JP2023548382A - 異種免疫細胞に対する化学走性を誘導する形質転換された免疫細胞 - Google Patents
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Abstract
本発明は、IL-7(interleukin-7)、CCL19(C-C Motif Chemokine Ligand 19)、またはこれらの組み合わせを発現する免疫細胞およびこれを有効成分として含む癌または感染性疾患の予防または治療用組成物に関する。本発明は、T細胞以外の免疫細胞、具体的には、ナチュラルキラー細胞の治療的有効量のみを注入することにより、患者の内因性T細胞と注入されたナチュラルキラー細胞との相互補完的免疫反応によって多角的かつ相乗的な治療効果を収めることができる。これとともに、本発明は、T細胞とT細胞以外の免疫細胞、具体的には、ナチュラルキラー細胞を併用投与する場合にも、これらの異なる細胞群を病変部位により集中的に作用させることにより、著しく改善された治療効果を収めることができる。【選択図】図1
Description
本発明は、免疫細胞、具体的には、T細胞が病変部位に移動するように特定の化学走性因子を発現するT細胞以外の免疫細胞、具体的には、ナチュラルキラー細胞に関する。
癌は、基本的に組織の成長調節異常に関連する疾患であり、癌細胞は、正常細胞に比べて過度に成長・増殖し、隣接組織に侵入したり遠距離組織に転移される特性を有する。抗癌治療は癌組織を物理的に除去したり、放射線照射および抗癌剤の投与により癌遺伝子(oncogene)、テロメラーゼ(telomerase)、成長因子受容体(growth factor receptor)、シグナル伝達分子などのように癌細胞の生存に必要な遺伝子の発現を阻害させたり、細胞死滅を誘導する方式で行われる。しかし、このような治療過程で癌細胞だけでなく正常細胞も損傷を受けるので、腫瘍組織を特異的に除去するために免疫抗癌治療方法が注目されている。特に、ここ数十年間、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、T細胞などの免疫細胞を用いて患者の体内免疫反応を活性化させて腫瘍組織を除去しようとする免疫細胞抗癌治療法が活発に研究されている。
ナチュラルキラー細胞(Natural Killer cell)は、末梢血リンパ球(peripheral blood lymphocyte)の約15%程度を占めるリンパ球系細胞であって、先天性免疫反応に重要な役割をし、具体的には、樹状細胞を活性化させ、細胞毒性Tリンパ球(CTL)を腫瘍に特異的に反応するように誘導して腫瘍細胞を除去する。ナチュラルキラー細胞は、肉腫(sarcoma)、骨髄腫(myeloma)、リンパ腫(lymphomas)および白血病(leukemia)のような悪性腫瘍を直接的に死滅させ、体外で活性化されたNK細胞を白血病などの血液癌患者を対象に同種骨髄移植後に投与することにより、その治療効果が確認されたりもした(Blood Cells Molecules&Disease,33:p261-266,2004)。しかし、正常人の体内で大部分のナチュラルキラー細胞は不活性化状態で存在するので、その治療効率を高めるために血液から分離されたNK細胞を体外で活性化させる研究が活発に進められている。
一方、免疫細胞のもう1つの軸をなすT細胞は、骨髄で生成されて胸腺(thymus)で成熟するリンパ球であって、免疫体系において記憶能力を有し、B細胞に情報を提供して抗体の生成を誘導する。T細胞は、胸腺で免疫寛容テストを経た後、細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell)、ヘルパーT細胞(helper T cell)、制御性T細胞(regulatory T cell)およびメモリーT細胞(memory T cell)の4つの細胞に分化されるが、このうち、CD8+T細胞である細胞毒性T細胞は、I型MHCと結合して癌細胞または感染細胞を識別し、主にナチュラルキラー細胞と同様に病変細胞を目標とする。
このようにナチュラルキラー細胞と細胞毒性T細胞を併用投与する場合、治療効果が極大化できるが、それぞれ治療的有効量を満足する2つの細胞を注入しなければならないという非効率性を克服できる新たな細胞治療剤の開発が要求されている。
本明細書全体にわたって多数の論文および特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文および特許文献の開示内容は全体として本明細書に参照により組み込まれ、本発明の属する技術分野のレベルおよび本発明の内容がより明確に説明される。
