KR20220012224A - 입양 전달 요법에서 t 림프구 및 nk 세포의 확장 및 분화를 위한 방법 - Google Patents

입양 전달 요법에서 t 림프구 및 nk 세포의 확장 및 분화를 위한 방법 Download PDF

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카렛 레온 몬존
갈리아 마젤라 몬탈보 베레오
조지 쿠코스
멜리타 어빙
엘리사베타 크리비올리
야켈린 오티즈 미란다
앙겔 데 제수스 코리아 오소리오
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센트로 데 인뮤놀러지아 모레큘러
루드비히 인스티튜트 포 캔서 리서치 리미티드
쌍트르 오스삐딸리에 위니베르씨떼 보두와
유니버시티 오브 로잔
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Abstract

본 발명은 암 치료에 유용한 입양 전이 요법을 위한 소망하는 표현형을 가진 림프양 세포를 얻기 위한 방법을 개시한다. 특히, 본 발명은 소망하는 중추 기억 표현형을 가진 세포의 확장을 위해 중간 친화도 IL-2 수용체를 통한 우선적 신호전달을 유도하기 위한 전략과 관련된다. 본 발명의 방법은 종양-침윤 림프구, TCR 또는 암 치료를 위한 키메라 항원 수용체 조작된 T 세포를 얻는데 유용하다.

Description

입양 전달 요법에서 T 림프구 및 NK 세포의 확장 및 분화를 위한 방법
본 발명은 생명공학 및 면역종양학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 소망하는 중추 기억(central memory) 표현형을 가진 림프양 세포(lymphoid cells)를 얻는 방법 및 암 환자의 입양세포 전이 요법(adoptive cell transfer therapies)에서 그것의 사용에 관한 것이다.
인터류킨-2(IL2)는 분자적으로 특성화되어 발견된 최초의 사이토카인이었다. 이것은 주로 T 및 NK 세포의 성장과 확장을 지원하는 것으로 밝혀졌다(Morgan et. al., 1976, Science, 193 (4257):1007-1008). IL2는 1992년에 임상 사용이 승인되었지만 그 수용체의 생물학적 역활에 대해서는 아직 연구 중이다(Rosenberg, 2014, J. Immunol., 192(12):5451-8; Smith, 2006, Medical Immunology, 1476 (9433):5-3). 고용량 IL2 투여(HD IL2)는 암 면역 요법으로서 사용된다. 전신 HD IL2 치료는 흑색종 및 신장암 암종 환자에서 지속적인 반응을 야기하지만 그 비율은 비교적 낮다. 더욱이, 전신 HD IL2 치료는 유의한 독성을 유도하므로, 임상 적합성을 더 제한한다(Atkins, 2006, Clin. Cancer Res., 12:2353-2358).
IL2는 림프양 세포 상의 3가지 종류의 수용체(IL2R)와 상호작용하는데, 이들은 IL2Rα 서브유닛(CD25)만을 함유하는 저 친화도 수용체(Kd ~10-8 M); IL2Rβ 및 IL2Rγ 서브유닛(CD122 및 CD132)에 의해 형성된 중간 친화도 수용체(Kd ~10-9 M); 및 IL2Rα, IL2Rβ 및 IL2Rγ의 3개 서브유닛을 함유하는 고 친화도 수용체(Kd ~10-11 M)이다. 이 중 중간-친화도(IL2Rβγ) 수용체와 고-친화도(IL2Rαβγ) 수용체만이 기능성이며, 세포에 신호를 전달할 수 있다(Stauber et. al., 2005, PNAS, 103(8):2788-2793; Wang, 2005, Science, 310(18):1159-1163).
IL2Rβ 및 IL2Rγ 서브유닛이 면역 시스템의 이펙터 림프양 세포에 존재하지만, IL2Rα 서브유닛의 구성성 발현이 조절성 T 세포(Treg)에 고 친화도 수용체를 제공함으로써 IL2가 생체 내에서 우선적으로 사용된다(Malek, 2008, Annu Immunol., 26:453-79). 암 환자에 대한 전신 HD IL2 요법의 효능에 대한 일부 문제점은 IL2에 의해 추진되는 Treg의 우선적 확장으로 인한 것이며, 이것은 항종양 면역을 약화시킨다(Choo Sim et. al., 2014 , J. Clin. Invest., 124(1):99-110)
암에 대한 전신 HD IL2 요법의 효능을 개선하기 위해 많은 시도가 이루어졌다. 몇몇 연구는 림프양 세포 상의 IL2 수용체 서브유닛의 차등 발현에 기초하여 일부 생물학적 특성이 증가 또는 저하되도록 자생 IL2를 돌연변이시키는 것이 가능함을 밝혔다(Skrombolas and Frelinger, 2014, Expert. Rev. Clin. Immunol., 10(2):207-217)). 초기 연구는 IL2Rα에 대한 IL2 친화력을 증진시키는데 집중했다(Rao et al., 2003, Protein Engineering, 16(12):1081-1087). 당시에는 분명하지 않았지만 현재 이 전략은 Treg의 대규모 자극의 결과로서 생체내 면역 반응을 실제로 하향조절한다는 것이 확인되고 있다. 보다 최근에는 1992 년에 Levin 등이 IL2Rβ 서브유닛에 대한 결합이 증진된 IL2 돌연변이체를 얻었고, 이것은 중간 친화도 IL2 수용체를 과발현하는 이펙터 세포를 우선적으로 활성화한다(Levin et. al., 2012, Nature, 484(7395):529-33). "수퍼카인 H9"로 명명된 이 뮤테인은 자생 IL2보다 개선된 생체내 항종양 효과 및 적은 독성을 나타냈다. Carmenate 등은 인간 IL2에 4개의 돌연변이 도입을 보고했는데, 이것은 이량체인 중간 친화도 수용체(IL2Rβγ)와의 상호작용에는 영향 없이 IL2Rα에 대한 친화도를 효과적으로 감소시켰다. 이 뮤테인은 생체내 투여되었을 때 Treg의 확장을 억제했고, 마우스 모델에서는 자생 IL2보다 더 효과적이고 덜 독성이었다(Carmenate et. al., 2013, J. Immunol., 190(12):6230-8). 2개의 다른 IL2 뮤테인, 즉 F42K 및 R38A도 IL2Rα에 대한 IL2 결합 친화도를 크게 감소시켰으며, 시험관내 Treg 자극에 대한 효과는 적게 나타내면서 동시에 LAK 세포를 효과적으로 확장시켰다(Heaton et. al., 1994, Ann. Surg. Oncol., 1(3):198-203).
전신 HD IL2 요법을 개선하기 위한 다른 시도로서, 몇몇 연구는 항체(Ab)의 Fc 부분에 대한 PEG화(PEGylation) 또는 융합에 의해 반감기를 증가시키는데 집중했다. 실제로 이들 전략 중 일부는 생체내 IL2 반감기의 유효한 증가를 가져왔고, 전체적인 항종양 효과에 긍정적인 영향을 미쳤다(Zhu et. al., 2015; Cancer Cell, 27:498-501; Charych et. al., 2016 , Clin.CancerRes., 22(3):680-90).
입양 세포 전이(ACT)는 도너로부터 세포가 회수되고 시험관내 배양 및/또는 조작된 다음 질환 치료를 위해 환자에 투여되는 치료 방법으로서 정의된다. 암 치료를 위해 ACT는 림프구의 전이를 수반한다(Gattinoni et. al., 2006, Nat. Rev. Immun., 6:383-393). 3가지 치료 양식이 현재 널리 사용되며, 이들은 a) 생체외 확장된 종양 침윤 림프구(TIL)의 사용; b) 종양-항원 유도된 펩타이드에 대해 높은 친화도/결합도를 가진 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 유전적으로 조작된 T 또는 NK 세포의 사용; 및 c) 종양-항원에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 T 또는 NK 세포의 사용이다. 후자의 전략은 전이된 림프구의 추가 유전자 조작과 조합되어, 이들의 생체내 이펙터 기능이 증진되는데, 예를 들어 IL12 및 다른 것들로서 관련된 사이토카인의 분비를 조작한다(Cassian Y., 2018, Curr. Opin. Immunol., 51:197-203).
항종양 면역을 유도하는 능력에도 불구하고 암 치료에 ACT를 광범위하게 적용하는 데는 몇 가지 잘 알려진 제한이 있다. 종양-반응성 T 이펙터 세포의 전이는 목표한 반응을 야기할 수는 있지만, 중추 기억 표현형을 가진 T 세포가 항종양 반응의 더 뛰어난 매개체임을 입증하는 강한 증거가 인간과 마우스에 모두 존재한다(Klebanoff et al., 2005, PNAS, 102(27):9571-6). 중추 기억 T 세포는 주변 림프절로의 이동에 필요한, CD62L 분자를 발현하는 항원-경험(antigen-experienced) 세포(CD44+)이다(Ridell et. al., 2014, Cancer J., 20(2):141-144). 이 세포는 생체내에서 더 오래 지속되는데, 이것은 항원 재만남시(TCF1+) IL2와 같은 사이토카인을 증식시키고 분비하는 큰 능력 때문일 가능성이 크다. 반면에, 이펙터 기억 T 세포는 CD62L 분자의 하향조절, 억제성 수용체(PD1, TIM3, LAG3)의 상향조절 및 사이토카인 방출의 손상이 유의하게 나타나는 항원-경험 세포이다. 이 세포는 생체내에서 점점 고갈되는 경향을 가진다(Kishton et. al. 2017, Cell. Metab., 26(1):94-109; Klebanoff et. al., 2005, PNAS, 102(27):9571-6). 따라서, 중추 기억 표현형을 가진 세포의 확장을 촉진하는 배양 조건이 보다 나은 ACT 암 면역요법을 개발하는데 훨씬 더 요망된다.
