DD202451A5 - Verfahren zur herstellung eines dna transfervektors, der eine ein somatostatin oder einen somatostatinvorlaeufer codierende nukleotidsequenz enthaelt - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines DNS-Transfer-Vektors fuer die Verwendung zur Aufrechterhaltung und Replikation einer Desoxynucleotidsequenz, die fuer ein Somatostatin oder einen Somatostatin-Vorlaeufer, ausgewaehlt aus der Praeprosomatostatin-1, Prosomatostatin-1, Praeprosomatostatin-2, Prosomatostatin-2 und Somatostatin-2 umfassenden Gruppe, codiert. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Somatostatinen, die mit hoher Spezifitaet angewendet werden koennen fuer die Regulierung des Hormonausstosses und die Behandlung von Krankheitszustaenden, die durch Hormonueberproduktion gekennzeichnet sind. Erfindungsgemaess wird die Desoxynucleotid-Sequenz mit einem durch Spalten eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym hergestellten DNS-Molekuel umgesetzt. Beispielsweise weist erfindungsgemaess die fuer Somatostatin-2 codierende Desoxynucleotid-Sequenz einen Plusstrang mit folgender Sequenz auf 5' - GCT GGC TGT AAG AAC TTC TAT TGG AAG GGC TTC ACT TCC TGT TAA - 3' worin A Desoxyadenyl ist, G Desoxyguanyl ist, D Desoxycytosyl ist und T Thymidyl ist.

Description

Verfahren zur Herstellung eines DNS-Übertragungsvektors Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines DiTS-Übertragungsvektors, der eine ein Somatostatin oder einen Somatostatin-Vorläufer codierende Hukleotidsequenz enthält. Die Erfindung bezieht sich darüber hinaus auch auf die Verwendung dieses Übertragungsvektors.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Ursprünglich wurde Somatostatin aus dem Säugetier-Hypthalamus isoliert_und als ein Inhibitor der Sekretion von Wachstumshormon nachgewiesen, Vale, W. et., C. R. Acad. Sei. Paris, 275, 2913 (1972). Das Hormon ist ein 14 Aminosäuren langes Peptid. Die Aminosäuresequenz von menschlichem Somatostatin ist Ala-GlyCysLysAsnPhePheTrpLysThrPheThrSerCys. Das Peptid kann linear oder durch Disulfidbindung zwischen den zwei Cys-Resten zyklisch sein, wobei jede Form aktiv.ist. Jüngste Arbeiten haben gezeigt, daß das Hormon in stärkerem laße über den gesamten Körper verteilt ist und einen breiteren Bereich von Regulationswirkungen aufweist, als dies zuvor angenommen worden war. Speziell ist Somatostatin in den D-Zellen des innersekretorischen Pankreas lokalisiert worden und hat sich dabei als ein Inhibitor sowohl der Insulin- als auch der Glukagonsekretion erwiesen. Darüber hinaus ist Somatostatin auch in abgetrennten, den Darm auskleidenden Epithelialzellen nachgewiesen worden, wo es die Sekretion verschiedener gastrointestinaler Hormone einschließlich Sekretin, Gastrin und Choleozystikinin inhibiert. Somatostatin ist jedoch universell in die Regulation der Sekretion von Peptidhormonen einbezogen, da es keine Wirkung auf die Sekretion von follikelstimulierendem Hormon, luteinisierendem Hormon oder Thyrotropin auszuüben vermag. Zusätzlich zu seiner regulatorischen Rolle bei der Produktion bestimmter

232787 6 -²'- ^ ⁶^ W32/36

3.6.82

Hormone deuten Beweise darauf hin, daß Somatostatin als ein Ueurotransmitter wirkt.

Die verbreitete Lokolisierung und Breite dieser hormonregulierenden Aktivität lassen erkennen, daß die Wirkung von Somatostatin von fundamentaler physiologischer Bedeutung ist. Indes liegen keine Beweise dafür vor, daß die beobachteten regulatorischen Effekte in jedem Falle durch die gleiche Verbindung hervorgerufen werden. In der Tat ist ermittelt worden, daß Peptide, die bis zu zehnmal so groß waren wie Somatostatin, mit Somatostatin-Antikörpern reagierten. Siehe hierzu Colon, J· et al., PESS Letts., J94, 327 (1978) und Ioe, B. et al., Endocrinology, 102, 1675 (1978). Eines dieser größeren Peptide hat sich als fähig erwiesen, die durch den Hypophysenhinterlappen bewirkte Sekretion von Wachstumshormon zu hemmen. Kürzlich ist ein die Somatostatinsequenz enthaltendes 28-Restpeptid aus intestinalem Gewebe vom Schwein isoliert und in seiner Sequenz dargestellt worden (Pradagrol, L_#, FEBS Letts, 109, 55 (1980))· Diese und andere Befunde haben zu der Vermutung geführt, daß Somatostatin gemeinsam mit einer Anzahl anderer Peptidhormone als Teil eines- großen Vorläuferpeptids synthetisiert werden kann, welches erst darauffolgend konstituiert wird. Ein derartiges Entstehen könnte die bekannten Somatostatinwirkungen modifizieren und zu gesteigerter Spezifität oder Selektivität führen.

Somatostatin-Analoga sind bereits chemisch synthetisiert worden· Derartige Analoga zeigten im Vergleich zum eigentlichen Somatostatin veränderte relative Aktivitäten in ihren Wirkungen auf unterschiedliche Hormone. So ist zwar von Somatostatin-Analoga und Peptiden mit Somatostatinsequenz

232787 6 - 3 - 59 676 18/32/36

3.6.82

bekannt, daß sie Somatostatinaktivität aufweisen, obwohl die relative Selektivität und Spezifität dieser Aktivitäten von dsnen des eigentlichen Somatostatins unterschieden sein können· Das Ausmaß dieser Unterschiede ist allein aus der Kenntnis der Struktur nicht vorherzusagen. Grundsätzlich könnte erwartet werden, daß größere Proteine mit Somatostatinsequenz mehr Spezifität der Aktivität zeigen. Tatsächlich besteht das Erscheinungsbild darin, daß Somatostatin selbst lediglich eines aus einer ganzen Pamilie miteinander verwandter Peptide ist, von denen alle die Sekretion von Peptiden - und damit insbesondere Peptidhormonen - hemmen, die aber auch in ihrer Aminosäuresequenz in Abhängigkeit von ihrer Quelle und dem Trägergewebe differieren können*, Mit dem Begriff Somatostatine beziehen wir;"uns im vorliegenden Text auf diese allgemeine Klasse von Peptiden.

Auf Grund ihrer bekannten biologischen Aktivitäten besitzen die Somatostatine=Bedeutung hinsichtlich der Regulation von Hormonausstoß und hinsichtlich der Behandlung von Krankheitszuständen, die durch Hormon-Überproduktion gekennzeichnet sind.

Somatostatin ist einem raschen Abbau durch Proteasen ausgesetzt. Darüber hinaus wird Somatostatin selbst nach parenteraler Verabreichung schnell ausgeschieden, so daß es schwierig ist, die wirksame Dosis zu steuern. Größere Peptide werden etwas langsamer ausgeschieden. Daher bieten Somatostatine mit höherer relativer Molekülmasse die Möglichkeit einer leichteren Ermittlung und Steuerung einer befriedigend wirksamen Dosierung. Die Somatostatine sind vorteilhaft zur Behandlung eines breiten Spektrums von Hormon-ühgleichgewichtssituationen geeignet. Beispielsweise wurde ein die Glukagon- nicht aber die Insulinsekretion selektiv inhibie-

- 4 - 59 676 18/32/36

3.6.82

rendes Somatostatin für insulinabhängige Diabetiker von lutzen sein, welche unter den Hyperglykämie exazerbierenden Auswirkungen einer relativen Glukagon-Überproduktion leiden. Ebenso ist profiferative Retinopathie, eine bei Diabetes häufige Krankheitserscheinung, bei derartigen Patienten mit einer Hormonüberproduktion gekoppelt, weshalb erwachsenen Patienten durch Verabreichung von Somatostatin geholfen werden kann· Eine durch Hyperglykämie hervorgerufene konstant maximale Sekretion kann sich gegenüber B-Zellen schädlich auswirken· Einige Individuen erzeugen eine kleine und unzureichende Menge endogenen Insulins bei maximaler Kapazität» Diese Patienten können von der Verabreichung eines exogenen Somatostatins profitieren. Patienten mit relativ normaler Glukagonsynthese würden ähnlicherweise von der Verabreichung eines Somatostatins mit fehlender Aktivität des Hemmens der 61uka.gonsekretion üTutzen ziehen.

Somatostatin wurde bereits aus verschiedenen Gewebsquellen isoliert^ es ist des weiteren mittels gebräuchlicher Techniken der Peptidchemie synthetisiert worden. Darüber hinaus gelang durch Anwendung von rekombinanten DHS-Techniken die Synthese von Somatostatin durch..einen Mikroorganismus, Itakura, K. et al., Science, 198, 1056 (1977). In jenem lalle wurde die die Aminosäuresequenz von Somatostatin codierende DUS auf der Basis der bekannten Aminosäuresequenz und der Codierungsbeziehungen des genetischen Codes chemisch synthetisiert. Die Codons wurden auf der Grundlage vorausgesetzter Kompatibilität mit dem Wirtsmikroorganismus E. coli ausgewählt. Wir sind sicher, daß vor dem Erscheinen der vorliegenden Erfindung die natürlich vorkommende somatostat incodierende DHS-Sequenz noch nicht isoliert und charakterisiert worden ist. Demzufolge war auch keine Information in bezug auf Vorläufer-Proteine erreichbar.

ο 17 7 8 7 6 -⁵ - ^{59 67δ}

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Somatostatine, die mit hoher Selektivität bzw. Spezifität angewendet werden können für die Regulierung des Hormonausstoßes und die Behandlung von Krankheitszuständen, die durch Hormon-Überproduktion gekennzeichnet sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein industriell anwendbares Verfahren aufzufinden zur Herstellung eines DUS-Übertragungsvektors, der eine ein Somatostatin oder einen Somatostatin-Vorläufer codierende Uucleotidsequenz enthält«

In einer der möglichen Verkörperungen ist das Verfahren zur Herstellung eines DITS-Übertragungsvektors, der eine ein Somatostatin oder einen Somatostatin-Vorläufer aus der Gruppe Präprosomatostatin-1, Prosomatostatin-1, Präprosomatostatin-2, Prosomatostatin-2 und Somatostatin-2 codierende Desosynukleotidsequenz enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Desoxynukleotidsequenz mit einem DIiS-Molekül reagiert, welches durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem EestriktIonsenzym angefertigt worden war«

In einer weiteren Verkörperung enthält der DNS-Übertragungsvektor die Somatostatin-2-codierende Desoxynukleotidsequenz.

In einer zusätzlichen Verkörperung schließt der die Somatostatin- 2-Sequenz enthaltende DUS-Übertragungsvektor einen Plus-Strang der Sequenz·

23 2 7 87 6 ~^β~ ^{59 δ7618/32/36}

3.6.82

5^f - GCT GGC TGT AAG AAC TTC TAT TGG AAG GGC TTC ACT TCC TGT TAA - 3^f ein, wobei

A = Desoxyadenyl,

G = Desoxyguanyl,

C = Desoxyzytosyl und

T = Thymidyl

In einer wieder anderen Verkörperung enthält der DHS-Übertragungsvektor die Präprosomatostatin-i-codierende Desoxynukleotidsequenz.

