６に示されるように、高度に発現されるヒ ト遺伝子のコドン用法頻度により示される。コドン用法表はWisconsin Sequence Analysis Package,Version8.1,Genetics Computer Group，ウイスコンシン州マ ディソンのプログラム「Human_High.cod」より得ている。高度に発現されるヒト 遺伝子において最もしばしば用いられるコドンは、ヒト宿主細胞での発現に最適 なコドンであると推定され、したがって合成コード配列を構築する基礎を形成す る。 ｐ40サブユニットをコードし、そして最適コドン用法を有する合成配列を、以 下の配列表１の第二列に示す（配列番号3)。 しかし、全体に最適化コドン用法を有する配列よりむしろ、均一にコドン用法 を最適化するため、同じアミノ酸が互いに近すぎるかまたは豊富である領域を除 いて、最適化コドン用法を有するｐ35およびｐ40コード配列を利用するのが望ま しい可能性がある。したがって、以下の配列表１の第三列は、配列の特定の領域 においてコドン均一性を減少させるこうした変化を除き、最適コドン用法を有す る合成ｐ40コード配列（配列番号４）を提供する。 配列表１ ヒトＩＬ-12ｐ40をコードする配列 第一列 天然配列（配列番号２） 第二列 全コドン最適化（配列番号３） 第三列 同一アミノ酸が近すぎるまたは豊富である場合以外、全コドン最適化（ 第二および第三列の変更は太字）（配列番号４） ヒトｐ35サブユニットは197アミノ酸のポリペプチドであり、予測される分子 量はおよそ22.5kdであって、そのアミノ酸配列は図５に配列番号５として示され ている。上記の配列表１と同様、配列表２はヒトＩＬ-12ｐ35サブユニットをコ ードする３つの配列を提供する。 上記のように、最上列は、天然ｐ35コード配列（配列番号６）を示す。第二列 はｐ35をコードするが、最適コドン用法を有する配列（配列番号７）を示す。第 三列は、ｐ35をコードし、均一なコドン用法のため、同じアミノ酸が互いに近す ぎるかまたは豊富すぎる領域を除いて、最適コドン用法を有する配列（配列番号 ８）を示す。 配列表２ ヒトＩＬ-12ｐ35をコードする配列 第一列 天然配列（配列番号６） 第二列 全コドン最適化（配列番号７） 第三列 同一アミノ酸が近すぎるまたは豊富である場合以外、全コドン最適化（ 第二および第三列の変更は太字）（配列番号８） さらに、コドン用法のかなりの部分が最適化された、例えば少なくとも50％、 70％、80％または90％最適化コドンを有する、他の合成配列を使用してもよい。 他の特定のｐ40およびｐ35サブユニットの合成配列は、図６のコドン用法表を参 考にして選択することができる。配列は、ポリペプチド配列の各アミノ酸のコド ンを選ぶことにより選択される。各ポリペプチドに対応するＤＮＡ分子をその後 、ルーチンの化学合成法により構築することができる。例えば、より短いオリゴ ヌクレオチドを合成し、そしてその後、全長コード配列を構築するのに適した関 係で連結してもよい。 Ｃ． in vitroデータ 上記の多価発現系を、in vitroでＡ549（ヒト肺癌）細胞にトランスフェクシ ョンすることにより、ＩＬ-12産生能に関して評価した。ヒトＩＬ-12ヘテロ二量 体の細胞培養上清への分泌は、QUANTIKINE^TM系（R&D Systems）を用いたELISA法 により検定した。しかしこうした検定には、ＩＬ-12に対するいかなる高感度検 定法を用いてもよい。２つの実験の代表的なデータを図７に示す。ＩＬ-12 ｍＲ ＮＡは、ノーザンブロット解析により解析した。ＲＮＡは、トランスフェクショ ンされたＡ549細胞より単離し、そして放射標識したｐ35およびｐ40配列の1:1混 合物をプローブとして使用するノーザンブロット法により解析した。各発現プラ スミドは、135ヌクレオチド離れた２つのポリＡ部位を有するため、各ｍＲＮＡ の種類は、135ヌクレオチド異なる２つのｍＲＮＡの二つ組である。ノーザンブ ロット解析により出現したすべてのバンドは、期待されるｍＲＮＡサイズに対応 する。pIN0773によりトランスフェクションされた、またはpIN0728IpIN0755によ りコトランスフェクションされた細胞において、ｐ40 ｍＲＮＡは1340/1475ヌク レオチドであり、そしてｐ35 ｍＲＮＡは1014／1149ヌクレオチドである。pIN07 44によりトランスフェクションされた細胞において、二シストロンｍＲＮＡは25 11／2646ヌクレオチドである。pIN0745またはpIN0772によりトランスフェクショ ンされた細胞において、ｐ35 ｍＲＮＡは2041／2176ヌクレオチドであり、そし てｐ40 ｍＲＮＡは1341／1476ヌクレオチドである。 最高レベルの発現（800−1000ng／10⁶細胞／40時間）は、２遺伝子系であ るpIN0773、および２プラスミド系であるpIN0728IpIN0755で得られた。ノーザン ブロット解析により、正しいサイズのｍＲＮＡが形成され、そしてこれら２つの 系で、ｐ35およびｐ40 ｍＲＮＡの集積および相対量は同程度であることが示さ れる。両方の系において、ｐ40 ｍＲＮＡのレベルは、ｐ35 ｍＲＮＡのレベルよ り高い。ｐ35およびｐ40遺伝子は、コード配列の性質以外は同一であることから 、ｍＲＮＡ集積レベルの相違は、おそらくｍＲＮＡの安定性の違いを反映してい るのであろう。単一プラスミドとしてのＩＬ-12発現が高レベルであるため、pIN 0773をin vivo評価のための構築物として選択した。 二番目に高い発現レベル（〜400ng／10⁶細胞／40時間）は、pIN0774で得られ た。このプラスミドはpIN0773とｐ35およびｐ40遺伝子の順序のみ異なる。ノー ザンブロット法から得られるＲＮＡプロフィールは、pIN0773と実質的に同じで ある。したがって、２つの遺伝子プラスミドにおける遺伝子の順序が、重要な変 数である可能性がある。 三番目に高い発現レベル（〜200ng／10⁶細胞／40時間）は、代替スプライシン グ構築物であるpIN0772で得られた。pIN0772は、ｐ35およびｐ40 ｍＲＮＡをバ ランスよく産生するよう設計したスプライス部位を有する。ノーザンブロット解 析により、バランスのよいｍＲＮＡ産生が達成されたが、全体のｍＲＮＡ集積は 減少したことが示される。スプライス部位の組み合わせをさらに最適化して、バ ランスのよい高レベルｍＲＮＡ産生を提供することができる。 より低い発現レベルは、もう１つの代替ＲＮＡスプライシング構築物である、 pIN0745で見られた。pIN0745の代替3'スプライス部位は同一配列であるため、Ｒ ＮＡスプライシングのバランスが崩れていると予測される。ノーザンブロットの データは、ｐ35 ｍＲＮＡは高レベルだが、ｐ40 ｍＲＮＡは非常に低レベルであ ることを示す。pIN0745とpIN0728（ｐ40サブユニットをコードする）のコトラン スフェクションは、高レベルのＩＬ-12を生成する。このことは、pIN0745のｐ40 合成が限られていることを立証する。この構築物設計は、代替スプライス部位の 相対強度を改変して、さらなるｐ40合成を提供することにより改善することがで きる。 遺伝子発現はまた、ＩＲＥＳを含む構築物であるpIN0744でも見られた。ノー ザンブロットのデータは、期待されるｍＲＮＡが高レベルで存在することを示す 。pIN0728またはpIN0755とのコトランスフェクション実験により、pIN0744のｐ4 0合成が限られていることが示された。 上記のように、pIN0773は２つのポリペプチド発現に有用である。ELISA実験（ 図７）は培養細胞で高レルベルの分泌ＩＬ-12を産生することを示す（〜1μｇ／ 10⁶細胞／40時間）。ノーザンブロット実験（上記の通り）は、高レベルおよび 期待されるサイズでｐ35およびｐ40 ｍＲＮＡを産生することを示す。