KR101815187B1 - 손상 조직으로 이동 능력이 향상된 중간엽 줄기세포 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PSGL1 (P-selectin glycoprotein ligand 1) 단백질을 발현하는, 분리된 중간엽 줄기세포에 sLeX (sialyl Lewis X) 당사슬 구조를 형성하는 단계를 포함하는, 손상 조직으로 이동 능력이 향상된 중간엽 줄기세포 제조 방법, 및 PSGL1 단백질을 발현하고 sLeX 당사슬 구조를 포함하는, 손상 조직으로 이동 능력이 향상된 중간엽 줄기세포, 이를 포함하는 손상 조직 치료용 조성물 및 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 손상 조직의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명을 통해 제조된 중간엽 줄기세포는 PSGL1 유전자를 발현하고 sLeX 당사슬 구조를 가져 손상 조직으로 효과적으로 이동할 수 있으므로, 손상 조직의 재생 및 치료 용도로 사용될 수 있다.

Description

손상 조직으로 이동 능력이 향상된 중간엽 줄기세포 및 이의 제조 방법 {Mesenchymal stem cells having enhanced transmigration capabilities to damaged tissue and method for producing thereof}

본 발명은 PSGL1 (P-selectin glycoprotein ligand 1) 단백질을 발현하는, 분리된 중간엽 줄기세포에 sLeX (sialyl Lewis X) 당사슬 구조를 형성하는 단계를 포함하는, 손상 조직으로 이동 능력이 향상된 중간엽 줄기세포 제조 방법, 및 PSGL1 단백질을 발현하고 sLeX 당사슬 구조를 포함하는, 손상 조직으로 이동 능력이 향상된 중간엽 줄기세포 및 이를 포함하는 손상 조직 치료용 조성물 및 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 손상 조직의 치료 방법에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cells; MSC)는 성체 줄기세포로서 자가 재생능과 골, 지방 및 연골과 같은 중간엽 계통의 조직들로 분화할 수 있는 다분화능을 가지고 있다. MSC들은 골수, 혈액, 제대혈과 지방 등과 같은 다양한 조직들로부터 분리해낼 수 있으며 시험관내 배양 조건에서 대량 증식이 가능하여 윤리적인 문제없이 세포 치료제의 원료 세포로 활용할 수 있다는 장점들을 갖고 있다. 게다가 이들은 손상된 조직 및 염증 부위로 이동할 수 있는 지향성(tropism)을 갖고 있어서 상처 치유에 도움을 주며, 여러 조건에서 면역억제 특성을 보인다. 그러나 대부분의 MSC들은 인체 주입 시에 빠른 시간 내에 제거 되며 일부 소수의 세포들만이 잔존하는 것으로 보고된 바 있다 (Lavoie et al., 2013 Biochimie). 따라서 MSC에 의한 세포 치료의 효과는 이들이 손상된 조직의 재생에 직접 참여하기 보다는 재생 촉진 인자들을 곁 분비 (paracrine secretion)하는 단기간의 역할 때문인 것으로 판단된다. 이에 MSC들을 손상 조직으로 보내기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

본래 MSC는 손상 조직 및 염증 부위로 이동하는 지향성을 가지고 있으나 이를 위한 핵심적인 부착인자 (adhesion ligands)와 케모카인 (chemokine) 수용체들은 상대적으로 소량 발현하고 있으며, 이들마저도 대량 증식을 위한 시험관 내 배양을 하는 동안 점차로 잃어버린다고 보고되었다 (Rombouts et al., 2003, Leukemia). 따라서 이들의 고발현을 유도하는 연구들이 많이 수행 되었으나 대부분의 연구들이 해당 유전자들을 효율적으로 전달하기 위한 벡터로 바이러스 시스템을 사용하여 인간을 대상으로 하는 임상에 적용하기 힘들다는 단점을 가지고 있다.

한편, 중간엽 줄기세포는 백혈구와 같은 혈액세포들보다 손상 조직 및 염증 부위로 이동하는 능력이 미약한 편이다. 백혈구의 경우 표면에는 P/E-셀렉틴 (selectin)의 리간드인 PSGL1 (P-selectin glycoprotein ligand 1) 단백질과 sLeX (sialyl Lewis X) 당사슬이 있어서, 활성화된 내피세포의 표면에 발현된 P/E-셀렉틴과 결합하여 접착과 이동 (transmigration)을 통해서 혈관벽을 손쉽게 빠져나간다. 즉 평상 시에는 혈관 속을 빠른 속도로 통과하는데 조직 손상이나 염증 반응에 의해서 활성화된 혈관벽의 내피세포들을 만나게 되면 PSGL1과 sLeX 당사슬 들이 P/E-셀렉틴과 결합하여 롤링 (rolling)을 하면서 속도가 느려지고 이어서 접착 및 이동을 거쳐서 혈관벽을 빠져나가 상처 및 염증 부위로 이동하는 것이다. 이에 반해 중간엽 줄기세포는 이러한 접착분자와 당사슬이 없어 이동 능력이 백혈구보다 미약한 것으로 알려져 있다.

상기 문제점들을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 손상 조직으로 이동 능력이 향상된 중간엽 줄기세포를 제조하기 위해 예의 노력한 결과, 중간엽 줄기세포에 PSGL1을 발현시키고 sLeX 당사슬을 형성시킨 경우 중간엽 줄기세포의 손상 조직 및 염증 부위로 이동하는 지향성이 향상되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 PSGL1 (P-selectin glycoprotein ligand 1) 단백질을 발현하는, 분리된 중간엽 줄기세포에 sLeX (sialyl Lewis X) 당사슬 구조를 형성하는 단계를 포함하는, 손상 조직으로 이동 능력이 향상된 중간엽 줄기세포 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 PSGL1 (P-selectin glycoprotein ligand 1) 단백질을 발현하고 sLeX (sialyl Lewis X) 당사슬 구조를 포함하는, 손상 조직으로 이동 능력이 향상된 중간엽 줄기세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 중간엽 줄기세포를 포함하는, 손상 조직 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 손상 조직의 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 PSGL1 (P-selectin glycoprotein ligand 1) 단백질을 발현하는, 분리된 중간엽 줄기세포에 sLeX (sialyl Lewis X) 당사슬 구조를 형성하는 단계를 포함하는, 손상 조직으로 이동 능력이 향상된 중간엽 줄기세포 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 “줄기세포 (stem cells)”란 적합한 환경 및 자극을 통해 각종 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있으며, 자가증식 (self-renewal) 능력을 갖추고 있는 세포를 말한다.

