CN112210014B - 一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白及组合物 - Google Patents

一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白及组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN112210014B
CN112210014B CN201910627990.4A CN201910627990A CN112210014B CN 112210014 B CN112210014 B CN 112210014B CN 201910627990 A CN201910627990 A CN 201910627990A CN 112210014 B CN112210014 B CN 112210014B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
leu
thr
lys
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910627990.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112210014A (zh
Inventor
张晋宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Kenuokefu Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Kenuokefu Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Kenuokefu Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Kenuokefu Biotechnology Co ltd
Priority to CN201910627990.4A priority Critical patent/CN112210014B/zh
Priority to PCT/CN2020/097441 priority patent/WO2021008308A1/zh
Priority to EP20841149.6A priority patent/EP3998288A4/en
Priority to JP2022501173A priority patent/JP7305020B2/ja
Priority to US17/625,131 priority patent/US20220267399A1/en
Publication of CN112210014A publication Critical patent/CN112210014A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112210014B publication Critical patent/CN112210014B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白及组合物。所述融合蛋白包含三种不同的基因片段。根据本发明获得的融合蛋白对各种动物实体瘤都有较好的抑制作用，能缩小肿瘤，甚至使之消退；能较好地抑制恶性肿瘤的转移；并且在很大程度上改善病患的生存质量。

Description

一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白及组合物
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，特别涉及一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白及组合物。
背景技术
肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。因为这种新生物多呈占位性块状突起，所以也称赘生物。
近年来，肿瘤治疗又出现了很多新方法，目前通用的有效治疗手段为放疗、化疗、手术治疗、免疫治疗等。但仍然存在放疗化疗不良反应严重，手术治疗风险大，免疫治疗对实体瘤效果不佳等问题。
在本申请人之前提交的未决中国专利申请第CN201810104146.9号中，公开了一种抗肿瘤药物组合物，包括有蛋白IL12、GMCSF和IL2，其中IL12蛋白质：GMCSF蛋白质：IL2蛋白质的质量比为0.1-10:0.1-10:0.1-10。该申请中的组合物对多种实体瘤病患起到了很好的病情控制作用，部分病患甚至能达到完全缓解，治疗过程中对病患身体刺激小，不良反应轻微，大幅改善了病患生存质量。然而，由于该申请中使用的是三种蛋白质的组合物，因此，在实际应用时需要逐个制备组分，然后按比例混合。这随之带来制备工艺复杂、质量控制难、成本高昂等问题。
因此，在本领域中需要一种能够较佳地控制或甚至完全缓解实体瘤的病情的单一组分的抗肿瘤蛋白药物，以在实现良好疗效的同时减少制备工艺、提高质量控制并降低用药成本。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的一个目的在于提供一种能够低成本、高效、简单地治疗动物肿瘤的融合蛋白。
上述目的通过以下方案来实现：
在一方面，本发明提供一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白，所述融合蛋白包含IL12、IL2和GMCSF基因片段。在所述融合蛋白的氨基酸序列中，各基因片段之间的连接顺序是可变化的，例如，可以为IL12、IL2和GMCSF，或者是IL2、IL12、和GMCSF，或者是IL12、GMCSF和IL2。所述三种基因片段之间可以直接连接，或者通过本领域中常见的连接子进行连接。例如，所述连接子可以为柔性连接片段，如GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG、GGGGSGGG等。在一个优选实施方案中，所述融合蛋白包含由得自猫或犬的IL12、IL2和GMCSF基因片段连接构成的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，所述融合蛋白包含由得自猫或犬的IL12、GMCSF和IL2基因片段连接构成的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL12基因片段由IL12a和IL12b两个亚基组成。在一个实施例方案中，所述IL12、IL2和GMCSF基因片段得自猫或犬。
通过所述技术方案，能够获得对各种动物实体瘤都有较好抑制作用的融合蛋白，所述融合蛋白能缩小肿瘤，甚至使之消退；能较好地抑制恶性肿瘤的转移；并且在很大程度上改善病患的生存质量。
所述第一方面进一步优选地，在所述IL2和GMCSF基因片段之间连接有DiaNHS76F8基因片段。例如，在一些具体实施方案中，所述融合蛋白为：cIL12bIL12aIL2GMCSF(ID SEQNO：1)、cIL12bIL12aGMCSFIL2(ID SEQ NO：2)、fIL12bIL12aIL2GMCSF(ID SEQ NO：3)、fIL12bIL12aGMCSFIL2(ID SEQ NO：4)、cIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF(ID SEQ NO：5)或fIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF(ID SEQ NO：6)。
DiaNHS76F8基因片段具有增强靶向肿瘤的能力。通过所述技术方案，能够进一步增强所述融合蛋白靶向肿瘤的效果。
进一步优选地，所述肿瘤包括选自以下中的一种或多种：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、口腔癌、鼻咽癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统的赘生物、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、躯干部肉瘤、基底细胞瘤。在一些优选实施方案中，所述肿瘤为躯干部肉瘤、基底细胞瘤和乳腺癌。
在第二方面，提供了一种用于治疗动物肿瘤的组合物，所述组合物包含：根据前述第一方面所述的融合蛋白和壳聚糖溶液。优选地，所述组合物包含30-70体积％的融合蛋白溶液和70-30体积％的壳聚糖溶液。进一步优选地，所述组合物包含40-60体积％的融合蛋白溶液和60-40体积％的壳聚糖溶液。进一步优选地，所述所述组合物包含50体积％的融合蛋白溶液和50体积％的壳聚糖溶液。
通过所述技术方案，能够获得一种可以直接注入动物肿瘤来进行治疗的组合物。不拘泥于任何理论，在所述组合物中，壳聚糖主要起增稠剂的作用，其在增加溶液粘稠性的同时减缓融合蛋白的释放速率，从而延长融合蛋白作为主要治疗成分的效用时间。
进一步优选地，所述壳聚糖溶液为含1-10重量％壳聚糖的溶液，进一步优选为含2-9重量％壳聚糖的溶液，进一步优选为含3-8重量％壳聚糖的溶液。在一个具体实施方案中，在所述壳聚糖溶液中，所述壳聚糖的含量可以为1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％或其间的任意范围或任意值，包括但不限于整数值或小数值。
通过调节壳聚糖的含量范围，能够调节组合物粘度以及融合蛋白的释放速率，从而有针对性地进行治疗。
进一步优选地，所述融合蛋白溶液为40-60体积％，所述壳聚糖溶液为70-30体积％，更优选为所述融合蛋白溶液为50体积％，所述壳聚糖溶液为50体积％。在一些实施方案中，在所述组合物中，所述融合蛋白溶液可以为30体积％、31体积％、32体积％、33体积％、34体积％、35体积％、36体积％、37体积％、38体积％、39体积％、40体积％、41体积％、42体积％、43体积％、44体积％、45体积％、46体积％、47体积％、48体积％、49体积％、50体积％、51体积％、52体积％、53体积％、54体积％、55体积％、56体积％、57体积％、58体积％、59体积％、60体积％、61体积％、62体积％、62体积％、64体积％、65体积％、66体积％、67体积％、68体积％、69体积％、70体积％，或其间的任意范围或任意值。所述壳聚糖溶液可以为30体积％、31体积％、32体积％、33体积％、34体积％、35体积％、36体积％、37体积％、38体积％、39体积％、40体积％、41体积％、42体积％、43体积％、44体积％、45体积％、46体积％、47体积％、48体积％、49体积％、50体积％、51体积％、52体积％、53体积％、54体积％、55体积％、56体积％、57体积％、58体积％、59体积％、60体积％、61体积％、62体积％、62体积％、64体积％、65体积％、66体积％、67体积％、68体积％、69体积％、70体积％，或其间的任意范围或任意值。
通过调节融合蛋白溶液和壳聚糖溶液的相对体积比例，能够调节组合物粘度以及融合蛋白的释放速率，从而有针对性地进行治疗。
通过上述技术方案，本发明获得了如下有益效果：
1)根据本发明的融合蛋为单一蛋白，其各组分之间具有非常良好的协同效果，在提升彼此效果的同时也充分抑制了各自的毒副作用；
2)制备工艺简单、工艺质量容易控制，具有良好的成本和价格优势；
3)在利用根据本发明的融合蛋白治疗各种肿瘤时，将主要成分配制药物溶液之后直接注射到肿瘤内，具有很强的靶向功效，并且不良反应轻微或甚至没有；
4)对各种实体瘤都有较好的抑制作用，能缩小肿瘤，甚至使之消退；能较好地抑制恶性肿瘤的转移；很大程度上改善病患的生存质量。
附图说明
以下将结合附图来具体描述本发明的一些优选实施方式。本领域的普通技术人员将会理解，这些附图仅用于举例说明的目的，而无意于以任何方式来限制本发明的范围。
图1是根据本发明治疗实施例10在用药之前的犬右前腿肉瘤照片；
图2是根据本发明治疗实施例10在用药之后的犬右前腿肉瘤对比照片。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例来描述本发明的一些具体实施方式。本领域的普通技术人员会理解，提供这些实施例的目的仅仅是为了举例说明如何能够实施本发明的方案，而非以任何方式限制本发明的范围。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白，所述融合蛋白包含IL12、IL2和GMCSF基因片段。
在该融合蛋白中，IL12为白细胞介素-12(IL12)基因片段，其为具有广泛生物学活性的细胞因子，主要由激活的炎性细胞产生。IL12基因片段的编码区包含IL12a和IL12b两个亚基，中间可以用T2A序列连接。IL12是免疫系统中负责调节T细胞的细胞因子，由活化T细胞产生，它对机体的免疫应答和抗病毒感染等起着至关重要的作用。目前IL12已被批准用于治疗某些癌症，包括转移性黑素瘤和肾细胞癌。然而，目前IL12的单独应用存在一些缺点：可引起发热、呕吐等一般症状，还可导致水盐代谢紊乱和肾、肝、心、肺等功能异常；最常见、最严重的是毛细血管渗漏综合征，使患者不得不中止治疗。因此其通常需要联合给药，以减轻其不良反应。
在该融合蛋白中，IL2为白细胞介素-2的基因片段。IL2具有比较强的抗肿瘤活性(强于IL12)，且副作用相对较小。然而，在本发明人的大量实验过程中，其单独使用仍然存在较多的问题。例如IL2具有剂量依赖性，在治疗过程中需要的剂量较高，导致成本高昂，容易引发贫血和血小板减少等。
在该融合蛋白中，GMCSF是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因片段，其对髓系干细胞到成熟粒细胞的增殖与分化过程均有刺激作用，可促进髓系干细胞向粒系(包括中性粒细胞、嗜酸粒细胞系)、红素、巨核细胞系、粒单细胞系和单核细胞系的共同祖细胞分化，并促进以上各系造血定向干细胞的增殖与成熟。然而，其不足之处在于对嗜碱粒细胞的作用不明显，对红系晚期造血细胞的作用也较小。
由于上述原因，本申请人尝试通过对各种细胞因子进行组合，以在利用其有效协同作用的同时降低其毒副作用。通过大量的筛选工作，本发明人终于发现，将上述三种细胞因子即IL12、IL2和GMCSF进行组合，可以在获得非常显著的肿瘤治疗效果的同时并避免它们各自的缺点。尽管目前的机制尚不清楚，发明人观察到IL12、IL2和GMCSF之间具有非常良好的协同作用，具体表现为该组合激发了患病动物免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤活性，使恶性肿瘤得到抑制，进而使瘤体缩小甚至消退，但是同时几乎没有观察到任何副作用。
本发明人在此发现的基础上完成了本申请人之前提交的未决申请(中国专利申请第CN201810104146.9号)的内容。此外，本发明人还意识到，在将IL12、IL2和GMCSF制成组合物的情况下，需要对其单独制备细胞、培养，获得各自的蛋白，最后进行混合。这带来制备工艺复杂、工艺质量难以控制、以及成本较高的问题。在此基础上，本发明人提出了三种将IL2、IL2和GMCSF制成融合蛋白来解决这些问题。本发明正是基于该发现而做出的。
下面将参考具体实施例来对本发明的优选实施方案进行进一步的详细说明。本领域的普通技术人员将会理解，提供这些示例性实施例的目的仅仅是举例说明的目的，而无意于以任何方式限制本发明。
实施例
试剂：DMEM培养基，1640培养基，胎牛血清购自life technologies公司；CDM4HEK293无血清培养基购于Thermo公司；细胞培养瓶，培养板购自Corning公司；Puromycin购自Chemicon公司；限制性内切酶购自Takara和NEB公司；连接酶购自NEB公司；DNA聚合酶购自Takara公司；质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒购自Omega Biotech公司；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成；基因合成和测序由life technologies公司完成。IL12，IL2ELISA试剂盒购于Thermo公司；GMCSF ELISA试剂盒购于Sigma公司；壳聚糖(Protosan G 213)购于NovaMatrix公司。重组犬IL12,GMCSF,IL2蛋白，重组猫IL12,GMCSF,IL2蛋白购于Novus Biologicals公司。
实施例1IL12表达细胞构建
合成犬IL12基因的编码区，包含IL12a(Genbank编号：NM_001003293)和IL12b(Genbank编号：NM_001003292)两个亚基，中间用T2A序列进行连接，合成的基因两端分别带有BamHI和XhoI酶切位点，然后用BamHI和XhoI进行酶切，体系如下：IL12质粒5μg，酶切缓冲液4μL，BamHI 1μL，XhoI 1μL，加水至总体积40μL，37℃静置12小时。取出EP管，加入4.4μL10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收IL12基因片段，待用。
