WO2003022883A2 - Verwendung eines proteins zur herstellung eines medikaments zur stimulierung des angeborenen unspezifischen immunsystems - Google Patents

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WO2003022883A2
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Definitions

  • the invention relates to the use of a protein for the manufacture of a medicament and a medicament for stimulating the innate unspecific immune system. It also relates to a method for producing the medicament.
  • Pathological cell death necrosis
  • the cytoplasmic membrane becomes permeable and the cell contents are released.
  • the programmed cell death, apoptosis initially preserves the cell membrane.
  • the cells are removed before their potentially dangerous contents are released into the environment.
  • the cells are subject to surface changes, for example a modification of the carbohydrates and the exposure of anionic phospholipids, in particular phosphatidylserine (PS) on the outside of the cytoplasmic membrane.
  • PS phosphatidylserine
  • the latter is caused by the downregulation of the ATP-dependent aminophospholipid translocase, which specifically transports aminophospholipids from the outside to the inside of the membrane.
  • a non-specific lipid flip site called scramblase is activated, which leads to an acceleration of the phosphatidylserine flip-flop mechanism.
  • Phosphatidylserine located on the outside of the cytoplasmic membrane serves as a recognition signal for the removal of apoptotic cells.
  • Annexin V Annexin V
  • murine peritoneal macrophages macrophages of the J774 cell line of the mouse and bone marrow macrophages.
  • ciert Kert (Krahling, S., et al., Cell Death Differ. 6 (1999), 183-189).
  • Annexin V generally leads to strong inhibition of apoptotic cell uptake by both activated and non-activated macrophages. Due to its Ca 2+ channel activity, Annexin V also slows down apoptosis in CEM cells.
  • Eliminating apoptotic cells normally does not induce inflammation or an immune response. In direct contact with plasma, apoptotic cells can produce procoagulatory and, under certain conditions, pro-inflammatory effects. On monocytes / macrophages, however, normally immunomodulating effects of apoptotic cells dominate through the interaction of the apoptotic cells via thrombospondin with CD36 on phagocytes.
  • Lectin-like molecules such as the vitronectin receptor (CD51 / CD61), thrombospondin, CD36 and CD14, are receptors that recognize surface changes on apoptotic cells. CD14 appears to be necessary for phagocytosis of lymphocytes and lipid-symmetric erythrocytes in activated and non-activated macrophages.
  • the phagocytosis of apoptotic lymphocytes by macrophages is stereospecifically inhibited by phosphatidyl-L-serine liposomes.
  • a receptor responsible for the recognition of phosphatidyl-L-serine is defined by antibodies which have been caused by immunization with TGF- ⁇ and ⁇ -glucan-stimulated macrophages (Fadok, VA, et al., Nature 405 (6782) (2000 ), 85-90).
  • receptors important for the detection of apoptotic cells include the scavenger receptors, the LPS receptor CD14, the thrombospondin receptor CD36, the vitronectin receptor CD51 / CD61, the complement receptors and the macrosialin CD68.
  • pentraxins, collectines, different complement factors, ß2-glycoprotein, the annexins and gas-6 serve as adapter proteins.
  • mice injected with apoptotic human T cells showed significantly reduced humoral responses to T cells compared to control mice injected with viable cells (Ponner, BB, et al., Scand. J. Immunol. 47: 343-347 (1998). It was also observed that immunization with apoptotic cancer cells induced drastically reduced cytotoxic T cell responses compared to living growth-blocked cells (Ronchetti, A., et al., J. Immunol. 163 (1999), 130-136 ). This shows that the engulfment phagocytosis of apoptotic cells does not lead to an efficient antigen presentation and activation of T and B lymphocytes.
  • Annexin V stimulates the humoral immune response. This article contains no information on stimulation of the cellular immune response or the innate unspecific immune system.
  • the object of the invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • it is intended to be used and a medicament against tumors, viruses, bacteria and parasites are given.
  • a method for producing the medicament is also to be specified.
  • the use of a protein for the manufacture of a medicament for stimulating the innate unspecific immune system is provided, the protein
  • b) comprises an effective fragment of Annexin V or the molecule which is largely similar to it.
  • the use of the protein according to the invention leads to a pro-inflammatory response of the monocytes or macrophages and thus to an increase in cellular immunity.
  • the claimed protein is ideal for combating tumors, viruses, bacteria and parasites.
  • the effect of the protein according to the invention is obviously based on the fact that apoptotic cells are changed by loading with Annexin V in such a way that they are able to activate the innate unspecific immune system, in particular natural killer cells (NK cells) and macrophages. Furthermore, the effective concentration of the monokine TNF- ⁇ is increased by the administration of Annexin V. The monokine TNF- ⁇ is particularly important for the recruitment of NK cells in the Peritoneum (Smyth, MJ et al., 1998, J. Exp. Med. 9: 1611-1619). Furthermore, the effect of the protein according to the invention is in particular also attributed to the fact that it binds to phosphatidylserine and inhibits its anti-inflammatory potency.
  • This function of the protein is not only fulfilled when it is annexin V. It is also met if the protein only comprises a molecule similar to Annexin V or an effective fragment of Annexin V or a molecule largely similar to the fragment. - A fragment is "effective" in particular when it binds to phosphatidylserine and contributes to the stimulation of a pro-inflammatory cellular immune response.
  • similar molecules is understood to mean those molecules which bind in particular to phosphatidylserine and to a certain extent have an identity with Annexin V.
  • an amino acid sequence of the protein can correspond to the amino acid sequence of SEQ ID No. 1 or No. 2 or at least 50%, preferably at least 60%, particularly preferably at least 70%, very particularly preferably at least 80%, identical to it his. Identity can be determined e.g. according to the method of Altschul, S.F. et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.
  • identity is understood here to mean the extent to which two nucleotide or amino acid sequences are invariant.
  • the amino acid sequence of SEQ ID No. 2 is an N-terminal deletion mutant of the amino acid sequence of SEQ ID No. 1, which lacks the eight amino acids 3 to 10, that is, the amino acids Lys Tyr Thr Arg Gly Thr Val Thr.
  • the Annexin V is non-human Annexin V, preferably the Annexin V of the chicken.
  • a comparison of the amino acid sequence of chicken annexin V with human annexin V shows that both proteins are 78.2% identical.
  • Chicken annexin V has a theoretical isoelectric point (p1) of 5.60, while human annexin V has a theoretical isoelectric point of 4.94.
  • the sequence of the human annexin can be called up under the accession number P08756 in the protein database "SWISS-PROT". Both annexins are immunogenic in the animal model.
  • the immune response can be stimulated by blocking, covering, masking and / or removal of extracellular membrane-located phosphatidylserine.
  • the protein can thus be used expediently to combat bacteria, viruses, parasites or tumors.
  • the protein is preferably used as an adjuvant. In this context, it can be used preferably in tumor therapy, for tumor vaccines, in virus therapy, in particular for the treatment of retrovirus infections, lentivirus infections, infections with Treponema pallidum, the Sindbis virus, Trypanosoma brucei and HIV infections and for the treatment of malaria and in malaria immunization.
  • the medicament can further comprise human tumor cells, wherein the tumor cells can be apoptotic and / or necrotic tumor cells.
  • the apoptosis and / or necrosis of the tumor cells can occur spontaneously or have been induced.
  • Possible inducers for apoptosis and / or necrosis are radiation of the tumor cells ex vivo or in vivo or contact of the tumor cells with cytostatics.
  • chemicals such as H 2 0 2 or staurosporine, medications such as corticosteroids, chemotherapeutic agents such as doxies are particularly suitable.
  • apoptotic and / or necrotic tumor cells are preferably brought into contact with the active substance.
  • a medicament for stimulating the innate unspecific immune system with a protein which
  • bb includes apoptotic and / or necrotic tumor cells.
  • a method for producing the medicament according to the invention whereby apoptotic and / or necrotic tumor cells are brought into contact with a protein which
  • the protein used in this method is preferably produced by expression using transformed strains of Escherichia coli and subsequent purification.
  • the Escherichia coli BL21 (DE3) strain is preferably used.
  • the strain of Escherichia coli used can be transformed with an expression plasmid which is capable of expressing chicken annexin V or an active fragment thereof.
  • the expression plasmid pDJ2-AnXV which in addition to the gene expressing chicken annexin V, contains an IPTG-inducible tac promoter and an antibiotic resistance cassette. Kanamycin is preferably used as the antibiotic for separating the non-transformed bacteria from the transformed bacteria.
  • the active ingredient is obtained with a purity that exceeds 95%.
  • annexin V of the chicken or an active fragment thereof as an active ingredient is based on the finding that the masking of phosphatidylserine with this active ingredient leads to a pro-inflammatory effect of apoptotic and / or necrotic cells and thus promotes the cellular immune response against apoptotic cells.
  • Chicken Annexin V increases the immunogenicity of autologous or syngeneic apoptotic cells clearly. It is therefore suitable to increase the efficiency of vaccines that contain apoptotic cells. This is particularly important if the cells have been irradiated before the vaccine is injected.
