CN117305252A - 一种重组间充质干细胞及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组间充质干细胞及其制备方法，涉及生物技术领域。所述重组间充质干细胞含有表达CXCL10、CCL20、CCL22和CA72‑4蛋白的基因组。其中，CXCL10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，CCL20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，CCL22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，CA72‑4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明的重组间充质干细胞含有表达CXCL10、CCL20、CCL22和CA72‑4蛋白的基因组，通过趋化因子CXCL10、CCL20、CCL22和CA72‑4能够提高间充质干细胞对肿瘤的治疗效果，减小肿瘤体积。

Description

一种重组间充质干细胞及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组间充质干细胞及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一种多能干细胞，具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于间充质干细胞分化的组织类型十分广泛，因此临床应用价值不菲。
趋化因子是一类由细胞分泌的小细胞因子或信号蛋白。由于它们具有诱导附近反应细胞定向趋化的能力，因而命名为趋化细胞因子。趋化因子被分为四个主要亚家族：CXC、CC、CX3C和XC。所有这些蛋白都通过与G蛋白连接的跨膜受体相互作用来发挥其生物学效应这些蛋白质结合到趋化因子受体而起作用，趋化因子受体是G蛋白偶连的跨膜受体，选择性地表达在靶细胞表面。趋化因子的主要作用是诱导细胞定向迁移，被趋化因子吸引的细胞沿着趋化因子浓度增加的信号向趋化因子源处的迁徙。有些趋化因子在免疫监视过程中控制免疫细胞趋化，如诱导淋巴细胞到淋巴结，这些淋巴结中的趋化因子通过与这些组织中的抗原提呈细胞相互作用而监视病原体的入侵；这些被称为稳态趋化因子，在不需要刺激源细胞的情况下产生和分泌。有些趋化因子在发育中起作用；他们能刺激新血管形成；引导细胞进入组织，为细胞的成熟提供特定的信号。其他趋化因子在炎症反应中起关键作用，可以因应对细菌感染、病毒感染而由多种细胞释放；也可以因非感染性的刺激如二氧化硅吸入，尿路结石等而释放。每个免疫细胞亚群都有不同的趋化因子受体表达模式，这使得它们对趋化因子有不同的反应，并根据每个环境的特殊需要迁移。在癌症中，它们在免疫细胞迁移到肿瘤中的模式中起着关键作用，从而形成肿瘤微环境的免疫特征，通常朝向促肿瘤形成状态。
趋化因子可以直接靶向肿瘤微环境中的非免疫细胞，包括肿瘤细胞、基质细胞和血管内皮细胞。因此，趋化因子参与多种癌症发展过程，如血管生成、转移、癌细胞增殖、干性和侵袭性，是疾病进展的关键决定因素，对患者预后和治疗反应有很大影响。由于它们在癌细胞和免疫浸润细胞中重要的调节功能，使得趋化因子配体及其受体成为非常强大的治疗靶点。
因此，如何利用趋化因子提高间充质干细胞对肿瘤的有效治疗，成为人们亟待解决的问题。
发明内容
本发明实施例的主要目的在于提供一种重组间充质干细胞及其制备方法，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
根据本发明实施例的第一方面，提供了一种重组间充质干细胞，所述重组间充质干细胞含有表达CXCL10、CCL20、CCL22和CA72-4蛋白的基因组。
进一步的，所述CXCL10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CCL20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CCL22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CA72-4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步的，所述基因组包括编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列、编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列、编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列、以及编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列，其中，编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
根据本发明实施例的第二方面，提供了一种重组间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ，其中，所述慢病毒Ⅰ包含编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅱ包含编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅲ包含编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅳ包含编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列；
S2、利用慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ转染间充质干细胞，获得所述重组间充质干细胞。
进一步的，所述间充质干细胞为离体人脐带间充质干细胞。
进一步的，所述构建慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ的方法，包括将慢病毒载体、包装质粒和表达质粒混合后转染细胞获得慢病毒，所述表达质粒的序列如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中的任意一种，所述慢病毒为慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ或慢病毒Ⅳ。
进一步的，所述慢病毒载体、包装质粒和表达质粒的质量比为2.5-3.0:0.8-1.2:1.8-2.2。
根据本发明实施例的第三方面，提供了一种治疗肿瘤的试剂盒，包括任一项上述重组间充质干细胞。
根据本发明实施例的第四方面，提供了一种由任一项上述重组间充质干细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
根据本发明实施例的第五方面，提供了一种治疗肿瘤的药物组合物，包括任一项上述重组间充质干细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
本发明实施例提供一种重组间充质干细胞及其制备方法，所述重组间充质干细胞含有表达CXCL10、CCL20、CCL22和CA72-4蛋白的基因组，通过趋化因子CXCL10、CCL20、CCL22和CA72-4能够提高间充质干细胞对肿瘤的治疗效果，增强抗肿瘤免疫反应，减小肿瘤体积。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例提供了一种重组间充质干细胞，所述重组间充质干细胞含有表达CXCL10、CCL20、CCL22和CA72-4蛋白的基因组。所述CXCL10蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述CCL20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CCL22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CA72-4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述基因组包括编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列、编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列、编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列、以及编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列，其中，编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明实施例提供的重组间充质干细胞，通过筛选出促进抗肿瘤免疫反应的趋化因子CXCL10、CCL20、CCL22和CA72-4，能够显著促进对肿瘤的抑制作用，提高间充质干细胞对肿瘤的治疗效果。
