KR20220100757A

KR20220100757A - 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20220100757A
Application number: KR1020210002528A
Authority: KR
Inventors: 태기융; 사후 아비식; 양희석; 전진
Original assignee: 광주과학기술원; 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2022-07-18
Also published as: US20220265724A1; KR102476845B1

Abstract

본 발명의 일 실시예는 프러시안 블루 나노입자 및 줄기세포를 포함하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, ROS 소거능 및 항염증 특성을 갖는 프러시안 블루 나노입자의 도입으로 손상 부위에서의 산화 스트레스 저항성, 생착률 및 생존률이 향상되어 치료 성능이 향상된 줄기세포 치료제 및 이의 제조방법을 제공 가능한 효과가 있다.

Description

프러시안 블루 나노입자를 포함하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제 및 이의 제조방법{Stem cell therapeutic agent for anti-inflammatory or damaged tissue regeneration containing Prussian blue nanoparticles, and method for manufacturing the same}

본 발명은 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

허혈-재관류 손상(ischemia/reperfusion(I/R) injury)이란, 장기 또는 조직이 혈류 장애(허혈)로 인한 일정 기간의 저산소 상태 후 혈류 회복(재관류)을 겪는 병태생리학적 상태를 일컫는다. 조직에 혈액 공급이 차단되거나 상실되어 갑작스런 허혈이 일어나게 되면 허혈된 조직의 기능장애와 괴사가 발생하게 되는데, 이러한 허혈된 조직에 산소와 영양분을 공급하고 재생을 위해 혈액을 다시 공급하는 것이 필수적이다. 그러나 허혈 기간에 발생한 손상보다 재관류 시 조직 손상이 더 심하게 일어날 수 있다. 급성 허혈-재관류 손상은 인체의 모든 기관 및 조직에 영향을 미치며 심각한 경우 사망에 이르게 할 수 있어 적절한 치료가 중요하다.

최근 줄기세포 도입을 통한 세포 치료 방식이 허혈-재관류 손상을 치료하기 위한 유망한 방식으로 부상하기 시작했다. 상처 부위에 대한 줄기세포의 도입은 손상된 세포나 조직의 자가 치유 및 재생을 유도할 수 있다. 실제로, 허혈-저관류 손상에서의 줄기세포의 직접 이식 또는 전신 주입은 내인성 회복 과정을 가속화하고 심장, 간, 신장, 장 등의 허혈-저관류 손상에서 사망률을 감소시키는 것으로 연구되었다.

그러나 조직 손상 부위에는 염증이나 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 다량으로 존재하므로 줄기세포가 생존하기에 열악한 환경이다. 이러한 조직 손상 부위에 줄기세포를 이식하게 되면 높은 산화 스트레스 환경으로 인하여 도입된 줄기세포의 생존과 생착을 저해하므로 치료 효과가 현저히 낮아지게 된다는 문제점이 있어 이를 개선하기 위한 연구 개발이 필요한 실정이었다.

대한민국 등록특허 제1815187호

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, ROS 소거능 및 항염증 특성을 갖는 프러시안 블루 나노입자의 도입을 통해 손상 부위에서의 산화 스트레스 저항성, 생착률 및 생존률이 향상되어 치료 성능이 향상된 줄기세포 치료제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 특수한 제조방법이나 번거로운 공정 과정 없이도 줄기세포와 프러시안 블루 나노입자를 함께 배양하는 것만으로 간단하게 제조 가능한 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제를 제공한다.

상기 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제는, 프러시안 블루 나노입자; 및 줄기세포;를 포함하는 것일 수 있다.

이때, 상기 프러시안 블루 나노입자는, 상기 줄기세포의 세포 내부로 함침되어 존재하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 프러시안 블루 나노입자는, ROS 소거 특성을 갖는 것을 특징으로 하고,

상기 줄기세포는, 상기 프러시안 블루 나노입자로 인하여 향상된 산화 스트레스 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 줄기세포는, 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 프러시안 블루 나노입자는, 평균 입경 30 nm 내지 50 nm 를 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 줄기세포는, 상기 프러시안 블루 나노입자 25 ㎍/mL 내지 500 ㎍/mL 농도에서 배양된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 줄기세포는, 상기 프러시안 블루 나노입자와 3 시간 내지 48 시간 동안 함께 배양된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 치료제는, 주사액 제형인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제의 제조방법을 제공한다.

상기 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제의 제조방법은, 프러시안 블루 나노입자를 준비하는 단계; 상기 프러시안 블루 나노입자가 줄기세포의 세포 내부에 함침되도록 상기 프러시안 블루 나노입자와 줄기세포를 함께 배양하는 단계; 및 상기 단계로부터 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 줄기세포를 수득하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

상기 프러시안 블루 나노입자와 줄기세포를 함께 배양하는 단계에서는, 상기 프러시안 블루 나노입자의 농도 25 ㎍/mL 내지 500 ㎍/mL 에서 배양하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 프러시안 블루 나노입자와 줄기세포를 함께 배양하는 단계에서는, 상기 프러시안 블루 나노입자와 3 시간 내지 48시간 동안 함께 배양하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, ROS 소거능 및 항염증 특성을 갖는 프러시안 블루 나노입자의 도입으로 손상 부위에서의 산화 스트레스 저항성, 생착률 및 생존률이 향상되어 치료 성능이 향상된 줄기세포 치료제를 제공 가능한 효과가 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 특수한 제조방법이나 번거로운 공정 과정 없이도 줄기세포와 프러시안 블루 나노입자를 함께 배양하는 것만으로 간단하게 제조 가능한 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제의 제조방법을 제공 가능한 효과가 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 제조예 및 비교예에 따라 제조된 MSC 및 PB-MSC 세포를 칼세인-AM 및 PI로 염색하여 생존 여부를 확인한 형광 현미경 이미지이다.
도 2는 본 발명의 비교예 및 제조예에 따라 제조된 MSC 및 PB-MSC 세포의 특성을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 비교예 및 제조예에 따라 제조된 MSC 및 PB-MSC 세포의 세포 내 PB 함침을 확인하기 위한 공초점 형광 현미경 이미지이다.
도 4는 본 발명의 비교예 및 제조예에 따라 제조된 MSC 및 PB-MSC 세포의 전분화능 및 다분화능을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 비교예 및 제조예에 따라 제조된 MSC 및 PB-MSC 세포의 체외 파라크린 활성 및 체외 항염증 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 비교예 및 제조예에 따라 제조된 MSC 및 PB-MSC 세포의 IRI 치료 활성을 혈청 분석 및 손상 간 조직의 조직병리학적 특성 분석을 통해 나타낸 그래프 및 이미지이다.
도 7은 본 발명의 비교예 및 제조예에 따라 제조된 MSC 및 PB-MSC 세포의 IRI 치료 활성을 확인하기 위하여 I/R 손상 간 조직을 H&E 염색하여 나타낸 이미지이다.
도 8은 본 발명의 비교예 및 제조예에 따라 제조된 MSC 및 PB-MSC 세포의 생체 내 항산화 활성 확인을 위한 이미지 및 그래프이다.
도 9는 본 발명의 비교예 및 제조예에 따라 제조된 MSC 및 PB-MSC 의 생체 내 항염증 활성을 확인하기 위한 그래프 및 이미지이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제를 설명한다.

