JP2001502666A

JP2001502666A - 肺遺伝子送達のための組成物および方法

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Publication number: JP2001502666A
Application number: JP10513850A
Authority: JP
Inventors: エス．ピライ，ラビラー; ローランド，アレイン
Original assignee: ジェネメディシン，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-09-12
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 2001-02-27
Also published as: AU738838B2; CA2265838A1; AU4583097A; WO1998010796A1; EP0956051A1; US6271206B1

Abstract

(57)【要約】気道への遺伝子送達のための組成物および方法が提供される。特に、霧状化核酸／安定化剤複合体を含む組成物、およびこのような複合体を肺遺伝子送達のために用いる方法が提供される。このような組成物は、好ましくは、超音波霧状にされる。

Description

【発明の詳細な説明】肺遺伝子送達のための組成物および方法技術分野本発明は、一般に、気道上皮細胞への遺伝子送達の分野に関する。本発明は、より詳細には、霧状化核酸／安定化剤複合体を含む組成物、およびこのような複合体を患者への核酸送達のために用いる方法に関する。発明の背景吸入を介する遺伝子送達は、種々の疾患の処置および防止のかなりの見込みを示す技術であるが、その適用は、実用上の困難性により制限されてきた。特に、安全性への関心が、いくつかのエアロゾル遺伝子送達方法（特に、ウイルスに基づく系を含むエアロゾル遺伝子送達方法）の開発を緩慢にさせており、そして他の送達方法の適用は、効率の問題により制限されている。遺伝子送達の見込みのあるアプローチの１つは、脂質に基づくキャリア、すなわちリポソームの使用を含む。しかし、他のキャリアのように、リポソームは、通常用いられる薬物送達装置を用いる核酸送達については非効率的であった。エアロゾル薬物送達のために用いられてきた薬学的装置は、計量吸入器（mete red dose inhaler）（MDI）、乾燥粉体吸入器（DPI）、および空気噴出噴霧器を含む。このような装置は、いくつかの治療剤の送達に適しているが、これらの装置を介する遺伝子送達は、実用上の問題を示す。MDIは、遺伝子送達には用いられていない。なぜなら、プラスミドを高圧ガス混合物とともに処方することの困難性のためである。DPIもまた、遺伝子送達に適切ではない。なぜなら、法外に速い吸入空気流速度が、粉体ブレンドの有効な分散を達成するために必要とされるからである。現在、遺伝子送達のための最も実用的な薬学的装置は、空気噴出噴霧器である。この装置は、オリフィスを介して高速空気噴出を送達して、リザーバーからの液体を空気流にするベンチュリ効果を生じるために、圧縮空気供給源を使用する。空気と液体との間の異なった速度は、液体をバラバラにして小滴を生じ、大多数の小滴は、呼吸可能な範囲（１〜５μｍ）である。噴出噴霧器は、脂質に基づく遺伝子送達に好ましい。なぜなら、処方の比較的容易さ（例えば、しばしば非経口処方物は、直接使用され得る）、用量調節の融通性（濃度および頻度）、入手可能性および時間をかけて実証された送達技術のためである。噴霧器の薬物リザーバーはまた、高用量のエアロゾル化治療剤を肺に投与するように設計され得る。しかし、空気噴出噴出器を用いる遺伝子送達にはかなりの欠点（携帯性がないこと、ユニット毎の排出の変動性、大きなデッドボリューム、および排出される溶液対溶媒の変動を含む）が残っている。送達効率（噴出される薬物の質量対下気道において沈着される薬物の質量の比として定義される）は非常に低い−２％未満。この低い送達効率は、この系を介する一定の空気流に寄与し得、排出エアロゾル流の連続的な噴霧化および付随した希釈をもたらす。さらに、噴出噴霧器を用いて、エアロゾルは、呼吸周期の60％をしめる呼息の間に、均等に生成される。従って、肺遺伝子送達の改善された方法についての必要性が当該分野に存在する。本発明はこれらの必要性を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。発明の要旨簡略に述べれば、本発明は、肺遺伝子送達のための組成物および方法を提供する。１つの局面では、本発明は、核酸送達装置を提供する。この装置は、１つの実施態様では、(a)超音波噴霧器（sonic nebulizer）、(b)核酸、および(c)安定化剤を備え、ここで、核酸および安定化剤は、超音波噴霧器の中に含まれる。関連する実施態様では、核酸および安定化剤は、別々の容器の中で提供され、超音波噴霧器は、この容器を受け、そしてそれからの吸入に適切なエアロゾルを生じるように適用される。別の局面では、超音波霧状化核酸／安定化剤複合体を調製するための方法が提供される。この方法は、(a)少なくとも１つの核酸を、少なくとも１つの安定化剤と合わせて複合体を形成させる工程；および(b)複合体のエアロゾルを、超音波噴霧器で形成させる工程を含む。関連する局面では、本発明は、超音波霧状化核酸／安定化剤複合体を提供する。ここで、複合体は、少なくとも１つの核酸および少なくとも１つの安定化剤を含み、そしてここで複合体は、超音波により霧状化されてエアロゾルを形成する。さらなる局面では、本発明は、超音波霧状化核酸／安定化剤複合体で患者を処置するための方法を提供する。この方法は、超音波霧状化核酸／安定化剤複合体を患者に提供する工程を含み、ここで、複合体は、患者による吸入に適切である。関連する局面では、治療用タンパク質をコードする核酸で患者を処置するための方法が開示される。この方法は、上で議論されたような複合体を患者に提供する工程を含み、ここで、複合体は、患者による吸入に適切である。なお別の関連する局面では、超音波霧状化核酸／安定化剤複合体で患者を処置するための方法が提供される。この方法は、(a)少なくとも１つの核酸と少なくとも１つの安定化剤を合わせて複合体を形成させる工程；(b)複合体のエアロゾルを、超音波噴霧器で形成させる工程；および(c)エアロゾルに患者による吸入を提供する工程を含む。