IL2는 시험관내에서 T 세포 및 NK 세포의 활성화와 확장을 촉진하므로 암에 대한 ACT 요법을 개발하는데 있어서 주된 역할을 해왔다. 초기 전략에서, IL2는 림포카인 활성화 킬러(LAK) 세포를 생성하기 위해 사용되었다. LAK와 전신 HD IL2의 병용투여는 전신 단독요법의 임상 반응을 증가시켰다. 다른 접근법에서, 종양 추출물로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 확장시키기 위해 고 농도의 IL2가 주로 사용된다. TIL은 시험관내에서 TCR 자극과 조합된 IL2의 존재하에 더 빠르게 확장한다. 확장된 TIL은 전신 HD IL2 섭생법과 함께 암 환자에 주입된다. 전신 HD IL2 섭생법은 전이된 세포의 생체내 지속성을 유지하는데 기여한다. 종합적인 결과로서, TIL + HD IL2 치료는 상당히 인상적인 종양 퇴행을 어느 정도 야기했지만, 전신 HD IL2-요법의 알려진 제한은 유지되었다(Rosenberg, 2014, J. Immunol., 192(12) 5451-8). ACT에 대한 애쥬번트로서, 전신 HD IL2의 효능을 증가시키려는 보다 최근의 시도는 서로 특이적으로 결합하지만 야생형 인간 대응물에는 결합하지 않는 돌연변이체 IL2 사이토카인과 돌연변이체 IL2 수용체를 사용하여, 수용체-리간드 직교화(orthogonalization)에 기반한 방법을 개발했다. 이 전략에 따라, 본 발명자들은 직교형 IL-2 사이토카인-수용체 쌍을 사용하여 조작된 T 세포를 향한 IL2의 특이성을 재정립하며, 제한된 표적외 활성 및 무시할만한 독성과 함께 조작된 전이된 T 세포의 선택적 확장을 제시하였다. 오쏘 IL2에서 확장된 오쏘-IL2R T 세포는 ACT의 마우스 암 모델에서 사용되었을 때 종양 부피를 감소시키고 생존을 증가시키는데 효과적이었다(Sockolosky et. al., 2018, Science, 359 (6379):1037-1042).
ACT와 관련된 T 세포 반응을 조절하기 위한 IL2의 독특하고 효과적인 역할에도 불구하고, 기억 T 세포의 확장/분화에 대한 IL2(긍정적 또는 부정적)의 정확한 효과는 완전히 이해되지 않고 있다. IL2의 존재 하에 시험관내 확장된 세포는 강한 이펙터 능력을 나타내며, 이것은 또한 생체내에서의 장기적 지속성 및 생존을 단축시켰다. IL2는 독특한 방식으로 T 세포의 활성화 및 증식을 촉진하지만, 또한 활성화-유도 세포사를 유도하기도 한다(Spolski et. al., 2018, Nat. Rev. Immunol., (18) 648-659). 연구들은 시험관내 프라이밍 동안 IL2 신호전달을 감소시키는 것이 기억 CD8+ T 세포의 발생에 유리할 수 있음을 밝혔다. IL2 신호전달의 감소는 주로 IL2 농도를 낮추거나 또는 시험관내 배양 동안 노출 시간을 줄임으로써 달성되었다. 일부 문헌에서, IL2의 사용을 공통 γ 사슬 패밀리의 다른 사이토카인으로 부분적으로 대체했다. 시험관내 T 세포 활성화 및 확장을 위한 많은 전략은 IL7, IL15 또는 IL21를 상이한 프로토콜에 따라 사용하지만, 이들은 전형적으로 어느 정도는 IL2와 조합한다(Hinrichs et .al., 2008; Blood, 111(11) 5326-5333; Mueller et. al., 2008, Eur. J. Immunol., 38(10) 2874-85; Zeng et. al., 2005, J. Exp. Med., 201(1) 139-48; Markley and Sadelain, 2010, Blood, 115(17) 3508-3519; Zhang et. al., 2015, Clin. Cancer Res., 21(10): 2278-88). 따라서, IL2는 ACT 면역요법에서 T 세포 활성화 및 확장을 위한 표준으로서 여전히 남아있다.
IL2/IL2R 상호작용의 복잡성과 T 세포 분화에 대한 그 영향은 아직 명확하지 않다. 특히, 시험관내 림프양 세포 확장/분화에 대한 상이한 IL2R(고 친화도 대 중간 친화도)를 통한 우선적 신호전달의 영향은 여전히 밝혀지지 않고 있다. 상기 언급된 IL2 뮤테인 중 어느 것도 ACT를 위해 시험관내 T 세포 확장 및 분화에 사용된 적이 없고, IL2R의 잘 알려진 기능적 형태 중 하나를 통해서 IL2 신호전달을 우선적으로 지시하기 위해 IL2/IL2R 상호작용을 합리적으로 수정하는 전략도 사용된 적이 없다.
본 발명자들은 놀랍게도 시험관내 세포 활성화/확장 동안 IL2/IL2Rα 상호작용을 억제함으로써 중간 친화도 IL2R을 통해 IL2 신호를 우선적으로 지시하는 상이한 제제/전략을 사용할 때의 이점을 발견했다. 이러한 제제/전략은 자생 IL2 신호전달을 사용하는 전통적인 배양 전략과 비교하여 현저한 중추 기억 표현형 및 상당한 항원 특이적 사멸 능력을 가진 종양-특이적 세포를 효과적으로 확장시킨다. 본 발명은 암 환자에서 입양 전이 요법 사용 전, 시험관내 세포 확장/분화를 위한 현재 프로토콜을 실질적으로 개선한다.
발명의 간단한 설명
본 발명은 대상으로부터 얻어진 샘플 중의 림프구 또는 이러한 샘플로부터 분리된 림프구를 확장시키는 단계를 포함하는 중추 기억 표현형을 가진 림프구의 부화 및 확장을 위한 시험관내 또는 생체외 방법을 제공하며, 여기서 확장 단계는 β/γ 이량체 IL-2 수용체의 활성화를 포함한다.
본 발명은 대상으로부터 얻어진 샘플 중의 림프구 또는 이러한 샘플로부터 분리된 림프구를 확장시키는 단계를 포함하는 중추 기억 표현형을 가진 림프구의 부화 및 확장을 위한 시험관내 또는 생체외 방법을 제공하며, 여기서 확장 단계는 β/γ 이량체 IL-2 수용체의 활성화를 포함한다.
본 발명은 입양세포 전이 요법에서 사용하기 위한 중추 기억 표현형을 가진 림프구의 부화 및 확장을 위한 방법을 제공하며, 여기서 확장 단계는 β/γ 이량체 IL-2 수용체의 활성화를 포함한다.
본 발명은 세 단계를 포함하는 입양세포 전이 요법에서 유용한 중추 기억 표현형을 가진 림프양 세포 집단의 확장 및/또는 분화 방법과 관련된다. 상기 단계는 다음과 같다:
i) 대상으로부터 림프양 세포를 추출하는 단계,
ii) 중간 친화도 IL-2 수용체를 통한 우선적 신호전달(이후 IL2Rβγ-편향-IL2 신호전달이라고 함)을 유도하면서, 림프양 세포 또는 선택적으로 더 유전적으로 조작된 림프양 세포를 시험관내 확장하는 단계, 및
iii) 암을 가진 대상에 활성화된/확장된 세포를 전이시키는 단계.
특히, 이 방법은 림프양 세포를 활성화/확장하면서 중간 친화도 IL2 수용체를 통한 우선적 신호전달을 유도하기(IL2Rβγ-편향-IL2 신호전달을 제공하기) 위해 상이한 전략들을 이용한다. 이들 전략은 다음 중 어느 것일 수 있다:
- 중간 친화도 IL2R을 통해 우선적으로 신호전달하는 가용성 IL-2 뮤테인과 함께 림프양 세포의 배양.
- 중간 친화도 IL2R을 통해 우선적으로 신호전달하는 IL2 뮤테인을 분비하도록 림프양 세포의 유전적 변형.
- 자생 IL-2와 함께 림프양 세포의 배양, 단:
a) IL2-IL2Rα 상호작용을 차단하는 약리학적 제제의 첨가,
b) IL2-IL2Rα 상호작용을 차단하는 가용성 단백질을 분비하도록 림프양 세포를 유전적으로 조작,
c) 세포 표면에서 IL2Rα 수용체 서브유닛(CD25)의 발현을 감소시키도록 림프양 세포를 유전적으로 조작, 또는
d) 세포 표면에서 중간 친화도 IL-2 수용체의 발현을 증가시키도록 림프양 세포를 유전적으로 조작.
