CN117417890A - 重编程巨噬细胞、制备方法、细胞群、治疗产品及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重编程巨噬细胞、制备方法、细胞群、细胞治疗产品及其应用，属于生物疫苗技术领域。其中，该重编程巨噬细胞内含有具有抗炎作用基因的信息载体、降解胞外基质基因的信息载体以及吞噬作用基因的信息载体。并且，由体外实验数据可知，该重编程巨噬细胞不仅对细胞外基质具有较高降解能力，还具有较高的吞噬凋亡细胞的能力，也具有较高的抗炎能力；由体内实验结果可知，经过该重编程巨噬细胞治疗后的小鼠肝脏中天狼猩红和α‑SMA比例下降，指示重编程巨噬细胞可改善肝纤维化、刺激肝脏再生并改善功能。由此可知，本发明提供的重编程巨噬细胞可作为治疗抗纤维化疾病用材料，用于靶向治疗纤维化疾病。

Description

重编程巨噬细胞、制备方法、细胞群、治疗产品及应用
技术领域
本发明属于生物疫苗技术领域，特别是涉及一种重编程巨噬细胞、制备方法、细胞群、治疗产品及应用。
背景技术
在全球范围内，有8.44亿人患有慢性肝病，每年约有200万人死亡，发病率逐年上升。任何原因引起的反复性肝损伤都会导致纤维化，并最终导致肝硬化。目前，除了器官移植外，肝硬化没有治愈选择，而器官移植需要大型手术和终身免疫抑制，同时供体器官的可用性也限制了移植的可行性。因此，肝纤维化的程度与患者的预后相关。因而，慢性肝病患者迫切需要有效抗纤维化的疗法。
目前，临床上尚无特异有效的抗纤维化治疗方法。常采用的治疗手段主要是通过治疗引起肝损伤的基础疾病来缓解肝损伤和炎症。但这种治疗手段仅仅属于保守治疗方法并不能从根本上解决纤维化疾病。芝加哥大学在专利CN112236445A中公开了一种包含重组细胞外基质(ECM)靶向蛋白和/或重组蛋白酶的巨噬细胞。本专利基于重组细胞外基质(ECM)靶向蛋白和/或重组蛋白酶对ECM的降解功能，可提高巨噬细胞治疗纤维化和改善纤维化病变的能力。然而由实验结果可知，上述方法虽然在一定程度上可以减少肝纤维化，但其治疗效果还有待提高，并且目前现有的特异有效抗纤维化治疗方法仍存在较大空缺。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种重编程巨噬细胞、制备方法、细胞群、治疗产品及应用。本发明根据组织纤维化的病变进程特点，提出了从抑制纤维化、降解纤维化胞外基质到吞噬纤维化细胞的全面、系统地纤维化疾病治疗技术构思，并提供了重编程巨噬细胞。该重编程巨噬细胞在现有技术的基础上对巨噬细胞进行了进一步的工程化改进，改进后的巨噬细胞含有抗炎作用基因的信息载体、吞噬作用基因的信息载体和降解胞外基质基因的信息载体。在抗纤维化治疗过程中，本发明提供的重编程巨噬细胞，不仅能抵抗炎症反应和减少纤维化病变外，还能降解纤维化细胞胞外基质，更能吞噬纤维化细胞，实现对纤维化细胞的消除。由此可知，本发明实施例提供的重编程巨噬细胞是从多角度对纤维化组织进行治疗，可达到特异有效的抗纤维化目的。具体内容如下：
第一方面，本发明实施例提供了一种重编程巨噬细胞。该重编程巨噬细胞包含：具有抗炎作用基因的信息载体、具有吞噬作用基因的信息载体以及降解胞外基质基因的信息载体。
在一些实施例中，信息载体为DNA、RNA、病毒和纳米颗粒中的任意一种或多种组合。
在一些实施例中，抗炎作用基因包括：促M2型稳态的基因和/或促巨噬细胞极化的基因。
在一些实施例中，促M2型稳态的基因为编码M-CSF的基因；促巨噬细胞极化的基因为编码IL-4的基因、编码IL-10的基因和编码分泌性白细胞蛋白酶抑制剂的基因中的一种或多种。
在一些实施例中，吞噬作用基因包括：识别PtdSer的受体的基因和/或识别PtdSer可溶性桥接蛋白的受体的基因。
在一些实施例中，识别PtdSer的受体包括：识别PtdSer的受体包括：TIM受体、整合素、CD300受体和粘附型G蛋白偶联受体中的一种或多种；
在一些实施例中，识别PtdSer可溶性桥接蛋白的受体为TAM受体。
在一些实施例中，TIM受体包括：TIM-1、TIM-3和TIM-4中的一种或多种；和/或
TAM受体包括：TYRO3、AXL和MER中的一种或多种；和/或
整合素包括：αMβ2整合素、αxβ2整合素、αvβ3整合素和αvβ5整合素中的一种或多种；和/或
CD300受体包括：CD300a、CD300b、CD300c、CD300d、CD300e、CD300f和CD300g中的一种或多种。
在一些实施例中，降解胞外基质基因包括基质降解酶的基因；其中，基质降解酶为胶原酶、明胶酶和基质金属蛋白酶中的一种或多种。
在一些实施例中，胶原酶为MMP8、MMP1和MMP13中的一种或多种组合；明胶酶为MMP2和/或MMP9；基质金属蛋白酶为MMP12。
在一些实施例中，巨噬细胞是M2特异性巨噬细胞。
在一些实施例中，巨噬细胞由自体外周血单核细胞诱导所得。
在一些实施例中，具有抗炎作用基因的信息载体、具有吞噬作用基因的信息载体以及降解胞外基质基因的信息载体，均是体外制备的。
在一些实施例中，抗炎作用基因、吞噬作用基因以及降解胞外基质基因，三者的制备模板均源于巨噬细胞。
第二方面，本发明实施例提供了一种细胞群。该细胞群包含第一方面提供的重编程巨噬细胞。
第三方面，本发明实施例提供了一种细胞治疗产品。细胞治疗产品包含第一方面提供的重编程巨噬细胞或包含第二方面提供的细胞群。
第四方面，本发明实施例提供了一种第一方面提供的重编程巨噬细胞或第二方面提供的细胞群的应用。该应用包括：在治疗纤维化疾病中的应用。
在一些实施例中，纤维化疾病为肝纤维化、心脏纤维化、肺纤维化、关节纤维化、骨髓纤维化、纵隔纤维化、腹膜后纤维化、肾因性全身性纤维化以及瘢痕瘤、克罗恩病、乳房纤维囊肿和佩罗尼病等中的任何一种。
第五方面，本发明实施例提供了一种第一方面所述重编程巨噬细胞或第二方面所述细胞群的冻存方式。
第六方面，本发明实施例提供了一种制备第一方面提供的重编程巨噬细胞的方法。
在一些实施例中，上述制备方法可以包括：分别构建具有抗炎作用基因的信息载体、降解胞外基质基因的信息载体以及具有吞噬作用基因的信息载体；
将构建的上述三种信息载体导入巨噬细胞中。
在一些实施例中，当信息载体为mRNA时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量为1～5μg/105细胞，具有吞噬作用基因的信息载体的载入量为1～5μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量为1～5μg/105细胞。