なおさらなる局面では、本発明は、霧状化核酸／安定化剤複合体で患者を処置するための方法を提供する。この方法は、霧状化核酸／安定化剤複合体を患者に提供する工程を含み、ここで、安定化剤は、カチオン性脂質を有し、正味の正の荷電を有し、そして患者による吸入に適切である。関連する局面では、霧状化核酸／カチオン性脂質複合体で患者を処置するための方法が提供される。この方法は、(a)少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのカチオン性脂質を合わせて、正味の正の荷電を有する複合体を形成させる工程；(b)複合体のエアロゾルを、噴霧器で形成させる工程；および(c)エアロゾルに患者による吸入を提供する工程を含む。本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより明らかになる。本明細書中に開示される全ての参考文献は、各々が個々に援用されたかのように、本明細書によってその全体が参考として援用される。図面の簡単な説明図１は、異なった荷電比の代表的な核酸／安定化剤複合体（50μｇのプラスミドDNAを含む）の気管内滴注後のラットの肺におけるCAT発現のレベル（全肺あたりのpg CATとして示す）を示すグラフである。評価した荷電比（−：＋）は、１：0.5（第３カラム）、１：0.8（第４カラム）、１：２（第５カラム）、および１：３（第６カラム）であった。ラクトース（第１カラム）および水（第２カラム）中でのCMV-CATの滴注後に観察された発現のレベルもまた示す。第３カラム〜第６カラムについては、括弧内の数字は、裸のDNAを越える増強倍数を示す。図２は、異なったサイズのリポソームを用いて処方された代表的な核酸／安定化剤複合体（50μｇのプラスミドDNAを含む）の気管内滴注後のラットの肺におけるCAT発現のレベル（全肺あたりのpg CATとして示す）を示すグラフである。１：３の荷電比（−：＋）を有するCMV-CAT/DOTMA：Cholの発現レベルは、237nm （第１カラム）、392nm（第２カラム）、および901nm（第３カラム）の粒径を有する複合体を示す。図３は、気管内滴注後の一連の代表的な核酸／安定化剤複合体のトランスフェクション効率を示すヒストグラムである。発現のレベルは、裸のDNAを越える増強倍数として表す。各例において、プラスミド／脂質複合体は、異なった孔径を有するポリカーボネートフィルターを通して押し出されたカチオン性リポソームを用いて、１：３の荷電比（−：＋）で処方された。複合体は、10％ラクトース中に、125μｇ/mLの濃度で処方された。評価した複合体（フィルター孔サイズを有する）は、DOTMA：DOPE：Chol 800nm（第１カラム）、DOTMA：DOPE MLV（第２カラム）、DOTMA：Chol 800nm（第３カラム）、DOTMA：DOPE 800nm（第４カラム）、DOTMA:DOPE 400nm（第５カラム）、DOTMA：Chol 100nm（第６カラム）、DOT MA：DOPE 100nm（第７カラム）、EDOPC（すなわち、エチルジオレイルホスファチジルコリン）：DOPE 100nm（第７カラム）、およびDOTMA：DOPE SUV（第８カラム）であった。図４は、50μｇの代表的な非霧状化核酸／安定化剤複合体（第１カラム）、または霧状化（第２カラム）もしくは残余（第３カラム）複合体の超音波噴霧器からの気管内滴注後のラットの肺におけるCAT発現のレベル（全肺あたりのpgのCAT として示す）を示すヒストグラムである。各々の例では、複合体は、CMV-CAT／D OTMA：Chol（直径530nm、荷電比（−：＋）１：３）であった。第２カラムおよび第３カラムは、それぞれ、10分間および30分間の霧状化の後の複合体の発現のレベルを示す。図５は、噴出噴霧器または超音波噴霧器での霧状化による、代表的なエアロゾル化核酸／安定化剤複合体の吸入後のCAT発現のレベル（全肺あたりのpg CATで）を示すヒストグラムである。各々の例では、複合体は、CMV-CAT／DOTMA：Chol （直径815nmおよび１：３（−：＋荷電））であった。第１カラム〜第３カラムは、噴出霧状化および鼻への曝露の後の発現のレベルを示す。第１カラムについては、吸入時間は60分間であり、そして送達されたDNA用量は2.1μｇ（測定値）であり；第２カラムについては、吸入時間は120分間であり、そして送達されたD NA用量は4.2μｇ（測定値）であり；そして第３カラムについては、吸入時間は2 40分間であり、そして送達されたDNA用量は6.4μｇ（測定値）であった。第４カラムは、超音波霧状化および10.5μｇの送達されたDNA用量（測定値）で10分間の経口吸入の後の発現のレベルを示す。各々の場合、動物の肺に沈着したエアロゾルの用量は、以下の式を用いて評価された：沈着した用量＝エアロゾル濃度(μｇ/L)×呼吸した空気の容量(Ｌ)×沈着係数。エアロゾル濃度は、臨界流速オリフィスを用いて所定の流速でフィルター上へのエアロゾルをサンプリングすることにより決定された。呼吸した空気の容量は、動物の通気パラメーターから評価した（HarknessおよびWagner，「The Biology and Medicine of Rabbits and Rodents」、LeaおよびFebiger，Philadelphia，1 983）。沈着モデルを用いて、下気道に沈着したエアロゾルの画分を評価した（S chlesinger，「Deposition and Clearance of Inhaled Particles」，R.O．McCl ellanおよびR.T．Henderson編「Concepts in Inhalation Toxicology」，Hemisp here Publishing Corporation，New York，1988）。図６は、水で再水和して等張にする際の、代表的な凍結乾燥したおよび噴出製粉核酸／安定化剤複合体の気管内滴注後のラットの肺におけるCAT発現のレベル（全肺あたりのpg CAT）を示すグラフである。CMV-CAT／DOTMA：Chol複合体（１：３（−：＋）の荷電比を有する）は、50μｇのDNA用量で滴注された。第１カラムは、ポジティブコントロールラット（10％ラクトース中に処方されたCMV- CAT／DOTMA：Cholで滴注された、粒子サイズ422nm）における発現のレベルを示し；第２カラムは、凍結乾燥複合体（456nmの粒子サイズ）での滴注後のCAT発現のレベルを示し；そして第３カラムは、噴出粉砕された複合体（488nmの粒子サイズ）での滴注後の発現のレベルを示す。