CN114773474A - Nk细胞的制备方法及其抗癌的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及NK细胞的制备方法及其抗癌的应用。本申请提供了一种抗CD20抗体，可与目标抗原高水平结合；提供了一种药物组合物，包括所述抗CD20抗体和经过基因修饰的NK‑92细胞，该细胞中导入了IL‑2突变体基因，所述人IL‑2突变体具有全新的氨基酸结构，在天然IL‑2序列基础上进行了多点突变尝试，其具有更强的NK‑92细胞促增殖能力和肿瘤细胞毒性；IL‑2突变体基因导入NK‑92细胞中，使其能够自主持续分泌该细胞因子，既能够满足自身需要，又能够避免全身给药造成的过重负担；所述经过基因修饰的NK‑92细胞与抗CD20抗体联用可在体内、体外有效杀伤肿瘤细胞，抑制白血病等血液肿瘤的生长和发展，延长模型动物生存期，调解TNF‑α、IFN‑γ等细胞因子的表达水平，强化抗肿瘤作用。

Description

NK细胞的制备方法及其抗癌的应用
技术领域：
本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体提供了NK细胞的制备方法及其抗癌的应用。
背景技术：
癌症是严重危害人们生命健康的恶性疾病，在世界各个国家或地区的发病率、死亡率居高不下。癌症根据其生理特性和发生部位可以分为实体肿瘤和血液肿瘤，其中白血病是最主要的血液肿瘤之一。白血病由于白细胞异常增殖而产生，根据增殖速度，它们可分为急性或慢性白血病；根据起源细胞，可分为髓系或淋巴系白血病。白血病主要的亚型包括急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)和慢性髓性白血病(chronic myeloidleukemia，CML)；和涉及淋巴链的急性淋巴细胞白血病(chronic myeloid leukemia，ALL)和慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)；其他不太常见的变体，例如成熟的B细胞和T细胞白血病、NK细胞相关的白血病等等，均来自成熟的WBC细胞。
白血病的发生和发展与多种遗传和环境风险因素有关，最近研究结果表明，电离辐射、危险化学品、化疗药剂(如烷化剂和拓扑异构酶抑制剂)、病毒感染(如人类T细胞白血病病毒、Epstein Barr病毒)、遗传综合征(如唐氏综合征、范可尼贫血、布鲁姆综合征、李-弗拉美尼综合征)等均可使得患白血病的风险增加。据世界卫生组织统计，全球白血病发病人数已达48万例，死亡率约为32％，而我国由于治疗手段相对落后，死亡率高达50％。
目前癌症的传统治疗手段以手术、放疗和化疗为主，虽然上述方法经过数十年的发展日臻成熟并挽救或延长了无数癌症患者的生命，但是面对肿瘤的新变化，尤其是耐药性、复发性、转移性癌症的出现，而显得越来越捉襟见肘。近年来出现的肿瘤免疫疗法，似乎给出了新的解决方案，这种疗法目的是增强对肿瘤细胞的免疫反应，进而借助机体自身的免疫机制抑制甚至杀死肿瘤细胞，并可与化学疗法、手术、放射疗法和靶向小分子结合使用，免疫肿瘤药物包括广泛的药物，包括抗体、疫苗、辅助疗法、细胞因子、溶瘤病毒、双特异性分子和细胞疗法。其中过继性细胞转移疗法取得了疗效最为显著，也受到了更多的关注，这种方法最初是输注淋巴细胞于患者体内治疗肿瘤，1980年代过继细胞移植的首次成功临床应用是基于在转移性黑色素瘤患者中使用自体肿瘤浸润淋巴细胞和在复发性白血病患者中输注同种异体供体淋巴细胞；1990年代随着基因技术的发展，通过使用T细胞受体或嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)来改善免疫细胞特异性成为可能，这种方式增强了T细胞的识别功能和杀伤功能，并且一旦注入患者体内CAR-T细胞就会在患者体广泛增殖，通过抗原释放、协助肿瘤浸润淋巴细胞攻击肿瘤或通过自身的持久性来促进免疫监视以防止肿瘤复发，目前这种方法在血液瘤的治疗中取得了巨大成功，世界范围内已经有多种药物批准上市。然而以T细胞为基础的免疫疗法却具有如下缺点：(1)移植抗宿主反应，难以形成通用型细胞系，多以个体T细胞进行基因改造，过程繁琐、成本较高且易产生污染风险；(2)免疫因子风暴，治疗中常伴随大量免疫因子释放，引发严重不良反应；(3)神经毒性，T细胞侵入大脑引发致命的脑水肿等等。