これは単 一のプラスミド内に含まれる。 RT-PCR解析を行い、ｐ35およびｐ40ＲＮＡ転写物のスプライシングの正確さを 評価した。pIN0773トランスフェクション細胞由来のＲＮＡを、合成イントロン に渡るプライマーを用いてRT-PCRにより解析した。ｐ40 ｍＲＮＡを解析するた め、上流プライマーは5'UTR内にあり、下流プライマーはｐ40コード配列内にあ った。ｐ35 ｍＲＮＡを解析するため、上流プライマーは5'UTR内にあり、下流プ ライマーはｐ35コード配列内にあった。コントロールとして、プラスミドＤＮＡ （Ｐ）を解析した。ｐ40 ｍＲＮＡを解析するため、pIN0728をプラスミドコント ロールとして使用した。ｐ35 ｍＲＮＡを解析するため、pIN0755をプラスミドコ ントロールとして使用した。増幅された配列は、100bpマーカーを用いて電気泳 動により解析した。その結果得られた電気泳動ゲルデータを比較すると、各ＲＮ Ａのスプライシングは期待される位置で進行していることが示される。 Ｄ． in vivoデータ 上記のプラスミド構築物を、搬送処方に取りこませた。一般的に50μｇのプラ スミドＤＮＡをＤＯＴＭＡ:chol（10％ラクトース中に800ｎｍのリポソームとし て調製された等モルＤＯＴＭＡ：コレステロール）と合わせ、ＤＮＡおよびＤＯ ＴＭＡが負対正の電荷比が1:3であるようにした。処方は気管内点滴注入により 、ラット肺に搬送された。処方、搬送、検定およびラット肺モデル系は、以下に 詳細に説明する。 ラット肺におけるpIN0773、pIN0744、pIN0745、pIN0744lpIN0728、およびpIN0 745IpIN0728の気管内点滴注入後のＩＬ-12発現を比較した。ＩＬ-12発現プラス ミド50μｇを、ＤＯＴＭＡ:Chol 1:3-/+と処方し、そして点滴注入によりラ ット肺に投与した。肺組織は、点滴注入の48時間後に採取し、そしてヒトＩＬ-1 2ヘテロニ量体のレベルを検定した。試験したプラスミド構築物のうち、pIN0773 が最も高く、そして最も一定したレベルのＩＬ-12発現を示した（およそ800pgＩ Ｌ-12／肺）。次はpIN0744/pIN0728コトランスフェクションであり、その後pIN0 745/pIN0728コトランスフェクション、続いてpIN0744およびpIN0745プラスミド であった。 したがって、pIN0773はin vivoで、記載された構築物中で最高の活性を示した 。単一多価プラスミドの搬送は同一細胞内での両方のサブユニットの発現を保証 する一方、２つの別々のプラスミドの搬送はそうではないことから、pIN0773のi n vivo活性は、pIN0728/pIN0744およびpIN0728/pIN0745より高いことが期待され る。 ある種のＩＬ-12コード構築物もまた、正常モルモット肺への点滴注入により 評価された。搬送処方は、80μｇのプラスミドＤＮＡを含む以外、ラット肺点滴 注入に記載されたものと同じであった。CATをコードするプラスミドＤＮＡを含 むコントロール処方、およびプラスミドＤＮＡを含まないコントロール処方もま た、提供された。その結果、ｐ0728およびｐ0744またはｐ0745のコトランスフェ クションは、ｐ0744またはｐ0745のみのトランスフェクションより、非常に増大 したＩＬ-12発現を提供することが立証された。肺組織および気管支肺胞洗浄液 の両方に関し、同様の結果が観察された。III ． 遺伝子搬送のための処方 Ａ．概論 上記のような発現系は、適切な部位に搬送された際、発現する可能性を提供す るが、構築物の搬送および細胞への取りこみの両方を補助しうる搬送系中で発現 系構築物を提供することは有益である。したがって、本発明はまた、１つまたは それ以上の発現系構築物（例えば上記のＤＮＡプラスミド）、陽イオン脂質、捕 脂質（好ましくは中性捕脂質）、および処方を等浸透圧および等張にする炭水化 物剤を含む、特定の処方も提供する。 一般的に、水溶液性の炭水化物溶液中の陽イオン脂質および中性捕脂質を、該 脂質および水溶液を望ましい大きさの孔を持つ膜から押し出すことなどにより、 リポソームに押し出し成形する。該リポソームをＤＮＡと合わせ、ＤＮＡ／脂質 複合体を形成し、その後、望ましい搬送部位への搬送に適した方法により哺乳動 物に投与することができる。後述するように、少なくとも肺への搬送では、リポ ソームの直径、およびＤＮＡ：陽イオン脂質電荷比が、得られる発現レベルを決 定する重要なパラメーターである。 プラスミド構築物に関連するさらなる重要な因子は、開環状（OC）型ではなく スーパーコイル（SC）型であるプラスミドの割合である。さらに、肺への搬送に 関しては、搬送様式もまた得られる発現レベルに影響する。対照的に、発現レベ ルは、利用された特定のプラスミド調製にはそれほど依存しないことが示された 。 Ｂ．リポソーム成形サイズ、ＤＮＡ：陽イオン脂質（-:+）電荷比、およびス ーパーコイルプラスミドの割合 上記のように、リポソーム押し出し成形サイズ、電荷比、およびスーパーコイ ルプラスミドの割合は、処方された複合体が肺へ搬送される際、観察される発現 レベルを決定するのに重要なパラメーターであった（観察される発現レベルに対 する、肺への搬送様式および異なる様式の影響は後に論じる）。 これらのパラメーターを評価するため、一般的には標準ラット肺モデル系を利 用した。該系は、点滴注入を用い、ラット肺におけるクロラムフェニコール・ア セチルトランスフェラーゼ（CAT）の発現レベルを測定した。ラットは重さ180− 200グラムであった。処方は一般的に、処方を細胞内液とおおよそ等張であるよ うにするための10％ラクトースと共に、陽イオン脂質および中性捕脂質として、 それぞれＤＯＴＭＡおよびコレステロール（chol）を含んだ。しかし、代わりの 陽イオン脂質、中性捕脂質の組み合わせを用いても同様の結果が得られ、したが って処方は、ＤＯＴＭＡ/cholを用いるものに限定されない。陽イオン脂質およ び中性捕脂質は、好ましくはおよそ等モル量存在することが好ましい。 エチルジオレイルホスファチジルコリン（EDOPC）を陽イオン脂質とし、そし てDOPEを捕脂質として利用する、ある代替脂質の組み合わせを評価した。EDOPC はエステル結合を有するリン脂質である。DOPEはジオレオイルホス ファチジルエタノールアミンである。ＤＯＴＭＡ:Cholを含む処方と同じ様式で リポソームから調製されたEDOPC:DOPEを含む処方は、点滴注入後、ラット肺にお いてＤＯＴＭＡ:Chol処方で見られたのと同様なレベルの発現を生じた。図８を 参照されたい。 さまざまな他の陽イオン脂質および捕脂質がEppsteinら，米国特許第4,897,35 5号（ＤＯＴＭＡおよびDOPEを含む）、およびPCT出願PCT/US95/03635、国際公開 WO 95/26356（EDMPCを含む）に記載されており、どちらも本明細書に援用される 。したがって、本発明の範囲内で、他の脂質選択を搬送処方に利用してもよい。 発現レベルに対する電荷比の影響を立証する試験を除き、ＤＮＡおよび陽イオ ン脂質は、負対正の電荷比が1:3であるような相対量で存在した。ラットには、 処方は一般的に、50μｇのプラスミドＤＮＡを含む400μｌの容量で投与された 。ＤＮＡ量を変化させる実験には、点滴注入量400μｌを維持したままＤＮＡ濃 度を変化させた。処方は、麻酔し送管したラットの気管にガバージ針（gavagene edle）点滴注入により投与した。 CAT発現レベルは、点滴注入の48時間後に測定した。全肺を除去して試験管に 入れ、瞬間凍結し、そしてビーズを用いて攪拌した。生じた液体中のCAT濃度を その後、商業的ELISA検定系（CAT ELISA、Boehringer Mannheimより）を用いて 測定した。