図７は、凍結乾燥したプラスミド／脂質複合体の安定性を示すグラフである。 CMV-CAT／DOTMA：Chol複合体（１：２（−：＋）の荷電比を有する）を凍結乾燥し、そして等張まで再構成した。０日目ならびに１、２、および４ヶ月後に測定した粒子サイズ（nm）およびゼータ電位（ｍＶ）を示す。図８は、非霧状化、エアロゾル化、および残余のプラスミド／脂質複合体における代表的なプラスミドのスーパーコイル形態の画分を示すグラフである。第１カラムは非霧状化複合体のスーパーコイルの％を示し、第２カラムは10分間のエアロゾル化複合体のスーパーコイルの％を示し、そして第３カラムおよび第４カラムはそれぞれ10分間および30分間後の残余の複合体のスーパーコイルの％を示す。図９は、超音波噴霧器からのエアロゾル化プラスミド／脂質複合体のサイズ分布を示すグラフである（一連の有効カットオフ直径未満の蓄積％として示す）。示した有効カットオフ直径は、0.4μｍ（第１カラム）、0.7μｍ（第２カラム）、1.1μｍ（第３カラム）、2.1μｍ（第４カラム）、3.3μｍ（第５カラム）、4 .7μｍ（第６カラム）、5.8μｍ（第７カラム）、および９μｍ（第８カラム）である。発明の詳細な説明上記のように、本発明は、一般に、肺遺伝子送達のための組成物および方法に関する。本発明の状況では、安定化剤（例えば、カチオン性脂質キャリア）と複合体化した遺伝子は、エアロゾル中に効率的に処方され、そして超音波霧状化の使用を介して患者に送達され得ることが見出されている。従って、本発明は、特に、超音波霧状化核酸／安定化剤複合体を含む組成物、このような組成物を含む超音波噴霧器、および患者の気道への治療用核酸薬物の送達のためのこのような組成物の使用に関する。本発明の状況では、核酸／安定化剤複合体の荷電が、霧状化または気管内滴注を介する遺伝子移入効率に影響を与える重要な要素であることもまた見出されている。より詳細には、正に荷電した複合体は、負に荷電した複合体よりも高レベルのトランスジーン発現をもたらし、そしてその効率は、正荷電の増加に伴って改善する。従って、本発明はまた、遺伝子移入を増強するように選択された荷電比（代表的には、少なくとも１：２の比（−：＋））を有する核酸／安定化剤複合体を含む組成物に関する。好ましくは、このような複合体は、患者への投与の前に霧状化される。本明細書で用いられる用語「霧状化」は、本明細書中で記載されるように、噴出霧状化または超音波霧状化により処理され、エアロゾルを形成する複合体をいう。用語「超音波霧状化」は、超音波霧状化により処理された複合体をいう。任意の市販の噴霧器を用いて、霧状化複合体を調製し得る。超音波霧状化複合体の調製のために、Omron Model NE-U07（Omron Health Care，Inc.，Lake View，IL ）のような超音波噴霧器が用いられ得る。超音波噴霧器は、非常に高い周波数で振動してリザーバー溶液中に波動を誘導する圧電性トランスデューサーを用いる。液体の表面でのこれらの波動の干渉は、エアロゾル（すなわち、コロイド状粒子の懸濁液）としての小滴の生成を導き、次いでこれは気流により運ばれる。この方法は、呼吸可能な範囲の粒子（代表的には１〜５μｍ）を含むエアロゾルを生成する。本発明の何らかの理論または機構に結びつけられることを望まないが、超音波霧状化核酸／安定化剤複合体の高い送達効率は、超音波噴霧器が受容的な態様で操作され、そして吸入の間にのみ、一方向弁を介してボーラスとしてエアロゾルを送達するという事実に寄与し得ると考えられる。このことは、呼息の間のエアロゾルの喪失を最小にする。任意の核酸分子が、本発明の霧状化核酸／安定化剤複合体の調製に用いられ得るが、プラスミドDNAおよびRNA分子が好ましい。好ましくは、複合体のサイズは、２μｍ未満であり、超音波噴霧器による有効なエアロゾル形成を可能にする。好ましい核酸分子は、目的の遺伝子を含むプラスミド発現ベクターである。このようなプラスミドは、当業者に周知の技術（例えば、Sambrookら，Molecular Cl oning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring H arbor，N.Y.,1989に見出される技術）を用いて調製され得る。好ましいプラスミドは、サイトカイン（例えばIL-12であるがこれに限定されない）、プロテアーゼインヒビターα-1アンチトリプシン、嚢胞性線維症膜貫通レギュレーター、および他のこのようなタンパク質をコードするプラスミドである。本発明の状況では、「安定化剤」は、核酸分子に複合体化された場合、核酸のトランスフェクション効率の有意な喪失を伴わずに、複合体の超音波霧状化を可能にする任意の化合物または物質であり得る。霧状化の際のスーパーコイル形態（最も強力なかつ壊れやすいプラスミドの物理的形態）の喪失は、20％未満であるべきである。適切な安定化剤は、１つ以上の脂質、ペプチド、および／またはポリマーを含む。例えば、１：３：１の荷電比（−：＋：−）で処方された縮合ペプチド（GM208）および溶解ペプチド（GM225.1）を含むペプチド／DNA複合体は、粒径およびゼータ電位測定により示されるように、霧状化のあとに安定である。脂質は好ましい安定化剤であり、そしてカチオン性脂質（例えば、N-[1-2,3 -ジオレオイルオキシ)プロピル]-N-N-N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTM A））は特に好ましい。カチオン性脂質は、代表的には、エンドソーム膜に融合し、そしてそれらの物理的状態を調整することにより、核酸／脂質複合体のエンドサイトーシス性取り込みの後にエンドソームからのDNAの放出を促進するヘルパー脂質（または共脂質（co-lipid））とともに用いられる。適切な共脂質は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）および／またはコレステロール（Chol）を含む（Brighamら，Am．J．Med．Sci．298:278-281;1989；Canoni caら，Am．J．Resp．Cell．Mol．Biol．10:24-29，1994;Bennettら，Biosci．Re p．