TWI227136B - Novel pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of cancer - Google Patents

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1227136 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之技術範, 本發明大體上係關於一種組合物，其含有諸如il— 18，也稱為干擾素—r—誘生因子（IGIF)，之增強劑 (potentiator)及化學治療藥劑◦化學治療藥劑可以是: 舉例而言，諸如脫波肯（topotecan)之喜樹鹼類、諸=阿 黴素（doxorubicin)之蒽環抗生素、諸如環磷醯胺之烷化 劑、或諸如派利塔生（paclitaxel)之抗微管劑。本發明另 關於這類組成物之製法，這類組成物於預防及/或治療腫 瘤上的用途，及這類組成物於抑制哺乳動物腫瘤或癌細胞 生長的用途。 本發明之技術背景 了解導致癌症且演變為更惡性且轉移性疾病的基因與 細胞變化，至今已有顯著進展。治療轉移性癌症，許多影 響範圍大的腫瘤，例如大腸癌、肺癌、前列腺癌及乳癌， 至今極少有令人印象深刻的進步，甚至對最新的化學治療 藥劑療法不是反應短暫，就是完全不反應。癌症之分子生 物學研究已提供為何腫瘤不能對化學治療反應的解釋。 正常細胞中，化學治療藥劑所引發的DNA破壞或其他代謝 干擾，啟動了計劃性細胞死亡途徑（細胞凋亡， apotosis)。該途徑有一種向上調節可防止細胞凋亡，此 為腫瘤遺傳演變的一部份。增加存活所做的突變選擇結 果，例如喪失p53功能或過度表現bcl-2，會發生細胞凋 亡，因為癌細胞發生異常DNA複製，通常會啟動細胞凋 亡。腫瘤細胞中抗細胞凋亡途徑被活化的事實’推測這些 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A视格（2丨0X297公釐）刷㈣議⑽) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} - 、一'll 線一 五、發明説明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227136 A7 B7 何種機I/。’财㈤之化學治療藥劑治療，不論其係經由 ^ $因/匕，導入新的治療方式，例如抑制腫瘤所引 與錄生成制或刺輯㈣叙免疫反應，藉以對化 學難治療·產生反應，有其重要性。 IL 18，也稱為干擾素〜誘生因子（IMF)，為最近 t見的新頭胞激素。活性IL—18包括⑸個胺基酸殘基。 了、有強政之生物活性，包括誘發T細胞或脾細胞生產干 擾=7增強NK細胞之殺戮活性、及促進天然CD4+T細 胞分化為Thl細胞。再者，人類IL-18增加GM-CSF的生 產，降低IL-1〇的生產。早已顯示α—18比IL12的干擾 素T誘生能力更大，且IL—18顯示有多種不同的受體並 利用一種特殊的訊號傳導途徑。 以動物模式評估IL-18於癌症治療上之治療潛力，及 IL-18抗體於肝損害（類似人類的肝衰竭）所致内毒性休克 之治療上的治療潛力，證實其具有保護作用。例如，曾有 報導指出IL-18可抑制大腸26腺癌於小鼠體内轉移及生 長。參見 Hanaya 氏等人，Anti-tumor effect of a new cytokine，IGIF，on the metastasis and growth of murine colon 26 adenocarcinoma ^ Proceeding of the Amerιcan Association for Cancer Research 37:451-452(1996)。有關IL-18抗腫瘤活性之進一步研究已發表於 下列文獻：Micallef 氏等人，Interleukin 18 induces the sequential activation of natural killer cells and cytotoxic T Lymphocytes to protect syngeneic -4- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227136 A7 B7 五、發明説明（3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) mice from transplantation with Meth A sarcoma. Cancer Res. 57:4557-4563(1997) ; Yoshida 氏等人， Antitumor effect of human pancreatic cancer cells transduced with cytokine genes which activate Thl helper T cells, Anticancer Res. 18:333-336(1998)； Osaki 氏等人，IFN- τ inducing factor/IL-18 administration mediates IFN- r and IL-12-independent antitumor effects, J. Immunol. 160:1742-1749(1998)； 及 Micallef 氏等人，Augmentation of in vitro interleukin 10 production after in vivo administration of interleukin 18 is activated macrophage-dependent and is probably not involved in the antitumor effects of interleukin 18， Anticancer 18(6A): 4267-74(1998)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 CD4+ T細胞是所有免疫反應的中樞調節元件。分為兩 次類，Thl及Th2。各次類由其分泌不同胞激素的能力界 定之。值得注意的是，分化作用之最強力誘發因子是胞激 素本身。由天然細胞前身發展成Th2細胞乃經由IL-4誘 生。發現IL-18之前，IL-12視為首要的Thl誘生胞激 素。IL-18也是Thl誘生胞激素，刺激干擾素製造的效 力比IL-12更強。

Thl細胞分泌IL-2、干擾素1及TNF-/5。干擾素-r 是著名的Thl胞激素’其直接作用在巨嗟細胞以增強該細 胞之殺微生物及胞嗤活性。結果，被活化的巨嗤細胞可有 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227136 at B7 五、發明説明（4 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 效摧毁細胞内病原及腫瘤細胞。Th2細胞生產比-4、1[-5、IL-6、IL-10及IL-13，其作用在於輔助B細胞發展成 製造抗體的細胞。整體觀之，Thl細胞主要負責細胞調節 免疫，而Th2負責體液免疫。 IL-18，編碼核苷酸序列，及此純化蛋白質之一些物 理化學及化學特性是已知的。

Hayashibara 株式會社生化藥學研究所 (“Hayashibara”）擁有的 EP0692536 A2，公開於 1996 年 1 月17日，其中揭示誘使免疫適格細胞生產干擾素之鼠 蛋白質，經進一步鑑定，此蛋白質具有一些物化性質及確 定之部分胺基酸序列。也揭示一種具有157胺基酸序列之 蛋白質、其兩種片段、編碼該蛋白質之DNA(471鹼基 對）、融合瘤、蛋白質純化方法、及檢測該蛋白質之方 法。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Hayashibara 擁有之 EP 0712931 A2，公開於 1996 年 5月22日，其中揭示157個胺基酸之人類蛋白質及其同系 物，編碼該蛋白質之DNA、轉形體、製備該蛋白質之方 法、抗該蛋白質之單株抗體、融合瘤、蛋白質純化方法、 及檢測該蛋白質之方法。

Hayashibara 擁有之 EP 0767178 A1，公開於 1997 年 4月9日，其中揭示之人類蛋白質接近N-端處具有10個 胺基酸之序列，該蛋白質誘使干擾素-T經由免疫適格細 胞生產。該案也揭示製備該蛋白質之方法、該蛋白質作為 藥物、該蛋白質用來作為抗癌藥、抗腫瘤劑、抗病毒劑、 __-6-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227136 A7 ______ B7 ------ 五、發明説明（） 抗菌劑、免疫劑及用於治療異位疾病。