酶切表达载体pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下：质粒2μg，酶切缓冲液3μL，BamHI 1μL，XhoI 1μL，加水至总体积30μL，37℃静置12小时。取出EP管，加入3.3μL10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收载体片段，待用。
连接pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO和IL12，体系如下：pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO 2μL，IL12 2μL，连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶0.5μL，水4.5μL。置于室温连接4小时。然后将连接体系进行大肠杆菌感受态的转化。第二天从转化的平板上挑取菌落，置于LB培养基中37度摇床内过夜培养，使用质粒提取试剂盒从培养的细菌中提取质粒，通过酶切鉴定片段是否成功连入载体中，然后将正确的载体送测序，确定构建成功，表达载体为pLentis-CMV-IL12-PGK-PURO。
制备调控载体的病毒，方法如下：1.消化培养的293FT细胞，计数后将3×106细胞/孔铺入10-cm培养皿中，培养液体积为10ml。2.第二天晚上，观察细胞状态，如果细胞状态好，进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25μm，取一只试管，加入灭菌水及以下质粒(pMD2.G 5μg+pSPAX2 15μg+pLentis-CMV-IL12-PGK-PURO 20μg)，总体积为1045μL，然后加入2M CaCl2 155μL，混匀，最后再加入1200μL 2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，迅速将混合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀。3.第三天早上，观察细胞状态，将培养基换为10ml新鲜DMEM培养基。4.第五天早上，观察细胞状态，并收集培养皿中的上清，用0.45μm滤器过滤，然后置于高速离心管中，50000g离心2小时，小心弃去上清，尽量用吸水纸吸干液体，然后用500μL HBSS重悬沉淀，溶解2小时后分装成小管，-70℃保存。
使用病毒转染293细胞，方法如下：消化培养的293细胞，按105细胞/孔接种到6孔板中，培养体积为1ml，24小时后，加入调控载体病毒10μL，在培养箱内继续培养24小时后，弃去上清，换为新鲜的培养基继续培养，待细胞长满后，将其传出到培养瓶中，按适合此细胞的浓度加入puromycin，继续培养，每两天更换一次培养基，并保持puromycin的浓度为3μg/ml，筛选一周后，存活的细胞即为稳定表达调控蛋白的细胞，命名为293(IL12)。
实施例2GMCSF表达细胞构建
合成犬GMCSF(Genbank编号：NM_001003245)基因的编码区，合成的基因两端分别带有BamHI和XhoI酶切位点，然后用BamHI和XhoI进行酶切，体系如下：GMCSF质粒5μg，酶切缓冲液4μL，BamHI 1μL，XhoI 1μL，加水至总体积40μL，37℃静置12小时。取出EP管，加入4.4μL10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收GMCSF基因片段，待用。
酶切表达载体pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下：质粒2μg，酶切缓冲液3μL，BamHI 1μL，XhoI 1μL，加水至总体积30μL，37℃静置12小时。取出EP管，加入3.3μL10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收载体片段，待用。
连接pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO和GMCSF，体系如下：pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO 2μL，GMCSF 2μL，连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶0.5μL，水4.5μL。置于室温连接4小时。然后将连接体系进行大肠杆菌感受态的转化。第二天从转化的平板上挑取菌落，置于LB培养基中37度摇床内过夜培养，使用质粒提取试剂盒从培养的细菌中提取质粒，通过酶切鉴定片段是否成功连入载体中，然后将正确的载体送测序，确定构建成功，表达载体为pLentis-CMV-GMCSF-PGK-PURO。
制备调控载体的病毒，方法如下：1.消化培养的293FT细胞，计数后将3×106细胞/孔铺入10-cm培养皿中，培养液体积为10ml。2.第二天晚上，观察细胞状态，如果细胞状态好，进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25μm，取一只试管，加入灭菌水及以下质粒(pMD2.G 5μg+pSPAX2 15μg+pLentis-CMV-GMCSF-PGK-PURO 20μg)，总体积为1045μL，然后加入2M CaCl2 155μL，混匀，最后再加入1200μL 2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，迅速将混合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀。3.第三天早上，观察细胞状态，将培养基换为10ml新鲜DMEM培养基。4.第五天早上，观察细胞状态，并收集培养皿中的上清，用0.45μm滤器过滤，然后置于高速离心管中，50000g离心2小时，小心弃去上清，尽量用吸水纸吸干液体，然后用500μL HBSS重悬沉淀，溶解2小时后分装成小管，-70℃保存。
使用病毒转染293细胞，方法如下：消化培养的293细胞，按105细胞/孔接种到6孔板中，培养体积为1ml，24小时后，加入调控载体病毒10μL，在培养箱内继续培养24小时后，弃去上清，换为新鲜的培养基继续培养，待细胞长满后，将其传出到培养瓶中，按适合此细胞的浓度加入puromycin，继续培养，每两天更换一次培养基，并保持puromycin的浓度为3μg/ml，筛选一周后，存活的细胞即为稳定表达调控蛋白的细胞，命名为293(GMCSF)。
实施例3IL2表达细胞构建
合成犬IL2(Genbank编号：NM_001003305)基因的编码区，合成的基因两端分别带有BamHI和XhoI酶切位点，然后用BamHI和XhoI进行酶切，体系如下：IL2质粒5μg，酶切缓冲液4μL，BamHI1μL，XhoI1μL，加水至总体积40μL，37℃静置12小时。取出EP管，加入4.4μL10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收IL2基因片段，待用。
酶切表达载体pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下：质粒2μg，酶切缓冲液3μL，BamHI 1μL，XhoI 1μL，加水至总体积30μL，37℃静置12小时。取出EP管，加入3.3μL10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收载体片段，待用。
连接pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO和IL2，体系如下：pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO2μL，IL22μL，连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶0.5μL，水4.5μL。置于室温连接4小时。然后将连接体系进行大肠杆菌感受态的转化。第二天从转化的平板上挑取菌落，置于LB培养基中37度摇床内过夜培养，使用质粒提取试剂盒从培养的细菌中提取质粒，通过酶切鉴定片段是否成功连入载体中，然后将正确的载体送测序，确定构建成功，表达载体为pLentis-CMV-IL2-PGK-PURO。
制备调控载体的病毒，方法如下：1.消化培养的293FT细胞，计数后将3×106细胞/孔铺入10-cm培养皿中，培养液体积为10ml。2.第二天晚上，观察细胞状态，如果细胞状态好，进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25μm，取一只试管，加入灭菌水及以下质粒(pMD2.G 5μg+pSPAX215μg+pLentis-CMV-IL2-PGK-PURO 20μg)，总体积为1045μL，然后加入2M CaCl2155μL，混匀，最后再加入1200μL 2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，迅速将混合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀。3.第三天早上，观察细胞状态，将培养基换为10ml新鲜DMEM培养基。4.第五天早上，观察细胞状态，并收集培养皿中的上清，用0.45μm滤器过滤，然后置于高速离心管中，50000g离心2小时，小心弃去上清，尽量用吸水纸吸干液体，然后用500μL HBSS重悬沉淀，溶解2小时后分装成小管，-70℃保存。
使用病毒转染293细胞，方法如下：消化培养的293细胞，按105细胞/孔接种到6孔板中，培养体积为1ml，24小时后，加入调控载体病毒10μL，在培养箱内继续培养24小时后，弃去上清，换为新鲜的培养基继续培养，待细胞长满后，将其传出到培养瓶中，按适合此细胞的浓度加入puromycin，继续培养，每两天更换一次培养基，并保持puromycin的浓度为3μg/ml，筛选一周后，存活的细胞即为稳定表达调控蛋白的细胞，命名为293(IL2)。
实施例4蛋白质分子cIL12bIL12aIL2GMCSF的表达
4.1构建表达载体
蛋白质分子cIL12bIL12aIL2GMCSF，其前端带有分泌信号肽，后端加入6*His以便纯化，合成基因对应的DNA序列，序列中有BamHI或XhoI位点处用简并密码子突变掉，合成序列前后端分别带有BamHI和XhoI酶切位点，酶切合成的带有目的基因的质粒，体系如下：5μg质粒、4μl酶切缓冲液、1μl BamHI和1μl XhoI，加水至总体积40μl，37℃静置12小时。取出EP管，加入4.4μl 10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收片段，待用。
在EP管内酶切载体pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下：2μg pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体质粒、3μl酶切缓冲液、1μl BamHI和1μl XhoI，加水至总体积30μl，37℃静置12小时。取出EP管，加入3.3μl 10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体片段，待用。
连接cIL12bIL12aIL2GMCSF和pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下，2μlpLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体片段、2μl基因片段、1μl连接酶缓冲液、0.5μl T4DNA连接酶和水4.5μl。置于室温连接4小时。然后将连接体系进行大肠杆菌感受态的转化。第二天从转化的平板上挑取菌落，置于LB培养基中37度摇床内过夜培养，使用质粒提取试剂盒从培养的细菌中提取质粒，通过酶切鉴定片段是否成功连入载体中，然后将正确的载体测序，确定构建成功。获得表达载体pLentis-CMV-cIL12bIL12aIL2GMCSF-IRES-PURO。
4.2制备表达病毒
1)消化培养的293FT细胞，计数后将3×106个细胞/孔铺入10cm培养皿中，培养液体积为10ml。
2)第二天晚上，观察细胞状态，如果细胞状态好，进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25μM，取一只试管，加入灭菌水及以下质粒(pMD2.G 6μg+pSPAX2 15μg+表达载体20μg)，总体积为1045μl，然后加入2M CaCl2 155μl，混匀，最后再加入1200μl 2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，迅速将混合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀。
3)第三天早上，观察细胞状态，将培养基换为10ml新鲜DMEM培养基。
4)第五天早上，观察细胞状态，并收集培养皿中的上清，用0.45μm滤器过滤，然后置于高速离心管中，50000g离心2小时，小心弃去上清，尽量用吸水纸吸干液体，然后用200μl HBSS重悬沉淀，溶解2小时后分装成小管，-70℃保存。
4.3制备表达细胞
消化培养的293A细胞，按105个细胞/孔接种到6孔板中，培养体积为1ml。24小时后，加入10μl表达上述目的基因的病毒，在培养箱内继续培养24小时后，弃去上清，换为新鲜的培养基继续培养。待细胞长满后，将其传出到培养瓶中，加入终浓度3μg/ml嘌呤霉素，继续培养，每两天更换一次培养基，并保持嘌呤霉素的浓度，筛选一周后，存活的细胞即为稳定表达所述蛋白的细胞，命名为293A-cIL12bIL12aIL2GMCSF。
4.4蛋白表达纯化
将构建的cIL12bIL12aIL2GMCSF表达细胞293A-cIL12bIL12aIL2GMCSF，传代到15cm培养皿中，待细胞长满后，将培养基换为30ml CDM4HEK293，继续培养5天，然后收集上清，0.45um滤器过滤，再用50kd的AMICON ULTRA-15超滤浓缩，获得的浓缩蛋白液用镍螯合磁珠进行纯化(海狸生物)，操作流程按说明书进行，获得的纯化蛋白液再用AMICON ULTRA-0.5超滤管进行超滤，将缓冲液置换为PBS，最后获得的蛋白液用IL12p70ELISA试剂盒检测蛋白浓度，将蛋白浓度用PBS调整到2ug/ul后，分装后于-20℃保存。
实施例5蛋白质分子cIL12bIL12aGMCSFIL2的表达
5.1构建表达载体
蛋白质分子cIL12bIL12aGMCSFIL2，其前端带有分泌信号肽，后端加入6*His以便纯化，合成基因对应的DNA序列，序列中有BamHI或XhoI位点处用简并密码子突变掉，合成序列前后端分别带有BamHI和XhoI酶切位点，酶切合成的带有目的基因的质粒，体系如下：5μg质粒、4μl酶切缓冲液、1μl BamHI和1μl XhoI，加水至总体积40μl，37℃静置12小时。取出EP管，加入4.4μl 10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收片段，待用。
在EP管内酶切载体pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下：2μg pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体质粒、3μl酶切缓冲液、1μl BamHI和1μl XhoI，加水至总体积30μl，37℃静置12小时。取出EP管，加入3.3μl 10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体片段，待用。
连接cIL12bIL12aGMCSFIL2和pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下，2μlpLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体片段、2μl基因片段、1μl连接酶缓冲液、0.5μl T4DNA连接酶和水4.5μl。置于室温连接4小时。然后将连接体系进行大肠杆菌感受态的转化。第二天从转化的平板上挑取菌落，置于LB培养基中37度摇床内过夜培养，使用质粒提取试剂盒从培养的细菌中提取质粒，通过酶切鉴定片段是否成功连入载体中，然后将正确的载体测序，确定构建成功。获得表达载体pLentis-CMV-cIL12bIL12aGMCSFIL2-IRES-PURO。
5.2制备表达病毒
1)消化培养的293FT细胞，计数后将3×106个细胞/孔铺入10cm培养皿中，培养液体积为10ml。
2)第二天晚上，观察细胞状态，如果细胞状态好，进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25μM，取一只试管，加入灭菌水及以下质粒(pMD2.G 6μg+pSPAX215μg+表达载体20μg)，总体积为1045μl，然后加入2M CaCl2155μl，混匀，最后再加入1200μl 2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，迅速将混合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀。