放射標識または他の酵素に基づくCAT検定系などの、他の検定系を代 わりに用いることができる。該CAT ELISA系はサンドイッチELISA法であり、固定 された抗CAT抗体を利用して試験溶液中のCATと結合させ、その後ジゴキシゲニン 標識抗CAT抗体を固定CATと複合体化させる。次にペルオキシダーゼ結合抗ジゴキ シゲニンを固定複合体に結合させ、そして基質と反応させて発色させ、検量線と 比較して試験試料中のCAT濃度を与えることができる。 リポソーム成形サイズの影響を評価するため、特定の大きさの孔を有する多孔 膜を通して押し出し成形することにより、リポソームを調製した。リポソーム調 製後、ＤＮＡを添加して搬送系複合体を提供した。構成要素の相対量は上記の通 りである。一連の試験において、リポソームは３つの異なる成形サイズ、100、 400、および800ｎｍ(膜の孔サイズ）を有するよう調製された。平均CAT発現レベ ルは、100、400、および800ｎｍ成形サイズの順に増加した。平均発現レベルは それぞれ、およそ2000、11000、および14000pg ＣＡＴ／ラット肺であった。し たがって、本明細書に記載される処方には、約800ｎｍの成形サイズがリポソー ム調製に使用されることが好ましいが、必要ではない。複合体をリポソーム押し 出し成形以外の方法で調製する場合、生じる複合体が、800ｎｍリポソーム押し 出し成形を使用して生じる大きさとほぼ同じ大きさであることが望ましい。 スーパーコイルおよび開環状プラスミドＤＮＡの相対レベルの影響を、リポソ ームを約800ｎｍの成形サイズに調製した上記の処方を用いて評価した。ＤＮＡ が主にスーパーコイル（SC）型である調製物（約80％がスーパーコイル型）は、 主に開環状（OC）ＤＮＡを有するかまたはSCおよびOC ＤＮＡの組み合わせの調 製物より高いレベルのCAT発現を提供した。OC試験は、平均CAT発現レベルおよそ 1000pg／肺を提供したが、混合OC/SC試験は、およそ2500pg／肺を提供し、そし てSC試験は、およそ6500pg／肺を提供した。したがって、概して発現レベルはSC 量の増加と共に増加することが示され、したがって、スーパーコイル型が高レベ ルであることが好ましい（例えば、少なくとも70、80、85、90、または95％SC） 。 ＤＮＡ:陽イオン脂質（-/+）電荷比の影響を、約400ｎｍの成形サイズを有す る処方を用いて評価した。図８を参照されたい。CAT発現レベルの結果により、 負対正の電荷比が1:3である場合、電荷比が1:0.5である場合より高い発現を提供 することが立証された。したがって、使用される処方は約1:3であることが好ま しいが、他の電荷比、すなわち1:3より高いものも低いものもまた、有用な発現 を提供することができる。 Ｃ．搬送および肺における発現 上記の構築物および処方と共にさまざまな搬送法を使用してもよく、特に、肺 への搬送は処方を生成しそして方向付けるのに、多くの異なる方法を用いて行っ てもよい。利用された第一の方法は、CAT発現解析に関し上述された送管および 点滴注入であった。他の様式は、エアロゾルを生成するための処方の噴霧化を 含み、その後、肺へと方向付けられる。噴霧化および適用技術の組み合わせには ：（1）ジェット噴霧化／曝露室における霧呼吸；（2）超音波噴霧化／送管；（ 3）超音波噴霧化／呼吸装置（mechanical ventilator）；および（4）直接噴霧 化およびカテーテル噴霧器を使用した方向付けが含まれる。ほとんどの解析はCA T検定に基づくが、いくつかの試験ではＩＬ-12をコードする発現系を使用した。 １．ＤＮＡ：脂質複合体の気管内点滴注入 ラットにおける処方の点滴注入は、概して上記の通りに行った。すでに記載し た試験に加え、CATをコードする処方およびＩＬ-12をコードする処方両方に関し 、用量反応解析を行った。これらの用量反応解析は、ＤＯＴＭＡ/cholおよび10 ％ラクトースと共にプラスミドＤＮＡを負対正の電荷比が1:3であるように有す る処方を利用した。 CAT発現に関する用量反応の結果を図９に示す。ラット肺におけるCAT量は、プ ラスミドＤＮＡの３つの異なる点滴注入量（2、10、および50μｇＤＮＡ）に関 し測定した。グラフにより、試験したＤＮＡ量範囲ではほぼ直線状の用量反応が 示唆された。 ＩＬ-12をコードするプラスミドＤＮＡを含む、点滴注入された典型的処方の ＤＮＡ量の関数として、ラット肺におけるＩＬ-12発現に関し、同様の用量反応 測定を行った（後述のプラスミドpIN0773を使用）。該処方は、10％ラクトース 水溶液中に800ｎｍ成形サイズで調製されたDotma/Cholを1:1のモル比で含み、そ して1:3の負対正の電荷比を有した。ラット肺当たりのＩＬ-12量は、プラスミド ＤＮＡの４つの異なる点滴注入量（3.13、6.25、12.5、および25μｇＤＮＡ）で 測定した。ＩＬ-12量は、点滴注入プラスミドＤＮＡが増加するにつれ増加した が、反応は試験範囲に渡り非直線状であるようだった。プラスミドＤＮＡが6.25 μｇであるとき、ラット肺当たりＩＬ-12約50ピコグラム（pg）が検出された。 ＤＮＡが12.5μｇであるとき、ＩＬ-12約350pg／肺が検出され、ＤＮＡが25μｇ であるとき、ＩＬ-12約1700pg／肺が検出された。 これらの結果により、期待された通り、肺に搬送される、望ましい産物をコー ドするＤＮＡの量が、得られる発現レベルにかなり影響を与えることが示された 。２．ａ．ＤＮＡ：脂質複合体の超音波噴霧化 本実施例は、エアロゾル複合体の生成および性質決定を説明する。 実施例１に記載されるプラスミド／脂質複合体を、超音波噴霧器（ModelNE-U0 7，Omron Health Care，Inc.，イリノイ州レイクビュー）を使用して製造者の指 示にしたがいエアロゾル化した。エアロゾル化された複合体を、改変した試験管 はめ込み装置（testtube impaction apparatus）を用いて収集した。この系にお いて、エアロゾルはしなやかなタイゴン（tygon）管内および細いガラスピペッ トを通じて供給した。ピペットを出たエアロゾルは氷冷試験管に衝突し、そして 凝縮した。エアロゾルは、後述のように、あらかじめ決められた時間間隔で性質 決定のために収集された。 超音波噴霧化プラスミド／脂質複合体および該複合体内のＤＮＡの安定性を、 上記のように動的光散乱（dynamic light scattering）およびドップラー電気泳 動光散乱（Doppler electrophoretic light scattering）を用いて評価した。複 合体化効率およびプラスミド完全性は、アガロースゲル電気泳動により測定した 。プラスミド完全性測定のため、電気泳動前に該ＤＮＡをTriton-Ｘで処理する ことにより複合体から取り除いた。Triton処理試料中のＤＮＡバンドの構造を裸 のＤＮＡコントロールのものと比較した。 噴霧化されないおよび噴霧化された複合体中のスーパーコイル状プラスミドの 割合は「裸のＤＮＡ」コントロール中のものと同様であった。スーパーコイル型 は、プラスミドの最も重要なそして壊れやすい物理的形状である。スーパーコイ ル型の完全性が噴霧化の後も維持された事実から、陽イオン脂質が滴形成中に誘 発されるＤＮＡの切断（shear）を防いでいることが示唆される。 放出される用量および空力学的（aerodynamic）直径を、米国薬局方<601>に定 義される標準法を用いて測定した。エアロゾルは、臨界流（critical flow）オ リフィス（CFO）を用いて、あらかじめ決定された流速である３１／分で、0.2μ ｍのフィルター上で収集した。エアロゾルを含むフィルターを５％ドデシル硫酸 ナトリウム（SDS）緩衝液５mlで洗浄し、ＤＮＡを脂質から分離した。