JPH09502993A - 免疫または炎症応答の調節による抗がん遺伝子療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫および／または炎症応答調節遺伝子の全部または一部についてコードする１以上の遺伝子を含んだＤＮＡ断片がゲノム中に挿入されたウイルスベクターが、哺乳動物におけるがん治療用薬物の製造に用いられる。本発明は、特に、サイトカイン、特にインターロイキン‐２、４、５、６または７、ガンマインターフェロン、コロニー刺激因子あるいはタイプβ腫瘍壊死因子についてコードする遺伝子がゲノム中に挿入された、ポックスウイルスに由来するウイルスベクターの用途に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫または炎症応答の調節による抗がん遺伝子療法 本発明は遺伝子療法によるがんの治療方法に関する。更に詳しくは、本発明は 免疫および／または炎症応答を調節する物質についてコードする遺伝子を腫瘍細 胞に送達するためのウイルスベクターの使用に関する。 がんは細胞増殖のコントロールの喪失に起因する疾患であると通常認められて いる。その原因は多く、特に細胞遺伝子の機能性の欠陥（例えば正常遺伝子の体 細胞変異による潜在的発がん遺伝子の活性化；細胞遺伝子の発現の調節解除；腫 瘍抑制遺伝子の発現の阻害）またはウイルス遺伝子の望ましくない発現による。 この２０年の間に、ほとんどの腫瘍細胞は、正常細胞では相当物を見い出せな い腫瘍特異性抗原（非自己抗原）をそれらの表面で出すことが明らかにされた。 これらの腫瘍特異性抗原は、例えば（ｉ）発現が胎児胚期に生じて、誕生時には それが消失するような程度まで退行する細胞抗原、（ii）通常非常に低いレベル で発現され、高レベルで発現されるときには腫瘍の特徴になる抗原、または(iii )構造またはコンホメーションが変えられた細胞抗原である。 原則として、これら腫瘍特異性抗原の異常発現は非自己抗原により誘導される 場合と同タイプの免疫応答を誘発することができる。この応答では好中球、リン パ球、単球およびマクロファージを含めた免疫系の細胞のすべてを使う。 一般的に言えば、２つの大きなタイプの免疫応答、即ちＢリンパ球による抗体 の産生に相当する体液型応答と、エフェクター細胞、本質的に細胞毒性Ｔ（Ｔ_C ）リンパ球、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞および食細胞に関連した細胞毒性効 果を有する細胞性免疫応答がある。調節細胞は双方のタイプの免疫応答、即ち本 質的にＴヘルパー（Ｔ_H）リンパ球およびＴサプレッサー（Ｔ_S）リンパ球を調節 する。 免疫応答は、異なる細胞タイプの協力を特に要する極端に複雑な現象である。 この協力は細胞間伝達物質として関与する可溶性分子であるサイトカインの中間 作用から生じる。 体液性免疫に関して、Ｂリンパ球は未変性コンホメーションの非自己抗原によ り刺激される。この刺激に応答して、Ｂリンパ球はこれらの外来抗原に対する特 異的抗体を産生する。 他方、Ｔリンパ球は主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の抗原と一緒に抗 原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で提示される非自己抗原の分解産物であるペプチド によってのみ刺激される。 Ｔリンパ球の活性化は、それらの増殖を誘発させて、それらの機能、特に細胞 毒性リンパ球による感染または腫瘍細胞の破壊を行う効果を有している。 スーパー抗原と称される１クラスだけの抗原は、常法どおりに提示されない。 事実、スーパー抗原は事前にペプチドへと分解されることなくＭＨＣの分子と結 合することができ、しかも同時に古典的抗原の経路で活性化されるＴリンパ球よ りも大量のＴリンパ球を活性化できる。このため、これらのスーパー抗原は強い 免疫応答を誘導することができる。 炎症はダメージ、例えば創傷または感染に対する体の応答により誘発される。 炎症応答は、免疫系の細胞を炎症の現場に引き寄せる効果を有する化学走性また は化学誘起作用分子（ケモカインという用語でも表わされる）の放出を特に含め た一連の反応からなる。 活性化されたＴリンパ球は、ＭＩＦ（遊走阻止因子）のような細胞遊走現象を 阻止する分子を特に産生する。その名称が示すように、ＭＩＦはマクロファージ の遊走を阻止して、その結果炎症部位でそれらの集中を促進する役割を有してお り、そのためそれらは最適の条件下でそれらの食作用機能を発揮する。 明らかにされたがんの場合において、免疫系自体に欠陥があるか、あるいは腫 瘍細胞の表現型変化が免疫応答を誘発する上で阻害するかまたは十分でないため に、抗腫瘍免疫応答には欠陥がある。 がんを治療するために、インターロイキン‐２（ＩＬ‐２）、インターフェロ ン（ＩＦＮ‐γ）または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タイプαのようなサイトカイン の全身および反復用量を患者に投与することにより抗腫瘍免疫反応を強化するこ とは既に提案されている(Rosenberg,1992,J.Clin.Oncology,10,180-199)。残念 ながら、副作用は無視しうるものではなく、それには悪心から死さえにも及ぶ。 