본 발명에서 용어 “중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSC)”란 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포를 말한다. 중간엽 줄기세포는 다분화능 (multipotency)을 가고, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 지방, 양수 등 기타 조직 등에도 존재하는 것으로 알려져 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 골수, 혈액, 제대혈, 지방, 양수, 피부 유래인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 그 유래 조직에 관계없이 중간엽 줄기세포의 일반적인 특징인 중간엽 계열 (mesodermal lineage)의 세포 (예컨대, 골, 지방 및 연골 등)로 분화할 수 있는 세포라면 본 발명의 범위에 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 동물 유래의 중간엽 줄기세포를 모두 포함하며, 상기 동물은 손상 조직이 발생하여 본 발명의 중간엽 줄기세포를 통해 치료가 가능한 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

중간엽 줄기세포는 상기 설명한 바와 같이 다분화능 (multipotency)을 가지며, 손상 조직을 회복시킬 수 있는 다양한 성장인자 (growth factor), 및 사이토카인 (cytokine) 등을 분비하여 손상 조직을 직접적 또는 간접적으로 회복시킬 수 있다. 다만, 중간엽 줄기세포는 조혈모세포 (hematopoietic stem cells) 또는 백혈구 (leukocyte) 등과는 달리 체내에서 손상 조직으로 이동하는 능력이 떨어지므로, 본 발명자들은 중간엽 줄기세포의 손상 조직으로 이동 능력을 향상시키기 위하여 PSGL1 (P-selectin glycoprotein ligand 1) 단백질을 발현하고 sLeX (sialyl Lewis X) 당사슬 구조를 가지는 중간엽 줄기세포를 제조하였다. 이와 같이 제조된 중간엽 줄기세포는 야생형 중간엽 줄기세포, PGSL1 단백질만 발현하는 중간엽 줄기세포, 또는 sLeX 당사슬 구조만 가지는 중간엽 줄기세포에 비하여 손상 조직으로 이동하는 능력이 현저히 향상될 수 있다.

감염 또는 상처에 의한 염증 반응은 혈관 벽으로의 백혈구의 부착에 의해 시작된다. 셀렉틴은 염증이 나타나는 동안 제1 백혈구-내피 세포 및 백혈구-혈소판 상호작용을 매개하는 당단백질의 패밀리를 나타낸다. 상기 셀렉틴 패밀리는 NH₂-말단 렉틴 도메인에 이어서, EGF-유사 도메인, 일련의 컨센서스 반복부, 막횡단 도메인, 및 짧은 세포질 꼬리를 포함한다. 셀렉틴의 렉틴 도메인은 특이적인 당접합체 리간드와 상호작용하여 세포 부착을 용이하게 한다. 대부분의 백혈구 상에서 발현되는 L-셀렉틴은 일부 내피 세포 및 다른 백혈구 상의 리간드에 결합한다. 사이토카인 활성화된 내피 세포 상에서 발현되는 E-셀렉틴은 대부분의 백혈구 상의 리간드에 결합한다. 활성화된 혈소판 및 내피 세포 상에서 발현되는 P-셀렉틴 또한 대부분의 백혈구 상의 리간드에 결합한다.

본 발명에서 용어 “PSGL1 (P-selectin glycoprotein ligand 1)”은 SELPLG 또는 CD162 (분화 클러스터 162)로도 명명되며, L-셀렉틴, E-셀렉틴 및 P-셀렉틴의 세 가지 모든 셀렉틴에 대한 인간 뮤신-유형 당단백질 리간드이다. 예를 들어, 상기 PSGL1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 인간 유래 PSGL1일 수 있고, 구체적으로 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 셀렉틴에 대한 당단백질 리간드로 작용할 수 있다면 상기 서열의 단편 또는 일부 서열의 부가, 결실, 치환된 형태를 모두 포함할 수 있다. PSGL1은 2 개의 120 kD 서브유닛을 갖는 디설파이드 결합된 동종이량체이며, 단핵구, 림프구, 과립구 및 일부 CD34⁺ 줄기세포에서 발현된다. PSGL1은 셀렉틴의 부착 상호작용을 용이하게 하기 때문에 여러 염증성 장애에서 병리적 백혈구 동원에 기여하는 경향이 있으나, 중간엽 줄기세포는 PSGL1이 발현되지 않아 상대적으로 손상 부위로 이동이 어렵다.

이에, 본 발명자들을 중간엽 줄기세포의 손상 부위로의 이동 능력을 향상시키기 위하여, 중간엽 줄기세포에 상기 PSGL1 단백질을 발현시키고자 하였다. 이를 위하여 이에 제한되는 것은 아니나, PSGL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 중간엽 줄기세포에 도입 (transfection)할 수 있다. 구체적으로 상기 벡터는 미니서클 (minicircle) 벡터일 수 있고, 상기 도입은 전기천공법 (electroporation), 더욱 구체적으로 마이크로포레이션 (microporation)에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 중간엽 줄기세포에서 특정 유전자를 발현시킬 수 있는 방법으로 당업계에 공지된 방법이라면 본 발명의 범위에 모두 포함될 수 있다. 당업자는 적절한 방법을 선택하여 PSGL1 단백질을 중간엽 줄기세포에서 발현시킬 수 있다.

중간엽 줄기세포는 일반적인 플라스미드 벡터로는 유전자 전달이 잘 되지 않는 형질전환이 어려운 (hard-to-transfect) 세포로서, 중간엽 줄기세포에서 유용 유전자들을 발현하기 위해서는 바이러스 시스템을 많이 이용해왔다. 그러나 바이러스 벡터들은 예상하지 못한 염색체 삽입 (chromosomal integration)과 종양 형성 및 면역 반응 유발 가능성 등으로 임상에는 적용하지 못한다는 문제점을 가지고 있어, 바이러스 벡터를 이용하지 않는 비바이러스성 유전자 전달 시스템 (non-viral gene delivery) 개발을 위한 연구들이 활발히 이루어져왔다.

이러한 시도들 중에 개발된 미니서클 (minicircle)은 세균 유래 플라스미드 백본 (backbone) 서열을 제거한 최소화된 진핵생물 발현 카세트 벡터로서 세균에서 유래된 CpG 모티프 (motif)가 제거되어 발현율과 발현 지속 시간이 길다는 장점을 가지고 있다. 미니서클은 보통 모플라스미드 (parental plasmid)를 증폭한 후에 위치 특이적 재조합 (site-specific recombinantion)을 통해서 세균 유래 백본 서열을 제거하여 만든다. 최근에는 유전 공학을 통해서 만들어진 대장균을 이용하여 아라비노스 유도 (arabinose induction) 시스템을 이용한 재조합 및 이어지는 세균 유래 서열들의 분해를 통해서 손쉽게 미니서클을 제조하는 방법이 발표된 바 있다. 따라서 미니서클을 이용하여 PSGL1을 중간엽 줄기세포에서 발현시킬 경우, 바이러스 벡터로부터 야기될 수 있는 부작용을 최소화할 수 있으며 동시에 중간엽 줄기세포에서 PSGL1을 지속적으로 발현시킴으로써 손상 조직으로의 이동 능력 향상을 기대할 수 있다.

구체적인 일 실시예에서, 본 발명자들은 상기 PSGL1의 발현을 위해, 임상 적용이 가능한 비바이러스성 유전자 전달 시스템으로 PSGL1 유전자를 포함하는 미니서클 (minicircle)을 마이크로포레이션 (microporation) 방법을 이용하여 중간엽 줄기세포에 도입 (transfection)하였고, 이를 통해 PSGL1을 세포 표면에 발현시켰다 (도 7 내지 도 10).