具体实施时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量可以为1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞；具有吞噬作用基因的信息载体的的载入量可以为1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量可以为1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞。这三种载入量也可以根据实际需求进行调整或任意组合。
在一些实施例中，当信息载体为DNA时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量为0.5～1μg/105细胞，具有吞噬作用基因的信息载体的载入量为0.5～1μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量为0.5～1μg/105细胞。
具体实施时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞；具有吞噬作用基因的信息载体的的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞。这三种载入量也可以根据实际需求进行调整或任意组合。
在一些实施例中，当信息载体为纳米颗粒时，载入量为0.5～5μg/105细胞。
具体实施时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞；具有吞噬作用基因的信息载体的的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞。这三种载入量也可以根据实际需求进行调整或任意组合。
在一些实施例中，导入的操作是利用电转系统或纳米颗粒实现的。
在一些实施例中，利用电转系统时，所采用的电压为250～300V，电转时间为8～12ms。
本发明的有益效果在于：本发明提供的重编程巨噬细胞内含有具有抗炎作用基因的信息载体、降解胞外基质基因的信息载体以及吞噬作用基因的信息载体。在抗纤维化治疗过程中，本发明提供的重编程巨噬细胞，不仅能抵抗炎症反应和减少纤维化病变外，还能降解纤维化细胞胞外基质，更能吞噬纤维化细胞，实现对纤维化细胞的消除。即，本发明实施例提供的重编程巨噬细胞是从多角度对纤维化组织进行治疗，可达到特异有效的抗纤维化目的。
并且，由体内实验结果可知，经过该重编程巨噬细胞治疗后的小鼠肝脏中天狼猩红和α-SMA比例下降，这指示重编程巨噬细胞可改善肝纤维化、刺激肝脏再生并改善功能；由体外实验数据可知，该重编程巨噬细胞不仅对细胞外基质具有较高降解能力，还具有较高的吞噬凋亡细胞的能力，也具有较高的抗炎能力。由此可知，本发明提供的重编程巨噬细胞可作为治疗抗纤维化疾病用材料，用于靶向治疗纤维化疾病。
附图说明
图1示出了本发明实施例1制备的重编程M2型巨噬细胞的体内药效检测结果；其中，图1A示出了本发明实施例1制备的重编程M2型巨噬细胞的药效试验示意图，图1B示出了肝脏组织天狼猩红和α－SMA组化染色；
图2示出了本发明实施例2制备的M-CSF稳态M2型巨噬细胞的功能检测结果；其中，图2A示出了M-CSF稳态M2型巨噬细胞的M-CSF分泌检测结果，图2B示出了紫草素诱导K562细胞凋亡状态检测结果，图2C示出了M-CSF稳态M2型巨噬细胞吞噬凋亡细胞能力检测结果；
图3示出了本发明实施例3制备的抗炎M2型巨噬细胞的IL-10分泌检测结果；
图4示出了本发明实施例4制备的增强吞噬M2型巨噬细胞的功能检测结果；其中，图4A示出了增强吞噬M2型巨噬细胞的CD300F分泌检测结果，图4B示出了增强吞噬M2型巨噬细胞吞噬凋亡细胞能力检测结果；
图5示出了本发明实施例5制备的增强ECM降解M2型巨噬细胞分泌的MMP功能检测；
图6示出了本发明对比例制备的重编程M2型巨噬细胞的体内药效检测结果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。下面对本发明的实施例作详细说明，在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明的各个方面详细描述于以下各实施例。实施例的用途不是要限制本发明。每个实施例可以应用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外说明，“或”的使用表示“和/或”。
本领域技术人员众所周知的方法可用于构建根据本发明的基因表达构建体、靶向载体和基因工程化的细胞。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、体内重组技术、聚合酶链反应(PCR)技术等。参见，例如Green&Sam brook，2012，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Fourth Edition，Cold SpringHarbor Laboratory，New York；Ausubel等人，1989，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience，NewYork，和PCR Protocols：A Guide to Methodsand Applications(Innis等人，1990，AcademicPress，San Diego，CA)中描述的技术。
本文所使用的术语“重编程”是指向目标细胞中引入增强细胞功能的目的基因。该目的基因可以是非天然存在的基因序列，也可以是天然存在的基因序列。应当理解，通常通过瞬时或稳定引入一种或多于一种目的基因来增强本文所述的重编程的细胞的基因组。
将目的基因引入待重编程的细胞中，来增强基因产物的产生。在一些情况下，通过电穿孔或纳米颗粒或脂质体的形式将待引入的基因直接引入受体细胞。
如本文所使用的，术语“或”和“和/或”用于描述组合或彼此排斥的多个部分。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别预期的是，x、y或z可以从实施方案中具体排除。
在整个申请中，术语“约”根据其在细胞生物学领域中的普通和一般含义使用，以指示值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准偏差。