3)第三天早上，观察细胞状态，将培养基换为10ml新鲜DMEM培养基。
4)第五天早上，观察细胞状态，并收集培养皿中的上清，用0.45μm滤器过滤，然后置于高速离心管中，50000g离心2小时，小心弃去上清，尽量用吸水纸吸干液体，然后用200μl HBSS重悬沉淀，溶解2小时后分装成小管，-70℃保存。
5.3制备表达细胞
消化培养的293A细胞，按105个细胞/孔接种到6孔板中，培养体积为1ml。24小时后，加入10μl表达上述目的基因的病毒，在培养箱内继续培养24小时后，弃去上清，换为新鲜的培养基继续培养。待细胞长满后，将其传出到培养瓶中，加入终浓度3μg/ml嘌呤霉素，继续培养，每两天更换一次培养基，并保持嘌呤霉素的浓度，筛选一周后，存活的细胞即为稳定表达所述蛋白的细胞，命名为293A-cIL12bIL12aGMCSFIL2。
5.4蛋白表达纯化
将构建的cIL12bIL12aIL2GMCSF表达细胞293A-cIL12bIL12aGMCSFIL2，传代到15cm培养皿中，待细胞长满后，将培养基换为30ml CDM4HEK293，继续培养5天，然后收集上清，0.45um滤器过滤，再用50kd的AMICON ULTRA-15超滤浓缩，获得的浓缩蛋白液用镍螯合磁珠进行纯化(海狸生物)，操作流程按说明书进行，获得的纯化蛋白液再用AMICON ULTRA-0.5超滤管进行超滤，将缓冲液置换为PBS，最后获得的蛋白液用IL12p70ELISA试剂盒检测蛋白浓度，将蛋白浓度用PBS调整到2ug/ul后，分装后于-20℃保存。
实施例6蛋白质分子fIL12bIL12aIL2GMCSF的表达
6.1构建表达载体
蛋白质分子fIL12bIL12aIL2GMCSF，其前端带有分泌信号肽，后端加入6*His以便纯化，合成基因对应的DNA序列，序列中有BamHI或XhoI位点处用简并密码子突变掉，合成序列前后端分别带有BamHI和XhoI酶切位点，酶切合成的带有目的基因的质粒，体系如下：5μg质粒、4μl酶切缓冲液、1μl BamHI和1μl XhoI，加水至总体积40μl，37℃静置12小时。取出EP管，加入4.4μl 10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收片段，待用。
在EP管内酶切载体pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下：2μg pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体质粒、3μl酶切缓冲液、1μl BamHI和1μl XhoI，加水至总体积30μl，37℃静置12小时。取出EP管，加入3.3μl 10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体片段，待用。
连接fIL12bIL12aIL2GMCSF和pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下，2μlpLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体片段、2μl基因片段、1μl连接酶缓冲液、0.5μl T4DNA连接酶和水4.5μl。置于室温连接4小时。然后将连接体系进行大肠杆菌感受态的转化。第二天从转化的平板上挑取菌落，置于LB培养基中37度摇床内过夜培养，使用质粒提取试剂盒从培养的细菌中提取质粒，通过酶切鉴定片段是否成功连入载体中，然后将正确的载体测序，确定构建成功。获得表达载体pLentis-CMV-fIL12bIL12aIL2GMCSF-IRES-PURO。
6.2制备表达病毒
1)消化培养的293FT细胞，计数后将3×106个细胞/孔铺入10cm培养皿中，培养液体积为10ml。
2)第二天晚上，观察细胞状态，如果细胞状态好，进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25μM，取一只试管，加入灭菌水及以下质粒(pMD2.G 6μg+pSPAX215μg+表达载体20μg)，总体积为1045μl，然后加入2M CaCl2155μl，混匀，最后再加入1200μl 2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，迅速将混合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀。
3)第三天早上，观察细胞状态，将培养基换为10ml新鲜DMEM培养基。
4)第五天早上，观察细胞状态，并收集培养皿中的上清，用0.45μm滤器过滤，然后置于高速离心管中，50000g离心2小时，小心弃去上清，尽量用吸水纸吸干液体，然后用200μl HBSS重悬沉淀，溶解2小时后分装成小管，-70℃保存。
6.3制备表达细胞
消化培养的293A细胞，按105个细胞/孔接种到6孔板中，培养体积为1ml。24小时后，加入10μl表达上述目的基因的病毒，在培养箱内继续培养24小时后，弃去上清，换为新鲜的培养基继续培养。待细胞长满后，将其传出到培养瓶中，加入终浓度3μg/ml嘌呤霉素，继续培养，每两天更换一次培养基，并保持嘌呤霉素的浓度，筛选一周后，存活的细胞即为稳定表达所述蛋白的细胞，命名为293A-fIL12bIL12aIL2GMCSF。
6.4蛋白表达纯化
将构建的cIL12bIL12aIL2GMCSF表达细胞293A-fIL12bIL12aIL2GMCSF，传代到15cm培养皿中，待细胞长满后，将培养基换为30ml CDM4HEK293，继续培养5天，然后收集上清，0.45um滤器过滤，再用50kd的AMICON ULTRA-15超滤浓缩，获得的浓缩蛋白液用镍螯合磁珠进行纯化(海狸生物)，操作流程按说明书进行，获得的纯化蛋白液再用AMICON ULTRA-0.5超滤管进行超滤，将缓冲液置换为PBS，最后获得的蛋白液用IL12p70ELISA试剂盒检测蛋白浓度，将蛋白浓度用PBS调整到2ug/ul后，分装后于-20℃保存。
实施例7蛋白质分子fIL12bIL12aGMCSFIL2的表达
7.1构建表达载体
蛋白质分子fIL12bIL12aGMCSFIL2，其前端带有分泌信号肽，后端加入6*His以便纯化，合成基因对应的DNA序列，序列中有BamHI或XhoI位点处用简并密码子突变掉，合成序列前后端分别带有BamHI和XhoI酶切位点，酶切合成的带有目的基因的质粒，体系如下：5μg质粒、4μl酶切缓冲液、1μl BamHI和1μl XhoI，加水至总体积40μl，37℃静置12小时。取出EP管，加入4.4μl 10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收片段，待用。
在EP管内酶切载体pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下：2μg pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体质粒、3μl酶切缓冲液、1μl BamHI和1μl XhoI，加水至总体积30μl，37℃静置12小时。取出EP管，加入3.3μl 10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体片段，待用。
连接fIL12bIL12aGMCSFIL2和pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下，2μlpLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体片段、2μl基因片段、1μl连接酶缓冲液、0.5μl T4DNA连接酶和水4.5μl。置于室温连接4小时。然后将连接体系进行大肠杆菌感受态的转化。第二天从转化的平板上挑取菌落，置于LB培养基中37度摇床内过夜培养，使用质粒提取试剂盒从培养的细菌中提取质粒，通过酶切鉴定片段是否成功连入载体中，然后将正确的载体测序，确定构建成功。获得表达载体pLentis-CMV-fIL12bIL12aGMCSFIL2-IRES-PURO。
7.2制备表达病毒
1)消化培养的293FT细胞，计数后将3×106个细胞/孔铺入10cm培养皿中，培养液体积为10ml。
2)第二天晚上，观察细胞状态，如果细胞状态好，进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25μM，取一只试管，加入灭菌水及以下质粒(pMD2.G 6μg+pSPAX2 15μg+表达载体20μg)，总体积为1045μl，然后加入2M CaCl2 155μl，混匀，最后再加入1200μl 2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，迅速将混合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀。
3)第三天早上，观察细胞状态，将培养基换为10ml新鲜DMEM培养基。
4)第五天早上，观察细胞状态，并收集培养皿中的上清，用0.45μm滤器过滤，然后置于高速离心管中，50000g离心2小时，小心弃去上清，尽量用吸水纸吸干液体，然后用200μl HBSS重悬沉淀，溶解2小时后分装成小管，-70℃保存。
7.3制备表达细胞
消化培养的293A细胞，按105个细胞/孔接种到6孔板中，培养体积为1ml。24小时后，加入10μl表达上述目的基因的病毒，在培养箱内继续培养24小时后，弃去上清，换为新鲜的培养基继续培养。待细胞长满后，将其传出到培养瓶中，加入终浓度3μg/ml嘌呤霉素，继续培养，每两天更换一次培养基，并保持嘌呤霉素的浓度，筛选一周后，存活的细胞即为稳定表达所述蛋白的细胞，命名为293A-fIL12bIL12aGMCSFIL2。
7.4蛋白表达纯化
将构建的cIL12bIL12aIL2GMCSF表达细胞293A-fIL12bIL12aGMCSFIL2，传代到15cm培养皿中，待细胞长满后，将培养基换为30ml CDM4HEK293，继续培养5天，然后收集上清，0.45um滤器过滤，再用50kd的AMICON ULTRA-15超滤浓缩，获得的浓缩蛋白液用镍螯合磁珠进行纯化(海狸生物)，操作流程按说明书进行，获得的纯化蛋白液再用AMICON ULTRA-0.5超滤管进行超滤，将缓冲液置换为PBS，最后获得的蛋白液用IL12p70ELISA试剂盒检测蛋白浓度，将蛋白浓度用PBS调整到2ug/ul后，分装后于-20℃保存。
实施例8蛋白质分子cIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF的表达
8.1构建表达载体
蛋白质分子cIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF，其前端带有分泌信号肽，后端加入6*His以便纯化，合成基因对应的DNA序列，序列中有BamHI或XhoI位点处用简并密码子突变掉，合成序列前后端分别带有BamHI和XhoI酶切位点，酶切合成的带有目的基因的质粒，体系如下：5μg质粒、4μl酶切缓冲液、1μl BamHI和1μl XhoI，加水至总体积40μl，37℃静置12小时。取出EP管，加入4.4μl 10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收片段，待用。
在EP管内酶切载体pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下：2μg pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体质粒、3μl酶切缓冲液、1μl BamHI和1μl XhoI，加水至总体积30μl，37℃静置12小时。取出EP管，加入3.3μl 10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体片段，待用。
连接cIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF和pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下，2μl pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体片段、2μl基因片段、1μl连接酶缓冲液、0.5μlT4DNA连接酶和水4.5μl。置于室温连接4小时。然后将连接体系进行大肠杆菌感受态的转化。第二天从转化的平板上挑取菌落，置于LB培养基中37度摇床内过夜培养，使用质粒提取试剂盒从培养的细菌中提取质粒，通过酶切鉴定片段是否成功连入载体中，然后将正确的载体测序，确定构建成功。获得表达载体：pLentis-CMV-cIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF-IRES-PURO。
8.2制备表达病毒
1)消化培养的293FT细胞，计数后将3×106个细胞/孔铺入10cm培养皿中，培养液体积为10ml。
2)第二天晚上，观察细胞状态，如果细胞状态好，进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25μM，取一只试管，加入灭菌水及以下质粒(pMD2.G 6μg+pSPAX215μg+表达载体20μg)，总体积为1045μl，然后加入2M CaCl2155μl，混匀，最后再加入1200μl 2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，迅速将混合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀。
3)第三天早上，观察细胞状态，将培养基换为10ml新鲜DMEM培养基。
4)第五天早上，观察细胞状态，并收集培养皿中的上清，用0.45μm滤器过滤，然后置于高速离心管中，50000g离心2小时，小心弃去上清，尽量用吸水纸吸干液体，然后用200μl HBSS重悬沉淀，溶解2小时后分装成小管，-70℃保存。
8.3制备表达细胞
消化培养的293A细胞，按105个细胞/孔接种到6孔板中，培养体积为1ml。24小时后，加入10μl表达上述目的基因的病毒，在培养箱内继续培养24小时后，弃去上清，换为新鲜的培养基继续培养。待细胞长满后，将其传出到培养瓶中，加入终浓度3μg/ml嘌呤霉素，继续培养，每两天更换一次培养基，并保持嘌呤霉素的浓度，筛选一周后，存活的细胞即为稳定表达所述蛋白的细胞，命名为293A-cIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF。
8.4蛋白表达纯化
将构建的cIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF表达细胞293A-cIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF，传代到15cm培养皿中，待细胞长满后，将培养基换为30ml CDM4HEK293，继续培养5天，然后收集上清，0.45um滤器过滤，再用50kd的AMICONULTRA-15超滤浓缩，获得的浓缩蛋白液用镍螯合磁珠进行纯化(海狸生物)，操作流程按说明书进行，获得的纯化蛋白液再用AMICON ULTRA-0.5超滤管进行超滤，将缓冲液置换为PBS，最后获得的蛋白液用IL12p70ELISA试剂盒检测蛋白浓度，将蛋白浓度用PBS调整到2ug/ul后，分装后于-20℃保存。
实施例9蛋白质分子fIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF的表达
9.1构建表达载体
蛋白质分子fIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF，其前端带有分泌信号肽，后端加入6*His以便纯化，合成基因对应的DNA序列，序列中有BamHI或XhoI位点处用简并密码子突变掉，合成序列前后端分别带有BamHI和XhoI酶切位点，酶切合成的带有目的基因的质粒，体系如下：5μg质粒、4μl酶切缓冲液、1μl BamHI和1μl XhoI，加水至总体积40μl，37℃静置12小时。取出EP管，加入4.4μl 10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收片段，待用。
在EP管内酶切载体pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下：2μg pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体质粒、3μl酶切缓冲液、1μl BamHI和1μl XhoI，加水至总体积30μl，37℃静置12小时。取出EP管，加入3.3μl 10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体片段，待用。