  • the immunogenicity of these cells is low, since the uptake of apoptotic cells causes an anti-inflammatory reaction of human monocytes / macrophages.
  • this anti-inflammatory effect of apoptotic and / or necrotic cells is reduced, thus significantly increasing their immunogenicity.
  • the anti-inflammatory effect of phosphatidylserine-exposing cells can be blocked with the protein according to the invention.
  • the protein can effect an immunostimulation by blocking, covering, masking and / or removing extracellular, preferably membrane-located phosphatidylserine.
  • the protein can therefore be used as a modulator of a cellular immune response.
  • the immunogenicity of tumor vaccines can be increased if they consist of irradiated and thus largely apoptotic tumor cells. Furthermore, it is possible to achieve a cellular immune response against those tumor cells that are cytostatically affected for therapeutic reasons. deals or have been radioactively irradiated in situ. In this case, a tumor-specific cellular immune response would increase the success of the therapy when eliminating the residual tumor mass. Also in the treatment of viral infections, for example enveloped viruses that expose phosphatidylserine, the blocking of the phosphatidylserine-dependent anti-inflammatory effect leads to a specific immune stimulation. The treatment of infections with lentiviruses and HIV must be seen as a particularly important example in this context.
  • Chicken annexin V is suitable for the treatment of people infected with HIV, since inflammatory phagocytosed apoptotic material triggers a "respiratory burst" in the phagocytes and thus leads to the destruction of the virus genomes.
  • phosphatidylserine e.g. Treponema pallidum
  • infections and parasitic diseases that lead to exposure of phosphatidylserine to infected host cells e.g. Sindbis virus, Plasmodium sociciparum, Trypanosoma brucei.
  • Fig. 2 is a polyacrylamide gel electrophoresis of samples of the individual purification steps of Annexin V des Chicken from transformed Escherichia Coli BL21 (DE3),
  • 4a shows the proportion of tumor-free animals as a function of the time and the injection of different amounts of irradiated tumor cells which had been treated after irradiation with or without chicken annexin V, the animals having been treated before the injection of living tumor cells,
  • 4b shows the proportion of tumor-free animals as a function of the time and the injection of irradiated tumor cells which were treated after irradiation with or without chicken annexin V, the animals being injected with living tumor cells before the treatment,
  • Fig. 5a tumor latency of the mice that did not reject the tumor, depending on the dose of irradiated tumor cells and the administration of Annexin V and
  • 6 shows the proportion of tumor-bearing animals as a function of the duration after tumor inoculation
  • 7 shows the survival rate as a function of the duration after tumor inoculation
  • Fig. 9 tabular summary of the results of the animal groups examined.
  • cAnxV chicken annexin V
  • expression plasmid pDJ2-AnxV was used, which in addition to the gene coding for cAnxV contains an IPTG-inducible tac promoter and a kanamycin resistance cassette.
  • E.coli BL21 (DE3) was transformed with the expression plasmid and expression kinetics were carried out. 2xYT with 50 mg / 1 kanamycin was used as the nutrient medium.
  • cAnxV For the preparation of cAnxV, a 100 ml preculture was inoculated with freshly transformed E. coli BL21 (DE3) and shaken at 37 ° C. for 8 h. 5 l of the main culture were mixed with 5 ml of the preculture and shaken at 37 ° C. for 16 to 20 h. The addition of IPTG was dispensed with, since in this case the same expression yields were achieved with and without induction. The cells were then harvested by centrifugation. The cell wet weight was 16 to 21 g. The expression kinetics is shown in FIG. 1. The expression kinetics showed that E. coli BL21 (DE3) is suitable for expression of cAnxV in the medium used even without induction with IPTG. A2. Purification of Annexin V of the chicken
  • the according to para. 1 cells obtained were resuspended in an Al buffer (20 mM Tris / HCl pH 7.5, 2 raM EDTA) and disrupted by high pressure (Gaulin). Insoluble constituents of the digestion suspension were removed by high-speed centrifugation. The soluble supernatant containing cAnxV was applied to a Q-Sepharose ff column (column 1) (25 ml, amersham pharmacia, Freiburg) equilibrated in buffer AI. The target protein was eluted by a linear one
  • a hydrophobic column can be used instead of the size exclusion chromatography (SEC) performed using column 3.
  • SEC size exclusion chromatography
  • the fractions containing cAnxV that elute from column 2 are combined and Increase to 1.5 M with solid ammonium sulfate.
  • the protein solution is applied to a Phenylsepharose ff column (15 ml, amersham pharmacia, Freiburg) and cAnxV eluted with a linear gradient from 1.5 to 0 M ammonium sulfate.
  • H-2b lymphoma line RMA was provided by Angelo A. Manfredi (Hospitale San Raffaele, 20132 Milan, Italy).
  • the H-2b melanoma cell line B16F1 was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). The cell lines were regularly tested for mycoplasma infection
  • RMA cells were as described in Bellone, M., et al. , J. Immunol. 159 (1997), 5391-5399 described, irradiated with ultraviolet light, then treated for 1 h at 37 ° C. with 50 ⁇ g / ml mitomycin C and washed. The externalization of phosphatidylserine was followed by staining with FITC-labeled Annexin V (Bender MedSystems, Valter Occhiena, Torino, Italy). The ion tightness of the plasma membrane was determined using propidium iodide. The cells were analyzed 0, 3, 9 and 18 h after irradiation.
  • Annexin V binding was determined by treating irradiated cells with increasing concentrations (1500 mg / ml) of unlabeled Annexin V or bovine serum albumin (BSA) and subsequent determination of the remaining Annexin V - fluorescein isothio- cyanate binding determined by flow cytometry (FACScan, Becton-Dickinson, San Jose, USA).
  • Macrophages were isolated by adhering to plastic from inflammatory peritoneal lavages which had been induced by injection of thioglycolate (Fadok, V.A., et al., Nature 405 (2000), 85-90).
  • Macrophages were co-cultivated in different ratios with irradiated tumor cells.
  • the cytokines TNF-alpha, IL-lbeta, IL-10 and TGF-beta were measured in the culture supernatant using specific commercial ELISAs (DuoSet ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN).
  • mice were immunized by subcutaneous (sc) injection in the balls of 1, 5 or 10 ⁇ 10 6 irradiated RMA cells.
  • the irradiated cells had been preincubated with or without 100 ⁇ g / ml chicken Annexin V for 20 min at room temperature in an isotonic buffer containing Ca 2+ .
  • the mice received a boost injection on the right flank.
  • the effectiveness of the immunization was tested by sc injection of 2.5 x 10 4 living RMA cells in the opposite flank. Twice a week, buttons were then used to check whether the animals had grown ore.
  • One animal was considered tumor positive if the mean of the two diameters perpendicular to each other was> 2 mm.
  • Murine peritoneal macrophages have been incubated with different amounts of radioactively irradiated tumor cells (bTZ) (syngeneic RMA tumor cells) which had previously been treated with either Annexin V of the chicken or not with Annexin V of the chicken. After 24 hours, the culture supernatant was harvested and the release of the cytokines TNF-alpha, IL-1-beta,
  • bTZ radioactively irradiated tumor cells
  • FIG. 3 shows the results of the tests with a bTZ / Mph ratio of 5 to 1.
  • the black bars show the results of irradiated tumor cells which have been treated with chicken annexin V.
  • the white bars show the results of irradiated tumor cells that have not been treated with chicken annexin V.
  • Table 1 Table 1
  • Irradiated syngeneic tumor cells treated with chicken annexin V protect and heal mice injected with a lethal tumor dose.
  • the treatment leads to a long-lasting specific anti-tumor immunity.
  • FIGS. 4a and b each show the proportion of tumor-free animals as a function of the time and the injection of different amounts of irradiated tumor cells (bTZ), which had been incubated with or without Annexin V of the chicken after the irradiation.
  • bTZ irradiated tumor cells
  • the results shown in Figures 4a and b with filled symbols relate to irradiated cells that have been treated with chicken's Annexin V.
  • the white symbols relate to results with irradiated cells that were treated without chicken's Annexin V.
  • FIG. 4a shows results of experiments in which live tumor cells were injected into mice after injection with irradiated tumor cells, which had been incubated after the irradiation with or without chicken annexin V (vaccination approach). Live tumor cells were injected on day 0 (1st arrow) and in the surviving animals on day 72 (2nd arrow).
  • mice were injected subcutaneously into the right flank twice according to the following scheme:
  • the human plasma cell line INA-6 was established from a pleural effusion of an eighty-year-old patient with plasma cell leukemia. It grows as a single cell suspension and shows the morphology of plasma blasts.
  • the INA-6 Tul subcell line originates from a passage in SCID mice. In contrast to the original cell line, INA-6 Tul proliferates independently of interleukin-6 and, after intraperitoneal (ip) injection in SCID mice, forms palpable tumors (Burger, R. et al. (2001) Hematol. J 2: 42-53).