본 발명에서 용어 "sLeX (sialyl Lewis X)"은 보통 세포 표면의 O-글리칸에 부착되는 4당류 탄수화물을 말하며, "sLeX 당사슬"은 sLeX가 부착된 당사슬을 말한다. 상기 PSGL1과 마찬가지로 sLeX는 셀렉틴과 결합할 수 있으므로, 중간엽 줄기세포 표면에 sLeX 당사슬 구조를 형성함으로써 중간엽 줄기세포의 손상 조직으로의 이동 능력을 향상시킬 수 있다.

중간엽 줄기세포에서 sLeX 당사슬 구조를 형성하기 위한 구체적인 방법으로, 이에 제한되는 것은 아니나 푸코실전이효소 (fucosyltransferase) 효소 반응을 이용하여 중간엽 줄기세포의 표면에 sLeX 당사슬을 형성시켜주거나, 이를 세포 표면에 부착시키는 방법을 이용할 수 있다.

상기 푸코실전이효소는 구체적으로 알파-1,3-푸코실전이효소 VI (alpha-1,3-fucosyltransferase VI, Fut6)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 푸코실전이효소는 예를 들어, 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니며 푸코실전이 활성을 가지는 효소라면 상기 서열의 단편 또는 일부 서열의 부가, 결실, 치환된 형태를 모두 포함할 수 있다.

상기 푸코실전이효소는 푸코실전이효소를 발현하는 세포를 배양한 배양액으로부터 수득한 것을 이용할 수 있고, 또는 화학적 합성 방법을 이용하거나 상업적으로 판매하는 것을 구매하여 사용할 수 있으며, 푸코실전이 활성을 가지는 효소라면 그 종류나 유래에 특별히 제한되지 않는다.

구체적으로 푸코실전이효소를 세포에 처리하는 경우, 처리 시간은 1 분 내지 120 분 처리하는 것일 수 있으며, 처리 농도는 1 μU 내지 500 μU일 수 있으나 중간엽 줄기세포에 sLeX 당사슬 구조를 형성시킬 수 있는 조건은 모두 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 본 발명에서 푸코실전이효소 1 유닛 (unit)은 1 분 동안 1 μmol의 푸코스를 부가하는 양으로 정의된다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 중간엽 줄기세포 표면에 sLeX 당사슬을 형성하기 위해 먼저 인간 유래 알파-(1,3)-푸코실전이효소 (alpha-(1,3)-fucosyltransferase VI, Fut6)를 발현하는 세포주 FT293-Fut6를 제작하였고 (도 1), 이의 분비 발현을 유도한 후 세포 배양액을 농축하여 기질인 GDP-푸코스 (fucose)와 함께 중간엽 줄기세포에 처리하였다 (도 2 내지 도 4). 그 결과, sLeX 당사슬이 세포 표면에 형성되는 것을 확인하였으며 (도 5), sLeX 당사슬이 없는 중간엽 줄기세포에 비하여 생쥐의 손상 조직으로 이동 능력이 증가한 것을 확인하였다 (도 6).

나아가, 미니서클을 이용하여 PSGL1을 분비 발현하도록 제조한 중간엽 줄기세포에 Fut6 농축액을 이용하여 중간엽 줄기세포 표면에 sLeX를 형성하도록 한 뒤 손상 조직으로 이동 능력을 확인한 결과, sLeX 당사슬만 형성된 중간엽 줄기세포 및 PSGL1만 발현하는 중간엽 줄기세포에 비하여 이동 능력이 크게 증가된 것을 확인하였다 (도 11).

따라서, 본 발명의 제조 방법을 통해 제조된 중간엽 줄기세포는 PSGL1 단백질을 발현하고 sLeX 당사슬을 포함하여 손상 조직으로 이동 능력이 현저히 향상된 것으로, 이를 이용하여 손상 조직을 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명은 또 다른 양태로서 PSGL1 (P-selectin glycoprotein ligand 1) 단백질을 발현하고 sLeX (sialyl Lewis X) 당사슬 구조를 포함하는, 손상 조직으로 이동 능력이 향상된 중간엽 줄기세포를 제공한다.

상기 PSGL1 단백질, sLeX 당사슬, 및 중간엽 줄기세포에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명은 또 다른 양태로서 상기 중간엽 줄기세포를 포함하는, 손상 조직 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "손상 조직"은 다양한 물리, 화학적 요인에 의해 손상된 조직을 의미하는 것으로, 구체적으로 상처 또는 염증성 조직일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 손상 조직으로 중간엽 줄기세포가 이동하게되면, 중간엽 줄기세포가 상기 조직을 구성하는 세포로 직접 분화하거나 또는 중간엽 줄기세포에서 분비되는 다양한 성장인자, 및 사이토카인 등에 의해 상기 조직을 간접적으로 회복시킴으로써 손상 조직을 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어 "치료"는 본 발명의 상기 조성물을 손상 조직을 가지는 개체에 투여하여 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명의 손상 조직 치료용 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 공인된 손상 조직 치료 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "약제학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 손상 조직 치료용 조성물은 약제학적으로 유효한 양의 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 손상 조직 치료용 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 손상 조직 치료용 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있고, 상기 조성물의 특성상 특히 비경구 경로를 통한 투여일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 손상 조직 치료용 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

본 발명은 또 다른 양태로서 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 손상 조직의 치료 방법을 제공한다.

상기 조성물, 투여 및 손상조직의 치료는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명을 통해 제조된 중간엽 줄기세포는 PSGL1 유전자를 발현하고 sLeX 당사슬 구조를 가져 손상 조직으로 효과적으로 이동할 수 있으므로, 손상 조직의 재생 및 치료 용도로 사용될 수 있다.