连接fIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF和pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下，2μl pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO载体片段、2μl基因片段、1μl连接酶缓冲液、0.5μlT4DNA连接酶和水4.5μl。置于室温连接4小时。然后将连接体系进行大肠杆菌感受态的转化。第二天从转化的平板上挑取菌落，置于LB培养基中37度摇床内过夜培养，使用质粒提取试剂盒从培养的细菌中提取质粒，通过酶切鉴定片段是否成功连入载体中，然后将正确的载体测序，确定构建成功。获得表达载体：pLentis-CMV-fIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF-IRES-PURO。
9.2制备表达病毒
1)消化培养的293FT细胞，计数后将3×106个细胞/孔铺入10cm培养皿中，培养液体积为10ml。
2)第二天晚上，观察细胞状态，如果细胞状态好，进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25μM，取一只试管，加入灭菌水及以下质粒(pMD2.G 6μg+pSPAX2 15μg+表达载体20μg)，总体积为1045μl，然后加入2M CaCl2 155μl，混匀，最后再加入1200μl 2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，迅速将混合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀。
3)第三天早上，观察细胞状态，将培养基换为10ml新鲜DMEM培养基。
4)第五天早上，观察细胞状态，并收集培养皿中的上清，用0.45μm滤器过滤，然后置于高速离心管中，50000g离心2小时，小心弃去上清，尽量用吸水纸吸干液体，然后用200μl HBSS重悬沉淀，溶解2小时后分装成小管，-70℃保存。
9.3制备表达细胞
消化培养的293A细胞，按105个细胞/孔接种到6孔板中，培养体积为1ml。24小时后，加入10μl表达上述目的基因的病毒，在培养箱内继续培养24小时后，弃去上清，换为新鲜的培养基继续培养。待细胞长满后，将其传出到培养瓶中，加入终浓度3μg/ml嘌呤霉素，继续培养，每两天更换一次培养基，并保持嘌呤霉素的浓度，筛选一周后，存活的细胞即为稳定表达所述蛋白的细胞，命名为293A-fIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF。
9.4蛋白表达纯化
将构建的fIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF表达细胞293A-fIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF，传代到15cm培养皿中，待细胞长满后，将培养基换为30ml CDM4HEK293，继续培养5天，然后收集上清，0.45um滤器过滤，再用50kd的AMICONULTRA-15超滤浓缩，获得的浓缩蛋白液用镍螯合磁珠进行纯化(海狸生物)，操作流程按说明书进行，获得的纯化蛋白液再用AMICON ULTRA-0.5超滤管进行超滤，将缓冲液置换为PBS，最后获得的蛋白液用IL12p70ELISA试剂盒检测蛋白浓度，将蛋白浓度用PBS调整到2ug/ul后，分装后于-20℃保存。
实施例10cIL12bIL12aIL2GMCSF治疗犬肿瘤案例
将纯化后的cIL12bIL12aIL2GMCSF融合蛋白溶液与3％壳聚糖按体积比1：1混匀后，分装1ml/支，现用现混。瘤内注射每次3支，每15天注射一次，连续注射三次。记录肿瘤大小如下：
注：“c”代表该融合蛋白为得自犬的蛋白，全文同。
鹿犬，10岁，右前腿肉瘤(见图1)，65mm*65mm*55mm。如表1所示，经三次瘤内注射后，瘤体面积减小85％。瘤体体积减小约95％(见图2)。用药后体温正常，未观察到其它不良反应。
实施例11cIL12bIL12aGMCSFIL2治疗犬肿瘤案例
将纯化后的cIL12bIL12aGMCSFIL2融合蛋白溶液与3％壳聚糖按体积比1：1混匀后，分装1ml/支，现用现混。瘤内注射每次3支，每15天注射一次，连续注射三次。记录肿瘤大小如下：
Figure BDA0002127786010000171
萨摩耶犬，13岁，甲状腺癌，约140mm*90mm。如表2所示，经三次瘤内注射后，瘤体面积减小80％。用药后体温正常，未观察到其它不良反应。
实施例12fIL12bIL12aIL2GMCSF治疗猫肿瘤案例
将纯化后的fIL12bIL12aIL2GMCSF融合蛋白溶液与3％壳聚糖按体积比1：1混匀后，分装1ml/支，现用现混。瘤内注射每次2支，每15天注射一次，连续注射三次。记录肿瘤大小如下：
用药后时间(天) 0 20 40 60 80 100
肿瘤尺寸(mm) 45*35 40*30 30*25 20*20 15*10 10*5
注：“f”代表该融合蛋白为得自猫的蛋白，全文同。
混种猫，12岁，胸部基底细胞癌，45mm*35mm。如表2所示，经三次瘤内注射后，瘤体面积减小95％。用药后体温正常，未观察到其它不良反应。
实施例13fIL12bIL12aGMCSFIL2治疗猫肿瘤案例
将纯化后的fIL12bIL12aGMCSFIL2融合蛋白溶液与3％壳聚糖按体积比1∶1混匀后，分装1ml/支，现用现混。瘤内注射每次1支，每30天注射一次，连续注射三次。记录肿瘤大小如下：
Figure BDA0002127786010000181
混种猫，11岁，舌根部鳞状细胞癌，约25mm*20mm。如表4所示，经三次瘤内注射后，瘤体面积减小80％。用药后体温正常，未观察到其它不良反应。
实施例14cIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF治疗犬肿瘤案例
将纯化后的cIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF融合蛋白溶液与3％壳聚糖按体积比1∶1混匀后，分装1ml/支，现用现混。瘤内注射每次2支，每15天注射一次，连续注射三次。记录肿瘤大小如下：
Figure BDA0002127786010000182
混种犬，12岁，乳腺癌，78mm*60mm。如表3所示，经三次瘤内注射后，瘤体面积减小87％。用药后体温正常，未观察到发热或其它不良反应。
实施例15fIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF治疗猫肿瘤案例
将纯化后的fIL12bIL12aIL2DiaNHS76F8GMCSF融合蛋白溶液与3％壳聚糖按体积比1∶1混匀后，分装1ml/支，现用现混。瘤内注射每次2支，每15天注射一次，连续注射三次。记录肿瘤大小如下：
用药后时间(天) 0 20 40 60 80 100
肿瘤尺寸(mm) 55*45 53*45 45*30 30*25 20*15 20*15
混种猫，13岁，乳腺癌，55mm*45mm。如表4所示，经三次瘤内注射后，瘤体面积减小88％。用药后体温正常，未观察到发热或其它不良反应。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Figure BDA0002127786010000201
Figure BDA0002127786010000211
Figure BDA0002127786010000221
Figure BDA0002127786010000231
Figure BDA0002127786010000241
Figure BDA0002127786010000251
Figure BDA0002127786010000261
Figure BDA0002127786010000271
Figure BDA0002127786010000281
Figure BDA0002127786010000291
Figure BDA0002127786010000301
Figure BDA0002127786010000311
Figure BDA0002127786010000321
Figure BDA0002127786010000331
Figure BDA0002127786010000341
Figure BDA0002127786010000351
Figure BDA0002127786010000361
Figure BDA0002127786010000371
Figure BDA0002127786010000381
Figure BDA0002127786010000391
Figure BDA0002127786010000401
Figure BDA0002127786010000411
Figure BDA0002127786010000421
Figure BDA0002127786010000431
Figure BDA0002127786010000441
Figure BDA0002127786010000451
Figure BDA0002127786010000461
Figure BDA0002127786010000471
Figure BDA0002127786010000481
Figure BDA0002127786010000491
Figure BDA0002127786010000501
Figure BDA0002127786010000511
Figure BDA0002127786010000521
Figure BDA0002127786010000531
Figure BDA0002127786010000541
Figure BDA0002127786010000551
Figure BDA0002127786010000561
Figure BDA0002127786010000571
Figure BDA0002127786010000581
Figure BDA0002127786010000591
Figure BDA0002127786010000601
Figure BDA0002127786010000611
Figure BDA0002127786010000621
Figure BDA0002127786010000631
Figure BDA0002127786010000641
Figure BDA0002127786010000651
Figure BDA0002127786010000661
Figure BDA0002127786010000671
Figure BDA0002127786010000681
Figure BDA0002127786010000691
Figure BDA0002127786010000701
Figure BDA0002127786010000711
Figure BDA0002127786010000721
Figure BDA0002127786010000731
Figure BDA0002127786010000741
序列表
<110> 北京科诺科服生物科技有限公司
<120> 一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白及组合物
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 817
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(817)
<223> 融合蛋白
<400> 1
Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp His
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys His Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Lys Val Leu Ser Arg Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Phe Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Val
145 150 155 160
Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys Gln Glu Gly Ser
165 170 175
Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Val Val Asp
180 185 190
Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile
195 200 205
Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Thr Asn Leu Gln Leu Lys Pro
210 215 220
Leu Lys Asn Ser Arg His Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr
225 230 235 240
Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Ala
245 250 255
Gln Gly Lys Asn Asn Arg Glu Lys Lys Asp Arg Leu Cys Val Asp Lys
260 265 270
Thr Ser Ala Lys Val Val Cys His Lys Asp Ala Lys Ile Arg Val Gln
275 280 285
Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Asp Trp Ala Ser Val
290 295 300
Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Ser Arg Ser Leu Pro Thr Ala Ser Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln
325 330 335
Cys Leu Asn His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu
340 345 350
Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Leu Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu
355 360 365
Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala
370 375 380
Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg
385 390 395 400
Glu Ile Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Gly Lys Ala
405 410 415
Ser Phe Met Thr Val Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys
420 425 430
Met Tyr Gln Met Glu Phe Lys Ala Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp
435 440 445
Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp
450 455 460
Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Val Thr Val Pro Gln Lys
465 470 475 480
Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys
485 490 495
Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Met
500 505 510
Met Ser Tyr Leu Asn Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
515 520 525
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ile Thr Ser Ser Ser Thr Lys Glu
530 535 540
Thr Glu Gln Gln Met Glu Gln Leu Leu Leu Asp Leu Gln Leu Leu Leu
545 550 555 560
Asn Gly Val Asn Asn Tyr Glu Asn Pro Gln Leu Ser Arg Met Leu Thr
565 570 575
Phe Lys Phe Tyr Thr Pro Lys Lys Ala Thr Glu Phe Thr His Leu Gln