  • Apoptotic INA-6 Tul cells were generated by UV irradiation for 40 seconds and subsequent cultivation for 12 hours. At this dose, the cells show an apoptosis rate of approx. 90%, with an increase in the radiation dose changing the rate only insignificantly.
  • SCID mice (Charles River Wiga GmbH) were used for the experiment. Due to a congenital defect, the SCID mice do not have a functional specific immune system in the form of mature T and B lymphocytes. The non-specific immune system of the animals is unaffected. In order to switch off an existing activity of natural killer cells (NK cells), the animals were exposed to whole-body gamma radiation with an individual dose of 2 Gy.
  • NK cells natural killer cells
  • the animals were injected with 2 ⁇ 10 7 vitals (vitality rate approx. 90%) INA-6 Tul cells in 1 ml culture medium (RPMI 1640 with 20% fetal bovine serum) ip.
  • mice 24 hours after tumor inoculation, the mice were divided into three groups of equal size.
  • the animals in the control group were injected 1 ml each with Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS).
  • the animals in the second group received 1 ml HBSS with 2 x 10 7 apoptotic INA-6 Tul cells ip administered.
  • the animals of the third group were injected with 1 ml HBSS each with 2 ⁇ 10 7 apoptotic INA-6 Tul cells, the cells having been incubated with 100 ⁇ g chicken annexin V at room temperature 30 minutes before the ip administration. 2-6.
  • HBSS Hanks' Balanced Salt Solution
  • INA-6 Tul cells In order to rule out a direct toxic effect of Annexin on INA-6 Tul cells, a proliferation test was carried out. For this purpose, 10 4 INA-6 Tul cells per well were placed in flat-bottom microtiter plates with 0.2 ml medium (RPMI-1640 with 10% fetal bovine serum and 2.5 ng / ml human recombinant interleukin-6) and different amounts of annexin V (6 pg / ml to 50 ⁇ g / ml) incubated for 72 hours, the cells being pulsed in the last 6 hours with 1 ⁇ Ci [ 3 H] -thymidine (Amersham) per well. The cells were then harvested and analyzed in a ⁇ -scintillation counter.
  • RPMI-1640 with 10% fetal bovine serum and 2.5 ng / ml human recombinant interleukin-6 different amounts of annexin V (6 pg / ml to 50 ⁇ g /
  • the animals in the second group showed strong general symptoms such as shaggy fur and weight loss, while the animals in the control group looked healthy on the outside.
  • One animal from the third group was received on the third and fifth day after the tumor inoculation and one animal from the second group was received on the 18th day after the tumor inoculation. The respective cause of death could not be determined. However, it can almost certainly be will conclude that the animals died of the induced myeloma at this early stage. Therefore, when evaluating the experiment, only the remaining nine and eight animals from the second and third groups were taken into account. Animals in the final stage of the disease were killed before further investigation.
  • the mean survival after tumor inoculation was 54.8 days in the control group, while the mice in the second group even had a slightly shortened survival of 50.4 days on average.
  • the mean survival of six of the eight mice in the third group was significantly higher at 71.3 days.
  • the remaining two animals in the third group survived the predetermined end of the observation period (day 95) by nine days.
  • Animals with delayed tumors primarily showed liver infiltrates and ascites, while the ulcers grew locally rather early.
  • SCID mice Due to a genetic defect, SCID mice do not have a specific immune system, which means that they do not have any functional cytotoxic T cells. However, they are able to prevent tumor growth with the help of their macrophages and NK cells through nitrogen monoxide metabolites and / or perforin-mediated cytotoxicity (Cifone, MG, Ulisse, S., and Santoin, A. ( 2001) Int Immunopharmacol 1 (8): 1513-1524).
  • apoptotic cells are changed by the annexin loading in such a way that they are able to activate the functioning unspecific immune system - in particular NK cells and macrophages - of the SCID mice.
  • TNF-alpha is particularly important for the recruitment of NK cells into the peritoneum, since TNF-alpha-deficient mice are deficient here (Smyth, M.J. et al. (1998) J Exp Med 9: 1611-1619).

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Proteins zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung des angeborenen unspezifischen Immunsystems, wobei das Protein a) ein Annexin V oder ein damit weitgehend ähnliches Molekül oder b) ein wirksames Fragment von Annexin V oder des damit weitgehend ähnlichen Moleküls umfasst.

Description

Verwendung eines Proteins zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung.' des angeborenen unspezifischen Immunsystems
Die Erfindung betrifft eine Verwendung eines Proteins zur Herstellung eines Medikaments und ein Medikament zur Stimulierung des angeborenen unspezifischen Immunsystems. Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des Medikaments.
Der pathologische Zelltod, die Nekrose, ist mit einem Anschwellen der Zellorganellen und der Zelle selbst verbunden. Die Zytoplasmamembran wird durchlässig und die Zeilinhaltsstoffe werden freigesetzt. Im Gegensatz dazu bleibt beim programmierten Zelltod, der Apoptose, die Zellmembran zu- nächst erhalten. Die Zellen werden beseitigt, bevor deren möglicherweise gefährlicher Inhalt in die Umgebung abgegeben wird. Die Zellen unterliegen dabei in einem frühen Apoptose- stadium Oberflächenänderungen, beispielsweise einer Modifizierung der Kohlenhydrate und der Exposition anionischer Phospholipide, insbesondere von Phosphatidylserin (PS) auf der Außenseite der Zytoplasmamembran. Letzteres wird durch die Herabregulierung der ATP-abhängigen Aminophospholipid- Translokase verursacht, welche Aminophospholipide von der Außenseite zu der Innenseite der Membran spezifisch trans- portiert. Außerdem wird eine als Scramblase bezeichnete, nicht-spezifische Lipid-Flipsite aktiviert, was zu einer Beschleunigung des Phosphatidylserin-Flip-Flop-Mechanismus führt. Auf der Außenseite der Zytoplasmamembran befindliches Phosphatidylserin dient als Erkennungssignal für die Besei- tigung apoptotischer Zellen.
Es ist bekannt, dass die Präinkubation apoptotischer Lympho- zyten mit Annexin V (AxV) die Aufnahme apoptotischer Zellen durch murine Peritonealmakrophagen, Makrophagen der J774- Zellinie der Maus und Knochenmarks-Makrophagen wirksam blök- kiert (Krahling, S., et al . , Cell Death Differ. 6 (1999), 183-189) . Außerdem führt Annexin V im Allgemeinen zu starker Inhibition der Aufnahme apoptotischer Zellen sowohl durch aktivierte als auch nicht-aktivierte Makrophagen. Infolge seiner Ca2+-Kanalaktivität verlangsamt Annexin V überdies die Apoptose in CEM-Zellen.
Die Beseitigung apoptotischer Zellen induziert normalerweise weder eine Entzündung noch eine Immunantwort. In direktem Kontakt mit Plasma können apoptotische Zellen prokoagulato- rische und unter bestimmten Bedingungen pro-inflammato- rische Effekte hervorrufen. Auf Monocyten/Makrophagen dominieren jedoch normalerweise immunomodulierende Effekte von apoptotischen Zellen durch die Wechselwirkung der apoptoti- sehen Zellen über Thrombospondin mit CD36 auf Phagozyten.
Lektin-artige Moleküle, wie der Vitronektin-Rezeptor (CD51/CD61) , Thrombospondin, CD36 und CD14, sind Rezeptoren, die Oberflächenänderungen auf apoptotischen Zellen erkennen. CD14 scheint für die Phagozytose von Lymphozyten und lipid- symmetrischen Erythrozyten bei aktivierten und nicht-akti- vierten Makrophagen erforderlich zu sein.
Die Phagozytose apoptotischer Lymphozyten durch Makrophagen wird stereospezifisch durch Phosphatidyl-L-serin-Liposomen gehemmt. Ein für die Erkennung des Phosphatidyl-L-serins verantwortlicher Rezeptor wird durch Antikörper definiert, die durch Immunisierung mit TGF-ß- und ß-Glucan-stimulierte Makrophagen hervorgerufen wurden (Fadok, V.A, et al . , Nature 405(6782) (2000), 85-90). Weitere für diese Erkennung apoptotischer Zellen wichtige Rezeptoren sind u.a. die Scaven- ger-Rezeptoren, der LPS-Rezeptor CD14, der Thrombospondin- Rezeptor CD36, der Vitronektin-Rezeptor CD51/CD61, die Komplementrezeptoren und das Makrosialin CD68. Außerdem können pentraxine, Kollektine, unterschiedliche Komplementfaktoren, ß2-Glycoprotein, die Annexine und Gas-6 als Adaptorproteine dienen.