与“包括”、“含有”或“特征在于”同义的术语“包含”是包含性的或开放式的，并且不排除其他未叙述的要素或方法步骤。短语“由......组成”不包括未指定的任何元素、步骤或成分。短语“基本上由......组成”将所描述的主题的范围限制为指定的材料或步骤，以及不实质影响其基本和新颖特征的材料或步骤。可以设想，在术语“包含”的上下文中描述的实施方案也可以在术语“由......组成”或“基本上由......组成”的上下文中实现。
第一方面，本发明实施例提供了一种重编程巨噬细胞。该重编程巨噬细胞包含：具有抗炎作用基因的信息载体、具有吞噬作用基因的信息载体以及降解胞外基质基因的信息载体。
本实施例中，具有抗炎作用基因的信息载体在巨噬细胞中表达后的产物可以抵抗炎症信号，达到抑制纤维化进程、稳定巨噬细胞表型、增强巨噬细胞功能的目的；具有吞噬作用基因的信息载体在巨噬细胞中表达后的产物可以增强吞噬细胞的吞噬能力，达到消除纤维化细胞的目的；降解胞外基质基因的信息载体在巨噬细胞中表达后的产物可以通过降解细胞外基质达到减少纤维化病变的目的。
本实施例中的巨噬细胞可以为肝巨噬细胞，其来源于自体外周血，是一种高度可塑性和异质性的细胞，是肝纤维化沉积和消退的细胞调节剂。在疾病进展中，M1型巨噬细胞释放信号，驱动炎性细胞募集和肝星状细胞活化以产生细胞外基质(ECM)。损伤停止后，M2型巨噬细胞释放基质金属蛋白酶(MMP)，促进纤维化ECM降解，吞噬凋亡的肝纤维化细胞以及抑制炎症反应因素，并驱动肝脏再生。在肝纤维化的小鼠模型中，巨噬细胞通过外周静脉注射和经过体循环到肝脏，表达抗炎因子、MMP和吞噬受体，从而改善肝纤维化，刺激肝脏再生并改善功能。因此，本实施例选用巨噬细胞作为肝纤维化治疗的治疗靶点。
本实施例中，采用在肝纤维进展的炎症状态下时补充增强分泌M-CSF的M2型巨噬细胞，有利于帮助病变的消退。
为了促进从致病性表型(M1)向恢复性表型(M2)的转变，以加速纤维化消退和促进肝脏再生，本实施例通过抗炎症，促进巨噬细胞极化的调节剂来实现。具体实施时，调节剂可以为类固醇(例如地塞米松)、IL-4、IL-10、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)和前列腺素E2(PGE2)。具体实施时，向巨噬细胞中转入表达这些调节剂的基因，对巨噬细胞进行重编程，以加快巨噬细胞向恢复性表现的转变。
本实施例提供的重编程巨噬细胞内含有具有抗炎作用基因的信息载体、降解胞外基质基因的信息载体以及吞噬作用基因的信息载体。在抗纤维化治疗过程中，本发明提供的重编程巨噬细胞，不仅能抵抗炎症反应和减少纤维化病变外，还能降解纤维化细胞胞外基质，更能吞噬纤维化细胞，实现对纤维化细胞的消除。即，本发明实施例提供的重编程巨噬细胞是从多角度对纤维化组织进行治疗，可达到特异有效的抗纤维化目的。
在一些实施例中，信息载体为DNA、RNA、病毒、病毒核酸和纳米颗粒中的任意一种或多种组合。
本实施例中，可以使用的病毒包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经营养性病毒、辛德比斯病毒等。
在一些实施例中，抗炎作用基因包括：促M2型稳态的基因和/或促巨噬细胞极化的基因。
本实施例中，先向巨噬细胞中补增促M2型稳态的基因，再将该巨噬细胞回输给受体。这样，在肝纤维进展的炎症状态下时，通过向受体补充增强分泌M-CSF的M2型巨噬细胞可以有利于帮助病变的消退。
本实施例中，先向巨噬细胞中补增促巨噬细胞极化的基因，再将该巨噬细胞回输给受体。这样，在肝纤维进展的炎症状态下时，通过向受体补充增强分泌抗炎因子的M2型巨噬细胞也可以有利于帮助病变的消退。
在一些实施例中，促M2型稳态的基因为编码M-CSF的基因；促巨噬细胞极化的基因为编码IL-4的基因、编码IL-10的基因和编码分泌性白细胞蛋白酶抑制剂的基因中的一种或多种。
在一些实施例中，吞噬作用基因包括：识别PtdSer的受体的基因和/或识别PtdSer可溶性桥接蛋白的受体的基因。
本实施例中，组织中巨噬细胞可以在10分钟内快速识别凋亡细胞上外化的脂酰丝氨酸(PtdSer)并吞噬细胞。巨噬细胞识别凋亡细胞的受体包括两种：1)直接识别PtdSer的受体，2)识别PtdSer可溶性桥接蛋白的受体。主要是TIM受体家族、TAM受体家族、整合素、CD300受体家族和其他受体。巨噬细胞还会吞噬病毒感染或代谢创伤但仍然活着的细胞。
在一些实施例中，识别PtdSer的受体包括TIM受体、整合素、CD300受体和粘附型G蛋白偶联受体中的一种或多种；识别PtdSer可溶性桥接蛋白的受体可以为TAM受体。
在一些实施例中，TIM受体包括：TIM-1、TIM-3和TIM-4中的一种或多种；和/或
TAM受体包括：TYRO3、AXL和MER中的一种或多种；和/或
整合素包括：αMβ2整合素、αxβ2整合素、αvβ3整合素和αvβ5整合素中的一种或多种；和/或
CD300受体包括：CD300a、CD300b、CD300c、CD300d、CD300e、CD300f和CD300g中的一种或多种。
本实施例中，ITM为T细胞免疫球蛋白粘蛋白受体。
本实施例中，TAM受体家族是细胞表面酪氨酸激酶(RTK)受体。这些受体不直接与PtdSer结合，而是依靠它们的激活配体：生长停滞特异性蛋白6(growth arrest-specificprotein 6，GAS6)和蛋白S(Protein S，PROS1)。配体的羧基末端性激素结合球蛋白(SHBG)结构域与TAM的细胞外结构域结合，而其氨基末端γ-羧谷氨酸(GLA)结构域与PtdSer结合。GAS6结合并激活三种TAM受体，而PROS1仅结合并激活TYRO3和MER。
本实施例中，整合素通过位于其第二个EGF样重复序列内的Arg-Gly-Asp(RGD)基序与MFGE8(即，可溶性细胞外基质糖蛋白乳脂球-EGF因子8)结合。
本实施例中，CD300受体能够直接识别暴露在死细胞和活化细胞质膜外翻的PtdSer，介导巨噬细胞的吞噬。
其他受体：脑特异性血管生成抑制剂1(BAI1)属于粘附型G蛋白偶联受体家族，携带RGD基序和多个血小板凝发素I型重复序列，可与PtdSer结合，并通过与下游效应物偶联来促进凋亡细胞的吞噬作用。血浆蛋白可修饰凋亡细胞的表面，并与胞吞作用有关。补体级联蛋白，如C1q和C3b。用于C3b结合的吞噬细胞受体被认为是CR3(由CD11b和CD18组成，形成αMβ2整合素)和CR4(由CD11c和CD18组成，形成αxβ2整合素)。