580 585 590
Cys Leu Ala Glu Glu Leu Lys Asn Leu Glu Glu Val Leu Gly Leu Pro
595 600 605
Gln Ser Lys Asn Val His Leu Thr Asp Thr Lys Glu Leu Ile Ser Asn
610 615 620
Met Asn Val Thr Leu Leu Lys Leu Lys Gly Ser Glu Thr Ser Tyr Asn
625 630 635 640
Cys Glu Tyr Asp Asp Glu Thr Ala Thr Ile Thr Glu Phe Leu Asn Lys
645 650 655
Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Phe Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly
660 665 670
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Arg
675 680 685
Ser Pro Thr Leu Val Thr Arg Pro Ser Gln His Val Asp Ala Ile Gln
690 695 700
Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asn Ser Asn Asp Val Thr Ala Val Met
705 710 715 720
Asn Lys Ala Val Lys Val Val Ser Glu Val Phe Asp Pro Glu Gly Pro
725 730 735
Thr Cys Leu Glu Thr Arg Leu Gln Leu Tyr Lys Glu Gly Leu Gln Gly
740 745 750
Ser Leu Thr Ser Leu Lys Asn Pro Leu Thr Met Met Ala Asn His Tyr
755 760 765
Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Ser Pro Cys Ala Thr Gln Asn
770 775 780
Ile Asn Phe Lys Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Phe Asn
785 790 795 800
Ile Pro Phe Asp Cys Trp Lys Pro Val Lys Lys His His His His His
805 810 815
His
<210> 2
<211> 817
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(817)
<223> 融合蛋白
<400> 2
Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp His
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys His Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Lys Val Leu Ser Arg Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Phe Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Val
145 150 155 160
Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys Gln Glu Gly Ser
165 170 175
Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Val Val Asp
180 185 190
Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile
195 200 205
Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Thr Asn Leu Gln Leu Lys Pro
210 215 220
Leu Lys Asn Ser Arg His Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr
225 230 235 240
Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Ala
245 250 255
Gln Gly Lys Asn Asn Arg Glu Lys Lys Asp Arg Leu Cys Val Asp Lys
260 265 270
Thr Ser Ala Lys Val Val Cys His Lys Asp Ala Lys Ile Arg Val Gln
275 280 285
Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Asp Trp Ala Ser Val
290 295 300
Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Ser Arg Ser Leu Pro Thr Ala Ser Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln
325 330 335
Cys Leu Asn His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu
340 345 350
Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Leu Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu
355 360 365
Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala
370 375 380
Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg
385 390 395 400
Glu Ile Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Gly Lys Ala
405 410 415
Ser Phe Met Thr Val Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys
420 425 430
Met Tyr Gln Met Glu Phe Lys Ala Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp
435 440 445
Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp
450 455 460
Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Val Thr Val Pro Gln Lys
465 470 475 480
Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys
485 490 495
Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Met
500 505 510
Met Ser Tyr Leu Asn Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
515 520 525
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Thr Leu Val Thr
530 535 540
Arg Pro Ser Gln His Val Asp Ala Ile Gln Glu Ala Leu Ser Leu Leu
545 550 555 560
Asn Asn Ser Asn Asp Val Thr Ala Val Met Asn Lys Ala Val Lys Val
565 570 575
Val Ser Glu Val Phe Asp Pro Glu Gly Pro Thr Cys Leu Glu Thr Arg
580 585 590
Leu Gln Leu Tyr Lys Glu Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Ser Leu Lys
595 600 605
Asn Pro Leu Thr Met Met Ala Asn His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro
610 615 620
Thr Pro Glu Ser Pro Cys Ala Thr Gln Asn Ile Asn Phe Lys Ser Phe
625 630 635 640
Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Phe Asn Ile Pro Phe Asp Cys Trp
645 650 655
Lys Pro Val Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
660 665 670
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ile Thr Ser Ser Ser Thr Lys Glu Thr Glu
675 680 685
Gln Gln Met Glu Gln Leu Leu Leu Asp Leu Gln Leu Leu Leu Asn Gly
690 695 700
Val Asn Asn Tyr Glu Asn Pro Gln Leu Ser Arg Met Leu Thr Phe Lys
705 710 715 720
Phe Tyr Thr Pro Lys Lys Ala Thr Glu Phe Thr His Leu Gln Cys Leu
725 730 735
Ala Glu Glu Leu Lys Asn Leu Glu Glu Val Leu Gly Leu Pro Gln Ser
740 745 750
Lys Asn Val His Leu Thr Asp Thr Lys Glu Leu Ile Ser Asn Met Asn
755 760 765
Val Thr Leu Leu Lys Leu Lys Gly Ser Glu Thr Ser Tyr Asn Cys Glu
770 775 780
Tyr Asp Asp Glu Thr Ala Thr Ile Thr Glu Phe Leu Asn Lys Trp Ile
785 790 795 800
Thr Phe Cys Gln Ser Ile Phe Ser Thr Leu Thr His His His His His
805 810 815
His
<210> 3
<211> 816
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(816)
<223> 融合蛋白
<400> 3
Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asn Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp His
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asn Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Ala Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Phe Leu
65 70 75 80
Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Arg
85 90 95
Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Lys Phe Thr Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Glu Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Lys Val Arg Val
145 150 155 160
Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys Gln Glu Gly Ser
165 170 175
Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Val Val Asp
180 185 190
Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile
195 200 205
Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro
210 215 220
Leu Lys Asn Ser Arg His Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr
225 230 235 240
Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Gly Val Gln Val
245 250 255
Gln Gly Lys Asn Asn Arg Glu Lys Lys Asp Arg Leu Ser Val Asp Lys
260 265 270
Thr Ser Ala Lys Val Val Cys His Lys Asp Ala Lys Ile Arg Val Gln
275 280 285
Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Asn Trp Ala Ser Val
290 295 300
Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Ser Arg Asn Leu Pro Thr Pro Thr Pro Ser Pro Gly Met Phe Gln
325 330 335
Cys Leu Asn His Ser Gln Thr Leu Leu Arg Ala Ile Ser Asn Thr Leu
340 345 350
Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu
355 360 365
Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala
370 375 380
Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg
385 390 395 400
Glu Ile Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr
405 410 415
Ser Phe Met Thr Thr Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys
420 425 430
Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Ala Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp
435 440 445
Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp
450 455 460
Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Val Asn Ser Val Thr Val Pro Gln Asn
465 470 475 480
Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys
485 490 495
Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asn Arg Met
500 505 510
Met Ser Tyr Leu Asn Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
515 520 525
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Glu Thr