더 구체적으로:
상기 방법에 사용된 IL-2 뮤테인은 본 발명의 SEQ ID NO. 1-6에 상응하는 US 9,206,243에 설명된 것들; 본 출원의 SEQ ID NO. 7에 상응하는 2012년에 Levin 등에 의해 개시된 수퍼카인 H9; 뿐만 아니라 본 발명의 SEQ ID NO. 8에 상응하는 WO 2017/202786의 SEQ ID NO 1에 기재된 F42 뮤테인을 포함하지만, 이들 분자에 제한되는 것은 아니다(Levin et al. in: Nature (2012). 48:529-535).
IL2-IL2Rα 상호작용을 차단하는데 사용된 약리학적 제제는 IL2Rα 또는 IL2에 결합하는 항체 또는 항체 단편; IL2Rα 또는 IL2에 결합하는 펩타이드 또는 화학적으로 정의된 소 분자; IL2Rα(CD25)의 가용성 형태 또는 그것의 변형된 변이체로부터 선택되지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법의 단계 ii)에서, IL2Rβγ-편향-IL2 신호전달은 림프양 세포 배양/확장의 상이한 시기들에 제공될 수 있다. IL2Rβγ-편향-IL2 신호전달은 시험관내 배양 동안 항상 또는 특정 시기에 제공될 수 있다. 더욱이, IL2Rβγ-편향-IL2 신호전달은 세포의 생체내 전이 후에도 유지될 수도 있고 유지되지 않을 수도 있다.
단계 ii)에서, 림프양 세포 확장은 다른 사이토카인, 예를 들어 IL12, IL17, IL15 및 IL21의 존재 하에 행해질 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
단계 iii)에서, 세포 전이는 단계 i)의 도너 대상에 또는 상이한 대상에 행해질 수 있다.
일부 실시형태에서, 중추 기억 표현형을 가진 림프구의 확장은 추가의 호르몬, 사이토카인, 및 림프구 확장에 최적화된 배양 조건의 사용을 포함한다.
상기 방법에 따른 림프양 세포는 다음 중 어느 것일 수 있다: T 세포의 혼합물, 정제된 CD4 또는 CD8 T 세포, NK 세포, NKT 세포. 림프양 세포는 말초혈 단핵세포, 종양 배액 림프절 또는 종양 침윤물로부터 단계 i)에서 얻어질 수 있다.
상기 방법에서 림프양 세포는 CAR 발현; 원하는 특이성의 TCR 발현; 세포막에서 다른 관심 수용체들의 발현; 관심 있는 상이한 사이토카인들 또는 가용성 단백질들의 분비를 위해 더 조작될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
종합하면, 본 발명의 방법은 전이된 세포의 지속성을 연장하고 생체외, 시험관내 및 생체내에서 높은 항종양 효과를 나타낸다.
특정 실시형태에서, 샘플은 배액 림프절로부터 얻어진다. 다른 실시형태에서, 샘플은 미처리 종양 단편, 효소 처리된 종양 단편, 분리/현탁된 종양 세포, 림프절 샘플, 또는 체액(예를 들어 혈액, 복수 또는 림프) 샘플이다. 특정 실시형태에서, 대상은 인간이다.
다른 양태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 림프구의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 치료가 필요한 대상에서 종양을 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 특정 실시형태에서, 종양은 고상 종양이다. 특정 실시형태에서, 종양은 액체 종양이다.
본 발명의 다른 주제는 입양세포 전이 요법에서, 특히 종양-침윤 림프구 또는 키메라 항원 수용체 T를 획득하는데 있어서 및 더 구체적으로 암의 치료에서 상기 방법의 사용이다.
또한, 본 발명에 의해 얻어진 세포가 본 발명의 주제이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 대상으로부터 얻어진 샘플 중의 림프구 또는 이러한 샘플로부터 분리된 림프구를 확장시키는 단계를 포함하는 중추 기억 표현형을 가진 림프구의 부화 및 확장을 위한 생체외 방법을 제공하며, 여기서 확장 단계는 β/γ 이량체 IL-2 수용체의 활성화를 포함한다.
본 발명은 대상으로부터 얻어진 샘플 중의 림프구 또는 이러한 샘플로부터 분리된 림프구를 확장시키는 단계를 포함하는 중추 기억 표현형을 가진 림프구의 부화 및 확장을 위한 시험관내 방법을 제공하며, 여기서 확장 단계는 β/γ 이량체 IL-2 수용체의 활성화를 포함한다.
본 발명은 입양세포 전이 요법에서 사용하기 위한 중추 기억 표현형을 가진 림프구의 부화 및 확장을 위한 방법을 제공하며, 여기서 확장 단계는 βγ 이량체 IL-2 수용체의 활성화를 포함한다.
본 발명은 ACT 요법에서의 사용을 위한, 생체외, 시험관내 및 생체내에서 T 림프구 상에서 IL2 수용체를 통한 신호전달의 변형에 의존한다. 본 발명은 주로 생체내 전이 전, 림프양 세포의 시험관내 활성화 및 확장에 사용된 자생 IL2(및 그것의 자생적으로 유도된 신호)를 중간 친화도 IL-2 수용체를 통해 우선적 신호전달을 유도하는(IL2Rβγ-편향-IL2 신호를 유도하는) IL2-유사 대용물로 대체하는 것을 목적으로 한다. 즉, IL2-유사 대용물은 IL2-이량체 수용체(IL2Rβγ)와 우선적으로 상호작용하고 그것을 통해서 신호전달하도록 지시된다. 이러한 대용물은 다음을 포함하지만 이들에 제한되는 것은 아니다:
- 중간 친화도 IL2R(IL2Rβγ)을 통해 우선적으로 상호작용하고 신호전달하는 가용성 IL-2 뮤테인과 함께 림프양 세포의 배양.
- 중간 친화도 IL2R을 통해 우선적으로 신호전달하는 IL2 뮤테인을 분비하도록 림프양 세포를 유전적으로 조작.
- 자생 IL-2의 존재 하에 림프양 세포의 배양, 단:
a) IL2-IL2Rα 상호작용을 차단하는 약리학적 제제의 첨가, 또는
b) IL2-IL2Rα 상호작용을 차단하는 가용성 단백질을 분비하도록 림프양 세포를 유전적으로 조작, 또는
c) 세포 표면에서 IL2Rα 수용체 서브유닛(CD25)의 발현을 감소시키도록 림프양 세포를 유전적으로 조작, 또는
d) 세포 표면에서 중간 친화도 IL-2 수용체의 발현을 증가시키도록 림프양 세포를 유전적으로 조작.
본원에 개시된 방법은 생체내 전이되었을 때 종양 제어에 매우 효과적인, 중추 기억 표현형을 가진 활성화된 림프양 세포를 생성/확장하기 위한 전략을 제공한다. 본 발명은 ACT 요법을 위한 현재의 전략을 실질적으로 개선 시킨다.
본 발명의 방법에 따른 림프양 세포의 배양은 면역세포의 시험관내 배양을 위한 적합한 환경 조건하에 적합한 배양 배지를 사용하여 수행될 수 있다. 림프양 세포 확장은 또한 다른 사이토카인, 예를 들어 IL12, IL17, IL15 및 IL21의 존재하에 행해질 수 있다. 림프양 세포 확장은 ACT와 관련하여 보고된 프로토콜 중 어느 것을 따를 수 있다. 이들 프로토콜에서 자생 IL2가 사용되는 배양 단계에서, 본원에 상세히 설명된 IL2-유사 대용물 중 어느 것이 자생 IL2 제공된 신호를 대체하기 위해 사용된다.
상기 방법에서 림프양 세포는 CAR 발현; 원하는 특이성의 TCR 발현; 세포막에서 다른 관심 수용체들의 발현; 관심있는 상이한 사이토카인들 또는 가용성 단백질들의 분비를 위해 더 조작될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
상기 방법에 따른 림프양 세포는 다음 중 어느 것일 수 있다: T 세포의 혼합물, 정제된 CD4 또는 CD8 T 세포, NK 세포, NKT 세포. 림프양 세포는 PBMC, 종양 배액 림프절 또는 종양 침윤물로부터 얻어질 수 있다.
용어 "IL2 뮤테인", "비α-뮤테인", "비α-IL2-뮤테인", "IL-2 뮤테인", "부분 작용제(agonist) IL2", 또는 "돌연변이체 IL2"는 본원에서 상호 교환하여 사용되며, 돌연변이된 인터류킨 2 단백질, 또는 변형된 인터류킨 2 단백질을 말하고, 이때 돌연변이는 β/γ 이량체 IL-2 수용체의 활성화를 유도하거나, IL2-이량체 수용체(IL2Rβγ)와 우선적으로 상호작용하거나, IL2Rβγ-편향-IL2 신호를 유도하거나, IL2Rα에 대해 감소된 친화도를 가지거나 또는 β/γ IL2 수용체에 대해 더 높은 친화도를 가진다. 이들 돌연변이되거나 변형된 IL2 뮤테인의 비제한적 예들은 Seq. 1-7이다.