In einer noch anderen Verkörperung beinhaltet der die Präprosoma tos tatin- 1-Se quenz enthaltende DUS-Übertragungsvektor einen Plus-Strang der Sequenz

5» - ATG AAG ATG GTC TCC TCC TCG CGC CTC CGC TGC CTC CTC GTG CTC CTG CTG TCC CTG ACC GCC TCC ATC AGC TGC TCC TTC GCC GGA CAG AGA GAC TCC AAA CTC CGC CTG CTG CTG GAC CGG TAC CCG CTG CAG GGC TCC AAA CAG GAC ATG ACT GGC TCC GCC TTG GCC GAG CTG CTC CTG TCG GAC CTC CTG CAG GGG GAG AAC GAG GCT CTG GAG GAG GAG AAC TTC CCT CTG GCC GAA GGA GGA CCC GAG GAC GCC CAC GCC GAC CTA GAG CGG CCC GCC AGC GGG GGG CCT CTG CTG GCC CCC CGG GAG AGA AAG GCC GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAA ACC TTC ACC TCC TGC TGA - 3*

in welcher

A = Desoxyadenyl,

G = Desoxyguanyl,

C = Desoxyzytosyl und

T β.Thymidyl

0 0 7 Q Π C - ⁷ - 59 676 18/32/36

O L I 0 / D 3.6.82

In einer weiteren Verkörperung enthält der DUS-Überträgungsvektor die Präprosomatostatin-2-codierende Desozynukleotidsequenz.

In wieder einer anderen Verkörperung beinhaltet der die Präprosoma tostatin-2-Sequenz enthaltende DETS-Übertragungsvektor einen Plus-Strang der Sequenz

5· - ATG CIG TGT ATC OGT TGT CCC GCC ATC TTG GCT CTC CTG GCG TTG GTT CTG TGC GGC CCA AGT GTT TCC TCC CAG CTC GAC AGA GAG CAG AGC GAC AAC GAG GAC CTG GAC CTG GAG CTG CGT CAG CAC TGG CTG CTG GAG AGA GCC CGG AGC GCC GGA CTC CTG TCC CAG GAG TGG AGT AAA CGG GCC GTG GAG GAG CTG CTG GCT GAG ATG TCT CTG CCA GAG GCC ACG TTC CAG CGG GAG CCG GAG GAC GCG TCC ATG GCA ACA GAA GGA CGG ATG AAC CTA GAG CGG TCC GTG GAC TCT ACC AAC AAC CTA CCC CCT CGT GAG CGT AAA GCT GGC TGT AAG AAC TTC TAT TGG AAG GGC TTC ACT TCC TGT TAA - 3¹,

wobei

A = Desoxyadenyl,

G = Desoxyguanyl,

C = Desoxyzytosyl und

T = Thymidyl

In einer weiteren Verkörperung schließlieh ist das Verfahren zur Herstellung des Plasmids pSR322/plaSl oder des Plasmids pBR322/pIaS2 dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem durch Spalten eines Übertragungsvektors mittels Restriktionsenzym hergestellten DUS-Molekül um pBR322 handelt und daß Pst I als Restriktionsenzym eingesetzt wurde.

232787 fi~⁸~ ^{59δ7618/32/3β}

3.6.82

Die Erfindung vermittelt des weiteren ein Verfahren zur Herstellung eines.Expressions-Übertragungsvektors, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restriktionsenzym präparierte DUS--Molekül an einem Punkt innerhalb einer expressiblen Kontrollregion gespalten wurde.

Darüber hinaus vermittelt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteine., welches die Aminosäuresequenz eines Somatostatins oder eines Somatostatin-Vorläufers als G-terminales Ende und ein Teil eines prokaryotischen Proteins als N-terminales Ende umfaßt. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein durch einen Expressiönsvektor transformierter Mikroorganismus inkubiert wird.

Schließlich vermittelt die Erfindung ein Verfahren zur Synthese eines Somatostatins oder eines Somatos tatin-Vorläufers aus der aus Präprosomatostatin-1, Präprosomatostatin-2 und Somatostatin-2 gebildeten Gruppe, Dieses Verfahren ist durch Inkubieren eines mittels· eines Expressionsvektors transformierten Mikroorganismus gekennzeichnet, wobei der genannte Expressionsvektor eine das genannte Somatostatin oder den genannten Somatostatin-Vorläufer codierende Desx>xynukleotidsequenz enthält. Dieses Verfahren muß unter Bedingungen durchgeführt werden, die der Darstellung der genannten Desoxynukleotidsequenz dienlich sind· Das Verfahren besteht schließlich noch aus dem Eeinigen des genannten Somatostatins oder Somatostatin-Vorläufers aus dem Lysat oder dem Kulturmedium des genannten Mikroorganismus.

Die vorliegende Erfindung offenbart das Klonen von cDHS, welche natürlich vorkommende Sequenzen enthält, die ihrer-

232787 6

"⁹" I⁹JZ ^18/32/36

seits sowohl bekannte als auch neuartige Somatostatinsequenzen codieren· Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird die folgende Nomenklatur verwendet:

Somatostatin 1 (S1) bezieht sich auf das im obigen Test und in der bisherigen Literatur als Somatostatin bezeichnete 14-Aminosäure-Peptid.

Somatostatin 2 (32) ist ein neuartiges, natürlich vorkommendes Somatostatin·

Präprosomatostatin 1 (Präpro S1) ist ein neuartiges Protein, welches S1 als C-terminale Sequenz enthält und als N-terminale Sequenz eine Sequenz von hydrophoben Aminosäuren aufweist· letztere ist charakteristisch für ein Signalpeptid, wie es bereits für andere Vorläufer von sekretorischen Proteinen beschrieben wurde, Devillers-Thiery,' A. et al., Proc. Hat. Acad. Sei· USA, 73, 5016 (1975).

Prosomatostatin 1 (Pro S1) resultiert aus der Entfernung des Signalpeptids von Präpro S1.

Ähnlicherweise handelt es sich bei Präprosomatostatin 2 (Präpro S2) und Prosomatostatin 2 (Pro S2) um neuartige Proteine,, die die S2-Aminosäuresequenz am Karboxylende aufweisen, sowie im Falle von Präpro S2 ein Signalpeptid enthalten bzw. im Falle von Pro S2 kein Signalpeptid enthalten· Präpro S1 weist eine relative Molekülmasse auf, die annähernd jener des "Großen Somatostatin^t1-Moleküls entspricht, das von Conlon, J. et al. (siehe oben) und SOe, B. et al. (.'siehe oben) sowohl in Säuger- als auch in Fischgewebe nachgewiesen worden ist.

⁴ _ - 10 - 59 676 18/32/36

23 2 7 87 6 3.6.₈₂

Präpro S1 und Präpro S2 werden als natürlich yorkommende Vorlaufermoleküle angesehen, aus denen die aktiven Somatostatine einschließlich Pro SI, S1, Pro S2 und S2 durch zusätzliche Verarbeitungsschritte abgeleitet werden·

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Synthese der oben erwähnten neuartigen Somatostatine in einem durch cDUS-Codierung für das gewünschte Protein passend transformierten Mikroorganismus, wobei die genannte cDUS in einen Übertragungsvektor eingefügt wird, der für die Darstellung der geklonten Einlage sowohl als ein Proteinprodukt als auch als ein mit einem Segment von bakteriellem Protein verbundenes Fusionsprotein geeignet ist. Die vorliegende Erfindung umfaßt also die neuartigen Somatostatine per se, sie umfaßt weiter neue Methoden zur Herstellung sowohl der neuartigen Somatostatine als auch von S1, des weiteren Übertragungsvektoren mit eingelagerten codierenden Sequenzen für/die obengenannten Somatostatine, durch die obengenannten Übertragungsvektoren transformierte neue Mikroorganismen sowie schließlich neue Fusionsproteine, welche die Aminosäuresequenzen der vorgenannten Somatostatine beinhalten.

Da eine natürlich vorkommende codierende Sequenz mit einer Si-codierenden Region bislang noch nicht isoliert worden war, bestand die Notwendigkeit der Verwendung eines solchen Gewebes als Ausgangsmaterial, das nachweislich einen ausreichend hohen Anteil somatostatinproduzierender Zellen besitzt und somit die praktische Isolation von ausreichend mit somatostatincodierenden Sequenzen angereicherter mRÜS gestattet. Beim Anglerfisch (lophius americanus) ist das als Brockmann-Körper bezeichnete innersekretorische Pankreas unschwer vom exokrinen Gewebe zu trennen und außerdem in hohem Mäße mit

2O O *7 0 Γ? C - 11 - 59 676 18/32/36

OLfQI D

3.6.82

D'zelltypen (somatos tat inerzeugend) relativ zu B-Zellen (insulinerzeugend) angereichert. Darüber hinaus ist die Aminosäuresequenz des S-I., das aus isolierten Zellen von Anglerfisch-Brockmann-Körpern stammt, identisch mit Säuger-Si, Hoe, B. et al., Endocrinology, 105, 1410 (1979).

Es wurde eine Reihe von cDHS-Einlagen aus Brockmann-KörpermRHS synthetisiert und geklont. Die Klone wurden sodann hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, untereinander über Kreuz zu hybridisieren. Auf diese Weise wurde festgestellt, daß die Mehrheit der cDHS-Klone jeweils einer von drei Gruppen zugeordnet werden konnte. Die darauffolgende Analyse zeigte, daß diese Gruppen cDITS umfaßte, die Fisch-Präproinsulin, Präpro S1 und - unerwarteterweise - die Präpro-S2-codierende Sequenz codierte. In den Techniken der vorliegenden Erfindung wurde in breitem Maße von enzymkatalysierten Reaktionen Gebrauch gemacht.

Unter Anwendung herkömmlicher Techniken wird RHS aus Zellen von Brockmann-Körpern isolier/tU-Durch Affinitätschromatographie wird polyadenylierte RHS isoliert, Die polyadenylierte RHS wird unter' Anwendung konventioneller Techniken als Schablone für die Herstellung einer doppelstrangigen cDHS-Kopie verwendet. Der erste cDUS-Strang wird unter Einsatz von umgekehrter Transkriptase, eines Olig-dT-Primers und der polyadenylierten RHS synthetisiert. Hach der Synthese des ersten cDHS-Stranges wird die RHS durch Alkali-Verdauung beseitigt; die einstrangige cDHS wird zur Selbstinitiierung der Synthese des zweiten Stranges durch umgekehrte Transkriptase genutzt. Die einzelstrangige Haarnadelschleife wird durch Verdauung mit S1-Huklease entfernt.