更に、このような治療は極端に高価であることがわかっている。 免疫賦活分子についてコードする遺伝子の患者の細胞中へのex vivo 移入に基 づく類似した考え方も、やはり提案されていた代替法を背景としている；これは 発現目的で行われる。簡単に言えば、（ｉ）腫瘍細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ ＴＩＬ）が患者から取り出される；（ii）それらはＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐ ６およびＴＮＦαのような免疫賦活分子についてコードする遺伝子を保有したベ クターによりex vivo でトランスフェクトされる；(iii) それらはそれらが由来 する患者の中に再移植される。 前記のような臨床試験は、現在まで、ささやかなまたは期待はずれの結果を与 えてきただけである。多くの研究者は低レベルの発現を報告している(Anderson, 1993,Science,259,1391-1392)。更に、このようなプロトコールは大規模に適用 することが困難である。事実、それは治療される患者毎に細胞のバルク培養を要 し、コスト、時間およびリスク観点からこれには欠点を伴う。加えて、インビト ロ培養期に新たな腫瘍抗原変異体の発現がないことは保証できない。 かなり最近になり、Plautz et al.(1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,4645-46 49)はマウス腫瘍細胞への組換えレトロウイルスによる直接インビボトランスフ ェクションについて報告した。後者はマウスＭＨＣ表面抗原についてコードする 相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の発現を行えるように変えられた。選択された抗原は 同種異系であり、即ちそれは宿主マウスに対して遺伝的バリエーションを示し、 この抗原を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を刺激する目的である。この方法 では各患者毎に細胞系を作る必要性を解消しているが、しかしながらそれは外科 的にアクセスしうる腫瘍のみに適用できる。 腫瘍をもつマウスに投与されたワクシニアウイルスはがん組織に優先的に感染 することがわかった。ワクシニアウイルスが免疫賦活分子についてコードする遺 伝子を保有しているとき、腫瘍増殖の阻害と一部の場合には完全な退縮が観察さ れる。 このため、本発明の目的は、哺乳動物におけるがん治療用医薬品の製造に関す る、がん細胞の破壊に関与する少くとも１つの物質（agent）、例えばがん細胞 に毒性である物質または免疫および／または炎症応答を調節する物質、ついてコ ードする１以上の遺伝子を含んだＤＮＡ断片がゲノムに挿入されたウイルスベク ターの使用である。 “ウイルスベクター”とは、真核細胞中への関心ある遺伝子の移入とその中で のその発現を行えるようにゲノムが修正されたウイルスを意味すると理解されて いる。本発明の関係で使用できるウイルスベクターは、特にポックスウイルス、 ヘルペスウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルスに由来する。有利には 、当該ベクターは非組込み性かつ非複製性であって、宿主細胞または起源が例え ばカナリヤポックスウイルスのような非ヒトであるものである。このようなベク ターとそれらの製造技術は当業者に公知である。 アデノウイルスに由来するウイルスベクターに関して、これは５′末端に位置 するＥ１Ａ遺伝子を少くとも欠いて、アデノウイルスの複製に必須のトランス活 性化タンパク質についてコードする、アデノウイルスの完全ゲノムからなること が好ましい。このため、それはＥ１Ａ遺伝子の発現産物をトランス（trans）で 供給する相補細胞系で増殖される。アデノウイルスゲノムの他の領域、特に非必 須Ｅ３領域と、一方で欠けた機能がトランスで補われるかぎりウイルス複製に必 須の他の領域も修正または欠失させてよいことは自明である。それにもかかわら ず、このようなベクターはキャプシドに必須の配列、即ち５′および３′ＩＴＲ （逆方向末端反復）とキャプシド領域を含んでいる。様々なアデノウイルスベク ターとそれらの製造技術は慣用的であり、GrahamおよびPrevect（Methods in Mo lecular Biology,vol.7,p.109-128; Ed: E.J.Murey,The human Press Inc．）に 示されている。 特に好ましい態様によれば、本発明の目的に有用なウイルスベクターはポック スウイルス、特にワクシニアウイルスまたはトリポックスウイルス、例えばカナ リヤポックスウイルスに由来する。後者が好ましい。 異種遺伝子を発現できるワクシニアウイルスを得るための一般的条件は、欧州 特許ＥＰ８３，２８６および出願ＥＰ２０６，９２０に記載されている。有利な 態様によれば、上記ＤＮＡ断片はウイルス遺伝子を不活化して組換えワクシニア ウイルスの選択を容易にするためにワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子中に挿入さ れる。 本発明が向けられている目的によれば、ウイルスベクターは組換えウイルスの 単離および精製の工程を容易にするために選択マーカー遺伝子の発現用のブロッ クを更に含むことができる。