本発明者らは、異種免疫細胞間の組み合わせによる複合的免疫反応によってより効率的に病変細胞または組織を除去できる優れた細胞治療剤を開発するために、鋭意研究努力した。その結果、IL-7、CCL19、またはこれらの組み合わせを発現する免疫細胞、具体的には、T細胞以外の免疫細胞、最も具体的には、ナチュラルキラー細胞を対象体に注入する場合、前記IL-7およびCCL19によって増殖およびホーミング(homing)された内因性T細胞と注入されたナチュラルキラー細胞が病変部位に同時に作用することにより、多角的かつ相乗的な免疫反応が誘導されることを見出し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、IL-7、CCL19、またはこれらの組み合わせを発現する免疫細胞およびこれを有効成分として含む癌または感染性疾患の予防または治療用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、IL-7、CCL19、またはこれらの組み合わせをエンコードする核酸分子を有効成分として含む異種免疫細胞の増殖またはホーミング(homing)誘導用組成物を提供することである。
本発明の他の目的および利点は下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲および図面によってより明確になる。
本発明の一態様によれば、本発明は、IL-7(interleukin-7)またはその機能的一部をエンコードする核酸分子;CCL19(C-C Motif Chemokine Ligand 19)またはその機能的一部をエンコードする核酸分子;またはこれらの組み合わせを発現する免疫細胞を提供する。
本発明者らは、異種免疫細胞の組み合わせによる複合的免疫反応によってより効率的に病変細胞または組織を除去できる優れた細胞治療剤を開発するために、鋭意研究努力した。その結果、IL-7、CCL19、またはこれらの組み合わせを発現する免疫細胞、具体的には、T細胞以外の免疫細胞、最も具体的には、ナチュラルキラー細胞を対象体に注入する場合、前記IL-7およびCCL19によって増殖およびホーミング(homing)された内因性T細胞と注入されたナチュラルキラー細胞が病変部位に同時に作用することにより、多角的かつ相乗的な免疫反応が誘導できることを見出した。
本明細書において、用語「免疫細胞」は、免疫反応の開始または促進過程に関与するすべての細胞を意味し、より具体的には、免疫エフェクター細胞(immune effector cell)を意味する。免疫細胞は、例えば、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、肥満細胞(mast cell)および樹状細胞を含むが、これらに限定されるものではない。より具体的には、前記免疫細胞は、T細胞以外の免疫細胞であり、最も具体的には、ナチュラルキラー細胞である。
本明細書において、用語「T細胞」は、当業界にて理解される意味と同一の範囲の細胞群であって、具体的には、ターゲット細胞を直接溶解させたり、またはターゲット細胞の死滅を誘発するエフェクター機能(effector function)またはヘルパー機能(helper function)を提供するCD8+またはCD4+T細胞を含むが、これに限定されず、本発明の属する技術分野にて「T細胞」に分類されるいかなる細胞も含まれる。
本明細書において、用語「機能的一部」は、全長タンパク質において一部のアミノ酸残基が削除された切片であって、その本来の生物学的活性および機能を維持する全長タンパク質の類似体を意味する。
本明細書において、用語「核酸分子」は、DNA(gDNAおよびcDNA)とRNA分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子における基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体(analogue)も含む(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980);UhlmanおよびPeyman,Chemical Reviews,90:543-584(1990))。
本発明の核酸分子は、添付した配列リスト上のヌクレオチド配列に限定されないことは当業者に自明である。ヌクレオチドにおける変異は、コドンの縮退性または生物学的に均等なアミノ酸をコードする異なるコドンの存在によってタンパク質構造の変化につながらないことがある。このような生物学的均等活性を有する変異を考慮すれば、本発明で用いられる核酸分子は、配列リストに記載の配列と実質的な同一性(substantial identity)を示す配列も含むものと解釈される。上記の実質的な同一性は、上記の本発明の配列と任意の他の配列を最大限に対応するように整列し、当業界にて通常用いられるアルゴリズムを利用して整列された配列を分析した時、最小80%の相同性、より具体的には85%の相同性、さらにより具体的には90%の相同性、最も具体的には95%の相同性を示す配列を意味する。