Es ist weiterhin bekannt, dass Mäuse, denen apoptotische menschliche T-Zellen injiziert wurden, im Vergleich zu Kontrollmäusen, denen lebensfähige Zellen injiziert wurden, signifikant verringerte humorale Antworten gegen T-Zellen zeigten (Ponner, B. B., et al . , Scand. J. Immunol . 47 (1998), 343-347) . Es wurde auch beobachtet, dass eine Immu- nisierung mit apoptotischen Krebszellen drastisch verringerte zytotoxische T-Zell-Antworten im Vergleich mit lebenden wachstumsblockierten Zellen induzierte (Ronchetti, A. , et al . , J. Immunol. 163 (1999), 130-136). Das zeigt, dass die Engulfmentphagozytose apoptotischer Zellen nicht zu einer effizienten Antigenpräsentation und Aktivierung von T- und B-Lymphozyten führt. Es ist möglich, dass eine schnelle Engulfmentphagozytose apoptotischer Zellen durch Makrophagen und deren anti-inflammatorische Antwort die Aufnahme und effiziente Präsentation von aus apoptotischen Zellen stammen- den Antigenen durch dendritische Zellen verhindert. Zusammen mit einer Produktion von Interleukin-10 (IL-10) durch Monocyten/Makrophagen nach Kontakt mit apoptotischen Zellen können diese Erkenntnisse die schlechte Effizienz von Krebs- Vakzinen, die apoptotische Zellen enthalten, erklären.
Aus Stach C. M. et al . , Gell Death and Differentiation (2000) 7, 911-915 ist es bekannt, dass Annexin V die humorale Immunantwort stimuliert . Über eine Stimulierung der zellulären Immunantwort oder des angeborenen unspezifischen Immunsystems enthält dieser Artikel keine Angaben.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere eine Verwendung und ein Medikament gegen Tumore, Viren, Bakterien und Parasiten angegeben werden. Ferner soll ein Verfahren zur Herstellung des Medikaments angegeben werden.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 14 und 22 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 13, 15 bis 21 und 23 bis 33.
Nach Maßgabe der Erfindung ist die Verwendung eines Proteins zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung des angeborenen unspezifischen Immunsystems vorgesehen, wobei das Protein
a) Annexin V oder ein damit weitgehend ähnliches Molekül
oder
b) ein wirksames Fragment von Annexin V oder des damit weitgehend ähnlichen Moleküls umfasst.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins zu einer pro-inflammatorischen Antwort der Monocyten oder Makrophagen und damit zu einer Erhöhung der zellulären Immunität führt. Das beanspruchte Pro- tein eignet sich hervorragend zur Bekämpfung von Tumoren, Viren, Bakterien und Parasiten.
Die Wirkung des erfindungsgemäßen Proteins beruht offensichtlich darauf, dass apoptotische Zellen durch eine Beladung mit Annexin V so verändert werden, dass sie in der Lage sind, das angeborene unspezifische Immunsystem, insbesondere natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und Makrophagen, zu aktivieren. Ferner wird durch die Verabreichung von Annexin V die wirksame Konzentration des Monokin TNF-α erhöht. Das Monokin TNF-α ist besonders wichtig für die Rekrutierung von NK-Zellen in das Peritoneum (Smyth, M. J. et al . , 1998, J. Exp . Med. 9:1611- 1619) . Ferner wird die Wirkung des erfindungsgemäßen Proteins insbesondere auch darauf zurückgeführt, dass es an Phosphatidylserin bindet und dessen anti-inflammatorische Potenz inhi- biert. Diese Funktion des Proteins wird nicht nur erfüllt, wenn es sich um Annexin V handelt. Sie wird auch dann erfüllt, wenn das Protein lediglich ein mit Annexin V ähnliches Molekül oder ein wirksames Fragment von Annexin V oder ein mit dem Fragment weitgehend ähnliches Molekül umfasst . - Ein Fragment ist insbesondere dann "wirksam" , wenn es an Phosphatidylserin bindet und zur Stimulierung einer pro-inflammato- rischen zellulären Immunantwort beiträgt. Unter dem Begriff "ähnliche Moleküle" werden solche Moleküle verstanden, welche insbesondere an Phosphatidylserin binden und zu einem gewis- sen Grad eine Identität mit Annexin V aufweisen.
Nach einer Ausgestaltung kann eine Aminosäuresequenz des Proteins der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 oder Nr. 2 entsprechen oder zumindest zu 50%, vorzugsweise zumindest zu 60%, besonders bevorzugt zumindest zu 70%, ganz besonders bevorzugt zumindest zu 80%, identisch damit sein. Die Ermittlung der Identität kann erfolgen z.B. nach dem Verfahren von Altschul, S. F. et al . (1997), Nucleic Acids Res . 25:3389- 3402.
Unter dem Begriff "Identität" wird vorliegend das Ausmaß verstanden, zu welchem zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen invariant sind.
Bei der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 handelt es sich um eine N-terminale Deletionsmutante der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1, der die acht Aminosäuren 3 bis 10, das heißt die Aminosäuren Lys Tyr Thr Arg Gly Thr Val Thr fehlen. Zweckmäßigerweise ist das Annexin V nicht-humanes Annexin V, vorzugsweise das Annexin V des Huhns. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz des Annexin V des Huhns mit menschlichem Annexin V ergibt, dass beide Proteine zu 78,2 % identisch sind. Das Annexin V des Huhnes besitzt einen theoretischen isoelektrischen Punkt (pl) von 5,60, während menschliches Annexin V einen theoretischen isoelektrischen Punkt von 4,94 aufweist. Die Sequenz des menschlichen Annexins kann unter der Zugriffsnummer P08756 in der Protein Datenbank "SWISS-PROT" ab- gerufen werden. Beide Annexine sind im Tiermodell immunogen.
Die Stimulierung der Immunantwort kann durch eine Blockade, Verhüllung, Maskierung und/oder Entfernung von extrazellulärem membranständig lokalisierten Phosphatidylserin bewirkt werden. Damit kann das Protein zweckmäßigerweise zur Bekämpfung von Bakterien, Viren, Parasiten oder Tumoren verwendet werden. Bevorzugterweise wird das Protein als Adjuvans verwendet. Es kann in diesem Zusammenhang vorzugsweise in der Tumortherapie, für Tumorvakzine, in der Virustherapie, insbe- sondere zur Behandlung von Retrovirusinfektionen, Lentivirus- infektionen, Infektionen mit Treponema pallidum, dem Sindbisvirus, Trypanosoma brucei und HIV-Infektionen und zur Behandlung der Malaria sowie in der Malariaimmunisierung verwendet werden.
Das Medikament kann neben dem Wirkstoff weiterhin menschliche Tumorzellen umfassen, wobei die Tumorzellen apoptotische und/oder nekrotische Tumorzellen sein können. Die Apoptose und/oder Nekrose der Tumorzellen kann dabei spontan aufgetre- ten oder induziert worden sein. Als Induktoren für die Apoptose und/oder Nekrose kommen Bestrahlung der Tumorzellen ex- vivo oder in-vivo oder ein Inkontaktbringen der Tumorzellen mit Zytostatika in Betracht. Es eignen sich in diesem Zusammenhang insbesondere Chemikalien wie H202 oder Staurosporin, Medikamente wie Kortikosteroide, Chemotherapeutika wie Dox- orubicin, cis-Platin oder Hydroxy-Harnstoff , UVB- und UVC- Strahlung, sowie ß-, γ- oder Röntgenstrahlung. Vorzugsweise werden die apoptotischen und/oder nekrotischen Tumorzellen mit dem Wirkstoff in Kontakt gebracht.
Nach weiterer Maßgabe der Erfindung ist ein Medikament zur Stimulierung des angeborenen unspezifischen Immunsystems mit einem Protein vorgesehen, welches
al) Annexin V oder ein damit weitgehend ähnliches Molekül
oder
a2) ein wirksames Fragment von Annexin V oder des damit weitgehend ähnlichen Moleküls und
bb) apoptotische und/oder nekrotische Tumorzellen umfasst .
Wegen der vorteilhaften Ausgestaltungen wird auf die vorher- gehende Beschreibung verwiesen. Die darin erwähnten Merkmale können sinngemäß auch Ausgestaltungen des Medikaments sein.
Nach weiterer Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Medikaments vorgesehen, wo- bei apoptotische und/oder nekrotische Tumorzellen in Kontakt gebracht werden mit einem Protein, welches
a) Annexin V oder ein damit weitgehend ähnliches Molekül
oder
b) ein wirksames Fragment von Annexin V oder des damit weitgehend ähnlichen Moleküls umfasst . Wegen der vorteilhaften Ausgestaltungen wird wiederum auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen. Die dort angegebenen Merkmale können auch zur Ausgestaltung des Verfahrens herangezogen werden.