特に抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与するＮｅ ｏ遺伝子、あるいはガンシクロビアまたはアシクロビアのようなあるヌクレオシ ドアナログに対する感受性を付与する１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ‐１） ＴＫ遺伝子が挙げられる。 このようなウイルスベクターは、免疫および／または炎症反応における望まし い調節効果と協力して作用できる、上記以外の遺伝子も含んでいてよい。当該遺 伝子は腫瘍特異性抗原の全部または一部についてコードするものであることが有 利である。更に詳しくは、子宮のがんに関与するＨＰＶウイルス、特にタイプ１ ６または１８のＥ６およびＥ７タンパク質、ＭＵＣ１タンパク質、更に詳しくは 乳癌に関与する後者の反復領域と、最後に結腸直腸がんに関与するＧＡ．７３３ ．２抗原が挙げられる。その抗原についてコードする配列は先行技術で記載され ている。例えば相補的プライマーを用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）技術で それらを単離すること、それらを選択されたウイルスベクター中に調節遺伝子の 上流または下流で挿入すること、しかもそれらの発現にとり必要な要素のコント ロール下にそれらを置くことは、当業者の能力内に属する。 本発明の目的にとり、以下調節物質と称される、免疫および／または炎症応答 を調節する物質の全部または一部についてコードする１以上の遺伝子を含んだＤ ＮＡ断片が、上記遺伝子の移入および発現用のビヒクルであるウイルスベクター 中に導入される。ＤＮＡ断片をウイルスベクター中に挿入する方法は当業者に公 知である。 更に、調節物質についてコードする遺伝子には、ゲノムタイプ（天然遺伝子の イントロン群の全部または一部を含んでいる）、イントロンを欠く相補的ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）タイプ、またはミニ遺伝子タイプ、即ち少くとも１つのイントロン を含む混合タイプがある。それは哺乳動物でみられるような天然調節物質、この ような物質の一部、多様な起源の配列の融合から生じるキメラ分子、あるいは改 善または修正された生物学的性質を示す変異体についてコードすることができる が、しかしながらこれらの分子は炎症応答で免疫調節機能または調節機能を発揮 できねばならない。このような変異体は、上記調節物質についてコードする遺伝 子の１以上のヌクレオチドの変異、欠失、置換および／または付加により得られ る。当該遺伝子は（ｉ）細胞内にあるかまたは外部媒体中に分泌される可溶性分 子、あるいは（ii）膜に固定され、このためそれを発現する細胞の表面に存在す る分子についてコードすることができる。 調節物質についてコードする遺伝子は、一般的に行われている慣用的技術に従 い、クローニング、ＰＣＲまたは化学合成により得られる。 勿論、ＤＮＡ断片は転写の調節に適した要素と、調節物質についてコードする 遺伝子の発現を行う翻訳開始および終結シグナルを含むことができる。これらの 要素の中では、プロモーター領域が特に重要であると思われる。 一般的に言えば、治療が望まれる哺乳動物の細胞、好ましくはヒト細胞で機能 するプロモーター領域を用いる。それには、上記遺伝子の発現を天然で支配する プロモーター領域、あるいは真核またはウイルス遺伝子に由来する異なる起源の プロモーター領域がある。更に、プロモーター領域は調節配列、例えば転写活性 化要素（エンハンサー）またはある細胞シグナルに応答する配列を含むように修 正してもよい。 選択されたプロモーター領域は構成的でもまたは調節的であってもよく、後者 の場合にはある組織特異性または事象特異性細胞シグナルに応答して調節的であ る。治療される腫瘍が特定の細胞タイプに由来するときには、組織特異性プロモ ーター領域を用いることが有利である。一方、（例えば、腫瘍細胞により通常放 出される増殖因子の存在により調節しうる）特定の腫瘍シグナルに応答するプロ モーターの使用が有利とわかっているが、その理由はその発現が腫瘍細胞に限定 されるからである。 このようなプロモーターは通常当業者に公知である。特に、ＳＶ４０（シミア ンウイルス４０）、ＨＭＧ（ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ）およびＴＫ （チミジンキナーゼ）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）およびＭｏ ‐ＭＬＶ（モロニーネズミ白血病ウイルス）ＬＴＲ（Long terminal repeats） 、アデノウイルスＭＬＰ（主要後期プロモーター）、ワクシニアウイルス７．５ ＫおよびＨ５Ｒプロモーター、α₁‐抗トリプシン、アルブミン、凝固因子ＩＸ およびトランスフェリン遺伝子の肝臓特異性プロモーターと、リンパ球で支配す る 遺伝子の発現を行う免疫グロブリン遺伝子のプロモーターが挙げられる。これら の例に限定されない。 本発明の関係において、ＤＮＡ断片は調節物質についてコードする１以上の遺 伝子を含むことができ、これは独立してまたは一緒になってそれらの発現を行え る要素のコントロール下に置いてもよい。