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是有效的先天效应细胞，能够靶向和杀死病毒感染的恶性细胞。与T细胞不同，NK细胞不需要匹配的人类白细胞抗原来激活或发挥功能，相反NK细胞依赖于一系列生殖系编码的激活和抑制受体，这些受体与靶细胞上的同源配体结合并引发细胞毒性。NK细胞不仅分泌颗粒酶B和穿孔素来裂解靶细胞，还分泌细胞因子和趋化因子来协调随后的免疫反应，这些独特的属性使NK细胞成为过继免疫治疗的有吸引力的细胞类型。正因如此，NK细胞也被报道用于治疗白血病等血液肿瘤中，如CN114377118A、CN113533729A、US20200306302A1、US5082833A公开了基于NK细胞开展的白血病治疗。然而来自临床研究的证据表明，NK细胞同种异体转移是有效且安全的(参见LiuE,Marin D,Banerjee P,Macapinlac HA,Thompson P,Basar R,et al..Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors.N Engl JMed.(2020)382:545–53.)，但仍然存在挑战，特别是在治疗性NK细胞的制造方面，由于NK细胞仅占外周淋巴细胞的10％，因此来自白细胞分离术的NK细胞供应有限。离体扩增对于产生临床相关水平的原代NK细胞进行输注是必要的，然而这一过程因端粒缩短和所得细胞的细胞毒性降低而变得复杂，因此如何有效扩增和维护肿瘤杀伤能力成为NK细胞治疗的首要问题。
为了克服原代NK细胞的局限性，从NK细胞淋巴瘤患者中建立了几种克隆NK细胞系，其中NK-92细胞系在多项临床研究中显示出一致的抗癌活性。NK-92细胞拥有许多标志性的激活受体(例如NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46)，但缺乏几种抑制性受体(例如，TIGIT和PD-1)，经伽马射线照射的NK-92细胞的输注也已被证明对患者是安全的。此外，NK-92的无限增殖会产生一致的均质NK细胞供应，以允许多次输注、改善治疗后勤工作并降低治疗开发的成本。然而由于免疫功能受损，与原代NK细胞相比，NK-92的抗癌活性降低。
有研究提出，NK-92是白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)依赖性的，即IL-2能够促进其增殖或活化。IL-2是由活化的T淋巴细胞分泌产生的细胞因子，由133个氨基酸组成，IL-2基因位于第4号染色体上，其第58，105位半胱氨酸形成的二硫键对于其活性的保持具有重要作用。IL-2的发现始于1960年代中期，人们发现抗原或有丝分裂原激活的白细胞培养物的上清液含有一种能够刺激淋巴细胞分裂的因子；该因子能够用于维持T细胞培养超过9个月，这种技术很快适应了具有持续细胞毒性潜力的肿瘤反应性T细胞的培养，后将其命名为IL-2。1983年报道了人类IL-2基因的测序，随后的1985年开发出人重组IL-2并用于恶性肿瘤的治疗，开启了IL-2的免疫治疗之路，并取得了令人满意的疗效，目前IL-2已经用于黑色素瘤、肺转移瘤、肾细胞癌、结肠癌患者癌和肺腺癌等多种肿瘤的治疗中。IL-2能够促进NK细胞的体外增殖，IL-2、IL-15、IL-7或饲养细胞处理是已被证明可增加NK细胞毒性的方式，将活化的NK细胞的输注和IL-2推注也被证明是安全的。但是天然IL-2的活性仍有待于提高，因此研究人员开始关注对于IL-2序列的改造，例如EP0200280A2提出将IL-2中104位的甲硫氨酸残基被保守氨基酸取代，可提高抗氧化活性；CN111018961A提出引入半胱氨酸残基形成二硫键，改善IL-2与其受体的结合活性；CN113667004A提出在IL-2的42/44位进行定点突变可改善抗肿瘤活性；CN101426916A提出C125S突变，所述突变蛋白提供了保持或增强的人NK细胞介导的自然杀伤细胞毒、淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞毒、或ADCC介导的细胞毒性。
CD20是抗肿瘤药物的明星靶点之一，它是由279个氨基酸组成的跨膜磷蛋白，同时也是特有的、存在于人类B淋巴细胞表面的标识，相对分子质量为33000-37000，有4个跨膜结构域，其中主要的抗原表位位于细胞质膜内侧的第三及第四跨膜区之间，构成的主要抗原表位对B淋巴细胞的分化和增殖具有非常重要的调节作用。近30年来，美国FDA批准上市的CD20靶点抗体类药物共有6个，包括2个鼠抗体偶联同位素药物，其中利妥昔单抗——美罗华(rituximab)获得较大的市场占有率，在2019年的销售额接近70亿美元，奥法木单抗、奥比妥珠单抗、奥瑞珠单抗也分别在2009、2013、2017年上市，用于治疗白血病和多发性骨髓瘤。