232787 6

59 676 13/32/36 3.6.82

Die cDNS ist nun zur Insertion in einen geeigneten Übertragungsvektor bereit. Brauchbare Übertragungsvektoren sind jene, die zur Transformierung von Bakterien wie etwa von E3cherichis coli und Bacillus subtilis, Hefe (Saccharpayees cerevisiae), den mutanten inl.-, csp- und esp-Stämmen von ITeurospora crassa und "Eierzellen in Gewebekultur fähig sind* Zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete und zur Transformierung von E₀ coli fähige Beispiele von Übertragungsvektoren umfassen die Plasmide pSC1O1, pMB9, pBR313, pBR315» pBR3i6 und pBR322 sowie die vom Bakteriophagen abgeleiteten Vektoren, d. tu Charon 3A, Charon 4A, Charon 16A und ^gtWES . /LB- In Tabelle 1 sind Quellen aufgeführt, in denen die Präparation und die kennzeichnenden; Merkmale' dieser Übertragungsvektoren beschrieben werden«

Tabelle 1 Übertragungsvektor

Literaturhinweis(e)

pSCiO1 pMB9

Cohen, et al., Proc. üTatl. Acad. Sei. USA, 70, 1293 und 3240 (19-7). Boyer, et al», Recombinatn Molecules, Beers, et al., Eds., Raven Press, IY, aufp. 13 (1977). Cohen, et al., Recombinant Molecules, auf S, 91

Rodriguez, et al.,. Molecular Mechanisms in Control of Gene Expression TICH-UCLA Symposium on Mol. & Cell. Biol. Bd. 5), lieslich, et al., Eds., Academic Press, ΠΥ, auf S. 471 (1976)

Bolivar, et al., Gene, 2, 75 (1977)

232787 6-13-

59 β?6 18/32/36 3.6.82

Übertragungsvektor Literaturhinwei3(e)

PBR313 pBR315 pBR3i6 pBR322

Charon 3A

Charon 4A Charon XgtWES

Bolivar et al.., siehe oben Rodriguez et al., siehe oben Rodriguez et al., siehe oben Bolivar et al., Gene, 2, 95 (1977) Bolivar et al., Gene, jj., 121 (1978) Sütcliffe, Cold Spring Harbor Symp.

on Quant. Biol., £3, 77 (1978) Blattner et al<,, Science, 196,

(1977)

Blattner et al.,__siehe oben Blattner et al*, siehe oben Tremeier et al., Nature, 263, 52β

(1976)

leder et al., Science, 196,

(1977).

Weitere zur.Transförmierung von.E. coli geeignete Vektoren sind bei Sinsheimer, R. L., Ann. Rev. Biochem., 46, 415 (1977) beschrieben. Zur Transförmierung von B. subtillis geeignete Übertragungsvektoren sind von Iordanescu, S., J. Bacteriol., 124, 597 (1964) und Ehrlich, S. D., Proc. Ha ti. Acad. Sei. USA, 74, I68O (1977) beschrieben worden. Ein derartiger Vektor ist als Plasmid pC194 identifiziert worden. Hybridplasmide mit Gehalt an Hefe-DNS —sowohl Plasmid- als auch/oder chromosomaler DUS — und bakterieller DHS — allgemein E.coli Plasmid-DNS — werden zur Transformierung von Hefe verwendet. Derartige Plasmide sind von Beggs, J. D., Nature, 275, 104 (1978); Asiav,. C· L. und Carbon, J., Proc. Uati. Acad. Sei. USA 76, 3829 (1979); und Kingsman, A. K. et al., Gene 2» 141 (1979) beschrieben worden. Zu den Übertragungsvektoren, die zur Transformierung von Tierzellen in Gewebekultur verwendet werden können,

23 2 7 87 6 -

59 676 18/32/36

3.6.82

gehören das Adeno-defektive Virus, das SV-4O~defektive Virus und das Polyoma-Virus.

Unter Anwendung konventioneller Techniken wird die cDlS in einen Übertragungsvektor inseriert. Die cDNS wird gewöhnlich in irgendeine im Übertragungsvektor nur einmal existierende Restriktionsstelle inseriert. Charon 3A und 4A sowie auch Xgt WES · XB enthalten keine solchen einmaligen Stellen, für diese Vektoren werden demzufolge Restriktionsstellen von begrenzter Anzahl herangezogen. Die einmaligen Restriktionsstellen in den verschiedenen Übertragungsvektoren und die nutzbaren Restriktionsstellen in den Vektoren Charon 3A, 4A und X gt WES * /I B sind in Tabelle 2 aufgeführt. "'

Tabelle Übertragungsvektor Einmalige Restriktionsstellen

pscior

pMB9 pBR313

pBR315 pBR3i6 pBR322 PC194 Charon 16A Charon 3A Charon 4A X g"fc WES ·

EcoRi,. Hind III, Sal I, Bam HI, H^a I,

Sma I

EcoRi, Hind III, Sal I, Bam HI

EcoRi, Hind III, Sal I, Bam HI, H^a. I,

Sma I, Xma I

EcoRi, Hind III, Sal I, Bam HI, Pst I

Hind III, Sal I, Bam HI, Ps_t I.

EcoRI, Hind III, Sal I,,. Bam.",HI,^;, Tst I

Hind-III·--.. . ' — " ' — ' ^a=^T.

EcoRI, Sst I

EcoRI EcoRI

232787 6

- 15 - 59 676 18/32/36

3.6.82

Generell wird die cDITS zur Erleichterung der Selektion ineine innerhalb eines phänotypischen Merkmals gelegene Restriktionsstelle inseriert. So befinden sich beispielsweise Hind III, Sal I und Bam HI in pSC1O1, pMB9, pBR3i3, pBE3i5, pBR3i6 und pBR322 innerhalb des für Tetrazyklin-Widerstandsfähigkeit zuständigen Gens oder innerhalb dessen Kontrollregion. Die Einlagerung an dieser Stelle resultiert in einem Verlust an Tetrazyklin-Widerstandsfähigkeit. Die cDHS kann in dem Übertragungsvektor durch Anwendung von Restriktionsstellen-Verbindern oder durch Desoxynukleotid-Schwanzbildung inseriert werden. Bei der erstgenannten Methode kann ein synthetisches Hukleotid, welches eine Rekognitionsstelle für eine einzelne Restriktions-Endonuklease von der oben diskutierten Art enthält, am stumpfen Ende mit der eDUS verbunden werden* Die eDUS und der Übertragungsvektor werden separat mit der Restriktions-Endonuklease inkubiert und sodann gekühlt, um den die cDHS enthaltenden Übertra- . gungsvektor zu formieren· Bei der letztgenannten Methode kann die cDUS unter Verwendung eines Desoxynukleotids uncL_._ terminaler Transferase, wie sie von Roychoudhury, R. et al., lucl. Acids .Res., 2> 863 (1976) beschrieben wurden, zur 'Schwanzbildung gebracht werden. In der gleichen Vorgehensweise kann der Übertragungsvektor nach Verdauung mit einer Restriktions-Endonuklease bei Verwendung des komplementären Deso2cynukleotids zur Schwanzbildung gebracht werden· Der geschwänzte Übertragungsvektor und die geschwänzte cDHS werden dann gekühlt, um den cDNS-haltigen Übertragungsvektor zu formieren· So kann die cDHS beispielsweise dC-geschwänzt sein, und der Übertragungsvektor kann an der Pst-I-Stelle geöffnet und dG-geschwänzt sein.

Der cDUS-haltige Übertragungsvektor wird nun zur Transformierung eines geeigneten Wirtes verwendet. Zu den für die verschiedenen Übertragungsvektoren geeigneten Wirten gehören

3 2 7 8 7 6 -.16 - 59 676 18/32/36

3.6.82

E. coli, B. subtilis, Hefe, I. crassa und Tierzellen in Gewebekultur. Die zur Transformierung jedes dieser Wirte befähigten Übertragungsvektoren sind bereits oben beschrieben worden. Herkömmlicherweise werden drei mutante Stämme von E. coli verwendet. Es handelt sich hierbei um- X. 1776, REI und HB1O1, E. coli % 1776 ist bei Curtis, R., Ann. Rev,-Microbiol. 30, 507 (1976) und im US-PS Hr. 4 190 495 be- . schrieben worden. E. coli RRI ist von Dugaiczyk, A., et al., Molecular Mechanisma in Control of Gene Expression auf Seite 543 beschrieben worden. E. coli HB101 schließlich ist bei Kedes, D. H. und Thomas, C* A., Proc. Hatl. Acad. Sei. USA 73« 1537 (1976) beschrieben worden. Die geeigneten Wirte werden vermittels herkömmlicher Techniken transformiert. Beispielsweise wird E. coli χ, 1776 durch den von Cooke, U.E. et al., J. Biol. Chenu, 255, 6502 (1980) beschriebenen cDNS-haltigen Übertragungsvek'tor transformiert. Ebenfalls durch konventionelle Techniken werden Kolonien selektiert und/oder einem Screening unterworfen. So können Kolonien beispielsweise auf der Basis des Verlustes von einem phänotypischen Merkmal wie etwa der-JTetraiayklin-Widerstandsfähigkeit selektiert werden. Das Screening der Kolonien kann (1) durch Beseitigen der cDNS durch eine geeignete Restriktions-Endonuklease sowie Analyse mittels Elektrophorese und Hybridisation (Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98,.503.(1975) oder (2) durch Verdoppeln in der von Grunstein, M, und Hogness, D. S., Proc. ITati. Acad. Sei. USA 72« 3961 (1975) beschriebenen Weise und Hybridisierung mit einem geeigneten Problem oder aber (3) durch Prüfung der Kolonien direkt hinsichtlich ihrer Darstellung mittels Radioimmunoasseay oder anderer Techniken vorgenommen werden.

Die als pLaS1 und pLaS2 bezeichneten DUS's werden in Bakterien dargestellt, um entweder Fusionsproteine zu erbringen,

*ί ? 7 fi 7 6 " ¹⁷ " 59 676 18/32/36

3.6.82

welche die durch die eingelagerten Sequenzen codierten Peptide oder aber die Peptide selbst enthalten. Verschiedene mögliche Techniken stehen zur Wahl; sie können beinhalten

(a) die Modifikation der codierenden Sequenzen zwecks Erlangung eines genau erwünschten übertragenden Startpunktes;

(b) die Selektion oder Konstruktion eines optimalen Expressionsvektors und (c) die nach der Übertragung erfolgende Bearbeitung entweder durch Ausnutzung der in-vivo-Bearbeitungsaktivität des Wirtes oder in vitro durch chemische Mittel.

Wo ein Fusionsprotein hervorgebracht wird, wird die Modifikation der geklonten ITukleotidsequenz im allgemeinen solange unnötig sein, solange die resultierende Sequenz die Tra-nslation der Einfügung im richtigen Ableserähmen ermöglicht und keine Stop-Kodone vor dem Anfangskodon der inserierten Sequenz intervenieren. Sowohl S1 als auch S2 können bequem als Fusionsproteine mit anschließender in-vitro-Bearbeitung nach der Translation dargestellt werden, da beide durch das Dipeptid arg-lys mit dem Rest der_ Pro-S1- oder Pro-S2-Sequenzen gebunden sind. Eine solche Sequenz ist insbesondere für tryptische Hydrolyse empfänglich. Sowohl S1 als auch S2 werden durch teilweise tryptische Verdauung leicht von ihren entsprechenden Vorläufern freigesetzt.

Präpro S1 und Präpro S2 werden als Fusionsproteine durch Insertion in geeignete Stellen innerhalb ausgeprägter Operons dargestellt, so etwa unter Einbeziehung der Pst-I-Stelle im ß-Laktamase-Gen von pBR322 (Villa-Komaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 7£, 3727 (1978)), der EcoRI-Stelle von pBR322, die die Lack-Kontrollregion und ß-Galaktosidase codierende Sequenz trägt (Itakura, K. et al., Science, 198,

232787 6

18 - 59 676 18/32/36

3.6.82

1056 (1979)) oder auch der Hind-III-Stelle des trpD-^ens von Plasmid ptrpED50 (Martial, J. et al., Science, ,205, (1979)).