15:47-53，1995を参照のこと）。本発明において使用するための脂質は、一般に、商業的供給源（例えば、Avanti Polar Lipids Inc．(Alabaster，AL)）から入手され得る。特に好ましい実施態様では、脂質の量およびタイプは、気管内滴注および／またはエアロゾル吸入の後に呼吸器上皮細胞に対して増強された遺伝子移入をもたらす複合体を生じるように選択される。本発明の状況では、粒子サイズおよび荷電が、肺トランスジーン発現に影響を与える重要な要素であることが見出されている。これらの特性は、カチオン性脂質、共脂質、および処方の方法により決定される。核酸／カチオン性脂質複合体のサイズおよび荷電比は、脂質および核酸の化学量論を改変することにより変化し得る（TomlinsonおよびRolland，J．Con trol．Rel.，印刷中，1996を参照のこと）。このような複合体の平均サイズは、カチオン性脂質の相対レベルのの関数として変化する（例えば、１：0.5（−：＋）荷電比についての100nmから、１：３荷電比についての220nmまで）。さらに、固定されたDNA／脂質比については、DNA濃度の増加は、複合体の平均直径の増加をもたらすことが見出されている。複合体のサイズおよび表面荷電は、一般に、当業者に周知の方法を用いて評価され得る。例えば、荷電比は、ドップラー電気泳動光散乱により決定され得る。複合体の平均直径およびゼータ電位は、ダイナミック光散乱およびドップラー電気泳動光散乱（TomlinsonおよびRolland，J．of Cont．Rel.，39:357-372，1996 を参照のこと）により特徴付けられ得る。ドップラー電気泳動光散乱は、一般に、任意の適切な装置（例えば、Coulter DELSA440(Coulter Corp.，Hialleah，FL )）を用いて行われ得る。このような分析は、４つの異なる角度からの散乱光を収集することにより行われ得る。装置の操作周波数は、サンプルの伝導性と電流が等しいかまたは低い振幅とともに、約500Hzであり得る。Coulter N4 MD Sub-M icron Particle Size Analyzer(Coulter Corp.，Hialeah，FL)を含む、ダイナミック光散乱分析を行うに適切な任意の装置が用いられ得る。一般的に、正に荷電した複合体は、負に荷電した複合体よりも高レベルの発現を与える（図１を参照のこと）。さらに、トランスジーン発現のレベルは、複合体の粒子サイズが増大するにつれて増加する（図２および３を参照のこと）。従って、核酸／安定化剤複合体は、代表的には、少なくとも１：２、好ましくは１：２〜１：６の範囲、そしてより好ましくは約１：３の荷電比（−：＋）を有する。核酸／安定化剤複合体の粒子サイズは、効率的な取り込みのためには200nm よりも大きいべきである。核酸および安定化剤は、特定の成分に適切な任意の技術を用いて複合体に処方され得る。このような技術は、当業者に周知である。１つ以上の脂質安定化剤を含む複合体では、大きな多層小胞（MLV）または押し出されたリポソーム（すなわち、単層小胞）が、核酸の添加の前に調製され得る。例えば、１：１のモル比で共脂質DOPEまたはコレステロールとともにDOTMAから構成されるカチオン性リポソームは、種々の孔径（例えば、200、400、および800nm）を有するポリカーボネートフィルターを通して押し出して、種々のサイズの単層小胞を調製し得る。100nm未満の直径を有する小さな単層小胞（SUV）もまた、適切な大きさのフィルターを通しての押出しにより調製され得る。次いで、プラスミド／脂質複合体は、連続注入装置を用いて、所定の比（DNAのカチオン性脂質に対する化学量論は、荷電および濃度に依存する）でのカチオン性リポソームとプラスミドDNAとの制御された混合により調製され得る。好ましくは、複合体は、10％ラクトース中に調製され、その結果、処方物は等張である。リポソームおよびプラスミドは、例えば、種々の流量自給式蠕動ポンプ（例えば、VWR Model Number 54856(VWR ，Houston，TX)）を用いて正確な比で混合チャンバーに送達され得る。定常状態条件は、混合チャンバーへの成分の投入流速が、混合チャンバーからの処方された複合体の流出速度に等しいように混合チャンバー中で維持され得る。複合体化効率（すなわち、カチオン性脂質上に縮合されたプラスミド画分）は、アガロースゲル電気泳動により決定され得る。プラスミドの完全性はまた、Triton Xを用いてDNAを複合体からストリッピングし、そしてストリッピングされたDNAバンドを裸のDNAコントロールのバンドと比較することにより、アガロースゲル電気泳動を用いて決定され得る。核酸／安定化剤複合体のコロイド安定性は、臨床適用に重要である。研究は、処方された複合体が経時的に凝集することを示し（Rollandら，Proc．Intern．S ymp．Contl．Rel．Bioact．Mat．21:240-241，1994を参照のこと）、それは減少したトランスフェクション効率をもたらす。本発明の状況では、等張媒体中での複合体の安定性は、処方された複合体を凍結防止剤（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、および／またはトレハロース）の存在下で凍結乾燥することにより増加され得ることが見出されている。例えば、ラクトース中に処方された複合体は、凍結乾燥機（例えば、Model TDS2COT500，FTS Systems Inc.，St one Ridge，NY）を用いて−30℃で凍結乾燥され得る。冷却、一次冷却、二次冷却、および減圧を、マイクロコンピューターを用いて制御し得る。制御された条件下での凍結乾燥および等張への再水和の後、複合体の安定性特性（サイズおよびゼータ電位）は維持される（図７を参照のこと）。凍結乾燥複合体は、噴出粉砕されて、乾燥粉末吸入投薬形態の調製のための１〜３μｍの範囲の粒子を生成し得る。再水和され、そして滴注される凍結乾燥および噴出製粉複合体は、細胞をトランスフェクトするそれらの能力を維持する；さらに、トランスフェクション効率は、凍結乾燥されていないプラスミド／脂質複合体に匹敵する（図６を参照のこと）。噴出粉砕は、例えば、Micro-Jet Mode l 00，Fluid Energy Aljet，Plumsteadville，PAを、60psigの粉砕圧、50psigの供給圧、および手動の供給で用いて行われ得る。