Incyte藥物公司擁有之W0 97/24441，公開於1997年 7月10日，其中揭示193個胺基酸之蛋白質，相當於il-18前軀物，及其編碼DNA。 化學治療樂劑疋该技術領域已知的。例如喜樹驗類， 包括脫波肯，揭示於SmithKline Beecham公司擁有之美國 專利第5, 004, 758號（‘758專利），1991年4月2曰核發。 吾樹驗類’包括脫波肯’也揭示於化沉仏即/ 即7，第 2 版，Bruce A. Chabner 及 Dan L. Longo 編輯，Lippincott-Raven 出版社，費城_1996，第 463-484頁。脫波肯揭示於Merck Index，第12版，_1996 Merck & Co·，公司，專屬編號9687。蒽環抗生素類， tL 括 Η 数 i ’ 揭元於 Cancer Chemotherapy and 万即y，第 2 版，Bruce A· Chabner 與 Dan L· Longo 編輯，Lippincott-Raven 出版社，費城，1996，第 409-434頁。阿黴素揭示於Merck Index，第12版，_1996 Merck & Co·，公司，專屬編號3495。烧化劑，包括環填 极條，揭示於 Cancer Chemotherapy and Biotherapy，第 2 版，Bruce A. Chabner 及 Dan L. Longo 編輯， Lippincott-Raven 出版社，費城_1996，第 297-332 頁。 環鱗醯胺揭示於Merck Index,第12版，-1996 Merck & Co.，公司，專屬編號2816。抗微管劑，包括派利塔生， 揭示於 Cancer Chemotherapy and Biotherapy，第 2 版，

Bruce A. Chabner 及 Dan L· Longo 編輯，Lippincott- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 1227136 五、發明説明（

Raven出版社，費城一1996，第263-296頁。派利塔生揭示 於 Merck Index，第 12 版，—1996 Merck & Co·，公司， 專屬編號7117。其他化學治療藥劑是熟悉該技術領域者已 知的。 發明簡述 本發明一方面提供一種多肽及化學治療藥劑之組合， 該多狀之全長胺基酸序列至少有7〇%與SEQ ΙΙ} Ν〇:ι或SEq ID NO: 2所示胺基酸序列相同。

本發明另一方面提供一種多肽及化學治療藥劑之組 合，該多肽之全長胺基酸序列至少有70%與SEQ ID 或SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列相同，該藥劑較好包括 喜樹鹼類，例如脫波肯；蒽環抗生素類，例如阿黴素G俨 化劑，例如環磷醯胺；或抗微管劑，例如派利塔生’。、誃烷 學治療_更好是幾何異構物。最好該化學治療藥劑=匕 波肯。該多肽與其他化學治療藥劑的組合方法是孰 術領域者已知的，也包括在本發明内。 、、…技 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明又一方面提供一種藥學組成物，发含有夕 例如IL-18，化學治療藥劑，及藥學上可接受之裁气夕狀， 本發明又一方面提供一種製備上述組成物之方\， 括將該多肽與該化學治療藥劑混合並回收所生成的組= ^發明又_方面提供—種及/或治_乳動· 症之方法，包括施用抑制癌症劑量之組成物^ ^ 含一多狀，例如IL-18，以及化學治療藥劑。〜且成物包 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2I0X297公釐 1227136 A7 B7 五、發明説明（7 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明又一方面提供一種預防及/或治療哺乳動物癌 症之方法，包括施用抑制癌症劑量之組成物，該組成物包 含一多肽，例如IL-18，以及化學治療藥劑與藥學上可接 受之載劑。 本發明又一方面提供一種抑制哺乳動物體内腫瘤細胞 生長之方法，該哺乳動物對含有多肽，例如IL-18，及化 學治療藥劑的組成物容易起反應，其中該方法包括對具有 該腫瘤細胞之哺乳動物施用抑制腫瘤細胞生長有效劑量之 這類組成物。 本發明又一方面提供一種抑制哺乳動物體内腫瘤細胞 生長之方法，該哺乳動物對一組成物容易起反應，該組成 物含有多肽，例如IL-18，及化學治療藥劑與藥學上可接 受之載劑，其中該方法包括對具有該腫瘤細胞之哺乳動物 施用抑制腫瘤細胞生長有效劑量之這類組成物。 圖示簡要說明 圖1 是圖形說明11-18單獨及與脫波肯組合使用，對晚 期肺部Lewis肺癌的影響。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖2 是圖形說明11-18單獨及與脫波肯組合使用，對肺 内部Lewis肺癌群落數目的影響 圖3 是圖形說明II-18與脫波肯一起減少肺部腫瘤小結 數目的影響(確認實驗）。 圖4 是圖形說明11-18與脫波肯組合使用，對抑制肺部 腫瘤生長的影響（確認實驗）。 圖5 是圖形說明低劑量IL-18對BALB/c母鼠後期皮下植 _-9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227136 A7 B7 五、發明説明（8 ) ^ 入M0PC-315漿細胞瘤的生長影響。 圖6 是圖形說明IL-18與最大耐受劑量之脫波肯對後期 MOPC-315漿細胞瘤的組合功效。 圖7 是圖形說明IL-18與低於最大劑量之脫波肯對後期 MOPC-315漿細胞瘤的組合功效。 圖8 是圖形說明高劑量IL-18對後期皮下植入MOPC-315 聚細胞瘤的影響。 圖9 是圖形說明IL-18與脫波肯組合，對後期皮下植入 M0PC-315漿細胞瘤的影響（確認實驗）。 圖10是圖形說明IL-18與低於最大劑量之脫波肯組合， 對後期皮下植入MOPC-315聚細胞瘤的影響（確認實 驗）。 圖11是圖形說明腹腔内或皮下提供高劑量IL—18為單一 藥劑，對後期皮下植入MOPC-315漿細胞瘤的影響。 圖12是圖形說明IL-18經腹腔内或皮下與脫波肯組合施 用’對皮下植入MOPC-315漿細胞瘤的影響。 圖13是圖形說明間歇性經皮下施用^―以與脫波肯，對 後期皮下植入MOPC-315聚細胞瘤的影響。 圖14是圖形說明IL-18對抑制後期皮下植入B16F1〇黑色 素瘤之腫瘤生長的影響。 圖15是圖形說明IL-18對鼠後期皮下植入Bl6n〇黑色素 瘤，延長環磷醯胺所致生長延遲之功效。 圖16是圖形說明脫波肯單獨施用或與a—18組合施用， 對鼠後期皮下植入B16F10黑色素瘤之影響= 圖17是圖形說明單獨施用高劑量IL—18，對抑制後期皮 _______ -10- 本紙張尺度適财酬家;^ ( CNS ) M規格（21G>< 297公羞) ----------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 、11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227136 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（9 ) 下植入B16F10黑色素瘤之腫瘤生長的影響。 圖18是圖形說明il-18與最大耐受劑量之環磷醯胺組 a，對後期皮下植入B16F10黑色素瘤之影響（爷 實驗）。 9 ^ 圖19是圖形說日月IL-18與低於最大劑量之環碟酸胺組 合，對後期皮下植入B16F10黑色素瘤之影響。 圖20是圖形說明IL—18與派利塔生組合，對後期^下植 入麥迪生氏（Madison)肺癌的影響。 圖21是圖形說明阿黴素對造成後期乳腺癌i6/c劑量依 賴式生長延遲的影響。 圖22是圖形說明IL-18對造成後期乳腺癌最低腫瘤 生長延遲的影響。 圖23是圖形說明IL-18對阿黴素於後期乳腺癌16/c之活 性影響。 發明詳細說明 本叙明大體上係關於一種組合物，其含有諸如IL一π 之增強劑及化學治療藥劑。化學治療藥劑可以是，舉例而 言，諸如脫波肯（topotecan)之喜樹鹼類、諸如阿黴素 (d⑽orubicin)之蒽環抗生素、諸如環磷醯胺之烷化劑、 或諸如派利4生（paclitaxei)之抗微管劑。本發明另關於 這類組成物之製法，這類組成物於預防及/或治療腫瘤上 的用途，及這類組成物於抑制哺乳動物腫瘤或細胞生長的 用途。 提供下列定義，有助於了解本案常用的一些名詞與縮 寫。 __________________-11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公酱j ---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1227136 A7 B7 五、發明説明（10 ) “CPA”表示環磷醯胺；“CR”表示完全腫瘤消失；“ip，，表 示經腹腔内；“iv”表示經靜脈；“ILS”表示增長壽命· “LTR”表示長期腫瘤消失；“MTD”表示最大耐受劑量” 表示部分腫瘤消失；“qID”表示每天用藥一次；‘‘q4D，，+厂、 每4天用藥一次；“q4Dx6”表示每4天用藥一次，共用溢6 次；“q4Dx7”表示每4天用藥一次，共用藥7次；‘‘仙巧，， 表示每天用藥一次，共用藥5天；“qDx21，，表示每天用举 一次，共用藥21天；“qDx26”表示每天用藥一次，共用铃 26天；“qDx30”表示每天用藥一次，共用藥3〇天；“％，，表 示經皮下；“UID”表示每天用藥一次。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 “相同性”是該技術領域已知，是兩種或兩種以上多肽 序列或兩種或兩種以上多核苷酸序列之間，經由比較序列 而決定的關係。該技術領域中，“相同性，，也表示多肽序列 或核苷酸序列之間的序列相關程度，該程度可藉由這類序 列之間的吻合度而決定。“相同性”與”相似性’’可由已知方 法輕易計算出來，包括下列方法但不限於此 {Computational molecular Biology^ Lesk, A. M.、編輯， 牛洋大學 版，紐約，\⑽名·，Biocomputing: Informatics 户ro/ecis*，Smith, D· W.編輯，Academic 出 版，紐約，1993 ; Computer Analysis of Sequence Data, 第 I 部，Griffin, A. M·及 Griffin，H. G.編輯，Humana 出版，紐約，1994 ; Sequence Analysis in Molecular 价von Heinje， G. Academic 出版，1987 ; 免户Gribskov，Μ·與 Devereux，J· -12-_______ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227136 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（η ) 編輯，M Stockton 出版，紐約，1991 ;及 Carillo，Η· 與 Lipman， D., SIAM J· Applied Math., 48: 1073(1988))。決定相同性的較佳方法是設計成可提供所 測序列之間的最大吻合度者。決定相同性及相似性的方法 是大眾可獲得之電腦程式。決定兩個序列之間相同性及相 似性之較佳電腦程式方法，包括下列方法但不限於此， GCG 套裝程式（Devereux，J.專 k、Nucleic Acids 此s⑸rc/? (1984))，BLASTP，BLASTN 及 FASTA (Atschul，S. F.等人，/ vifo/ec·万/ο/,么/5:403-410 (1990)。BLAST X (见AST 手冊，Altschul，S·等人， NCBINLM Bethesda，MD 20894 ; Altchul，S.等人，7： ifo/.方/(9人 iV5:403-410(1990))。熟知之 Smith Waterman 演算法也可用來決定相同性。 “經分離的，，表示“藉由人工”改變其天然狀態。如果“經 分離的”組成物或物質在自然界發生，其經過改變或是自 其原先環境分離出來，或兩種情形皆發生。例如，動物活 體内天然存在之多核苷酸或多肽不是“經分離的，，，但是由 具有其天然狀態之共存物質所分離的相同多核苷酸或多肽 是“經分離的，，，此名詞用於本說明書。 “多肽”表示含有兩個或兩個以上胺基酸，胺基酸彼此 藉由肽鍵或經修飾狀鍵連接，即肽同位質（isosteres)， 之任何肽或蛋白質。“多肽，，也表示短鏈，通常是肽類、 募肽類或寡聚體，以及較長鏈，通常表示蛋白質。多肽可 含有除了 20個基因編碼之胺基酸以外的胺基酸。“多肽，， —-:__ _13擊 本紙張尺度適用 ( 210X297/^ - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .

、1T 線·· 1227136 A7 _____ __ —B7 五、發明説明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 包括經修飾之胺基酸序列，修飾可利用天然方法，例如轉 譯後修飾法，或利用該技術領域熟知之化學修飾技術。這 些，飾法充分揭示於基礎教科書及更詳盡的專題論文，以 及眾多的研究文獻。修飾可發生在多肽的任何位置，包括 肽主鏈、胺基酸側鏈及胺基或羧基端。可了解的是，指定 多肽的不同位置可有相同或變化程度不同之同類型修飾。 一才曰定多肽也可包括許多類型的修飾。多肽可因為泛素化 (ubiquitination)而呈支鏈狀、及有或無支鏈的環狀。環 狀支鏈與支鏈環狀多狀可由轉譯後天然製法產生，或由合 成法製得。修飾包括乙醯化、醯化、ADp—核醣基化、醯胺 化、共價鍵結黃素、共價鍵結血質部分、共價鍵結核苷酸 或核苷酸衍生物、共價鍵結脂肪或脂肪衍生物、共價鍵結 磷脂醯基肌醇、交聯、環化、形成二硫鍵、去甲基化、形 成共價交聯、形成胱胺酸、形成焦麩胺酸酯、甲醯化、τ -羧化、糖基化、形成GPI錨、羥基化、蛾化、甲基化、 肉笪蔻醯化、氧化、蛋白質水解處理、磷酸化、異戊烯基 化、消旋作用、ί西酸化、硫酸鹽化、轉移調節之胺基 酸為蛋白質，例如精胺醯化、及泛素化（例如參見 PROTEIN-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,第 2 版，Τ· Ε· Creighton, W. Η· Freeman and Company,紐 約 ’ 1993 ; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects ，第 1-12 頁，標題 POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C. Johnson 編輯，Academic 出版，紐約， ___-14- _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1227136 A7 B7 五、發明説明（13 ) 1983，iS^/ier 氏等人’“Ana lysis for protein modification and nonprotein cofactors^, Meth Enzymol (1990) 182: 626-646 ，及 Rattan 氏等人，“Protein Synthesis: Post-translational Modifications and

Aging”，如/7 AT «Sbi· (1992) 663:48-62)。 “變種”表示異於參照之多核苷酸或多肽，但保留必要 特性，的多核苷酸或多肽。多核苷酸之典型變種與參照之 多核甘酸在核甘酸序列上有所不同。變種之核菩酸序列變 化，可改變或不改變參照之多核苷酸所編碼之多肽的胺基 酸序列。核苷酸變化可導致由參照之多核苷酸編碼之多肽 中的胺基酸取代、增加、刪除、接合及截斷，說明如下。 多肽之典型變種與參照之多肽在胺基酸序列上有所不同。 一般而言，差異有所限制，如此參照之多肽與變種的序列 在整體上非常相似，且許多區域是相同的。變種與參照之 多狀可在胺基酸序列上不同，其可以是任何組合方式的一 個或一個以上之取代、增加、刪除。取代或插入之胺基酸 殘基，可以是或不是遺傳密碼所編碼之胺基酸殘基。多核 苷酸或多肽之變種可以是天然發生的，例如對偶變種，或 者是未知可天然發生之變種。非天然發生之多核苷酸或多 肽變種可經由突變生成技術或直接合成法製得。 用於多肽序列比較之較佳參數包括下列： 1)演算法：Needleman 與 Wunsch，J· Mol· Biol. 48:443-453(1970)； 比較矩陣：BLOSSUM62，記載於 Hentikoff 與 Hentikoff， -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) . 、-口 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227136 A7 A7 B7 五、發明説明（14)