溶液を遠 心分離し、そしてＤＮＡ濃度を波長260ｎｍで分光光度計により検定した。超音 波噴霧器からの産出エアロゾル流中のＤＮＡ濃度は５μｇ/mlであった。 超音波噴霧器により生成されるエアロゾルは、慣性はめ込み技術（inertlalim paction technique）を用いて、集合中央値空力学的直径（mass medianaerodyna mic diameter）（MMAD）および幾何標準偏差（GSD）に基づき性質決定した。８ つのはめ込み台（impaction stage）および前分離装置からなるAndersen 1 SCFM （28.31／分）非生存（non-viable）周辺試料採取装置を使用して、エアロゾル 粒子を収集した。エアロゾルは５分間集めた。エアロゾルは、ステンレス鋼ディ スク上および孔サイズが0.2μｍであるガラス繊維フィルター（Gelman Type A/E ，Gelman Sciences Inc.，ミシガン州アナーバー）上のはめ込み台各８つで収集 した。各ディスクをはめ込み装置から除去し、ペトリ皿にのせ、そして５mlの５ ％SDSで洗浄した。各ぺトリ皿を周期的間隔で震蕩し、沈着した粒子中の脂質を 完全に溶解した。溶液を遠心分離し、そしてＤＮＡ濃度を波長260ｎｍで分光光 度計により検定した。カスケードはめ込み装置の各台で収集したＤＮＡの累積集 合分画を、対数確率用紙上に、その台の有効カットオフ（effective cut-off） 直径に対してプロットし、そして最小二乗法により該データに関する対数正規分 布を計算した。MMAD（集合を等分した回帰上の点として得られた）は2.4μｍで あった。GSD（それより下で集合による分布の84.1％が発生する粒子サイズを集 合中央値サイズで割ることにより計算される）は3.2であった。エアロゾルのサ イズ分布により、大部分の粒子は呼吸可能な範囲にあることが示された。 非噴霧化および噴霧化プラスミド／脂質複合体の気管内点滴注入後、導入遺伝 子発現レベルを比較する試験を行った。 動物を３つの処置群に分け（３動物／群）、そして80mg/kgのケタミンを腹腔 内投与して麻酔した。処置群に気管カテーテルを送管し、そして手術台上にあお 向けに置いた。エアロゾルを気管カテーテルを通じて搬送し、そして人工呼吸空 気流により運んだ。動物をあらかじめ決定した時間間隔でエアロゾル化複合体に 曝露した。吸入後、動物から抜管し、麻酔から回復させ、そして動物飼育施設に 戻した。動物は、ドライアイス室を用いて、吸入48時間後にCO₂窒息により安楽 死させ、肺組織を採取した。該組織をTris/HCl緩衝液中でホモジェナイズし、そ して遠心分離した。上清を引き続き、製造者の指示にしたがってCAT発 現に関するELISA検定（Boehringer Mannheim CAT ELISA Kit，カタログ番号1363 727）を用い、分析した。 気管内送管により400μｌの超音波噴霧化複合体（10分後、衝突装置上で収集 ）または噴霧器容器から30分後に分取した残留複合体（100μｇのプラスミドＤ ＮＡ）を点滴注入した動物のCAT発現レベルの結果により、非噴霧化、噴霧化ま たは残留プラスミド／脂質複合体の気管内点滴注入後の導入遺伝子発現のレベル は、匹敵するものであることが示される。 ｂ．呼吸装置を用いた超音波エアロゾル化ＤＮＡ：脂質複合体の肺搬送 動物肺に沈着するエアロゾル化ＤＮＡ：脂質複合体の量を増加させるため、超 音波噴霧器と組み合わせた呼吸装置の使用の実現可能性を評価した。呼吸装置は 、基本的に、シリンダーおよびピストンからなる陽圧ポンプである。陽圧機械的 側バルブを、ピストンの動きにより吸気および呼気と同調したモーター上のカム により活性化した。動物の呼吸パラメーター（呼吸頻度、一回呼吸量および呼気 時間）は、呼吸装置により調節した。呼吸装置は３つのポートからなった。超音 波噴霧器からのエアロゾルは、ピストンの逆向きの動きの間に底のポートから引 き込まれた。エアロゾルは、ピストンの前向きの動きの間に、中央のポートから 気管カテーテルを介し動物に搬送された。吐き出されたエアロゾルは上部のポー トから排気された。 次のプラスミド／脂質複合体およびプラスミドをラクトース（10％w/v)中に処 方した。 CMV-CAT/ＤＯＴＭＡ:chol（800ｎｍ）、電荷比（-:+）1:3 プラスミドＤＮＡ濃度：200μｇ/ml 本研究において、超音波噴霧器により生成されたエアロゾルは、呼吸当たり５ mlの速度で動物に搬送された。呼吸装置は100呼吸／分の頻度で作動した。曝露 時間は５分間であった。 エアロゾル化ＤＮＡ：脂質複合体の吸入後、有意なレベルのCAT発現があった 。本研究で観察されたCAT発現レベルは、気管内点滴注入後に得られたものと匹 敵した。エアロゾル化複合体のかなりの割合が、エアロゾル吸入管および気管カ テーテルにつながれたエアロゾル搬送管中に凝縮した。続く研究において、 呼吸装置を低い頻度で作動させることでこうした凝縮を最小限にした。 これらの続く研究において、超音波噴霧器により生成されたエアロゾルは、呼 吸当たり６mlの速度で動物に搬送された。呼吸装置は50および75呼吸／分の頻度 で作動させた。曝露時間はそれぞれ、7.5および15分に増やした。 改変した作動方法を用いた場合、発現は最小限の検出可能レベルであった。本 研究の結果により、呼吸装置の使用は吸入量を増加させるのには適切な方法では ない可能性があることが示唆される。肺に沈着するエアロゾル化ＤＮＡ：脂質複 合体量を増やすためには、別の戦略が好ましい。こうした代替法には、超音波噴 霧化と送管およびエアロゾル搬送のための噴霧化カテーテルの使用が含まれる。 ｃ． 送管を用いた超音波エアロゾル化ＤＮＡ：脂質複合体の肺搬送 ラット肺中のCAT発現レベルを、800ｎｍ成形サイズリポソームとして調製され たＤＯＴＭＡ:cholと共に、CATをコードするプラスミドＤＮＡを含む処方を用い て測定した。ＤＮＡおよび陽イオン脂質の負対正の電荷比は1:3であった。処方 は超音波噴霧化され、そしてラット肺に直接送管により搬送された。したがって 、本方法は効果的なエアロゾル形成および適用部位への効率的な搬送の両方を提 供する。投与48時間後、肺当たりに存在するCAT量を上記のようにBoehringer Ma nnheimのCAT ELISAキットを用いて測定した。 曝露室における呼吸霧搬送と比較すると、直接送管ははるかに迅速な複合体沈 着を供給した。FITC標識デキストランの相対沈着比に基づく計算において、超音 波噴霧化／送管方法は10分曝露でジェット噴霧化／呼吸霧法の60倍以上沈着した 。この高い沈着速度はまた、CAT発現レベルをも反映した。超音波噴霧化／送管 法を用いた10分曝露後のCATレベルは、240分のジェット噴霧化／呼吸霧曝露と同 程度のCAT発現レベルを生じた。 ４．カテーテル噴霧化 噴霧化カテーテルは、圧縮空気供給と共に液体供給装置を使用し、カテーテル 先端でエアロゾルを生成する。カテーテルは直径約0.2から1.0mmであり、いくつ かの一体型気液毛細管からなる。これらの毛細管は集まり、そしてカテーテルの 遠位端で小口として終結する。気体および液体はそれぞれの毛細管を流れ、そし て該小口から出る。気体および液体が緊密に接触することにより、遠位端に エアロゾルが生成する。該液体は呼吸装置の呼吸相と同調し律動的に送られても よいし、または手動でシリンジを介して搬送されてもよい。該カテーテルは治療 エアロゾルの肺内適用を標的とするために気道内に置かれてもよい。in vivo研 究により、カテーテルは95％以上の噴霧化薬剤を搬送し、そしてエアロゾル化さ れた薬剤のおよそ85−95％は肺に沈着することが示されている。本装置により生 成されるエアロゾルの集合中央値空力学的直径（MMAD）は５μｍより大きい。