患者への投与の前に、凍結乾燥し、そして噴出製粉複合体を、等張まで再水和するべきである。核酸／安定化剤複合体は、超音波噴霧器（例えば、Omron Model NE-U07）を用いてエアロゾル化され得る。この装置は、高周波（2.4Hz）での圧電性結晶の振動によりエアロゾルを生成する。他の噴霧器が用いられ得るが、３つのパラメーターが噴霧器の選択に特に重要である：質量メジアン空気力学的直径（mass med ian aerodynamic diameter）（MMAD）、呼吸可能な用量（RD）、および送達効率（標準的な技術を用いて決定され得る）。好ましくは、MMADは約５μｍ未満であり、RDは約60％より大きく、そして送達効率（すなわち、下気道に沈着した薬物の質量の、エアロゾル化した薬物の質量に対する比）は約10％より大きい（Pill aiら，J．Aerosol Med．9:227-240，1996を参照のこと）。エアロゾル化した核酸／安定化剤複合体は、例えば、改変された試験管埋伏装置を用いて収集され得る。エアロゾルは、可撓性のタイゴンチュービング（tygo n tubing）、およびピペットを出るエアロゾル粒子が氷冷試験管上に衝突し、そして濃縮されるように、細いガラスピペットを通して供給され得る。このようにして、エアロゾルは、所定の時間間隔で収集され得る。本明細書中に記載されるように調製される核酸／安定化剤複合体は、一般に、患者の気道への遺伝子送達のために用いられ得る。本発明の状況では、患者は、ヒトまたは他の哺乳動物であり得、そして１つ以上の疾患に罹患し得るが、検出可能な疾患に罹っていなくともよい。従って、１つ以上の核酸／安定化剤複合体での患者の処置は、予防目的または存在する疾患の処置のためであり得る。例えば、IL-12をコードする核酸を含む複合体は、エアロゾル吸入により投与されて、アレルゲン誘導性喘息発作に対する免疫応答を改変し得る。本明細書中に記載される核酸／安定化剤複合体は、吸入（これは、経口および／または経鼻であり得る）による投与に適切である。好ましくは、複合体は、超音波霧状化されるが、上記のように、正味の正荷電を有する複合体に噴出霧状化もまた用いられ得る。患者への投与のために、１つ以上の核酸／安定化剤複合体が、一般に、薬学的組成物として処方される。薬学的組成物は、核酸／安定化剤複合体を、生理学的に受容可能なキャリア（すなわち、有効成分の活性を妨害しない非毒性物質）と組み合わせて含む。当業者に公知の任意の適切なキャリアは、本発明の薬学的組成物に用いられ得る。代表的なキャリアは、合成粒子キャリア（例えば、ペプチドおよび生分解性ポリマー、またはこのような物質の組合せ）を含む。必要に応じて、薬学的組成物は、例えば、保存剤、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス、および／または他の活性成分のような他の添加剤をさらに含み得る。投与の頻度および投薬量は、患者毎に、そして投与される特定の核酸、気道上皮細胞への処方されるプラスミドの生物学的利用能、ならびに遺伝子発現のレベルおよび持続期間に依存して異なる。トランスジーンによりコードされるタンパク質は標的部位で発現されるので、予防効果のために必要とされる用量は、従来の経路による薬物送達のために必要とされる用量より少ない大きさのオーダーであり、同時に副作用がより少ない。一般的に、１〜２用量は、予防効果または治療効果のために標的部位で必要とされる治療タンパク質のレベルに依存して毎週投与され得る。適切な用量は、疾患に罹患した患者の症状に改善を示すに十分である超音波霧状化／安定化剤複合体の量である。このような改善は、より少ない全身性副作用、改善された患者のコンプライアンス、および／または疾患状態に関連する臨床症状の改善に基づいて検出され得る。一般的に、１用量の中に存在する超音波霧状化／安定化剤複合体の量は、約500μｇ〜４mgの範囲である。本明細書中に詳述される処方物についての超音波噴霧器から放出される用量は、約 10〜15μｇ/Lの範囲である。エアロゾルの流出濃度から評価された曝露時間、正常な呼吸条件下でのヒトの換気パラメータ、およびエアロゾルの質量メジアン空気力学的直径（MMAD）に基づく沈着効率は、約15分間〜約２時間で変化し得る。以下の実施例は例示のために提供されるのであって、限定のために提供されるのではない。実施例実施例１核酸／安定化剤複合体の調製本実施例は、核酸／安定化剤複合体の調製を例示する。サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター／エンハンサーにより駆動される細菌レポーター遺伝子クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT ）を含むプラスミドを、標準的技術を用いて構築した。DOPEまたはコレステロール（Chol）のいずれかを有するカチオン性脂質DOTMA（全ての脂質は、Avanti Po lar Lipids Inc.,Alabaster，ALから入手した）から１：１のモル比で構成される単層小胞を、200、400、および800nmの孔径を有するフィルター（Poretics Co rp.，Livermore，CA）を通しての押出しにより調製した。１：３の荷電比（−：＋）のCMV-CAT／DOTMA：DOPE複合体およびCMV-CAT／DOT MA：Chol複合体を、制御された条件下で連続注入装置を用いてプラスミドをリポソームに混合することにより10％（w/v）ラクトース中に処方した。プラスミドD NA濃度は、200μｇ/mLであった。複合体の平均直径およびゼータ電位は、Coulte r N4 MD Sub-Micron Particle Size Analyzer（Coulter Corp.，Hialeah，FL）を用いてダイナミック光散乱を介して、およびドップラー電気泳動光散乱（Coul ter DELSA 440(Coulter Corp.，Hialeah，FL））を介して特徴付けられた。分析を、４つの異なる角度からの散乱光を収集することにより行なった。器具の操作の周波数は約500Hzであり、そして電流の振幅はサンプルの伝導率と同じであるかまたはそれより低かった。平均直径は図２に示す通りであり、そしてゼータ電位の測定は、複合体上の全荷電が正であることを示した。複合体化効率を、アガロースゲル電気泳動により決定し、そして調製した複合体が100％、１：３の荷電比（−：＋）であることが見出された。