도 1은 인간 유래 푸코실전이효소 VI (fucosyltransferase VI, Fut6)를 생산을 위한 FT293-Fut6 세포주 제작 과정을 모식화한 것이다.
도 2는 FT293-Fut6 세포 배양액으로부터 얻어진 Fut6 농축액의 활성을 분석한 결과이다. (A) FT293-Fut6 세포 배양액을 농축하여 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate　polyacrylamide gel electrophoresis)(좌측) 및 웨스턴블랏 (Western blot) (우측)으로 분석하였으며, 32 kDa의 Fut6에 해당하는 밴드는 화살표로 표시하였다. (B) APTS-LNnT를 기질로 하여 Fut6 농축액의 푸코스 부가 활성을 DNA sequencer를 이용하여 분석하였다. (C) Fut6 농축액에 의해서 시간 별로 푸코스가 부가된 LNnT의 비율을 그래프로 나타내었다.
도 3은 Fut6 농축액을 이용하여 hBM-MSC 세포의 표면에 sLeX 구조를 형성할 수 있는지를 유세포분석을 이용하여 확인한 것이다. 처리한 Fut6 농축액의 활성 유닛에 따른 sLeX가 형성된 세포의 비율을 표시하였다.
도 4는 Fut6 농축액 반응에 따른 hBM-MSC 세포의 생존율 변화를 트립판 블루 염색을 이용하여 분석한 결과이다. Fut6 농축액 반응 전 (흰색 막대)과 반응 후 (검은색 막대)의 생존율을 표시하였다.
도 5는 근적외선 형광을 내는 양자점을 이용하여 hBM-MSC 세포를 표지한 결과를 보여준다. (A) Qtracker cell labeling kit를 이용하여 염색된 hBM-MSC 세포를 유세포분석으로 확인한 결과이다. (B) 동일한 방법으로 염색된 hBM-MSC를 콘포칼 형광 현미경으로 분석한 결과이다. 핵은 DAPI (파랑)로 염색하였고, 세포막은 alexa488로 표지 된 anti-CD44 항체(녹색)으로 염색하였으며, 양자점으로부터 나오는 800 nm 형광은 빨간색으로 표시하였다.
도 6은 근적외선 형광 양자점으로 표지 된 hBM-MSC 세포의 손상 조직으로 이동을 분석한 결과이다. (A) hBM-MSC 세포를 생쥐의 꼬리 정맥에 주사한 다음 8 일 후 근적외선 형광 이미지를 Excitation: 670 nm, Emission: 840/80 nm, Exposure time: 0.02 s의 조건에서 분석하였다. (B) 생쥐 상처 조직의 동결절편에 대한 근적외선 형광 이미지를 분석하였으며, 양자점으로 염색된 hBM-MSC 세포가 빨간색 점으로 관찰된다 (화살표 표시).
도 7은 미니서클 벡터 구축을 이미지화한 것이다. (A) 미니서클 벡터가 모플라스미드 (parental plasmid)로부터 유도 과정을 거쳐 미니서클과 박테리아 백본 (bacterial backbone)으로 나뉘지는 것을 보여주는 모식도이다. (B) 및 (C) 각각 CMV와 EF1 alpha 프로모터를 가진 미니서클-EGFP 벡터를 maxiprep으로 뽑아서 겔 추출 (gel extraction) 과정을 거친 다음, DNA를 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 것이다.
도 8는 EGFP 리포터 유전자 발현을 위한 미니서클을 Lipofectamine을 이용하여 세포 내로 도입한 결과를 나타낸다. (A) EGFP 형광을 내는 세포 (GFP⁺ 세포)의 비율로서 형질전환 효율을 보여주며, 1 νg의 pcDNA3.1-EGFP, McCMV-EGFP 및 McEF1-EGFP를 HEK293T 세포(흰색 막대), hAT-MSCs (회색 막대) 및 hBM-MSC (검은색 막대) 세포에 도입한 후 3 일째에 분석 하였다. 세 번의 실험 결과의 평균이고 표준편차도 같이 표시하였다. (B) 트립판 블루 (Trypan blue) 염색을 통해 세포 생존율을 확인한 것이다. (C) 형질전환 된 HEK293T (위), hAT-MSC (중간), 및 hBM-MSC (아래)의 형광 이미지를 보여준다.
도 9는 EGFP 리포터 유전자 발현을 위한 미니서클을 마이크로포레이션 방법을 이용하여 세포 내로 도입한 결과를 나타낸다. (A) EGFP 형광을 내는 세포(GFP⁺ 세포)의 비율로서 형질전환 효율을 보여주며, 1 νg의 pcDNA3.1-EGFP, McCMV-EGFP 및 McEF1-EGFP를 HEK293T 세포(흰색 막대), hAT-MSCs (회색 막대) 및 hBM-MSC (검은색 막대) 세포에 도입한 후 3 일째에 분석 하였다. 세 번의 실험 결과의 평균이고 표준편차도 같이 표시하였다. (B) 트핍판 블루 염색을 통해 세포 생존율을 확인한 것이다. (C) 형질전환 된 HEK293T (위), hAT-MSC (중간), 및 hBM-MSC (아래)의 형광 이미지를 보여준다.
도 10은 마이크로포레이션 방법을 이용하여 McCMV-PSGL1을 hAT-MSC 세포에 도입하였을 때 세포 표면의 PSGL1 발현을 유세포분석 방법으로 분석한 결과를 보여준다.
도 11은 hAT-MSC에 PSGL1이 발현되고 sLeX 당사슬이 형성되었을 때 생쥐에서 손상된 조직으로 이동능력이 증가함을 보여준다. (A) 생쥐의 등의 피부에 퍼치 (punch)를 이용하여 상처를 내고 그 부위를 SDF-1을 포함하는 마트리젤 (matrigel)로 채웠다 (화살표). Indocyanine green으로 염색된 hAT-MSC를 꼬리 정맥에 주입하였을 때 우선적으로 생쥐의 폐로 모인다. 아무런 처리를 하지 않은 hAT-MSC (B), PSGL1만 발현된 hAT-MSC (C), sLeX 당사슬이 표면에 형성된 hAT-MSC (D), PSGL1이 발현되고 sLeX 당사슬이 형성된 세포(E)들을 상기의 생쥐에 주입한 후 시간 별로 상처 부위의 근적외선 형광을 관찰하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 푸코실전이효소 ( Fucosyltransferase ) VI 발현 벡터 및 생산 세포주 제작

인간 유래 알파-1,3-푸코실전이효소 VI (alpha-1,3-fucosyltransferase VI, Fut6) 발현용 벡터 제작을 위해서 한국생명공학 연구원 유전자은행 (http://genebank.kribb.re.kr)에서 인간 Fut6 cDNA 클론 (KU033024)을 분양 받고, 이를 주형으로 하여 두 번의 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)으로 해당 유전자를 증폭하였다 (도 1).

우선 Fut6_F1 (서열번호 1)과 Fut6_R (서열번호 3) 프라이머를 이용하여 첫 번째 PCR을 수행하여 증폭한 DNA 절편을 정제하고, 이를 다시 주형으로 하여 Fut6_F2 (서열번호 2)와 Fut6_R (서열번호 3) 프라이머를 이용한 두 번째 PCR을 수행하여 DNA 절편을 얻었다. 이렇게 증폭하여 얻은 DNA 절편을 BamHI과 XhoI 제한효소를 사용하여 Flp-In T-REX 시스템 (Life technologies, Waltham, MA, USA)의 pcDNA5/FRT/TO 벡터에 클로닝하여, pcDNA5/FRT/TO-Fut6 벡터를 제작하였다.

Fut6_F1: 5'-CGGGATCCGGCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCT-3' (서열번호 1)

Fut6_F2: 5'-CTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCTCCTATCTGCGTGTGTCTC-3' (서열번호 2)

Fut6_R: 5'-CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGTGAACCAAGCCGCTAT-3' (서열번호 3)

이렇게 제작된 pcDNA5/FRT/TO-Fut6 벡터와 Flp-In T-REX 시스템의 pOG44 벡터를 제조사에서 제공하는 방법에 따라 1:9 비율로 Flp-In T-REX 293 세포에 Lipofectamine 2000 (Life technologies)을 사용하여 도입 (transfection)하였다 (도 1). 그리고 하이그로마이신 (hygromycin) B 150 νg/ml 농도에서 살아남는 클론 중 테트라사이클린 (tetracycline)으로 발현을 유도하였을 때 Fut6를 고발현하는 세포주를 선별하여 FT293-Fut6 세포주로 명명하였다 (도 2의 A).