본 발명에서 사용하는 용어 “줄기세포 치료제”는, 세포의 조직과 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologus), 동종(allogenic), 또는 이종(xenogenic)의 줄기세포를 이용하여 체외에서 증식 및 선별하고 체내에 도입함으로써 조직의 재생 치료에 사용하는 치료제를 의미한다.

줄기세포를 손상된 조직 부위에 이식하여 손상 조직을 치료하는 방법은 줄기세포의 면역 조절 및 파라크린(Paracrine) 효과를 통해 손상 부위의 자가 치유 및 재생을 가능하게 하는 유망한 치료 방법이다. 그러나, 전술한 바와 같이 줄기세포를 조직 손상 부위에 이식하는 경우 손상 부위의 높은 산화 스트레스 환경으로 인하여 줄기세포의 생존 및 생착력이 떨어져 치료 효과가 감소되는 문제점이 있었다.

이에 착안하여, 본 발명은 프러시안 블루 나노입자를 줄기세포에 도입하여 상기 줄기세포의 산화 스트레스 저항성을 향상시켜 손상된 조직 부위의 열악한 환경에서의 생존력 및 생착력을 향상시킴으로써, 줄기세포를 통한 치료 효율을 향상시킨 줄기세포 치료제를 개발하기에 이르렀다.

또한, 상기 프러시안 블루 나노입자는, ROS 소거 특성을 갖는 것을 특징으로 하고, 상기 줄기세포는, 상기 프러시안 블루 나노입자로 인하여 향상된 산화 스트레스 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 프러시안 블루 나노입자(PB 나노입자)는, 페로시안화 철의 수화물로, 푸른 빛깔을 띠는 것을 특징으로 하며, 종래 주로 세슘이나 탈륨에 노출된 환자의 치료를 위해 사용되거나, 자기공명영상(MRI)을 위한 생체 적합성 조영제로 개발되어, 근적외선을 열로 변환하는 기능 덕분에 광열 암 치료에도 사용되어 FDA에서 승인되어 그 생체 안정성이 이미 입증된 바 있는 물질이다.

또한, 상기 프러시안 블루 나노입자는, 세포 내 ROS 소거능 및 염증성 사이토카인의 발현 억제를 통한 항염증 활성 특성을 갖는다. 이러한 특성으로 인하여, 본 발명과 같이 줄기세포에 상기 PB 나노입자를 도입하게 되면, PB 나노입자의 ROS 소거능 및 항염증 활성으로 인하여 줄기세포의 산화 스트레스 저항성을 향상시킬 뿐 아니라, 이를 통해 조직 손상 부위에 다량으로 존재하는 염증이나 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)으로 인한 산화 스트레스 환경에서의 줄기세포 생착력 및 생존력을 높임으로써 세포 치료 효과를 호적하게 향상시킬 수 있다.

특히, 본 발명의 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제는, 허혈-재관류 손상을 치료하기 위하여 손상 부위에 다량으로 존재하는 염증이나 활성산소종으로부터 줄기세포를 보호하고 생착 및 생존을 조력함으로써 허혈-재관류 손상 치료 효율을 향상시킬 수 있다.

이때, 상기 줄기세포는, 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

일반적으로, 줄기세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포, 역분화줄기세포 등으로 분류할 수 있다. 이 중에서도 성체 줄기세포(adult stem cell)는 우리 몸의 다양한 장기에 존재하면서 신체가 손상되었을 때 재생 작용을 하는 세포로서 대표적으로 골수, 탯줄 등에 있는 조혈줄기세포, 중간엽줄기세포 등이 있다.

그 중에서도 줄기세포 재생 치료에는 다른 줄기세포에 비해 안전성, 분리 및 배양 기술 등의 표준화, 대량생산 시 저렴한 비용 등의 장점을 지닌 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)가 가장 손쉽게 이용될 수 있는 특징을 가지므로 본 발명에 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 조직 손상 치료를 위해 이용될 수 있는 공지의 줄기세포라면 제한 없이 이용 가능하다.

상기 프러시안 블루 나노입자는, 평균 입경 30 nm 내지 50 nm 를 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 평균 입경 40 nm를 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 줄기세포는, 상기 프러시안 블루 나노입자 25 ㎍/mL 내지 500 ㎍/mL 농도에서 배양된 것을 특징으로 하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 100 ㎍/mL 내지 300 ㎍/mL 농도에서, 가장 바람직하게는, 200 ㎍/mL에서 배양된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 프러시안 블루 나노입자의 농도가 25 ㎍/mL 미만일 경우, 상기 프러시안 블루 나노입자의 상기 줄기세포 보호 효과 및 상기 줄기세포의 산화 스트레스 저항성 향상 효과가 미미하여 바람직하지 않다.

상기 프러시안 블루 나노입자의 농도가 500 ㎍/mL 이상인 경우, 줄기세포의 생존률이 감소할 수 있어 바람직하지 않다.

따라서, 본 발명의 상기 줄기세포는, 상기 프러시안 블루 나노입자 25 ㎍/mL 내지 500 ㎍/mL 농도에서 배양된 것을 특징으로 하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 100 ㎍/mL 내지 300 ㎍/mL 농도에서, 가장 바람직하게는, 200 ㎍/mL에서 배양된 것이 가장 바람직하다.

상기 줄기세포는, 상기 프러시안 블루 나노입자와 3 시간 내지 48 시간 동안, 가장 바람직하게는, 24시간 동안 함께 배양된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 배양 시간이 3시간 미만인 경우, 상기 프러시안 블루 나노입자가 줄기세포 내부로 충분히 함침되지 못하여 상기 줄기세포 보호 효과 및 상기 줄기세포의 산화 스트레스 저항성 향상 효과가 미미하여 바람직하지 않다.

상기 배양 시간이 48시간 초과인 경우, 배양 시간을 이 이상 늘리더라도 줄기세포 내부로 함침되는 프러시안 블루 나노입자가 일정 수준 이상 증가하지 않으므로 효율적이지 않다.

따라서, 상기 줄기세포는, 상기 프러시안 블루 나노입자와 3 시간 내지 48 시간 동안, 가장 바람직하게는, 24시간 동안 함께 배양된 것이 가장 바람직하다.

상기 줄기세포 치료제는, 주사액 제형인 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 줄기세포 치료제로 사용되기 위하여 적절한 제형 및 성상이라면 제한 없이 이용 가능하다.