言い換えれば、ＤＮＡ断片は調節物質 についてコードする１以上の遺伝子の発現用のカセットを１以上含んでいてもよ い。 更に、ＤＮＡ断片は細胞から当該調節物質の分泌を行わせるシグナル配列を含 んでいてもよい。それには上記調節物質についてコードする遺伝子の天然シグナ ル配列、または真核細胞で機能する異種シグナル配列、例えばトランスフェリン またはα₁‐抗トリプシンについてコードする遺伝子のシグナル配列がある。 免疫および／または炎症応答を調節する物質とは、特に ‐主要特異性抗原に対する抗体の産生を増幅するようにＢリンパ球を活性化す ることで体液性免疫応答を刺激する； ‐腫瘍細胞に対する有意の細胞毒性または遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を誘発 するようにＴリンパ球を活性化することによって細胞性免疫応答を刺激する； ‐免疫系の細胞を腫瘍部位に運ぶように炎症応答を誘導または刺激する； または ‐現実の腫瘍部位または腫瘍部位近くに免疫系の細胞を留めておくように細胞 遊走現象を阻止する ことができる分子を意味すると理解されている。 上記機能を少くとも示す分子は、特に（Ｉ）サイトカイン、（II）細胞表面共 刺激分子、(III)ケモカイン、（IV）リンパ球表面マーカーに対するモノクロー ナル抗体、（Ｖ）感染性生物（細菌、ウイルスまたは寄生虫）に特徴的なスーパ ー抗原、および（VI）アジュバント機能を有するポリペプチドから選択される。 （Ｉ） 本発明の目的に有利なサイトカインは、免疫系の細胞、特にリンパ球およびマ クロファージ、あるいはそれらの前駆幹細胞（progenitor stem cells）により 産生されて、免疫系の細胞の活性化、免疫系の細胞間のシグナルの輸送と、幹細 胞から血流の成熟細胞への細胞分化に関与するものである。 本発明の目的に有用なサイトカインに関しては、特に以下のものが挙げられる ： （１）インターロイキン（ＩＬ）。現在、１６種のインターロイキンが明らか にされている。それらは多面的効果を発揮することから、それらに特定の機能を 割り当てることは特に困難である。本発明の関係では、すべてのインターロイキ ンに関心があるが、以下が更に具体的に挙げられる： ‐細菌成分による刺激後にマクロファージから産生されるＩＬ‐１。その役割 はリンパ球活性化のレベルで発揮される。ＩＬ‐１は前炎症分子でもあり、それ 自体ケモカイン産生を誘導する。 ‐活性化Ｔリンパ球の増殖に関与し、ＩＦＮ‐γと共同してＢリンパ球による 抗体産生を刺激するＩＬ‐２。更に、一部の研究では、それが腫瘍で産生される とリンパ球の化学走性役割を有することを示す傾向がある。 ‐活性化Ｔリンパ球により産生され、Ｂリンパ球と一部の場合にはＴリンパ球 の増殖を刺激するＩＬ‐４ ‐好酸性白血球の増殖および分化と、小さな程度で抗体産生を促進するＩＬ‐ ５ ‐マクロファージおよびＴリンパ球により産生されるＩＬ‐６。それは多面的 効果を有し、特にＴリンパ球の細胞毒性活性と抗体産生の刺激剤として関与する 。それは前炎症分子でもある。 ‐骨髄の間質の細胞により産生され、前ＢおよびＴリンパ球の増殖に関与する ＩＬ‐７ ‐活性化マクロファージにより産生され、ＩＦＮ‐γ産生を誘導するＩＬ‐１ ２ （２）抗ウイルスおよび免疫調節性質を有するインターフェロン（ＩＦＮ）。 それらは食細胞を活性化し、ＭＨＣクラスＩおよびII表面抗原の発現を高め、し かも腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性を刺激することができる。３つの主要 クラスのＩＦＮがあり、各々が本発明の関係で関心あるものである。これらの異 なるクラスα、βおよびγは各々多くのサブタイプを含んでいる。 （３）造血幹細胞の成熟と、血流の成熟細胞へのそれらの分化に関与するコロ ニー刺激因子ＣＳＦ。ＧＭ‐ＣＳＦ、Ｇ‐ＣＳＦおよびＭ‐ＣＳＦ（各々顆粒球 ‐マクロファージ、顆粒球およびマクロファージに関する）はこれらの因子がそ れらの影響を及ぼす細胞タイプと成熟段階に応じて区別される。 （４）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）。マクロファージにより産生されるＴＮＦαと Ｔリンパ球により産生されるＴＮＦβに区別される。双方ともマクロファージお よびリンパ球の抗腫瘍細胞毒性活性と、炎症反応で観察される局所的組織変化に 関与している。 （５）マクロファージ遊走を阻止するＭＩＦ因子 （６）マクロファージの化学走性因子である補体断片Ｃ５ａ 本発明の目的にとり、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、 ＩＮＦ‐γ、ＧＭ‐ＣＳＦおよびＴＮＦβが最も特に好ましい。 （II） 共刺激分子とは、免疫および／または炎症反応に間接的に関与する、細胞表面 に存在する分子；例えば、免疫系の細胞により認識されうる形をした抗原の提示 プロセスに関与する分子である。 本発明の目的に有用である共刺激分子に関して、以下のものが特に挙げられる ： （１）主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の抗原。ヒトでは、ほとんどの 有核細胞がそれらの表面で可変量のクラスＩ抗原を発現し、一方クラスII抗原は Ｂリンパ球、食細胞および活性化Ｔリンパ球に限定された分布を有している。