在一些实施例中，降解胞外基质基因包括基质降解酶的基因；其中，基质降解酶为胶原酶、明胶酶和基质金属蛋白酶中的一种或多种。
肝纤维化是一个动态过程，其特征是ECM沉积和降解之间的不利平衡。ECM降解是纤维化消退最相关的方面之一，需要激活MMP、巨噬细胞吞噬活性和下调MMP抑制分子。MMP是主要的基质降解酶，根据底物特异性，可以分为胶原酶、明胶酶和基质金属蛋白酶。胶原酶为MMP8、MMP1和MMP13等，将天然原纤维胶原蛋白切割成明胶；明胶酶为MMP2、MMP9等，降解各种基质，包括明胶、胶原蛋白和弹性蛋白；基质金属蛋白酶为MMP12等，降解弹性蛋白。
在一些实施例中，巨噬细胞是M2特异性巨噬细胞(即M2型巨噬细胞)。
在一些实施例中，具有抗炎作用基因的信息载体、所述具有吞噬作用基因的信息载体以及所述降解胞外基质基因的信息载体，均是体外制备的。
在一些实施例中，抗炎作用基因、吞噬作用基因以及降解胞外基质基因，三者的制备模板均源于巨噬细胞。
本实施例中，利用M2型巨噬细胞抗纤维化作用，选用电转系统递送具有抗炎作用基因的信息载体、具有吞噬作用基因的信息载体以及降解胞外基质基因的信息载体到单核细胞衍生的巨噬细胞中，重新编程M2型细胞，使其能够抵抗体内炎症信号，处于更稳态的M2型，抑制炎症信号，同时增强M2型巨噬细胞吞噬凋亡细胞和降解胞外基质能力，以期回输回人体内达到改善肝纤维化目的，并驱动肝脏再生。
第二方面，本发明实施例提供了一种细胞群。该细胞群包含第一方面提供的重编程巨噬细胞。
第三方面，本发明实施例提供了一种细胞治疗产品。细胞治疗产品包含第一方面提供的重编程巨噬细胞或包含第二方面提供的细胞群。
本实施例所使用的术语“细胞治疗产品”是指包含一种或多于一种细胞的细胞群，该一种或多于一种细胞以靶向个体中的期望位置并在期望位置具有生理相关作用。例如，细胞治疗产品可以是细胞群，其包括可以降解胶原蛋白、吞噬纤维化的细胞、消除炎症以及诱导抗炎作用的重编程巨噬细胞。细胞群可以是同质的(即，仅包含重编程巨噬细胞)或异质的(包含重编程巨噬细胞、非重编程巨噬细胞以及其他无论是否为重编程的细胞类型)。
细胞治疗产品还可以包含一种或多于一种细胞培养基成分(例如缓冲液、抗生素、盐、维生素、生长因子、氨基酸等)和/或治疗性化合物，以维持细胞群和/或治疗疾病。例如，细胞治疗产品可以包含重编程巨噬细胞和抗生素。细胞治疗产品还可以包含其他治疗剂，例如α-生育酚、干扰素-γ、槲皮素、ACE抑制剂和PPAR-δ中的一种或多种。本实施例中，适用于治疗应用的其他治疗剂和药物试剂和/或赋形剂也可以包含在预期的细胞治疗产品中。
术语“治疗”是指在减轻或改善伤害、病理或病症方面的任何成功或成功的标志，包括任何客观或主观参数，例如减轻、缓解、减少症状或使患者更能忍受伤害、病理或病症，减慢退化或衰退的速度，使退化的终点衰弱减少，改善对象的身心健康，或延长存活时间。症状的治疗或缓解可以基于客观或主观参数，包括体格检查、神经系统检查和/或精神病学评估的结果。
第四方面，本发明实施例提供了一种第一方面提供的重编程巨噬细胞或第二方面提供的细胞群的应用。该应用包括：在治疗纤维化疾病中的应用。
本实施例中，纤维化疾病可以为肝纤维化、心脏纤维化、肺纤维化、关节纤维化、骨髓纤维化、纵隔纤维化、腹膜后纤维化、肾因性全身性纤维化以及瘢痕瘤、克罗恩病、乳房纤维囊肿和佩罗尼病等中的任何一种。
本实施例中，第一方面提供的重编程巨噬细胞或第二方面提供的细胞群可以表达靶向纤维化的蛋白质，从而在受体中达到治疗纤维化组织的目的；并且在使用时，第一方面提供的重编程巨噬细胞或第二方面提供的细胞群可以在重编后立即用于需要被治疗的患者，也可以冷冻以备后用。
第五方面，本发明实施例提供了一种第一方面所述重编程巨噬细胞或第二方面所述细胞群的冻存方式。
第一方面提供的重编程巨噬细胞或第二方面提供的细胞群的施用，可以通过一般公认的任何向患者施用的方式进行。在一些实施方案中，可以通过门静脉注射、心内注射或静脉内(IV)注射将基因工程化巨噬细胞引入有需要的个体。
第六方面，本发明实施例提供了一种制备第一方面提供的重编程巨噬细胞的方法。
该方法可以包括：分别构建具有抗炎作用基因的信息载体、降解胞外基质基因的信息载体以及具有吞噬作用基因的信息载体；将该三种信息载体导入巨噬细胞中。其中，导入的具体操作可以采用电转系统导入或纳米颗粒导入，电转时所采用的电压为250～300V，电转时间为8～12ms。
在一些实施例中，当信息载体为mRNA时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量为1～5μg/105细胞，具有吞噬作用基因的信息载体的载入量为1～5μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量为1～5μg/105细胞。
具体实施时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量可以为1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞；具有吞噬作用基因的信息载体的的载入量可以为1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量可以为1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞。这三种载入量也可以根据实际需求进行调整或任意组合。
在一些实施例中，当信息载体为DNA时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量为0.5～1μg/105细胞，具有吞噬作用基因的信息载体的载入量为0.5～1μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量为0.5～1μg/105细胞。
具体实施时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞；具有吞噬作用基因的信息载体的的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞。这三种载入量也可以根据实际需求进行调整或任意组合。
在一些实施例中，当信息载体为纳米颗粒时，载入量为0.5～5μg/105细胞。