상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, ROS 소거능 및 항염증 특성을 갖는 프러시안 블루 나노입자의 도입으로 손상 부위에서의 산화 스트레스 저항성, 생착률 및 생존률이 향상된 줄기세포 치료제를 제공 가능한 효과가 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제의 제조방법을 설명한다.

이때 상기 실시예의 구성요소들 중 일부는 전술한 실시예의 구성요소들과 동일하며, 이에 따라 동일한 구성요소들에 대한 설명은 생략하거나 간단하게 기재하고, 추가된 구성요소들에 대해서 주로 설명하기로 한다.

상기 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제의 제조방법은, 프러시안 블루 나노입자를 준비하는 단계; 상기 프러시안 블루 나노입자가 줄기세포의 세포 내부에 함침되도록 상기 프러시안 블루 나노입자와 줄기세포를 함께 배양하는 단계; 및 상기 단계로부터 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 줄기세포를 수득하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 프러시안 블루 나노입자와 줄기세포를 함께 배양하는 단계에서는, 상기 프러시안 블루 나노입자의 농도 25 ㎍/mL 내지 500 ㎍/mL 농도에서 배양하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

따라서, 상기 프러시안 블루 나노입자와 줄기세포를 함께 배양하는 단계에서는, 상기 프러시안 블루 나노입자 25 ㎍/mL 내지 500 ㎍/mL 농도에서, 더욱 바람직하게는, 100 ㎍/mL 내지 300 ㎍/mL 농도에서, 가장 바람직하게는, 200 ㎍/mL에서 배양되는 것이 가장 바람직하다.

상기 프러시안 블루 나노입자와 줄기세포를 함께 배양하는 단계에서는, 상기 프러시안 블루 나노입자와 3시간 내지 48시간 동안 함께 배양하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

따라서, 상기 프러시안 블루 나노입자와 줄기세포를 함께 배양하는 단계에서는, 상기 프러시안 블루 나노입자와 3 시간 내지 48 시간 동안, 가장 바람직하게는, 24시간 동안 함께 배양되는 것이 가장 바람직하다.

상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 특수한 제조방법이나 번거로운 공정 과정 없이도 줄기세포와 프러시안 블루 나노입자를 함께 배양하는 것만으로 간단하게 제조 가능한 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제의 제조방법을 제공 가능한 효과가 있다.

이하에서는 제조예, 비교예 및 실험예를 통해 본 발명에 대해 더욱 상세하게 설명한다. 하지만 본 발명이 하기 제조예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1 내지 5> 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 중간엽 줄기세포(PB-MSC)의 제조

본 발명의 일 실시예에 따른 가능한 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제를 제조하기 위하여, 프러시안 블루 나노입자가 함침된 중간엽 줄기세포를 제조하였다.

상기 프러시안 블루 나노입자가 함침된 중간엽 줄기세포를 제조하기 위하여, 먼저 평균 크기가 ~ 40nm 인 PB 나노입자를 합성하였다. 그 다음, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(MSC)를 5% CO₂ 분위기, 37℃에서 10% FBS와 1% 항생제 및 항진균제가 보충 된 MEMα에서 세포를 배양하여 준비하였다. 그 다음, MSC를 96-well 세포 배양 플레이트에 시드하고, 각각 25 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL, 500㎍/mL의 PB 나노입자와 함께 24시간동안 배양하였다.

<제조예 6 내지 10> 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 중간엽 줄기세포(PB-MSC)의 제조

상기 제조예 1에서 배양시간을 48시간으로 한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 공정 조건으로 제조예 6 내지 10을 제조하였다.

<비교예 1> 대조군 중간엽 줄기세포의 제조

상기 제조예 1에서, MSC 배양 시 PB 나노입자를 첨가하지 않고(0 ㎍/mL) 배양한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 공정 조건으로 비교예 1을 제조하였다.

<비교예 2> 대조군 중간엽 줄기세포의 제조

상기 제조예 6에서, MSC 배양 시 PB 나노입자를 첨가하지 않고(0 ㎍/mL) 배양한 것을 제외하고는 상기 제조예 6과 동일한 공정 조건으로 비교예 2를 제조하였다.

<실험예 1> PB 나노입자의 생체 적합성 확인 실험

본 발명의 PB 나노입자의 생체 적합성을 확인하는 실험을 진행하였다. 이를 위하여, 먼저 제조예 및 비교예에 따라 배양된 줄기세포를 세척하고 37℃에서 2시간 동안 MTT 시약이 포함 된 새로운 배지에서 배양하였다. 마지막으로 세포 내부에 형성된 포르마잔 결정을 DMSO에 용해시키고 VarioskanTM LUX 마이크로 플레이트 판독기(Thermo-Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)로 590nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 세포의 생존 여부는 세포를 칼세인-AM 및 PI를 포함하는 염색약과 함께 30분간 배양함으로써 확인하였다. 염색 후, 살아있는(녹색) 및 죽은(적색) 세포를 형광 현미경(Nikon TE2000-U, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

도 1은 제조예 및 비교예에 따라 제조된 본 발명의 PB 나노입자를 처리한 MSC 세포를 칼세인-AM 및 PI로 염색하여 생존 여부를 확인한 형광 현미경 이미지이다.

도 1을 참조하면, 칼세인-AM 염색에 해당하는 밝은 녹색 형광 신호를 통해 PB 나노입자로 처리된 거의 모든 MSC 세포가 생존 가능함을 확인할 수 있으며, 이를 통해, PB 나노입자의 생체 적합성을 확인할 수 있다. 다만, 500 ㎍/mL 이상의 PB 나노입자 처리 시 죽은 세포에 해당하는 적색 형광 신호가 관찰되는 것으로 보아 500 ㎍/mL 이상의 PB 나노입자는 MSC 세포 생존에 부정적 영향을 미친다는 것 또한 확인할 수 있다.

도 2는 본 발명의 비교예 및 제조예에 따라 제조된 PB-MSC 세포의 특성을 분석하여 나타낸 그래프이다.

도 2의 (a)는 비교예 및 제조예에 따라 제조된 PB-MSC 세포의 생존력을 나타낸 그래프이다.

도 2의 (a)를 참조하면, 24시간 또는 48 시간 동안 PB와 함께 배양 한 후 MSC의 생존력에는 유의한 감소가 관찰되지 않는 것을 확인할 수 있다. MSC의 최대 200 μg/mL까지의 PB 나노입자의 존재 하에서 거의 100% 생존 가능하고 대사 활성을 나타내었으며, 세포 생존율은 48시간 동안 매우 높은 농도의 PB (500 μg/mL)로 배양 한 후 84 ± 4 %로 약간 감소한 것을 확인할 수 있다. 따라서, 500 μg/mL 이하의 PB 나노입자 처리는 MSC의 생존력에 영향을 주지 않는다는 것을 확인할 수 있다.

도 2의 (b)는 PB 나노입자 처리 시간에 따라 PB-MSC 세포 내 PB 나노입자의 함침을 PB 입자의 철 이온을 분석하여 확인한 그래프이다.