실시예 2: Fut6의 발현 및 농축

상기 실시예 1에서 제작한 FT293-Fut6 세포주를 고농도의 포도당 (4.5 g/l), 15 νg/ml 블라스티시딘 (blasticidin), 150 νg/ml 하이그로마이신 (hygromycin) B 및 5 % FBS (fetal bovine serum) 가 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagel Medium) 배지에서 배양한 후 40 장의 150 mm 배양접시에 각각 1 x 10⁷ 세포가 되도록 준비하였다. 그리고 동일한 배지로 이틀 동안의 안정화 과정을 거친 후 배지를 제거하고, PBS (phosphate-buffered saline) 20 ml로 3 번 세척하였다. 세척 후 100 U/ml 페니실린, 100 νg/ml 스트렙토마이신 및 1 νg/ml 테트라사이클린을 함유하고 FBS가 없는 DMEM 배지를 각각 30 ml 씩 넣고 24 시간 동안 Fut6 발현을 유도하였다.

이렇게 Fut6가 발현된 1.2 L의 배양액을 수득하고 0.22 νm 필터 (Sarstedt, Numbrecht, Germany)를 이용하여 불순물인 입자들을 제거한 후에 500 νl의 단백질분해효소 칵테일 억제제 (protease cocktail inhibitor, Roche, Basel, Switzerland)와 PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)가 최종 2 mM이 되도록 넣어 주었다. 그리고 Labscale TFF 시스템 (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA)과 pelicon XL filter 30 K (Millipore)를 사용하여 100 ml까지 농축하였다. 그리고 HBSS (Hank's balanced salt solution)를 넣어주면서 반복하여 농축하여 HBSS로 버퍼를 교환하였다. HBSS로 버퍼를 교환한 후 최종 15 ml로 농축이 되면 다시 Amicon Ultra 10 K (Millipore)와 원심분리기를 사용하여 1 ml까지 농축시킨 후 분주하여 -70 ℃에서 보관하였다. 최종 농축된 용액에서 Fut6 는 SDS-PAGE와 웨스턴블랏 (Western blot) 분석을 이용하여 확인하였다 (도 2의 A).

실시예 3: 농축된 배양액의 Fut6 활성 측정

상기 실시예 2에서 발현하여 농축한 Fut6 용액의 푸코실전이효소 (fucosyltransferase) 활성은 DNA sequencer 분석 방법을 이용하여 수행하였다. 구체적으로 푸코실전이효소 반응의 기질로는 LNnT (Lacto-N-neotetraose, Prozyme, Hayward, CA, USA)를 APTS (8-aminopyrene-1,3, 6-trisulfonic acid trisodium salt)로 표지 하여 사용하였다. APTS 표지와 APTS 표지 된 LNnT (APTS-LNnT)를 정제한 후 454 nm에서 APTS의 흡광도를 측정하여 APTS-LNnT의 농도를 결정하였다.

푸코실전이효소 반응은 0.01 % BSA (bovine serum albumin)와 2 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)가 포함된 HBSS 용액 6 νl, 1/10로 희석한 Fut6 농축액 1 νl, 0.2 νM APTS-LNnT 1 νl, 및 1 mM GDP-L-푸코스 (Fucose) 2 νl를 넣어서 반응을 진행하였다. 시간 별 (0, 5, 10, 30, 60, 및 90분)로 반응 한 후, 95 ℃에 5 분간 방치하여 반응을 끝내고 이를 건조시켰다.

상기의 건조된 시료에 증류수 10 νl를 넣어 용해시킨 뒤 DNA sequencer를 이용한 분석을 실시하여 APTS-LNnT에 푸코스가 부가된 피크가 시간에 따라서 증가하는 것을 확인하였다 (도 2의 B). 초기 5 분에 푸코스가 부가된 피크가 검출되기 시작하였으며, 피크의 면적을 구하여 푸코스가 부가된 피크의 비율을 구하였을 때 30 분에서 75 %로 나타났고, 60 분에는 거의 100 %를 차지하는 것을 확인하였다 (도 2의 C). 푸코실전이효소 1 유닛 (unit)을 1 분 동안 1 νmol의 푸코스를 부가하는 양으로 정의하였을 때, Fut6 농축액은 1.1 mU/ml로 계산되었다.

실시예 4: Fut6 농축액을 이용한 MSC의 sLeX ( sialyl Lewis X) 구조 형성

상기 실시예 2와 3을 통하여 준비하고 푸코실전이효소 활성이 측정된 Fut6 농축액을 이용하여 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC)의 세포 표면에 sLeX 구조를 형성하였다.

인간 골수에서 유래된 MSC (Lonza, Basel, Switzerland) 1 x 10⁶ 개의 세포를 PBS로 2 번 세척한 후에 HBSS 600 ㎕에 현탁 하였다. 그리고 20 mM HEPES, 1 mM GDP-L-푸코스 및 0.1 % BSA를 첨가한 후, Fut6 농축액을 각각 0, 10, 100, 및 300 μU으로 넣고 37 ℃에서 300 rpm으로 교반하면서 1 시간 동안 반응시켰다.

상기의 반응 후에 MSC를 수득한 후 sLeX에 대한 항체인 항-CD15s (BD, East Rutherford, New Jersey, USA)를 이용하여 유세포 분석 (flow cytometry)을 수행하였다 (도 3).

그 결과 사용한 Fut6 농축액의 유닛 양에 따라서 sLeX가 형성된 세포의 비율이 증가하는 것을 관찰하였다. 구체적으로, 10 μU Fut6 농축액을 사용하였을 때 88 %의 세포가 sLeX를 형성하였으며, 100 μU 사용 시에 99 %의 세포가 sLeX를 형성하였다.

Fut6 농축액을 이용한 반응에서 MSC의 생존 능력 (viability)의 변화가 있는지를 측정하기 위해 트립판 블루 (trypan blue, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 염색을 이용하여 제조사에서 제공하는 방법에 따라서 죽은 세포의 숫자를 확인하였다. Fut6 농축액을 이용한 반응을 한 경우에도 모두 90 % 이상의 생존율을 유지하는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).

실시예 5: 근적외선 형광 양자점을 이용한 MSC의 표지

근적외선 형광은 조직 투과성이 높아서 생쥐와 같은 소동물 영상 실험에 유용하게 사용된다. 인간 골수 유래 MSC를 800 nm의 근적외선 형광을 내는 양자점 Qdot800이 포함된 Qtracker cell labeling kit (Life technologies)를 이용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라서 표지 하였다. MSC가 양자점으로 잘 표지 되었는지는 유세포분석과 콘포칼 (confocal) 형광 현미경을 이용하여 확인하였다.