용어 "림프구" 또는 "림프양 세포"는 본원에서 상호 교환하여 사용되며, 동물의 면역을 매개하는 임의의 세포를 말하고, 림프구, 림프모구 및 형질세포를 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 이 용어는 항원에 대한 다양한 세포-표면 수용체를 보유하고 적응면역반응을 담당하는 백혈구 부류를 말한다. 이들은 선천면역반응과 적응면역반응을 매개할 수 있다. 이들은 체액성 및 세포-매개 면역을 매개할 수 있다.
본 발명에서 제안된 전략은 암 치료를 위한 ACT 요법에서 치료 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 얻어진 중추 기억 표현형을 가진 림프구 집단의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 치료가 필요한 대상에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 종양은 고상 종양(예를 들어 난소 종양, 흑색종, 폐 종양, 위장 종양, 유방 종양)이다. 특정 실시형태에서, 종양은 액체 종양(예를 들어 백혈병 또는 림프종)이다. 특정 실시형태에서, 종양은 종양 항원을 포함하는 적어도 하나의 펩타이드와 일치하는 돌연변이를 발현한다. 특정 실시형태에서, 대상은 인간이다.
중간 친화도 IL2R(IL2Rβγ)를 통해 우선적으로 상호작용함으로써 신호전달하는 IL2로부터 유도된 조작 사이토카인의 사용
본 발명의 한 실시형태는 IL2 뮤테인을 사용하여 T 세포 활성화 및 확장 프로토콜 동안 중간 친화도 이량체 IL2 수용체-IL2Rβγ를 통해서 IL2 신호전달을 특이적으로 지시하는 것에 관한 것이다. IL2 뮤테인은, 제한은 아니지만, IL2Rα 상호작용 친화도가 감소된 변이체, 예를 들어 US 9,206,243에 개시된 것들; IL2Rβ 상호작용 친화도가 증가된 변이체, 예를 들어 Levin et al., 2012에 설명된 수퍼카인 H9; 또는 이 두 가지가 조합된 변이체(IL2Rα 상호작용 친화도는 낮고 IL2Rβ 상호작용 친화도는 더 큼)를 포함한다. 림프구는 특이적 TCR 신호전달, CD3/CD28 활성화 및/또는 다른 생존 사이토카인과 조합된 이들 뮤테인에 의해 활성화된다. 이 IL2-유사 신호는 배양 내내 유지될 수 있거나 또는 특정 배양 단계에서 사용될 수 있고, 우선적으로는 최초의 활성화 시기 동안 제공되어야 한다. 뮤테인은 1 ng/ml 내지 1 mg/ml의 농도 범위로 사용될 수 있다.
림프양 세포 확장은 ACT와 관련하여 보고된 프로토콜 중 어느 것을 따를 수 있다. 그러나, 원 프로토콜에서 자생 IL2가 사용되는 배양 단계에서, IL2 뮤테인이 대신 첨가된다. 예를 들어, 세포를 항체 항-CD3/CD28 및 IL2 뮤테인과 함께 배양하는 것에 기초한 프로토콜일 수 있거나, 또는 IL2 뮤테인과 IL7, IL15, IL12 및 IL21 같은 다른 사이토카인들을 조합할 수 있다.
중간 친화도 IL2R(IL2Rβγ)를 통해 우선적으로 신호전달하는 IL2 뮤테인을 분비하도록 림프양 세포의 유전적 조작
본 발명의 한 실시형태는 본 발명에서 언급된 IL2 뮤테인 중 어느 것을 분비하도록 림프양 세포를 유전적으로 변형하는 것에 관한 것이다. 림프양 세포의 변형은 ACT 기술과 관련하여 널리 사용되는 형질감염 또는 형질도입 방법 중 어느 것에 의해 행해질 수 있다. 예를 들어, 이것은 게놈 편집 기술 또는 바이러스 벡터를 사용하여 T 세포에 뮤테인 유전자를 가진 구성물을 도입함으로써 달성될 수 있다. 이 구성물은 또한 형질도입 효능의 용이한 추적을 위한 리포터 단백질 및 형질도입된 부분의 부화를 위한 항생물질 내성 유전자를 함유할 수 있다.
형질감염/형질도입의 효능은 높아야 한다. 이러한 효능은 적어도 시험관내 확장 동안 림프양 세포가 자가분비 IL2Rβγ-편향-IL2 신호를 스스로에 제공할 수 있을만큼 충분히 높아야 한다. 이러한 특정 과정은 생체내 전이 후 IL2Rβγ-편향-IL2 신호의 활용능을 림프양 세포에 부여할 수 있고, 더 나아가 세포 지속성 및 항종양 능력에도 기여한다.
조작된 림프양 세포의 세포 확장은 배양물에 자생 IL2를 첨가하지 않는 조건으로 ACT와 관련하여 보고된 프로토콜 중 어느 것을 따를 수 있다. 예를 들어, 림프양 세포는 특이적 TCR 신호전달, IL7, IL15 및 IL21 같은 생존 사이토카인이 보충된 및/또는 단독 CD3/CD28 활성화에 의해 활성화될 수 있다.
림프양 세포 배양물에 IL2-IL2Rα 상호작용을 파괴하는 약리학적 제제의 첨가
본 발명의 다른 실시형태는 ACT의 시험관내 림프양 세포 확장에서 자생 IL2가 사용되는 상태에서 IL2/IL2Rα 상호작용을 약리학적으로 파괴하는 상이한 방식들에 관한 것이다. 이러한 약리학적 제제의 첨가는 고 친화도 삼량체 IL2R에 대한 IL2의 접근을 차단함으로써 자생 IL2의 신호를 IL2Rβγ-편향-IL2 신호로 바꾼다.
활성화/확장 프로토콜은 특이적 TCR 신호전달, CD3/CD28 활성화 및 다른 관심 사이토카인들과 조합될 수 있다. 약리학적 제제와 IL2는 항상 함께 사용되어야 하며 동시에 배양물에 첨가되어야 한다. 결과의 IL2Rβγ-편향-IL2 신호는 배양 내내 유지될 수 있거나 또는 특정 배양 단계에서 사용될 수 있고, 우선적으로는 최초의 활성화 기간 동안 제공되어야 한다. 약리학적 제제는 차단 능력을 강화하기 위해 과량으로 사용되어야 한다. 구체적인 양은 IL2와 CD25의 결합을 차단하는 능력을 체크하면서 사례별로 보정되어야 된다.
본 발명에서 IL2-IL2Rα 상호작용을 차단하기 위해 사용된 약리학적 제제는, 제한은 아니지만, IL2Rα 또는 IL2에 결합하는 항체 또는 항체 단편; IL2Rα 또는 IL2에 결합하는 펩타이드 또는 화학적으로 정의된 소 분자; IL2Rα(CD25)의 가용성 형태 또는 그것의 변형된 변이체를 포함한다.
IL2에 결합하는 약리학적 제제의 경우, 이들은 IL2Rβγ를 통한 결합 및 신호전달에는 영향 없이 IL2Rα와의 상호작용만을 차단하는 능력에 대해 검증되어야 한다. 이들 제제는 배양물에 IL2과 별도로 첨가될 수 있지만, 원하는 복합체의 형성을 촉진하기 위해 미리 IL2와 혼합될 수도 있다.
이 실시형태에서, 림프양 세포 확장은 ACT와 관련하여 보고된 프로토콜 중 어느 것을 따를 수 있다. 그러나, 원 프로토콜에서 자생 IL2가 사용되는 배양 단계에서, 약리학적 제제가 또한 첨가된다. 예를 들어, 세포를 항-CD3/CD28 mAb 및 IL2 + 차단제와 함께 배양하는 것에 기초한 프로토콜일 수 있거나, 또는 IL2 + 차단제와 IL7, IL15, IL12 및 IL21 같은 다른 사이토카인들을 조합할 수 있다.
IL2와 IL2Rα의 상호작용을 차단하는 가용성 단백질을 분비하도록 림프양 세포의 유전적 조작
본 발명의 한 실시형태는 IL2와 IL2R의 상호작용을 특이적으로 차단하는 가용성 단백질을 분비하도록 림프양 세포를 유전적으로 변형하는 것에 관한 것이다. 림프양 세포의 변형은 ACT 기술과 관련하여 널리 사용되는 형질감염 또는 형질도입 방법 중 어느 것에 의해 행해질 수 있다. 예를 들어, 이것은 게놈 편집 기술 또는 바이러스 벡터를 사용하여 T 세포에 원하는 단백질 유전자를 가진 구성물을 도입함으로써 달성될 수 있다. 형질감염/형질도입의 효능은 높아야 한다. 이러한 효능은 적어도 림프양 세포가 IL2-IL2Rα 상호작용을 유의하게 차단하기에 충분한 가용성 단백질을 생성하고, 시험관내 확장 동안 IL2Rβγ-편향-IL2 신호를 스스로에 제공할 수 있을만큼 충분히 높아야 한다.