도 2의 (b)를 참조하면, 배양 시간뿐만 아니라 PB 농도가 증가함에 따라 세포 내 철 농도가 증가하는 것을 확인할 수 있다. 24시간 동안 200 μg/mL의 PB와 함께 배양 된 MSC는 MSC의 정상 철 수준보다 약 5배 높은 가장 높은 세포 내 철 함량을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 반면에 배양 시간을 24시간에서 48시간으로 늘려도 세포 철분 수준은 더 이상 증가하지 않는 것으로 보아, 200 μg/mL의 PB에서 24시간 동안 배양하는 것이 PB 나노입자를 MSC에 함침하기 위한 최적 조건임을 확인할 수 있다.

<실험예 2> 프러시안 블루 나노입자의 중간엽 줄기세포 함침 확인 실험

본 발명의 PB 나노입자의 MSC 함침을 확인하는 실험을 진행하였다. 이를 위하여, 먼저 37℃에서 배양된 제조예 및 비교예에 따른 세포를 준비하여 세포를 세척하고 1N 수산화 나트륨 용액으로 용해시켰다. 용해 된 샘플은 ferrozine 기반 비색 분석에 의해 세포 내 철 농도의 정량화에 의해 분석되었다.

PB 나노입자의 세포 내 흡수는 공초점 형광 현미경으로 분석되었다. 양전하 형광 염료인 프로피듐 요오드화물(PI)은 나노 입자 합성 동안 정전기 상호 작용을 통해 음전하 PB로 캡슐화되었다. PI 캡슐화 된 PB 나노 입자는 MSC와 함께 2 시간 동안 배양되어 이미징을 위해 세척되었다.

도 3은 본 발명의 비교예 및 제조예에 따라 제조된 PB-MSC 세포의 세포 내 PB 함침을 확인하기 위한 공초점 형광 현미경 이미지이다.

도 3의 (a)를 참조하면, 세포 내 PI 형광 신호는 세포의 세포질 전체에서 명확하게 관찰되는 것을 확인할 수 있다(도 3의 (a)). 유리 PI는 살아있는 세포에 불침투성이기 때문에 세포 내 형광 신호는 PI 캡슐화 된 PB 나노입자에서 나와야하므로, 이를 통해 PB 나노입자의 세포 흡수를 확인할 수 있다.

도 3의 (b)를 참조하면, 형광 신호가 대부분 세포의 중앙 영역에 있음을 확인할 수 있다. 이를 통해, PB 나노입자는 세포 표면에만 결합 된 것이 아니라 대부분 세포 내부에 함침되어 있음을 확인할 수 있다.

<실험예 3> 산화 스트레스 저항성 및 세포 내 ROS 소거능 측정 실험

본 발명의 비교예 및 제조예에 따른 MSC 및 PB-MSC세포의 산화 스트레스 저항성 및 세포 내 ROS 소거능을 확인하는 실험을 진행하였다. 과산화수소(H₂O₂)는 간의 I/R 손상을 포함한 많은 염증 관련 산화 스트레스 조건에서 상승하는 전형적인 ROS이다. 따라서 우리는 다양한 농도의 H₂O₂가 PB-MSC에 미치는 영향을 조사하고 PB 나노입자가 없는 MSC와 비교해보았다.

먼저, 세포를 다양한 농도의 과산화수소(H₂O₂)에 노출시켜 산화 스트레스를 유도하였다. 24시간 배양 후, 세포를 세척하고 MTT 분석을 통해 세포 대사 활성을 측정하여 생존율을 정량화하였다.

세포 내 ROS는 ROS 민감성 형광 프로브인 DCFH-DA를 사용하여 측정되었다. MSC 및 PB-MSC를 12-well 세포 배양 플레이트에서 성장시키고 2시간 동안 100μM H₂O₂에 노출시켰다. 그 후, 세포를 세척하고 37℃에서 30 분 동안 무 혈청 배지에서 10μM DCFH-DA와 함께 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS로 세척하고 트립신 처리하여 4℃에서 3분 동안 1500rpm에서 원심 분리하여 세포를 수집하였다. 수집 된 세포는 유세포 분석기(FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 분석되었다. H₂O₂ 처리가 없는 MSC가 대조군으로 사용되었다. 또한, 세포 내 형광 신호를 가시화하고 청색 여기광(488 nm)을 사용하여 형광 현미경으로 이미지화 하였다(TE2000, Nikon, Tokyo, Japan).

제조예 4(PB-MSC@12h) 및 제조예 9(PB-MSC@24h)의 두 개의 서로 다른 PB-MSC를 실험에 사용하여 H₂O₂ 매개 산화 스트레스에 대한 PB 나노입자 함침 효과를 분석하였다.

도 2의 (c)를 참조하면, PB 나노입자가 없는 비교예의 MSC는 H₂O₂ 농도가 증가함에 따라 대사 활동이 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이에 비해, 제조예의 PB-MSC세포는 H₂O₂ 처리에 대한 반응으로 더 나은 세포 생존력을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 낮은 H₂O₂ 농도(25 및 50μM)에서는 세 그룹 모두 높은(> 90 %) 대사 활성을 보였으며 그룹간에 큰 차이가 없었으나, 100μM H₂O₂ 농도에서 비교예의 MSC의 생존율은 ~40%로 크게 감소한 반면, 제조예의 PB-MSC 세포의 생존율은 각각 85% 및 100%로 확인되었다. H₂O₂를 150 및 200μM으로 증가시키면 비교예의 MSC에서는 90% 이상의 생존력 손실이 발생했지만 PB-MSC@24h는 200μM의 H₂O₂가 존재하더라도 90% 이상의 세포 생존율을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 따라서, PB 나노입자가 없는 비교예의 MSC가 높은 ROS 환경에 매우 취약한 반면 PB 나노입자가 함침된 본 발명의 PB-MSC는 PB 나노입자가 더 많이 함침될수록 높은 ROS 환경에서 향상된 생존력을 나타냄을 확인할 수 있다.

이후 실험에서는 제조예 9(PB-MSC@24h)의 세포로 실험을 진행하였다. 이에 이하에서는 간단하게 PB-MSC로 표기하기로 한다.

PB-MSC의 세포 내 PB 나노입자는 우수한 ROS 소거 특성을 통해 H₂O₂ 매개 높은 산화 스트레스를 줄일 수 있다. 이를 확인하기 위해 DCFH-DA를 형광 프로브로 사용하여 유세포 분석으로 세포 내 ROS 수준을 정량화하였다.

도 2의 (d) 내지 (f)를 참조하면, 100μM H₂O₂로 4시간 동안 처리 된 비교예의 MSC는 높은 ROS 수준과 세포 내부의 높은 산화 스트레스 환경으로 인해 상당히 높은 세포 내 DCFH 형광 신호를 나타내는 반면, 실시예의 PB-MSC에서는 확연하게 감소하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 유세포 분석 형광 이미징의 결과와도 일치하는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 세포 내 PB 나노입자가 ROS 소거 및 산화 스트레스 감소를 통해 과량의 H₂O₂ 환경에서도 MSC 세포를 보호 가능한 효과가 있음을 확인할 수 있다.