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919(1992)； (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 帽扣分法：12 帽長度扣分法：4 提供這些參數之實用程式是大眾可獲得的，如 Genetics Computer Group，Madison WI 之“gap”。上述參 數是用於肽比較之欠缺參數（與終端帽不扣分一起）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之多肽序列可與SEQ ID N(hl或SEQ ID N0:2 之參照序列相同，即100%相同，或可包括達到某整數之 胺基酸改變，此改變與參照序列比較時，相同性％低於 100%。這類改變是選自下列，包括至少一個胺基酸刪除、 取代（包括保守與不保守取代作用）、或插入，其中此改變 可發生在參照之多肽序列之胺基端或羧基端位置，或上述 終端位置之間的任何位置，此位置於參照序列之胺基酸序 列内獨立散佈，或於參照序列内呈一個或一個以上連續基 團方式分布。決定指定％相同性之胺基酸改變數目，係將 SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2之胺基酸總數乘以預期百分 比相同性之百分比數（除以100)，然後所得結果分別由得 自SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2之胺基酸總數中扣除， 或： na^Xa — (Xa · y)， 其中na是改變之胺基酸總數，Xa是SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2之胺基酸總數，且y是，例如，〇· 7〇代表70%， -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Ϊ227136 A7

0·8〇代表80%，0.85代表85%等等，其中Xa及y非整 數者，在被Xa扣除之前，將其化整為最接近之整數。 融合蛋白質”表示被兩種，通常無關連，的融合基 因或其片段編碼之蛋白質。歐洲專利申請案EP-A-0 464 中有一貫施例揭示融合蛋白質，其包括免疫球蛋白分子固 疋區的终多部分’以及另一人類蛋白質或其部分。許多情 況下’使用免疫球蛋白Fc區作為融合蛋白質之一部份對 用於治療與診斷有其優點，例如，增強藥物動力性質[例 如參見歐洲專利申請案EP-A 0232 262]。另一方面來說， 為了一些用途，當融合蛋白質表現、測定與純化之後，冀 求能夠刪除Fc部分。 劑（Potentiator) 增強劑聯合細胞減少療法，通常會增強免疫反應。 IL-18是一種廣效增強劑，當與不同種類化學治療藥劑結 合時，其保留本身之免疫刺激作用。有些化學治療藥劑之 增強劑是專一的，此增強劑與被調節之藥物作用機制有 關，例如使用曱醯四氫葉酸（leucovorin)與5-氟尿嘧咬組 合，或使用泰洛帕胺（tirapazamine)與DNA破壞劑，例如 順鉑（cisplatin)或烷化劑。 多狀 本發明一方面係關於IL-18多肽與化學治療劑組合。 此多肽之多肽組份，及含有喜樹鹼化合物之本發明組成 物、其分離法、鑑定法、及一些製造技術揭示於歐洲專利 申請案0692536A2、歐洲專利申請案0712931A2、歐洲專利 _ -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇ί 公釐） " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1227136 A7 B7 五、發明説明（Μ) 1 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 申請案0767178Α1、及國際專利申請案WO 97/2441。上述 多肽包括經分離之多肽，其含有一胺基酸序列，該序列分 別與 SEQ ID NO. 1 及 SEQ ID NO. 2 全長之 SEQ ID NO· 1 (人類IL-18)及SEQ ID NO· 2 (鼠IL-18)所示胺基酸序 列比較，具有至少70%相同性，較好至少80%相同性， 更好至少90%相同性，更更好至少95%相同性，最好至 少97-99%相同性。這類多肽包括分別含有SEQ ID NO. 1 及SEQ ID NO. 2所示胺基酸的多肽。 本發明多肽是干擾素-r-誘生多肽。該多肽之主要作 用在於誘發細胞調節性免疫，包括誘使T細胞生產干擾素 -T、脾細胞增強NL細胞之殺戮活性、及促進天然CD4+T 細胞分化為Thl細胞。下文將這些性質記載為“IL-18活 性”、或“IL-18多肽活性”、或“IL-18生物活性”。也包括 在這些活性中的是該IL-18多肽之抗原及免疫原活性，尤 其是具有SEQ ID NO. 1及SEQ ID NO. 2所示多肽的抗原 及免疫原活性。較好，本發明多肽具有至少一種IL-18 生物活性。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明多肽可呈“成熟”蛋白質之形式，或是較大蛋白 質（例如融合蛋白質）之一部份。通常較好包括其他胺基酸 序列5這些序列包括分泌或領導序列、前序列、有助純化 之序列，例如多個組織胺酸殘基，或重組生產過程中用於 安定的其他序列。 本發明也包括上述多肽之變種，即該多肽藉由保守式 胺基酸取代而與參照物不同，一殘基可藉由保守式胺基酸 _ -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227136 五、發明説明（ 17 A7 B7 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 取Γ而被具有類似特性之另—殘基取代。通常這類取代作 用&生在Ala、Val、Leu及Ile之間；Ser及Thr之間； 酉义性〜基Asp及Glu之間；Asn及Gln之間；及驗性殘基 L:s及Airg之間，或芳族殘基心及加之間。特別佳的 欠種中’以任何—種組合取代、刪除、或增加數個5—1〇、 1-5 ' 1-3 ’ 1-2或1個胺基酸。 本發明多狀可用任何合適方法製備。這類多狀包括經 分離之天然發生的多肽、重組生產的多肽、合成製造之多 Ί组合這些方法所製造的多月太。製備這類多肽之方法 是該技術領域熟知的。 、11

S —本發明之重組多肽可藉由該技術領域熟知的方法，自 含有表現系統之經遺傳重組的宿主細胞製得。因此，本發 明另方面係關於表現系統，該系統包括編碼本發明多肽 之们夕核♦酸或數個多核苷酸，本發明也關於經由這 類表現系統而被遺傳重組之宿主細胞，及利用重組技術生 產本發明多肽之方法。也可使用無細胞轉譯系統 ，利用本 發明之DNA構築體衍生之rna生產這些蛋白質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 合適宿主的代表性範例包括細菌細胞，例如鏈球菌、 葡萄球菌、大腸桿菌、鏈黴菌、及枯草桿菌細胞；真菌細 胞’例如酵母菌細胞、曲黴菌細胞；昆蟲細胞例如果蠅細 胞S2及草地粘蟲Sf9細胞；動物細胞例如CHO、COS、 HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293 及 Bowes 氏黑色素瘤細 胞及植物細胞。 可使用的表現系統種類繁多，例如，染色體、附加體 ____ -19- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) a4規格（210X297公釐） 1227136

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (ePiS〇me)、及病毒衍生的系統，諸如衍自細菌質體、嗟 菌體、轉因子（加nsposon)、酵母菌附加體、♦入元件、 酵母菌染色體元件、病毒例如杆狀病毒、小病毒（諸如 SV40)、牛痘病毒、腺病毒、禽疫病毒、假性狂犬病病毒 及逆轉錄病毒的載體；以及衍自上述組合之載體，例如衍 自質體與噬菌體遺傳兀件(例如粘接質體及噬菌質體)之載 體。表現系統可含有調節與產生表現作用之控制區。大體 上，在宿主内能夠維持、複製或表現多核苷酸而生產多肽 的任何系統或載體皆可使用。利用許多已知且慣用之技術 中的任何一種，將適合的核苷酸序列插入表現系統，舉例 而曰，例如下列文獻列出的技術：Sambrook氏等人，