본 발명에서 IL2-IL2Rα 상호작용을 차단하는데 사용될 수 있는 단백질은, 제한은 아니지만, IL2Rα 또는 IL2에 결합하는 항체 또는 항체 단편; IL2Rα(CD25)의 가용성 형태 또는 임의의 변형된 변이체를 포함한다.
이 실시형태에서, 림프양 세포 확장은 ACT와 관련하여 보고된 프로토콜 중 어느 것을 따를 수 있다. 이 경우 변형 없이 세포 조작에 반드시 필요한 것들을 따른다. 예를 들어, 세포를 항-CD3/CD28 및 IL2와 함께 배양하거나, 또는 IL2와 IL7, IL15, IL12 및 IL21 같은 다른 사이토카인들을 조합할 수 있다.
세포 표면에서 IL2Rα 수용체 서브유닛(CD25)의 발현을 감소시키도록 림프양 세포의 유전적 조작
본 발명의 다른 실시형태는 세포 표면에서 IL2R의 발현을 감소시키도록 림프양 세포를 유전적으로 변형하는 것에 관한 것이다. 세포 조작을 위해 몇몇 전략이 사용될 수 있으며, 제한은 아니지만, 간섭 RNA, 게놈-편집 기술 및 녹아웃 전략을 포함한다. 림프양 세포의 변형은 ACT 기술과 관련하여 널리 사용되는 형질감염 또는 형질도입 방법 중 어느 것에 의해 행해질 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터를 사용하여 세포에 CD25 유전자를 표적화하는 shRNA를 가진 구성물을 도입함으로써 림프양 세포에서 CD25 발현의 감소 또는 완전한 억제가 달성될 수 있다.
이 실시형태에서, 림프양 세포 확장은 ACT와 관련하여 보고된 프로토콜 중 어느 것을 따를 수 있다. 이 경우 변형 없이 세포의 유전자 조작에 반드시 필요한 것들을 따른다. 예를 들어, 조작된 세포는 항체 항-CD3/CD28 및 IL2와 함께 배양될 수 있거나, 또는 IL2와 IL7, IL15, IL12 및 IL21 같은 다른 사이토카인들을 조합할 수 있다.
세포 표면에서 중간 친화도 IL-2 수용체의 발현을 증가시키도록 림프양 세포의 유전적 조작
본 발명의 다른 실시형태는 세포 표면에서 이량체 수용체 IL2Rβγ의 발현을 증가시키도록 림프양 세포를 유전적으로 변형하는 것에 관한 것이다. 이것은 바이러스 벡터를 사용하여 구성성-발현 프로모터하에 CD122(IL2Rβ 사슬) 유전자 또는 CD132(IL2Rγ 사슬) 유전자를 가진 구성물을 T 세포에 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안으로서, 이 전략에서, 자생 CD122 대신 IL2-친화도가 증가된 돌연변이된 CD122(IL2Rβ 사슬)를 발현하도록 T 세포가 변형될 수 있다. 이것은 게놈 편집 기술 또는 바이러스 벡터를 사용하여 림프양 세포에 돌연변이된 또는 야생형 CD122의 유전자를 가진 구성물을 도입함으로써 달성될 수 있다.
설명된 전략에서, 구성물은 또한 형질도입 효능의 용이한 추적을 위한 리포터 단백질 및 형질도입된 부분의 부화를 위한 항생물질 내성 유전자를 함유할 수 있다.
이 실시형태에서, 림프양 세포 확장은 ACT와 관련하여 보고된 프로토콜 중 어느 것을 따를 수 있다. 이 경우 변형 없이 세포의 유전자 조작에 반드시 필요한 것들을 따른다. 예를 들어, 조작된 세포는 항체 항-CD3/CD28 및 IL2와 함께 배양될 수 있거나, 또는 IL2와 IL7, IL15, IL12 및 IL21 같은 다른 사이토카인들을 조합할 수 있다.
치료 방법
관련된 양태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 림프구 집단의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 치료가 필요한 대상에서 종양을 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 특정 실시형태에서, 종양은 고상 종양이다. 특정 실시형태에서, 종양은 액체 종양(예를 들어 혈액암)이다.
도 1. 자생 IL2와 함께 배양되었을 때와 IL2βγ를 통해서 우선적으로 신호전달하는 IL2 뮤테인과 함께 배양되었을 때 얻어진 T 세포 표현형의 비교. A) 배양물 생존, B) 기억 및 이펙터 세포 퍼센트.
도 2. 자생 IL2와 함께 배양되었을 때와 광범위한 용량 범위의 중간 친화도 수용체 IL2βγ를 통해서 우선적으로 신호전달하는 IL2 뮤테인과 함께 배양되었을 때 T 세포에서 회수된 표현형의 비교. A) 배양물 생존, B) PD1 양성 세포 퍼센트 및 C) 중추 기억-유사 표현형을 가진 세포 퍼센트.
도 3. 자생 IL2와 함께 배양되었을 때와 IL7 및 IL15 사이토카인과 조합된 중간 친화도 수용체 IL2βγ를 통해서 우선적으로 신호전달하는 IL2 뮤테인과 함께 배양되었을 때 T 세포에서 회수된 표현형의 비교. A) 배양물 생존, B) 기억 및 이펙터 세포 퍼센트.
도 4. 자생 IL2와 함께 배양되었을 때와 IL7 및 IL15와 조합된, 광범위한 용량 범위의, 중간 친화도 수용체 IL2βγ를 통해서 우선적으로 신호전달하는 IL2 뮤테인과 함께 배양되었을 때 T 세포에서 회수된 표현형의 비교. A) 배양물 생존, B) PD1 양성 세포 퍼센트 및 C) 중추 기억-유사 표현형을 가진 세포 퍼센트.
도 5. IL2로 자극되었을 때와 IL2-뮤테인만으로 자극되었을 때 또는 IL2로 자극되었을 때와 IL7 및 IL15와 조합된 IL2-뮤테인으로 자극되었을 때 T 세포에서 회수된 표현형의 비교.
도 6A. T 세포에서 IL2 또는 IL2 뮤테인에 대한 형질도입의 효능을 측정하는, eGFP 양성 세포의 퍼센트를 나타내는 히스토그램.
도 6B. 자생 IL2 또는 IL2-뮤테인을 생성하도록 T 림프구가 형질도입되었을 때 배양물에서 회수된 중추 기억 및 이펙터 기억 표현형을 가진 세포 퍼센트의 비교.
도 7A. 상이한 shRNA 구성물을 사용한 형질도입 후 CD25 하향조절의 효능을 나타내는 히스토그램.
도 7B. T 림프구가 CD25의 감소된 발현을 나타낼 때 중추 기억 및 이펙터 기억 표현형을 가진 세포의 퍼센트.
도 8. CD8+ T 세포에서 항-CD25 항체를 이용했을 때 IL2Rβγ-편향-IL2 신호전달을 제공하는 효과의 비교. A) 배양물 생존 및 B) 기억 및 이펙터 세포 퍼센트.
도 9. IL2 단독, IL2+IL15+IL7, IL2-뮤테인 단독 또는 IL2-뮤테인+IL15+IL7의 경우 CD8+ T 세포의 기능적 능력. A) 펩타이드 SIINFEKL에 의해 재자극된 OTI CD8+ T 세포에 의한 그랜자임 β 생성, B) IL2, IL2-뮤테인 단독 또는 IL7 및 IL15와 조합하여 배양된 OT1 세포의 B16-OVA 세포에 대한 종양 사멸 능력.
도 10. 자생 IL2 또는 IL2 뮤테인과 함께 배양된 OT1 세포를 투여받은 MB16OVA 종양 보유 동물에서 종양 부피의 측정.
도 11. 자생 IL2 또는 중간 친화도 수용체 IL2βγ를 통해서 우선적으로 신호전달하는 IL2-뮤테인을 생성하도록 형질도입된 OT1 T 세포의 생체내 항종양 효과의 비교. A) 종양 부피, B) 시간 경과에 따른 생존.
도 12. IL2 또는 IL2 뮤테인과 함께 배양하기 전후 CD8+ TIL의 특성화. A) 확장 수준, B) TIL에 의한 Ki-67 발현 퍼센트 및 C) 나이브 T 세포(CD62L+CD44-), 중추 기억(CD62L+CD44+) 및 (CD62L-CD44+)의 분포.
도 13. IL2 또는 IL2 뮤테인과 함께 배양하기 전후 CD8+ TIL의 특성화. A) 억제성 마커 발현 퍼센트 및 B) IFNγ, TNFα 및 그랜자임 β.
도 14. IL2 또는 IL2 뮤테인과 함께 배양된 TIL에서 NK 세포의 확장. A) NK 세포 퍼센트 및 B) NK 세포 수.
실시예
실시예 1. IL2βγ를 통해서 우선적으로 신호전달하는 IL2-뮤테인으로 자생 IL2를 치환하는 것은 림프구 생육성을 보존하고 중추 기억-유사 표현형을 부여한다.