こ れらの細胞表面マーカーは、特にＴリンパ球とＡＰＣ細胞とのおよびＴｃリンパ 球と表面で非自己抗原を提示する標的細胞との相互作用について前記されたよう な免疫認識の現象に関与する。このためこれは、腫瘍部位でＭＨＣ抗原の発現を 増加させることによって免疫応答の強度が改善されることを示唆している。 （２）ヒトマーカーＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０およびＣＤ４０に関するリ ガンド。特に、マーカーＣＤ４０のリガンドは活性化Ｔリンパ球の表面に位置し 、Ｂリンパ球の刺激および増殖に関与している。他方、インビトロ研究ではマー カーＣＤ２７およびＣＤ３０のリガンドがＴリンパ球の増殖を誘導することを示 した。一部の著者によりタンパク質Ｂ７と称されているマーカーＣＤ２８のリガ ンドに関して、これはＡＰＣにより合成され、ＮＫ細胞により表面で非自己抗原 を提示する標的細胞の認識に関与し、それによってそれらの破壊を行う。 （３）リンパ球機能抗原タイプ１ ＬＦＡ‐１（白血球機能抗原）。これはす べての白血球に共通してマクロファージ上にも存在する表面レセプターであり、 非特異性細胞付着現象で重要な部分を果たす。後者は炎症部位への免疫系の細胞 の遊走に関与することで化学走性プロセスに関係している。 （４）多くの細胞タイプの表面に存在する細胞間付着分子タイプ１（ＩＣＡＭ ‐１）。ＩＣＡＭ‐１はＬＦＡ‐１分子に関するリガンドの１つである。 (III) 上記のように、ケモカインは炎症部位付近または炎症部位で合成されて、免疫 系の細胞をこの部位に運ぶ分子である。一般的に言えば、ケモカインは一方で白 血球の表面に存在する付着分子と、他方で内皮細胞の表面に存在する付着分子と の相互作用を介して作用する（例えばＬＦＡ‐１およびＩＣＡＭ‐１）。管壁の 内皮細胞への白血球の付着に続いて、炎症部位にそれらが遊走する。 本発明の目的に有用であるケモカインに関して、以下のものが特に挙げられる ： （１）ＰＦ‐４（血小板因子‐４；Denel et al.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.U SA,74,2256） （２）ＲＡＮＴＥＳ（様々なタイプの白血球に関する化学走性因子）（Schall el al.,1988,J.Immunol.,141,1018）、および （３）ＡＣＴ‐２（Ziptel et al,,1989,J.Immunol.,142,1587）。これはＭＨ ＣクラスＩ分子と関連した抗原の認識に関与するＴリンパ球の付着を促進するタ ンパク質である。 （IV） 本発明の目的に有用であるモノクローナル抗体は、例えば細胞表面マーカーＣ Ｄ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＣＤ４０に対するものである。事実、一部の研究 ではＴリンパ球増殖の刺激に関してこのような抗体の役割を示した。 （Ｖ） 本発明の目的に有用であるスーパー抗原は、例えば狂犬病ウイルス核タンパク 質、あるいは特にStaphylococcus属の細菌により産生される細菌エンテロトキシ ンである。 （VI） 本発明の目的に有用であるポリペプチド性質のアジュバントは、例えば２０Ｓ “層”細菌遺伝子の発現産物である。 本発明から生じる医薬品は哺乳動物、最も具体的にはヒトでがんの治療用とし て考えられている。こうして治療されるがんは、乳、肺および結腸がんのような 固形腫瘍であることが有利である。このような医薬品は、更に具体的には、多く のタイプのがんでよく出会う合併症であって、しかも満足できる療法が現在存在 しない二次腫瘍を治療することを可能にすることが注目される。 本発明から生じる医薬品は、常用されるいずれか一般的な経路、特に全身的、 筋肉内、皮下または腹腔内のような非経口で投与される。一般的に言えば、静脈 内投与が特に有利であると思われる。一方、アクセスしうる腫瘍の場合には、医 薬品は腫瘍部位への直接注射または局所適用により投与してもよい。一般的に言 えば、投与は１回分の用量で、反復した用量で、またはある時間間隔後に何回も 行う。 本発明の好ましい態様によれば、医薬品は治療活性量の前記ウイルスベクター 以外にも、薬学的観点から許容されるキャリアを含む。それは薬学的観点から許 容されるビヒクル、希釈剤またはアジュバントを含んでいてもよく、液体または 凍結乾燥形で供給される。 適切な投与量は、異なるパラメーター、例えば投与経路、治療される個体、腫 瘍状態の性質および重篤度、用いられるウイルスベクターのタイプ、あるいは調 節物質についてコードする遺伝子に応じて変わる。適切な投与量を評価できる基 準の１つは、調節物質の血清活性の測定である。これらの活性試験は標準試験で ある。特に、ＩＬ‐２生物活性試験が挙げられる（Gillis et al,1978,J.Immuno l.,120,2027-2032）。しかしながら、一般的に、キロ当たりのウイルスベクター の用量は１０⁴〜１０¹¹、有利には１０⁷〜１０¹⁰、好ましくは１０⁷〜１０⁹プラ ーク形成単位（ｐｆｕ）／キロである。 