実施例２エアロゾル超音波霧状化核酸／安定化剤複合体の調製本実施例は、エアロゾル複合体の生成および特徴付けを例示する。実施例１に記載されるプラスミド／脂質複合体を、超音波噴霧器（Model NE-U 07，Omron Health Care，Inc.，Lake View，IL）を用いて、製造者の説明書に従ってエアロゾル化した。エアロゾル化複合体を、改変された試験管埋伏装置を用いて収集した。この系において、エアロゾルを、可撓性タイゴンチュービング中に、そして細いガラスピペットを通して供給した。ピペットを出たエアロゾルを、氷冷試験管上に衝突させ、そして濃縮させた。エアロゾルを、以下に記載される通りに、特徴付けのために所定の時間間隔で収集した。超音波霧状化プラスミド／脂質複合体の安定性および複合体内のDNAを、上記のようにダイナミック光散乱およびドップラー電気泳動光散乱を用いて評価した。複合体化効率およびプラスミドの完全性を、アガロースゲル電気泳動により決定した。プラスミド完全性決定のために、電気泳動の前にTriton-Xでの処理により、DNAを複合体から剥がした。Triton処理サンプルにおけるDNAバンドの構造を、裸のDNAコントロールの構造と比較した。図８は、非霧状化複合体および霧状化複合体におけるスーパーコイルプラスミドの画分が、「裸のDNA」コントロールにおける画分と同様であったことを示す。スーパーコイル形態は、プラスミドの物理的形態のうちで最も強力（potent）かつ脆弱である。スーパーコイル形態の完全性が霧状化の後に維持されたという事実は、カチオン性脂質が、小滴形成の間に誘導される剪断からDNAを保護するのを助けることを示す。放出用量および空気力学的直径を、米国薬局方＜601＞に定義されるような標準法を用いて決定した。エアロゾルを、0.2μｍフィルター上で、３L/分の所定の流速で、臨界流れオリフィス（critical flow orifice）（CFO）を用いて収集した。エアロゾルを含むフィルターを、５mLの５％ドデシル硫酸ナトリウム（SD S）緩衝液で洗浄して脂質からDNAを分離した。溶液を遠心分離し、そして260nm の波長でDNA濃度について分光光度学的にアッセイした。超音波噴霧器からの流出エアロゾル流中のDNA濃度は、５μｇ/mLであった。超音波噴霧器から生成されたエアロゾルを、慣性埋伏技術（inertial impacti on technique）を用いて、質量メジアン空気力学的直径（MMAD）および幾何標準偏差（GSD）に基づいて特徴付けた。８つの埋伏ステージおよびプレセパレーター（preseparator）からなるAndersen 1 SCFM（28.3L/分）非生存可能環境サンプラーを用いて、エアロゾル粒子を収集するために使用した。エアロゾルを５分間収集した。エアロゾルを、ステンレススチールディスクの上および0.2μｍの孔径を有するガラス繊維フィルター（Gelman Type A/E，Gelman Sciences Inc. ，Ann Arbor，MI）上の８つの埋伏ステージの各々で収集した。ディスクのそれぞれを、インパクター（impactor）から取り出し、ペトリ皿上に置き、そして５ mLの５％SDSで洗浄した。各々のペトリ皿を、沈着した粒子からの脂質の完全な溶解のために定期的な間隔で振盪した。溶液を遠心分離し、そしてDNA濃度について260nmの波長で分光光度学的にアッセイした。対数方眼紙に、カスケードインパクターの各々のステージで収集したDNAの累積的質量画分を、その段階の有効なカットオフ直径に対してプロットし、そして対数正規分布を最小二乗法によってデータについて計算した。MMAD（質量を等しく分割する回帰上の点としてとられる）は、2.4μｍであった。GSD（粒径サイズ（それより下に84.1％の質量分布が存在する）を、質量メジアンサイズで割ることにより計算する）は、3.2であった。エアロゾルのサイズ分布（図９に示す）は、大多数の粒子が呼吸可能な範囲にあることを示す。実施例３プラスミド／脂質複合体の肺滴注本実施例は、非霧状化および霧状化プラスミド／脂質複合体の気管内滴注後のトランスジーン発現のレベルを例示する。動物を、３つの処置群（３動物／群）に分け、そして腹腔内に与えられた80mg /kgのケタミンで麻酔した。処置群に、気管カテーテルで挿管し、そして手術台の上に仰臥しておく。エアロゾルを、気管カテーテルを通して送達し、そして換気気流により運んだ。動物を、所定の時間間隔でエアロゾル化した複合体に曝露した。吸入後、動物を抜管し、そして麻酔から回復させ、そして動物飼育施設に戻した。動物を、ドライアイスチャンバーを用いて吸入48時間後のCO₂窒息により安楽死させ、そして肺組織を採取した。組織をTris/HCl緩衝液中でホモジナイズし、そして遠心分離した。続いて、上清を、製造者の説明書に従ってCAT発現についてELISAアッセイを用いて分析した（Boehringer Mannheim CAT ELISA Kit 、カタログ番号1363727）。以下でさらに議論する図４は、気管内挿管により400μｌの音波霧状化複合体（10分後、インピンジャー（impinger）で収集）、または噴霧器リザーバーから 30分後にアリコートに分けられた残りの複合体（100μｇのプラスミドDNA）が滴注された動物におけるCAT発現のレベルを示す。結果は、非霧状化、霧状化、または残りのプラスミド／脂質複合体の気管内滴注後のトランスジーン発現のレベルが匹敵したことを示す。実施例４トランスフェクション効率に対する荷電の効果本実施例は、共脂質DOPEおよびコレステロールとともにカチオン性脂質DOTMA を含む核酸／安定化剤複合体のインビボトランスフェクション効率に対する複合体の荷電の効果を示す。カチオン性脂質および共脂質を、種々の孔径（100、400、または800nm）を有するポリカーボネート膜フィルターを通しての押出しにより調製される大きな多層小胞（MLV）または単層小胞として処方した。種々の荷電比でのCMV-CAT/DOTMA ：Chol複合体を、10％（w/v）ラクトース中に実施例１に記載される通りに処方した。プラスミド／脂質複合体（125μｇ/mLプラスミドDNＡ）の気管内滴注後のラット肺におけるCAT発現のレベルを、上記で議論したように、ELISAアッセイにより評価した。結果（図１に示す）は、評価した比の範囲にわたって荷電比が増加するにつれ、増加したレベルのCAT発現をもたらすことを示す。