在本发明的一些典型实施例中，提供了一种重组间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ，其中，所述慢病毒Ⅰ包含编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅱ包含编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅲ包含编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅳ包含编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列；
S2、利用慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ转染间充质干细胞，获得所述重组间充质干细胞。
优选的，所述间充质干细胞为离体人脐带间充质干细胞，在具体实施中，可选取离体脂肪间充质干细胞、离体骨髓间充质干细胞中的任意一种。
优选的，所述构建慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ的方法，包括将慢病毒载体、包装质粒和表达质粒混合后转染细胞获得慢病毒，所述表达质粒的序列如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中的任意一种，所述慢病毒为慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ或慢病毒Ⅳ。所述慢病毒载体、包装质粒和表达质粒的质量比为2.5-3.0:0.8-1.2:1.8-2.2。
在本发明的一些典型实施例中，提供了一种治疗肿瘤的试剂盒，包括上述的重组间充质干细胞，通过采用本发明的试剂盒，不仅能够对肿瘤有良好的效果，还便于携带，给人们的使用带来便捷。
在本发明的另一些典型实施例中，提供了一种由任一项上述重组间充质干细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。具体的，在一些实施例中，提供了一种治疗肿瘤的药物组合物，包括任一项上述重组间充质干细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。
为更好的理解本发明的技术方案，以下结合具体实施例对本发明进行详细论述。
实施例1
本实施例提供一种重组间充质干细胞，所述重组间充质干细胞含有表达CXCL10、CCL20、CCL22和CA72-4蛋白的基因组。所述CXCL10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CCL20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CCL22蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述CA72-4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述基因组包括编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列、编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列、编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列、以及编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列，其中，编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
实施例2
本实施例提供了一种重组间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ，其中，所述慢病毒Ⅰ包含编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅱ包含编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅲ包含编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅳ包含编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列；
S2、利用慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ转染离体人脐带间充质干细胞，获得所述重组间充质干细胞。
所述构建慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ的方法，包括将慢病毒载体、包装质粒和表达质粒混合后转染细胞获得慢病毒，所述慢病毒载体、包装质粒和表达质粒的质量比为2.5:0.8:1.8；所述表达质粒的序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中的任意一种，所述慢病毒为慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ或慢病毒Ⅳ。
实施例3
本实施例提供了一种重组间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ，其中，所述慢病毒Ⅰ包含编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅱ包含编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅲ包含编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅳ包含编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列；
S2、利用慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ转染离体人脐带间充质干细胞，获得所述重组间充质干细胞。
所述构建慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ的方法，包括将慢病毒载体、包装质粒和表达质粒混合后转染细胞获得慢病毒，所述慢病毒载体、包装质粒和表达质粒的质量比为3.0:1.2:2.2；所述表达质粒的序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中的任意一种，所述慢病毒为慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ或慢病毒Ⅳ。
实施例4
本实施例提供了一种重组间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ，其中，所述慢病毒Ⅰ包含编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅱ包含编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅲ包含编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅳ包含编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列；
S2、利用慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ转染离体人脐带间充质干细胞，获得所述重组间充质干细胞。
所述构建慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ的方法，包括将慢病毒载体、包装质粒和表达质粒混合后转染细胞获得慢病毒，所述慢病毒载体、包装质粒和表达质粒的质量比为2.75:1.0:2.0；所述表达质粒的序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8中的任意一种，所述慢病毒为慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ或慢病毒Ⅳ。
实施例5
本实施例提供了一种重组间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建慢病毒Ⅰ，所述慢病毒Ⅰ包含编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列；
S2、利用慢病毒Ⅰ转染离体人脐带间充质干细胞，获得所述重组间充质干细胞。
所述构建慢病毒Ⅰ的方法，包括将慢病毒载体、包装质粒和表达质粒混合后转染细胞获得慢病毒，所述慢病毒载体、包装质粒和表达质粒的质量比为2.75:1.0:2.0；所述表达质粒的序列如SEQ ID NO.5所示。
实施例6
本实施例提供了一种重组间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建慢病毒Ⅱ，所述慢病毒Ⅱ包含编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列；
S2、利用慢病毒Ⅱ转染离体人脐带间充质干细胞，获得所述重组间充质干细胞。
所述构建慢病毒Ⅱ的方法，包括将慢病毒载体、包装质粒和表达质粒混合后转染细胞获得慢病毒，所述慢病毒载体、包装质粒和表达质粒的质量比为2.75:1.0:2.0；所述表达质粒的序列如SEQ ID NO.6所示。
实施例7
本实施例提供了一种重组间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建慢病毒Ⅲ，所述慢病毒Ⅲ包含编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列；
S2、利用慢病毒Ⅲ转染离体人脐带间充质干细胞，获得所述重组间充质干细胞。
所述构建慢病毒Ⅲ的方法，包括将慢病毒载体、包装质粒和表达质粒混合后转染细胞获得慢病毒，所述慢病毒载体、包装质粒和表达质粒的质量比为2.75:1.0:2.0；所述表达质粒的序列如SEQ ID NO.7所示。
实施例8
本实施例提供了一种重组间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建慢病毒Ⅳ，所述慢病毒Ⅳ包含编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列；
S2、利用慢病毒Ⅳ转染离体人脐带间充质干细胞，获得所述重组间充质干细胞。
所述构建慢病毒Ⅳ的方法，包括将慢病毒载体、包装质粒和表达质粒混合后转染细胞获得慢病毒，所述慢病毒载体、包装质粒和表达质粒的质量比为2.75:1.0:2.0；所述表达质粒的序列如SEQ ID NO.8所示。
实验1
收集血液肿瘤患者的自体MSC，按照实施例2-8的方法分别制备重组间充质干细胞A、重组间充质干细胞B、重组间充质干细胞C、重组间充质干细胞D、重组间充质干细胞E、重组间充质干细胞F、重组间充质干细胞G，没有处理的自体MSC作为对照组；将重组间充质干细胞A、重组间充质干细胞B、重组间充质干细胞C和对照组在体外扩增培养5周，将患者分为4组，每组50名患者，分别静脉注射重组间充质干细胞A、重组间充质干细胞B、重组间充质干细胞C和对照组，观察肿瘤形状变化。实验结果如表1所示：
表1不同组别肿瘤变化情况
组别 处理 肿瘤平均尺寸(mm)
组别1 重组间充质干细胞A 7.2
组别2 重组间充质干细胞B 7.1
组别3 重组间充质干细胞C 6.6
组别4 重组间充质干细胞D 7.8
组别5 重组间充质干细胞E 8.1
组别6 重组间充质干细胞F 7.9
组别7 重组间充质干细胞G 8.2
组别8 自体MSC 8.6
从表1可见，通过采用本发明实施例2-8的方法制备的重组间充质干细胞能够显著提升间充质干细胞对肿瘤的治疗效果，减小肿瘤体积；尤其采用实施例2-4的方法制备的重组间充质干细胞，治疗效果更好，说明趋化因子CXCL10、CCL20、CCL22和CA72-4具有一定的协同作用，比起单独采用任何一个趋化因子均具有更好的效果。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种重组间充质干细胞，其特征在于：所述重组间充质干细胞含有表达CXCL10、CCL20、CCL22和CA72-4蛋白的基因组。
2.根据权利要求1所述的重组间充质干细胞，其特征在于：所述CXCL10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CCL20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CCL22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CA72-4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的重组间充质干细胞，其特征在于：所述基因组包括编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列、编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列、编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列、以及编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列，其中，编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
4.一种如权利要求1-3中任一项所述重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ，其中，所述慢病毒Ⅰ包含编码所述CXCL10蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅱ包含编码所述CCL20蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅲ包含编码所述CCL22蛋白的核苷酸序列，所述慢病毒Ⅳ包含编码所述CA72-4蛋白的核苷酸序列；
S2、利用所述的慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ转染间充质干细胞，获得所述重组间充质干细胞。
5.根据权利要求4所述重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞为离体人脐带间充质干细胞。
6.根据权利要求4所述重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述构建慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ和慢病毒Ⅳ的方法，包括将慢病毒载体、包装质粒和表达质粒混合后转染细胞获得慢病毒，所述表达质粒的序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7和SEQID NO.8中的任意一种，所述慢病毒为慢病毒Ⅰ、慢病毒Ⅱ、慢病毒Ⅲ或慢病毒Ⅳ。
7.根据权利要求6所述重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述慢病毒载体、包装质粒和表达质粒的质量比为2.5-3.0:0.8-1.2:1.8-2.2。
8.一种治疗肿瘤的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-3中任一项所述重组间充质干细胞。
9.一种如权利要求1-3中任一项所述重组间充质干细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
10.一种治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：包括权利要求1-3中任一项所述重组间充质干细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。
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