Molecular Cloning ··實驗室手冊，第 2 版，c〇id Spring Harbor Laboratory 出版，Cold Spring Harbor% 紐約 (1989)。適合之分泌訊號可併入所欲的多肽，如此可將轉 譯後的蛋白質分泌至内質網管腔中、細胞漿膜周圍的空間 内、或細胞外環境。這些訊號對該多肽可以是内源的，或 外源的訊號。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明多狀可利用已知方法自重組細胞培養物回收及 純化，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉澱法、酸萃取法、陰 離子或陽離子交換層析法、填酸纖維素層析法、疏水性交 互作用層析法、高效液相層析法、羥基磷灰石層析法及外 源凝集素（lectin)層析法。純化最好使用親和性層析法。 當多肽於分離及/或純化過程中變性時，可使用再摺疊蛋 白質之熟知方法重新生成活性構型。 _— —_ -20- __ 本紙張尺度適用中國國家^準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） " " 1227136 五、發明説明（ 化學治療藥劑 本發明預期使用任何總類之化學治療藥劑與增強劑， 例如IL-18組合。化學治療藥劑之總類範例包括喜樹鹼 類，例如脫波肯；蒽環抗生素類，例如阿黴素；烷化劑， 例如環磷醯胺；及抗微管劑，例如派利塔生。較好該化學 治療樂劑是幾何異構物。最好該化學治療藥劑是脫波肯。 熟悉該技術領域者已知的其他化學治療藥劑也包括在本發 明内。 該技術領域已知之化學治療藥劑，其範例有喜樹鹼 韻。脫/皮月疋吾樹驗的範例之一。喜樹驗類，包括脫波 肯’揭示於SmithKline Beecham公司擁有之，758專利， 1991年4月2日核發專利。喜樹鹼類，包括脫波肯，也揭 示於 Cancer Chemotherapy and Biotherapy,第 2 版， Bruce A· Chabner 與 Dan L. Longo 編輯，Lippincott-

Raven出版社，費城—1996，第463-484頁。脫波肯進一步 揭示於 Merck Index，第 12 版，_199，Merck & Co.公 司，專屬編號9687。 遠技術領域已知之另一個化學治療藥劑範例是蒽環抗 生素類。阿黴素與柔紅黴素（daunorubicin)是蒽環抗生素 範例。這些藥劑是目前臨床操作上最廣泛使用的抗腫瘤 劑。阿黴素目前主要用於治療實體腫瘤，尤其是乳癌及淋 已瘤。養 t Cancer Chemotherapy and Biotherapy，第 2 版，Bruce A· Chabner 與 Dan L. Longo 編輯， Lippincott-Raven 出版社，費城，1996，第 409-434 頁。 -21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 〇χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227136 A7 B7 五、發明説明（2〇) 阿黴素進一步揭示於Merck Index,第12版，_1996 Merck & Co.，公司，專屬編號3495。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 該技術領域已知之另一個化學治療藥劑範例是烷化 劑。烷化劑之範例之一是環磷醯胺。這些藥劑廣泛用於化 學治療上，用於習知組合攝生法及配合骨髓移植之高劑量 勢 ° 冬 t Cancer Chemotherapy and Biotherapy，％ 1 版，Bruce A. Chabner 及 Dan L. Longo 編輯， Lippincott-Raven 出版社，費城_1996，第 297-332 頁。 環填S&胺進一步揭示於Merck Index，第12版，_1996 Merck & Co.，公司，專屬編號2816。 該技術領域已知之另一種化學治療藥劑是抗微管劑。 抗微管劑之範例之一是紫杉院（taxane)派利塔生 (paclitaxel)。紫杉烷類對許多種類的腫瘤有效力。參見 Cancer Chemotherapy and Biotherapy,第 2 版，Bruce A. Chabner 及 Dan L· Longo 編輯，Lippincott-Raven 出版 社，費城一1996，第263-296頁。派利塔生進一步揭示於 Merck Index，第 12 版，—1996 Merck & Co.，公司，專屬 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 編號7117。其他化學治療藥劑是熟悉該技術領域者已知 的。 本發明提供增強劑，例如上述之IL-18，與該技術領 域已知之化學治療劑，例如上述藥劑，之組合。 另一方面提供藥學組成物，其包含治療有效劑量之上 述增強劑’以及上述化學治療劑。也可使用藥學上可接受 之載劑或賦型劑。所使用的藥學載劑，舉例而言，可以是 ___ _ -22- 本紙張尺度適财公5 --- 1227136 A7 A7 B7 五、發明説明（） 21 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 固體或液體。固體載劑之範例包括下列物質但不受限於 此··乳糖、白土、蔗糖、滑石、明膠、凝膠、果膠、阿拉 伯膠、硬脂酸鎂、硬脂酸等。液體載劑之範例包括下列物 質但不受限於此：鹽水、經緩衝之鹽水、葡萄糖、水、甘 油、乙醇糖漿、花生油、橄欖油、及其組合。載劑或稀釋 劑也可包括該技術領域已知之緩釋物質，例如甘油基單硬 脂酸酯或甘油基二硬脂酸酯，單獨使用或與蠟乙基纖維 素、羥丙基曱基纖維素、曱基異丁烯酸酯等組合使用。 本發明另關於藥物包袤及套組，其包括一種或一種以 上的容器，其中充填一種或一種以上之上述本發明組成物 的組成分。多肽與化學治療藥劑的組合可單獨使用，或與 其他化合物，例如治療性化合物，合併使用。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 組成物將配合用藥途徑，例如全身用藥或經口途徑， 加以調配。全身用藥之較佳形式包括注射、通常是經靜脈 注射。也可使用其他注射途徑，例如經皮下、經肌内、或 經腹腔内。若多肽與化學治療藥劑的組合可調配成腸衣 或包以被膜的配方，則可經口用藥。全身用藥之另一種方 式包括穿黏膜及穿皮用藥，其使用諸如膽鹽、梭鏈孢酸 (fusidic acids)或其他去污劑之穿透劑。這些組合物也表 面及/或局部用藥，以油膏、糊劑、凝膠劑等形式。 組成物所需之劑量範圍由所選擇的增強劑及化學治療 藥劑、用藥途徑、配方性質、對象之狀態性質、及參與實 際操作者的判斷力決定。儘管如此，此組成物施用至對象 之適合劑量為，IL-18介於1毫微克/仟克至1微克/什 _-23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227136 Λ7 Α7 Β7 五、發明説明（） 22 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 克，化學治療藥劑介於特定化學治療藥劑之臨床可接受劑 量之1/10至該特定化學治療藥劑之臨床可接受劑量的10 倍。所需劑量預期將有多種變化，此由所用的化合物種類 及多種用藥途徑的不同效力而定。例如，預期穿皮用藥比 經靜脈内用藥需要更高劑量。這些劑量濃度上的變化可使 用標準經驗慣例加以調整，此乃該技術領域可了解的。 施用此組成物的規劃係由劑量、所選擇的增強劑及化 學治療藥劑、用藥途徑、配方性質、對象之狀態性質、及 參與實際操作者的判斷力決定。儘管如此，合適的用藥規 劃是每天給藥1-3次至每週給藥1次。施用該組成物之規 劃中預期將有種變化，此由所用的化合物種類及多種用藥 途徑的不同效力而定。例如，預期穿皮用藥比經靜脈内用 藥需要更高劑量。施用該組成物之規劃中的變化可使用標 準經驗慣例加以調整，此乃該技術領域可了解的。 本說明書引用之所有公開文獻’包括專利及專利申請 案，但不限於此，皆併入本發明作為參考，當每份個別公 開文獻特別且單獨指出時，係視為全部併入本發明作為參 考。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 相信熟悉該技術領域者利用上述說明可將本發明實施 至最大範圍。因此，下列實施例僅用於說明，絕不應構成 本發明範圍之任何限制。 實例I (A) : Lewis肺癌模型中腫瘤生長減少情形 實驗步驟 經由後期實體腫瘤模型（高轉移性Lewis肺癌），顯示 _____-24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227136 A7 A7 B7 五、發明説明（） 23 脫波肯與IL-18組合之活性實驗中，B6D2F1母鼠由靜脈接 踵105 Lewis肺癌細胞，於第7天隨機分組為各有14隻小 鼠之處理組。當腫瘤立足並生長於肺部之際，延後處理直 到第7天。於第16天犧牲各組中一半的小鼠，測定對肺 部腫瘤生長的治療功效，其餘小鼠繼續接受處理並檢視其 存活情形（參見實例I (B))。第7天開始，經腹腔内施用 脫波肯，q4Dx7，第32天結束，劑量以mg/kg表示。由第 7天至第32天，經腹腔内施用鼠IL-18，UID，劑量以//g/ 鼠表示。對照組動物有3組，對照組在第17至30天之間 全部死亡。檢視動物之存活情形達61天。（參見圖1與 2，及表1)。 結果 對照組在第16天有非常大的腫瘤負擔，平均有350 mg肺部腫瘤（參見圖1與2)。肺部的個別巨視腫瘤數目大 於80 (參見圖2)。 單獨施用IL-18明顯減少肺腫瘤重量與結節數，無明 確的劑量-反應。IL-18單獨施用只有中度功效，接受胞激 素的動物沒有增加存活時間半值。脫波肯之最高耐受劑量 (MTD)(15 mg/kg，q4D攝生法）抑制腫瘤生長90%以上，但 鼠仍具有平均45個之肺腫瘤結節。添加IL-18得到類似 的強效腫瘤生長抑制作用。與低於最大劑量（9 mg/kg， q4D攝生法）之脫波肯組合明顯有好處（參見圖1與2)。 實例1(B)- Lewis肺癌模型中的存活情形 實驗步驟 _-9S·._ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 線< 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227136 A7 B7 五、發明説明（） 24 參見實例1(A)之步驟。 結果 如表1所示，於具有後期全身性Lewis肺癌之小鼠 中，由IL-18與脫波肯組合之試驗所得存活數據證實了 IL-18之活性，此活性由測量腫瘤而鑑知。如所預期的， 當IL-18單獨使用，IL-18對存活時間沒有影響。單獨使 用脫波肯，在其MTD時，延長壽命8%，在0. 6x MTD劑量 時，延長63%。0.5 mg/kg之IL-18加上最大耐受劑量（15 mg/kg)之脫波肯，增加壽命145% ;低於最大劑量（9mg/kg) 之脫波肯加上〇· 5 mg/kg之IL-18，增加壽命82%。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表1 治 療 組 劑 量 存活時間 半值（天數） 壽命增加 百分比（％) 對 照 組 • 22 - IL-18 10 24 9 3 23 4 1 22.5 2 0.3 22 0 脫波肯 15 37 68 脫波肯+ IL-18 15 + 10 54 145 15 + 3 32 45 15 + 1 47 114 15 + 0.3 41 86 脫波肯 9.0 36 63 脫波肯+IL-18 9.0+10 40 82 9.0 + 3 38 73 9.0+1 35 59 9.0+ 0.3 28 27 _ -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