実施例５トランスフェクション効率に対する粒子サイズの効果本実施例は、共脂質DOPEおよびコレステロールとともにカチオン性脂質DOTMA を含む核酸／安定化剤複合体のインビボでのトランスフェクション効率に対する粒子サイズの効果を例示する。カチオン性脂質および共脂質を、大きな多層小胞（MLV）として処方したか、または種々の孔径（100、400、および800nm）を有するポリカーボネート膜フィルターを通して押し出した。種々の粒径および固定された１：３（−：＋）の荷電比を有するCMV-CAT/DOTMA：Chol複合体およびCMV-DOTMA：DOPE複合体を、実施例１に記載される通りに10％（w/v）ラクトース中に処方した。プラスミドDNA濃度は125μｇ/mLであった。上記のように、複合体の平均直径およびゼータ電位を、ダイナミック光散乱およびドップラー電気泳動光散乱により特徴付け、そして複合体化効率を、アガロースゲル電気泳動により決定した。図２に示すデータは、トランスジーン発現のレベルが、複合体の粒子サイズが 237から901nmへと増加するにつれて増加することを実証する。さらに（図３）、１：３の荷電比を有する処方物での気管内滴注後に観察された発現のレベルは、処方されなかったDNA（水中またはラクトース中の非縮合DNA）よりも100倍を越えて高かった。実施例６トランスフェクション効率に対する霧状化の効果本実施例は、霧状化核酸／安定化剤複合体のトランスフェクション効率を例示する。 CMV-CAT/DOTMA：Chol複合体（直径530nm、１：３（−：＋）荷電比）を、上記のように調製した。次いで、気管内滴注後に高レベルのトランスジーン発現を与える制御されたコロイド特性および表面特性を有する最適化したプラスミド／脂質複合体を、超音波噴霧器を用いてエアロゾル化した。これらの複合体を、超音波噴霧器を用いてエアロゾル化し、プラスミドおよびプラスミド／脂質複合体の安定性、ならびに気管内滴注およびエアロゾル複合体の吸入後のラット肺におけるインビポでのトランスジーン発現を評価した。DNAはカチオン性リポソームに複合体化したままであり、そしてプラスミドの完全性は保持された（霧状化前のサンプルおよび霧状化後のサンプルにおけるプラスミドのスーパーコイル形態の画分が類似であったことを示す、図８を参照のこと）。霧状化の前の複合体の平均直径は、530±329nmであった。10分間または20分間の霧状化の後に噴霧器中に残存している複合体の平均直径は、それぞれ、481±289nmおよび510±361nmであった。ゼータ電位測定は、粒子の表面荷電が、霧状化プロセスの後に荷電していないことを示した。これらの知見は、プラスミド／脂質複合体のコロイド特性が、霧状化後に保持されたこと、およびカチオン性リポソームへのDNAの結合は、小滴形成の間に誘導される剪断からDNAが保護され得ることを実証する。超音波噴霧器を用いて生成されたエアロゾルの質量メジアン空気力学的直径（MMAD）は、５μｍ未満であった。このことは、粒子が呼吸可能な範囲にあることを示す（図９を参照のこと）。次いで、気管内滴注（霧状化なしおよび10分間または30分間の超音波霧状化あり）後のラット肺におけるCAT発現のレベルを、上記の通りに評価した。動物を、腹腔内に与えた80mg/kgのケタミンで麻酔し、そして３つの処置群に分けた（３動物／群）。処置群に、リザーバーからアリコートに分けた、霧状化複合体または残りの複合体の400μｌ（100μｇプラスミドDNA）を気管内挿管により滴注した。霧状化していない複合体を滴注した動物は、ポジティブコントロールとして使用した。動物を、ドライアイスチャンバーを用いて、滴注48時間後にCO₂窒息により安楽死させ、そして肺組織を採取した。組織をTris-HCl緩衝液中でホモジナイズし、そして遠心分離した。続いて、CAT発現のためのELISAアッセイを用いて上清を分析した。図４に示す結果は、霧状化および残余の複合体で得られた発現レベルが、匹敵したことを示す。これらの知見は、プラスミドDNAのトランスフェクション効率が、霧状化後に保持されたことを示す。本発明者らはまた、再水和懸濁液として気管内滴注によりラット肺に送達された凍結乾燥しそして噴出製粉（jet mill）プラスミド／脂質複合体のインビボでのトランスフェクション効率を評価した。本発明者らは、処方された物質を、等張性媒体中でプラスミド／脂質複合体の安定を増加させるための凍結保護物質の存在下で凍結乾燥するための方法を開発した。ラクトース中で処方された複合体は、凍結乾燥機（Model TDS2COT500，FTS Systems Inc.，Stone Ridge，NY）を用いての特定の凍結保護物質（ラクトースおよびマンニトール）での制御された条件下で−30℃で凍結乾燥された。冷却、一次冷却、二次冷却、および減圧を、マイクロコンピューターを用いて制御した。噴出粉砕を、例えば、Micro-Jet Mo del 00，Fluid Energy Aljet，Plumsteadville，PAを、60psigの粉砕圧、50psig の供給圧、および手動の供給で用いて行った。次いで、凍結乾燥し、そして噴出製粉複合体を、等張まで再水和した。図６は、凍結乾燥し、そして噴出製粉DNA／脂質複合体の気管内滴注後のラット肺におけるCAT発現のレベルを評価した実験の結果を示す。凍結乾燥し、そして噴出粉砕し、再水和し、そして滴注した複合体は、肺細胞をトランスフェクトするその能力を保持した。さらに、トランスフェクション効率は、凍結乾燥しなかったプラスミド／脂質複合体のトランスフェクション効率に匹敵した。図７に示すように、凍結乾燥し、そして再水和したCMV-CAT/DOTMA：Chol複合体（１：２（−：＋）の荷電比で）の安定性特徴（サイズおよびゼータ電位）は、少なくとも４ヶ月の期間にわたって変化しないままであった。トランスフェクション効率はまた、この時間の期間にわたって安定であることが見出された。実施例７核酸／安定化剤複合体の吸入後のトランスジーン発現本実施例は、核酸／安定化剤複合体の経鼻または経口吸入後の肺におけるトランスジーン発現のレベルを例示する。 CMV-CAT/DOTMA：Chol複合体（直径813nm、１：３（−：＋）の荷電比）を、上記の通りに調製した。これらの複合体を、噴出および超音波噴霧器を用いてエアロゾル化し、そして上記の通りに、鼻のみを曝露するチャンバーを用いて、または気管カテーテルを通してラットに投与した。