Das in diesem Verfahren verwendete Protein wird vorzugsweise durch Expression mittels transformierter Stämme von Escheri - chia coli und anschließende Reinigung hergestellt. Vorzugsweise wird der Stamm Escherichia coli BL21 (DE3) eingesetzt. Der verwendete Stamm von Escherichia coli kann mit einem Ex- pressionsplasmid transformiert werden, der zur Expression von Annexin V des Huhnes oder eines wirksamen Fragmentes davon fähig ist. Beispielsweise ist das Expressionsplasmid pDJ2- AnXV, das neben dem Annexin V des Huhnes exprimierenden Gen einen IPTG-induzierbaren tac-Promotor und eine Antibiotikum- Resistenz-Kasette enthält. Als Antibiotikum zur Trennung der nicht-transformierten Bakterien von den transformierten Bakterien wird vorzugsweise Kanamycin verwendet.
Die unter Verwendung der transformierten Stämme von Escheri chia coli erhaltenen Zellen, die nach einer Kultur in einem Nährmedium Annexin V des Huhnes enthalten, werden in einem Puffer aufgeschlossen. Die dabei erhaltene Lösung, die das Annexin V des Huhnes enthält, wird mittels Säulenchromatogra- phie gereinigt, wobei ein Salz-Gradient, zweckmäßigerweise ein Natriumchlorid-Gradient, verwendet wird. Der Wirkstoff wird dabei mit einer Reinheit erhalten, die 95 % übersteigt.
Die Eignung von Annexin V des Huhnes oder eines wirksamen Fragmentes davon als Wirkstoff beruht auf der Feststellung, dass die Maskierung von Phosphatidylserin mit diesem Wirkstoff zu einer pro-inflammatorischen Wirkung apoptotischer und/oder nekrotischer Zellen führt und somit die zelluläre Immunantwort gegen apoptotische Zellen fördert. Annexin V des Huhnes erhöht die Immunogenit t von autologen bzw. syngenen apoptotischen Zellen deutlich. Es ist deshalb geeignet, die Effizienz von Vakzinen, die apoptotische Zellen enthalten, zu erhöhen. Das ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn die Zellen vor einer Injektion der Vakzine bestrahlt worden sind. Ohne die Verwendung des Wirkstoffes Annexin V des Huhnes ist die Immunogenitat dieser Zellen gering, da die Aufnahme apoptotischer Zellen eine anti-inflammatorische Reaktion menschlicher Monocyten/Makrophagen bewirkt. Durch die Behandlung der Zellen mit Annexin V des Huhnes wird diese anti-inflamma- torische Wirkung apoptotischer und/oder nekrotischer Zellen reduziert und so deren Immunogenitat deutlich erhöht.
Mit dem erfindungsgemäßen Protein kann der anti-inflammatorische Effekt phosphatidylserin-exponierender Zellen blok- kiert werden. Des Weiteren kann das Protein eine Immunstimulation durch Blockade, Verhüllung, Maskierung und/oder Entfernung von extrazellulärem, vorzugsweise membranständig lokalisiertem Phosphatidylserin bewirken. Das Protein kann deshalb als Modulator einer zellulären Immunantwort verwendet werden.
Ein wichtiges Einsatzgebiet für die Blockade der anti-inflam- matorischen Wirkungen phosphatidylserin-exponierender Zellen ergibt sich aus der daraus resultierenden spezifischen "Adju- vanswirkung" . Phosphatidylserin tragende Zellen werden nach der Blockade des anti-inflammatorischen Wirkprinzips über einen pro-inflammatorischen, immunstimulatorisehen Alternativweg prozessiert, der zu einer massiv erhöhten Immunantwort führt. Für diese "Adjuvanswirkung" ergeben sich die unter- schiedlichsten Anwendungsgebiete, z.B. in der Humanmedizin.
Zum einen kann dadurch die Immunogenitat von Tumorvakzinen gesteigert werden, wenn diese aus bestrahlten und somit größtenteils apoptotischen Tumorzellen bestehen. Weiterhin ist es möglich, eine zelluläre Immunantwort gegen solche Tumorzellen zu erzielen, die aus therapeutischen Gründen zytostatisch be- handelt oder in situ radioaktiv bestrahlt worden sind. In diesem Fall würde eine tumorspezifische zelluläre Immunantwort bei der Beseitigung der Resttumormasse den Therapieerfolg steigern. Auch bei der Behandlung von Virusinfektionen, z.B. von behüllten Viren, die Phosphatidylserin exponieren, führt die Blockade des phosphatidylserinabhängigen anti-in- flammatorischen Effekts zu einer spezifischen Immunstimulation. Als besonders wichtiges Beispiel in diesem Zusammenhang muss die Behandlung der Infektionen mit Lentiviren und HIV angesehen werden. Ein von der Zelle "unbemerktes" phosphati- dylserinabhängiges Eindringen der Viren führt zur Viruspersi- stenz im langlebigen Monocyten/Makrophagen-Pool . Die Virus- persistenz führt bei den allermeisten Infizierten nach einer mehr oder minder langen Latenzzeit zum Tode. Annexin V des Huhns ist für die Behandlung von HIV-Infizierten geeignet, da inflammatorisch phagozytiertes apoptotisches Material in den Phagozyten einen "respiratory burst" auslöst und so zur Zerstörung der Virengenome führt .
Ähnliches gilt auch für die Behandlung von Infektionen mit Phosphatidylserin-exponierenden Bakterien (z.B. Treponema pallidum) oder von Infektionen und parasitären Erkrankungen, die zur Exposition von Phosphatidylserin auf infizierten Wirtszellen führen (z.B. Sindbisvirus, Plasmodium fälciparum, Trypanosoma brucei) .
Die Erfindung wird nachstehend anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 die Expressionskinetik von Annexin V des Huhns in transformierten Escherichia Coli BL21 (DE3) anhand einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese,
Fig. 2 eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proben der einzelnen Reinigungsschritte von Annexin V des Huhns aus transformierten Escherichia Coli BL21 (DE3) ,
Fig. 3 Verhältnisse der sekretierten Zytokine in Abhängig- keit von der Inkubation muriner Peritonealmakropha- gen mit radioaktiv bestrahlten Tumorzellen, die vorher mit Annexin V des Huhns oder nicht mit Annexin V behandelt worden waren,
Fig. 4a den Anteil tumorfreier Tiere in Abhängigkeit von der Zeit und der Injektion unterschiedlicher Mengen bestrahlter Tumorzellen, die nach der Bestrahlung mit oder ohne Annexin V des Huhns behandelt worden waren, wobei die Tiere vor der Injektion lebender Tumorzellen behandelt worden sind,
Fig. 4b den Anteil tumorfreier Tiere in Abhängigkeit von der Zeit und der Injektion bestrahlter Tumorzellen, die nach der Bestrahlung mit oder ohne Annexin V des Huhns behandelt worden waren, wobei den Tieren vor der Behandlung lebende Tumorzellen injiziert wurden,
Fig. 5a Tumor-Latenz von den Mäusen, die den Tumor nicht abgestoßen haben, in Abhängigkeit der Dosis bestrahlter Tumorzellen und der Gabe an Annexin V und
Fig. 5b Überleben von Mäusen, die den Tumor nicht abgestoßen haben, in Abhängigkeit von der Dosis bestrahl- ter Tumorzellen und der Gabe an Annexin V,
Fig. 6 den Anteil der tumortragenden Tiere in Abhängigkeit der Dauer nach der Tumorinokulation, Fig. 7 die Überlebensrate in Abhängigkeit der Dauer nach der Tumorinokulation,
Fig. 8 die [3H] -Thymidin-Aufnahme von INA6 TUl-Zellen über der AxV-Konzentration und
Fig. 9 tabellarische Zusammenstellung der Ergebnisse der untersuchten Tiergruppen.
A. Expression und Reinigung von Annexin V des Huhns
AI . Expression von Annexin V des Huhns
Zur Expression von Annexin V des Huhns (cAnxV) wurde als Ex- pressionsplasmid pDJ2-AnxV verwendet, das neben dem cAnxV kodierenden Gen einen IPTG-induzierbaren tac-Promotor und eine Kanamycin-Resistenz-Kassette enthält. E.coli BL21 (DE3) wurde mit dem Expressionsplasmid transformiert und Expressionskinetiken durchgeführt. Dabei wurde 2xYT mit 50 mg/1 Kanamycin als Nährmedium eingesetzt.