먼저, 10 nM의 양자점을 37 ℃에서 4 시간 동안 MSC와 인큐베이션하고 유세포분석을 수행한 결과, 98 % 이상의 MSC가 표지 되는 것을 확인하였다 (도 5의 A). 다음으로, 콘포칼 형광 현미경을 이용하여 양자점이 세포 표면이 아니라 세포 안으로 들어가서 표지 된 것을 확인하였다 (도 5의 B).

실시예 6: 생쥐에서 MSC의 손상 조직으로 이동 관찰

인간 골수 유래 MSC를 사용하였기 때문에 동물 실험을 위해서는 면역 기능이 결핍 된 NOD/SCID 생쥐 (6주령/암컷)를 사용하였다. 생쥐의 손상 조직은 등 부위에 5 mm의 생검 펀치 (biopsy punch)를 이용하여 상처를 내었다. 그 다음 실시예 5의 방법을 통해 수득한 Qdot800으로 표지된 1 x 10⁶ 개의 MSC 세포를 꼬리 정맥에 주사하였다. Fut6 농축액을 이용하여 sLeX 구조가 형성된 MSC와 대조군 MSC를 주사한 후 이들의 근적외선 형광을 2 일 간격으로 8 일 동안 관찰하였다. 도 6의 A는 8일 후의 생쥐의 형광 이미지를 보여주며 상처부위에서 자가형광이 관찰되는 반면에 Fut6 농축액으로 반응한 MSC 세포가 주입된 생쥐는 상처의 치유로 인해서 자가 형광이 관찰되지 않았다. 그리고 8 일째 되는 날 생쥐를 희생하여 해부를 하고 상처 조직의 동결절편 (cryosection)의 근적외선 형광 이미지를 관찰하였을 때, Fut6 농축액으로 반응시킨 MSC가 주입된 생쥐의 상처 조직에서 근적외선 형광을 내는 세포들을 관찰할 수 있었다 (도 6의 B).

실시예 7: 리포터 유전자를 발현하는 미니서클 ( Minicircle ) 벡터의 제작

MSC에 원하는 유전자를 효과적으로 발현하기 위해서는 주로 바이러스를 이용한 유전자 전달 방법을 사용하나 인체에 적용하는 경우에 안전성 문제가 있어서 임상에는 사용하지 못한다. 이에, 상기 문제점을 해결하기 위한 비바이러스성 유전자 전달 방법으로 미니서클을 이용한 리포터 벡터를 제작하였다.

먼저 CMV 또는 EF1α 프로모터가 있는 미니서클의 모플라스미드 (parental plasmid)인 pMC.CMV-MCS-SV40polyA (MN501A-1)와 pMC.EF1-MCS-SV40polyA (MN502A-1)를 System Biosciences, Inc (Mountain View, CA, USA)로 부터 구입하였다. 리포터로는 EGFP 유전자를 pIRES2-EGFP (Clontech, Palo Alto, CA, USA)를 주형으로 하여 Mc-EGFP_F (서열번호 4)와 Mc-EGFP_R (서열번호 5) 프라이머를 이용한 PCR로 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편은 XbaI과 EcoRI 제한효소를 이용하여 각각 pMC.CMV-MCS-SV40polyA와 pMC.EF1-MCS-SV40polyA 플라스미드에 클로닝하여 최종적으로 pP-McCMV-EGFP와 pP-McEF1-EGFP 벡터를 제작하였다.

Mc-EGFP_F: 5'- GCTCTAGAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3' (서열번호 4)

Mc-EGFP_R: 5'- GTCGAGCTAGCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCC-3' (서열번호 5)

미니서클과 비교할 대조군으로 일시적인 발현 벡터로 널리 활용되는 pcDNA3.1 플라스미드 (Life Technologies)에도 pcDNA3.1-EGFP_F (서열번호 6)와 pcDNA3.1-EGFP_R (서열번호 7) 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭한 EGFP 유전자를 BamHI과 NheI 제한효소를 이용하여 클로닝하여 pcDNA3.1-EGFP를 제작하였다.

pcDNA3.1-EGFP_F: 5'- CTAGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3' (서열번호 6)

pcDNA3.1-EGFP_R: 5'- CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3' (서열번호 7)

실시예 8: 미니서클의 제작 및 정제

미니서클의 제조를 위해서 모플라스미드 (parental plasmid)인 pP-McCMV-EGFP와 pP-McEF1-EGFP 벡터를 각각 대장균 ZYCY10P3S2T 균주 (System Biosciences, Inc)에 형질전환으로 도입하였다. 콜로니 중 하나를 선택하여 제조사에서 제공한 방법에 따라서 배양과 미니서클 제조를 위한 아라비노스 유도 (arabinose induction)를 수행한 후 이를 수득하였다 (도 7의 A). 이렇게 수득한 대장균 침전물로부터 NucleoBond^® Xtra Maxi Plus plasmid purification kit (Macherey-Nagel, Duren, Germany)를 이용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 플라스미드를 정제하였다 (도 7의 B의 2 열). 그리고 미니서클의 순도를 더 높이기 위해서 전기영동한 아가로스 겔 (agarose gel)의 미니서클에 해당하는 밴드를 잘라낸 다음, 이로부터 GeneJET Gel Extraction Kit (Thermoscientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 McCMV-EGFP와 McEF1-EGFP 미니서클을 고순도로 정제하였다.

실시예 9: 리포터 미니서클을 이용한 형질전환 조건 확립

미니서클 1 νg을 Lipofectamine 2000 (Life Technologies)을 이용하여 제조사에서 제공한 방법을 따라서 HEK293T 세포, 인간 골수 유래 MSC (human bone marrow-derived MSC, hBM-MSC) 및 인간 지방조직 유래 MSC (human adipose tissue-derived MSC, hAT-MSC)에 도입하였다 (도 8). HEK293T 세포에서는 미니서클이 높은 효율로 도입된 반면에 hBM-MSC와 hAT-MSC에서는 McCMV-EGFP와 McEF1-EGFP 모두 매우 낮은 효율로 도입되었다.

이에, Lipofectamine 대신 새로운 전기천공법 (electroporation)인 마이크로포레이션 (microporation)을 이용하여 미니서클의 도입을 시도하였다. Life Technology의 Neon^TM transfection system을 이용하여 제조사에서 제공하는 방법을 따랐다.

우선, 도입하고자 하는 세포들을 수득한 후에 PBS로 세척하고 제조사에서 제공하는 재현탁 완충액 R에 웰 당 1 x 10⁶ 세포를 재현탁 하고 1 ㎍의 미니서클 또는 플라스미드를 섞어 주었다. 그리고 최적의 마이크로포레이션 조건을 찾기 위해서 다양한 조건에서 도입을 수행하였으며, 그 조건은 다음과 같다.

제1조건 [990 voltage, 40 ms, one pulse],

제2조건 [1000 voltage, 30 ms, three pulses],

제3조건 [1300 voltage, 30 ms, two pulses],

제4조건 [1500 voltage, 20 ms, one pulse],

제5조건 [1500 voltage, 20 ms, two pulses].