尽管现有技术中对于NK-92细胞、IL-2、抗CD20抗体等作了大量而富有成效的研究，但仍面临如何提高和改善NK-92细胞抗肿瘤效果的问题，本发明在现有研究基础上，设计并获得了与目标抗原具有高亲和力的抗CD20抗体；对人IL-2天然序列进行定点突变，获得了促进NK-92细胞增殖能力和强化其细胞毒性能力更强的IL-2变体，并将所述基因引入NK-92细胞中，使得NK-92可通过自我分泌的方式持续获得免疫激活，而不需全身性注射，避免过度免疫刺激；使用本发明中所述的经基因修饰的NK-92与抗CD20抗体联合使用，可进一步提高肿瘤杀伤效果，调节多种因子表达水平。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明中提供了一种抗CD20抗体，其特征在于所述抗体包括如SEQ ID NO:1-3所示重链CDR区和SEQ ID NO:4-6所示轻链CDR区。
进一步的，所述抗体的重链可变区如SEQ ID NO:7所示。
进一步的，所述抗体的轻链可变区如SEQ ID NO:8所示。
CD20为著名的抗肿瘤靶点，在B细胞恶性肿瘤中多有表达，本发明中使用的抗CD20抗体可与目标抗原高特效性结合，发挥高治疗性和高靶向性的抗肿瘤作用。
提供了一种药物组合物，包括所述的抗CD20抗体，以及免疫细胞，所述免疫细胞携带有编码如SEQ ID NO:9所示的人白细胞介素2突变体的基因。
本发明在已有研究基础上，对人天然IL-2序列进行了研究，对已知的44位、125位等潜在可变位点进行突变，还在18位、34位、68位、123位设计了定点突变，使得IL-2与目标靶位结合活性更高，相比于F44S、C125S等已知改造突变体，具有更强的NK-92细胞增殖活性和肿瘤细胞毒性。
进一步的，其中所述人白细胞介素2突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
所述IL-2突变体在体外可促进NK-92细胞等免疫细胞增殖，但是这种方式在体内治疗中往往需要大规模的全身给药，容易引发不必要的临床治疗负担，导致难以预期的不良反应，增加患者治疗负荷和经济成本，因此本发明中将IL-2突变体导入NK-92细胞内，不仅能够避免全身给药带来的困境，还能够实现持续增殖和实现高水平肿瘤毒性。
进一步的，其中所述免疫细胞选自T细胞和/或NK细胞。
进一步的，其中所述免疫细胞选自NK-92细胞。
NK-92细胞是经过人工选用的成熟细胞系，利用开发通用型细胞治疗产品，并且已有研究证明该细胞的临床安全性；还有研究表明，NK-92的PD-1表面抗原低表达，说明其可避免肿瘤细胞借由PD-1/PD-L1途径而触发的免疫逃逸。
提供了一种所述的抗CD20抗体或所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述肿瘤选自淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤。
本发明中实验验证了所述CD20抗体、经基因修饰的免疫细胞对白血病具有较好的治疗作用，已有研究表明抗CD20抗体、NK-92细胞对于淋巴瘤、骨髓瘤也具有治疗作用，因此可以推测所述CD20抗体、经基因修饰的免疫细胞对于其他血液肿瘤也具有良好的治疗作用。
有益效果
本申请提供了一种抗CD20抗体与及其与免疫细胞的应用，具有以下优势：
(1)提供了一种具有全新CDR区的抗CD20抗体，可与目标抗原高亲和力结合；
(2)对人IL-2氨基酸序列进行改造，获得了具有全新结构的IL-2衍射物，具有更强的NK-92细胞促增殖能力和肿瘤细胞毒性；
(3)将IL-2突变体基因导入NK-92细胞中，使其能够自主持续分泌该细胞因子，既能够满足自身需要，又能够避免全身给药造成的过重负担；
(4)基因修饰的NK-92细胞能够高效杀死白血病等血液肿瘤细胞，在体内、体外都展现了令人满意的抗肿瘤效果；
(5)基因修饰的NK-92细胞与抗CD20抗体联用，可有效调解免疫因子表达，进一步提高了抗肿瘤活性，产生明显协同作用。
附图说明
图1：基因修饰对NK-92细胞增殖能力的影响；
图2：肿瘤细胞杀伤力；
图3：TNF-α表达水平；
图4：IFN-γ表达水平；
图5：实验动物生存期。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。