本明細書において、用語「発現する」は、本発明の免疫細胞が発現しない外来(exogenous)遺伝子が遺伝子伝達体を介して導入されたことで人為的に発現したり、内因性(endogenous)遺伝子が内在的な発現システムによって自然的に発現したり、または内因性(endogenous)遺伝子の自然的発現量を増加させるために、遺伝子伝達体を用いて過発現させることをすべて含む意味である。したがって、本発明の免疫細胞は、IL-7とCCL19を内在的に発現する細胞、IL-7を内在的に発現しCCL19を人為的に発現させた細胞、CCL19を内在的に発現しIL-7を人為的に発現させた細胞、およびIL-7とCCL19を人為的に発現させた細胞をすべて包括する。
本明細書において、用語「発現させる」は、対象細胞が外来遺伝子を発現させたり、または内因性遺伝子を過発現させるために、遺伝子伝達体を用いて人為的に目的細胞内で染色体外因子としてまたは染色体の統合完成によって複製可能になることを意味する。したがって、用語「発現させる」における「発現」は、「形質転換(transformation)」、「形質注入(transfection)」または「形質導入(transduction)」と同一の意味である。
本明細書において、用語「遺伝子伝達体(gene delivery system)」は、遺伝子を細胞内に運ぶすべての手段を意味し、遺伝子伝達は、遺伝子の細胞内浸透(transduction)と同一の意味を有する。組織レベルで、用語「遺伝子伝達」は、遺伝子の拡散(spread)と同一の意味を有する。したがって、本発明の遺伝子伝達体は、遺伝子浸透システムおよび遺伝子拡散システムと記載される。
IL-7およびCCL19遺伝子のヌクレオチド配列は、通常の遺伝子導入に用いられるすべての遺伝子伝達システムに適用可能であり、例えば、プラスミド、アデノウイルス、アデノ-関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、ワクチニアウイルス、リポソームまたはニオソームに適用可能である。
本発明の遺伝子伝達体がネイキッド(naked)組換えDNA分子またはプラスミドの場合には、微細注入法(Capecchi,M.R.,Cell,22:479(1980))、カルシウムホスフェート沈殿法(Graham,F.L.et al.,Virology,52:456(1973))、電気穿孔法(Tur-Kaspa et al.,Mol.Cell Biol.,6:716-718(1986))、リポソーム-媒介形質感染法(Biochim.Biophys.Acta,721:185-190(1982))、DEAE-デキストラン処理法(Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190(1985))、および遺伝子ボンバードメント(Yang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:9568-9572(1990))方法によって遺伝子を細胞内に移入させることができ、具体的には、電気穿孔法(electroporation)を用いることができる。
本発明の具体的な実施形態によれば、前記IL-7は、配列リストの第1配列のアミノ酸配列と85%以上の配列相同性を有し、より具体的には90%以上の配列相同性を有し、最も具体的には95%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の具体的な実施形態によれば、前記CCL19は、配列リストの第2配列のアミノ酸配列と85%以上の配列相同性を有し、より具体的には90%以上の配列相同性を有し、最も具体的には95%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の具体的な実施形態によれば、前記IL-7またはその機能的一部をエンコードする核酸分子は、配列リストの第3配列のヌクレオチド配列を含む。
本発明の具体的な実施形態によれば、前記CCL19またはその機能的一部をエンコードする核酸分子は、配列リストの第4配列のヌクレオチド配列を含む。
本発明によれば、配列リストの第3配列および第4配列は、IL-7およびCCL19遺伝子の塩基配列がナチュラルキラー細胞で効率的に発現するようにコドン最適化を行ったヌクレオチド配列である。