상기 조건들을 이용하여 pcDNA3.1-EGFP, McCMV-EGFP 및 McEF1-EGFP를 hAT-MSC (표 1)와 hBM-MSC 세포 (표 2)에 마이크로포레이션 방법으로 도입하여 EGFP 형광을 내는 세포들의 비율과 생존율을 분석하였다.

분석 결과 hAT-MSC와 hBM-MSC 모두 제1조건에서 도입 효율뿐만 아니라 세포의 생존 능력도 가장 좋은 것을 확인하여, 제1조건을 선택하였다 (도 9). 반면에 HEK293T 세포의 경우에는 제5조건에서 가장 좋은 도입 효율을 보여 주었다.

hAT-MSC를 위한 마이크로포레이션 조건

	GFP positive (%)			Viability (%)
	pcDNA3.1	McCMV	McEF1	pcDNA3.1	McCMV	McEF1
제1조건	14.6	66.8	42.0	90.2	90.2	90.4
제2조건	6.6	29.1	37.5	40.8	24.8	22.4
제3조건	0.3	1.4	4.9	4.7	4.2	1.0
제4조건	3.1	51.8	58.5	6.9	39.6	65.9
제5조건	0	2.3	19	12.6	4.6	6.4

hBM-MSC를 위한 마이크로포레이션 조건

	GFP positive (%)			Viability (%)
	pcDNA3.1	McCMV	McEF1	pcDNA3.1	McCMV	McEF1
제1조건	19	63.2	41.3	79.1	82.0	88.4
제2조건	1.1	18.5	19.7	26.8	45.6	21.5
제3조건	0.3	8.1	3.9	6.9	7.0	11.9
제4조건	1.6	45.5	24.7	19.7	61.6	76.1
제5조건	0.3	16.1	2.3	7.4	3.8	3.6

실시예 10: PSGL1 발현을 미니서클 벡터의 제작 및 준비

인간 유래 PSGL1 (P-selectin glycoprotein ligand 1)을 발현시키기 위해서 해당 유전자를 Sino Biological Inc (Beijing, China)에서 구입하였다. 그리고 이를 주형으로 하고 Mc-PSGL1_F (서열번호 8)와 Mc-PSGL1_R (서열번호 9) 프라이머를 이용하여 PSGL1 유전자를 증폭하고, BamHI과 EcoRI 제한효소를 이용하여 pMC.CMV-MCS-SV40polyA 벡터에 클로닝하여 pP-McCMV-hPSGL1을 제작하였다.

Mc-PSGL1_F: 5'-GCTCTAGAGCCACCATGGCAGTGGGGGCCAG-3' (서열번호 8),

Mc-PSGL1_R: 5'-GGAATTCCTAAGGGAGGAAGCTGTG-3' (서열번호 9).

그 다음 모플라스미드 (parental plasmid)인 pP-McCMV-hPSGL1로부터 미니서클 McCMV-PSGL1의 제작 및 정제는 실시예 8과 동일한 방법으로 수행하여 준비하였다.

실시예 11: McCMV - PSGL1의 도입

상기 실시예 10에서 제작하고 준비한 McCMV-PSGL1을 hAT-MSC에 실시예 9에서 사용하였던 마이크로포레이션 방법으로 도입하였다. 도입 후 hAT-MSC를 72 시간 동안 배양하고, 항-PSGL1 항체(Sino Biological Inc, Beijing, China)를 이용한 유세포분석으로 세포 표면에 PSGL1이 발현되는지 분석하였다. 그 결과, 약 22 %의 세포에서 PSGL1의 표면 발현을 확인하였다 (도 10).

실시예 12: PSGL1에 sLeX 형성을 통한 이동 능력 증가 확인

상기 실시예 11에서와 동일한 방법으로 McCMV-PSGL1이 도입된 hAT-MSC를 3 일간 배양한 후 실시예 4에서와 동일한 방법으로 Fut6 농축액을 처리하였다. 그리고 실시예 11 및 4에서와 동일한 방법으로 hAT-MSC의 세포 표면에서 PSGL1의 발현과 sLeX의 형성을 유세포분석으로 확인하였다.

그 다음, PSGL1이 발현되고 sLeX가 형성된 hAT-MSC, PSGL1만 발현된 hAT-MSC, sLeX만 형성된 hAT-MSC 및 아무런 처리도 하지 않은 hAT-MSC 세포를 근적외선 형광을 내는 Indocyanine green (Dongin-Dang Pharmaceuticals, Seoul, Korea)을 이용하여 염색하였다(Boddington et al., 2010, Cell Transplant).

구체적으로, Indocyanine green 분말을 20 % DMSO가 포함된 DMEM 배지에 녹여 1 mg/ml 농도의 저장 (stock) 용액을 만든 후, 60 ㎕/ml 농도로 세포에 처리하여 30 분 동안 37 ℃의 세포 배양기에서 배양시켜 염색하였다.