以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1抗CD20抗体的设计和获得
在前期研究中，使用人CD20基因和蛋白，通过噬菌体展示文库技术，设计并获得了靶向人CD20的单克隆抗体，其包括如SEQ ID NO:1-3所示重链CDR区和SEQ ID NO:4-6所示轻链CDR区；所述抗体的重链可变区如SEQ ID NO:7所示；所述抗体的轻链可变区如SEQ IDNO:8所示。
使用BiacoreT200检测QX007N(HZD78-70)与人CD20的亲和力。采用商品化ProteinA芯片，通过捕获法固定适量的抗体，使得Rmax在50RU左右，捕获流速是10μl/min。用仪器自带分析软件计算抗体的结合速率常数ka，解离速率常数kd以及平衡解离常数KD值。经测定，该单克隆抗体与目标抗原的KD值11.57×10-9M，说明其能够以高亲和力结合目标抗原。
实施例2 IL-2突变体设计与制备
2.1 IL-2突变体设计
人天然IL-2由133个氨基酸所组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。根据现有研究结果，IL-2氨基酸结构中半胱氨酸形成二硫键，对于IL-2与其受体结合活性至关重要，且有研究这提出对42位和44位的苯丙氨酸(Phe)进行突变，即F42S/F44S；以及对125位半胱氨酸(Cys)，即C125S，能够改善促进NK-92细胞的增殖活性，在该基础上，本发明人对IL-2中的在18位、34位、44位、68位、123位和125位等多个位点进行了点突变研究，获得了全新的突变体，记为mu-IL-2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
2.2 IL-2蛋白制备
将编码相应IL-2突变体的DNA序列导入pcDNA3.3表达载体中，将上述表达载体电转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，转化后涂布于含有抗生素的LB平板上，37℃下在培养过夜，筛选阳性克隆。提取质粒，测序显示所述目标序列正确。
本实施例中使用毕赤酵母真核表达载体制备IL-2突变体蛋白，可保证目标蛋白更接近真核生物的生理状态。将目标核酸片段克隆到表达载体pPIC-9r上，转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株，置于30℃，220rpm摇床培养48h；使用甲醇诱导表达48h，离心收集上清，经超滤膜浓缩后使用离子交换层析进行纯化。对纯化后的蛋白进行蛋白电泳，利用考马斯亮蓝染色液进行染色，结果表明相关蛋白纯度较高，能够满足后续实验要求。
在前期研究中，经细胞水平实验测定，表明该IL-2突变体能够有效促进NK-92细胞增殖。
实施例3 NK-92细胞基因修饰及细胞增殖活力影响
3.1 NK-92细胞基因修饰
本实施例中采用慢病毒载体转染NK-92细胞，主要步骤如下：
(1)将上述IL-2突变体和天然IL-2基因克隆至慢病毒表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro中，将其电转化如大肠杆菌DH5α中，涂布平板，37℃过夜培养。挑取单菌落摇菌培养，使用试剂盒提取质粒。经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选阳性克隆，得到相应的重组质粒pLV-IL-2。
(2)将Lenti-X293T细胞接种于含有10％FBS的DMEM培养基中，于37℃、5％CO2下培养，当细胞密度为70-80％时进行转染实验；将相应的4种重组质粒pLV-IL-2添加到293T细胞培养基中，37℃、5％CO2下孵育6h后，弃去培养基，PBS洗三次后更换完全培养基；收集转染后48小时的293T细胞上清液。于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；采用超速离心法收集病毒，获得病毒浓缩液。
(3)体外培养NK-92细胞，将1×106个细胞接种于6孔板中，按50:1比例加入上述慢病毒载体，充分混匀，37℃、5％CO2下培养3-4天，中间根据细胞生长情况可传代或换液。采用流式细胞仪鉴定转染结果，结果表明转染后的NK-92细胞能够有效表达目标蛋白。
3.2细胞增殖活力影响