本発明の他の様態によれば、本発明は、上述した本発明の免疫細胞を有効成分として含む癌または感染性疾患の予防または治療用組成物を提供する。
本発明の免疫細胞が細胞治療剤として適用される場合、多様な腫瘍および感染性疾患の治療に適用可能である。本発明の免疫細胞、具体的には、ナチュラルキラー細胞は、固形癌(solid cancer)および血液癌を含むすべての種類の腫瘍に適用可能であり、前記癌は、例えば、胃癌、肝癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌、リンパ腫を含むが、これに限定されるものではない。本発明の免疫細胞、具体的には、ナチュラルキラー細胞を用いて予防または治療できる感染性疾患は、ウイルスまたは病源菌の感染によって発生する疾患であり、呼吸器および血液、皮膚接触などにより伝染して感染しうる疾患をすべて含む概念である。このような感染性疾患は、例えば、B型およびC型肝炎、ヒトパピローマウイルス(human papilloma virus:HPV)感染、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus)感染、ウイルス性呼吸器疾患、インフルエンザを含むが、これに限定されるものではない。
本明細書において、用語「予防」は、疾患または疾病を保有していると診断されたことはないが、このような疾患または疾病にかかる可能性がある対象体において疾患または疾病の発生を抑制することを意味する。
本明細書において、用語「治療」は、(a)疾患、疾病または症状の発展の抑制;(b)疾患、疾病または症状の軽減;または(c)疾患、疾病または症状を除去することを意味する。本発明の免疫細胞が対象体に投与されると、ナチュラルキラー細胞とこれによって病変部に誘導された内因性T細胞または外部から注入された自己または同種T細胞による複合的な免疫反応が行われて、癌細胞、感染細胞または病源菌の死滅を誘導することにより、腫瘍または感染疾患による症状の発展を抑制したり、これを除去したり、または軽減させる役割をする。したがって、本発明の組成物は、それ自体で疾患の細胞治療剤組成物になってもよく、あるいは他の薬理成分、例えば、治療用T細胞またはその他公知の抗癌剤などと共に投与されて前記疾患に対する治療補助剤として適用されてもよい。このため、本明細書において、用語「治療」または「治療剤」は、「治療補助」または「治療補助剤」の意味を含む。
本明細書において、用語「投与」または「投与する」は、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接的に投与することにより、対象体の体内で同一の量が形成されるようにすることをいう。
本発明において、用語「治療的有効量」は、本発明の組成物を投与しようとする個体に治療的または予防的効果を提供するのに十分な程度に含有された組成物の含有量を意味し、よって、「予防的有効量」を含む意味である。
本明細書において、用語「対象体」は、制限なく、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒヒまたはアカゲザルを含む。具体的には、本発明の対象体は、ヒトである。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、IL-7(interleukin-7)またはその機能的一部をエンコードする核酸分子;CCL19(C-C Motif Chemokine Ligand 19)またはその機能的一部をエンコードする核酸分子;またはこれらの組み合わせを有効成分として含む異種免疫細胞の増殖またはホーミング(homing)誘導用組成物を提供する。
本発明で用いられる核酸分子についてはすでに詳述したので、過度の重複を避けるためにその記載を省略する。
本明細書において、用語「異種免疫細胞(heterogeneous immune cell)」は、本発明の核酸分子が導入される対象細胞と異なる種類の免疫細胞を意味する。具体的には、前記異種免疫細胞は、T細胞または樹状細胞(dendritic cell)である。本発明によれば、IL-7およびCCL19を同時に発現する免疫細胞、具体的には、T細胞以外の免疫細胞、最も具体的には、ナチュラルキラー細胞を対象体に注入してT細胞の増殖および化学走性を誘導することにより、病変部に多量の内因性T細胞を移動させることができる。用語「化学走性(chemotaxis)」は、化学的刺激によって誘導される移動性細胞の陽性(刺激に向かう方向)または陰性(刺激から遠ざかる方向)移動を意味し、具体的には、陽性移動を意味する。本発明によれば、T細胞は、IL-7によって増殖および分化され、相応する化学走性因子であるCCL19によって活性化されてIL-7およびCCL19を発現するナチュラルキラー細胞に移動することで、病変部位にはT細胞とナチュラルキラー細胞という相互補完的免疫細胞で構成された非均質細胞群が形成される。このため、本発明の組成物は、ナチュラルキラー細胞に導入することにより、単一細胞の治療的有効量だけでも異なる細胞群の併用投与効果を収める治療補助剤の役割を果たすことができる。