具体实施时，具有抗炎作用基因的信息载体的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞；具有吞噬作用基因的信息载体的的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞；降解胞外基质基因的信息载体的载入量可以为0.5μg/105细胞，0.6μg/105细胞，0.7μg/105细胞，0.8μg/105细胞，0.9μg/105细胞，1μg/105细胞，2μg/105细胞，3μg/105细胞，4μg/105细胞，5μg/105细胞。这三种载入量也可以根据实际需求进行调整或任意组合。
在一些实施例中，导入的操作是利用电转系统或纳米颗粒实现的。
在一些实施例中，预期用于本文的细胞包括M2型巨噬细胞，其可以关闭炎症反应并促进组织伤口修复，称为“抗炎M2特异性巨噬细胞”。
在一些实施方案中，可以从待处理的个体(如自体来源)中提取细胞，进行重编程，然后再回输(例如通过注射)该个体中，以除去该个体的肝、心脏、肺或其他组织或器官中的纤维化瘢痕。在一个实施方案中，这种重编程后的细胞治疗产品可以源自个体的单采血液分离术产品。在另一个实施方案中，预期用于个体的细胞治疗产品可以源自另一个体(即异源)或另一个细胞来源的血液分离术产品。在一个实施方案中，可以如Fraser等人所述制备合适的自体巨噬细胞群体(Development，functional characterization and validationof methodology for GMP-compliant manufacture of phagocytic macrophages：Anovel cellular therapeutic for liver cirrhosis.Cytotherapy 2017Sep；19(9)：1113-1124)。
本实施例中，巨噬细胞的来源可以是自体外周血。具体是由自体外周血单核细胞诱导所得。
本实施例中，巨噬细胞的制备可以采用本领域已知的方法。例如，先通过Ficoll密度梯度离心法制备PBMC，然后对PBMC进行处理以分离单核细胞，在将分离的单核细胞向巨噬细胞进行分化。
其中，Ficoll密度梯度离心法制备PBMC的操作可以为：将一定体积的Ficoll转移到离心管中；然后将全血覆盖在Ficoll上，并将离心管在室温下按照200g离心45分钟的标准进行离心，得到红细胞沉淀、Ficoll层、包含PBMC的白色层和血浆层；提取包含PBMC的白色层。
PBMC中包含单核细胞和淋巴细胞，因此可以对PBMC进行处理以分离单核细胞。本实施例通过磁珠分离或离心逆流淘洗法将单核细胞与淋巴细胞分离，富集单核细胞。
巨噬细胞的培养：本实施例分离的单核细胞(也可以直接对PBMC进行培养)在含有巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的分化培养基中培养进行诱导培养以得到巨噬细胞。培养条件只要是适于培养巨噬细胞的就可以，本实施例中没有特别限制。例如，将巨噬细胞接种于培养基中的密度可以为5×105个细胞/mL(在具体实验过程中也可以表示为5E+05个细胞/mL)。培养温度可以为37℃。可以根据巨噬细胞的生长状态适当地设定培养时间，例如可以将培养时间设定为5天～8天。培养环境可以为5％CO2的培养环境。
为了使本领域技术人员更好地理解本发明实施例提供的重编程巨噬细胞，下面通过具体实施例进行详细阐述。其中，所用试剂和仪器，若未作特别说明，则均为现有的商业化产品，可直接购买。
以下各实施例中所用mRNA序列是我方根据模板采用本领域技术人员已知方法制得，例如，基于DNA模板通过RNA聚合酶合成得到。其中，DNA模板源于巨噬细胞，具体地，可在基因库(如GeneCards或National Library of medicine)中查询。
实施例1.重编程M2型巨噬细胞的制备及体内抗纤维化作用的检测
步骤1，巨噬细胞的制备
使用单采系统的MNC的标准程序，无菌收集外周血单个核细胞即白细胞富集物，处理2.5倍血量，收集4小时。单核细胞的分离在符合GMP条件的封闭系统进行，通过离心逆流淘洗系统进行分离。分离结束时，将单核细胞洗涤在含有药物级0.5％人白蛋白(HSA)的EDTA/PBS缓冲液中，计数，然后利用含有50ng/mL M-CSF细胞因子的TexMACS培养基重悬细胞为0.5×106单核细胞/mL，灌注到培养袋中，在温度37℃、CO2浓度5％、湿度75％的条件下诱导8天为巨噬细胞，其中每2天进行一次半量换液。
步骤2，使用流式细胞仪组合抗体分析单核细胞和巨噬细胞表面标志物：将纯化的单核细胞或巨噬细胞与FC封闭抗体孵育5分钟，然后与1:100稀释的抗体混合物在4℃下孵育20分钟，流式洗涤缓冲液洗涤细胞，最后以1:100比例加入死细胞染料DRAQ7。细胞表面标记物抗体为：CD45、CD14、CCR2、CD206以及25F9，其中CD45作为白细胞标志物，CD14作为单核细胞以及单核细胞衍生细胞标志物，CCR2作为单核细胞高表达标志物，巨噬细胞应该低表达；25F9作为巨噬细胞成熟的标志物，CD206作为巨噬细胞吞噬和清除能力的标志物。使用正向和侧向散射，DRAQ7死细胞排除，对单核细胞和巨噬细胞进行门控，使用FlowJo软件进行分析。确定巨噬细胞的25F9和CD206平均荧光强度(MFI)是第0天单核细胞的5倍，作细胞产品释放标准。
实施例1制备的巨噬细胞的形态均一。并且，诱导为巨噬细胞的诱导率平均值为60.1％，范围是41.4～78.1％。由此可知，采用本发明实施例提供的方法，可以成功制备巨噬细胞，且细胞形态均一、诱导率高。
利用离心逆流淘洗系统分离出高纯度的单核细胞，平均值为79.0％，范围是71.8～97.7；采用本实施例提供的方法能够生产出大于108巨噬细胞，诱导的巨噬细胞数平均值为6.38×108细胞，范围是4.1～9.9×108细胞；本实施例1制备的巨噬细胞拥有成熟的表型CD14+/高表达25F9，以及高水平表达与组织修复和炎症消退相关的标志物CD206，低表达CCR2。其中，CCR2是一种与转运到发炎部位相关的趋化因子受体，在稳态和炎性单核细胞上高度表达，并伴有疾病的潜在恶化，在抗纤维化过程中需要低表达。本发明实施例1具备大规模生产巨噬细胞产品的能力。
步骤3，巨噬细胞功能检测
步骤3.1，吞噬功能检测：使用pHRodo磁珠测试单核细胞和巨噬细胞的吞噬能力。其中，pHRodo磁珠被胞吞的酸化后会发出荧光，故可以对吞噬进行测定。具体操作可以为：在单核细胞或巨噬细胞中加入1μL的pHrodoTMRed E.coli生物颗粒，培养1小时，然后洗涤细胞，利用流式细胞仪术定量巨噬细胞荧光微球摄取，评估吞噬作用。