こ のサイズ範囲は身体内噴霧化に適しているであろう。 電荷比（-:+）1:3で処方されるCMV-CAT/ＤＯＴＭＡ:Chol（800ｎｍ）複合体を 、噴霧化カテーテルを用いてエアロゾル化した。噴霧化された処方の容量はｌｍ ｌであった。エアロゾル化ＤＮＡ：脂質複合体を衝突装置内で収集した。噴霧化 前および後の複合体の粒子サイズ分布を動的光散乱技術を用いて測定した。収集 されたエアロゾルのＤＮＡ濃度は、分光光度技術を用いて定量化した。ＤＮＡ： 脂質複合体の安定性およびプラスミドの完全性を、ゲル電気泳動を用いて評価し た。 ゲル電気泳動により、噴霧化前および後のＤＮＡ：脂質複合体は安定であり、 そしてプラスミドの完全性は維持されることが示された。噴霧化前および後の複 合体のサイズ分布に変化がなかったことから、複合体のコロイド性特質は維持さ れていることが示された。コントロールおよびエアロゾル化処方中のＤＮＡ濃度 はまったく同様で、装置が高いエアロゾル搬送効率を有することが示唆された。 Ｄ．ＩＬ-12処方の貯蔵安定性 上記のＩＬ-12処方は、少なくとも４週間安定であることが示されている。凍 結乾燥前および後の処方複合体安定性を最長８週間まで測定した。 第０週から第８週までＤＮＡ：脂質複合体サイズに変化はなかった。この観察 により、複合体のコロイド性特質は、湿性（wet）および凍結乾燥処方で維持さ れることが示された。また、複合体中のプラスミドのスーパーコイル型の割合も 、第０週から第８週まで、統計的に有意な違いを示さなかった。この観察により 、該プラスミドの完全性は、貯蔵に際し維持されることが示唆された。 これらの観察の見地から、他の産物をコードするＤＮＡを含む処方は、同様の 安定性を示すであろうことが期待される。IV ． 外因性ＩＬ-12の薬理学的活性 外因性ＩＬ-12投与は、多くの動物モデルにおいて薬理学的活性を有すること が示されてきた。これらのモデルにおいてＩＬ-12投与により観察される結果は 、ヒトにおけるＩＬ-12の治療能力を暗示する。こうした結果には、マウス喘息 モデルにおけるＩＬ-12の効果、およびさまざまな型のマウス腫瘍における効果 の立証が含まれ、どちらも直接的およびＤＮＡ免疫化のアジュバントとしての効 果である。 Ａ．アレルゲン誘導気道変化（アレルギー性喘息）に対する外因性ＩＬ-12の 効果 動物喘息モデルにおけるＩＬ.12効果の報告例が、Kipsら，1995，Int．Erch.All ergy．Immunol．107:115-118，およびKipsら，1996，Am．J．Respir．Crit.Care Med．153:535-539に提供される。これらの参考文献は、マウスにおける抗原誘導 気道変化に対するＩＬ-12の効果を記載する。本モデルにおいて、マウスは腹腔 内注射によりオボアルブミン（OA）に能動的に感作させた。その後、注射の14− 21日後に、動物を曝露室内でエアロゾル化オボアルブミンに曝露した。本措置の 結果、気道好酸球増加症、オボアルブミン特異的IgE産生、およびカルバコール に対する気道反応性冗進が起こった。注射によるＩＬ-12投与の第０日から第５ 日に、BAL液中に検出されるアレルゲン誘導好酸球流入が有意に減少し、アレル ゲン誘導IgE合成が阻害され、ならびにカルバコールへの反応性冗進がなくなっ た。本モデルにおいて、第14日から第21日のエアロゾルオボアルブミン曝露と共 にＩＬ-12投与を行うと、循環する特異的IgEの存在にも関わらず、気道好酸球増 加症および反応性亢進が除かれることも示された。 これらの結果は、ブラジル鉤虫（Nippostrongylus brasiliensis）に感染した マウスにＩＬ-12投与した際の効果が立証されたことと合わせ、ＩＬ-12がある種 の免疫系関連障害に対する効果的な治療剤となる可能性があることを示唆する。 Ｂ．ＩＬ-12の抗腫瘍活性 ＩＬ-12投与はまた、マウスにおいてさまざまな腫瘍の後退（regression）、 根絶、または確立の予防を引き起こす効果があることも示されてきた。抗腫瘍効 果は、全身性ＩＬ-12投与を用いて立証されてきた（Brendaら，1993，J．Ex．Me d. 178:1223;Nastalaら，1994，J．Immunol.）が、ＩＬ-12遺伝子治療もまた効果的 であることが示されてきた。 こうした立証の１つが、Rakhmilevichら，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:6 291-6296に報告されている。粒子仲介（遺伝子銃（gene gun））in vivo搬送を 用い、外因性ＩＬ-12遺伝子発現が多くの異なる皮内腫瘍に及ぼす影響を調べた 。Renca、MethA、SA-1、およびL5178Y移植腫瘍において、腫瘍に重層する上皮細 胞へのＩＬ-12ｃＤＮＡ搬送により、治療部位に検出可能なレベルのＩＬ-12タン パク質、および腫瘍の完全後退が生じた。完全後退には腫瘍移植の７日後に開始 される１から４回の治療が必要であった。 さらに、転移性Ｐ815腫瘍モデルを用いて、進行した皮内腫瘍上の皮膚へのＩ Ｌ-12ｃＤＮＡ搬送に続き、該腫瘍を切除しそしてさらに３回ＩＬ-12治療を行う と、全身性転移腫瘍の発生が減少した。この減少の結果、試験マウスの生存期間 が延長された。ＩＬ-12治療に起因する腫瘍後退もまた、特定の腫瘍に対する記 憶免疫反応の発生にも関係することが示された。 したがって、ＩＬ-12 in vivo遺伝子治療は、さまざまなマウス腫瘍モデルに おいて、皮内腫瘍の根絶または抑制に効果的な方法であることが示された。これ らの結果により、ヒトにおけるＩＬ-12遺伝子治療は同様の治療効果を持つであ ろうことが示唆される。 Teharaら，1996,J.Immunol．と同様、マウス皮内腫瘍に対するＩＬ-12遺伝子 治療の効果を研究した。Teharaらは、ＩＬ-12サブユニットをコードするレトロ ウイルス発現ベクターを利用した。MCA207メチルコラントレン誘導肉腫を用いた 場合、ＩＬ-12をコードするレトロウイルスベクターでトランスフェクションし た移植細胞は腫瘍を形成できなかった。逆に、非トランスフェクション細胞およ びＩＬ-12をコードしないレトロウイルスベクターでトランスフェクションした 細胞は常に触診可能な腫瘍を形成した。 マウスの片方の側腹部にＩＬ-12トランスフェクション細胞を接種すると、も う一方の側腹部に接種した非トランスフェクション細胞由来の腫瘍が形成される のが阻害されることも示された。同時に接種が行われた場合、強い阻害が報告さ れているが、ＩＬ-12トランスフェクション細胞が非トランスフェクション細胞 接 種の最大３日後に接種された際でも、有意な阻害が起こった。Rakhmilevichの研 究と同様、腫瘍特異的記憶免疫反応もまた立証された。 上記の参考文献に示されるように、報告された結果は、外因性ＩＬ.12を用い る抗腫瘍治療は、全身性に投与されても、または遺伝子治療を通じて投与されて も、さまざまなマウス腫瘍モデルに効果があることを立証している。同様に、こ うした研究により、ＩＬ-12治療はヒトにおいて効果的な抗腫瘍治療であろうこ とが示唆される。 Ｃ．ＩＬ-12のアジュバント効果 ＩＬ-12を喘息およびさまざまな腫瘍の治療モデルにおいて直接薬剤として使 用するのに加え、ＩＬ-12はアジュバントとして機能し、抗腫瘍ＤＮＡ免疫化に おける反応を増強するであろうことが示されてきている。例えば、Irvineら，19 96,J.Immunol．156:238-245では、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をトランスフェ クションしたマウス腺癌細胞株を用いた。β−ガラクトシダーゼはモデル抗原と して働く。