Modifikationen der Sequenzlänge durch ein oder zwei Hukleotide zwecks Erreichung der korrekten Ablesungsphase sind im Fachgebiet weithin bekannt« Einfügungen an der Pst-I-Stelle von pBR322 mit dem Ziel der Schwanzbildung kommen mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 : 6 in korrektem Phasenzustand und. Ableserahmen vor·

Pro S1 und Pro S2 werden in vitro aus Fusionsproteinen hergestellt, die einer spezifischen Spaltung zugänglich sind.· Die geklonten UukleοtidSequenzen werden modifiziert,_: um jene Aminosäuresequenzen zu codieren, welche die Spezifität für ein proteolytisches Enzym erbringen. Eine dafür geeignete Sequenz'ist"AspAspAspAspLys, die vorzugsweise durch das Enzym Enterokinase gespalten wird. Hierzu liegt die Beschreibung· in der Anmeldungsschrift der Serien-Nr. 125 878 vom 29· Februar 1980 vor. Wie· dort ausgeführt, wird eine die obengenannte Aminosäuresequenz codierende koppelnde Sukleotidsequenz nächst der den erwünschten Aminoterminus von Pro S1 oder Pro S2 codierenden lukleotidsequenz inseriert.

Eine solche Insertion erfordert die Modifikation von plaSi oder pIaS2 durch Entfernen von Uukleotiden auf dem 3^f-Ende der Pro-S1- oder Pro-S2-codierenden Sequenz. Dies erfolgt entweder durch kontrollierte Verdauung des 3'-Endes der Einfügung mittels 3'-Endonuklease oder T4-DB"S-Polymerase, oder aber durch die Kombination von Restriktions-Endonukleasespaltung an einem Punkt an der 5'-Seite des gewünschten Startpunktes gemeinsam mit chemischer Synthese zum Zwecke der

232787 6

-¹⁹- f;lt ^18/32/36

Wiederherstellung jenes so entfernten Teiles der gewünschten Sequenz. Die kontrollierte Verdauung wird am besten unter Einsatz von T4-Polymerase durchgeführt, welche - bei Abwesenheit zugefügter Deso:xynukleotid-Trophophate - die 3'..»5^rexonukleolytische Verdauung von doppelstrangiger DUS katalysiert (Englund, P. T., J. Biol. Chem., 246, 3269 (1971)). Das Ausmaß der Verdauung wird durch die Auswahl von geeigneter Temperatur, Reaktionszeit und Enzymmenge in Anlehnung an die im Fachgebiet wohlbekannten Grundsätze gesteuert.

In jedem Falle wird ein versuchsweises Vorgehen erforderlich sein, da für jeden Enzymposten und für jede zu modifizierende DUS die optimalen Reaktionsbedingungen bestimmt werden müssen. Auf diese Weise kann das Ausmaß der Verdauung gesteuert werden. Das;Beenden der Verdauung an einem vorher festgelegten Haltepunkt wird durch Einbeziehen eines einzelnen, mit dem gewünschten Haltepunkt korrespondierenden Desoxynukleotid-Triphosphats in das Reaktionsgemisch bewerkstelligt. In Anwesenheit von dATP beispielsweise wird die DIiS 3'»..5' verdaut, bis die Polymerase einen dA-Rest und damit einen Punkt erreicht, an welchem e'ine weitere Uettoverdauung endet. Zur Konstruktion von DBS-Molekülen mit einem vorher festgelegten Endpunkt können nacheinander verschiedene Verdauungszyklen - jeder mit seinem vorbestimmten Haltepunkt - durchgeführt werden. Die exonukleolytische Verdauung mit T4-Polymerase beeinflußt lediglich die Stränge mit 3'-Termini. Die komplementären Stränge verbleiben als unpaarige einstrangige Schwänze, welche ebenfalls entfernt werden müssen. Pur diesen Zweck ist S1-luklease das bevorzugte Enzym_o Das Produkt der kombinierten Behandlung mit T4-Polymerase und S1-Buklease ist stumpfendende, doppeistrangige DIiS. Die chemische Synthese von Desoxynukleotidsequenzen zum Ersetzen von Segmenten,

23 2 7 87 6 - 2o -.r 59 ^e 19/32/36

3.6.82

die durch Restriktions-Endonukleaseverdauung gespalten wurden, erfolgt beispielsweise in der von Itakura, K. et al., J, Biol. Chem. _t 250, 4592 (1975) und Itakura, K. et al., J. Am« Chem« Soc, 97,. 7327 (1975) beschriebenen Weise.

Präpro S1 und Präpro S2 werden in ähnlicher Art synthetisiert, wobei sie anfänglich als Fusionsproteine erscheinen.

Durch Yerwendung geeigneter Expressions-Übertragungsvektoren werden die Somatostatine der vorliegenden Erfindung auch direkt dargestellt, d. h. nicht ah irgendein prokaryotisches Protein angeschmolzen. Im allgemeinen ist es notwendig, die geklonten Einfügungen - ρIaS1 und plaS2 - zu modifizieren, um die dem gewünschten Startpunkt vorgelagerte, nicht durch Translation gekennzeichnete 5'-Segion zu beseitigen. In den Fällen, in denen Präpro S1 und Präpro S2 die primären Expressionsprodukte sind, werden die anderen Somatostatine von ihnen gewonnen. ;

Das der direkten· Darstellung-— zugrundeliegende"""Frihzip besteht darin, daß das inserierte DNS-Segment vollständig ,jenes codierende Segment ersetzt, welches normalerweise durch die bakterielle Kontrollregion transkribiert und übersetzt .wird. Die zu bewahrende essentielle Komponente der Kontrollregion wird als Expressionseinheit bezeichnet. Die Expressionseinheit umfaßt einen Promotor und eine zum Wirken im Wirtsorganismus befähigte ribosomale Bindungsstelle. In praktischer Hinsicht ist es nicht erforderlich, die den Wirtsanteil des Fusionsproteins codierenden lukleotide übergenau zu beseitigen. Die Beziehung zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Startkodon (AÜG) ist solcherart, daß der Startkodon irgendwo innerhalb der 3 bis 11 Eukleotide der robosomalen

23 2 7 8 7 6 -²¹ - 59 67618/32/36

3.ο.82

Bindungsstelle angesiedelt werden kann (Shine et al., Proc. Hat..Acad. Sei,- USA, Jl> 1342 (1974); Steitz, J. et al., Proc. lat. Acad. Sei.. USA, 21, 4734 (1975). In dieser 3...11-Hukleotidregion setzt das zuerst angetroffene AUG den Ableserahmen für die Translation. Im Falle des vom oben beschriebenen ptrp_E5O abgeleiteten p.trpE3Q, das den Operator, Promotor, Attenuator und die Ribosom-Bindungssequenzen des Tryptophan-Operons gemeinsam mit der Uukleotidsequenz enthält, welche sieben Aminosäuren des trpE-Proteins mit anschließender Hind-III-Stelle codiert, schafft die Entfernung eines Minimums von 23·..29 Uukleotiden von der Hind-Sll-Stelle einen Platz für die Insertion in eine Expressionseinheit unter Tryptophan-Operonkontrolle.

Für die direkte Darstellung von Präpro S1 beispielsweise wird die originale cDHS-Einfügung in oben beschriebener Weise modifiziert, um die unübersetzte 5'-Region zu entfernen. Ein Vektor für die direkte Darstellung kann durch Modifikation von ptrpE3O konstruiert werden, indem die 23...29-Nukleotide unter Verwendung von T4-D¥3-Polymerase und ,S1-Iuklease in der oben beschriebenen Y/eise entfernt werden. Eine die Restriktionssequenz für Bam HI-Endonuklease enthaltende Verbinder-Uukleotidsequenz wird stumpfendig durch die von Valenzuela et al. (siehe oben) beschriebene Vorgehensweise sowohl mit der modifizierten cDlS-Einfügung als auch mit dem modifizierten ptrpE3Q verbunden. Dies erfolgt zur Erleichterung der Insertion, welche im wesentlichen in der von Ullrich, A. et al., Science, 196, 1313 (1977) beschriebenen Weise vorgenommen wird. Geeignete Wirte wie etwa E. coli HB1O1, RRI oder X 1776 oder andere Bakterien werden durch jene rekombinanten Vektoren transformiert, welche die inserierte Präpro-ST-codierende Region tragen· Transforman-

232787 6 ~²²- ^{39 676 is/32/36}

3.6.82

ten werden hinsichtlich ihrer Widerstandsfähigkeit gegen- , über Ampicillin aasgewählt und dann unter Bedingungen angezogen, die für die Ausbildung von Präpro S1 günstig sind.

Präpro 31 und Präpro S2 werden durch Entfernen der ET-terminal en Sequenz der signalpeptidhaltigen hydrophoben Aminosäuren zu Pro S1 bzw. Pro S2 umgewandelt. Die in-vitro-Beseitigung des Signalpeptids erfolgt durch Behandlung des aus transformierten, induzierten Zellen extrahierten Proteins mit einer Präparation von "rohen" Mikrosomen, wie sie von Jackson, E. C, Bio bei·,. G. ,-Proc. Hat. Acad. Sei. USA, 74, 5598 (1977) beschrieben wurde. Die in-vivo-Beseitung des Signalpeptids kann während der direkten bakteriellen Ausbildung der Präpro S1— oder Präpro S2-codierenden Sequenz vorkommen· Bakterielle und von Säugern stammende Signalpeptide weisen Sequenzähnlichkeiten auf. Proteine mit Säuger-Signalpeptiden können durch bakterielle Zellen bearbeitet werden; dies resultiert in einer Exkretion des Propeptids (in diesem 3?alle Pro S1) in den periplasmatischen Raum oder in das Medium. Dieses Auftreten einer derartigen-bakteriellen Bearbeitung ist durch Beobachten des Auftretens eines Proteins im Medium oder periplasmatischen Raum induzierter Zellen nachzuweisen; in nicht induzierten Zellen war es wie Messungen mit Hilfe des Inkorporierens einer radioaktiven Aminosäure oder mittels Radioimmunoassay ergaben - nicht nachweisbar.

S1 und S2 selbst können - wie bereits weiter oben beschrieben - durch tryptische Verdauung sowohl von Präpro S1 als auch von Pro S1 bzw. von Präpro S2 oder Pro S2 hergestellt werden. In dieser Weise können sowohl Extrakte ganzer Zellen als auch teilweise gereinigte Proteinpräparationen behandelt werden, um S1- oder S2-Erträge zu erbringen.

O O 07 Q -7 C """ 5967618/32/36

27 8/ 6 3.6.82

Präpro S1, Pro S1, S1, Präpro S2, Pro S2 und S2, in der beschriebenen Weise synthetisiert, werden durch bekannte Techniken wie beispielsweise Gelfiltration, Ionenaustausch-Chromatografie, Affinitäts-Chromatografie und Differential-Lö'slichkeitstechniken gereinigt. Die Aminosäuresequenz en werden durch herkömmliche Methoden der Aminosäuresequenz-Analyse erhärtet·

Die in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendeten gereinigten Enzyme sind gegenwärtig über kommerzielle Quellen zu beziehen. Restriktions-Endonukleasen, ihre Nomenklatur und Stellen-Spezifität sind im einzelnen von Roberts, R., CrIt. Rev. Bioehem., 4-, 123 (1976) beschrieben worden. Die im hier beschriebenen Verfahren eingesetzten Restriktionsenzyme wurden von Hew England BioLabs, Beverly, Massachusetts bezogen und in Mengen bzw. unter Reaktionsbedingungen angewendet, die vom Hersteller für jedes Enzym spezifiziert wor-. den waren» Umgekehrte Transkriptase wurde durch Dr. J. Beard, Life Sciences, Inc. St. Petersburg, Florida geliefert. DlJS-Polymerase I und T4-Polynukleotidkihase wurden von Hew England Biolabs, Beverly, Massachusetts bereitgestellt. Mikrokokken-S1-Huklease lieferte Miles Laboratories, Elkhart, Indiane. Bakterielle basische Phosphatase wurde über Worthing ton Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, beschafft.