그 다음, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 생쥐의 피부 조직을 손상 시킨 후, 세포의 이동을 유도하는 케모카인 (chemokine)인 재조합 SDF-1a 단백질 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) 1 mg을 섞은 50 ml의 마트리젤 (matrigel, Corning, Corning, NY, USA)을 손상 부위에 이식하였다. 그리고 이 생쥐의 꼬리 정맥에 Indocyainine green으로 염색된 상기의 hAT-MSC 1 x 10⁶ 세포를 주입하고 시간 별로 IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA)를 이용하여 근적외선 형광(excitation 745nm, emission 840nm) 이미지를 분석하여 hAT-MSC의 이동을 추적하였다. 그 결과 PSGL1이 발현되고 sLeX가 형성된 hAT-MSC가 가장 이동 능력이 뛰어난 것을 관찰하였다(도 11).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Mesenchymal stem cells having enhanced transmigration capabilities to damaged tissue and method for producing thereof <130> KPA150874-KR <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fut6 F1_primer <400> 1 cgggatccgg catgggatgg agctgtatca tcctcttctt ggtagcaaca gct 53 <210> 2 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fut6 F2_primer <400> 2 cttcttggta gcaacagcta caggtgtcca ctcctcctat ctgcgtgtgt ctc 53 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fut6 R_primer <400> 3 ccgctcgagt cagtggtggt ggtggtggtg ggtgaaccaa gccgctat 48 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC-EGFP_F_primer <400> 4 gctctagagc caccatggtg agcaagggcg ag 32 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC-EGFP_R_primer <400> 5 gtcgagctag cgaattctta cttgtacagc tcgtcc 36 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA3.1-EGFP_F_primer <400> 6 ctagctagca tggtgagcaa gggcgag 27 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA3.1-EGFP_R_primer <400> 7 cgggatcctt acttgtacag ctcgtccatg 30 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mc-PSGL1_F_primer <400> 8 gctctagagc caccatggca gtgggggcca g 31 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mc-PSGL1_R_primer <400> 9 ggaattccta agggaggaag ctgtg 25 <210> 10 <211> 428 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSGL1 <400> 10 Met Ala Val Gly Ala Ser Gly Leu Glu Gly Asp Lys Met Ala Gly Ala 1 5 10 15 Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn 20 25 30 Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu 35 40 45 Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr 50 55 60 Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg 65 70 75 80 Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser 85 90 95 Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly 100 105 110 Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu 115 120 125 Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu Ile Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala 130 135 140 Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Val Pro Thr Glu Ala Gln Thr Thr 145 150 155 160 Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Arg Leu Thr Ala Thr Glu 165 170 175 Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Gly Leu Glu Ala Gln 195 200 205 Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala 210 215 220 Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr 225 230 235 240 Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Glu Ala Thr Glu 245 250 255 Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu 260 265 270 Ala Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro Ser Ala Thr Glu Ala Leu 275 280 285 Ser Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu Phe Ile Pro Phe Ser Val 290 295 300 Ser Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro Met Ala Ala Ser Asn Leu Ser 305 310 315 320 Val Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His Ile Ser Val Lys Gln Cys 325 330 335 Leu Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu Val Ala Thr Ile Phe Phe Val 340 345 350 Cys Thr Val Val Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr 355 360 365 Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu Met Val Cys Ile Ser Ser Leu 370 375 380 Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu 385 390 395 400 Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg 405 410 415 Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu His Ser Phe Leu Pro 420 425 <210> 11 <211> 1287 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSGL1 <400> 11 atggcagtgg gggccagtgg tctagaagga gataagatgg ctggtgccat gcctctgcaa 60 ctcctcctgt tgctgatcct actgggccct ggcaacagct tgcagctgtg ggacacctgg 120 gcagatgaag ccgagaaagc cttgggtccc ctgcttgccc gggaccggag acaggccacc 180 gaatatgagt acctagatta tgatttcctg ccagaaacgg agcctccaga aatgctgagg 240 aacagcactg acaccactcc tctgactggg cctggaaccc ctgagtctac cactgtggag 300 cctgctgcaa ggcgttctac tggcctggat gcaggagggg cagtcacaga gctgaccacg 360 gagctggcca acatggggaa cctgtccacg gattcagcag ctatggagat acagacgacc 420 cagcctgccg caaccgaggc ccagaccacg cagcccgtgc ccacggaggc gcagacgacg 480 cccctggccg ccaccgaagc ccagacaact cgactgacgg ccacggaggc acagaccact 540 ccactggcag ccacagaggc acagaccact ccaccagcag ccacggaagc acagaccact 600 caacccacag gcctggaggc acagaccact gcaccagcag ccatggaggc acagaccact 660 gcaccagcag ccatggaagc acagaccact ccaccagcag ccatggaggc acagaccact 720 caaaccacag ccatggaggc acagaccact gcaccagaag ccacggaggc acagaccact 780 caacccacag ccacggaggc acagaccact ccactggcag ccatggaggc cctgtccaca 840 gaacccagtg ccacagaggc cctgtccatg gaacctacta ccaaaagagg tctgttcata 900 cccttttctg tgtcctctgt tactcacaag ggcattccca tggcagccag caatttgtcc 960 gtcaactacc cagtgggggc cccagaccac atctctgtga agcagtgcct gctggccatc 1020 ctaatcttgg cgctggtggc cactatcttc ttcgtgtgca ctgtggtgct ggcggtccgc 1080 ctctcccgca agggccacat gtaccccgtg cgtaattact cccccaccga gatggtctgc 1140 atctcatccc 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Trp Ser Gly Gln Pro Ala His Pro Pro Leu Asn Leu Ser Ala Lys 165 170 175 Thr Glu Leu Val Ala Trp Ala Val Ser Asn Trp Gly Pro Asn Ser Ala 180 185 190 Arg Val Arg Tyr Tyr Gln Ser Leu Gln Ala His Leu Lys Val Asp Val 195 200 205 Tyr Gly Arg Ser His Lys Pro Leu Pro Gln Gly Thr Met Met Glu Thr 210 215 220 Leu Ser Arg Tyr Lys Phe Tyr Leu Ala Phe Glu Asn Ser Leu His Pro 225 230 235 240 Asp Tyr Ile Thr Glu Lys Leu Trp Arg Asn Ala Leu Glu Ala Trp Ala 245 250 255 Val Pro Val Val Leu Gly Pro Ser Arg Ser Asn Tyr Glu Arg Phe Leu 260 265 270 Pro Pro Asp Ala Phe Ile His Val Asp Asp Phe Gln Ser Pro Lys Asp 275 280 285 Leu Ala Arg Tyr Leu Gln Glu Leu Asp Lys Asp His Ala Arg Tyr Leu 290 295 300 Ser Tyr Phe Arg Trp Arg Glu Thr Leu Arg Pro Arg Ser Phe Ser Trp 305 310 315 320 Ala Leu Ala Phe Cys Lys Ala Cys Trp Lys Leu Gln Glu Glu Ser Arg 325 330 335 Tyr Gln Thr Arg Gly Ile Ala Ala Trp Phe Thr 340 345 <210> 13 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fut6 <400> 13 atgggatgga gctgtatcat 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aggagctgga caaggaccac 900 gcccgctacc tgagctactt tcgctggcgg gagacgctgc ggcctcgctc cttcagctgg 960 gcactcgctt tctgcaaggc ctgctggaaa ctgcaggagg aatccaggta ccagacacgc 1020 ggcatagcgg cttggttcac ccaccaccac caccaccact gactcgag 1068

Claims (14)

1. PSGL1 (P-selectin glycoprotein ligand 1) 단백질을 발현하는, 분리된 중간엽 줄기세포의 표면에 직접적으로 sLeX (sialyl Lewis X) 당사슬 구조를 형성하는 단계를 포함하는, 손상 조직으로 이동 능력이 향상된 중간엽 줄기세포 제조 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 PSGL1 단백질을 발현하는 중간엽 줄기세포는 PSGL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 중간엽 줄기세포에 도입하여 제조한 것인, 제조 방법.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 벡터는 미니서클 (minicircle) 벡터인 것인, 제조 방법.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 도입은 마이크로포레이션 (microporation)을 이용하여 수행되는 것인, 제조 방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 골수, 혈액, 제대혈, 지방, 양수, 피부 유래인 것인, 제조 방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 sLeX 당사슬 구조를 형성하는 단계는, 중간엽 줄기세포에 푸코실전이효소 (fucosyltransferase)를 처리하여 수행되는 것인, 제조 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 푸코실전이효소는 알파-1,3-푸코실전이효소 VI (alpha-1,3-fucosyltransferase VI)인 것인, 제조 방법.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 푸코실전이효소는 푸코실전이효소를 발현하는 세포를 배양한 배양액으로부터 수득한 것인, 제조 방법.
   
9. 제6항에 있어서, 상기 처리 시간은 1 분 내지 120 분 처리하는 것인, 제조 방법.
   
10. 제6항에 있어서, 상기 처리 농도는 1 μU 내지 500 μU으로 처리하는 것인, 제조 방법.
    
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