<실험예 4> 전분화능(pluripotency) 및 다분화능(multilineage differentiation) 확인 실험

본 발명의 PB-MSC 세포의 전분화능(pluripotency) 및 다분화능(multilineage differentiation)을 확인하는 실험을 진행하였다. 전분화능과 다분화능은 MSC 치료제의 핵심 요소이다. 따라서, PB 나노입자의 함침으로 인하여 MSC의 전분화능과 다분화능은 영향을 받지 않아야 한다. 이를 위하여, 먼저 다능성 마커 유전자(Oct4, Sox2, Nanog 및 CXCR4)의 발현을 RT-qPCR을 사용하여 분석하였다. 모든 유전자 발현은 β액틴의 발현으로 정규화 되었다. 제조예의 PB-MSC에서 다능성 유전자의 발현을 비교예 MSC와 ΔΔCt 방법으로 비교하였다. β액틴, Oct4, Sox2, Nanog 및 CXCR4의 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

그 다음, 비교예의 MSC 및 제조예의 PB-MSC를 면역 형광 염색을 통해 세포 다능성 마커(SSEA4, CD90, CD29, F-액틴)를 특정하였다. 이를 위하여 배양 된 세포를 10% 중성 완충 포르말린에 10분 동안 고정하고 1% BSA로 실온에서 60분 동안 유지한 후 세포를 세척 완충액(PBS + 0.05%)으로 두 번 헹구어, 각각의 1차 항체(SSEA4 (1:50) (Santa Cruz Biotechnology, USA), CD90 (1:100) (BD Bioscience, USA), CD29 (1:100) (Abcam, UK))와 함께 overnight으로 배양하였다. 그 다음, 세포를 세척하고 각각의 2차 항체 (Alexa fluor 488-anti mouse IgG for SSEA4 and CD90, Alexa fluor 594-anti rabbit IgG for CD29)를 1:200로 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 배양 한 후, 세포를 세척하고 DAPI로 대조 염색 하였다. F-액틴 염색을 위해서는 세포를 Alexa fluor 594 접합 된 Phalloidin (1:50)과 함께 4℃ 에서 overnight으로 배양했습니다. 이 또한 세척 후 세포핵을 DAPI로 대조 염색 하였다. 이를 형광 현미경(TE2000, Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 세포를 시각화하고 이미지화하였다.

도 4는 본 발명의 비교예 및 제조예에 따라 제조된 PB-MSC 세포의 전분화능 및 다분화능을 나타내는 그래프이다.

도 4의 (a)는 비교예의 MSC와 제조예의 PB-MSC에서 다능성 마커 유전자 발현을 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 4의 (a)를 참조하면, 본 발명의 제조예의 PB-MSC에서 4개의 유전자 모두의 발현은 비교예의 정상 MSC에서의 발현과 유사한 것을 확인할 수 있다.

도 4의 (b)는 비교예의 MSC와 제조예의 PB-MSC에서 SSEA4, CD90, CD29 및 F-액틴의 면역 염색 이미지이다.

도 4의 (b)를 참조하면, 비교예의 MSC와 제조예의 PB-MSC에서 면역 형광 염색 또한 차이가 없음을 확인할 수 있다. 마찬가지로 F-액틴 또한 차이를 보이지 않는 것을 확인할 수 있다.

따라서, 도 4의 (a) 및 (b)의 유전자 발현 및 면역 형광 이미징 결과를 통해 PB 나노입자의 함침이 MSC의 세포 골격과 전분화능에 부정적인 영향을 주지 않는다는 것을 확인할 수 있다.

또한, 비교예의 MSC 및 제조예의 PB-MSC의 다분화 능력(multilineage differentiation)의 비교를 위하여, 먼저 세포를 24-well 조직 배양 플레이트(2 x 104 cell/well)에 접종하였다. 세포 생장이 8-90%에 도달한 후 배지를 골 형성 또는 지방 형성 분화 배지로 교체하였다.

먼저 골 형성을 위하여 기저 배지에 덱사메타손(10nM), β글리세로 포스페이트(10mM) 및 L-아스코르브 산(50μg/mL)을 보충하였다. 17 일 동안 배양 한 후, 세포를 알리자린 레드 S(ARS)로 염색하여 칼슘 침착 형성을 평가하였다. 염색의 정량화를 위하여 10% (w/v) 염화세틸피리디늄 용액을 각 well에 첨가하고 플레이트를 흔들면서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 용해 된 염료의 흡광도는 540 nm에서 측정되었다.

그 다음, 지방 생성을 위해, 기저 배지를 StemPro 지방 생성 분화 유도 배지(Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)로 대체하였다. 21 일 동안 유도 후 분화 된 세포의 지질 방울을 Oil Red O(ORO) 염색으로 염색 하였다. 염색 된 세포는 명 시야 현미경으로 관찰되었다. 정량 분석을 위해 1000μL의 이소프로판올을 사용하여 염색 된 ORO 염료를 추출하고 510nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 4의 (c)는 골 형성 분화 후 MSC 및 PB-MSC를 알리자린 레드 S (ARS)로 염색하여 나타낸 이미지이다.

도 4의 (d)는 추출 된 ARS 염료의 정량 분석을 위한 흡광도 그래프이다.

도 4의 (e)는 지방 생성 분화 후 MSC 및 PB-MSC의 오일 레드O (ORO)로 염색하여 나타낸 이미지이다.

도 4의 (f)는 추출 된 ORO 염료의 정량 분석을 위한 흡광도 그래프이다.

도 4의 (c) 내지 (f)를 참조하면, PB-MSC에서도 MSC와 유사한 수준으로 성공적인 골 형성 및 지질 방울을 생성함을 확인할 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 MSC의 PB 나노입자 함침이 세포의 다분화능에 부정적인 영향을 주지 않는 다는 것을 확인할 수 있다.

<실험예 5> 체외 파라크린 활성 실험

본 발명의 PB-MSC 세포의 파라크린 활성을 측정하는 실험을 진행하였다. 줄기세포 기반 세포 치료는 세포의 파라크린 활성에 기인한다. 손상된 조직에 주입되면, MSC는 환경 신호에 반응하여 다양한 성장 인자, 사이토카인 및 케모카인을 분비하여 조직 복구를 촉진하게 된다. 본 실험예 6에서는 PB 나노입자의 함침이 MSC의 파라크린 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해 PB-MSC 세포의 파라크린 활성을 측정하는 실험을 진행하였다.

이를 위하여, 먼저 MSC 또는 PB-MSC 세포를 24-well 조직 배양 플레이트에 시드하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, PBS로 세포를 세척하여 신선한 배지를 첨가하고 24시간 또는 72시간 동안 배양 한 후 배지를 수집하고 원심 분리(3000rpm, 5 분, 4℃)하여 세포 파편을 제거하고 -20℃에 보관하였다.