Ausführungsbe ispieI

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

ΊΙ ? 7 R 7 fi - 24 - 59 676 18/32/36

Ausführungsbeispiel 1

Synthese von cDUS. Mit Hilfe der Guanidin-Thiozyanat-Methode - Chirgwin et al.,. Biochemistry, 2A₃ 5194 (1979) - wurde RITS aus Anglerfisch-Brockmann-Körpern extrahiert; die Brockmann-Körper stellte Biological Associates, Portland, Maine, zur Verfügung. Ein Gramm Gewebe der Brockmann-Körper, ergab eine Ausbeute von annähernd 6,5 mg Gesamt-RHS. PoIyadenylierte RUS wurde unter Anwendung der Oligo-dT-Zellulose-Affinitätschromatografie gereinigt (Aviv, H. et al., Proc. Hat. Acad. Sei. USA, 69, 1409 (1972)). Unter Verwendung von umgekehrter Transkriptase (Charge Hr. 1577) wurden aus 10 /Ug plyadenylierter RUS 1,3 /Ug einstrangiger cDUS hergestellt, wobei das folgende Reaktionsgemisch von 200 ,ul Yolumen eingesetzt wurde: 40 mM tris-HCl, pH 8,3, 10 ml MgCl_?, 56 mM ß-Merkaptoethanol, 0,5 mM dATP, dGTP, dTTP, 0,15 mM H-dCTP (sp. Act. 5,2 mCi//Ug/ml polyadenylierte RUS, 15 Einheiten umgekehrte Transkriptase /ug RNS. Das Inkubieren erfolgte 30 min lang bei 40 ⁰C und anschließend 2 min bei. 68 ⁰C. Die Reaktion wurde durch Zusetzen von HaEDTA (pH 8,0) zu 20 mM gestoppt,, sodann wurde die Reaktionsmischung über G-75 Sephadex (Handelsmarke) chromatografiert. Die DHS-haltige Fraktion wurde mit Ethanol ausgefällt. RHS wurde durch Alkalibehandlung (0,2 M HaOH, 23 min bei 68 ⁰C) beseitigt, und der:zweite cDHS-Strang wurde:im nachstehenden ,Reaktionsgemisch unter Einsatz von DHS-Polymerase I ausgeführt: 100 mM Ha HEPES pH 6,9, 75 mM KCl, 10 mM igClg, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 100 mM von jedem der vier Desoxynukleotid-Triphosphate, 0,8 /Ug/ml einstrangiger cDHS (kurz vor dem Zusetzen 3 min gekocht), und 75 Einheiten E.coli-DHS-Polymerase I//Ug DHS. Die Inkubation erfolgte bei 14 ⁰C über 2 Stunden hinweg. Als Reaktionsvolumen wurden 20 mM HaEDTA hergestellt, einmal mit Phenolchloroformisoamyl-Alkohol

23 2 7 87 6 -25- 5967018/32/36

3·6,82

(50 : 48 : 2 auf Volumen bezogen) extrahiert und über eine G-75 Sephadex-Säule geleitet. Bei der Präparierung für die dC-Schwanzbildung wurden die Haarnadelschleifen der doppelstrangigen DHS (ds-cDUS) gestutzt und mittels 31 Mikrokokken-Huklease stumpfendig gemacht. Die S1-Verdauung wurde bei 37 ⁰C über 30 min hinweg in 100 /ul Reaktionsvolumen durchgeführt, welches 0,3 M UaCl, 0,03 M NaOAc, 3 mM ZnCl₂, (pH 4,5) und 175 S1-Einheiten//ug ds-cDHS enthielt· lach der organischen Extraktion und der G-75 Sephadex-Chromatografie zwecks Entfernung kleiner DITS-Fragment e wurden 300 ng gestutzter ds-cDUS unter Verwendung von terminaler Transferase (Kälberthymus) in einer 30-minütigen Reaktion bei 37 ⁰C der Schwanzbildung ausgesetzt, wobei das Reaktionsgemisch 140 mM Kaliumkakodylat, 30 mM tris-Base (pH 7,8), 1 mM CoCl₂, 0,1 mM DTT, 25 M dCTP ( cC ³²P-dCTP, 8,36 ,uCi/nMol) und Einheiten terminaler Transferase/,ug ds-cDlTS enthielt. Die. Schwanzbildungsreaktion ist allgemein bei Roychoudhury, R,, et al·, lud. Acids Res.., 3, 101 (1976) beschrieben. Vorangegangene Untersuchungen hatten gezeigt, daß unter diesen Bedingungen dem 3'-Ende annähernd 30 Basen zugesetzt γ/erden· Das Plasmid pBR322 wurde durch Pst-I-Endonuklease gespalten und unter Anwendung der oben beschriebenen Schwanzbildungsreaktion mit dG-Schwänzen versehen, wobei allerdings statt dCTP dGTP zum Einsatz kam und keine radioaktive Markierung erfolgte. Äquimolare Mengen von dC-geschwänzter cDlS und dG-geschwänztem pBR322 wurden bei einer Konzentration von 1 /Ug/ml gekühlt; hierfür wurden zweistündige aufeinanderfolgende Inkubationen bei 42 ⁰C, 30 ⁰C und 14 ⁰C (36) gewählt. Die Hybridplasmid-DiTS wurde mit Ethanol ausgefällt, sodann zum Transformieren von E. coli TC 1776 verwendet und hinsichtlich ihrer Tetrazyklin-Widerstandsfähigkeit selektiert. Um mit verschiedenen markierten Sonden auslesen zu können,

2787

- 26 - 59 676 18/32/36

3.6.82

wurden auf Whatman-541-Zellulosepapier rekombinante- Kolonien angebaut, in situ lysiert und entsprechend der von Grunstein et al*, Proc. Hat.. Acad. Sei.-USA, 72, 3961 (1975) beschriebenen Yorgehensweise für die Hybridisierung vorbereitet. Die PiIter wurden an eine ^J P-markierte cDHS-Sonde hybridisiert, welche aus polyS+RUS vom Anglerfisch-Brockmann-Körper synthetisiert worden war. Unter Anwendung einer von Staudenbauer, W. I., Mol. Gen. Genet., 145, 273 (1976) beschriebenen Vorgehensweise wurde aus jenen Kolonien Plasmid-DETS isoliert, die ein starkes- autoradiografisches Signal gab» Auf der.Basis,ihrer mittels Gel-Elektrophorese-gemessenen Größen wurden verschiedene Plasmide selektiert, ihre cDNS-Einfügungen wurden mittels präparativer Akrylamidgel-Elektrophorese gereinigt. Gereinigte Einlagerungs-cDHS aus diesen Plasmiden wurde mittels, Einschnitt-Translation markiert und mit anderen gereinigten cDHS'n in parrweisen Kombinationen hybridisiert. Auf,diese Weise konnten die Einlagerungen in,, eine Anzahl nicht über Kreuz hybridisierender Gruppen unterteilt und ihre relative Häufigkeit abgeschätzt werden. Die unter den in der beschriebenen Weise selektierten Kolonien am häufigsten auftretende Einlagerung codierte - wie sich durch Hukleotid-Sequenzanalyse zeigte - Pisch-Präproinsulin. Zwei zusätzliche Gruppen wurden analysiert, und spezifische Einlagerungen - als plaSI und ρIaS2 bezeichnet - wurden zur Analyse ausgewählt.

Die zwei ausgewählten Einlagerungen wurden analysiert, um mittels der von Alwine et al., Proc. Hat. Acad. Sei. USA, 74» 5350 (1977) beschriebenen Methode die für jede Einlagerung spezifische korrespondierende mKETS hinsichtlich ihrer Größe abschätzen zu können. Die Methode erforderte die Hybridisation an Anglerfisch polyadenylierte RlS, welche vorher

23 2 7 87 δ "²⁷" " "Ii ^18/32/36

J,OmOd

auf einem 2 %igen Agarose-Methylquecksilber-Gel (Bailey, J, et al., Anal, Biochem., 70.» 75 (1976) chroma to grafi er t und auf diazotiertes Zellulosepapier (Alwine, Jr. et al., siehe oben) übertragen worden war. Die Hybridisierung erfolgte bei 42 ⁰C über 48 Stunden hinweg. Die hybridisierten Pasern wurden nach dreimaligem Waschen (100 ml Volumen, je 10 min) in 0,3 M UaOl, 0,03 M UaZitrat, 0,1 % (M/V) SDS bei 20 ⁰C autoradiografiert, daran anschließend wurde.der gleiche Vorgang unter Einsatz von 5 mM IaCl, 1,5 ml laZitrat 0,1 % SDS bei 50 ⁰C wiederholt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt. Gasse 1: Hind III verdaute X-DlS und Hae III verdaute φ 1174 DUS Molekularmassestandards; Gasse 2: Ethidiumbromid-Färbung von Anglerfisch-Brockmann-Körper (1 /Ug polyadenylierte RUS); Gasse 3: Hybridisation von übertrage-

3?

ner Anglerfisch-polyS+ an ρLaS1 P Einlagerung DNS; Gasse 4:

Hybridisation von übertragener Anglerfisch-polyS+ RUS an pLaS2 ³²P Einlagerung DUS.

Aus den Daten in Abbildung 1 -ist zu ersehen, daß sowohl pLaSi als auch pLaS2 insbesondere an mRUS'n von annähernd 700 Basen hybridisieren; dies korrespondierend mit der Größe einer Hauptklasse von polyadenylierter mHUS,. die im Brockmann-KÖrper gefunden wurde. Mit Hilfe einer ähnlichen Analyse konnte gezeigt werden, daß die__-andere hauptsächliche polyadenylierte mEEiS von 840 Basen mit Einlagerungen korrespondiert, welche Präproinsulin codieren,

Ausführungsbeispiel 2

Die Desoxynukleotidsequenzen von pLaS1 -und ρLaS2 wurden unter Anwendung der Methode von Maxam, *A. et al. (Proc. Hat, Acad. Sei. USA, 74, 560, (1977)) analysiert. In Abbildung 3 sind

232787 6-

28 - I 59 676 18/32/36

3.6.82

die Ribonukleotidsequenzen gemeinsam mit jenen korrespondierenden vorhergesagten Aminosäuresequenzen dargestellt, die durch die "Smpfindungs"-Stränge der DUS, d. h· die sequentiell mit den entsprechenden mRIfS'n korrespondierenden Stränge codiert werden. Die Desosynukleotidsequenz des Empfindungsstranges ist identisch mit der Ausnahme, dal3 U durch T ersetzt wird· Der korrekte Ableserahmen wird an einem Fehlen von Terminationskodonen über einen beträchtlichen Anteil der Einlagerung hinweg wiedererkannt; im Falle von pLaS1 darüber hinaus auch noch durch den Umstand, daß er S1 in der richtigen Weise codiert. Die Nummerierung der Amihosäurepositionen erfolgt mit der amino—terminalen Aminosäure von S1 beginnend und in der positiven Richtung fortsetzend bis zum Karboxy-terminalen Ende von S1; in der negativen Richtung läuft die Nummerierung bis zum ersten_:;AUG-Kodon (Position -107), vorausgesetzt, daß es sich dabei um den Punkt der Translationsinitiation handelt.