本発明の具体的な実施形態によれば、前記核酸分子は、1つの遺伝子伝達体に共に挿入されるか、または2つの遺伝子伝達体にそれぞれ挿入されて組成物中に含まれてもよい。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、上述した本発明の免疫細胞を対象体に投与するステップを含む癌または感染性疾患の予防または治療方法を提供する。本発明で用いられる免疫細胞およびこれにより予防または治療できる癌および感染性疾患についてはすでに詳述したので、過度の重複を避けるためにその記載を省略する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、IL-7(interleukin-7)またはその機能的一部をエンコードする核酸分子;CCL19(C-C Motif Chemokine Ligand 19)またはその機能的一部をエンコードする核酸分子;またはこれらの組み合わせを免疫細胞に導入するステップを含む異種免疫細胞の増殖またはホーミング(homing)誘導方法を提供する。本発明で用いられる核酸分子および異種免疫細胞についてはすでに詳述したので、過度の重複を避けるためにその記載を省略する。
本発明の特徴および利点を要約すれば、次の通りである:
(a)本発明は、IL-7、CCL19、またはこれらの組み合わせを発現する免疫細胞およびこれを有効成分として含む癌または感染性疾患の予防または治療用組成物を提供する。
(b)本発明は、T細胞以外の免疫細胞、具体的には、ナチュラルキラー細胞の治療的有効量のみを注入することにより、患者の内因性T細胞と注入されたナチュラルキラー細胞の相互補完的免疫反応によって多角的かつ相乗的な治療効果を収めることができる。
(c)本発明はまた、T細胞とT細胞以外の免疫細胞、具体的には、ナチュラルキラー細胞を併用投与する場合にも、これらの異なる細胞群を病変部位により集中的に作用させることにより、著しく改善された治療効果を収めることができる。
(a)本発明は、IL-7、CCL19、またはこれらの組み合わせを発現する免疫細胞およびこれを有効成分として含む癌または感染性疾患の予防または治療用組成物を提供する。
(b)本発明は、T細胞以外の免疫細胞、具体的には、ナチュラルキラー細胞の治療的有効量のみを注入することにより、患者の内因性T細胞と注入されたナチュラルキラー細胞の相互補完的免疫反応によって多角的かつ相乗的な治療効果を収めることができる。
(c)本発明はまた、T細胞とT細胞以外の免疫細胞、具体的には、ナチュラルキラー細胞を併用投与する場合にも、これらの異なる細胞群を病変部位により集中的に作用させることにより、著しく改善された治療効果を収めることができる。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例1:IL-7およびCCL19発現ベクターの作製
IL-7およびCCL19を発現するヒトNK細胞を製造するための発現ベクターを作製した。発現ベクターとしては、ヒト延長因子1アルファ(EF1α)プロモーター制御下のpEF1a-IRES二重シストロン哺乳動物発現ベクター(Takara、CAT#631970)を用いた。
IL-7およびCCL19を発現するヒトNK細胞を製造するための発現ベクターを作製した。発現ベクターとしては、ヒト延長因子1アルファ(EF1α)プロモーター制御下のpEF1a-IRES二重シストロン哺乳動物発現ベクター(Takara、CAT#631970)を用いた。
ベクター内に挿入しようとする遺伝子であるIL-7および/またはCCL19のORF配列をコドン最適化して(それぞれ配列リストの第3配列および第4配列)合成し、pEF1a-IRESベクターのマルチクローニングサイトA(MCS A)にはIL-7またはCCL19を、MCS BにはCCL19またはIL-7をクローニングした。この時、前記pEF1a-IRESベクターは、2つのMCSの間にIRES(internal ribosome entry site)が位置して2つの遺伝子が同時発現できるようにした。前記陰性対照群ベクターである空ベクター(Empty vector)の構造は図1に、IL-7/CCL19発現ベクターの構造は図2に、CCL19/IL7発現ベクターの構造は図3にそれぞれ示した。