나이브 OT1 마우스 비장으로부터 CD8+ T 세포를 분리한다. 항CD3/항CD28 코팅된 비드를 자생 IL2와 함께 7일 동안 또는 IL2 뮤테인과 함께 10일 동안 TCR 자극에 사용한다. IL2 뮤테인은 Center of Molecular Immunology(배치 1201602)에서 얻어진 것이며, 특허 US 9,206,243의 SEQ ID NO 6에 공개된다. 2일마다 배양물을 확장시켜 밀도를 1x106으로 유지하고 사이토카인을 신선한 배지와 함께 첨가한다. 두 배양 조건에서 다수의 T 세포가 성공적으로 확장되며, 세포 수의 유사한 배수 증가가 관찰된다. 도 1A는 자생 IL2와 비교하여 IL2 뮤테인을 사용했을 때 배양물의 생육성이 개선된 것을 보여준다(p< 0.0001). 추가로, 기억 세포의 양 및 억제성 마커의 발현을 유세포계수법에 의해 측정했다. 자생 IL2와 비교하여 IL2-뮤테인을 사용했을 때 세포에서 유의하게 높은 퍼센트의 중추 기억-유사 표현형을 가진 세포(CD62L+/CD44+로 규정됨)가 관찰되었다(도 1B). PD-1, Lag-3, Tim-3, 및 Tigit 마커의 표현형 분석은 IL2-뮤테인 활성화된 세포가 면역 체크포인트 리간드(PD-1, Lag-3, Tim-3, Tigit)의 발현을 억제했음을 보여주었다(표 1).
시험관내 T 세포 활성화/확장에 자생 IL2 또는 IL2-뮤테인이 사용되었을 때 고갈 마커 발현(양성 세포 퍼센트)
마커 자생 IL-2 IL-2 뮤테인
PD1 2.61 0.38
TIM3 17.0 0.42
Lag3 79.9 15.9
Klrg1 12.4 0.06
생육성(도 2A), PD1 발현(도 2B) 및 CD62L 발현(도 2C)과 관련하여 설명된 효과는 자생 IL2 및 IL2-뮤테인 모두에 대해 광범위한 용량 범위에서 일관적이다.
종합하면, 이들 결과는 우선적 IL2βγ 자극을 나타내는 IL2-뮤테인에 의한 자생 IL2의 치환이 자생 IL2에 의해 유도된 이펙터 표현형이 아니라 중추 기억 표현형을 촉진한다는 것을 나타낸다. IL2-뮤테인은 림프 재순환(더 많은 CD62L 발현) 및 고갈에 대한 내성(더 적은 PD1 발현)의 가능성을 IL2보다 많이 부여하며, 생체내 전이를 위한 훨씬 더 바람직한 표현형이다.
실시예 2. IL2βγ를 통해서 우선적으로 신호전달하는 IL2-뮤테인으로 자생 IL2를 치환하는 것은 IL7 및 IL15와 조합된 배양 프로토콜에서 중추 기억 표현형을 선호한다.
다른 문헌에 이미 설명된 대로, IL7 및 IL15와 IL2의 조합은 IL2를 단독 사용한 것과 비교했을 때 T 세포 적합성(fitness)을 개선한다(Redeker and Arens, 2016, Front Immunol. 6(7):345). 본 실험에서는 OT-I T 세포 활성화/확장 프로토콜에서 자생 IL2 또는 IL2-뮤테인을 배양물에서 IL7 및 IL15와 조합했다.
이 전략에서, 실시예 1에 설명된 것과 동일한 TCR 자극이 사용되었다. 자생 IL2 또는 IL2-뮤테인을 배양을 시작하면서부터 5일차까지 첨가한 후, 세포를 10일 동안 IL7/IL15에 유지한다. 이 시나리오에서, 두 배양 조건 모두 배양물 중 유사한 세포 밀도 및 높은 생육성(도 3A)을 제공하며, 이펙터 세포보다 기억 세포의 발생을 촉진한다. 그러나, IL2-뮤테인의 사용은 도 3B에 도시된 대로 자생 IL2와 비교하여 배양물에서 중추 기억 세포를 더 높은 비율로 나타냈다(p< 0.0015). 동시에, 뮤테인과 함께 배양된 세포는 표 2에 나타낸 대로 고갈 마커의 더 적은 발현을 나타냈다.
IL7 및 IL15와 조합하여 시험관내 T 세포 활성화/확장에 자생 IL2 또는 IL2-뮤테인이 사용되었을 때 고갈 마커 발현(양성 세포 퍼센트)
마커 자생 IL-2 IL-2 뮤테인
PD1 1.69 0.48
TIM3 10.3 0.18
Lag3 84.3 21.1
Klrg1 6.07 0.05
IL7/IL15와 조합된 자생 IL2 및 IL2-뮤테인에 대해, 배양물 중 상이한 농도 평가는 생육성(도 4A), PD1 발현(도 4B) 및 중추 기억-유사 표현형(도 4C)과 관련하여 설명된 효과가 광범위한 용량 범위에서 일관적임을 증명한다.
자생 IL2를 단독 사용한 것과 비교했을 때 자생 IL2와 IL7 및 IL15의 조합은 배양 조건을 개선하지만, IL2-뮤테인의 경우에는 조합된 프로토콜을 사용했을 때 개선이 관찰되지 않는데, 그 이유는 IL2-뮤테인 단독 사용도 T 세포 생육성을 보존하고 중추 기억 표현형을 유도하는데 매우 효과적이기 때문이다. 추가로, IL2-뮤테인 단독 사용은 활성화된 T 세포에서 중추 기억-유사 표현형을 유도하는데 있어서 IL2, IL7 및 IL15의 조합만큼 효과적이다(도 5).
실시예 3. IL2βγ를 통해서 우선적으로 신호전달하는 IL2-뮤테인을 생성하는 유전적으로 조작된 T 세포는 중추 기억 표현형을 획득한다.
시험관내 및 생체내에서 지속적인 사이토카인 지원 소스를 생성하기 위해, 중간 친화도 IL2 수용체를 우선적으로 활성화하는 IL2-뮤테인을 생성하도록 T 세포를 유전적으로 조작했다. 증진된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 암호화하는 레트로바이러스 구성물과 자생 IL2 또는 IL2-뮤테인이 사용된다. 새로 분리된 나이브 OT-I T 세포를 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드와 자생 IL2 또는 IL2-뮤테인으로 자극함으로써 형질도입 과정을 개시한다. 24h 및 48h에 세포가 담긴 레트로넥틴 코팅 플레이트에 농축된 레트로바이러스 벡터 상청액을 첨가한다. 형질도입 후, 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드에 의한 TCR 자극을 IL7과 함께 7일 동안, IL15와 함께 10일 동안 유지한다. eGFP 발현에 의해 형질도입 효능을 확인했고, 이것은 두 구성물에서 모두 80%를 초과했다(도 6A). ELISA에 의해 분비된 분자(자생 IL2 또는 IL2-뮤테인)를 검출했다.
가용성 IL2 뮤테인과 함께 OT1 T 세포를 배양했을 때 관찰된 것과 유사한 방식으로, IL2-뮤테인을 생성하도록 조작된 세포는 주로 이펙터 세포였던 자생 IL2를 생성하도록 조작된 세포와 비교했을 때 더 높은 퍼센트의 기억 표현형을 가졌다(p< 0.0001)(도 6B). 또한, IL2-뮤테인을 생성하도록 조작된 세포는 자생 IL2를 생성하도록 조작된 세포와 비교하여 고갈 마커 발현이 더 적었다(표 3).
자생 IL2 또는 IL2-뮤테인을 생성하도록 T 세포가 조작되었을 때 고갈 마커 발현(양성 세포 퍼센트)
마커 자생 IL-2 IL-2 뮤테인
PD1 3.02 0.67
TIM3 17.0 0.35
Lag3 80.1 36.2
종합하면, 이들 결과는 IL2-뮤테인에 의한 IL2βγ를 통한 자극이 IL2-유사 신호전달이 일정하고 지속적일 때 이 새로운 배양 방법에서 중추 기억 분화를 선호한다는 가설을 확인한다.
실시예 4. CD25 발현을 하향조절하도록 유전적으로 조작하는 것은 자생 IL2로 확장된 T 세포에서 중추 기억 표현형을 선호한다.
IL2 알파 사슬 유전자(CD25)의 발현을 차단하는 것을 목표로 eGFP를 암호화하는 벡터와 il2ra를 표적화하는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)를 사용했다. 새로 분리된 나이브 OT1 T 세포를 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드와 자생 IL2로 자극함으로써 형질도입 과정을 개시한다. shRNA의 3개의 상이한 구성물을 사용했고, CD25의 표면 발현에 기초하여 가변적인 녹다운 효능을 얻었다. 스크램블 shRNA를 함유하는 렌티바이러스에 의한 형질도입을 대조군으로 사용한다. 2회차 형질도입 후, 자생 IL2(50 U/ml)와 함께 5일 동안 배양물에 세포를 유지한다. 상이한 구성물에 의한 형질도입 후 CD25 표면 발현 감소를 유세포계수법에 의해 평가했다(도 7A). 자생 IL2 자극 5일 후 중추 기억 세포의 퍼센트는 CD25 하향조절이 더 잘 달성되었을 때보다 월등하다(도 7B).