Für die Herstellung von cAnxV wurde eine 100 ml Vorkultur mit frisch transformierten E. coli BL21 (DE3) angeimpft und 8 h bei 37°C geschüttelt. 5 1 Hauptkultur wurden mit 5 ml der Vorkultur versetzt und 16 bis 20 h bei 37°C geschüttelt. Auf einen Zusatz von IPTG wurde verzichtet, da in diesem Fall mit und ohne Induktion gleiche Expressionsausbeuten erzielt wurden. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation geerntet. Die Zellfeuchtmasse betrug 16 bis 21 g. Die Expressi- onskinetik ist in Fig. 1 dargestellt. Die Expressionskinetiken ergaben, dass sich E. coli BL21 (DE3) auch ohne Induktion mit IPTG für eine Expression von cAnxV in dem eingesetzten Medium eignet . A2. Reinigung von Annexin V des Huhns
Die gemäß Ziff. 1 erhaltenen Zellen wurden in einem Puffer AI (20 mM Tris/HCl pH 7 , 5 , 2 raM EDTA) resuspendiert und mittels Hochdruck (Gaulin) aufgeschlossen. Unlösliche Bestandteile der Aufschlusssuspension wurden durch hochtourige Zentrifuga- tion entfernt. Der lösliche cAnxV-enthaltende Überstand wurde auf eine in Puffer AI äquilibrierte Q-Sepharose-ff-Säule (Säule 1) (25 ml, amersham pharmacia, Freiburg) aufgetragen. Die Elution des Zielproteins erfolgte durch einen linearen
NaCl-Gradienten. Die cAnxV-enthaltenden Fraktionen wurden zu- sammengefasst und gegen einen Puffer A2 (50 mM Na-Acetat pH 5,6) dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine in A2 äquilibrierte Resource-S-Säule (Säule 2) (6 ml, amersham pharmacia, Freiburg) aufgetragen und cAnxV mit einem linearen NaCl-Gra- dienten eluiert . Die vereinigten cAnxV-enthaltenden Fraktionen wurden mittels Ultrafiltration (Pall Filtron, USA) konzentriert und auf eine in 10 mM Na-Phosphat pH 7,2, 140 mM NaCl äquilibrierte Superdex 200 pg-Säule (Säule 3) (amersham pharmacia, Freiburg) aufgetragen. Homogenes cAnxV wurde von der Säule eluiert. Aus 20 g Zellen (Feuchtmasse) wurden 30 mg cAnxV mit einer Reinheit, die 95 % überstieg, isoliert. Fig. 2 zeigt anhand einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese die Ergebnisse der Reinigung unter Verwendung der Säulen 1 bis 3.
Alternativ kann anstelle der angegebenen Säulen für Säule 1 Q-Sepharose XL (amersham pharmacia, Freiburg) , für Säule 2 SP-Sepharose HP (amersham pharmacia, Freiburg) und/oder für Säule 3 Sephacryl S200 HR (amersham pharmacia, Freiburg) ver- wendet werden.
Alternativ kann anstelle der mittels Säule 3 durchgeführten Größen-Ausschluss-Chromatografie (SEC) eine hydrophobe Säule eingesetzt werden. In diesem Fall werden die cAnxV-enthal- tenden Fraktionen, die von Säule 2 eluieren, vereinigt und mit festem Ammoniumsulfat auf 1,5 M aufgestockt. Die Proteinlösung wird auf eine Phenylsepharose ff-Säule (15 ml, amersham pharmacia, Freiburg) aufgetragen und cAnxV mit einem linearen Gradienten von 1,5 bis 0 M Ammoniumsulfat eluiert.
B. Immunisierung von Mäusen mit Annexin V-behandelten, apoptotischen Tumorzellen
Bl . Mäuse und Tumorzellen
Sechs bis acht Wochen alte, weibliche C57BL/6 Mäuse wurden in einer pathogenfreien Tierversuchsanlage gemäß den Richtlinien der Europäischen Gemeinschaft gehalten. Die syngene H-2b Lym- phomlinie RMA wurde von Angelo A. Manfredi (Hospitale San Raffaele, 20132 Mailand, Italien) zur Verfügung gestellt. Die H-2b Melanom Zellinie B16F1 wurde von der American Type Cul- ture Collection (ATCC, Rockville, MD) bezogen. Die Zellinien wurden regelmäßig auf Mykoplasmeninfektion getestet
B2. Zelltod
RMA Zellen wurden wie bei Bellone, M. , et al . , J. Immunol. 159 (1997) , 5391-5399 beschrieben mit ultraviolettem Licht bestrahlt, anschließend für 1 h bei 37°C mit 50 μg/ml Mi- tomycin C behandelt und gewaschen. Durch Färbung mit FITC- markiertem Annexin V (Bender MedSystems, Valter Occhiena, To- rino, Italy) wurde die Externalisierung von Phosphatidylserin verfolgt . Die Ionendichtigkeit der Plasmamembran wurde mit Hilfe von Propidiumiodid bestimmt. Die Zellen wurden 0, 3, 9 und 18 h nach Bestrahlung analysiert. Die Spezifität der Annexin V-Bindung wurde durch die Behandlung bestrahlter Zellen mit steigenden Konzentrationen (1500 mg/ml) von unmarkiertem Annexin V oder Rinderserumalbumin (BSA) und anschließender Bestimmung der verbliebenen Annexin V - Fluorescein-isothio- cyanat Bindung mittels Durchflusszytometrie (FACScan, Becton- Dickinson, San Jose, USA) ermittelt.
B3. Makrophagen
Makrophagen wurden durch Anhaften an Kunststoff aus entzündlichen Peritoneallavagen, die durch Injektion von Thioglyko- lat induziert worden waren, isoliert (Fadok, V. A. , et al . , Nature 405 (2000) , 85-90) .
B4. Bestimmung der Zytokinfreisetzung von Makrophagen nach Co-Kultur mit bestrahlten Tumorzellen
Makrophagen wurden in unterschiedlichen Verhältnissen mit be- strahlten Tumorzellen co-kultiviert . Im Kulturüberstand wurden mit Hilfe spezifischer kommerzieller ELISAs die Zytokine TNF-alpha, IL-lbeta, IL-10 and TGF-beta gemessen (DuoSet ELI- SA, R&D Systems, Minneapolis, MN) .
B5. Immunisierung und Heilung
Die Immunisierung der Mäuse erfolgte durch subkutane (s.c.) Injektion in den Fußballen von 1, 5 oder 10 x 106 bestrahlten RMA Zellen. Die bestrahlten Zellen waren entweder ohne oder mit 100 μg/ml Hühner Annexin V für 20 min bei Raumtemperatur in einem Ca2+-haltigen isotonen Puffer vorinkubiert worden. Am Tag 15 erhielten die Mäuse eine Boost-Injektion in die rechte Flanke. Am Tag 30 wurde die Effektivität der Immunisierung durch s.c. Injektion von 2,5 x 104 lebenden RMA Zel- len in die gegenüberliegende Flanke getestet. Zwei Mal wöchentlich wurde dann durch Tasten überprüft, ob bei den Tieren Tu ore angewachsen waren. Ein Tier wurde als tumorpositiv gewertet, wenn der Mittelwert der beiden senkrecht zueinander stehenden Durchmesser > 2 mm war. Wenn ein Tumor > 10 mm ge- wachsen war oder ulzerierte, wurden die befallenen Tiere ge- tötet. Tiere, bei denen innerhalb von 10 Wochen nach der Injektion lebender RMA Zellen kein Tumor tastbar war, wurden als tumornegativ gewertet. Diesen tumorfreien Mäusen wurden abermals 2,5 x 104 lebende RMA Zellen in die gegenüberliegen- de Flanke injiziert, um die Dauer des Schutzes zu überprüfen. Die Spezifität der Antitumorwirkung wurde in den geschützten Tieren durch s.c. Gabe von 2,5 x 104 syngenen B16F1 Melanom- zellen überprüft (Bellone, M. , et al . , J. Immunol. 158 (1997) , 783-789) . Zur Bestimmung des Effekts von Unterschie- den bei der Behandlung von etablierten RMA Lymphomen wurden 2,5 x 104 lebende RMA Zellen s.c. in die linke Flanke injiziert. Nachdem der Tumor drei Tage lang angewachsen war, wurden die Tiere an der gegenüberliegenden Flanke mit 1 oder 5 x 106 bestrahlten RMA Zellen ohne oder mit Annexin V des Huhns behandelt (Eine Vakzinierung pro Woche über drei Wochen) . Das Tumorwachstum wurde bestimmt wie oben beschrieben.
B6. Ergebnis
Murine Peritonealmakrophagen sind mit unterschiedlichen Mengen radioaktiv bestrahlter Tumorzellen (bTZ) (syngene RMA- Tumorzellen) inkubiert worden, welche zuvor entweder mit Annexin V des Huhns oder nicht mit Annexin V des Huhns behandelt worden waren. Nach 24 h wurde der Kulturüberstand geern- tet und die Freisetzung der Zytokine TNF-alpha, IL-1-beta,
IL-10 and TGF-beta mit ELISAs gemessen. Die Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Versuche mit einem bTZ/Mph Ratio von 5 zu 1. Die schwarzen Balken zeigen die Ergebnisse bestrahlter Tumorzellen, die mit Annexin V des Huhns behandelt worden sind. Die weißen Balken zeigen die Ergebnisse bestrahlter Tumorzellen, die nicht mit Annexin V des Huhns behandelt worden sind. In der nachstehenden Tabelle 1 sind die Einzelwerte der Messungen noch einmal zusammengefasst . Tabelle 1
Figure imgf000019_0001
* P<0,05 ** P<0,01
Die Behandlung apoptotischer Zellen mit Annexin V des Huhns verschiebt das Zytokinmuster von Phagozyten in Richtung In- flammation.