最後に、本発明の主題は： （ｉ）発現に必要な要素の制御下に置かれた、がん細胞の破壊に関与する少く とも１つの物質（agent）、例えば免疫および／または炎症応答を調節する物質 、ついてコードする１以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片がゲノム中に挿入され、特 に前記物質が特異的にがん腫瘍に送達される、がん細胞に正の親和性を示すウイ ルスベクターの使用、 （ii）治療の必要な個体が、がん細胞の破壊に関与する少くとも１つの物質、 例えば免疫および／または炎症応答を調節する物質、についてコードする１以上 の遺伝子を含むＤＮＡ断片がゲノム中に挿入されたウイルスベクターの、薬学的 観点から有効な量で注射されることからなる、哺乳動物におけるがん治療方法、 および (iii) 物質の全部または一部についてコードする１以上の遺伝子を含むＤＮＡ 断片がゲノム中に挿入されたウイルスベクターが全身投与されることからなる、 がん細胞の破壊に関与する物質、例えば免疫および／または炎症応答を調節する 物質、を特異的に送達するための方法 である。 本発明は下記例で説明されるが、それらに制限されない。 例例１ ：サイトカインについてコードする遺伝子をもつ組換えワクシニアウイルス の作製 下記の作製はManiatisら（1989，Laboratory Manual，Cold Spring Harbor La boratory Press,Cold Spring Harbor,NY）で詳述された遺伝子工学および分子ク ローニングの一般的技術に従い行う。細菌プラスミドを用いるクローニング工程 のすべては宿主株としてEscherichia coli（E.coli）株５ＫまたはＸＬ１‐Blue （Stratagene）を用いて行い、一方ファージＭ１３に由来するベクターを用いる 場合はE.coli NM522で行う。 合成オリゴデオキシヌクレオチドによる部位特定変異誘発では、Zollerおよび Smith(1982,Nucleic Acids Res.,10,6487)により記載されたプロトコールを適用 し、市販元のキットを製造業者の推奨に従い用いる。 ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６およびＩＬ‐７についてコード する遺伝子を含んだＤＮＡ断片を、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターの 下流におけるトランスファーベクター中へそれらを挿入する目的で適切な制限部 位を導入するように、部位特定変異誘発工程に付す。２つのトランスファーベク ター、即ちｐＴＧ１８６‐ポリ（特許出願ＥＰ２０６，９２０で記載されている ）およびｐＴＧ１９４を用いる。後者はポリリンカーの向きの点でｐＴＧ１８６ ‐ポリと異なる。 更に詳しくは： Goughら(1984,Nature,309,763)で記載されたようなネズミＧＭ‐ＣＳＦについ てコードするｃＤＮＡをもつ断片を、翻訳開始ＡＴＧに対して−１７位にＢａｍ ＨＩ部位を作るように、Ｍ１３ＴＧ１３０（Kieny et al.,1983,Gene,26,91）中 へのクローニング後に部位特定変異誘発に付す。それによるベクターから単離さ れたＢａｍＨＩ‐ＳａｌＩ断片はｐＴＧ１９４の同部位間に挿入する。 Leeら(1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,2061)に記載されたようなネズミＩＬ ‐４についてコードするｃＤＮＡをもつＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ断片をベクター Ｍ１３ＴＧ１３０中に導入し、翻訳開始ＡＴＧのすぐ上流でＢｇｌII部位を作る ように部位特定変異誘発に付す。こうして処理されたベクターをＥｃｏＲＩおよ びＢｇｌIIで切断し、相当する断片をｐＴＧ１９４と同様の部位間に導入する。 Kinashiら(1986,Nature,324,70)で記載されたようなネズミＩＬ‐５について コードするｃＤＮＡをもつＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ断片を最初にベクターＭ１３ ＴＧ１３０中にサブクローニングし、その後翻訳開始ＡＴＧに対して−１０位に ＰｓｔＩ部位および−３位にＡを導入するように部位特定変異誘発に付す。こう して処理されたベクターをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断し、相当する断片を ｐＴＧ１８６‐ポリと同様の部位間に挿入する。 Van Snickら(1988,Eur.J.Immunol.,18,193)で記載されたようなネズミＩＬ‐ ６についてコードするｃＤＮＡをもつＥｃｏＲＩ断片をベクターＭ１３ＴＧ１３ １（Kienyら、前掲）中にサブクローニングし、翻訳開始ＡＴＧに対して−９位 にＢａｍＨＩ部位および−３位にＡを導入するように部位特定変異誘発に付す。 こうして処理されたベクターをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、相当する 断片をｐＴＧ１９４のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位間に挿入する。 Namanら(1988,Nature,333,571)で記載されたようなネズミＩＬ‐７についてコ ードするｃＤＮＡをもつＳｓｔＩ‐ＨｉｎｄIII断片をベクターＭ１３ＴＧ１３ ０中にサブクローニングし、翻訳開始ＡＴＧに対して−１１位にＥｃｏＲＶ部位 および−３位にＡを作るように部位特定変異誘発に付す。