β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドの遺伝子銃搬送を用い たＤＮＡ免疫化は、続く腫瘍細胞攻撃から転移性腫瘍が増殖するのを防いだ。し かし、この免疫化は確立した転移性腫瘍の増殖にはほとんどあるいはまったく効 果を持たなかった。 逆に、こうした確立した腫瘍を持つマウスに、ＤＮＡ免疫化に続き、18から24 時間後にＩＬ-12を投与することを含む治療は、ＤＮＡ免疫化のみ、またはＩＬ- 12投与のみの場合と比べて、肺転移数のかなりの減少を提供した。このように、 続いて行うＩＬ-12投与は、アジュバント効果を提供し、ＤＮＡ免疫化を増強し た。 ＩＬ-12によるアジュバント効果はまた、多くの他の抗原でも立証されている 。こうした結果により、ＩＬ-12アジュバントにより増強された抗腫瘍ＤＮＡ免 疫化は、有用な抗腫瘍治療である可能性があることが示唆される。Ｖ． モルモット抗原誘導気道炎症モデルにおけるＩＬ-12処方の搬送の効果 上記のＩＬ-12ＤＮＡ：脂質処方投与の効果を、モルモットの抗原誘導気道炎 症モデルを用いて評価した。該モデルの時間表図を図10に示す。一般的に、試験 は体重約250−300グラムで購入したHartleyモルモットを用いて行い、そして 450−500グラムで使用した。該処方をラットに関し上述したものと同様の方式で 点滴注入により投与した。点滴注入処方量は１mlであり、10％ラクトース中にＤ ＯＴＭＡ:cholと共にＩＬ-12をコードするプラスミドＤＮＡ50μｇを含み、そし て負対正の電荷比は1:3であった。処方は、800ｎｍ成形サイズリポソームを用い て調製した。第21日のオボアルブミン（OA）抗原攻撃の６時間（またはいくつか の試験では24時間）後、動物を殺し、そして肺を10mlのハンクス液（Hank's sol ution）で３回洗浄し、細胞を収集した。細胞を洗浄液から遠心分離により除き 、再懸濁し、赤血球を溶解し、そして無傷の細胞を計数した。 喘息の本モルモットモデルを用い、モルモットをＩＬ-12をコードする構築物5 0μｇを含む処方で前処置することにより、気管支肺胞洗浄細胞（BAL）数は、30 mg/kgのデキサメタゾンをOA攻撃の１時間前および４時間後に投与したのに匹敵 する程度に減少することが立証された。これらのBAL細胞数は、OA攻撃しない場 合の細胞数と同程度であった。これに対し、OA攻撃を受けたが、いかなる処方で も治療されなかったモルモットおよび、OA攻撃を受けた後、CATをコードする発 現構築物を有する処方を搬送されたモルモットは、同程度の、より高いBAL細胞 数を有した。CATをコードするＤＮＡを含む処方では、BAL細胞数が減少しなかっ た。 ＩＬ-12の抗炎症作用と一致して、総BAL細胞数の著しい減少が見られただけで なく、BAL細胞中の好酸球数が特異的に減少した。図11を参照されたい。 洗浄液中のヒトＩＬ-12濃度もまた測定した；ＩＬ-12濃度の増加は、一般的に 総BAL細胞数の減少と相関していることが見出された。ＩＬ-12濃度は、ヒトＩＬ -12ヘテロ二量体のサンドイッチELISA検定（R&D SystemsのQUANTIKINE^TMおよび 高感度QUANTIKINE^TM）を用いて測定された。検定キットの選択は、試験する液体 中の、予測されるＩＬ-12濃度に依存する。これらの検定は洗浄液中および細胞 抽出物中の両方のヒトＩＬ-12の確実な定量を示した。CAT検定に関し示したのと 同様に、他の検定法もまた、ＩＬ-12定量に使用してもよい。 ＩＬ-12をコードする処方で前処置したモルモットにおけるBAL細胞数の減少は また、動物が代わりに、さまざまな組み合わせのＩＬ-12でないものをコードす る処方構成要素、またはCATをコードするＤＮＡを含む処方で前処置された 際には見られないことが示された。一連の試験において、以下の処置を受けたモ ルモットで、以下のBAL細胞数が観察された：（1）OA攻撃なし、約５ｘ10⁶BAL細 胞／動物；（2）OA攻撃とデキサメタゾン処置、約９ｘ10⁶細胞／動物；（3）OA 攻撃、約28ｘ10⁶細胞／動物；（4）OA攻撃および10％ラクトース前処置、約41x1 0⁶細胞／動物；（5）OA攻撃および水中のCATをコードするＤＮＡ50μｇによる前 処置、約30x10⁶細胞／動物。 本モデルで得られた結果から、ＩＬ-12をコードするＤＮＡを含む本発明の処 方を肺に投与すると、ＩＬ-12の生物学的に効果的な発現が産生されることが示 された。VI ． 投与 本明細書において、投与は、体内にＤＮＡのプラスミドまたはキャリアーを導 入する経路を指す。上記の搬送法に加え、発現系構築物および搬送系処方を、さ まざまな異なる方法により投与することができる。 投与は、標的組織に直接行ってもよいし、また全身投与の後、標的組織に標的 搬送することによってもよい。特に、本発明は、いかなる特定の核酸配列でも組 織内で遺伝子治療に有用なあるレベルでの調節発現を確立するために、発現系ま たは処方を身体に投与することにより、疾患を治療するのに用いることができる 。 好ましいベクター投与の手段および搬送のための処方の使用は、上述の通りで ある。好ましい態様は、噴霧化処方を動物の気道に沈着させることによるか、ま たは針注射またはハイポスプレー（hypospray）を用いた直接注入による。 いかなる選択されたベクター構築物でも投与経路は該発現ベクターの特定の用 途に依存するであろう。一般的に、用いられる各ベクター構築物の特定の処方は 、特定の標的組織に関連したベクター取りこみ、およびその後の効率の立証に重 点が置かれるであろう。取りこみに関する研究には、ベクターの細胞への取りこ みおよび選択されたＤＮＡ発現を評価する取りこみ検定が含まれるであろう。こ うした検定はまた、取りこみ後の標的ＤＮＡの局在、および発現タンパク質の定 常状態濃度の維持に必要な条件の確立を決定するであろう。その後、有効性およ び細胞毒性を試験してもよい。毒性は細胞生存性のみでなく、細胞機能も含むで あ ろう。 筋細胞は、溶液、懸濁物またはコロイドとしてＤＮＡ粒子を筋肉に単に注射し た後、細胞外空間からＤＮＡを取りこむ特有の能力を有する。本方法によるＤＮ Ａ発現は数か月維持される可能性がある。 処方ＤＮＡベクターの搬送には、標的細胞によるエンドサイトーシスを受ける 巨大分子複合体にＤＮＡを取りこませることを含む。こうした複合体は、脂質、 タンパク質、炭水化物、合成有機化合物、または無機化合物を含んでもよい。好 ましくは、該複合体はＤＮＡ、陽イオン脂質、および中性脂質を特定の比率で含 む。ベクターと共に形成される複合体の特性（大きさ、電荷、表面特性、組成） は、体内でのベクターの生物学的利用能を決定する。処方の他の要素は、リガン ドとして機能し、細胞の表面または内部の特定の受容体と相互作用する。処方の 他の要素は、細胞への進入、エンドソームからの放出、および核への進入を増強 するよう機能する。 搬送はまた、ＤＮＡ輸送体（transporter）の使用を通じて行ってもよい。Ｄ ＮＡ輸送体は、ＤＮＡベクターに結合し、そして上皮細胞に取りこまれることが 可能な分子を指す。ＤＮＡ輸送体は、非共有的にＤＮＡと結合し、そして効率的 にＤＮＡを細胞膜を通して輸送することが可能である分子複合体を含む。該輸送 体はまた、核膜を通してＤＮＡを輸送することが好ましい。