Bestrahlte syngene Tumorzellen, die mit Annexin V vom Huhn behandelt worden sind schützen und heilen Mäuse, die eine letale Tumordosis injiziert bekommen hatten. Die Behandlung führt dabei zu einer langanhaltenden spezifischen Anti-Tumor- Immunität .
Die Fig. 4a und b zeigen jeweils den Anteil an tumorfreien Tieren in Abhängigkeit von der Zeit und der Injektion unterschiedlicher Mengen bestrahlter Tumorzellen (bTZ) , die nach der Bestrahlung mit oder ohne Annexin V des Huhns inkubiert worden waren. Die in den Fig. 4a und b mit gefüllten Symbolen gezeigten Ergebnisse betreffen bestrahlte Zellen, die mit Annexin V des Huhns behandelt worden sind. Die weißen Symbolen betreffen Ergebnisse mit bestrahlten Zellen, welche ohne Annexin V des Huhns behandelt worden sind.
Die Fig. 4a zeigt Ergebnisse von Versuchen, bei denen Mäusen nach der Injektion mit bestrahlten Tumorzellen, die nach der Bestrahlung mit oder ohne Annexin V des Huhns inkubiert worden waren, lebende Tumorzellen injiziert wurden (Vakzinie- rungsansatz) . Die Injektion lebender Tumorzellen erfolgte am Tag 0 (1. Pfeil) und bei den überlebenden Tieren am Tag 72 (2. Pfeil) .
C57B1/6 Mäuse wurden zweimal nach folgendem Schema subkutan in die rechte Flanke injiziert:
mit PBS mit 1 x 106 bestrahlten Tumorzellen (bTZ) mit 5 x 10s bestrahlten Tumorzellen (bTZ) mit 1 x 107 bestrahlten Tumorzellen (bTZ)
Am Tag 0, zwei Wochen nach der letzten Boosterinjektion, wurden 2,5 x 104 lebende RMA-Tumorzellen in die gegenüberliegen- de linke Flanke der Mäuse injiziert. Am Tag 72 wurde die Injektion bei den überlebenden Tieren wiederholt (Pfeil) . Die Fig. 4a zeigt, dass die Inkubation mit Annexin V des Huhns (schwarze Dreiecke) die Tumorabstoßung gegenüber der Injektion mit unbehandelten bestrahlten Tumorzellen (weiße Dreiecke) in allen Gruppen deutlich steigert.
Um die Wirkung auf voretablierte Tumoren zu untersuchen wurden 2,5 x 104 lebende RMA-Tumorzellen subkutan in die linke Flanke von C57B1/6 Mäusen injiziert. Jede Kohorte enthielt 10 Mäuse. Vier Tage später wurden entweder 1 x 106 oder 5 x 10s bestrahlte RMA-Tumorzellen in die rechte Flanke injiziert. Diese Injektion erfolgte nach Behandlung der bestrahlten Zellen mit (gefüllte Symbole) oder ohne (offene Symbole) Annexin V des Huhns. Die Fig. 4b zeigt den Zeitverlauf der tumorfrei- en Tiere. Bei der Injektion von 5 x 106 Tumorzellen steigert die Behandlung der bestrahlten Tumorzellen mit Annexin V des Huhns deren Immunogenitat und die daraus folgende Tumorabstoßung signifikant. Wie in Fig. 5 gezeigt, waren bei den Mäusen, die nicht vollständig geschützt waren, sowohl die Tumor-Latenz (Fig. 5a) , als auch die Überlebenszeit erhöht, wenn die bestrahlten Tumorzellen vor der Injektion mit Annexin V des Huhns behandelt worden waren.
C. Daten von SCID-Mäusen Cl. Ziel
Bestimmung des Einflusses einer AxV-Behandlung apoptotischer Zellen auf das angeborenen unspezifische Immunsystem.
C2. Material und Methoden
C2.1. Zellen
Die humane Plasmazellinie INA-6 wurde aus einem Pleuraerguss eines achtzigjährigen Patienten mit Plasmazellenleukämie etabliert. Sie wächst als Einzelzellsuspension und zeigt die Morphologie von Plasmablasten. Die Subzellinie INA-6 Tul stammt aus einer Passage in SCID-Mäusen. Im Gegensatz zur Original-Zellinie proliferiert INA-6 Tul unabhängig von In- terleukin-6 und bildet nach intraperitonealer (i.p.) Injektion in SCID-Mäusen deutlich schneller tastbare Tumoren (Bur- ger, R. et al . (2001) Hematol . J. 2: 42-53).
C2.2. Induktion von Apoptose in INA-6 Tul-Zellen
Die Erzeugung apoptotischer INA-6 Tul-Zellen erfolgte durch UV-Bestrahlung für 40 Sekunden und anschließende Weiterkultivierung für 12 Stunden. Bei dieser Dosis zeigen die Zellen eine Apoptoserate von ca. 90%, wobei eine Erhöhung der Bestrahlungsdosis die Rate nur unwesentlich verändert. C2.3. SCID-Mäuse
Für das Experiment wurden 30 weibliche, sechs Wochen alte SCID-Mäuse (Charles River Wiga GmbH) eingesetzt. Auf Grund eines angeborenen Defekts besitzen die SCID-Mäuse kein funktionales spezifisches Immunsystem in Form reifer T- und B- Lymphocyten. Das unspezifische Immunsystem der Tiere ist jedoch unbeeinflusst . Zur Ausschaltung einer vorhandenen Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) wurden die Tiere einer Ganzkörper-Gammabestrahlung mit einer individuellen Dosis von 2 Gy bestrahlt.
C2.4. Inokulation mit INA-6 Tul
24 Stunden nach der Bestrahlung wurden den Tieren je 2 x 107 vitale (Vitalitätsrate ca. 90%) INA-6 Tul-Zellen in 1 ml Kulturmedium (RPMI 1640 mit 20% fötalem Rinderserum) i.p. injiziert .
C2.5. Therapeutische Immunisierung
24 Stunden nach der Tumorinokulation wurden die Mäuse in drei gleich große Gruppen geteilt. Die Tiere der Kontrollgruppe erhielten je 1 ml Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) i.p. injiziert. Die Tiere der zweiten Gruppe erhielten je 1 ml HBSS mit 2 x 107 apoptotischen INA-6 Tul-Zellen i.p. verabreicht. Die Tiere der dritten Gruppe schließlich erhielten je 1 ml HBSS mit 2 x 107 apoptotischen INA-6 Tul-Zellen injiziert, wobei die Zellen 30 Minuten vor der i.p. -Gabe mit 100 μg Annexin V des Huhns bei Raumtemperatur inkubiert worden waren. C2.6. Statistische Auswertung der Daten
Die statistische Analyse der Daten erfolgte durch den Log- Rank-Test mit Hilfe des Softwarepakets SPSS 10.0.7 von SPSS Ine .
C2.7. Ergänzendes Experiment
Um einen direkten toxischen Effekt von Annexin auf INA-6 Tul- Zellen ausschließen zu können, wurde ein Proliferationstest durchgeführt. Hierzu wurden 104 INA-6 Tul-Zellen pro Näpfchen in Flachboden-Mikrotiterplatten mit 0,2 ml Medium (RPMI-1640 mit 10% fötalem Rinderserum und 2,5 ng/ml humanem rekombinan- tem Interleukin-6) und unterschiedlichen Mengen Annexin V (6 pg/ml bis 50 μg/ml) über 72 Stunden inkubiert, wobei die Zellen in den letzten 6 Stunden mit 1 μCi [3H] -Thymidin (Amersham) pro Näpfchen gepulst wurden. Anschließend wurden die Zellen geerntet und in einem ß-Szintillationszähler analysiert. Die Werte in Fig. 8 zeigen den mittleren [3H] -Thy- midin-Einbau in cpm (counts per minute) aus Triplikaten mit der einfachen Standardabweichung als Fehlerbalken. Die Kurve zeigt eindeutig, dass Annexin V keinerlei Einfluss auf die Proliferation von INA-6 Tul-Zellen ausübt.
C3. Beobachtungen während der Tierstudie
48 Stunden nach der Tumorinokulation zeigten die Tiere der zweiten Gruppe, vor allem aber die Tiere der dritten Gruppe, starke allgemeine Krankheitszeichen wie struppiges Fell und Gewichtsverlust, während die Tiere der Kontrollgruppe äußerlich gesund wirkten. Am dritten und am fünften Tag nach der Tumorinokulation ist je ein Tier der dritten Gruppe sowie am 18. Tag nach der Tumorinokulation ein Tier der zweiten Gruppe eingegangen. Die jeweilige Todesursache konnte nicht ermit- telt werden. Es kann jedoch mit ziemlicher Sicherheit ausge- schlössen werden, dass die Tiere zu diesem frühen Zeitpunkt an der induzierten Myelomerkrankung verstarben. Bei der Auswertung des Versuchs wurden daher aus der zweiten und dritten Gruppe nur die verbliebenen neun bzw. acht Tiere berücksich- tigt . Tiere im finalen Krankheitsstadium wurden vor der weiteren Untersuchung getötet .