将分别1×105个NK-92细胞、NK-92-IL-2细胞和NK-92-mu-IL-2细胞接种于96孔板中，于37℃、5％CO2环境中培养24小时。采用MTT法检测细胞，每孔加入50μL的MTT(5mg/mL)溶液，37℃孵育4h；吸弃孔内的培养液，每孔加入150μL的DMSO震荡至板底的紫色结晶完全溶解，酶标仪490nm波长处测定吸光度OD值。以对照组细胞增殖率为100％计，按如下公式计算其他各组细胞增殖率，细胞增殖率(％)＝OD转染组/OD对照组×100％。
如图1所示，转染IL-2基因可提高NK-92细胞增殖能力，而使用本发明中所提供的IL-2突变体后，NK-92细胞的增殖能力得到进一步强化，相比于野生型NK-92细胞提供了近一倍，说明转染这种IL-2突变体可有效促进NK-92细胞增殖，为其在体内发挥抗肿瘤作用提供基础。
实施例4肿瘤细胞杀伤实验
4.1基因修饰的NK-92细胞对肿瘤细胞杀伤能力
本实施例中以人急性髓性白血病细胞系THP-1细胞作为靶细胞，考察对肿瘤的杀伤能力。将THP-1细胞接种于RPMI-1640完全培养基(含10％FBA)中，37℃、5％CO2下培养至对数生长期后，收集细胞用于细胞杀伤实验。
将THP-1细胞接种于96孔板中，然后分别加入：NK-92组，按10:1比例接种NK-92细胞；NK-92-mu-IL-2组，按10:1比例接种NK-92-mu-IL-2细胞；联合组1，按10:1比例接种NK-92细胞并加入10ng/ml的抗CD20抗体；联合组2，按10:1比例接种NK-92-mu-IL-2细胞并加入10ng/ml的抗CD20抗体。另单设效应细胞孔和靶细胞孔，每组设立3个复孔。37℃培养24h后，每孔加入10μL CCK8试剂，孵育4h，用酶标仪检测其在450nm处的吸光度(OD值)，以空白孔校零，按公式计算杀伤力。
杀伤力(％)＝[1-(实验孔OD值－单效应细胞孔OD值)/单靶细胞孔OD值]×100％
如图2所示，NK-92细胞及其与抗CD20抗体联合对THP-1细胞具有一定的杀伤能力，但是野生型的NK-92细胞杀伤能力很弱，仅有约30％的杀伤力；联合抗CD20抗体后，杀伤能力得到强化；使用基因修饰的NK-92-mu-IL-2细胞，可以有效杀死肿瘤细胞，在前期的研究中表明，转染并表达该突变IL-2，可以促进NK-92细胞增殖，从而有利于其发挥肿瘤杀伤作用；基因修饰的NK-92-mu-IL-2细胞联合抗CD20抗体后，肿瘤杀伤能力得到出人意料的强化，杀伤率显著高于其他实验组。
4.2细胞因子释放测定
取上述细胞杀伤实验中各组的细胞上清，采用ELISA试剂盒(购自美国BD公司)检测上清中的TNF-α、IFN-γ浓度，具体步骤按照试剂盒说明书进行。
TNF-α是一种已知的抑癌因子，可介导多种抗肿瘤机制，发挥抗肿瘤作用。如图3所述，使用mu-IL-2修饰后可显著提高TNF-α的表达水平，有利于激活TNF-α相关抗肿瘤通路；联合抗CD20抗体后TNF-α的表达并未明显提高，说明抗CD20抗体对于TNF-α的分泌影响有限；这种现象在使用野生型的NK-92细胞中也得到了类似的结果。
IFN-γ是最早发现的一种可以干扰病毒复制的细胞因子之一，后来逐渐发现其不同程度地参与了其他病原体感染、肥胖、妊娠、过敏反应、肿瘤以及自身免疫疾病，完整的IFN-γ信号体系是诱导肿瘤细胞MHC-I类分子表达并充分提呈抗原，从而被效应T细胞有效识别并杀伤的必要环节。有报道称，抗CD20抗体可调节IFN-γ的表达水平，本发明中所提供的抗CD20抗体也具有这种特性，如图4所示，NK-92细胞联合抗CD20抗体后可显著促进IFN-γ的分泌，且在NK-92-mu-IL-2细胞联合抗CD20抗体中，IFN-γ的分泌水平似乎更高，说明其能够通过调节IFN-γ通路杀死肿瘤细胞。
实施例5动物实验
选用3-4周龄，SPF级，BALB/c裸鼠，室温26-28℃，空气湿度40％-60％，饲养1周以实验适应环境。培养THP-1细胞至对数生长期，使用无菌PBS调整细胞密度至2×105/μL单细胞，麻醉裸鼠并将其固定于操作台上，用微量注射器脑内注射入THP-1细胞5μL(细胞数1×106个)，造模一周后经活体成像仪检测，证明造模成功。
将实验动物随机分为4组，NK-92组，尾静脉注射1×106个NK-92细胞；NK-92-mu-IL-2组，尾静脉注射1×106个NK-92-mu-IL-2细胞；联合组1，尾静脉注射1×106个NK-92细胞，每3天注射50mg/kg抗CD20抗体；联合组2，尾静脉注射1×106个NK-92-mu-IL-2细胞，每3天注射50mg/kg抗CD20抗体；对照组，每3天注射1mL无菌生理盐水。每日观测实验动物的生存情况，记录并计算各组模型动物的平均生存时间。