鼻曝露のために、鼻のみを曝露するチャンバーは、水平な側枝を有するエアロゾル入口部分およびエアロゾル排出部分からなっていた。入口部分は、排出に比較してより高圧に保持された。エアロゾル化複合体は、頂部を通ってチャンバーに入り、動物の鼻の周辺に流れ、そして動物の鼻の周辺の一連の穴を通して出ていった。エアロゾル濃度が頂部および底の口で均一であるようにチャンバーを操作した。動物を、所定の時間間隔で、エアロゾル化した複合体に曝露した。曝露後、動物を管からはずし、それらのそれぞれのケージに置き、そして動物飼育施設に戻した。曝露の48時間後、肺組織を採取し、そして上記の通りにアッセイした。図５に示される、肺におけるCAT発現のレベルは、エアロゾル化複合体の経口吸入および鼻の曝露が、トランスジーン発現を生じることを実証する。さらに、超音波霧状化複合体は、噴出霧状化複合体により達成されたDNA送達およびトランスジーン発現のレベルに匹敵するDNA送達およびトランスジーン発現のレベルを、有意に少ない吸入時間でだが達成し得る。前述から、本発明の特定の実施態様を、例示の目的のために本明細書中に記載してきたが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱せずに行われ得ることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸送達装置であって、以下： (a)超音波噴霧器； (b)核酸；および (c)安定化剤；を備え、ここで、該核酸および安定化剤は、該超音波噴霧器の中に含まれる、核酸送達装置。２．核酸送達装置であって、以下： (a)超音波噴霧器； (b)核酸；および (c)安定化剤；を備え、ここで、該超音波噴霧器は、該核酸および安定化剤を受けるように適応され、そしてそれからの吸入に適切なエアロゾルを生成する、核酸送達装置。３．前記核酸が、DNAである、請求項１または２に記載の装置。４．前記DNAが、サイトカインをコードする、請求項３に記載の装置。５．前記サイトカインが、IL-12である、請求項４に記載の装置。６．前記DNAが、α-1アンチトリプシンまたは嚢胞性線維症膜貫通レギュレーターをコードする、請求項３に記載の装置。７．前記安定化剤が、脂質である、請求項１または２に記載の装置。８．前記脂質が、カチオン性脂質である、請求項７に記載の装置。９．前記核酸および前記安定化剤が、正味の正の荷電を有する複合体が生成されるような量で存在する、請求項８に記載の装置。１０．前記複合体が、１：２〜１：６の範囲の荷電比（−：＋）を有する、請求項９に記載の装置。１１．前記安定化剤が、ペプチドである、請求項１または２に記載の装置。１２．前記安定化剤が、ポリマーである、請求項１または２に記載の装置。１３．超音波霧状化核酸／安定化剤複合体を調製するための方法であって、以下の工程： (a)少なくとも１つの核酸を、少なくとも１つの安定化剤と合わせて、複合体を形成させる工程；および (b)該複合体のエアロゾルを、超音波噴霧器で形成させる工程、を包含する、方法。１４．前記核酸が、DNAである、請求項１３に記載の方法。１５．前記DNAが、サイトカインをコードする、請求項１４に記載の方法。１６．前記サイトカインが、IL−12である、請求項１５に記載の方法。１７．前記DNAが、α-1アンチトリプシンまたは嚢胞性線維症膜貫通レギュレーターをコードする、請求項１４に記載の方法。１８．前記安定化剤が、脂質である、請求項１３に記載の方法。１９．前記脂質が、カチオン性脂質である、請求項１８に記載の方法。２０．前記複合体が、正味の正の荷電を有する、請求項１９に記載の方法。２１．前記複合体が、１：２〜１：６の範囲の荷電比（−：＋）を有する、請求項２０に記載の方法。２２．前記安定化剤が、ペプチドである、請求項１３に記載の方法。２３．前記安定化剤が、ポリマーである、請求項１３に記載の方法。２４．超音波霧状化核酸／安定化剤複合体。２５．前記核酸が、DNAである、請求項２４に記載の複合体。２６．前記DNAが、サイトカインをコードする、請求項２５に記載の複合体。２７．前記サイトカインが、IL-12である、請求項２６に記載の複合体。２８．前記DNAが、α-1アンチトリプシンまたは嚢胞性線維症膜貫通レギュレーターをコードする、請求項２５に記載の複合体。２９．前記安定化剤が、脂質である、請求項２４に記載の複合体。３０．前記脂質が、カチオン性脂質である、請求項２９に記載の複合体。３１．前記複合体が、正味の正の荷電を有する、請求項３０に記載の複合体。３２．前記複合体が、１：２〜１：６の範囲の荷電比（−：＋）を有する、請求項３１に記載の複合体。３３．前記安定化剤が、ペプチドである、請求項２４に記載の複合体。３４．前記安定化剤が、ポリマーである、請求項２４に記載の複合体。３５．超音波霧状化核酸／安定化剤複合体で患者を処置するための方法であって、超音波霧状化核酸／安定化剤複合体を患者に提供する工程を包含し、ここで、該複合体は、治療用タンパク質をコードする核酸を含み、そして該患者による吸入に適切である、方法。３６．治療用タンパク質をコードする核酸で患者を処置するための方法であって、超音波霧状化核酸／安定化剤複合体を患者に提供する工程を包含し、ここで、該複合体は、該患者による吸入に適切である、方法。３７．超音波霧状化核酸／安定化剤複合体で患者を処置するための方法であって、以下の工程： (a)少なくとも１つの核酸と少なくとも１つの安定化剤を合わせて複合体を形成させる工程； (b)該複合体のエアロゾルを、超音波噴霧器で形成させる工程；および (c)該エアロゾルを、患者による吸入のために提供する工程、を包含する、方法。３８．霧状化核酸／安定化剤複合体で患者を処置するための方法であって、霧状化核酸／安定化剤複合体を患者に提供する工程を包含し、ここで、該安定化剤は、カチオン性脂質を有し、正味の正の荷電を有し、そして該患者による吸入に適切である、方法。３９．霧状化核酸／カチオン性脂質複合体で患者を処置するための方法であって、以下の工程： (a)少なくとも１つの核酸と少なくとも１つのカチオン性脂質を合わせて、正味の正の荷電を有する複合体を形成させる工程； (b)該複合体のエアロゾルを、噴霧器で形成させる工程；および (c)該エアロゾルを、患者による吸入のために提供する工程、を包含する、方法。４０．前記複合体が、１：２〜１：６の範囲の荷電比（−：＋）を有する、請求項３８または３９のいずれかに記載の方法。