530 535 540
Gln Gln Gln Leu Glu Gln Leu Leu Leu Asp Leu Arg Leu Leu Leu Asn
545 550 555 560
Gly Val Asn Asn Pro Glu Asn Pro Lys Leu Ser Arg Met Leu Thr Phe
565 570 575
Lys Phe Tyr Val Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Thr His Leu Gln Cys
580 585 590
Leu Val Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Gln
595 600 605
Ser Lys Asn Phe His Leu Asn His Ile Lys Glu Leu Met Ser Asn Ile
610 615 620
Asn Val Thr Val Leu Lys Leu Lys Gly Ser Glu Thr Arg Phe Thr Cys
625 630 635 640
Asn Tyr Asp Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Lys Trp
645 650 655
Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Phe Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly
660 665 670
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser
675 680 685
Pro Ser Ser Val Thr Arg Pro Trp Gln His Val Asp Ala Met Lys Glu
690 695 700
Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asn Ser Ser Glu Ile Thr Ala Val Met Asn
705 710 715 720
Glu Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe Asp Pro Glu Glu Pro Lys
725 730 735
Cys Leu Gln Thr His Leu Lys Leu Tyr Glu Gln Gly Leu Arg Gly Ser
740 745 750
Leu Ile Ser Leu Lys Glu Pro Leu Arg Met Met Ala Asn His Tyr Lys
755 760 765
Gln His Cys Pro Leu Thr Pro Glu Thr Pro Cys Glu Thr Gln Thr Ile
770 775 780
Thr Phe Lys Asn Phe Lys Glu Lys Leu Lys Asp Phe Leu Phe Asn Asn
785 790 795 800
Pro Phe Asp Cys Trp Gly Pro Asp Gln Lys His His His His His His
805 810 815
<210> 4
<211> 816
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(816)
<223> 融合蛋白
<400> 4
Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asn Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp His
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asn Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Ala Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Phe Leu
65 70 75 80
Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Arg
85 90 95
Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Lys Phe Thr Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Glu Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Lys Val Arg Val
145 150 155 160
Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys Gln Glu Gly Ser
165 170 175
Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Val Val Asp
180 185 190
Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile
195 200 205
Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro
210 215 220
Leu Lys Asn Ser Arg His Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr
225 230 235 240
Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Gly Val Gln Val
245 250 255
Gln Gly Lys Asn Asn Arg Glu Lys Lys Asp Arg Leu Ser Val Asp Lys
260 265 270
Thr Ser Ala Lys Val Val Cys His Lys Asp Ala Lys Ile Arg Val Gln
275 280 285
Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Asn Trp Ala Ser Val
290 295 300
Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Ser Arg Asn Leu Pro Thr Pro Thr Pro Ser Pro Gly Met Phe Gln
325 330 335
Cys Leu Asn His Ser Gln Thr Leu Leu Arg Ala Ile Ser Asn Thr Leu
340 345 350
Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu
355 360 365
Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala
370 375 380
Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg
385 390 395 400
Glu Ile Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr
405 410 415
Ser Phe Met Thr Thr Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys
420 425 430
Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Ala Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp
435 440 445
Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp
450 455 460
Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Val Asn Ser Val Thr Val Pro Gln Asn
465 470 475 480
Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys
485 490 495
Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asn Arg Met
500 505 510
Met Ser Tyr Leu Asn Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
515 520 525
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Pro Ser Ser Val Thr
530 535 540
Arg Pro Trp Gln His Val Asp Ala Met Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu
545 550 555 560
Asn Asn Ser Ser Glu Ile Thr Ala Val Met Asn Glu Thr Val Glu Val
565 570 575
Val Ser Glu Met Phe Asp Pro Glu Glu Pro Lys Cys Leu Gln Thr His
580 585 590
Leu Lys Leu Tyr Glu Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Ile Ser Leu Lys
595 600 605
Glu Pro Leu Arg Met Met Ala Asn His Tyr Lys Gln His Cys Pro Leu
610 615 620
Thr Pro Glu Thr Pro Cys Glu Thr Gln Thr Ile Thr Phe Lys Asn Phe
625 630 635 640
Lys Glu Lys Leu Lys Asp Phe Leu Phe Asn Asn Pro Phe Asp Cys Trp
645 650 655
Gly Pro Asp Gln Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
660 665 670
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Glu Thr Gln Gln
675 680 685
Gln Leu Glu Gln Leu Leu Leu Asp Leu Arg Leu Leu Leu Asn Gly Val
690 695 700
Asn Asn Pro Glu Asn Pro Lys Leu Ser Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
705 710 715 720
Tyr Val Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Thr His Leu Gln Cys Leu Val
725 730 735
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Gln Ser Lys
740 745 750
Asn Phe His Leu Asn His Ile Lys Glu Leu Met Ser Asn Ile Asn Val
755 760 765
Thr Val Leu Lys Leu Lys Gly Ser Glu Thr Arg Phe Thr Cys Asn Tyr
770 775 780
Asp Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Lys Trp Ile Thr
785 790 795 800
Phe Cys Gln Ser Ile Phe Ser Thr Leu Thr His His His His His His
805 810 815
<210> 5
<211> 1309
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(1309)
<223> 融合蛋白
<400> 5
Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp His
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys His Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Lys Val Leu Ser Arg Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Phe Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Val
145 150 155 160
Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys Gln Glu Gly Ser
165 170 175
Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Val Val Asp
180 185 190
Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile
195 200 205
Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Thr Asn Leu Gln Leu Lys Pro
210 215 220
Leu Lys Asn Ser Arg His Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr
225 230 235 240
Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Ala
245 250 255
Gln Gly Lys Asn Asn Arg Glu Lys Lys Asp Arg Leu Cys Val Asp Lys
260 265 270
Thr Ser Ala Lys Val Val Cys His Lys Asp Ala Lys Ile Arg Val Gln
275 280 285
Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Asp Trp Ala Ser Val
290 295 300
Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Ser Arg Ser Leu Pro Thr Ala Ser Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln
325 330 335
Cys Leu Asn His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu
340 345 350
Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Leu Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu
355 360 365
Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala
370 375 380
Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg
385 390 395 400
Glu Ile Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Gly Lys Ala
405 410 415
Ser Phe Met Thr Val Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys
420 425 430
Met Tyr Gln Met Glu Phe Lys Ala Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp
435 440 445
Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp
450 455 460
Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Val Thr Val Pro Gln Lys
465 470 475 480
Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys
485 490 495
Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Met
500 505 510
Met Ser Tyr Leu Asn Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
515 520 525
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ile Thr Ser Ser Ser Thr Lys Glu
530 535 540
Thr Glu Gln Gln Met Glu Gln Leu Leu Leu Asp Leu Gln Leu Leu Leu
545 550 555 560
Asn Gly Val Asn Asn Tyr Glu Asn Pro Gln Leu Ser Arg Met Leu Thr
565 570 575
Phe Lys Phe Tyr Thr Pro Lys Lys Ala Thr Glu Phe Thr His Leu Gln
580 585 590
Cys Leu Ala Glu Glu Leu Lys Asn Leu Glu Glu Val Leu Gly Leu Pro
595 600 605
Gln Ser Lys Asn Val His Leu Thr Asp Thr Lys Glu Leu Ile Ser Asn
610 615 620
Met Asn Val Thr Leu Leu Lys Leu Lys Gly Ser Glu Thr Ser Tyr Asn
625 630 635 640
Cys Glu Tyr Asp Asp Glu Thr Ala Thr Ile Thr Glu Phe Leu Asn Lys
645 650 655
Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Phe Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly
660 665 670
Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
675 680 685
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser
690 695 700
Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp
705 710 715 720
Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser
725 730 735
Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg
740 745 750
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu
755 760 765
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly
770 775 780
Lys Trp Ser Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
785 790 795 800
Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
805 810 815
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
820 825 830
Ser Gln Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
835 840 845
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
850 855 860
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
865 870 875 880
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
885 890 895
Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
900 905 910
Glu Ile Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser
915 920 925
Ser Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
930 935 940
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
945 950 955 960
Leu Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
965 970 975
Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
980 985 990
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
995 1000 1005
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
1010 1015 1020
Tyr Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
1025 1030 1035 1040
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Glu
1045 1050 1055
Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg
1060 1065 1070
Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr
1075 1080 1085
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn
1090 1095 1100
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly
1105 1110 1115 1120
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala
1125 1130 1135
Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe
1140 1145 1150
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ser Ser Gly Leu Val
1155 1160 1165
Pro Arg Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ala Pro Thr Arg Ser Pro Thr Leu
1170 1175 1180
Val Thr Arg Pro Ser Gln His Val Asp Ala Ile Gln Glu Ala Leu Ser
1185 1190 1195 1200
Leu Leu Asn Asn Ser Asn Asp Val Thr Ala Val Met Asn Lys Ala Val
1205 1210 1215
Lys Val Val Ser Glu Val Phe Asp Pro Glu Gly Pro Thr Cys Leu Glu
1220 1225 1230
Thr Arg Leu Gln Leu Tyr Lys Glu Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Ser
1235 1240 1245
Leu Lys Asn Pro Leu Thr Met Met Ala Asn His Tyr Lys Gln His Cys
1250 1255 1260
Pro Pro Thr Pro Glu Ser Pro Cys Ala Thr Gln Asn Ile Asn Phe Lys
1265 1270 1275 1280
Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Phe Asn Ile Pro Phe Asp
1285 1290 1295
Cys Trp Lys Pro Val Lys Lys His His His His His His
1300 1305
<210> 6
<211> 1308
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(1308)
<223> 融合蛋白
<400> 6
Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asn Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp His
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asn Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Ala Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Phe Leu
65 70 75 80
Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Arg
85 90 95
Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Lys Phe Thr Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Glu Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Lys Val Arg Val
145 150 155 160
Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys Gln Glu Gly Ser
165 170 175
Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Val Val Asp
180 185 190
Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile
195 200 205
Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro
210 215 220
Leu Lys Asn Ser Arg His Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr
225 230 235 240
Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Gly Val Gln Val
245 250 255
Gln Gly Lys Asn Asn Arg Glu Lys Lys Asp Arg Leu Ser Val Asp Lys
260 265 270
Thr Ser Ala Lys Val Val Cys His Lys Asp Ala Lys Ile Arg Val Gln
275 280 285
Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Asn Trp Ala Ser Val
290 295 300
Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Ser Arg Asn Leu Pro Thr Pro Thr Pro Ser Pro Gly Met Phe Gln
325 330 335
Cys Leu Asn His Ser Gln Thr Leu Leu Arg Ala Ile Ser Asn Thr Leu
340 345 350
Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu
355 360 365
Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala
370 375 380
Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg
385 390 395 400
Glu Ile Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr
405 410 415
Ser Phe Met Thr Thr Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys
420 425 430
Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Ala Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp
435 440 445
Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp
450 455 460
Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Val Asn Ser Val Thr Val Pro Gln Asn
465 470 475 480
Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys
485 490 495
Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asn Arg Met
500 505 510
Met Ser Tyr Leu Asn Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
515 520 525
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Glu Thr
530 535 540
Gln Gln Gln Leu Glu Gln Leu Leu Leu Asp Leu Arg Leu Leu Leu Asn
545 550 555 560
Gly Val Asn Asn Pro Glu Asn Pro Lys Leu Ser Arg Met Leu Thr Phe
565 570 575
Lys Phe Tyr Val Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Thr His Leu Gln Cys
580 585 590
Leu Val Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Gln
595 600 605
Ser Lys Asn Phe His Leu Asn His Ile Lys Glu Leu Met Ser Asn Ile
610 615 620
Asn Val Thr Val Leu Lys Leu Lys Gly Ser Glu Thr Arg Phe Thr Cys
625 630 635 640
Asn Tyr Asp Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Lys Trp
645 650 655
Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Phe Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly
660 665 670
Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
675 680 685
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu
690 695 700
Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly
705 710 715 720
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile
725 730 735
Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
740 745 750
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