実施例2:IL-7およびCCL19発現の確認
NK92細胞株はATCC(CAT#CRL-2407)から購入し、12.5%ウマ血清(Horse Serum、Sigma、CAT#H1270)、12.5%ウシ胎児血清(Fetal Bovine Serum、FBS、Gibco、CAT#10099141)およびインターロイキン-2(IL-2;Peprotech、CAT#200-02)が含まれたα-MEM(Alpha Minimum Essential Medium)で培養した。IL-7およびCCL19を発現するNK92細胞株(以下、「形質転換NK92細胞株」)を作製するために1×106NK92cells/0.1mLの密度で電気穿孔法(electroporation)を行って、形質転換NK92細胞株を作製した。
NK92細胞株はATCC(CAT#CRL-2407)から購入し、12.5%ウマ血清(Horse Serum、Sigma、CAT#H1270)、12.5%ウシ胎児血清(Fetal Bovine Serum、FBS、Gibco、CAT#10099141)およびインターロイキン-2(IL-2;Peprotech、CAT#200-02)が含まれたα-MEM(Alpha Minimum Essential Medium)で培養した。IL-7およびCCL19を発現するNK92細胞株(以下、「形質転換NK92細胞株」)を作製するために1×106NK92cells/0.1mLの密度で電気穿孔法(electroporation)を行って、形質転換NK92細胞株を作製した。
電気穿孔法はNeonTM Transfection System(ThermoFisher、CAT#MPK5000)を用い、詳しくは、1800-1850vの電圧、10msのパルス長、1回、10~20μgのDNA(実施例1で作製した陰性対照群ベクター、IL-7/CCL19発現ベクターまたはCCL19/IL-7発現ベクター)の条件で行い、10%FBSが含まれたRPMI1640培地(Gibco #11875168)2mLで1日間培養後、IL-7またはCCL19の発現量を測定したり、トランスウェルアッセイ(Transwell assay)を行った。
形質転換NK92細胞株におけるIL-7およびCCL19の発現量を測定するために、6-ウェルプレートに培養中の培地を収集して800gで5分間遠心分離により上層液のみを分離し、上層液中、ウェルあたり0.1mLずつを適切に希釈し、IL-7またはCCL19酵素結合免疫吸着分析法(Enzyme linked immunosorbent assay、ELISA;IL-7、Komabiotech、CAT#k0331215;CCL19、Abcam、CAT#ab100601)実験に用いて、IL-7またはCCL19の発現量を測定した。
IL-7およびCCL19の免疫吸着分析法実験は各製造会社の標準実験方法によって行い、450nmの波長で最終数値を測定して表1に示した。
*N.D:Not detected(検出されず)
表1の結果を通して、IL-7/CCL19 NK92細胞株およびCCL19/IL-7 NK92細胞株でIL-7およびCCL19を分泌することを確認した。これに対し、空ベクターを注入した陰性対照群細胞ではIL-7およびCCL19が検出されなかったり、不十分なレベルで検出された。
実施例3:IL-7およびCCL19発現NK細胞によるT細胞の走化性および増殖分析
NK細胞が分泌するIL-7およびCCL19によるT細胞の走化性(chemotaxis)効果および増殖効果を確認すべく、12-ウェルのトランスウェル(transwell)(Corning、CAT#CLS3421)を用い、チャンバのフィルタは5μmのポリカーボネート(polycarbonate)を用いた。
NK細胞が分泌するIL-7およびCCL19によるT細胞の走化性(chemotaxis)効果および増殖効果を確認すべく、12-ウェルのトランスウェル(transwell)(Corning、CAT#CLS3421)を用い、チャンバのフィルタは5μmのポリカーボネート(polycarbonate)を用いた。
HuT78 T細胞株(cell line)を用いたIL-7/CCL19 NK92細胞および陰性対照群の比較
T細胞であるHuT78細胞(ATCC、CAT#TIB-161)1×107cellを、FBSが除外され1%PSのみ添加されたIMDM(Gibco、CAT#12440053)培地で24時間培養した。その後、5×106cells/mLの密度のHuT78細胞100μlを前記と同一の培地を用いて上部チャンバ(upper chamber)に分注し、チャンバの下層には実施例2で作製したIL-7/CCL19 NK92細胞株で2-3日間培養した培養液を分注した。