步骤3.2，极化能力检测：用50ng/mL IFN-γ或20ng/mL IL-4处理第7天巨噬细胞48小时，诱导细胞极化为M1或M2表型，来检查向定义的分化巨噬细胞极化的能力。48小时后利用流式细胞术检测相关表型。
磁珠吞噬测定显示，未分化单核细胞吞噬微球百分率平均值为37.1％，范围为13.5～49.3％，而本实施例制备的巨噬细胞吞噬微球百分率平均值为72.2％，范围为52.2-90.4％。由这两项结果可知，本实施例制备的巨噬细胞吞噬能力更强。
本实施例制备的巨噬细胞显示CD206表达与IL-4孵育时显著上调，但与IFN-γ孵育时略有降低。
本实施例的上述检测结果指示巨噬细胞保留了一定程度的可塑性。因此，我们可以通过体外重编程手段，使巨噬细胞处于更稳态的M2型，更能抵抗体内炎症因子极化，平衡体内炎症环境，增加吞噬和降解ECM能力。
步骤4，重编程M2型巨噬细胞的制备及体内抗纤维化作用的检测
本实施例中，M-CSF/IL-10/CD300F/MMP16 mRNA分别是基于各自对应的基因序列模板人工合成的。
本实施例中，M-CSF mRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。IL-10mRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。CD300F mRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。MMP16mRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。
步骤4.1，重编程M2型巨噬细胞的制备
利用bio-rad电转系统，依次将1μg/105细胞的M-CSF mRNA、1μg/105细胞的IL-10mRNA、1μg/105细胞的CD300F mRNA、1μg/105细胞的MMP16 mRNA导入到第7天的巨噬细胞中，静息过夜，收集重编程M2型巨噬细胞冻存备用。其中，电转时的电压为250V，电转时间为10ms。
步骤4.2，重编程M2型巨噬细胞的体内抗纤维化作用的检测
图1示出了本发明实施例1制备的重编程M2型巨噬细胞的体内药效检测结果。其中，图1A示出了本发明实施例1制备的重编程M2型巨噬细胞的药效试验示意图，图1B示出了肝脏组织天狼猩红和α-SMA组化染色。
利用四氯化碳(CCl4)小鼠纤维化模型检测体内抗纤维化作用：如图1A所示，CC l4腹腔注射NOG小鼠，每周2次，第6周时静脉回输重编程M2型巨噬细胞，3×106细胞/只，然后持续注射CCl4到第10周，麻醉处死小鼠，收取肝脏组织，组化染色天狼猩红和α-SMA，评估肝脏组织纤维化消退情况。
其中，空白组为不注射CCl4建模在第6周时静脉注射PBS；对照组为CCl4建模在第6周时静脉注射PBS；治疗组为CCl4建模在第6周时静脉注射实施例1制备的重编程M2型巨噬细胞。
其中，天狼猩红染色可用于区分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型胶原，可直接观察分析胶原纤维化程度；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是肝星状细胞活化的标志，已证明α-SMA在肝脏纤维化中随着纤维化程度的加重而表达增加，可以指示肝脏纤维化程度。
如图1B所示，检测结果显示经过重编程M2型巨噬细胞治疗后，小鼠肝脏中天狼猩红区域的占比下降率为74.1％，α-SMA的面积比下降率为68.7％，两者的比例均有较大幅度的下降。也就是说，本发明实施例制备的重编程M2型巨噬细胞可改善肝纤维化，具有刺激肝脏再生并改善功能。
实施例2M-CSF稳态M2型巨噬细胞制备和功能检测
步骤1，制备M-CSF稳态M2型巨噬细胞
利用bio-rad电转系统，设置电压250V，电转时间10ms，将1μg/105细胞的M-CSFmRNA导入到实施例1中制备的第7天的巨噬细胞中，静息过夜，得到M-CSF稳态M2型巨噬细胞，收集该细胞冻存。
步骤2，功能检测
检测M-CSF稳态M2型巨噬细胞的M-CSF分泌和吞噬凋亡细胞能力。其中，M-CS检测的具体操作包括：将1×106细胞数的M-CSF稳态M2型巨噬细胞和1×106细胞数的未电转M-CSF mRNA的巨噬细胞，分别培养过夜，收集上清，利用ELISA试剂盒定量检测M-CSF分泌。吞噬凋亡细胞能力检测的具体操作包括：利用紫草素诱导K562细胞凋亡，20小时收集细胞计数，然后按照靶细胞(凋亡的K562细胞)比效应细胞(电转或未电转M-CSF mRNA的M2型巨噬细胞)为2:1的比例，一起孵育4小时，最后利用流式细胞仪分析吞噬凋亡细胞的巨噬细胞百分率。
图2示出了本发明实施例2制备的M-CSF稳态M2型巨噬细胞的功能检测结果；其中，图2A示出了M-CSF稳态M2型巨噬细胞的M-CSF分泌检测结果；图2B示出了紫草素诱导K562细胞凋亡状态检测结果；图2C示出了M-CSF稳态M2型巨噬细胞吞噬凋亡细胞能力检测结果。
由图2A的实验结果可知，未电转导入M-CSF mRNA的巨噬细胞的M-CSF分泌最高值还不到40pg/mL，而电转导入M-CSF mRNA后所得的M-CSF稳态M2型巨噬细胞的M-CSF分泌明显增强，平均值为2896.0pg/mL，范围1772.0-5480.3pg/mL。并且，由图2B和图2C的实验结果可知，电转与不电转M-CSF mRNA的吞噬细胞的吞噬能力，两者没有显著差异，这指示电转M-CSF mRNA不会影响巨噬细胞吞噬能力。而在肝纤维进展的炎症状态下时，补充M-CSF有助于M2巨噬细胞抵抗炎症因子极化，维持M2型稳态，有利于帮助纤维化病变的消退。因此，本发明实施例2制备得到的M-CSF过表达巨噬细胞具有稳定M2型巨噬细胞的潜力。
实施例3抗炎M2型巨噬细胞制备和功能检测
步骤1，制备抗炎M2型巨噬细胞
利用bio-rad电转系统，设置电压250V，电转时间10ms，将1μg/105细胞的IL-10mRNA导入到实施例1中制备的第7天的巨噬细胞中，静息过夜，得到抗炎M2型巨噬细胞，收集该细胞冻存。
步骤2，功能检测
检测抗炎M2型巨噬细胞的IL-10分泌。具体操作包括：将1×106细胞数电转IL-10mRNA后得到的抗炎M2型巨噬细胞和1×106细胞数的未电转IL-10mRNA的巨噬细胞，分别独立培养过夜，收集上清，利用ELISA试剂盒定量检测两者的IL-10分泌情况。