755 760 765
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys
770 775 780
Trp Ser Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
785 790 795 800
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
805 810 815
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
820 825 830
Gln Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
835 840 845
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly
850 855 860
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
865 870 875 880
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
885 890 895
Gln Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
900 905 910
Ile Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser
915 920 925
Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
930 935 940
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu
945 950 955 960
Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
965 970 975
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
980 985 990
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
995 1000 1005
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
1010 1015 1020
Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
1025 1030 1035 1040
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Glu Leu
1045 1050 1055
Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile
1060 1065 1070
Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln
1075 1080 1085
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn
1090 1095 1100
Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn
1105 1110 1115 1120
Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp
1125 1130 1135
Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly
1140 1145 1150
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ser Ser Gly Leu Val Pro
1155 1160 1165
Arg Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ala Pro Thr Ser Ser Pro Ser Ser Val
1170 1175 1180
Thr Arg Pro Trp Gln His Val Asp Ala Met Lys Glu Ala Leu Ser Leu
1185 1190 1195 1200
Leu Asn Asn Ser Ser Glu Ile Thr Ala Val Met Asn Glu Thr Val Glu
1205 1210 1215
Val Val Ser Glu Met Phe Asp Pro Glu Glu Pro Lys Cys Leu Gln Thr
1220 1225 1230
His Leu Lys Leu Tyr Glu Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Ile Ser Leu
1235 1240 1245
Lys Glu Pro Leu Arg Met Met Ala Asn His Tyr Lys Gln His Cys Pro
1250 1255 1260
Leu Thr Pro Glu Thr Pro Cys Glu Thr Gln Thr Ile Thr Phe Lys Asn
1265 1270 1275 1280
Phe Lys Glu Lys Leu Lys Asp Phe Leu Phe Asn Asn Pro Phe Asp Cys
1285 1290 1295
Trp Gly Pro Asp Gln Lys His His His His His His
1300 1305

Claims (7)

1.一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含IL12、IL2和GMCSF片段，所述IL12、IL2和GMCSF片段得自猫或犬，所述融合蛋白为SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6任一所示的蛋白。
2.一种用于治疗动物肿瘤的组合物，其特征在于，所述组合物包含根据权利要求1所述的融合蛋白和壳聚糖溶液。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含30-70体积％的融合蛋白溶液和70-30体积％的壳聚糖溶液。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含50体积％的融合蛋白溶液和50体积％的壳聚糖溶液。
5.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述壳聚糖溶液为含1-10重量％壳聚糖的溶液。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述壳聚糖溶液为含3-8重量％壳聚糖的溶液。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述壳聚糖溶液为含3重量％壳聚糖的溶液。
CN201910627990.4A 2019-07-12 2019-07-12 一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白及组合物 Active CN112210014B (zh)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910627990.4A CN112210014B (zh) 2019-07-12 2019-07-12 一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白及组合物
PCT/CN2020/097441 WO2021008308A1 (zh) 2019-07-12 2020-06-22 一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白及组合物
EP20841149.6A EP3998288A4 (en) 2019-07-12 2020-06-22 FUSION PROTEIN AND COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF TUMORS IN ANIMALS
JP2022501173A JP7305020B2 (ja) 2019-07-12 2020-06-22 動物の腫瘍を処置するための融合タンパク質および組成物
US17/625,131 US20220267399A1 (en) 2019-07-12 2020-06-22 Fusion Protein And Composition For Treating Animal Tumors

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910627990.4A CN112210014B (zh) 2019-07-12 2019-07-12 一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白及组合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112210014A CN112210014A (zh) 2021-01-12
CN112210014B true CN112210014B (zh) 2022-10-11

Family

ID=74047777

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910627990.4A Active CN112210014B (zh) 2019-07-12 2019-07-12 一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白及组合物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220267399A1 (zh)
EP (1) EP3998288A4 (zh)
JP (1) JP7305020B2 (zh)
CN (1) CN112210014B (zh)
WO (1) WO2021008308A1 (zh)

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5891680A (en) * 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
CA2380331C (en) * 1999-08-09 2012-11-20 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Multiple cytokine-antibody complexes
EP1731531B1 (en) * 1999-08-09 2012-05-30 Merck Patent GmbH Multiple cytokine-antibody complexes
US20070178066A1 (en) * 2003-04-21 2007-08-02 Hall Frederick L Pathotropic targeted gene delivery system for cancer and other disorders
CN108686202A (zh) * 2017-04-06 2018-10-23 张晋宇 肿瘤免疫疗法
CN111527109A (zh) * 2017-12-26 2020-08-11 南京金斯瑞生物科技有限公司 以抗体Fc区为骨架的融合蛋白二聚体及其应用
CN111848811A (zh) * 2019-04-27 2020-10-30 张晋宇 一种蛋白质异二聚体及其用途
CN111848810A (zh) * 2019-04-28 2020-10-30 张晋宇 一种蛋白质分子及其用途
CN112294760A (zh) * 2019-07-26 2021-02-02 张晋宇 一种液体制剂及其应用
WO2021147886A1 (zh) * 2020-01-21 2021-07-29 张晋宇 一种药物组合物及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Zhang, JY ; Jiang, HC ; Zhang, HY.In situ administration of cytokine combinations tumor regression in mice.《EBioMedicine》.2018,第37卷第38-46页. *

Also Published As

Publication number Publication date
JP7305020B2 (ja) 2023-07-07
CN112210014A (zh) 2021-01-12
JP2022540202A (ja) 2022-09-14
US20220267399A1 (en) 2022-08-25
WO2021008308A1 (zh) 2021-01-21
EP3998288A4 (en) 2023-08-09
EP3998288A1 (en) 2022-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018184484A1 (zh) 细胞因子组合
Vilcek et al. Fibroblast growth enhancing activity of tumor necrosis factor and its relationship to other polypeptide growth factors.
JPH09502993A (ja) 免疫または炎症応答の調節による抗がん遺伝子療法
US20220211803A1 (en) Protein molecule and use thereof
US11795203B2 (en) Protein heterodimer and use thereof
AU1811795A (en) Method for preparing clonogenic fibroblasts, method for gene transfection of fibroblasts and gene-transfected fibroblasts so obtained
AU2002360788A1 (en) Hair follicle growth
CN112210014B (zh) 一种用于治疗动物肿瘤的融合蛋白及组合物
US20200338166A1 (en) Anti-tumor drug composition and polynucleotide composition
AU2021461372A1 (en) Long-acting recombinant human interleukin-2 fusion protein, and preparation method therefor and application thereof
CN102757503A (zh) 人前列腺凋亡反应蛋白4与凋亡素2配体融合蛋白的制法和用途
KR101815187B1 (ko) 손상 조직으로 이동 능력이 향상된 중간엽 줄기세포 및 이의 제조 방법
WO2019027298A2 (ko) Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방또는 치료용 약학 조성물
WO2023176750A1 (ja) 目的とする核酸を搭載した、核酸医薬品としてのエクソソームの新規製造方法
CN113786416B (zh) 转基因的nk细胞在治疗癌症中的用途
CN116606884B (zh) 一种制备car-t细胞的方法以及制得的car-t细胞及其应用
JP2023548382A (ja) 異種免疫細胞に対する化学走性を誘導する形質転換された免疫細胞
CN116375883A (zh) 重组car元件及其在her2阳性肿瘤中的应用
KR101305834B1 (ko) 신경교종 치료를 위한 방사선 및 ｔｒａｉｌ 발현 간엽줄기세포의 조합 치료 방법
CN114773474A (zh) Nk细胞的制备方法及其抗癌的应用
CN116987666A (zh) 靶向sting通路制备治疗性nk细胞
CN117305252A (zh) 一种重组间充质干细胞及其制备方法
CN113599395A (zh) 含有nk细胞的治疗癌症的药物组合物
CN116510022A (zh) 一种用于抗肿瘤的组合物、重组质粒组合物及其应用
TWI278320B (en) A complex immunity gene medicine composition for inhibiting tumor cell

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant