WO2003052094A2 - Expressionsvektor zur herstellung von annexin v - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft einen Expressionsvektor enthaltend- zumindest die Komponenten des Vektors pBR322 oder pKK223-3, welche für dessen Replikation erforderlich sind - einen Expressionsbereich, welcher in Leserichtung aufeinander folgend einen ersten Promotor, eine für einen Repressor spezifische Bindungsstelle, eine einer prokaryotischen Ribosomenbindungsstelle entsprechende Sequenz, eine Klonierungsstelle mit einem für Annexin V kodierenden Gen und mindestens einen Transkriptionsterminator aufweist und- mindestens ein Kanamycin-Resistenz-Gen mit einem zweiten Promotor.
Description
Expressionsvektor zur Herstellung von Annexin V
Die Erfindung betrifft einen Expressionsvektor und eine E. coli-Zelle zur Herstellung von Annexin V.
Es ist allgemein bekannt, eukaryotische Gene in Bakterien mittels Plasmiden bzw. Vektoren als Expressionsvektoren zur Expression zu bringen. Aus der DE 37 10 364 AI ist es be- kannt, ein VAC-Protein mittels eines Expressionsvektors, z.B. pBR322, in E. coli zu exprimieren. Als Antibiotika-Resistenz- Gene werden Gene für die Tetracyclin- oder die Ampicillin- Resistenz vorgeschlagen. VAC-Proteine werden auch als Annexine bezeichnet.
Aus der EP 0 351 826 A2 ist die Expression des Plazenta- Koagulationsinhibitors CPBII, welcher auch als Annexin VI bezeichnet wird, in E. coli bekannt. Zur Expression wird der ein Ampicillin-Resistenz-Gen enthaltende Expressionsvektor pKK223-3 und der E. coli-Stamm JM105 verwendet.
Aus der WO 00/73332 AI ist die Expression von Annexin V im E . coli-Stamm BL21 bekannt. Expressionsvektoren sind auf Basis des Vektors pET12a konstruiert worden und enthalten ein Ampi- cillin-Resistenz-Gen.
Aus Turnay J. et al . , Journal of Cellular Biochemistry 58 (1995), Seiten 208 bis 220, ist es bekannt, ein Annexin V-Gen aus dem Huhn in E. coli mittels des ein Ampicillin-Resistenz- Gen enthaltenden Expressionsvektors pTrc99A zu exprimieren.
Übliche Elemente von Expressionsvektoren sind ein Origin, ein Gen, welches eine Antibiotika-Resistenz vermittelt, ein für den Lac-Repressor kodierendes lac I-Gen, ein Promotor unter der Kontrolle des lac-Operators und eine optimale Ribosomen-
bindungsstelle . Daran schließt sich üblicherweise ein kurzes offenes Leseraster mit einer multiplen Klonierungsstelle für den Einbau einer cDNA in das richtige Leseraster an. Ein solcher Expressionsvektor ist in Bakterien stumm, wenn der Lac- Repressor die Transkription der eingebauten cDNA verhindert. Das lac I-Gen ist in dem Vektor nicht erforderlich, wenn der Expressionsvektor in Bakterien eingesetzt wird, in welchen das lac I-Gen auf andere Weise exprimiert wird, etwa weil es auf einem weiteren Vektor vorhanden ist. Durch Zusatz des In- duktors IPTG kann die Transkription auf einfache Weise freigegeben werden. Die Bakterien produzieren dann oft, aber nicht immer das durch die cDNA kodierte Protein. Häufig ist das Protein auch unlöslich und fällt schon in den Bakterien als Präzipitat, so genannte "inclusion bodies", aus. Nicht jeder Vektor mit den angegebenen Elementen ist zur Expression eines vorgegebenen Proteins gleich gut geeignet.
Weiterhin ist selbst ein mittels eines zur Expression gut geeigneten Vektors hergestelltes Protein nicht unbedingt als Therapeutikum einsetzbar. Der Grund dafür ist insbesondere, dass sich die üblicherweise zur Selektion erfolgreich trans- fizierter Zellen verwendeten Antibiotika nicht restlos vom Protein abtrennen lassen. Das Vorhandensein von Antibiotika in geringen Mengen des verabreichten Proteins kann zur Ent- stehung von Resistenzen gegen dieses Antibiotikum führen.
Weiterhin haben die Antibiotika teilweise erhebliche Nebenwirkungen. So bestehen häufig Allergien gegen Ampicillin und Tetracycline, welche in einer Präparation des Proteins noch in Spuren enthalten sind. Bei Verabreichung einer solchen Präparation kann es zu einem lebensbedrohlichen anaphylak- tischen Schock kommen. Kanamycin weist eine hohe systemische Toxizität auf und sollte daher nicht systemisch verabreicht werden. Es wird daher heute als Therapeutikum nur noch in Augenpräparaten eingesetzt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Expressionsvektor anzugeben, der für die Expression von als Therapeutikum systemisch einsetzbarem Annexin V gut geeignet ist. Weiterhin soll eine E. coli-Zelle bereitgestellt werden, mittels der als Therapeutikum systemisch einsetzbares Annexin V hergestellt werden kann.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 19 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 18 und 20.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Expressionsvektor vorgesehen, welcher die folgenden Elemente enthält:
zumindest die Komponenten des Vektors pBR322 oder pKK223-3, welche für dessen Replikation erforderlich sind
einen Expressionsbereich, welcher in Leserichtung aufeinander folgend einen ersten Promotor, eine für einen Repressor spezifische Bindungsstelle, eine einer pro- karyotischen Ribosomenbindungsstelle entsprechende Sequenz, eine Klonierungsstelle mit einem für Annexin V kodierenden Gen und mindestens einen Transkriptions- terminator aufweist und
mindestens ein Kanamycin-Resistenz-Gen mit einem zwei- ten Promotor.
Der Vektor pBR322 stammt aus dem E. coli-Stamm K12 SK1592, welcher von der DSMZ unter der Nummer DSM No . 3879 bezogen werden kann. Der Vektor pKK223-3 ist aus Brosius, J. und Ho- ly, A. (1984) Proc Natl Acad Sei USA 81, Seiten 6929 - 6933 bekannt und kann z.B. von der Firma Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg bezogen werden. Unter den Komponenten sind Nu- kleotidsequenzen zu verstehen, welche für die in dem Vektor pBR322 oder pKK223-3 enthaltenen funktionellen Einheiten ko-
dieren. Diese funktioneilen Einheiten können Gene, wie beispielsweise das rop-Gen oder Nukleotidsequenzen sein, welche eine sonstige Funktion, etwa bei der Replikation des Vektors, aufweisen. Es können sämtliche Komponenten des Vektors pBR322 oder pKK223-3, insbesondere die vollständige Nukleotidsequenz des Vektors in dem Expressionsvektor enthalten sein. Es können aber auch einzelne Komponenten des Vektors fehlen, sofern sie nicht für die Replikation des Vektors erforderlich sind.
Die für den Repressor spezifische Bindungsstelle erlaubt eine Induktion der Expression des für Annexin V kodierenden Gens. Die der prokaryotischen Ribosomenbindungsstelle entsprechende Sequenz ist eine Sequenz, durch deren Transkription eine mRNA-Sequenz entsteht, die eine prokaryotische Ribosomenbin- dungssteile (Shine-Dalgarno-Sequenz) darstellt. Die prokaryotische Ribosomenbindungsstelle ist für die Einleitung der Translation erforderlich. Bei der Klonierungsstelle kann es sich um eine einfache, um eine multiple oder um eine durch ein Einfügen des für Annexin V kodierenden Gens nicht mehr durch Restriktionsenzyme verdaubare Klonierungsstelle handeln. Eine multiple Klonierungsstelle zeichnet sich gegenüber einer einfachen Klonierungsstelle durch mehr als eine Restriktionsschnittstelle aus, welche den Einbau verschiedener DNAs erlauben. In der Klonierungsstelle ist ein für Annexin V kodierendes Gen im Leseraster enthalten. Bei dem Gen sind in der Nukleotidsequenz Abweichungen von der nativen Nukleotidsequenz möglich, sofern sie sich nicht oder nur so in der Proteinsequenz auswirken, dass die Funktion des Proteins nicht verloren geht. Bei der Funktion kann es sich auch um nur eine von mehreren Funktionen von Annexin V handeln. Solche Funktionen sind z.B. die Fähigkeit Phosphatidylserin zu binden oder die Blutkoagulation zu inhibieren. Der Expressionsbereich ohne das für Annexin V kodierende Gen kann, insbesondere bei einem die Komponenten des Vektors pKK223-3 ent- haltenden Expressionsvektor, zumindest teilweise, aus dem im
Vektor pKK223-3 in der Nukleotidsequenz 4146 bis 72 enthaltenen Expressionsbereich stammen.
Trotz der Toxizität von Kanamycin und der herrschenden Mei- nung, dass dessen Einsatz deswegen vermieden werden sollte, weist der erfindungsgemäße Expressionsvektor ein Kanamycin- Resistenz-Gen auf. Er ist besonders gut zur Expression von als Therapeutikum systemisch einsetzbarem Annexin V geeignet. Durch das Kanamycin-Resistenz-Gen kann bei der Expression auf die Verwendung von häufig Allergieprobleme verursachendem Am- picillin oder Tetracyclin verzichtet werden. In einer aus der Expression resultierenden für den therapeutischen Einsatz aufgereinigten Annexin V-Präparation kann das Vorhandensein von Kanamycin nicht völlig ausgeschlossen werden. Bei der Aufreinigung von Annexin V kann Kanamycin aber mindestens so weit abgereichert werden, dass dessen Toxizität bei den üblicherweise verabreichten Mengen an Annexin V unbedenklich ist. Die Abreicherung von Ampicillin oder Tetracyclin unter die zur Auslösung eines anaphylaktischen Schocks ausreichenden sehr niedrigen Konzentrationen ist dagegen schwierig. Ein weiterer entscheidender Vorteil besteht darin, dass Kanamycin wegen seiner Toxizität therapeutisch nicht mehr systemisch eingesetzt wird. Dadurch stellt die Entstehung Kanamycin- resistenter Krankheitserreger keine wesentliche, ansonsten bei einem Notfalleinsatz möglicherweise lebensbedrohliche, Gefahr dar.
Vorzugsweise stammt das für Annexin V kodierende Gen aus einem Huhn. Dieses Gen ist besonders gut für die Expression mittels des Expressionsvektors geeignet. Der Expressionsvektor mit dem 966 Basenpaare großen Annexin V Gen aus dem Huhn kann eine Größe von etwa 4000 Basenpaaren aufweisen und ist damit gut zu handhaben. Um eine besonders effiziente Expression von Annexin V in E. coli zu erreichen, können in dem für Annexin V kodierenden Gen sämtliche Codons durch solche er-
setzt sein, die in E. coli bevorzugt translatiert werden. Es ist bekannt, am 5 ' -Ende eines Annexin-Gens für E. coli optimale Codons zu verwenden. Diese Maßnahme wird offensichtlich für ausreichend erachtet, um eine erhöhte Expressionseffizi- enz in E. coli zu erreichen. Überraschenderweise kann durch den Ersatz sämtlicher Codons im Annexin V-Gen durch in E. coli bevorzugt translatierte Codons eine weitere Erhöhung der Effizienz erreicht werden.
Weil das im Annexin V-Gen natürlicherweise vorhandene Stop-
Codon in E. coli überlesen werden kann, kann das resultierende Protein zusätzliche unerwünschte Aminosäuren aufweisen. Am 3 ' -Ende der Sequenz des für Annexin V kodierenden Gens ist deshalb vorzugsweise mindestens ein zusätzliches Stop-Codon im Leseraster des Gens vorhanden. Besonders bevorzugt sind zwei zusätzliche Stop-Codons vorhanden. Das bewirkt, dass das exprimierte Protein exakt an der vorgesehenen Stelle endet.
Vorzugsweise ist der erste Promotor ein tac-Promotor. Der Re- pressor kann ein Lac-Repressor sein. Der tac-Promotor entspricht dem von De Boer, H.A. et al . (1983) Proc Natl Acad Sei USA 80, Seiten 21 - 25 publizierten tac-Promotor. Er ist ein hybrider Promotor, der in Kombination mit der spezifischen Bindungsstelle für den Lac-Repressor eine, z.B. mit Al- lolactose oder Isopropyl-ß-D-thiogalactosid (IPTG) , induzierbare Expression des Annexin V-Gens erlaubt. Die Transkription wird in E. coli-Stämmen unterdrückt, welche einen hohen Pegel an Lac-Repressor erzeugen. Solche Stämme werden als lac Iq- Stämme bezeichnet. Bei dem Transkriptionsterminator kann es sich um den Transkriptionsterminator rrnB Tl oder rrnB T2 handeln. Es ist auch möglich, dass sowohl rrnBl Tl als auch rrnB T2 als Transkriptionsterminatoren in dem Expressionsvektor enthalten sind. Die Transkriptionsterminatoren rrnB Tl und T2 stammen aus dem rrnB Operon in E. coli.
Bevorzugt sind in dem Expressionsvektor von den Komponenten des Vektors pBR322 das Ampicillin-Resistenz-Gen und/oder das Tetracyclin-Resistenz-Gen und von den Komponenten des Vektors pKK223-3 das Ampicillin-Resistenz-Gen, zumindest teilweise, nicht enthalten. Dadurch wird eine geringe Größe des Expressionsvektors ermöglicht. Vorzugsweise stammt das in dem Expressionsvektor enthaltene Kanamycin-Resistenz-Gen aus dem Vektor pACYC177 oder dem aus E. coli stammenden Transposon Tn903. Das Kanamycin-Resistenz-Gen aus dem Transposon Tn903 kann als Fragment durch Verdau des Plasmids pUC4K mit der Re- striktionsendonuklease Barn HI erhalten werden. Das Plasmid pUC4K ist z.B. von der Firma Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg zu beziehen. Der Vektor pACYC177 stammt aus dem E. coli-Stamm PC2166, welcher von der Deutschen Sammlung von Mi- kroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig (DSMZ) unter der Nummer DSM No . 5587 bezogen werden kann.
Vorzugsweise ist der zweite Promotor der Promotor pK aus dem Vektor pACYC177. Dieser Promotor ist stark genug, um eine für eine Kanamycin-Resistenz ausreichend hohe Expression des Ka- namycin-Resistenz-Gens sicherzustellen. Gleichzeitig wird durch den Promotor pK keine so starke Expression bewirkt, dass dadurch die Expression von Annexin V wesentlich vermindert wird. Das Kanamycin-Resistenz-Gen mit dem zweiten Promo- tor kann an den aus dem Vektor pBR322 stammenden Restriktionsschnittstellen Eco RI und Sty I oder der aus dem Vektor pKK223-3 stammenden Restriktionsschnittstelle Eco RI in den Expressionsvektor eingefügt sein. Vorzugsweise ist das Kanamycin-Resistenz-Gen mit dem zweiten Promotor pK in der Nu- kleotidsequenz 1816 bis 2771 des Vektors pACYC177 in dem Expressionsvektor enthalten.
Der Expressionsbereich kann an den aus dem Vektor pBR322 stammenden Restriktionsschnittstellen Ban I und Eco RI in den Expressionsvektor eingefügt sein. Vorzugsweise weist der Ex-
pressionsbereich ohne das für Annexin V kodierende Gen die Sequenz SEQ ID NO: 1 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll auf.
Bei einem Ausführungsbeispiel ist in dem Expressionsvektor keine außerhalb der Klonierungsstelle gelegene Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease der Klasse II, welche eine Erkennungssequenz mit der Nukleotidfolge ATG aufweist, enthalten. Restriktionsendonukleasen der Klasse II erkennen eine spezifische Nukleotidsequenz und schneiden spezifisch in dieser Sequenz oder in der Nähe dieser Sequenz. Eine Restriktionsendonuklease der Klasse II, welche eine Erkennungssequenz mit der Nukleotidfolge ATG aufweist, erlaubt auf einfache Weise die Klonierung des Startcodons ATG eines zu exprimie- renden Gens. Der eine effiziente Translation der mRNA gewährleistende optimale Abstand zur Ribosomenbindungsstelle beträgt in Prokaryoten 4 bis 8 Nukleotide zwischen dem letzen Nukleotid der Ribosomenbindungsstelle und dem A des Startcodons. Wenn außerhalb der Klonierungsstelle keine Schnittstel- le für die genannte Restriktionsendonuklease vorhanden ist, ist es möglich, diese Schnittstelle spezifisch in der Klonierungsstelle zu verwenden, um auf einfache Weise die Klonierung des Startcodons des zu exprimierenden Annexin V-Gens im optimalen Abstand zur Ribosomenbindungsstelle zu ermöglichen. Das Entfernen der Restriktionsschnittstellen kann durch gerichtete Mutagenese erfolgen. Bevorzugt sind die Restriktionsendonukleasen Nde I und Nco I . Die Erkennungssequenz beider Restriktionsendonukleasen enthält die Nukleotidfolge ATG. Die Erkennungssequenzen kommen ansonsten aber selten vor, so dass nur wenige außerhalb der Klonierungsstelle gelegene Schnittstellen zu entfernen sind. Eine zu entfernende Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease Nde I kann aus dem Vektor pBR322 stammen.
Der Expressionsvektor ohne das für Annexin V kodierende Gen kann die Sequenz SEQ ID NO: 2 gemäß dem anliegenden Sequenz- Protokoll aufweisen. Der Expressionsvektor mit Komponenten des Vektors pBR322 und einem vom Annexin V-Gen aus dem Huhn durch Codon-Optimierung abgeleiteten Annexin V-Gen kann die Sequenz SEQ ID NO: 3 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll aufweisen. In dieser Sequenz sind zwei zusätzliche Stop- Codons im Leseraster für Annexin V enthalten. Der Expressionsvektor mit Komponenten des Vektors pKK223-3 und dem Anne- xin V-Gen des Huhns kann die Sequenz SEQ ID NO: 4 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll aufweisen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine E. coli- Zelle, welche einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor ent- hält. Vorzugsweise gehört die E. coli-Zelle dem Stamm BL21 an. Dieser Stamm kann z.B. von der Firma Novagen, Inc., 601 Science Drive, Madison, WI 53711, USA bezogen werden. Diese Zelle hat sich als besonders geeignet für die Expression von Annexin V erwiesen. Die E. coli-Zelle kann auch einem lac Iq- Stamm, insbesondere dem Stamm JM105, angehören. Eine E. coli-
Zelle eines lac Iq-Stamms ist besonders geeignet für die Expression von Annexin V in einem Expressionsvektor, in welchem der erste Promotor der tac-Promotor ist. E. coli-Zellen vom Stamm JM105 können z.B. von der American Type Culture Collec- tion (ATCC) , Manassas, VA 20108, USA bezogen werden.
Ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor zur Expression von Annexin V kann durch ein Verfahren mit folgenden Schritten hergestellt werden:
al) Herstellen eines ersten Vektors durch vollständiges oder parzielles Entfernen der für die Replikation nicht erforderlichen Komponenten des Vektors pBR322 oder durch eine PCR-Amplifikation zumindest der Komponenten des Vektors pBR322, welche für die Replika-
tion des Vektors erforderlich sind und anschließender Ligation,
Synthese eines Expressionsbereichs, welcher in Leserichtung aufeinander folgend einen ersten Promotor, eine für einen Repressor spezifische Bindungsstelle, eine einer prokaryotisehen Ribosomenbindungsstelle entsprechende Sequenz, eine Klonierungsstelle und einen Transkriptionsterminator aufweist und
Einfügen des Expressionsbereichs in den Vektor pBR322, den ersten Vektor oder einen aus diesen Vektoren durch einen der Schritte dieses Verfahrens entstandenen Vektor
oder
a2) Herstellen eines ersten Vektors durch vollständiges oder parzielles Entfernen der für die Replikation nicht erforderlichen Komponenten mit Ausnahme des eine Klonierungsstelle aufweisenden Expressionsbereichs des Vektors pKK223-3 oder durch eine PCR-Amplifika- tion des eine Klonierungsstelle aufweisenden Expres- sionsbereichs und zumindest der Komponenten des Vektors pKK223-3, welche für die Replikation des Vektors erforderlich sind und anschließender Ligation
und
b) Einfügen mindestens eines funktioneil aktiven Ka- namycin-Resistenz-Gens in den Vektor pBR322, den Vektor pKK223-3, den ersten Vektor oder einen aus diesen Vektoren durch einen der Schritte dieses Verfahrens entstandenen Vektor, wenn in dem ersten Vektor ansonsten kein funktionell aktives Kanamycin-Resistenz-Gen vorhanden ist und
c) Einfügen eines für Annexin V kodierenden Gens in die Klonierungsstelle .
Das Einfügen und Entfernen erfolgt im Allgemeinen durch übliche Klonierungsschritte . Es versteht sich, dass die Schritte lit. b und lit. c sowohl bei einem Verfahren mit dem Schritt lit. al als auch bei einem Verfahren mit dem Schritt lit. a2 durchgeführt werden. Beim Schritt al kann das Entfernen oder die PCR-Amplifikation an dem Vektor pBR322 oder einem durch das Verfahren, insbesondere durch Einfügen des Expressionsbe- reichs, entstandenen Vektor erfolgen. Ein bei den Schritten al und a2 in dem Vektor bereits vorhandener Expressionsbereich wird bei der PCR-Amplifikation zusammenhängend mit den Komponenten des Vektors amplifiziert . Die Ligation ist erforderlich, um die bei der PCR-Amplifikation entstehenden freien Enden zu einem Vektor zu schließen. Dabei können die freien Enden des Vektors miteinander oder mit freien Enden einer einzufügenden DNA, insbesondere des Expressionsbereichs oder des für Annexin V kodierenden Gens, ligiert werden. Das Kanamycin-Resistenz-Gen ist funktionell aktiv, wenn nach dem Einfügen ein zweiter Promotor die Expression des Kanamycin- Resistenz-Gens ermöglicht. Das funktionell aktive Kanamycin- Resistenz-Gen umfasst den zweiten Promotor, wenn er nicht im Vektor vorhanden ist .
Das für Annexin V kodierende Gen kann aus einem Huhn stammen. Vorzugsweise werden in dem für Annexin V kodierenden Gen die Codons durch solche ersetzt, welche in E. coli bevorzugt translatiert werden. Eine solche Codon-Optimierung kann durch gerichtete Mutagenese oder Neusynthese erfolgen. In einem Ausführungsbeispiel des Verfahrens wird am 3 ' -Ende der Sequenz des für Annexin V kodierenden Gens mindestens ein zusätzliches Stop-Codon im Leseraster des Gens eingefügt. Besonders vorteilhaft ist das Einfügen von zwei zusätzlichen Stop-Codons. Vorzugsweise wird das Stop-Codon mittels eines, insbesondere die Sinnstrang-Sequenz SEQ ID NO : 5 und die An-
tisinnstrang-Sequenz SEQ ID NO: 6 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll aufweisenden, Linkers eingefügt. Das Einfügen erfolgt bevorzugt in eine für Annexin V kodierende cDNA vor dem Einfügen in die Klonierungsstelle, wobei hier unter Einfügen auch ein endständiges Anfügen zu verstehen ist. Das Anfügen des Linkers mit den Sequenzen SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll erfolgt bevorzugt über eine in der Annexin V-cDNA vorhandene Bse RI- Restriktionsschnittstelle .
Bevorzugt ist der erste Promotor ein tac-Promotor. Der Repressor kann ein Lac-Repressor sein. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Transkriptionsterminator um den aus E. coli stammenden Transkriptionsterminator rrnB Tl oder rrnB T2. Es ist auch möglich, dass sowohl rrnBl Tl als auch rrnB T2 Transkriptionsterminatoren sind. Vorzugsweise wird beim Herstellen des ersten Vektors das Ampicillin-Resistenz-Gen und/oder zumindest ein Teil des Tetracyclin-Resistenz-Gens entfernt oder nicht mittels PCR amplifiziert . Das Kanamycin-Resistenz- Gen kann vor dem Einfügen durch eine PCR amplifiziert oder aus einem Plasmid isoliert worden sein. Das Einfügen des zweiten Promotors ist nicht erforderlich, wenn in dem Vektor ein Promotor vorhanden ist, welcher die Expression des Ka- namycin-Resistenz-Gens ermöglicht. Vorzugsweise stammt das Kanamycin-Resistenz-Gen aus dem Vektor pACYC177 oder dem aus E. coli stammenden Transposon Tn903. Das Kanamycin-Resistenz- Gen kann mit einem zweiten Promotor, insbesondere dem Promotor pK aus dem Vektor pACYC177, eingefügt werden. Das Kanamycin-Resistenz-Gen mit dem zweiten Promotor wird vorzugs- weise an den aus dem Vektor pBR322 stammenden Restriktionsschnittstellen Eco RI und Sty I oder der aus dem Vektor pKK223-3 stammenden Restriktionsschnittstelle Eco RI eingefügt. Das umfasst auch ein Einfügen in den Vektor pBR322 oder pKK223-3 selbst. Bei einem Ausführungsbeispiel wird das Ka- namycin-Resistenz-Gen mit dem zweiten Promotor pK durch PCR-
Amplifikation der Nukleotidsequenz 1816 bis 2771 des Vektors pACYC177 erhalten. Bevorzugt wird der Expressionsbereich an den aus dem Vektor pBR322 stammenden Restriktionsschnittstellen Ban I und Eco RI eingefügt. Das Einfügen kann dabei auch in den Vektor pBR322 selbst erfolgen. In einer Ausgestaltung weist der Expressionsbereich ohne das für Annexin V kodierende Gen die Sequenz SEQ ID NO : 1 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll auf.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn eine außerhalb der Klonierungsstelle gelegene Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease der Klasse II, welche eine Erkennungssequenz mit der Nukleotidfolge ATG aufweist, insbesondere durch gerichtete Mutagenese, entfernt oder so verändert wird, dass die Re- striktionsendonuklease an dieser Schnittstelle nicht mehr schneiden kann. Um die oben erläuterten Vorteile einer ATG- Sequenz in der Erkennungssequenz ausnutzen zu können, muss das Entfernen oder Verändern vor dem Einfügen eines zu expri- mierenden Gens erfolgen. Vorzugsweise handelt es sich bei der Restriktionsendonuklease um Nde I oder Nco I. In einer Ausführungsform weist der Expressionsvektor ohne das für Annexin V kodierende Gen die Sequenz SEQ ID NO: 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll auf. Der vollständige Expressionsvektor kann die Sequenz SEQ ID NO: 3 gemäß dem anliegenden Sequenz- protokoll aufweisen. Diese Sequenz enthält ein vom Annexin V- Gen aus dem Huhn durch Codon-Optimierung abgeleitetes Gen. In diese Sequenz sind zwei zusätzliche Stop-Codons im Leseraster für Annexin V eingefügt worden. Der Expressionsvektor kann auch die Sequenz SEQ ID NO: 4 gemäß dem anliegenden Sequenz- protokoll aufweisen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand möglicher Klonierungs- schemas erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 das Einfügen des Produkts der PCR-Amplifikation des Kanamycin-Resistenz-Gens mit dem zugehörigen Promotor pK aus dem Vektor pACYC177 in den Vektor pBR322,
Fig. 2 das Entfernen der Restriktionsschnittstelle Nde I in dem daraus resultierenden Vektor und
Fig. 3 das Einfügen des Expressionsbereichs in den resul- tierenden Vektor.
Aus dem in Fig. 1 gezeigten Vektor pACYC177 werden die das Kanamycin-Resistenz-Gen mit dem zugehörigen Promotor pK umfassenden Nukleotide 1816 - 2771 mittels einer PCR-Reaktion amplifiziert . Das Produkt dieser Reaktion wird mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sty I verdaut. Es wird in den ebenfalls mit diesen Enzymen verdauten Vektor pBR322 einklo- niert .
Aus dem daraus resultierenden Vektor wird durch eine gerichtete Mutagenese die Restriktionsschnittstelle Nde I entfernt. Das ist schematisch in Fig. 2 dargestellt. Fig. 3 zeigt schematisch, wie der synthetisch hergestellte Expressionsbereich in den resultierenden Vektor an den Restriktionsschnittstel- len Ban I und Eco RI einkloniert wird.
Poly A+-RNA aus Hühnerleber wird zur Herstellung von Gesamt- cDNA revers transkribiert. Für Annexin V kodierende cDNA wird aus der Gesamt-cDNA mittels PCR amplifiziert . Die amplifi- zierte cDNA wird an den durch entsprechende Primer bei der
PCR eingeführte Restriktionsschnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Nde I und Barn HI enzymatisch verdaut. Diese cDNA wird an den im Vektor in dem Bereich zwischen der mit SD gekennzeichneten Ribosomenbindungsstelle und dem mit Tl ge- kennzeichneten Transkriptionsterminator ebenfalls vorhandenen
Restriktionsschnittstellen Barn HI und Nde I in den Vektor einkloniert .
Bei einem weiteren Klonierungsschema wird die gesamte Sequenz des Vektors pKK223-3 mit Ausnahme des für die Ampicillin- Resistenz kodierenden Gens und des dazugehörenden Promotors mittels einer PCR amplifiziert . Die dazu verwendeten Primer weisen die Sequenzen SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll auf. Die amplifizierte Sequenz wird an den durch jeden der Primer jeweils eingeführten
Schnittstellen für das Restriktionsenzym Bgl II geschnitten. Das aus dem Transposon Tn903 aus E. coli stammende Kanamycin- Resistenz-Gen wird als Fragment des Vektors pUC4K durch einen Verdau dieses Vektors mit der Restriktionsendonuklease Barn HI gewonnen. Das die Kanamycin-Resistenz aufweisende Fragment und die amplifizierte Sequenz werden an den durch den Verdau mit Barn HI und Bgl II entstandenen kompatiblen kohäsiven Enden der Schnittstellen zu einem ersten Vektor ligiert. Die darin in dem aus dem Vektor pKK223-3 stammenden Expressions- bereich enthaltene Klonierungsstelle wird mit der Restriktionsendonuklease Eco RI geschnitten. Die dabei entstandenen Nukleotidüberhänge werden mittels des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I aufgefüllt und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert .
Aus embryonalen Hühnerfibroblasten wird Poly A+-RNA isoliert. Daraus wird mittels einer reversen Transkription cDNA gewonnen. Für Annexin V kodierende cDNA wird daraus mittels PCR amplifiziert . Die amplifizierte cDNA wird mit der Restrikti- onsendonuklease Nco I und anschließend mit der Restriktionsendonuklease Barn HI verdaut. Die Nukleotidüberhänge des für Annexin V kodierenden Fragments werden mittels des Klenow- Fragments von DNA-Polymerase I aufgefüllt. Das resultierende Fragment wird mit dem Eco RI -geschnittenen aufgefüllten und
dephosphorylierten ersten Vektor zu einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor ligiert .
Claims
1. Expressionsvektor enthaltend
- zumindest die Komponenten des Vektors pBR322 oder pKK223-3, welche für dessen Replikation erforderlich sind
einen Expressionsbereich, welcher in Leserichtung aufeinander folgend einen ersten Promotor, eine für einen Repressor spezifische Bindungsstelle, eine einer prokaryotisehen Ribosomenbindungsstelle entsprechende Sequenz, eine Klonierungsstelle mit einem für Annexin V kodierenden Gen und mindestens einen Transkriptions- terminator aufweist und
mindestens ein Kanamycin-Resistenz-Gen mit einem zweiten Promotor.
2. Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei das für Annexin
V kodierende Gen aus einem Huhn stammt .
3. Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei in dem für Annexin V kodierenden Gen sämtliche Codons durch solche ersetzt sind, die in E. coli bevorzugt translatiert werden.
4. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei am 3 ' -Ende der Sequenz des für Annexin V kodierenden Gens mindestens ein zusätzliches Stop-Codon, vorzugsweise zwei zusätzliche Stop-Codons, im Leseraster des Gens vorhanden ist/sind.
5. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste Promotor ein tac-Promotor ist.
6. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Repressor ein Lac-Repressor ist.
7. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei der Transkriptionsterminator der Transkriptionsterminator rrnB Tl oder rrnB T2 ist.
8. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei von den Komponenten des Vektors pBR322 das Ampi- cillin-Resistenz-Gen und/oder das Tetracyclin-Resistenz-Gen und von den Komponenten des Vektors pKK223-3 das Ampicillin- Resistenz-Gen, zumindest teilweise, nicht enthalten sind.
9. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei das Kanamycin-Resistenz-Gen aus dem Vektor pACYC177 oder dem aus E. coli stammenden Transposon Tn903 stammt .
10. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei der zweite Promotor der Promotor pK aus dem Vektor pACYC177 ist.
11. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Kanamycin-Resistenz-Gen mit dem zweiten Promo- tor an den aus dem Vektor pBR322 stammenden Restriktionsschnittstellen Eco RI und Sty I oder der aus dem Vektor pKK223-3 stammenden Restriktionsschnittstelle Eco RI in den Expressionsvektor eingefügt ist.
12. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Kanamycin-Resistenz-Gen mit dem zweiten Promotor pK in der Nukleotidsequenz 1816 bis 2771 des Vektors pACYC177 in dem Expressionsvektor enthalten ist.
13. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei der Expressionsbereich an den aus dem Vektor pBR322 stammenden Restriktionsschnittstellen Ban I und Eco RI in den Expressionsvektor eingefügt ist.
14. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei der Expressionsbereich ohne das für Annexin V kodierende Gen die Sequenz SEQ ID NO: 1 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll aufweist.
15. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei keine außerhalb der Klonierungsstelle gelegene
Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease der Klasse II, welche eine Erkennungssequenz mit der Nukleotidfolge ATG aufweist, enthalten ist.
16. Expressionsvektor nach Anspruch 15, wobei die Restriktionsendonuklease Nde I oder Nco I ist.
17. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Expressionsvektor ohne das für Annexin V ko- dierende Gen die Sequenz SEQ ID NO : 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll aufweist.
18. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Expressionsvektor die Sequenz SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll aufweist .
19. E. coli-Zelle enthaltend einen Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche .
20. E. coli-Zelle nach Anspruch 19, wobei die E. coli-Zelle dem Stamm BL21 oder einem lac Iq-Stamm, insbesondere dem Stamm JM105, angehört.
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000073332A1 (en) * | 1999-06-01 | 2000-12-07 | University Of Washington | Annexin derivatives with endogenous chelation sites |
| WO2003022883A2 (de) * | 2001-09-13 | 2003-03-20 | Responsif Gmbh | Verwendung eines proteins zur herstellung eines medikaments zur stimulierung des angeborenen unspezifischen immunsystems |
Family Cites Families (6)
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|---|---|---|---|---|
| DE3710364A1 (de) * | 1987-03-28 | 1989-01-19 | Boehringer Ingelheim Int | Vascular-antikoagulierende proteine, dna die diese kodieren, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung |
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| US6010705A (en) * | 1997-04-11 | 2000-01-04 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Attenuated, invasive vaccines against fish pathogens |
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- 2002-12-16 WO PCT/EP2002/014347 patent/WO2003052094A2/de not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000073332A1 (en) * | 1999-06-01 | 2000-12-07 | University Of Washington | Annexin derivatives with endogenous chelation sites |
| WO2003022883A2 (de) * | 2001-09-13 | 2003-03-20 | Responsif Gmbh | Verwendung eines proteins zur herstellung eines medikaments zur stimulierung des angeborenen unspezifischen immunsystems |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| TAIT J F ET AL: "SITE-SPECIFIC MUTAGENESIS OF ANNEXIN V ROLE OF RESIDUES FROM ARG-200 TO LYS-207 IN PHOSPHOLIPID BINDING" ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, Bd. 288, Nr. 1, 1991, Seiten 141-144, XP009015380 ISSN: 0003-9861 * |
| TURNAY JAVIER ET AL: "Collagen binding activity of recombinant and N-terminally modified annexin V (Anchorin CII)." JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY, Bd. 58, Nr. 2, 1995, Seiten 208-220, XP009015379 ISSN: 0730-2312 in der Anmeldung erw{hnt * |
| ZHANG L N ET AL: "Expression and purification of recombinant human annexin V in Escherichia coli." PREPARATIVE BIOCHEMISTRY & BIOTECHNOLOGY, Bd. 30, Nr. 4, November 2000 (2000-11), Seiten 305-312, XP009015378 ISSN: 1082-6068 * |
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| DE69635178T2 (de) | Ein bei der Expression von Nitrilase-Gen beteiligter regularischer Faktor, sowie dessen Gen |
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