图3示出了本发明实施例3制备的抗炎M2型巨噬细胞的IL-10分泌检测结果。如图3所示，未电转导入IL-10mRNA的巨噬细胞的IL-10分泌极少，几乎为0，而电转导入IL-10mRNA后，明显能够增强巨噬细胞IL-10分泌，平均值为2662.8pg/mL，范围1322.8-4415.3pg/mL。而抵御炎症因子对巨噬细胞极化，平衡肝纤维化炎症环境，可以加速纤维化消退和促进肝脏再生。因此，本发明实施例3制备的抗炎M2型巨噬细胞具有可加速纤维化消退和促进肝脏再生的功能。
实施例4增强吞噬M2型巨噬细胞制备和功能检测
步骤1，制备增强吞噬M2型巨噬细胞
利用bio-rad电转系统，设置电压250V，电转时间10ms，将1μg/105细胞的CD300FmRNA导入到实施例1中制备的第7天的巨噬细胞中，静息过夜，得到增强吞噬M2型巨噬细胞，收集该细胞冻存。
步骤2，功能检测
检测增强吞噬M2型巨噬细胞的CD300F mRNA表达以及吞噬凋亡细胞能力。其中，检测CD300F mRNA表达的具体操作包括：将1×106细胞数的增强吞噬M2型巨噬细胞和1×106细胞数的未电转CD300F mRNA的巨噬细胞，按照1:100稀释度孵育CD300F抗体，分别独立培养过夜，以未电转的巨噬细胞为对照，流式细胞仪分析CD300F表达率。吞噬凋亡细胞能力检测的具体操作包括：利用紫草素诱导K562细胞凋亡，20小时收集细胞计数，然后按照靶细胞(凋亡的K562细胞)比效应细胞(电转或未电转M-CSF mRNA的巨噬细胞)为2:1的比例，一起孵育4小时，最后利用流式细胞仪分析吞噬凋亡细胞的巨噬细胞百分率。
图4示出了本发明实施例4制备的增强吞噬M2型巨噬细胞的功能检测结果；其中，图4A示出了增强吞噬M2型巨噬细胞的CD300F分泌检测结果；图4B示出了增强吞噬M2型巨噬细胞吞噬凋亡细胞能力检测结果。
由图4A可知，未电转导入CD300F mRNA的巨噬细胞不表达CD300F(图4A中因其不表达，固图中未显示，仅显示了导入CD300F mRNA的实验组检测结果)，而电转导入CD300FmRNA后，能够增强巨噬细胞表达CD300F，平均值为92.1％，范围84.6-95.6％。由图4B可知，过表达CD300F增强了巨噬细胞吞噬凋亡细胞能力，平均值31.1％，范围19.5-38.5％。而巨噬细胞吞噬肝纤维化的细胞如肌成纤维细胞、肝星状细胞等，也是纤维化消退机制之一。也就是说，本发明实施例4制备的增强吞噬M2型巨噬细胞其吞噬细胞的能力得到了显著提高，有助于组织纤维化的消退。
实施例5增强ECM降解M2型巨噬细胞制备和功能检测
本实施例中，MMP14 mRNA，MMP 15mRNA，MMP 16mRNA，MMP 19mRNA分别是基于各自对应的基因序列模板人工合成的。其中，MMP16 mRNA的序列与实施例1中的序列相同，在本实施例中不做赘述；而MMP14/15/19mRNA各自的序列如下：
MMP14 mRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：5所示；MMP15 mRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；MMP19 mRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：7所示。
步骤1，制备增强ECM降解M2型巨噬细胞
利用bio-rad电转系统，设置电压250V，电转时间10ms，依次将0.25μg/105细胞的MMP14 mRNA，0.25μg/105细胞的MMP 15mRNA，0.25μg/105细胞的MMP 16mRNA，0.25μg/105细胞的MMP 19mRNA分别导入到相应的实施例1中制备的第7天的巨噬细胞中，静息过夜，得到增强ECM降解M2型巨噬细胞，收集该细胞冻存。
步骤2，功能检测
检测增强ECM降解M2型巨噬细胞的MMP活性。具体操作包括：将1×106细胞数的分别电转有MMP14/15/16/19mRNA的巨噬细胞和1×106细胞数的未电转MMP14/15/16/19mRNA的巨噬细胞，分别独立培养过夜，收集上清，离心去除细胞碎片。根据胶原蛋白酶活性检测试剂盒说明书，将细胞培养上清与底物反应，检测基质金属蛋白酶对胶原降解能力。
图5示出了本发明实施例5制备的增强ECM降解M2型巨噬细胞分泌的MMP功能检测。如图5所示，分别电转导入MMP14/15/16/19mRNA后，能够增强巨噬细胞对胶原酶的降解，其中MMP16效果最佳。而ECM降解是纤维化消退最相关的机制之一。也就是说，本发明实施例5制备的增强ECM降解M2型巨噬细胞具有较好地消退组织纤维化的功能。
对比例
本对比例的具体操作与实施例1基本相似，区别仅为：步骤4.1中，仅将1μg/105细胞的MMP16 mRNA导入到第7天的巨噬细胞中，静息过夜得到，收集重编程M2型巨噬细胞冻存备用。
重编程M2型巨噬细胞的体内抗纤维化作用的检测。本对比例采用与实施例1相同的检测方式检测重编程M2型巨噬细胞抗纤维化的效果，利用四氯化碳(CCl4)小鼠纤维化模型检测体内抗纤维化作用。
图6示出了本发明对比例制备的重编程M2型巨噬细胞的体内药效检测结果。如图6所示，检测结果显示经过本对比例制备的重编程M2型巨噬细胞治疗后，小鼠肝脏中天狼猩红染色面积的下降率实施例1和对比例的结果分别为74.1％和49.5％，α-SMA的面积比下降率实施例1和对比例的结果分别为68.7％和36.2％。由此可知，虽然单用MMP16mRNA重编程M2型巨噬细胞在降解纤维化肝脏中的胶原效果较好，但是抑制肝星状细胞活化能力较弱，而本发明提供的重编程巨噬细胞降解胶原和抑制肝星状细胞活化能力均更强。也就是说，本发明提供的重编程M2型巨噬细胞相较于单用MMP16 mRNA重编程M2型巨噬细胞，在抗纤维化作用上有较大提升，在纤维化疾病治疗中具有广阔的潜在应用市场。
综上，由实施例2-5可知，当分别向M2型巨噬细胞中导入M-CSF mRNA、IL-10mRNA、CD300F mRNA、MMP14/15/16/19mRNA后，所得到的相应重编程M2型巨噬细胞在一定程度上均有助于纤维化疾病的治疗。由实施例1和对比例可知，当同时向M2型巨噬细胞中导入M-CSFmRNA、IL-10mRNA、CD300F mRNA、MMP16mRNA后，相对于仅导入MMP16mRNA，对纤维化组织具有更明显的消退作用。