Beginnend mit dem ersten AUG-Kodon am 5'-Ende des Empfindungsstranges sagt die Translation von pLaSi die Sequenz eines 121-Aminosäurepeptids voraus, welches die SI-Aminosäuresequenz an seinem Karboxy-Terminus enthält« Das 121-Aminosäurepeptid ist ein bisher noch nicht beschriebenes, im vorliegenden Text als Präpro S1 bezeichnetes Somatostatin mit einer relativen Molekülmasse von 13 328.

Unsere Befunde deuten darauf hin,, daß- gemeinsam mit vielen anderen Hormonen - die Synthese von S1 eine nach der Translation erfolgende Umsetzung mit einschloß. Die Translation von Somatostatin-mKIS ergibt einen Vorläufer (Präpro S1), welcher ein Signalpeptid enthält,, das während des Transits in das endoplasmatis.che Retikulum freigesetzt werden kann. Der daraus resultierende Vorläufer (Pro S1) wird, daraufhin ge-

232787 6

- 29 - 59 676 18/32/36

3.6.82

spalten, um das eigentliche S1 zu erbringen· Analog zu anderen Signalpeptiden und insbesondere analog zu jenem von Anglerfisch-Insulin - mit dem es die Sequenzhomologie gemeinsam hat - ist der Präpeptidanteil von Präpro S1 wahrscheinlich ungefähr 20...25 Basen lang. STach Entfernen des Signalpeptids würde das daraus hervorgehende Pro-51-Molekül dann annähernd 96...101 Aminosäurereste und eine relative Molekülmasse von ungefähr 9 000 aufweisen. Pro S1 ist mehr als fünfmal größer als Somatostatine

Die pLaS2-Desoxynukleotidsequenz wurde auf eine Weise analysiert, die der für pLaSi beschriebenen ähnelte.

Die Translation von pIaS2 sagt die Sequenz eines 125-Aminosäurepeptids voraus, welches überraschenderweise an seinem Karboxy-Terminus eine 14-Aminosäuresequenz enthält, die sich von S1 um nur zwei Aminosäuren unterscheidet. Diese Sequenz wird im vorliegenden Text als Somatostatin 2 (S2) bezeichnet. Innerhalb der vollen Sequenz sind daher drei neuartige Somatostatine enthalten: S2, Pro S2 und Präpro S2. Die vorausgesagten relativen Molekülmassen von Präpro S2 und Pro S2 betragen 14 100 bzw· 11 600. Abbildung 3 veranschaulicht die entsprechenden Ribonukleotid- und Aminosäuresequenzen von pIaS2. Die Desosynukleotidsequenz ist identisch mit Ausnahme dessen, daß U durch T ersetzt wird.

Ausführungsbeispiel 3

(A) Ausführungsbeispiel 1 wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 Plasmid pBR3i5 verwendet wird. Alle Bedingungen einschließlich der Selektion der rekombinanten Klone entsprechen der bereits gegebenen Beschreibung. Die

2 3 2 7 8 7 6 ~³⁰ ~ ^{59 δ7δ 18/32/36}

3.6.82

Einlagerungen werden entfernt und gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 2 analysiert. Als .Ausbeute werden DITS'η von etwa 700 Basenpaaren mit den in Abbildung 3 gezeigten Sequenzen gewonnen·

(B) Ausführungsbeispiel 1 wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 Plasmid pBR3i6 verwendet wird. Alle Bedingungen sind mit den in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen identisch» Die Beseitigung und Analyse der Einlagerungen gemäß Ausführungsbeispiel 2 erbringt DHS¹ η mit den in Abbildung 3 gezeigten. Sequenzen·

Ausfuhrungabeispiel 4

Pur dieses Ausführungsbeispiel wird die cDlS nach der im Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt. Alle in diesem und den folgenden Ausführungsbeispielen verwendeten Restriktionsstellen-Verbinder werden nach der von Scheller, R. Ξ· et al. (Science 196, 177 (1977)) beschriebenen Methode zubereitet· Die in diesem und den folgenden Ausführungsbeispielen verwendeten Restriktions-Endonukleasen sind im Handelsverkehr von lew England Biolabs, Beverly, Massachusetts, zu beziehen; die gewählten optischen Bedingungen richten sich nach den Empfehlungen der Hersteller, Die Transformation von E. coli % 1776 erfolgt in der;ln:Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise.

(A) Hind~II!-Verbinder mit der Sequenz 5'-GCAAGCTTGG - 3' werden der in Ausführungsbeispiel 1 hergestellten cDlS durch stumpfendige Ligation unter Einsatz von T4-DlS-Ligase verbunden, wie dies von Valenzuela, P. et al., latüre, 280, (1979) beschrieben worden ist. lach der Ligation wird das

7 ft? 6 - 31 - 59 676 18/32/36 i ° ' 3.6.82

Produkt mit Hind III oder Hsu I.entsprechend der von Ullrich, A. et al., Science 196, 1313 (1977) beschriebenen "Vorgehensweise verdaut. Ebenfalls nach der von Ullrich, A. et al. (siehe oben) beschriebenen Vorgehensweise wird Plasmid pBR322 an der Hind-III-Restriktionssteile entweder mit Hind III oder Hsu I gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt. IJach der Ethanolausfällung wird das phosphatasebehandelte gespaltene pBR322 der kohäsive Hind-III-Termini enthaltenden cDITS gemäß Beschreibung von Ullrich, A. et al., (siehe oben) verbunden. E« coli % M7& wird mit dem Ligationsgemisch transformiert, und die transformierten Kolonien werden hinsichtlich ihrer Tetrazyklin-Widerstandsfähigkeit selektiert. Das Vorhandensein von geklönter DNS wird entsprechend der Beschreibung in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt. Ebenfalls gemäß Beschreibung in AusführungsbeispieI 1 werden jene Kolonien ausgelesen, die Einlagerungen enthalten. Die Einlagerungen werden durch Verdauung mit Hind III oder Hsul beseitigt und gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 2 analysiert. Die Einlagerungen enthalten etwa 700 Basenpaare _und_weisen__di_e _in Abbildung 3 dargestellten Sequenzen auf.

(B) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei anstelle von pBR322 verschiedene Vektoren verwendet werden. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel werden die Plasmide pSC101, pMB9, pBR3i3, pBR3i5 und pBR3i6 anstelle von pBR322 verwendet· Alle Bedingungen einschließlich der Selektion von rekombinanten Klonen entsprechen der in (A) gegebenen Beschreibung. Für alle Plasmide werden identische Ergebnisse erzielt, d. tu in jedem Falle werden rekombinante Plasmide gewonnen, welche Einlagerungen mit den in Abbildung 3 gezeigten Sequenzen aufweisen.»

(C) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei verschiedene andere Restriktionsstellen-Verbinder und Restrik-

9 Λ Ο 7 ft 7 6 - 32 - 59 676 13/32/36

3.6.82

tions-Endonukleasen.verwendet werden. In diesem Ausführungsbeispiel werden anstelle der Verbinder für Hind III die Verbinder für Sal I und Bam HI eingesetzt. Die Sequenzen dieser Verbinder sind 5' - GGTCGACC- 3¹ und 5' - CCGGATCCGG 3'. Werden SaI-!-Verbinder eingesetzt, dann werden die verbind erbehandelte cDITS und pBR322 mit Restriktions-Endonuklease"" Sal" I gespalten; werden Bam-HI-Verbinder eingesetzt, dann ist die Restriktions-Endonuklease Bam HI. Alle Bedingungen einschließlich der Selektion von rekombinanten Klonen entsprechen der in Ausführungsbeispiel 4(A) gegebenen Beschreibung, Pur beide Verbinder und Restriktions-Endonukleasen werden identische Ergebnisse gewonnen·

(D) Ausführungsbeispiel 4(C) wird wiederholt, wobei,ansteile von Plasmid pBR322 die Plasmide pSC1O1, pMB9» pBR3i3, pBR315 und pBR3i6 verwendet werden. Alle Bedingungen entsprechen den in Ausführungsbeispiel 4(C) beschriebenen; eswerden identische Resultate erzielt, d. h· in jedem Falle werden Einlagerungen gewönne, welche die in Abbildung 3 gezeigten Sequenzen aufweisen.

(E) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei ein Eco-RI-Restriktionsverbinder mit der Sequenz 5' - CCGAATTCGG 3^! anstelle des Hind-Ill-Verbinders sowie Ecο RI anstelle von Hind III (Hsu I) verwendet wird· Alle Bedingungen sind mit den bereits beschriebenen identisch, mit Ausnahme dessen, daß die transformierten Kolonien nicht hinsichtlich Tetrazyklin-Widerstandsfahigkeit selektiert werden. Das Vorhandensein von geklönter DUS wird in der in Alisführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise erreicht. Gewonnen werden rekombinante Klone, die Einlagerungen mit den in Abbildung 3 gezeigten. Sequenzen aufweisen.

O O O 7 Q 7 R * ³³ - ⁵⁹ "^{δ 18/32/36}

23 Z / o / ο 3.6.82

(P) Ausführungsbeispiel 4(2) wird wiederholt, wobei anstelle τοπ Plasmid pBR322 die Plasmide pSGIOr, pMB9,· pBR3i3 und pBR315 verwendet werden. Beibehalten werden die in Ausführungsbeispiel 4(E.) beschriebenen Bedingungen; für jedes Plasmid werden identische Resultate erzielt.

(G) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei ein pst-I-Restriktionsverbinder mit der Sequenz 5* - GCTGGAGG 3^f und Pst I anstelle des Hind-III-Verbinders bzw. Hind III (Hsu I) eingesetzt werden. Die gleichen Bedingungen werden beibehalten mit der Ausnahme, daß die Selektion rekombinanter Klone in der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise νorgenommen wird. Gewonnen werden rekombinante Klone mit der in Abbildung 3 dargestellten Sequenz.

(H) Ausführungsbeispiel 4(G)' wird wiederholt, wobei anstelle von pBR322 die.Plasmide pBR315 und pBR3i6 verwendet werden. Es werden die gleichen Bedingungen wie in Ausführungsbeispiel 4(G) beibehalten und identische Resultate erzielt.

(I) Die AusführungsbeispieIe 1, 3(A), 3(B) und 4(A)...(H) werden wiederholt, wobei E. coli RRI oder E. coll HB1O1 anstelle von E. coll ^, 1776 verwendet werden. Alle Bedingungen entsprechen der bereits gegebenen Beschreibung; es werden identische Ergebnisse erzielt.

Ausführungsbeispiel 5

Bei diesem Ausführungsbeispiel wird die cDUS wie in Ausführungsbeispiel 1 hergestellt. Eco-RI-Restriktionsstellenverbinder werden gemäß der von Yalenzuela, P. et al. (siehe oben) beschriebenen Vorgehensweise sttunpfendig an die cDHS'

20 O *7 0 ¹T C - 34 - 59 676 18/32/36 O L I Q I 0 3.6.32

angelagert und entsprechend der Beschreibung von Ullrich, A. et al. (siehe oben) mit Eco RI gespalten.