、1T 線泰 1227136 五、發明説明（） 經腹腔内施用脫波肯，d4Dx7,第7天開始，第犯天結 束；劑量以mg/kg表示。 經腹腔内施用鼠IL-18 ’ UID，第7天至第32天；劑量以 V g/鼠表示。 IMJIQO- Lewi旦肺癌模型中腫瘤 實驗步驟 乂 進-步實驗中，脫波肯加上α_1δ之組合活性以後期 全身性Lewis肺癌模型純證實。此實驗包括使用高劑量 之HB6D2F1母鼠（22-24 gm)經靜脈接種1〇5 Lewis 肺癌細胞，於第7天隨機分組為各有12_丨 組。於第Η天犧牲各組中一半的小鼠，測定又二= 生長的治療功效，包括腫瘤重量與結節數。其餘小鼠繼續 接受處理並檢視其存活情形。第7, u，15, 19, 23及29 天，，腹腔内施用脫波肯，q4Dx 6 ;劑量濃度以mg/kg表 不。第7天至第33天，經腹腔内施用鼠化_18，冲χ26 ; 劑量濃度以/zg/鼠表示。有3組對照組，對照組在第Η 至28天之間全部死亡。（參見圖3與4，及表幻。 結果 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 最大耐文劑量之脫波肯提供減少腫瘤重量及結節數的 良好作用，較低劑量之脫波肯對此兩種參數的影響較小。 上述組合減少腫瘤負擔的功效，低於單獨使用脫波肯所達 到的功效。此功效的最佳證據是腫瘤重量，而不是結節 數，此時較低劑f IL—i8有較大作用。此結果確認了 最初研 九此種組合在Lewis肺癌所得的有利結果。（參見圖3與4)。 1227136 A7 B7 26 五、發明説明（ 實例UiHi 癌模型中的存活情开名 實驗步驟 參見實例IKA)之步驟。 結果 實驗存活半值得結果整理於如下表2。施用最大耐受 劑量之脫波肯時，也施用IL—18的小鼠的存活時間明顯二 長。施用低於最大劑量之脫波肯時，也施用最高劑量'乂 18的小鼠壽命延長兩倍。 ^ 表2 (請先閱讀背面之0/1土思事項再填寫本耳) 治 療 組 劑量* 存活時間 半值（天數) 壽命增力ϋ 百分比（％) η