例えば、すべて本明 細書に援用される（図を含む）以下の出願を参照されたい：（1）Wooら、米国第 07/855,389号、表題"A ＤＮＡ Transporter System and Method of Use"、1992 年３月20日提出、現在出願放棄；（2）Wooら、PCT/US93/02725、国際公告WO93/1 8759、表題“A ＤＮＡ Transporter System and Method of Use”、（米国およ び他の国に示される）、1993年３月19日提出；（3）Wooらによる一部継続出願、 表題“Nucleic Acid Transporter Systems and Methods of Use”、1993年12月1 4日提出、米国第08/167,641号；（4）Szokaら、米国第07/913,669号、表題“Sel f-Assembling Polynucleotide Delivery System”、1992年７月14日提出、およ び（5）Szokaら、PCT/US93/03406、国際公告WO93/19768、表題“Self-Assemblin g Polynucleotide Delivery System”、（米国および他の国に示される）、1993 年４月５日提出。 遺伝子の直接的な筋肉への搬送は、非常に効果的であった。実験により、ＤＮ Ａの筋細胞への直接注入による投与の結果、注射領域で遺伝子が発現することが 示される。IGF-Iを含むプラスミドの注射の結果、比較的一定のレベルで、何か 月も該遺伝子が発現する。注射されたＤＮＡは、組み込まれず染色体外にある状 態でありつづけるようである。輸送のこの手段は好ましい態様である。 搬送法として好ましい別の方法は、ＤＮＡ輸送体系を含む。該ＤＮＡ輸送体系 は、独立してそしてＤＮＡに非共有的に結合するいくつかの要素を含む粒子から なる。各要素は、特定の受容体を認識するリガンド、または例えばＤＮＡに結合 する陽イオン基と複合体を形成するタンパク質などの他の機能的群（functional group）からなる。使用してもよい陽イオンの例には、スペルミン、スペルミン 誘導体、ヒストン、陽イオンペプチドおよび／またはポリリジンがある。１つの 要素はＤＮＡベクターおよび標的細胞の細胞表面受容体の両方に結合することが 可能である。こうした要素の例には、アシアロ糖タンパク質受容体、葉酸受容体 、マンノース−６−リン酸受容体またはカルニチン受容体と相互作用する有機化 合物がある。第二の要素は、ＤＮＡベクターおよび核膜上の受容体の両方に結合 することが可能である。核リガンドは核膜を通じ、輸送体系を認識しそして輸送 することが可能である。こうしたリガンドの例には、SV40ラージＴ抗原またはヒ ストン由来の核標的配列がある。第三の要素は、ＤＮＡベクターおよびエピソー ム分解を誘発する要素の両方に結合することが可能である。例には、アデノウイ ルスなどの不活性ウイルス粒子、インフルエンザウイルス赤血球凝集素関連ペプ チド、または上に引用されたSzoka特許に記載されるGALAペプチドがある。 投与はまた、上記の好ましい態様の脂質を含んでもよい。脂質は、単層、二層 または多層方式で、そして内部水性空間がＤＮＡなどの水溶性化合物を捕捉する ように配置された脂質からなる、直径0.05から数ミクロンの範囲の空洞の球状小 胞であるリポソームを形成してもよい。脂質は、リポソームを形成しなくても有 用である可能性がある。特定の例には、ＤＮＡおよび標的細胞の膜と相互作用し 、ＤＮＡが該細胞に進入するのを容易にする、陽イオン脂質およびDOPEを含む複 合体の使用が含まれる。 遺伝子搬送はまた、遺伝子操作された細胞の移植により行ってもよい。例えば 、 筋芽細胞（myoblast）と呼ばれる末成熟筋細胞を使用して、遺伝子を筋繊維内に 運んでもよい。組換えヒト成長ホルモンを発現するよう遺伝子操作された筋芽細 胞は、動物血液中に成長ホルモンを分泌することが可能である。取りこまれた遺 伝子の分泌は最長３か月間に渡り維持されることが可能である。 筋芽細胞は次第に分化し、そして存在する筋肉組織に融合する。該細胞が存在 する構造に取りこまれるため、寛容されるばかりでなく、成長を促進される。筋 芽細胞は遺伝子治療を必要とする個人から筋組織を採取することにより容易に得 られ、そして遺伝子操作された細胞もまた患者の筋肉に損傷を与えることなく、 容易に戻すことが可能である。同様に、角化細胞を用いて遺伝子を組織に搬送し てもよい。微量生検の培養により、多量の角化細胞を生成することが可能である 。培養物を層別化シートとして調製し、そしてヒトに移植した際、表皮を生成し 、何年にも渡って組織特異的特性を改良しつづける。角化細胞は、培養中に適切 なベクターをトランスフェクションすることにより、遺伝子操作する。角化細胞 は、表皮を真皮から分離する基底膜により血液循環とは分けられているが、ヒト 角化細胞は、産生されたタンパク質を血液循環中に分泌する。 選択された搬送法の結果、適切な生物学的効果を発揮するレベルで、核酸カセ ット内にコードされた遺伝子産物を発現するはずである。発現速度は疾患、ベク ターおよび遺伝子産物の薬物動態、および投与経路に依存するであろうが、１− 1000mg／体重kg／日の間であるべきである。このレベルは、標準的な方法により 容易に測定可能である。これは多かれ少なかれ最適用量に依存するであろう。治 療期間は、疾患症状の経過を通じて延長され、連続的でもよい。投薬回数は疾患 、搬送ベヒクルおよび臨床試験からの有効性データに依存するであろう。 当業者は、本発明が目的を達成するためによく適応していること、および本発 明に固有のものと共に言及された利点を、容易に理解するであろう。本明細書に 記載されたプラスミド構築物は、処方、方法、および治療と共に、現在、典型的 な好ましい態様の代表であり、そして本発明の範囲を限定するものとして意図さ れていない。当業者は、本発明中に改変および他の用法を思いつくであろうし、 そしてこれらは本発明の精神に含まれ、または請求項の範囲により定義される。 本発明の範囲および精神から離れることなく、本明細書に開示される本発明に 、多様な置換および修飾を作成することが可能であることは、当業者には容易に 明らかであろう。 本明細書中に言及されたすべての特許および刊行物は、個々の刊行物が明確に そして個別に援用されると示されたのと同程度に、本明細書に援用される。

【手続補正書】 【提出日】平成１１年５月２０日（１９９９．５．２０） 【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 14/54 Ｃ０７Ｋ 14/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 デシュパンデ，ディーパ アメリカ合衆国テキサス州77381，ザ・ウ ッドランズ，ホリー・クリーク・コート 333，ナンバー 1306

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 組換え真核生物遺伝子の発現のためのプラスミドであって、 第一の５’−非翻訳領域、第一の合成イントロン、第一のコード配列、および第 一の合成３’−非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナルに転写的に連結した第一の転写 調節配列を含む第一の転写単位、ここで前記第一の合成イントロンは前記調節配 列と前記第一のコード配列との間にあり；および 第二の５’−非翻訳領域、第二の合成イントロン、第二のコード配列、および第 二の合成３’−非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナルに転写的に連結した第二の転写 調節配列を含む第二の転写単位、ここで前記第二の合成イントロンは前記調節配 列と前記第二のコード配列との間にある、 を含むことを特徴とするプラスミド。 ２． 前記第一の転写調節配列または前記第二の転写調節配列がサイトメガロウ イルスプロモーター／エンハンサー配列を含む、請求項１記載のプラスミド。 ３． 前記第一のコード配列または前記第二のコード配列が治療用分子または治 療用分子のサブユニットをコードする、請求項１記載のプラスミド。 ４． 前記第一の転写調節配列および第二の転写調節配列が同一である、請求項 １記載のプラスミド。 ５． 前記第一の転写調節配列および第二の転写調節配列が異なる、請求項１記 載のプラスミド。 ６． 前記第一のコード配列および前記第二のコード配列が、ヒトＩＬ−１２の ｐ４０サブユニットをコードする配列およびヒトＩＬ−１２のｐ３５サブユニッ トをコードする配列を含む、請求項１記載のプラスミド。 ７． ヒトＩＬ−１２のｐ４０サブユニットをコードする前記配列がヒトＩＬ− １２のｐ３５サブユニットをコードする前記配列の５’側にある、請求項６記載 のプラスミド。 ８． 組換え真核生物遺伝子の発現のためのプラスミドであって、可変スプライ シングを有するイントロン、第一のコード配列、および第二のコード配列を含む プラスミド。 ９．さらに、 第一のコード配列および第二のコード配列に転写的に連結した転写調節配列； ５’−非翻訳領域； 前記第一のコード配列の５’側のイントロン； 前記第一のコード配列の３’側かつ前記第二のコード配列の５’側にある代替ス プライシング部位；および ３’−非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナル を含む、請求項８記載のプラスミド。 １０． 前記第一のコード配列または前記第二のコード配列が、治療用分子また は治療用分子のサブユニットをコードする、請求項９記載のプラスミド。 １１． 前記転写調節配列がサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー 配列を含む、請求項９記載のプラスミド。 １２． 前記第一のコード配列および前記第二のコード配列が、ヒトＩＬ−１２ のｐ４０サブユニットをコードする配列およびヒトＩＬ−１２のｐ３５サブユニ ットをコードする配列を含む、請求項８記載のプラスミド。 １３． 組換え真核生物遺伝子の発現のためのプラスミドであって、 第一のコード配列、ＩＲＥＳ配列、第二のコード配列、および３’一非翻訳領域 ／ポリ（Ａ）シグナルに転写的に連結した転写調節配列、ここで前記ＩＲＥＳ配 列は前記第一のコード配列と前記第二のコード配列との間にあり；および 前記プロモーターと前記第一のコード配列との間にあるイントロン を含むことを特徴とするプラスミド。 １４． 前記転写調節配列がサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー 配列を含む、請求項１３記載のプラスミド。 １５． 前記第一のコード配列および前記第二のコード配列が、ヒトＩＬ−１２ のｐ４０サブユニットをコードする配列およびヒトＩＬ−１２のｐ３５サブユニ ットをコードする配列を含む、請求項１３記載のプラスミド。 １６． 前記ＩＲＥＳ配列が、脳心筋炎ウイルスからのものである、請求項１３ 記載のプラスミド。 １７． 天然のヒトＩＬ−１２サブユニットコード配列に対して５０％未満の同 一性を有する合成ヌクレオチド配列を含む、ヒトＩＬ−１２サブユニットをコー ドするＤＮＡ配列。 １８． 前記合成ヌクレオチド配列が配列番号３の配列に対して少なくとも９９ ％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１７記載のＤＮＡ配列。 １９． 前記合成ヌクレオチド配列が、配列番号３または４の配列と同一のヌク レオチド配列を含む、請求項１８記載のＤＮＡ配列。 ２０． 前記合成ヌクレオチド配列が、配列番号７の配列に対して少なくとも９ ９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１７記載のＤＮＡ配列。 ２１． 前記合成ヌクレオチド配列が配列番号７または８の配列と同一のヌクレ オチド配列を含む、請求項２０記載のＤＮＡ配列。 ２２． 哺乳動物においてＤＮＡ分子を搬送するための組成物であって、 約８００ナノメーターの押し出し成形サイズを有するリポソームとして調製され た、中性捕脂質を有する陽イオン性脂質；および コード配列を含む若干量のＤＮＡ、 を含む組成物。 ２３． 前記ＤＮＡの少なくとも約８０％がスーパーコイル型である、請求項２ ２記載の組成物。 ２４． 前記ＤＮＡの少なくとも約９０％がスーパーコイル型である、請求項２ ３記載の組成物。 ２５． 前記ＤＮＡの少なくとも約９５％がスーパーコイル型である、請求項２ ４記載の組成物。 ２６． 前記陽イオン性脂質および前記ＤＮＡが負対正の電荷比が約１：３で存 在する、請求項２２記載の組成物。 ２７． さらに等張炭水化物溶液を含む、請求項２２記載の組成物。 ２８． 前記等張炭水化物溶液が約１０％ラクトースから本質的になる、請求項 ２７記載の組成物。 ２９． 前記陽イオン性脂質がＤＯＴＭＡであり、前記中性捕脂質がコレステロ ールである、請求項２２記載の組成物。 ３０． 哺乳動物においてＤＮＡ分子を搬送するための組成物であって、 中性捕脂質を有する陽イオン性脂質；および コード配列を含む若干量のＤＮＡを含み、 前記陽イオン性脂質および前記ＤＮＡが負対正の電荷比が約１：３で存在するこ とを特徴とする組成物。 ３１． 前記ＤＮＡの少なくとも約８０％がスーパーコイル型である、請求項３ ０記載の組成物。 ３２． 前記ＤＮＡの少なくとも約９０％がスーパーコイル型である、請求項３ １記載の組成物。 ３３． 前記ＤＮＡの少なくとも約９５％がスーパーコイル型である、請求項３ ２記載の組成物。 ３４． さらに等張炭水化物溶液を含む、請求項３０記載の組成物。 ３５． 前記等張炭水化物溶液が約１０％ラクトースから本質的になる、請求項 ３４記載の組成物。 ３６． 前記陽イオン性脂質がＤＯＴＭＡであり、前記中性捕脂質がコレステロ ールである、請求項３０記載の組成物。 ３７． ＤＮＡを哺乳動物に搬送するための組成物を製造する方法であって、 ａ． コード配列を含むＤＮＡを調製し； ｂ． 約８００ｎｍの押し出し成形サイズを有するリポソームを調製し、ここで 前記リポソームは陽イオン性脂質および中性捕脂質を含み；そして ｃ． 前記リポソームを、前記陽イオン性脂質および前記ＤＮＡが負対正の電荷 比が約１：３で存在するような量で前記ＤＮＡと組み合わせる、 の各工程を含む方法。 ３８． 哺乳動物の病状または疾患を治療する方法であって、 前記病状または疾患を患う哺乳動物に、哺乳動物中にＤＮＡ分子を搬送するため の組成物を投与することを含み、 前記ＤＮＡは治療用分子またはそのサブユニットをコードするコード配列を含み 、かつ 前記組成物は陽イオン性脂質、中性捕脂質および前記ＤＮＡを含み、前記陽イオ ン性脂質および前記ＤＮＡについて負対正の電荷比が約１：３である、 ことを特徴とする方法。 ３９． 前記組成物が超音波噴霧により投与されるために調製される、請求項３ ８記載の方法。 ４０． 前記ＤＮＡが、ヒトＩＬ−１２ｐ４０サブユニットおよびｐ３５サブユ ニットをコードする２つのコード配列を含む、請求項３８記載の方法。 ４１． 前記疾患または病状が喘息である、請求項３８記載の方法。 ４２． 前記疾患または病状が癌である、請求項３８記載の方法。 ４３． 陽イオン性脂質、中性捕脂質、およびＤＮＡを含むワクチンアジュバン トであって、 前記ＤＮＡはＩＬ−１２のｐ４０サブユニットおよびＩＬ−１２のｐ３５サブユ ニットをコードする配列を含み、かつ 前記陽イオン性脂質および前記ＤＮＡは、負対正の電荷比が約１：３で存在する ことを特徴とするワクチンアジュバント。 ４４． ワクチンに対する哺乳動物の応答を増強する方法であって、前記哺乳動 物にワクチンおよびアジュバントを投与することを含み、 前記アジュバントは陽イオン性脂質、中性捕脂質、およびＤＮＡを含み、前記Ｄ ＮＡはＩＬ−１２のｐ４０サブユニットおよびＩＬ−１２のｐ３５サブユニット をコードする配列を含み、かつ 前記陽イオン性脂質および前記ＤＮＡは、負対正の電荷比が約１：３で存在する 、ことを特徴とする方法。