(A) In der von Blattner et al« (siehe oben) beschriebenen Weise hergestellte Charon-16-DITS wird als Übertragungsvektor verwendet« Die kohäsiven Enden werden durch 60-minütige Inkubation bei 42 ⁰G in 0,-1-MTris-HCl (pH 8,0) und 10 mm MgCl₀ gekühlt. Der Vektor wird an der Eco-RI-Endonuklease gespalten und dann in der von Ullrich, A. et al. (siehe oben) beschriebenen Weise mit alkalischer Phosphatase behandelt. Each der Ethano!ausfällung wird die phosphatasebehandelte Vektor-DlS zu cDlTS hinzugegeben, welche kohäsive Eco-RI-Termini in einem molaren Verhältnis von 2 Mol Vektor zu 1 Mol cDHS enthält. Das Gemisch wird gemäß Beschreibung von Ullrich, A. et al. (siehe oben) mit T4-DliS-Ligase, verbunden. Das Ligationsgemisch wird direkt einer Suspension von E. coli-,%,1776-Zellen zugesetzt, welche entsprechend Ausführungsbeispiel 1 für die Transformation vorbereitet wurden. Ebenfalls nach der im Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise wird die Transformation vorgenommen· Die rekombinanten Phagen werden zurückgewonnen und auf Iac" Bakterien auf Platten angelegt, welche 5-Chlor-4-brom-3-indolyl-ß-D-galaktosid (XS)₉ (80 /Ug/ml) enthalten. Für die Herstellung von farblosen Belägen werden rekombinante Phagen selektiert, welche die in die Eco-RI-Stelle von Charon 16A inserierte cDBS enthalten. Die gewünschten Rekombinanten werden nach der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise isoliert und mit einem Überschuß an Eco-RI-Endonuklease verdaut; das Aufschlußprodukt wird in der in Ausführungsbeispiel 2 beschriebenen Weise analysiert. Zurückgewonnen werden DITS'η von etwa 700 Basenpaaren Länge und den in Abbildung 3 gezeigten Sequenzen. Anderenfalls wird die Ligationsmischung dazu benutzt, rekombinante Phagen durch in-vitro-Verpacken gemäß

23 2 7 8 7 6 ~³⁵ ~ 59 67613/32/36

3β 6.82

der Beschreibung von Sternberg, N. et al., Gene 1, 255 (1977) zu. bilden« Rekombinante Phagen können darüber hinaus durch Anwendung der von Benton, W«. D. und Davis, R. W., Schience 196, 180 (1977) berichteten in-situ-Plaque-Hybridisationatechnik ausgelesen werden«

(B) In der von Blattner et al« (siehe oben) beschriebenen Weise hergestellte Charon-3A-D]JS oder Charon-4A-DUS wird anstelle der im vorangegangenen Ausführungsbeispiel genannten Charon-16A-DlS als Übertragungsvektor verwendet· Alle Bedingungen sind mit den für Charon-16A-DNS beschriebenen identisch. Die Selektrio rekombinanter Phagen erfolgt durch (a) Plattieren der Phagen auf Lac⁺ Bakterien auf 26-haltigen Platten und Isolieren farbloser Plaques sowie darauffolgend Entweder Hybridisation an eine geeignete Sonde oder Restriktions-Endonuklease-Yerdauung in der von Blattner et al« (siehe oben) beschriebenen Weise« Die Einlagerungen werden nach der bereits dargestellten Methode entfernt; als Ausbeute werden DUS'η von etwa 700 Basenpaaren Länge mit den in den Abbildungen 1 und 2 gezeigten Sequenzen .gewonnen.

(C) Als Übertragungsvektor wird anstelle der weiter oben verwendeten Charon-16A die nach Beschreibung von Timier et al. (siehe oben) hergestellte % gt WBS · % B-DUS genutzt. Alle Bedingungen entsprechen den für Charon 16A beschriebenen. Die Selektion rekombinanter Phagen erfolgt nach der Hybridisationsmethode von Benton und Davis (siehe oben). Die Einlagerungen werden in der oben beschriebenen Weise entfernt und erbringen DlS'n von etwa 700 Basenpaaren Länge mit den in Abbildung 3 gezeigten Sequenzen.

(D) Die Ausführungsbeispiele 5(A)...(C) werden wiederholt, wobei E. coli RPI, E. coli HB101, E. coli DP50 oder E. coli

232787 6.

- 36 - 59 676 18/32/36'

3.6.82

DP50Supl? anstelle von E. coli %> 1776 verwendet werden. Alle Bedingungen sind identisch: es werden identische Ergebnisse erzielt.

Ausführtuagsbeispiel 6

Pur dieses Ausführungsbeispiel wird die cDUS in der^in"Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise zubereitet. Es werden Hind-III-Restriktionsstellenverbinder zugesetzt, und die cDHS wird mit Hind III oder Hsu I in der in Ausführungsbeispiel 4(A) beschriebenen .Weise' verdaut»

Als Übertragungsvektor wird das Plasmid pC194 verwendet, das - wie von Ehrlich, S. D. (siehe oben) beschrieben - aus S, aureua isoliert worden war. pC194 wird an der Hind-III-Stelle mit Hind III oder Hsu I gespalten und dann mit, alkalischer Phosphatase in der von Ullrich, A. et al (siehe oben) beschriebenen leise behandelt. Ebenfalls in der von Ullrich, A. et al. (siehe oben) beschriebenen Weise wird die cDUS mit Hind-III-kohäsiven Termini mit dem gespaltenen pC194 verbunden. Entsprechend der Beschreibungen von Sgarmella, V. et al., J. Mol. Biol., JO5, 587 (1967) und Borenstein, S. und Ephrati-Elizue, E., J. Mol. Biol., 45» 137 (1969) erfolgt eine Kompetenz-Induktion von B. subtilis RUB331. Die Transformation von B. subtilis RUB331 erfolgt unter Verwendung der ebenfalls von Sgaramella et al. und Borenstein et al. (siehe oben) beschriebenen Ligationsmischung. Die Zellsuspension wird direkt auf L-Platten angelegt, welche 3 /Ug Chloramphenikol enthalten. Selektierte Rekombinanten werden gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 1 isoliert und mit Hind III verdaut; das Aufschlußprodukt wird gemäß Ausführungsbeispiel 2 analysiert. Zurückgewonnen werden DUS^!η von etwa 700 Basenpaaren Länge mit

- 37 - 59 676 18/32/36

3.6.82

den in Abbildung 3 gezeigten Sequenzen«

Ausführungsbeispiel 7 Synthese der Präpro-S1 -codierenden DES

(a) Die Einlagerungs-DIS wird zunächst durch Pst-I-Endonukleaseverdarning von pBR322/pLaS1 aepariert und dann mittels präparativer Gel-Elektrophorese gereinigt· Sodann wird eine 15-/Ug-Probe der gereinigten Einlagerungs-DITS modifiziert, indem die DUS in WaBser suspendiert wird, welchem eine konzentrierte Salzlösung zugesetzt wird, so daß die endgültige Zusammensetzung 70 mM tris (pH 8,8), 70 mM MgCl_p, 10 mM Dithiothreitol und 13,75 Einheiten T4~Polymerase in einem Gesamtvolumen von 250 /Ul enthält· Das Reaktionsgemisch wird 3,3 min lang bei 37 ⁰C inkubiert· Dem Reaktionsgemisch wird sodann dTTP (50 mM) zugesetzt, um die endonikleolytische Verdauung am näehstgelegenen Adenin-Rest in der Sequenz abzuschließen· Nach einer zusätzlichen 0,5-minütigen Inkubation wird das Reaktionsgemisch in ein Eisbad umgesetzt, und das Enzym wird 'durch fünfminütige Wärmebehandlung bei 65""⁰C" inaktiviert. Die behandelte DUS wird mittels Ethanolausfällung zurückgewonnen. Die Verdauung mit Si-Uuklease zur Erlangung von stumpfen Enden wird in der von Ullrich, A. et al·, Science, 196, 1313 (1977) beschriebenen Weise ausgeführt.

Wie in Abbildung 3 gezeigt, beginnt die durch Translation veränderte Region von pLaS1 mit einem Α-Rest· Der nächstliegende Α-Rest in der 5'-nichtübersetzten Region befindet sich fünf Reste vor dem Startkodon (AUG)· Die oben beschriebenen Verdauungsbedingungen sind darauf ausgerichtet, annähernd 30 IFukleotide vom'3'-Ende zu entfernen. Daher wird

232787 6 -

38 - 59 676 18/32/36 3.6.82

ein beträchtlicher Anteil der T4-polymeraseverdauten DlS-Moleküle am Startkodon bei Position -107 begrenzt werden»

(B) Ausführungsbeispiel 7(A) wird wiederholt, wobei die Präpro-S1-Einlagerung durch Verdauung jener Übertragungsvektoren entfernt wird, die in den Ausführungsbeispielen 3, 4, 5 und 6 durch das geeignete Re strikt ions enzym vor der Verdauung mit T4-Polymerase hergestellt worden waren· Die verwendeten Übertragungsvektoren und Restriktionsenzyme sind in Tabelle 3 zusammengestellt*

Tabelle 3 Restriktionsenzym Übertragungsvektor (Ausführungsbeigpiel)

Pst I 3A, 3B, 4Gf 4H

Hind III 4A, 4B, 6

Sal I 40, 4D

Bam HI 40,. 4D

Bco RI 4E, 4Ϊ¹, 5A, 5B, 5C

Die verbleibenden Schritire~werden gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 7(A) durchgeführt; in Jedem Falle werden identische Resultate erzielt.

Augführungsbeispiel 8 Synthese der Präpro-S2-codierenden Dl^-S

Das Plasmid pBR322/pIaS2 oder die anderen Übertragungsvektoren, welche die in den vorangegangenen Ausführungsbeispielen hergestellte Präpro-S2-Einlagerung enthalten, werden mit dem geeigneten Restriktionsenzym entsprechend Ausführungsbeispiel 7(A) oder 7(B) verdaut und mittels präparativer Gel-Elektrophorese gereinigt. Das Entfernen der 5'-

23 2 7 87 6 - 39 - - 59 676 18/32/3β

3.6.82

nichtübersetzten Region erfolgt unter Verwendung von T4-Polymerase in der in Ausführungsbeispiel 7(A) beschriebenen Weise, wobei dies hier allerdings in Anwesenheit von dATP durchgeführt wird. Die Reaktion wird entsprechend der Beschreibung in Ausführungsbeispiel 7(A) gestoppt. Überschüssiges dATP und die verdauten Basen werden mittels Chromatografie auf 6-50 Sephadex beseitigt. Der DJS wird T4-Polymerase zugesetzt, dann wird 0,25 min lang inkubiert, bevor dATP hinzugegeben wird, um die Verdauung an jenem dem Startkodon vorgelagerten T zu stoppen» Entsprechend obiger Beschreibung wird die Reaktion gestoppt, und die DUS wird extrahiert und chromatografiert. Durchgeführt wird weiter eine abschließende Verdauung mit T4-Polymerase in Anwesenheit von dTTP· Die behandelte DHS wird mittels Ethanolausfällung zurückgewonnen und - wie oben beschrieben - mit S1-Huklease verdaut,· um'stumpfe Enden zu erlangen» Als Ausbeute erscheint eine DIS, die mit dem Startkodon an der Position -111 beginnt.