ＥｃｏＲＶ‐ＰｓｔＩ 断片をこうして得られたベクターから単離し、ｐＴＧ１９４のＳｍａＩおよびＰ ｓｔＩ部位間にクローニングする。 上記で得られたトランスファーベクターを用いて、対応ワクシニアウイルスを Kienyら(1984,Nature,312,163)で記載されたような相同的組換え方法に従い作製 する。こうして得られた組換えウイルスはＶＶ‐ＧＭ‐ＣＳＦ、ＶＶ‐ＩＬ‐４ などと命名する。 他の組換えワクシニアウイルス、特に（ｉ）ヒトＩＬ‐２（特許出願ＥＰ２０ ６，９３９）、（ii）ヒトＩＬ‐６（Nakagawa et al.,1991,Eur.Cytokine Net. ,2,11-16）および(iii) ヒトＩＦＮ‐γ（特許出願ＥＰ２０６，９２０）につい てコードするｃＤＮＡを含んだものは、既に記載されている。例２ ：ＩＬ‐６についてコードする遺伝子を含むワクシニアウイルス （ＶＶ‐ＩＬ‐６）による腫瘍担持ヌードSwissマウスの処置 １．腫瘍担持ヌードSwissマウスの作製 ヒト結腸直腸腫瘍に由来する細胞系ＳＷ９４８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２３７） を供給業者の推奨に従い連続式に培養する。収集された細胞をトリプシン、その 後デオキシリボヌクレアーゼ（１０μg/ml）で５分間処理する。次いでそれらを ＰＢＳ（Dulbeccoリン酸緩衝液；Sigma,Ｄ５６５２）で洗浄し、１０⁷細胞／１ ００μlの濃度でこの同緩衝液に再懸濁する。 ６〜８週齢雌性ヌードSwissマウス（Iffa Credo,France）に各々こうして得ら れた細胞懸濁液１００μlを皮下投与する。７日後、触知しうる腫瘍をもつマ ウスを選択する。 ２．試験 これらのマウスを約８匹の群に分ける。２群は参照群として使うことを目的と する：マウスにトランスファーベクターｐＴＧ１８６‐ポリから生じたＴＫ￣非 組換えワクシニアウイルス（ＶＶ‐１８６）１０⁷または１０⁸ｐｆｕを投与する 。第三群のマウス（陰性コントロール群）にはＰＢＳ１００μlだけを投与する 。最後に、他の２群のマウスには例１で得られたＶＶ‐（ネズミＩＬ‐６）１０⁷ または１０⁸ｐｆｕを投与する。 ウイルスをＰＢＳ溶液に入れて尾において静脈内投与する。 注射から７日後に、下記のように血液、器官および腫瘍のウイルス含有率につ いて分析するために、マウス３匹を各群から取出して屠殺する。 腫瘍および異なる器官（肝臓、脾臓、脳など）は摘出してトリプシンで処理し 、懸濁物が得られるまで機械的に撹拌する。血液サンプルを２０ｍＭ ＥＤＴＡ を含む等容量のＰＢＳ緩衝液で希釈する。 こうして得られた細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０％の牛胎児血清を含むDulb ecco ＭＥＭ培地（修正イーグル培地；Gibco BRL）に再懸濁する。細胞（生存 および非生存）の数を常法に従い計測することで調べる。次いで１０倍連続希釈 をＰＢＳ緩衝液で行う。各希釈液１μl、１０μlまたは１００μlを直径３ｃｍ のペトリ皿(Falcon 3001)で確立されたＢＨＫ細胞の培養物に加える。皿を５％ ＣＯ₂中３７℃で一夜インキュベートし、溶解プラークを翌日計数する。 屠殺されたマウスについて、腫瘍の増殖過程はスライディングキャリパーを用 いて腫瘍の長さ、幅および深さを測定することにより経時的に記録する。各腫瘍 の容量は楕円体４／３πｒ₁ｒ₂ｒ₃に関する式を適用することにより計算するが 、ここでｒ₁、ｒ₂およびｒ₃は各々半分に減少させた長さ、幅および深さを表す 。 ３．結果 注入されたウイルスのタイプにかかわりなく、腫瘍細胞の感染のレベルは健常 組織の場合よりもかなり大きいことがわかった。 ＶＶ‐ＩＬ‐６を投与したマウスの腫瘍の増殖は、用量にかかわりなく、コン トロール群および陰性参照の場合よりも少ない。一部のマウスはＶＶ‐ＩＬ‐６ の投与後約１５日間で腫瘍の完全退縮を示す。例３ ：ＩＬ‐２についてコードする遺伝子を含むワクシニアウイルス （ＶＶ‐ＩＬ‐２）による腫瘍担持ＤＢＡ／２マウスの処置 例２を： （ｉ）特許出願ＥＰ２０６，９３９で記載されたような、ヒトＩＬ‐２につい てコードする遺伝子を含んだワクシニアウイルス （ii）ＤＢＡ／２マウス肥満細胞腫に由来するネズミ細胞系Ｐ８１５（ＡＴＣ Ｃ ＴＩＢ ６４）、および (iii) ６〜８週齢雌性ＤＢＡ／２マウス（Iffa Credo,France） を用いて繰返す。 変更点は次のとおりである：１００μlの容量中１０⁵Ｐ８１５細胞をＤＢＡ／ ２マウスに注射する。１０⁸ｐｆｕのウイルスを各群のマウスに注射する。生物 学的分析に使うためのマウスは注射後３日目に各群から取出す。 例２で報告された場合に匹敵する結果が観察された。例４ ：ＧＭ‐ＣＳＦについてコードする遺伝子を含むワクシニアウイルス （ＶＶ‐ＧＭ‐ＣＳＦ）による腫瘍担持ＤＢＡ／２マウスの処置 例３を１０⁸ｐｆｕのＶＶ‐ＧＭ‐ＣＳＦを用いて繰返す。腫瘍の増殖の過程 は例１で記載されたように経時的に記録する。前記のように、コントロール群お よび陰性参照と比較した腫瘍の増殖の遅延化が試験群の一部動物で観察される。 １０匹中３匹のマウスがウイルスベクターの投与後１５日間で腫瘍の完全退縮を 示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/00 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ 39/39 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 39/395 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ 37/66