T 세포에서 CD25의 하향조절은 자생 IL2를 배양물에 사용하여 중간 친화도 수용체 IL2βγ를 우선적으로 자극하는 시나리오를 제공한다. 이들 조건하에서는 CD8+ T의 중추 기억-유사 표현형으로의 분화가 선호된다.
실시예 5. 세포가 자생 IL2로 자극되지만 배양물에 동시 첨가된 약리학적 제제로 CD25 상호작용이 차단되었을 때 중추 기억 표현형이 얻어진다.
중간 친화도 수용체 IL2βγ를 통해서 자생 IL2 신호전달을 우선적으로 지시하기 위한 다른 시도로서, 시험관내 T 세포 활성화 동안 자생 IL2와 함께 배양물에 약리학적 제제를 첨가한다. 약리학적 제제는 차단 효과를 보장하기 위해 고 농도로 첨가된다. OT-I T 세포를 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드, 50 IU/ml IL2 및 10 μg/ml 항-CD25 단클론성 항체(BioLegend clone 3C7)와 함께 배양한다. 항-CD25가 제0일부터 첨가되고, 2일마다 자생 IL2와 함께 신선한 배지를 첨가할 때 보충된다. 무관한 특이성을 가진 항체를 동형 대조군으로 사용한다. 배양 10일 후 세포의 표현형은 자생 IL2 활성화 동안 항-CD25의 첨가가 동형 대조군과 비교했을 때 세포 생육성(도 8A) 및 중추 기억-유사 표현형(도 8B)(p< 0.0001)을 증가시킨 것을 드러냈다. 추가로, 항체에 의해 CD25와 자생 IL2의 상호작용을 파괴했을 때 고갈 마커의 더 적은 발현이 얻어진다(표 4).
T 세포가 자생 IL2로 자극되지만 CD25와의 상호작용이 항CD25 항체에 의해 파괴되었을 때 고갈 마커 발현(양성 세포 퍼센트)
마커 동형 대조군 항-CD25
PD1 4.12 3.33
TIM3 18.5 0.54
Lag3 80.2 21.3
종합하면, 이들 결과는 CD25와의 상호작용을 손상시킴으로써 IL2βγ를 통해서 자생 IL2 신호전달을 지시하는 것이 세포를 중추 기억 표현형 쪽으로 유도한다는 것을 시사하며, 이것은 입양세포 요법에 더 적합하다.
실시예 6. 이량체 수용체 IL2βγ를 통한 우선적 활성화를 받은 OT-I T 세포는 다중기능성이며, 시험관내에서 효과적인 T 세포 항원-특이적 세포독성을 나타낸다.
IL2βγ를 통해서 활성화된 중추 기억 T 세포의 기능적 능력을 평가하기 위해 세포독성 분석을 수행했다. 실시예 1 및 3에 설명된 대로 활성화된 OT1 세포를 동족 펩타이드 SIINFEKL로 16시간 동안 자극했고, 유세포계수 분석을 수행하여 그랜자임 β의 생성을 결정했다. OT-I T 세포의 사멸 능력을 평가하기 위해, 표면에서 OVA 명목 항원을 발현하도록 형질도입된 B16 흑색종 세포(B16-OVA)를 1:1 비율로 세포와 함께 배양했다. 형질도입되지 않은 B16 흑색종 세포를 대조군으로 사용했다. IncuCyteCytotox 시약을 첨가하고 60시간 동안 2시간마다 사멸 능력을 평가했다. 대조군 세포에서는 세포용해가 관찰되지 않았으므로, 표적 세포의 세포용해는 항원 특이적이었다.
IL2βγ를 통해서 우선적으로 신호전달하는 IL2 뮤테인으로 활성화된 OT1 세포는 생체외에서 효과적인 직접적 세포용해 활성을 나타냈으며, 이것은 IL2βγ를 통해서 신호가 제공되었을 때 세포가 강력한 사멸 세포로 분화된다는 것을 보여준다(도 9A 및 B).
실시예 7. 이량체 수용체 IL2βγ를 통한 우선적 활성화를 받은 T 세포는 흑색종 모델에서 ACT에 사용되었을 때 더 우수한 항종양 활성을 나타낸다.
B16/OVA 종양 셀라인과 함께 사용된 OT1 모델은 가장 많이 사용되는 모델 중 하나이며, ACT의 유의미한 전임상 예측을 나타낸다. C57BL/6 레시피언트 마우스는 제0일에 피하 주사로 1x106 OVA-발현 흑색종 세포를 투여 받았고, 종양 세포 접종 10일 후에 치사량 아래로 방사선 조사되었다(5Gy).
그룹 1: 치료받지 않음(대조군)
그룹 2: 자생 IL2로 활성화된 OT1 T 세포 투여(실시예 1 참조)
그룹 3: IL2-뮤테인으로 활성화된 OT1 T 세포 투여(실시예 1 참조)
그룹 4: 자생 IL2+IL7+IL15로 활성화된 OT1 T 세포 투여(실시예 2 참조)
도 10에 도시된 대로, IL2-뮤테인으로 프라이밍된 세포를 사용한 ACT는 자생 IL2-활성화된 세포와 비교하여 종양 성장을 더 잘 제어했다. 종합하면, 이들 결과는 IL2-뮤테인 활성화에 의해 얻어진 낮은 고갈 마커 발현을 가진 초기 유도된 기억 표현형이 생체내 종양 제어를 위한 효과적인 조합이었음을 나타낸다.
실시예 8. IL2βγ를 통해서 우선적으로 신호전달하는 IL2-뮤테인을 분비하도록 조작된 T 세포는 ACT에 사용되었을 때 확실한 항종양 활성을 나타냈다.
ACT의 효능을 개선하기 위한 노력으로서, IL2-뮤테인을 생성하도록 T 세포를 유전적으로 조작했다. 유전자의 삽입은 시험관내뿐만 아니라 생체내에서도 T 세포에서 연속적이며 지속적인 IL2-뮤테인 신호전달을 가능하게 한다. C57BL/6 레시피언트 마우스는 제0일에 피하 주사로 1x106 OVA-발현 흑색종 세포를 투여 받았고, 종양 세포 접종 10일 후에 치사량 아래로 방사선 조사되었다(5Gy). 동물을 3개의 치료 그룹으로 나누었고, 제11일과 제15일에 다음과 같이 OT1 마우스로부터 1x106 T 세포를 정맥내 전이에 의해 투여 받았다.
그룹 1: 치료받지 않음(대조군)
그룹 2: 자생 IL2-조작된 OT1 T 세포 투여(실시예 3에 설명된 형질도입 프로토콜 참조)
그룹 3: IL2-뮤테인-조작된 OT1 T 세포 투여(실시예 3에 설명된 형질도입 프로토콜 참조)
도 11에 도시된 대로, IL2-뮤테인을 생성하도록 조작된 OT1 T 세포를 투여 받은 마우스는 확립된 종양의 양호한 제어(도 11A)와 더 높은 생존(도 11B)을 나타냈다.
실시예 9. IL2-뮤테인을 사용한 TIL의 생성
ACT 요법은 TIL을 사용하여 수행될 수 있으므로, TIL 발현에 대한 IL2-뮤테인의 효과를 평가했다. 종양-침윤 림프구에서 β/γ 이량체 IL2 수용체 활성화의 역할을 연구하기 위해, 제19-21일 사이에 C57BL/6 마우스로부터 MC38 종량을 분리하고, 이어서 종양 세포를 접종했다. 종양을 기계적으로 해리시켰고, 14-16일 동안 IL2 또는 IL2-뮤테인의 존재하에 배양했다. 배양 조건에 IL2-뮤테인을 사용했을 때 TIL 확장이 더 컸다는 것을 발견했다. 이와 일치하여, IL2-뮤테인은 ki67 마커와 관련하여 TIL의 증식 속도를 증가시켰다(도 12A 및 B). 또한, IL2-뮤테인과 함께 생체외 배양된 TIL은 대조군과 비교하여 중추 기억-유사 T 세포의 유의한 확장을 나타냈다(도 12C). 종합하면, 이들 데이터는 IL2-뮤테인이 중추 기억 분화 표현형을 선호하는 CD8+ TIL 확장을 유도한다는 것을 나타낸다.
실시예 10. 돌연변이체 IL-2로 확장된 TIL은 다중기능성이며, 활성화 및 고갈 마커의 감소를 나타낸다.
실시예 9의 방법에 의해 얻어진 TIL을 확장 전에 기능성 및 표현형에 대해 특성화했고, 항-CD3 및 항-CD2 항체의 존재하에 4시간 동안 자극했다.
자생 IL2로 확장된 TIL과 비교하여 IL2-뮤테인으로 확장된 TIL에서 억제성 수용체 PD-1, Lag-3, 및 Tim-3이 극적으로 감소되었다는 것을 발견했다(도 13A). 또한, TIL을 기능성에 대해 분석했다(도 13B). 종합하면, 이들 데이터는 기능성에 손상 없이 TIL을 확장시키고 이들을 중추 기억-유사 표현형에 대해 부화시키는 IL2-뮤테인의 능력을 나타낸다.