C4. Ergebnisse
Am Tag 29 nach der Inokulation zeigten sieben der zehn Tiere der Kontrollgruppe erbsengroße Tumoren am Ort der Inokulation. Vergleichbare Beobachtungen wurden auch in der zweiten Gruppe gemacht, wo sieben von neun Tieren deutliche Tumorbildung zeigten. Überraschenderweise konnte bei keinem der acht Tiere, die mit Annexin V-beladenen apoptotischen INA-6 Tul- Zellen behandelt worden waren (Gruppe 3) , zu diesem Zeitpunkt ein Tumor festgestellt werden. Die Unterschiede der Daten bzgl . Tumorwachstum zwischen der Gruppe 3 und der Gruppe 2 (p=0,0001) bzw. der Kontrollgruppe (p=0,004) sind statistisch signifikant (Fig.9, Tabelle) .
Die mittlere Überlebensdauer nach Tumorinokulation betrug in der Kontrollgruppe 54,8 Tage, während die Mäuse der zweiten Gruppe sogar eine leicht verkürzte Überlebensdauer von durch- schnittlich 50,4 Tagen aufwiesen. Im Gegensatz dazu war die mittlere Überlebensdauer von sechs der acht Mäuse der dritten Gruppe mit 71,3 Tagen deutlich höher. Außerdem haben die restlichen zwei Tiere der dritten Gruppe das vorher festgelegte Ende des BeobachtungsZeitraums (Tag 95) um neun Tage überlebt. Tiere, bei denen Tumoren verzögert auftraten, zeigten in erster Linie Leberinfiltrate und Aszitesbildung, während die Geschwüre bei frühzeitigem Auftreten eher lokal begrenzt wuchsen. Die Unterschiede der Überlebensdaten zwischen der Gruppe 3 und der Gruppe 2 (p=0,0004) bzw. der Kontroll- gruppe (p=0,0095) sind statistisch signifikant (Fig. 6, 7, Tabelle) .
C5. Schlussfolgerungen
Die Beteiligung von nicht-spezifischen NK-Zellen neben auf spezifische Antigene gerichteten zytotoxischen T-Zellen an einer erfolgreichen Tumorabwehr ist allgemein bekannt.
Auf Grund eines genetischen Defekts besitzen SCID-Mäuse kein spezifisches Immunsystem, also auch keine funktionalen zytotoxischen T-Zellen. Sie sind jedoch in der Lage, mit Hilfe ihrer Makrophagen und NK-Zellen durch Stickstoffmonoxid-Me- taboliten oder/und Perforin-vermittelte Zytotoxizität das Tu- morwachstum zu unterbinden (Cifone, M.G. , Ulisse, S., and Santoin, A. (2001) Int Immunopharmacol 1(8): 1513-1524).
Die vorliegenden Daten zeigen, dass die therapeutische Gabe von Annexin-beladenen apoptotischen Zellen die Etablierung eines humanen Tumors in SCID-Mäusen deutliche hinauszögern und so die Überlebensdauer verlängern kann.
Offensichtlich werden apoptotische Zellen durch die Annexin- Beladung so verändert, dass sie in der Lage sind, das funk- tionierende unspezifische Immunsystem - insbesondere NK-Zellen und Makrophagen - der SCID-Mäuse zu aktivieren.
Vor allem die Heraufregulierung des Monokins TNF-alpha durch Annexin-beladene apoptotische Zellen (Fig.6, 7) könnte hier für die Aktivierung der NK-Zellen verantwortlich sein. Denn TNF-alpha ist besonders wichtig für die Rekrutierung von NK- Zellen in das Peritoneum, da TNF-alpha-defiziente Mäuse hier einen Mangel zeigen (Smyth, M.J. et al . (1998) J Exp Med 9: 1611-1619) .

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Proteins zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung des angeborenen unspezifischen Iraraun- Systems, wobei das Protein
a) Annexin V oder ein damit weitgehend ähnliches Molekül,
oder
b) ein wirksames Fragment von Annexin V oder des damit weitgehend ähnlichen Moleküls umfasst .
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Protein an Phos- phatidylserin bindet.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 , wobei eine Aminosäuresequenz des Proteins der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr . 1 oder Nr. 2 entspricht oder zumindest zu 50%, vorzugsweise zu- mindest zu 60%, besonders bevorzugt zu zumindest 70%, ganz besonders bevorzugt zumindest zu 80%, identisch damit ist.
4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Annexin V nicht-humanes Annexin V ist.
5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das nicht-humane Annexin V das Annexin V des Huhns ist .
6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo- bei die Stimulierung der Immunantwort durch eine Blockade,
Verhüllung, Maskierung und/oder Entfernung von extrazellulärem membranständig lokalisierten Phosphatidylserin bewirkt wird.
7. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein zur Bekämpfung von Bakterien, Viren, Parasiten oder Tumoren verwendet wird.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein als Adjuvans, vorzugsweise in der Tumortherapie, für Tumorvakzine, in der Virustherapie, insbesondere zur Behandlung von Retrovirusinfektionen, Lentivirusinfektionen, Infektionen mit Treponema pallidum, Sindbisvirus, Trypanosoma brucei und HIV-Infektionen und zur Behandlung der Malaria sowie in der Malariaimmunisierung, verwendet wird.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament weiterhin menschliche Tumorzellen umfasst.
10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Tumorzellen apoptotische und/oder nekrotische Tumorzellen sind.
11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Apoptose und/oder Nekrose durch Bestrahlung der Tumorzellen ex- ivo oder in- vivo ausgelöst wird.
12. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Apoptose und/oder Nekrose durch Inkontaktbringen der Tumorzellen mit Zytostatika ausgelöst wird.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Tumorzellen mit dem Protein in Kontakt gebracht werden.
14. Medikament zur Stimulierung des angeorenene unspezifischen Immunsystems mit einem Protein, welches
al) Annexin V oder ein damit weitgehend ähnliches Molekül, oder a2) ein wirksames Fragment von Annexin V oder des damit weitgehend ähnlichen Moleküls
und
bb) apoptotische und/oder nekrotische Tumorzellen umfasst .
15. Medikament nach Anspruch 14, wobei das Protein an Phosphatidylserin bindet .
16. Medikament nach Anspruch 14 oder 15, wobei eine Aminosäuresequenz des Proteins der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 oder Nr. 2 entspricht oder zumindest zu 50%, vorzugsweise zumindest zu 60%, besonders bevorzugt zu zumindest 70%, ganz besonders bevorzugt zumindest zu 80%, identisch damit ist .
17. Medikament nach Anspruch 14 bis 16, wobei das Annexin V nicht-humanes Annexin V ist.
18. Medikament nach Anspruch 17, wobei das nicht-humane Annexin V das Annexin V des Huhns ist.
19. Medikament nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei es weiterhin menschliche Tumorzellen umfasst .
20. Medikament nach Anspruch 19, wobei die Tumorzellen apoptotische und/oder nekrotische Tumorzellen sind.
21. Medikament nach einem der Ansprüche 19 oder 20, wobei die Tumorzellen mit dem Protein in Kontakt sind.
22. Verfahren zur Herstellung des Medikaments nach einem der Ansprüche 14 bis 21, wobei apoptotische und/oder nekrotische Tumorzellen in Kontakt gebracht werden mit einem Protein, welches
a) Annexin V oder ein damit weitgehend ähnliches Molekül,
oder
b) ein wirksames Fragment von Annexin V oder des damit weitgehend ähnlichen Moleküls umfasst.
23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Protein an Phosphatidylserin bindet.
24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei eine Aminosäu- resequenz des Proteins der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 oder Nr. 2 entspricht oder zumindest zu 50%, vorzugsweise zumindest zu 60%, besonders bevorzugt zu zumindest 70%, ganz besonders bevorzugt zumindest zu 80%, identisch damit ist.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei das Annexin V nicht-humanes Annexin V ist.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das nicht-humane Annexin V das Annexin V des Huhns ist.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei die Apoptose und/oder Nekrose durch Bestrahlung der Tumorzellen ex-vivo oder in-vivo ausgelöst wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei die Apoptose und/oder Nekrose durch Inkontaktbringen der Tumorzellen mit Zytostatika ausgelöst wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 28, wobei das Protein durch Expression mittels transformierten Stämmen von Escherichia coli und anschließende Reinigung hergestellt wird.
30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei der transformierte Stamm von Escherichia coli Escherichia coli BL21 (DE3) ist.
31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, wobei als Expressi- onsplasmid pDJ2-AnXV verwendet wird.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, wobei die Reinigung des exprimierten Annexin V mittels Säulenchromatographie erfolgt .
33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Säulenchromatogra- phie unter Verwendung eines Salz-Gradienten durchgeführt wird.
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