如图5所示，使用未经处理的NK-92细胞在体内治疗白血病肿瘤模型的效果并不理想，与对照组相比未见显著延长生存期作用，这可能是用于该NK-92细胞在体内肿瘤环境中的生存时间较短，难以发挥有效的治疗作用；而导入mu-IL-2基因后，可显著延长体内NK-92细胞的生存时间，mu-IL-2具有较强的促增殖能力，且可自主生产和分泌，起到了长效治疗的作用，故使得裸鼠模型生存期显著改善；抗CD20抗体的使用能够有效靶向肿瘤细胞，使得抗肿瘤效果得到强化，动物生存期得到大幅度延长，联合经过基因修饰的NK-92细胞，抗肿瘤效果更加显著，不仅使得生存期得到大幅度提高，肿瘤生长也受到明显抑制，免疫因子表达水平得到改善。
虽然本发明参考其示例性的实施例已经进行了具体显示和描述，本领域的技术人员应当理解的是，在不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的多种改变。
序列表
<110> 南京涵台余生物科技有限公司
<120> NK细胞的制备方法及其抗癌的应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Gln Ser Pro Ala Cys Glu
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Cys Trp Arg Ser Ala Ser Gln Glu
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Gly Pro Gln Gln Ser Gly Phe Ser Thr Ser Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Ser Thr Phe Ser Leu Lys Gly
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Trp Ser Gly Gly Val Ser
1 5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Phe Thr Ile Gln Met Pro Glu Tyr Cys Asn Ser Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Pro Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Lys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ala Cys Glu
20 25 30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Leu Gly Leu Glu Trp Val Ala
35 40 45
Val Thr Cys Trp Arg Ser Ala Ser Gln Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Gly Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Gly Pro Gln Gln Ser Gly Phe Ser Thr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Lys
115 120
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Glu Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ser Thr Phe Ser Leu Lys Gly Trp
20 25 30
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Glu Trp
35 40 45
Ser Gly Gly Val Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Tyr Ser
50 55 60
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Glu Leu Glu Pro Glu Asp Phe
65 70 75 80
Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Thr Ile Gln Met Pro Glu Tyr Cys Asn Ser
85 90 95
Lys Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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1 5 10 15
Leu Cys Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Phe Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Ser Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Met Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Cys Thr Phe Thr Gln Ser Ile
115 120 125
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130
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcgccgacca gcagcagcac caaaaaaacc cagctgcagc tggaacatct gtgcctggat 60
ctgcagatga ttctgaacgg cattaacaac tataaaaact ttaaactgac ccgcatgctg 120
acctttaaaa gctatatgcc gaaaaaagcg accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 180
gaagaactga aaccgctgga aatggtgctg aacctggcgc agagcaaaaa ctttcatctg 240
cgcccgcgcg atctgattag caacattaac gtgattgtgc tggaactgaa aggcagcgaa 300
accaccttta tgtgcgaata tgcggatgaa accgcgacca ttgtggaatt tctgaaccgc 360
tggtgcacct ttacccagag cattattagc accctgacc 399
<210> 11
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130

Claims (9)

1.一种抗CD20抗体，其特征在于所述抗体包括如SEQ ID NO:1-3所示重链CDR区和SEQID NO:4-6所示轻链CDR区。
2.根据权利要求1所述的抗CD20抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区如SEQ IDNO:7所示。
3.根据权利要求1所述的抗CD20抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区如SEQ IDNO:8所示。
4.一种药物组合物，包括如权利要求1-3中任一项所述的抗CD20抗体，以及免疫细胞，所述免疫细胞携带有编码如SEQ ID NO:9所示的人白细胞介素2突变体的基因。
5.如权利要求5所述的药物组合物，所述人白细胞介素2突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示。
6.如权利要求4所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞选自T细胞和/或NK细胞。
7.如权利要求6所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞选自NK-92细胞。
8.权利要求1至3中任一项所述的抗CD20抗体或权利要求4至7中任一项所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，所述肿瘤选自淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤。
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