실시예 11. 돌연변이체 IL-2를 사용하여 TIL로부터 NK 세포의 생성
총 확장된 TIL 중 NK 세포의 비율에 따른 β/γ 이량체 IL2 수용체 활성화의 역할을 연구하기 위해, 제19-21일 사이에 C57BL/6 마우스로부터 MC38 종량을 분리하고, 이어서 종양 세포를 접종했다. 종양을 기계적으로 해리시켰고, 14-16일 동안 IL2 또는 IL2-뮤테인의 존재하에 배양했다. 총 세포 중 비율(도 14A) 및 절대 수치(도 14B)의 측면에서, IL2-뮤테인과 함께 생체외 배양된 TIL은 자생 IL2와 비교하여 NK 세포의 유의한 확장을 나타냈다.
SEQUENCE LISTING <110> Centro de Inmunolog? Molecular LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH LTD CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE VAUDOIS UNIVERSITY OF LAUSANNE <120> Method for the expansion and differentiation of T lymphocytes and NK cells in adoptive transfer therapies. <130> 602018CU00 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> by DNA recombinant technology <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Lys Met Leu Thr Ile Lys Phe Asn Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Leu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Val Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> by DNA recombinant technology <400> 2 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Lys Met Leu Thr Gln Lys Phe Glu Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Val Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 3 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> by DNA recombinant technology <400> 3 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ile Lys Phe Asn Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Leu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Val Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> by DNA recombinant technology <400> 4 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Lys Met Leu Thr Lys Lys Phe Arg Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Leu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Val Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 5 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> by DNA recombinant technology <400> 5 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Lys Met Leu Thr Ile Lys Phe Glu Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Val Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 6 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> by DNA recombinant technology <400> 6 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Ala Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 7 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> by DNA recombinant technology <400> 7 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Lys Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130

Claims (30)

  1. 입양세포 전이 요법에 유용한 중추 기억 표현형을 가진 T 림프구 및 NK 세포의 분화 및 확장을 위한 방법으로서, 하기의 세 단계를 포함하는 방법.
    i) 대상으로부터 림프양 세포의 추출 단계,
    ii) 중간 친화도 IL-2 수용체(IL2Rβγ)를 통한 우선적 신호전달을 유도하면서, 더 유전적으로 조작된 T 림프구 및 NK 세포를 시험관내 확장 및 분화시키는 단계, 및
    iii) 암을 가진 대상에 활성화된 세포를 전이시키는 단계
  2. 제 1 항에 있어서, 림프양 세포를 확장시키면서 중간 친화도 IL2 수용체(IL2Rβγ)를 통한 우선적 신호전달을 유도하는 전략은:
    - 중간 친화도 IL2R(IL2Rβγ)를 통해서 우선적으로 상호작용하고 신호전달하는 가용성 IL-2 뮤테인과 함께 림프양 세포를 배양하는 것,
    - 중간 친화도 IL2R을 통해서 우선적으로 상호작용하고 신호전달하는 IL2 뮤테인을 분비하도록 림프양 세포를 유전적으로 조작하는 것,
    - 자생 IL-2 및 IL2-IL2Rα 상호작용을 차단하는 약리학적 제제의 존재하에 T 림프구 및 NK 세포를 배양하는 것,
    - 자생 IL-2의 존재하에 T 림프구 및 NK 세포를 배양하고, IL2-IL2Rα 상호작용을 차단하는 가용성 단백질을 분비하도록 이러한 세포를 유전적으로 조작하는 것,
    - 자생 IL-2의 존재하에 T 림프구 및 NK 세포를 배양하고, 세포 표면에서 IL2Rα 수용체 서브유닛의 발현이 감소하도록 이러한 세포를 유전적으로 조작하는 것,
    - 자생 IL-2의 존재하에 T 림프구 및 NK 세포를 배양하고, 세포 표면에서 중간 친화도 IL-2 수용체의 발현이 증가하도록 이러한 세포를 유전적으로 조작하는 것
    을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, IL-2 뮤테인은:
    - SEQ ID NO. 1,
    - SEQ ID NO. 2,
    - SEQ ID NO. 3,
    - SEQ ID NO. 4,
    - SEQ ID NO. 5,
    - SEQ ID NO. 6 및
    - SEQ ID NO. 7
    을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, IL2-IL2Rα 상호작용을 차단하는 약리학적 제제는:
    - IL2Rα 또는 IL2에 결합하는 항체 또는 항체 단편,
    - IL2Rα 또는 IL2에 결합하는 펩타이드 또는 화학적으로 정의된 소 분자 및
    - IL2Rα의 가용성 형태 또는 그것의 변형된 변이체
    를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 단계 iii)은 동일한 도너에서 또는 상이한 도너에서 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 단계 ii)에서 중간 친화도 IL-2 수용체에 의한 신호전달은 세포 배양의 상이한 시기들에서 일어나거나 또는 상기 신호전달이 시험관내 및 생체내에서 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 전이된 세포의 지속성 및 더 높은 시험관내 및 생체내 항종양 효과를 연장하기 위한 것임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    - IL12,
    - IL17,
    - IL15 및
    - IL21
    을 포함하는 군으로부터 선택된 다른 사이토카인과 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 방법이 수행되는 림프양 세포는 T 세포 혼합물; 정제된 CD4 또는 CD8 T 세포; NK 세포; NKT 세포 중 어느 것임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, T 림프구 및 NK 세포는 말초혈 단핵세포, 종양 배액 림프절 또는 종양 침윤물로부터 단계 i)에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 방법에서 림프양 세포는 CAR 발현; 원하는 특이성의 TCR 발현; 세포막에서 다른 관심 수용체의 발현; 관심있는 상이한 사이토카인 또는 가용성 단백질의 분비를 위해 더 조작되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 입양세포 전이 요법을 위한 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 항의 방법의 사용.
  13. 제 9 항에 있어서, 종양-침윤 림프구 또는 키메라 항원 수용체 T를 얻기 위한 것임을 특징으로 하는 사용.
  14. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 암의 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 사용.
  15. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어진 세포.
  16. 중추 기억 표현형을 가진 림프구의 생체외 부화 및 확장을 위한 방법으로서,
    a. 대상으로부터 림프구 집단을 획득하는 단계, 및
    b. β/γ 이량체 IL-2 수용체를 활성화하는 조건에서 세포를 배양하여 림프구를 확장시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  17. 제16 항에 있어서, 단계 (b)는 적어도 하나의 IL2 뮤테인을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16 항에 있어서, 단계 (b)는 IL-2 수용체의 적어도 하나의 서브유닛의 발현을 조절함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18 항에 있어서, IL-2 수용체의 서브유닛은 알파(CD25), 베타, 또는 감마 서브유닛인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제16 항에 있어서, 단계 (b)는 IL-2 수용체와 그것의 동족 단백질의 상호작용을 억제함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20 항에 있어서, IL-2 수용체와 그것의 동족 단백질의 상호작용의 억제는 IL-2 수용체의 알파 서브유닛을 하향조절함으로써, 또는 베타 및 감마 서브유닛을 상향조절함으로써 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20 항에 있어서, IL-2 수용체와 그것의 동족 단백질의 상호작용의 억제는 세포를 항-CD25 항체와 함께 인큐베이션함으로써 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제16 항에 있어서, 단계 (b)는 돌연변이체 IL-2 서열의 발현 및 분비를 코딩하는 핵산을 림프구에 형질도입함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제16 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 의해 얻어진 세포 조성물.
  25. 중추 기억 표현형을 가진 림프구를 투여하는 단계를 포함하는 치료가 필요한 대상에서 암을 치료하는 방법으로서,
    a. 대상으로부터 림프구 집단을 획득하는 단계;
    b. 상기 림프구에서 β/γ 이량체 IL-2 수용체를 활성화함으로써 림프구 집단을 확장시키는 단계; 및
    c. 단계 (b)로부터의 림프구의 치료적 유효 용량을 대상에 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  26. 제25 항에 있어서, β/γ 이량체 IL-2 수용체의 활성화 단계는 상기 림프구를 돌연변이체 IL-2와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제25 항에 있어서, β/γ 이량체 IL-2 수용체의 활성화 단계는 상기 림프구에 돌연변이체 IL-2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제25 항에 있어서, β/γ 이량체 IL-2 수용체의 활성화 단계는 상기 림프구에 IL-2 수용체의 서브유닛 β/γ의 발현을 상향조절하기 위한 뉴클레오타이드 서열을 도입하는 단계 및 상기 림프구를 야생형 IL-2와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제25 항에 있어서, β/γ 이량체 IL-2 수용체의 활성화 단계는 상기 림프구에 IL-2 수용체의 알파 서브유닛의 발현을 하향조절하기 위한 뉴클레오타이드 서열을 도입하는 단계 및 상기 림프구를 야생형 IL-2와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제25 항에 있어서, β/γ 이량체 IL-2 수용체의 활성화 단계는 상기 림프구를 야생형 IL-2 및 항-CD25 항체와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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