本发明实施例根据组织纤维化的病变进程特点，提出了从纤维化预防到消退纤维化再到吞噬纤维化细胞的全面、系统地纤维化疾病治疗技术构思。并根据该构思提供了胞内同时含有具有抗炎作用基因的信息载体、降解胞外基质基因的信息载体以及吞噬作用基因的信息载体的重编程巨噬细胞。在抗纤维化治疗过程中，本发明提供的重编程巨噬细胞，不仅能进一步增加炎症反应的消除和减少纤维化病变外，还能诱导抗炎途径使机能具有持久地抗炎功能，对纤维化有较好的预防功能，更能吞噬纤维化细胞，实现对纤维化细胞的消除。即，本发明实施例提供的重编程巨噬细胞是从多角度对纤维化组织进行治疗，可达到特异有效的抗纤维化目的。
特别考虑到的是，关于本发明的一个实施方案讨论的任何限制可以适用于本发明的任何其他实施方案。此外，本发明的任何组合物可用于本发明的任何方法，并且本发明的任何方法可用于制备或利用本发明的任何组合物。在实施例中阐述的实施方案的方面也是可以在不同实施例中的其他地方或本申请的其他地方，例如在发明内容、具体实施方式、权利要求和附图说明中讨论的实施方案的上下文中可以实施的实施方案。
对于方法实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。
以上对本发明所提供的一种重编程巨噬细胞、制备方法、细胞群、细胞治疗产品及其应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (23)

1.一种重编程巨噬细胞，其特征在于，所述巨噬细胞包含：具有抗炎作用基因的信息载体、具有吞噬作用基因的信息载体以及降解胞外基质基因的信息载体。
2.根据权利要求1所述的重编程巨噬细胞，其特征在于，所述抗炎作用基因包括：促M2型稳态的基因和/或促巨噬细胞极化的基因。
3.根据权利要求2所述的重编程巨噬细胞，其特征在于，所述促M2型稳态的基因为编码M-CSF的基因；
所述促巨噬细胞极化的基因为编码IL-4的基因、编码IL-10的基因和编码分泌性白细胞蛋白酶抑制剂的基因中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的重编程巨噬细胞，其特征在于，所述吞噬作用基因包括：识别PtdSer的受体的基因和/或识别PtdSer可溶性桥接蛋白的受体的基因。
5.根据权利要求4所述的重编程巨噬细胞，其特征在于，所述识别PtdSer的受体包括TIM受体、整合素、CD300受体和粘附型G蛋白偶联受体中的一种或多种；
所述识别PtdSer可溶性桥接蛋白的受体为TAM受体。
6.根据权利要求5所述的重编程巨噬细胞，其特征在于，所述TIM受体包括TIM-1、TIM-3和TIM-4中的一种或多种；和/或
所述TAM受体包括TYRO3、AXL和MER中的一种或多种；和/或
所述整合素包括αMβ2整合素、αxβ2整合素、αvβ3整合素和αvβ5整合素中的一种或多种；和/或
所述CD300受体包括CD300a、CD300b、CD300c、CD300d、CD300e、CD300f和CD300g中的一种或多种；和/或
所述粘附型G蛋白偶联受体为脑特异性血管生成抑制剂1。
7.根据权利要求1所述的重编程巨噬细胞，其特征在于，所述降解胞外基质基因包括基质降解酶的基因；其中，基质降解酶为胶原酶、明胶酶和基质金属蛋白酶中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的重编程巨噬细胞，其特征在于，所述胶原酶为MMP8、MMP1和MMP13中的一种或多种组合；
所述明胶酶为MMP2和/或MMP9；
所述基质金属蛋白酶为MMP12。
9.根据权利要求1-8任一所述的重编程巨噬细胞，其特征在于，所述信息载体为DNA、RNA、病毒、病毒核酸和纳米颗粒中的任意一种或多种组合。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的重编程巨噬细胞，其特征在于，所述巨噬细胞是M2特异性巨噬细胞。
11.一种细胞群，其特征在于，所述细胞群包含权利要求1-10中任意一项所述的重编程巨噬细胞。
12.一种细胞药物，其特征在于，所述细胞药物包含：权利要求1-10中任意一项所述的重编程巨噬细胞，或包含权利要求11所述的细胞群。
13.一种权利要求1-0任意一项所述重编程巨噬细胞或权利要求11所述细胞群在治疗纤维化疾病中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述纤维化疾病为肝纤维化、心脏纤维化、肺纤维化、关节纤维化、骨髓纤维化、纵隔纤维化、腹膜后纤维化、肾因性全身性纤维化以及瘢痕瘤、克罗恩病、乳房纤维囊肿和佩罗尼病等中的任何一种。
15.一种权利要求1-10任意一项所述重编程巨噬细胞或权利要求11所述细胞群的冻存方式。
16.一种制备权利要求1-10任意一项所述重编程巨噬细胞的方法。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
分别构建具有抗炎作用基因的信息载体、降解胞外基质基因的信息载体以及具有吞噬作用基因的信息载体；
将构建的上述三种信息载体导入巨噬细胞中。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，当所述信息载体为mRNA时，三种信息载体的载入量均为1～5μg/105细胞；或
当所述信息载体为DNA时，三种信息载体的载入量均为0.5～1μg/105细胞；或
当所述信息载体为纳米颗粒时，三种信息载体的载入量均为0.5～5μg/105细胞。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述导入的操作是利用电转系统或纳米颗粒实现的。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，利用电转系统时，所采用的电压为250～300V，电转时间为8～12ms。
21.根据权利要求17-20任意一项所述的方法，其特征在于，所述巨噬细胞由自体外周血单核细胞诱导所得。
22.根据权利要求17-20任意一项所述的方法，其特征在于，所述具有抗炎作用基因的信息载体、所述具有吞噬作用基因的信息载体以及所述降解胞外基质基因的信息载体，均是体外制备的。
23.根据权利要求17-20任意一项所述的方法，其特征在于，所述抗炎作用基因、所述吞噬作用基因以及所述降解胞外基质基因，三者的制备模板均源于巨噬细胞。
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