활성에 대한 높은 산화 스트레스의 영향을 확인하기 위하여 MSC와 PB-MSC를 2시간 동안 200μM H₂O₂에 노출시켜 배양한 후, 세포를 PBS로 세척하고 일반 배지에서 배양 하였다. H₂O₂에 노출 된 세포에서 분비되는 VEGF 및 HGF의 농도는 ELISA로 측정되었다.

도 5는 본 발명의 비교예 및 제조예에 따라 제조된 PB-MSC 세포의 체외 파라크린 활성 및 체외 항염증 활성을 나타내는 그래프이다.

도 5의 (a) 및 (b)를 참조하면, MSC와 PB-MSC는 모두 정상 환경에서 비슷한 수준의 VEGF 및 HGF 분비를 나타내지만, 높은 H₂O₂환경에 노출 된 후에는 크게 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이와 대조적으로, H₂O₂ 처리 된 PB-MSC는 H₂O₂에 노출 된 비교예의 MSC에 비해 상당히 높은 VEGF 및 HGF 분비를 나타냄을 확인할 수 있다. 따라서, PB 나노입자의 함침은 MSC의 파라크린 활성에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 확인할 수 있다.

<실험예 6> 체외 항염증 활성 실험

본 발명의 PB-MSC 세포의 체외 항염증 활성을 측정하는 실험을 진행하였다. LPS는 toll-like receptor 4 (TLR4)를 통해 대식세포를 활성화하고 일련의 신호 전달 이벤트를 유발하여 ROS 및 TNF-α와 같은 다른 염증 유발 매개체를 생성한다. 따라서, LPS에 의해 자극된 RAW264.7 대식세포에 의해 분비되는 TNF-α를 측정함으로써 본 발명의 PB-MSC의 항염증 활성을 측정하였다.

이를 위하여, 먼저RAW 254.7 뮤린 대식세포를 well당 2 x 104 세포의 농도로 12-well 플레이트에 접종하였다. 12시간 후, 대식세포는 처리 방법에 따라 다음과 같은 그룹으로 분류하였다. i) 정상 배지에서 배양 된 대식세포; ii) 100ng/mL LPS로 12시간 동안 활성화시킨 후 이어 정상 배지에서 배양된 대식세포; iii) 100ng/mL LPS로 12시간 동안 활성화 된 대식세포를 MSC 또는 PB-MSC와 공동 배양. 분석을 위해 24시간 또는 72시간의 공동 배양 후 배양 배지를 수집하였다. 대식세포에서 분비되는 TNF-α 및 IL-10의 농도는 ELISA (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)로 측정되었다.

도 5의 (c) 및 (d)를 참조하면, 그룹 i)에 해당하는 비자극 대조군 대 식세포는 매우 낮은 수준의 TNF-α를 생성하지만, 그룹 ii)에 해당하는 활성화 된 대식세포는 매우 높은 수준의 TNF-α를 생성함을 확인할 수 있다. 이를 MSC와 함께 배양한 그룹 iii)에서는 비교예에 따른 MSC와 함께 배양된 활성화 된 대식세포는 TNF-α 분비가 어느정도 감소하고 항염증성 사이토카인인 IL-10의 분비는 증가하는 것을 확인할 수 있으나, PB-MSC와 공동 배양된 활성화 된 대식세포가 유의하게 낮은 수준의 TNF-α 및 높은 수준의 IL-10 분비를 나타내는 것을 통해, PB 나노입자를 MSC에 함침하였을 때 줄기세포의 항염증 기능이 향상되었다는 것을 확인할 수 있다.

<실험예 7> 체내 치료 활성 확인 실험

본 발명의 PB-MSC 세포의 체내 치료 활성, 특히 체내 허혈-재관류 손상(IRI) 치료 활성을 확인하는 실험을 진행하였다.

이를 위하여, 먼저 부분적으로 IRI가 유도된 마우스를 준비하였다. 상기 IRI 유도는 다음과 같이 진행되었다.

먼저 마우스에 Ketamine과 Xylazine의 혼합 용액 (4 : 1 비율)을 복강 주사하여 마취하였다. 그 다음, 간 동맥과 문맥의 첫 번째 가지를 오른쪽 하엽의 혈관을 제외하고 미세 혈관 클램프로 고정하여 간의 약 70%에 허혈성 손상을 입혔다. 90분 간 허혈 후 미세 혈관 클램프를 제거하여 재관류를 시작하였다. 이때, 마우스는 PBS (500μL) 단일 주사, PB 나노입자(50μg/마우스) 단일 주사, MSC (1x105 세포/마우스) 주사 및 PB-MSC (1x105 세포/마우스) 주사한 4개의 그룹으로 나누어 준비하였다. Sham 그룹의 마우스는 동일한 수술을 받았지만 혈관 폐색은 진행하지 않았다. 각각 3, 6, 12 시간의 재관류 후 소량의 혈액을 채취하고 생화학적 분석을 위하여 혈청을 분리하고 추가 분석을 위하여 전혈과 간 조직을 수득하였다.

<실험예 7-1> I/R 손상 간 조직의 혈청 분석 실험

본 발명의 PB-MSC 세포의 IRI 치료 활성을 측정하기 위하여 먼저 혈청을 분석하는 실험을 진행하였다. 이를 위하여, 먼저 간 손상을 확인하기 위한 일반적인 마커인 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 효소를 측정하였다.

도 6은 본 발명의 PB-MSC 세포의 IRI 치료 활성을 혈청 분석 및 손상 간 조직의 조직병리학적 특성 분석을 통해 나타낸 그래프 및 이미지이다.

도 6의 (a)와 같이 마우스 IRI 모델을 구성하였다.

도 6의 (b)는 마우스 IRI 모델의 허혈-재관류에 의한 간 손상을 나타내는 지표인 혈청 내 ALT 및 AST 수준을 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 6의 (b)를 참조하면, Sham 그룹의 마우스는 모든 시점에서 혈청 ALT 및 AST 수준의 최소 수준을 나타내었으며, PBS 그룹에서의 ALT 및 AST의 혈청 농도는 현저하게 높았다. 즉, 이는 허혈-재관류로 인한 간 손상의 신호임을 확인할 수 있다. PBS 그룹과 비교하여 PB 나노입자 단독으로 처리 된 마우스는 ALT 및 AST의 감소 된 혈청 수준을 나타내어 PB 나노입자 자체 또한 자체적인 ROS 소거능으로 인하여 약간의 치료 활성을 나타냄을 나타냈다. 그러나 PB-MSC로 처리 한 마우스가 모든 시점에서 가장 낮은 수준의 혈청 ALT / AST를 나타내었으며, 이를 통해 PB-MSC가 허혈-재관류 손상으로 인한 간 조직 세포 손상으로부터 간을 보호하는 효과가 가장 뛰어난 것을 확인할 수 있다.