IL-18 100 30 10 3 1 6 6 6 6 6 22 18.5 18 18 20 22 3 0 0 11 脫波肯 脫波肯+ IL-18 -訂- 15 33.5 86 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 15 + 100 15 + 30 15 + 10 15 + 2 15 + 1 7 6 43 42 41 42 38 脫波肯 脫波肯+IL-18 9 9+100 9 + 30 9+10 9 + 3 9+1 6 7 7 7 7 7 25.5 34 30 27 30 29 139133 128 133 111 42 89 67 50 67 61 線· -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 1227136 A7 B7 五、發明説明（） 27 第7，11，15，19，23，及29天，經腹腔内施用脫波肯， q4Dx6 ;劑量濃度以mg/kg表示。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 第7天至第32天，經腹腔内施用鼠IL-18，q4Dx2 ;劑量 以#g/鼠表示。 f例III- M0PC-315漿細胞瘤 實驗步驟 M0PC-315漿細胞瘤類似習知多發性骨體瘤的人類癌 症。此腫瘤是漿細胞的惡性腫瘤，漿細胞是參與抗體表現 之B淋巴細胞的成熟型。同系BALB/c小鼠中，MOPC-315 快速生長至極大體積。此腫瘤不是高度轉移型或侵略型。 評估IL-18係利用具有固著於皮下之M0PC-315漿細 胞瘤的小鼠。為了要增加機會觀察免疫療法的影響，評估 IL-18與有效化學治療藥劑組合，以及IL-18單劑治療。 每天經腹腔施用0.3，1，3,及10 //g/鼠之IL-18，且根 據q4D規劃，經腹腔内施用9及15 mg/kg之脫波肯。兩 種藥劑皆在腫瘤植入後第11天，此時腫瘤體積半值介於 32至88 mg之間，開始施用。對照組腫瘤花了 ΐ7· 2天長 成1公克（參見圖5-7)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 結果 於本實驗所評估的劑量下，以IL-18單獨處理者對固 者腫瘤之腫瘤生長的影響微乎其微。腫瘤生長延遲1 3一 3.1天（參見圖5)。單獨施用脫波肯者，在其最大耐受劑 量達到的完全腫瘤消失是1/7，且延遲腫瘤生長約12天。 最大耐受劑量之脫波肯與劑量為10，3，或1 “g/氣/ _____________ -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐）— ------- 1227136 A7 B7 五、發明説明（） 28 天之IL-18組合，比單獨使用脫波肯更有活性，其完全腫 瘤消失的鼠達到5/7，且為長期腫瘤消失。值得注意的 是，腫瘤在消失前已生長至相當大的體積。也值得注意的 是，腫瘤在中斷治療後重新生長，然後在沒有進一步治療 而再次腫瘤消失，推測此為經由免疫調節的反應（參見圖 6) ° 也證實IL-18與低於最高劑量的脫波肯組合，有增強 且從未預期的結果。9 mg/kg脫波肯對腫瘤生長的影響極 小或無影響，沒有腫瘤消失且只有4天的腫瘤生長延遲。 施用高劑量IL-18，7隻小鼠中有5隻完全腫瘤消失，1隻 部分腫瘤消失。另外兩隻小鼠是長期腫瘤消失，94天仍顯 示腫瘤消失跡象（參見圖7)。 實例 IV-M0PC-315漿細胞瘤 實驗步驟 IL-18與脫波肯組合對具有後期M0PC-315漿細胞瘤之 小鼠的活性以大型實驗加以證實，此實驗中使用較高劑量 的IL-18。此實驗中，第10天開始施用脫波肯，q4Dx6， 同一天開始施用IL-18，qDx30。兩種藥物皆經腹腔内施 用，測量腫瘤以評估活性。 結果 先前實驗中，IL-18施用最高劑量，10//g/鼠/天， 但IL-18單獨使用對腫瘤生長無影響。然而，確認實驗 中，IL-18施用更高劑量，100及30 10/zg/鼠/天，於 最高劑量時，IL-18單獨施用對引起延遲型腫瘤消失有 _-30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 1227136 五、發明説明（） 29 ； 效，六隻小鼠中的4隻有腫瘤消失。較低劑量之IL-18無 效，如圖8所示。 IL-18與脫波肯組合的高效活性，在最咼而ί受劑量的 脫波肯時獲得證實（參見圖9)。單獨使用脫波肯是相當有 效的’得到2/6完全腫瘤消失且延長腫瘤生長之抑制作 用。但是第33天中斷脫波肯，發現有腫瘤重新生長的現 象。當使用三種最高劑量的IL-18，發現所有被處理的小 鼠實質上有快速、完全且延長腫瘤消失。這些反應發生的 IL-18劑量是單獨使用IL-18無效的IL_18劑量。（參見圖 9) ° 低於最高劑量之脫波肯實質上對此後期腫瘤無作用， 但其與隶南三種劑量的IL-18組合時’幾乎所有動物發現 有完全的腫瘤消失。（參見圖10)。 复例V- MOPC-315漿細胞瘤（用藥規劃與途徑的研究） 實驗步驟 重複評估IL-18與化學治療藥劑的組合，以確定下列 事項·（a) IL-18經皮下用藥時，其於腫瘤模型中效力如 何？(b)當IL-18以間段規劃用藥時，其是否有活性？或是 否有必要每日治療？此實驗也使用脫波肯建立於·PC_315 漿細胞瘤模型上，第10天開始治療，當時腫瘤體積約 100mm3。脫波肯施用最大耐受劑量，15 mg/kg，根據q4D 攝生法，而IL-18施用的劑量範圍大，經腹腔内或經皮 下，根據qlD或q4D攝生法。此實驗中，發現組合者比上 述研究有更高毒性，此可由嚴重的體重減少得證，故僅兩 ____zliz______ 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210 X297公釐1 ' . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 、IT_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227136 A7 B7 五、發明説明（） 30 次治療過程之後，中斷脫波肯。但繼續IL-18(參見圖11-13)。 結果 單獨施用IL-18，採用qlD規劃，於100 //g/天之劑 量下有活性，此結果證實較早實驗的結果。經腹腔内與經 皮下兩種途徑皆有活性，雖然經腹腔内較有效。（參見圖 11) 。如圖13所示，當胞激素單獨使用時，間歇施用1000 或100 //g/劑的IL-18對引起腫瘤消失無效。 再次驗證每日施用IL-18與脫波肯組合之活性，IL-18經皮下或經腹腔内施用的活性相等。經由任一途徑，需 要劑量為10 //g/天或更高才能顯示增進功效（參見圖 12) 。 根據間歇式用藥規劃施用IL-18,與化學療法組合是 有效的。10或100 //g/鼠/劑的相同劑量在q4D攝生法， 以及qlD攝生法，同樣有效（參見圖13)。 實例VI-B16黑色素瘤 實驗步驟 此實驗中，以後期同系腫瘤模型評估單獨使用IL-18 及與化學療法的組合。對具有後期皮下植入B16F10黑色 素瘤的小鼠，單獨施用IL-18,或IL-18與環磷醯胺或與 脫波肯組合施用。腫瘤植入後第11天開始治療。載劑對 照組之存活時間半值是20天。 結果 以IL-18單獨治療對腫瘤生長無效，對存活時間的影 _ -^9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------Φ------1T------00— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227136 A7 B7 五、發明説明（） 31 響微乎其微（$30% ILS)，雖然應注意到IL-18不用漿細胞 瘤模型中單獨施用IL-18有活性之高劑量予以治療。（參 見圖14)。根據q7D規劃，施用最大耐受劑量之環磷醯 胺，300 mg/kg，則存活率增加95%，腫瘤生長延遲14 天。（參見圖15)。脫波肯在其最大耐受劑量時無活性（參 見圖16)。 IL-18與最大财受活性之環鱗驢胺組合，對抗腫瘤活 性有最低且劑量依賴式的影響。最低劑量的IL-18與環磷 醯胺的組合延長壽命110%，腫瘤生長延遲增加3天。更高 劑量的IL-18組合與單獨施用環磷醯胺的功效無異（參見 圖 15)。 此轉移性腫瘤模型中，對於延遲B16F10生長或延長 壽命的影響，最大财受劑量之脫波肯與IL-18的組合不比 脫波肯單獨施用有效。（參見圖16)。應注意的是，B16F10 黑色素瘤是一種變化大的腫瘤模型，其對於目前可用的治 療方法反應差。 實例VII- B16黑色素瘤 實驗步驟 進行重複實驗，藉以決定IL-18與環磷醯胺的組合在 B16黑色素瘤模型上的效力。將組織培養之B16F10繼代細 胞經皮下植入，令其在治療前生長至體積半值為1〇〇 mm3。此實驗結果發現延遲腫瘤生長，故直到第14天尚未 達到100 mm3之體積半值；治療開始時具有極大腫瘤之同 一動物，其腫瘤大小也變化相當大。 __ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I---------Hn------、玎------#· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227136 A7 B7 五、發明説明（） 32 結果 I 辞丨 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 施用IL-18，環磷醯胺或其組合，無腫瘤消失現象。 單獨施用IL-18產生最低的腫瘤生長延遲，延遲兩天。最 大对受劑量的環磷:酿胺延遲腫瘤生長14天，添加IL-18 對此活性的功效影響不大。與高劑量IL-18組合時，似乎 降低功效，但此僅僅因為此試驗組的腫瘤在治療之初比別 組大許多之故。低於最大劑量的環磷醯胺，180 mg/kg， 延遲腫瘤生長僅有4天，但組合時的功效增強，除了治療 開始時有大腫瘤之組合試驗組之外，腫瘤生長延遲延長至 約10及15天（參見圖17-19)。 實例VIII-麥迪生氏（MADISON) 109肺癌 實驗步驟 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以麥迪生氏109肺癌進行實驗，藉以測定IL-18與派 利塔生組合的功效。此腫瘤模型是對派利塔生最敏感的同 系鼠腫瘤，但對此藥物只有中度反應。將此腫瘤經皮下植 入，令其於治療前生長至體積半值為126-326 mm3。治療 之初具有極大腫瘤的一些動物，其腫瘤大小變化極大。根 據qDx5規劃（第9-13天），經靜脈施用派利塔生（12，24, 48mg/kg)。根據qDx21規劃，經皮下施用IL-18，每隻鼠 劑量為1，10及1〇〇 //g。 結果 派利塔生以48 mg/kg之劑量單獨或組合施用是有毒 性的，根據明顯的體重減少，其在24 mg/kg劑量時接近 毒性。派利塔生在此劑量下，添加較高劑量的IL-18確實 _ -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） A7 1227136 ___B7 五、發明説明（） 33 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 造成早期死亡。如同較早的實驗，單獨施用IL-18是可充 分而ί受的。（參見圖20及表3)。 單獨治療或組合治療沒有腫瘤消失現象。單獨施用派 利塔生對腫瘤生長延遲及延長存活時間的影響微乎其微。 組合對功效無重要改良，但施用12 mg/kg劑量的派利塔 生，延長較低劑量IL-18之腫瘤生長延遲作用。單獨施用 低劑量IL-18，延長壽命77%，但不延遲腫瘤生長。當此 劑量的IL-18與派利塔生組合時，可發現相同的延長壽命 現象（參見圖20及表3)。 表3 IL-18 sc 派利塔生 mg/kg, iv 0 12 24 48 0 T-C3.5 天 NT 27% ILS T-C 9.7 天 -4.7g 35% ILS 毒性 1 T-C 1.7 天 NT 77% ILS T-C 9·9 天 -3.7g 77% ILS T-C 9.7 天 -5.6g 77% ILS 毒性 10 T-C 2.1 天 NT 12% ILS T-C 6.4 天 -4.2g 21% ILS 毒性 毒性 100 T-C 2·8 天 NT 0%ILS T-C 3.3 天 -3.5g 46% ILS 毒性 毒性 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 T-C :腫瘤生長延遲 NT :無毒性，體重減少低於3 gm _-35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210 X 297公釐） 1227136 at B7 五、發明説明（） 34 實例IX-乳腺癌16/C 實驗步驟 以16/c乳腺癌腫瘤模型進行實驗，藉以測定IL-18 單獨施用及與阿黴素組合的功效。將16/c純系細胞以 1:10勻漿經皮下植入，令其於治療前生長至體積半值為 52-109 mm3。第12及19天經靜脈施用阿黴素，劑量為7· 2, 12及20 mg/kg。第12天開始，根據qDx21規劃經皮下施 用IL-18，劑量為1，10，及1〇〇 //g/鼠。此研究的終點 是腫瘤延遲及腫瘤消失。 結果 單獨施用阿黴素或IL-18或組合施用，沒有腫瘤消 失。如表4所示，IL-18明顯加重阿黴素之毒性。最大而才 受劑量之阿黴素是20 mg/kg。此劑量即使與1//g的IL-18組 合，也是有毒性。1/3最大耐受劑量的阿黴素不造成重量減 少，效力極低或無，與10或100 Ag之IL-18組合有毒性。 表4 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 IL-18 pg/ 鼠、，ip 阿德 mg/kj t素 0 7.2 12 20 0 無毒性 無毒性 無毒性 1 無毒性 無毒性（1/6) 毒性_ 毒性（4/6) 10 無毒性 毒性_ 毒性_ 毒性_ 100 無毒性 毒性陶 毒性_ 毒性（6/6) (毒性死亡) -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227136 at B7 五、發明説明（） 35 因為有毒性，組合在抗腫瘤活性上的影響不能測定。 阿黴素產生劑量依賴式腫瘤生長延遲，如圖21所示。單 獨施用IL-18在不到一週内就產生極低的腫瘤生長延遲， 超過100倍劑量範圍沒有劑量-反應證據。（參見圖22)。 兩種藥劑在最低劑量時，只有組合的劑量是耐受的，沒有 增強阿黴素之抗腫瘤活性（參見圖23)。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