T細胞であるHuT78細胞(ATCC、CAT#TIB-161)1×107cellを、FBSが除外され1%PSのみ添加されたIMDM(Gibco、CAT#12440053)培地で24時間培養した。その後、5×106cells/mLの密度のHuT78細胞100μlを前記と同一の培地を用いて上部チャンバ(upper chamber)に分注し、チャンバの下層には実施例2で作製したIL-7/CCL19 NK92細胞株で2-3日間培養した培養液を分注した。
以後、37℃および5%CO2条件の細胞培養器で1日間培養した後、上部チャンバを除去し、3日間追加培養した。下部チャンバの細胞数を測定するために、ウェルあたり培地400μlを800gで5分間遠心分離し上層液を除去して、濃縮されたサンプルを得た。濃縮されたサンプル10μlにTrypan blue10μlを1:1の比率で混合してCountessTM II(Invitrogen、CAT#AMQAX1000)で測定し、400μl中の総生存細胞数に換算して、その結果を下記表2に示した。
PBMC由来T細胞を用いたIL-7/CCL19 NK92細胞、CCL19/IL-7 NK92細胞および陰性対照群の比較
末梢血液単核細胞(Peripheral blood mononuclear cell、PBMC)から分離したT細胞の走化性を確認するために、PBMCからT細胞をEasySepTM Human T cell Isolation Kit(STEMCELL #17951)を用いて分離し、2×106cells/mLの濃度のT細胞を2%FBSが含まれたRPMI1640培地で希釈後、100μlを上部チャンバ(upper chamber)に分注し、チャンバの下層には、実施例2で作製したIL-7/CCL19およびCCL19/IL-7形質転換NK92細胞株で1日間培養した培養液を分注した。
末梢血液単核細胞(Peripheral blood mononuclear cell、PBMC)から分離したT細胞の走化性を確認するために、PBMCからT細胞をEasySepTM Human T cell Isolation Kit(STEMCELL #17951)を用いて分離し、2×106cells/mLの濃度のT細胞を2%FBSが含まれたRPMI1640培地で希釈後、100μlを上部チャンバ(upper chamber)に分注し、チャンバの下層には、実施例2で作製したIL-7/CCL19およびCCL19/IL-7形質転換NK92細胞株で1日間培養した培養液を分注した。
以後、37℃および5%CO2条件の細胞培養器で1日間培養した後、上部チャンバを除去し、3日間追加培養した。下部チャンバの細胞数を測定するために、ウェルあたり培地500μlを800gで5分間遠心分離し上層液を除去して、濃縮されたサンプルを得た。濃縮されたサンプル10μlにTrypan blue10μlを1:1の比率で混合してCountessTM IIで測定し、総細胞数に換算して、その結果を下記表3に示した。
表2および表3に示すように、陰性対照群空ベクター導入NK92細胞株に比べて、IL-7/CCL19 NK92細胞株およびCCL19/IL-7 NK92細胞株処理群で下部チャンバに移動したT細胞数が著しく多かった。これにより、IL-7およびCCL19を分泌するように形質転換されたNK92細胞株によってT細胞の走化性(chemotaxis)および移動したT細胞の増殖(proliferation)誘導効果を確認することができた。
実施例4:形質転換NK92細胞株とこれによって移動したT細胞の癌細胞死滅効果およびこれに関連する分泌因子の測定
HepG2肝癌細胞株(ATCC #HB-8065)を2×105cells/mLの濃度で10%FBSが含まれたRPMI1640培地に希釈させた後、0.1mLずつ96-ウェルプレートの各ウェルに分注して、1日間培養した。実施例2と同様の方法で電気穿孔法により1日間培養した形質転換NK92細胞株が含まれた0.5mL RPMI1640培地を、実施例3と同様の方法でトランスウェルチャンバの下層に移し、上部チャンバにはPBMCから分離したT細胞2×105cells/0.1mLを移して、1日間T細胞の移動を誘導した。この時、下層チャンバには1×105個のCD3/CD28 Dynabeadsと100U IL-2を添加して移動したT細胞が活性化できるようにした。1日間培養後に上部チャンバを除去し、HepG2肝癌細胞株が培養中の96ウェルプレートにウェルあたり0.1mLずつ移した後、3日間さらに培養した。その後、PBS(Phosphate Buffer Saline)を用いて3回洗浄後、CCK-8溶液が1%含有された10%FBS-RPMI1640培地0.1mLに入れ替えた後、2時間追加培養した。HepG2肝癌細胞株の細胞生存の程度を測定するために450nmにおける吸光度を測定し、細胞生存の程度を数1のように計算し、その結果を表4に示した。