<실험예 7-2> I/R 손상 간 조직의 조직병리학적 특성 분석 실험

본 발명의 PB-MSC 세포의 IRI 치료 활성을 측정하기 위하여 IRI로 손상된 간 조직의 조직학적 특성 및 면역조직화학적 특성을 분석하는 실험을 진행하였다.

이를 위하여, 상기에서 수집된 간 조직을 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 파라핀에 포매하여 6μm 두께로 절편하고 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 간 조직 손상은 H&E 염색 섹션에서 괴사 영역을 정량화하여 추정되었다. 간 조직에서 세포 사멸은 말단 deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) 염색 키트로 분석하였다. TUNEL-양성 세포는 간당 4-6 개의 무작위로 선택된 섹션에서 Image J 소프트웨어(버전 1.8.0)를 사용하여 정량화되었다.

도 6의 (c)는 I/R 손상 및 다양한 치료 후 H&E 염색에 의한 간 조직을 나타낸 이미지이다.

도 6의 (d)는 간 섹션을 TUNEL 염색하여 나타낸 이미지이다.

도 6의 (e)는 H&E 염색 이미지에서 간 섹션의 괴사 영역을 정량화하여 나타낸 그래프이다.

도 6의 (f)는 TUNEL 염색으로부터 간 조직의 세포 사멸을 정량화하여 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명의 PB-MSC 세포의 IRI 치료 활성을 확인하기 위하여 I/R 손상 간 조직을 H&E 염색하여 나타낸 이미지이다. 이때, 점선은 괴사 부위를 나타낸다.

도 6 내지 도 7을 참조하면, PB-MSC 처리한 간 조직의 괴사 면적은 1.7±1.4 %에 불과하여 대조군인 PBS 그룹보다 거의 33 배 낮은 것을 확인할 수 있으며, 세포 사멸 또한 PB-MSC 처리한 경우 가장 낮은 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 PB-MSC는 비교예의 MSC와 비교하여 허혈-재관류로 인한 손상된 조직의 치료 효율이 향상되었음을 확인할 수 있다.

<실험예 7-3> 생체 내 항산화 활성 확인 실험

본 발명의 PB-MSC의 생체 내 항산화 활성을 확인하는 실험을 진행하였다. I/R 손상 동안 과도한 ROS 생성은 지질, 단백질, DNA 등에 심각한 산화 손상을 일으키게 된다. 따라서, 지질 과산화는 I/R 손상으로 인한 산화 손상을 평가하기 위한 바이오 마커로 이용될 수 있다. 본 발명의 실험예 8-3에서는 지질 과산화 최종 산물인 티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS)의 분석에 의해 손상 간 추출물에서의 지질 과산화 수준을 측정함으로써 PB-MSC의 산화 스트레스 저감 효과 및 생체 내 항산화 활성을 확인하였다.

이를 위하여, 먼저 냉동 간 조직을 차가운 RIPA 완충액에 현탁하고 균질화하였다. 상기 균질물을 4℃에서 10분 동안 3000rpm으로 원심분리하고 분석을 위해 상층액을 수집하였다. 100μL의 상층액을 100μL의 10%(w/v) 트리클로로아세트산 및 800μL 티오바르비투르산(TBA) 시약과 혼합하고 수조에서 60분 동안 95℃에서 배양하였다. TBARS의 양은 각각 530 및 555 nm의 여기 및 방출 파장으로 형광 측정에 의해 측정되었다. 정량화를 위하여 다양한 농도의 순수한 말론디알데히드(MDA)를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 모든 조직 샘플에서 TBARS의 수준은 BSA를 표준으로 사용하여 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fischer, Waltham, MA, USA)로 총 단백질을 측정하여 정규화되었다.

도 8은 본 발명의 PB-MSC 세포의 생체 내 항산화 활성 확인을 위한 이미지 및 그래프이다.

도 8의 (a)는 간 섹션에서 인간 핵 항원(HNA)을 면역 조직학적 염색을 통해 나타낸 이미지이다.

도 8의 (a)를 참조하면, 인간 MSC가 마우스에 투여 되었기 때문에, 인간 핵 항원(HNA)의 면역 조직학적 염색을 사용하여 간 조직에서 이식 된 MSC 세포의 존재를 확인할 수 있다. 이때, MSC 세포가 이식되지 않은 Sham, PBS 및 PB 그룹은 HNA에 대한 양성 염색을 나타내지 않은 것을 통해 위양성 신호가 없음 또한 확인할 수 있다.

도 8의 (b)는 이미지 분석에 의해 정량화 된 섹션 당 (HNA⁺) 세포의 평균 수를 나타낸 그래프이다.

도 8의 (b)를 참조하면, 비교예의 MSC 그룹과 비교하여 필드 당 평균 HNA⁺ 세포수가 PB-MSC 그룹에서 더 높은 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해 이식된 PB-MSC의 생존력이 MSC에 비해 향상되었음을 확인할 수 있다.

도 8의 (c)는 간 조직 균질물에서 TBARS 분석을 통한 지질 과산화 분석 그래프이다.

도 8의 (c)를 참조하면, TBARS 분석에 의해 간 추출물의 지질 과산화 수준을 측정하여 ROS 매개 조직 손상을 측정한 결과, sham 그룹과 비교하여 TBARS 값은 PBS 그룹에서 약 4 배 증가한 것을 통해 조직의 산화 손상을 확인할 수 있다. PB 나노입자 자체를 사용한 그룹 또한 PBS 그룹에서 지질 과산화 수준을 감소시켰으며, 이는 PB 나노입자가 그 단독으로도 ROS 소거능으로 인해 ROS 유도 조직 손상을 어느 정도 억제 할 수 있음을 나타낸다. 그러나 PB-MSC 처리 그룹이 모든 다른 그룹과 비교하여 지질 과산화를 가장 강력하게 억제한 것을 통해, PB 나노입자의 MSC에의 함침이 세포의 생체 내 항산화 활성을 향상시킨다는 것을 확인할 수 있다.

<실험예 7-4> 유전자 발현 분석을 통한 생체 내 항염증 활성 실험

본 발명의 PB-MSC의 생체 내 항염증 활성을 확인하는 실험을 진행하였다. 높은 ROS 생성 외에도, I/R 손상의 또 다른 특징은 강력한 염증 반응이다. 재관류의 초기 단계에서 많은 양의 호중구가 간 조직으로 침투하게 되며, 침윤 된 호중구와 함께 활성화 된 Kupffer 세포는 조직에 염증을 일으키는 환경을 조성한다. 따라서, 이때 MSC의 면역 조절 및 항염증 활성은 I/R 손상 치료에 중요하다. 이러한 MSC의 항염증 작용을 분석하기 위하여, 본 발명의 실험예 8-4에서는 TNF-α, IL-1b, iNOS, IL-10의 간 발현을 비교하였다.