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 哺乳動物におけるがん治療用医薬品の製造に関する、細胞表面共刺激分 子、ケモカイン、リンパ球表面マーカーに対するモノクローナル抗体、感染性生 物（細菌、ウイルスまたは寄生虫）に特徴的なスーパー抗原、およびアジュバン ト機能を有するポリペプチドから選択される、免疫および／または炎症応答を調 節する物質の全部または一部についてコードする１以上の遺伝子を含んだＤＮＡ 断片がゲノム中に挿入されたウイルスベクターの使用。 ２． 医薬品が非経口投与、特に静脈内または筋肉内投与用である、請求項１ に記載のウイルスベクターの使用。 ３． 細胞表面共刺激分子が主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラス ＩおよびII抗原、マーカーＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０およびＣＤ４０に関す るリガンド、リンパ球機能抗原タイプ１（ＬＦＡ‐１）と、細胞間付着分子タイ プ１（ＩＣＡＭ‐１）から選択される、請求項１または２に記載のウイルスベク ターの使用。 ４． ケモカインがＰＦ‐４（血小板因子‐４）、ＲＡＮＴＥＳおよびＡＣＴ ‐２から選択される、請求項１または２に記載のウイルスベクターの使用。 ５． モノクローナル抗体が抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ４ ０モノクローナル抗体から選択される、請求項１または２に記載のウイルスベク ターの使用。 ６． 哺乳動物におけるがん治療用医薬品の製造に関する、少くとも１つのサ イトカインについてコードする１以上の遺伝子を含んだＤＮＡ断片がゲノム中に 挿入され、上記医薬品が非経口投与、特に静脈内または筋肉内投与用である、ウ イルスベクターの使用。 ７． サイトカインがインターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因 子（ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ ）および補体断片Ｃ５ａから選択される、請求項６に記載のウイルスベクターの 使用。 ８． サイトカインがインターロイキン‐２、‐４、‐５、‐６および‐７、 ガンマインターフェロン、顆粒球‐マクロファージタイプコロニー剌激因子（Ｇ Ｍ‐ＣＳＦ）並びに腫瘍壊死因子タイプβ（ＴＮＦβ）から選択される、請求項 ７に記載のウイルスベクターの使用。 ９． ヒトにおけるがん治療用医薬品の製造に関する、請求項１〜８のいずれ か一項に記載のウイルスベクターの使用。 １０． 哺乳動物における固形がん腫瘍の治療用医薬品の製造に関する、請求 項１〜９のいずれか一項に記載のウイルスベクターの使用。 １１． ウイルスベクターがポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイ ルスおよびヘルペスウイルスから選択されるウイルスに由来する、請求項１〜１ ０のいずれか一項に記載のウイルスベクターの使用。 １２． ウイルスベクターが非組込み性ベクターである、請求項１〜１１のい ずれか一項に記載のウイルスベクターの使用。 １３． ウイルスベクターが非複製性ベクターである、請求項１〜１２のいず れか一項に記載のウイルスベクターの使用。 １４． ウイルスベクターがポックスウイルスに由来する、請求項１１に記載 のウイルスベクターの使用。 １５． ウイルスベクターがトリポックスウイルスに由来する、請求項１４に 記載のウイルスベクターの使用。 １６． ウイルスベクターがワクシニアウイルスに由来する、請求項１４に記 載のウイルスベクターの使用。 １７． ウイルスベクターが腫瘍特異性抗原についてコードする遺伝子を更に 含んでなるものである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のウイルスベクタ ーの使用。 １８． 発現に必要な要素の制御下に置かれた、がん細胞の破壊に関与する少 くとも１つの物質についてコードする１以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片がゲノム 中に挿入され、前記物質が特異的にがん腫瘍に送達される、がん細胞に正の親和 性を示すウイルスベクターの使用。 １９． 発現に必要な要素の制御下に置かれた、免疫および／または炎症応答 を調節する物質についてコードする１以上の遺伝子を含むＤＮＡ断片がゲノム中 に挿入され、免疫および／または炎症応答を調節する前記物質ががん腫瘍に特異 的に送達される、請求項１８に記載のウイルスベクターの使用。 ２０． ウイルスベクターがポックスウイルスに由来する、請求項１８または １９に記載のウイルスベクターの使用。