7 3 I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227136 序列表

<110> Johnson, Randall K <120>新化合物 <130> P50777 <140〉未知 <141> <150> 60/086,560 <151> 1999-05-21 <160> 2

<170> Windows 第 3 版適用之 FastSEQ <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213>人類 <400> 1

Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val lie Arg Asn Leu Asn 15 10 15

Asp Gin Val Leu Phe lie Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30

Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie 35 40 45 lie Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie 50 55 60

Ser Val Lys Cys Glu Lys lie Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys lie 65 70 75 80 lie Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys 85 90 95

Ser Asp lie lie Phe Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110

Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 1227136

Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140

Gly Asp Arg Ser lie Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 145' 150 155 <210> 2 <211> 157 <212> PRT <213> 氛 <400> 2

Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val lie Arg Asn lie Asn 15 10 15

Asp Gin Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gin Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30

Thr Asp lie Asp Gin Ser Ala Ser Glu Pro Gin Thr Arg Leu lie lie 35 40 45

Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60

Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys lie lie 65 70 75 80

Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn lie Asp Asp lie Gin Ser 85 90 95

Asp Leu lie Phe Phe Gin Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110

Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gin Lys Glu 115 120 125

Asp Asp Ala Phe Lys Leu lie Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140

Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gin Ser 145 150 155

Claims (1)

1227136 A8 B8 C8 D8 公告本j 丨修正· ^ I補先衣0年5乃a 專利申請案第88107944號·-’ ROC Patent Appln. No. 88107944 修正後無劃線之申請專利範圍中文本·附件(二) Amended Claims in Chinese - Enel. (Π) (民國93年8月々日送呈j (Submitted on August ^, 2004) 1· 一種用於預防及/或治療癌症之醫藥組成物，其係包含 一具有SEQ ID NO: 1所示胺基酸序列之多肽及脫波肯 (topotecan) ° 2· —種用於預防及/或治療癌症之醫藥組成物，其係包含 一具有SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列之多肽及脫波肯 (topotecan) 〇 3·如申晴專利範圍第1或2項之醫藥組成物，其進一步包 含一藥學上可接受之載劑。 4. 一種抑制哺乳動物體内腫瘤細胞生長之醫藥組成物， 其係包括具有SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:2之胺基酸 序列之多肽及脫波肯為活性成分。 5·如申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其進一步包 20 含一藥學上可接受之載劑。.， . 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 88162b-接 1 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS)A4規格（210x297公釐）