이를 위하여, 먼저 TRIzol 시약을 사용하여 마우스 간 조직에서 RNA를 정제한 후 RT-qPCR을 진행하였다. β액틴은 표적 유전자(TNF-α, IL-1βiNOS, IL-10)의 정규화에 사용되었으며, 배 변화는 Sham 그룹과 비교하여 ΔΔCt 방법으로 계산되었다. 상기 표적 유전자의 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

도 9는 본 발명의 PB-MSC의 생체 내 항염증 활성을 확인하기 위한 그래프 및 이미지이다.

도 9의 (a)는 간에서 전 염증 유전자(TNF-α, IL-1βiNOS) 및 항염증 유전자(IL-10)의 발현을 나타낸 그래프이다.

도 9의 (a)를 참조하면, 유전자 수준에서, 전 염증성 사이토카인 유전자(TNF-α, IL-1b 및 iNOS)의 발현은 Sham 그룹에 비해 PBS 처리 된 마우스에서 유의하게 높은 것을 확인할 수 있다. TNF-α 및 IL-1b의 발현은 PB 처리 군에서 약간 감소한 반면, iNOS 발현은 영향을 받지 않았다. 이에 비해 MSC 및 PB-MSC 처리는 TNF-α, IL-1b 및 iNOS의 발현에 대해 더 강력한 억제 효과를 나타냈다. 그러나, PB-MSC 처리군은 MSC에 비해 TNF-α 및 IL-1b의 발현에서 유의하게(p <0.05) 더 높은 억제를 나타냈다. 또한 통제되지 않은 염증을 억제하고 간세포 증식을 촉진하는 데 도움이 되는 항 염증성 사이토카인인 IL-10의 간 발현은, MSC 그룹과 PB-MSC 그룹에서 각각 3.2배와 5.1배 크게 증가한 것을 확인할 수 있다.

도 9의 (b) 및 (c)는 각각 TNF-α 및 IL-10의 혈청 농도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.

도 9의 (b) 및 (c)를 참조하면, 유전자 발현 분석과 유사하게 PB-MSC 처리는 전 염증성 TNF-α 수준을 낮추고, 항 염증성 IL-10 수준을 높이는 데 가장 높은 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

또한, 미에로페록시다제(Myeloperoxidase, MPO)는 호중구에서 주로 발견되는 효소이다. 따라서, 간에서의 MPO 활성은 재관류 동안 간에서 호중구가 침윤한 바이오 마커로 사용될 수 있다. 본 발명의 실험예 8-4에서는 호중구의 침윤 정도를 확인하기 위해서 간 조직 균질 액에서 MPO 활성을 분석하였다.

이를 위하여, 먼저 수득한 간 조직(~ 50mg)을 얼음 욕조에서 0.5 % (w / v) 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드를 함유하는 500μL 인산 칼륨 완충액(50mM, pH 6.0)에서 균질화하였다. 상기 균질물을 4℃에서 15분 동안 12000rpm으로 원심 분리하고 분석을 위해 상층액을 수집하였다. 상층액의 MPO 활성은 o-다이아니시딘 이염산염을 기질로 사용하여 450nm에서 비색 분석을 통해 측정되었다. 흡광도 값은 샘플에서 총 단백질을 측정하여 정규화 되었으며 Sham 그룹에 대한 배 변화로 표시되었다.

도 9의 (d)는 다양한 그룹의 처리 후 간에서 MPO 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 9의 (d)를 참조하면, Sham과 비교하여 MPO 활성은 PBS 그룹에서 약 5.5배 증가하여 상당한 호중구 침윤을 나타냄을 확인할 수 있다. 다른 그룹에 비해 MPO 활성은 PB-MSC 그룹에서 현저히 낮았으며, 이는 PB 나노입자가 함침된 MSC가 호중구 침윤 감소에 가장 효과적임을 의미한다는 것을 확인할 수 있다.

도 9의 (e) 및 (f)는 각각 간 섹션에서 (e) DAPI(파란색)를 사용한 F4/80(빨간색) 및 (f) DAPI(파란색)를 사용한 TNF-α(녹색)의 면역 조직학적 염색 이미지를 나타내고, 도 9의 (f) 및 (h)는 상기 각각의 이미지로부터 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이다.

도 9의 (e) 내지 (h)를 참조하면, Sham 그룹은 최소한의 대식세포 활성화로 인해 F4/80에 대해 낮은 염색을 나타내는 것을 확인할 수 있으며, PBS 그룹에서 훨씬 더 강한 형광 신호를 통해 손상된 조직에서 대식세포의 상당한 활성화를 확인할 수 있다. 예상한 것과 같이, F4/80 발현은 PB-MSC 그룹에서 가장 크게 감소하였다. 또한 활성화 된 대식세포에 의해 분비되는 전 염증성 사이토카인 TNF-α 또한 PB-MSC에서 가장 낮은 발현을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 상기와 같은 염증성 유전자의 발현 측정을 통하여, 본 발명의 PB-MSC는 MSC보다 높은 수준의 항염증 활성을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

프러시안 블루 나노입자; 및
줄기세포;를 포함하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제.
제1항에 있어서,
상기 프러시안 블루 나노입자는, 상기 줄기세포의 세포 내부로 함침되어 존재하는 것을 특징으로 하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제.
제1항에 있어서,
상기 프러시안 블루 나노입자는, ROS 소거 특성을 갖는 것을 특징으로 하고,
상기 줄기세포는, 상기 프러시안 블루 나노입자로 인하여 향상된 산화 스트레스 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는, 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제.
제1항에 있어서,
상기 프러시안 블루 나노입자는, 평균 입경 30 nm 내지 50 nm 를 갖는 것을 특징으로 하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는, 상기 프러시안 블루 나노입자 25 ㎍/mL 내지 500 ㎍/mL 농도에서 배양된 것을 특징으로 하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는, 상기 프러시안 블루 나노입자와 3 시간 내지 48 시간 동안 함께 배양된 것을 특징으로 하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제.
제1항에 있어서,
주사액 제형인 것을 특징으로 하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제.
프러시안 블루 나노입자를 준비하는 단계;
상기 프러시안 블루 나노입자가 줄기세포의 세포 내부에 함침되도록 상기 프러시안 블루 나노입자와 줄기세포를 함께 배양하는 단계; 및
상기 단계로부터 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 줄기세포를 수득하는 단계;
를 포함하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 프러시안 블루 나노입자와 줄기세포를 함께 배양하는 단계에서는, 상기 프러시안 블루 나노입자의 농도 25 ㎍/mL 내지 500 ㎍/mL 에서 배양하는 것을 특징으로 하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 프러시안 블루 나노입자와 줄기세포를 함께 배양하는 단계에서는, 상기 프러시안 블루 나노입자와 3 시간 내지 48 시간 동안 함께 배양하는 것을 특징으로 하는 항염증용 또는 손상 조직 재생용 줄기세포 치료제의 제조방법.