HepG2肝癌細胞株(ATCC #HB-8065)を2×105cells/mLの濃度で10%FBSが含まれたRPMI1640培地に希釈させた後、0.1mLずつ96-ウェルプレートの各ウェルに分注して、1日間培養した。実施例2と同様の方法で電気穿孔法により1日間培養した形質転換NK92細胞株が含まれた0.5mL RPMI1640培地を、実施例3と同様の方法でトランスウェルチャンバの下層に移し、上部チャンバにはPBMCから分離したT細胞2×105cells/0.1mLを移して、1日間T細胞の移動を誘導した。この時、下層チャンバには1×105個のCD3/CD28 Dynabeadsと100U IL-2を添加して移動したT細胞が活性化できるようにした。1日間培養後に上部チャンバを除去し、HepG2肝癌細胞株が培養中の96ウェルプレートにウェルあたり0.1mLずつ移した後、3日間さらに培養した。その後、PBS(Phosphate Buffer Saline)を用いて3回洗浄後、CCK-8溶液が1%含有された10%FBS-RPMI1640培地0.1mLに入れ替えた後、2時間追加培養した。HepG2肝癌細胞株の細胞生存の程度を測定するために450nmにおける吸光度を測定し、細胞生存の程度を数1のように計算し、その結果を表4に示した。
また、前記死滅効果の測定で収集した培地を用いて、活性化されたT細胞と活性化されたNK細胞から分泌するグランザイム(Granzyme)-B(Grz-B)およびインターフェロン(Interferon-γ(IFN-γ)、TNF(Tumor necrosis factor)-αの分泌量を酵素結合免疫吸着分析法(ELISA;GrzB、abcam #ab235635;IFN-γ、komabiotech #K0331121;TNF-α、komabiotech #K0331131)により測定して、その結果を表5に示した。表4および表5の各値は平均±標準偏差で表した。
*N.D:Not detected(検出されず)
表4に示すように、陰性対照群である空ベクターを導入したNK92細胞株に比べて、IL-7/CCL19 NK92細胞株およびCCL19/IL-7 NK92細胞株が含まれた実験群で著しく高いHepG2の死滅効果が確認され、表5のように、HepG2細胞株の死滅効果に関連する因子も、陰性対照群に比べて、IL-7/CCL19 NK92細胞株、CCL19/IL-7 NK92細胞株試験群でより高い分泌量を示した。このため、IL-7/CCL19 NK細胞およびCCL19/IL-7 NK細胞株とも効率的な抗癌治療剤として適用可能であることを確認した。
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、このため、本発明の範囲が制限されるものではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物によって定義される。
Claims (7)
- IL-7(interleukin-7)またはその機能的一部をエンコードする核酸分子;CCL19(C-C Motif Chemokine Ligand 19)またはその機能的一部をエンコードする核酸分子;またはこれらの組み合わせを発現する免疫細胞。
- 前記免疫細胞は、T細胞以外の免疫細胞であることを特徴とする請求項1に記載の免疫細胞。
- 前記T細胞以外の免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞であることを特徴とする請求項2に記載の免疫細胞。
- 請求項1~3のいずれか1項に記載の免疫細胞を有効成分として含む癌または感染性疾患の予防または治療用組成物。
- IL-7(interleukin-7)またはその機能的一部をエンコードする核酸分子;CCL19(C-C Motif Chemokine Ligand 19)またはその機能的一部をエンコードする核酸分子;またはこれらの組み合わせを有効成分として含む異種免疫細胞の増殖またはホーミング(homing)誘導用組成物。
- 前記異種免疫細胞は、T細胞または樹状細胞(dendritic cell)であることを特徴とする請求項5に記載の組成物。
- 前記核酸分子は、1つの遺伝子伝達体に共に挿入されたり、または2つの遺伝子伝達体にそれぞれ挿入されて組成物中に含まれることを特徴とする請求項5に記載の組成物。
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