Ausführungsbeispiel 9 Synthese der S1-codierenden PITS

Die Präpro-S1-codierende Einlagerung wird durch Verdauung jener Übertragungsvektoren entfernt, die in den vorangegangenen Ausführungsbeispielen mit den geeigneten Restriktionsenzymen - siehe Ausführungsbeispiele 7(A) oder 7(B) - hergestellt worden waren. Die Einlagerung wird sodann mit Xma I verdaut und mittels präparativer Gel-Elektrophorese gereinigt. Die gereinigte Einlagerungs-DS"S wird dann mit T4-Polymerase in Anwesenheit von dATP gemäß der in Ausführungsbeispiel 7(A) beschriebenen Vorgehensweise verdaut. Ebenfalls gemäß Ausführungsbeispiel 7(A) wird die Reaktion gestoppt,

7 7 ft 7 fi - 40 - 59 676 18/32/36

3.6.82

die behandelte DlS zurückgewonnen und mit Si-Nuklease zur Erlangung stumpfer Enden verdaut. Dieses Vorgehen erbringt eine DS^-S, die das gesamte S1 mit Ausnahme der zwei N-terminalen Aminosäuren codiert· Eine Nukleotidsequenz, die diese zwei Aminosäuren codiert, wird unter Anwendung eines Verfahrens nach Itakura, K. et al·, J. Biol. Ghein., 250» 4592 (1975) und Itakura, K. et al«; J. Am. ^Ghem« Soc, ,97, 7326 (1975) chemisch synthetisiert. Diese Sequenz wird sodann nach dem Verfahren von Valenzuela, P. et al«, Nature 280? 815 (1979) stumpfendig mit dem Überrest der S1-codierenden Sequenz verbunden. Dies erbringt die komplette Si-codierende Sequenz.

Ausführung^beispiel 10 Synthese der S2-codierenden DHS

Die Präpro-S2-codierende Einlagerung wird durch Verdauung jener Übertragungsvektoren entfernt, die--in den vorangegangenen Ausführungsbeispielen mit den geeigneten- Eestriktioasenzymen - siehe Ausführungsbeispiele 7(A) oder 7(B) - hergestellt worden waren. Die Einlagerung wird dann mit dem Restriktionsenzym Ava II oder Hgi GII oder Bgi EII verdaut. Mittels Gel-Elektrophorese wird ein DNS-Fragment von etwa 120 Basenpaaren Länge isoliert, welches an der dritten Base im Kodon bei Position -15 von Präpro S2 beginnt und sich in die 3'-nichtübersetzte Region fortsetzt. Dieses Fragment wird sodann mit T4-Polymerase gemäß Ausführungsbeispiel 7(A) und 9 verdaut, wobei fünf Zyklen des in Ausführungsbeispiel 8 beschriebenen Formats verwendet werden. Diese Zyklen werden in Anwesenheit von dITP, dCTP, dGTP, dTTP und dCTP durchgeführt. lach der abschließenden . T4-Polym.erase-Verdau«- ung wird die DNS durch Ethano!ausfällung zurückgewonnen und

- 41 - 59 676 18/32/36

_3β6.82

mit S1-Huklease verdaut, mn - wie in Ausführungsbeispiel 7(1) beschrieben - stumpfe Enden zu liefern· Als Ausbeute wird die komplette S2-codierende Sequenz gewonnen.

Ausführnngsbeispiel 11

(A) Die in den Ausftihrungsbeispielen 7(A) und 7(B) hergestellte Präpro-S1-codierende Desosynukleotidsequenz, also Präpro S1 am Startkodon beginnend, wird vermittels der in den Ausführungsbeispielen 1, 3(A), 3(B), 4(A)...(I), 5(A), 5(B) und 6 beschriebenen Yorgehensweisen in Übertragungsvektoren inseriert. Alle Bedingungen sind mit den beschriebenen identisch. Die DlJS wird mit dem geeigneten Restriktionsenzym wie beispielsweise in Tabelle 3 dargelegt - entfernt und gemäß Ausführungsbeispiel ,2 analysiert» In jedem Falle wird eine DHS mit einer Sequenz gewonnen, welche am Startkodon auf Position -107 beginnt und sich zum Ende der für pla51 in Abbildung 3 gezeigten Sequenz fortsetzt.

(B) Die im Ausführungsbeispiel 8 hergestellte Präpro-S2-codierende Desoxynukleotidsequenz, also Präpro S2 am Startkodon beginnend, wird vermittels der in Ausführungsbeispiel' 11(A) beschriebenen Yorgehensweise in die Übertragungsvektoren inseriert, entfernt und -analysiert. In jedem Falle wird eine DES mit einer Sequenz gewonnen, welche am Startkodon auf Position -111 beginnt und sicH zum Ende der für pIaS2 in Abbildung 3 gezeigten Sequenz fortsetzt.

(C) Die im Ausführungsbeispiel 9 hergestellte S1-codierende Desoxynukleotidsequenz wird vermittels der in Ausführungsbeispiel 11(A) beschriebenen Yorgehensweise in Übertragungsvektoren inseriert, entfernt und analysiert. In jedem Falle wird

- 42 - 59 676 18/32/36

3.6.82

eine DlS gewonnen, die die in Abbildung 3 für S1 (Somatostatin) gezeigte Sequenz aufweist.

(D) Die im Ausführungsbeispiel 10 hergestellte S2-codierende Desoxynukleotidsequenz wird vermittels der in Ausführungsbeispiel 11(A) beschriebenen Vorgehensweise in Übertragungs- ₍-~: vektoren inseriert, entfernt und analysiert. In jedem Falle ^v· wird eine DHS gewonnen, die die in Abbildung 3 für S2 (Somatostatin II) gezeigte Sequenz aufweist.

Ausführungsbeispiel 12

Die im vorliegenden Text beschriebenen verschiedenen codierenden Regionen können durch jedwede der oben beschriebenen Methoden dargestellt werden.

(A) Die Darstellung von Präpro S1 als ein Fusionsprotein wird durch Inkorporieren einer radioaktiven Aminosäure in ein in nichttransformierten Zellen nicht vorhandenes Protein oder

C-\ mittels Radioimmunoassay vorgenommen· In beiden Fällen werden in Ausführungsbeispiel 1 hergestellte pBR322/pLaS1-enthärtende bakterielle Zellen oder pBR322-enthaltende bakterielle Zellen als Kontrollvariante/ in Hährbouillon angebaut· Im erstgenannten Verfahren werden nach 3-stündigem Wachstum 1,5 ml Zellen durch Zusetzen von 20 /uCi ^S-L-Methionin radioaktiv markiert und 10 min lang inkubiert· Die Zellen werden sodann mittels Zentrifugation gesammelt*- gewaschen und in 250 /ul Pufferlösung - Glykol 10 % (V/V), ß-Merkaptoethanol 5 % (V/V) und SDS 2,-3 % (M/V) in 0,0625 M tris (pH 6,8) - resuspendiert· Die Suspension wird 5 min lang gekocht, dann einem 10 % (M/V) SDS-Polyakrylamid-Gel ausgesetzt und mittels Elektrophorese fraktioniert. Die Proteinbanden wer-

^ den durch Autoradiografie sichtbar gemacht· Die Ergebnisse

"⁴³" f%l ^18/32/36

23 2 7 87 θ f

zeigen das Vorhandensein einer in nichttransformierten Kulturen nicht beobachteten neuen Proteinbande.

Beim Radioimmunoassay-Verfahren werden die bakteriellen Zellen nach dem Wachsen mittels Zentrifugation gesammelt. Die Zellen werden resuspendiert, lysiert und mit strahlenmarkiertem S1-Antikörper versetzt, welcher von einer freien 1-terminalen Gruppe auf Position 1 von ST nicht abhängt (Arimura, A. et al·, Proc« Soc. Exp, Biol. led» 148, 784 (1975). Der Immunkomplex wird ausgefällt, und die Radioaktivität wird gemessen· Ermittelt wird eine Positionsreaktion, welche die Produktion eines Präpro-Si-enthaltenden Fusionsproteins nachweist.

(B) Zur direkten Darstellung von Präpro Si wird die Einlagerung ρ Ia Si gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 7(A) oder 7(B) modifiziert oder die modifizierte Einlagerung wird aus den in Ausführungsbeispiel 11(A) hergestellten Übertragungsvektoren entfernt. Sin Vektor für die direkte Darstellung wird durch Modifikation des Plasmids ptrp_E3O vermittels Beseitigen von 23.».29 lukleotiden unter Einsatz von T4-Polymerase und S1-Nuklease gemäß obiger Beschreibung.konstruiert.

Sowohl die modifizierte ρLaS1-Einlagerung als auch der modifizierte Expressionsvektor werden mit einem spezifischen Verbinder-Oligonukleotid mit der Sequenz 5^f-GCGGATCCGG~3^f an einem Strang und seiner komplementären Sequenz; am anderen Strang versorgt; dies erfolgt durch stumpfendige Ligation unter Verwendung von DBS-Ligase, wie dies von Valenzuela et al», Nature, 280, 815 (1979) beschrieben wurde« Die Verbinder-Oligonukleotide liefern gegenüber Bam-HI-Endonuklease sensitive Restriktionsstellen -, letztere wird zur Erleich-

232787 6- 44- £ 59 .676 18/32/3 6

3.6.82

terung der Insertion verwendet. Die Insertionsreaktion wird im wesentlichen nach der von Ullrich, A, et al· (siehe oben) beschriebenen Weise durchgeführt. Die Wirtsbakterien E. coli EB1O1, RRI oder 3^1776 werden durch die die inserierte modifizierte Präpro-S1-codierende Region tragenden rekoinbinanten Vektoren transformiert, und die Transformanten werden hinsichtlich ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber Ampizillin selektiert. Ein einzelner, für die weitere Analyse ausgewählter Transformant wird als ptrpE3O/PPSi bezeichnet.

Durch ptrpE3O/PPS1 transformierte Bakterienzellen werden bei 37 ⁰C in einem mit Leuzin, Prolin, Vitamin 81 und Ampizillin angereicherten Standard-Minimalmedium (M9) angebaut,"In der frühen log-Phase wird das trp-Operon durch Zusetzen von ß-Indolylakrylsäure (30 ,ug/ml Medium) induziert. Die Kontrollkulturen bleiben ininduziert. Nach drei weiteren Stunden Wachstum werden 1,5 ml Zellen durch Hinzugeben von 20 /

TC /

^JS-L-Methionin radioaktiv markiert und 10 min lang inkubiert. Die Zellen werden sodann durch Zentrifugation gesammelt, gewaschen und in 250 /Ul Pufferlösung - Blykol 10 % (V/V), ß-Merkap to ethanol 5 % (V/V) und SDS 2,3 % (M/V) in .. 0,0625 M tris (pH 6,8 :) - resuspendiert. Die Suspension wird 5 min gekocht, dann einem 10 % (M/V) SDS-Polyakrylamid-Gel ^appliziert und elektrophoretisch fraktioniert. Die Proteinbanden werden autoradiografisch sichtbar gemacht. Die Ergebnisse lassen das Vorhandensein einer neuen Proteinbande mit einer relativen Molekülmasse von etwa 13 000 erkennen, welche in nichtinduzierten oder nichttransformierten Kulturen nicht beobachtet wird.

Präpro S1 wird durch herkömmliche Techniken einschließlich beispielsweise Gelfiltration, Ionenaustauschqhromatografie, Äffinitätschromatografie und Differential-Löslichkeitstech-

3 2 7 87 6 " ⁴⁵ ~ 59 676 18/32/36

3·6.82

niken gereinigt.. Die Überführung von Präpro S1 zu Pro S1 erfolgt durch das von Jackson, R· C. et al« (siehe oben) beschriebene Verfahrene

(C) Präpro S2 ¹WiTd entweder als ein Fusionsprotein oder direkt gemäß der in Ausführungsbeispiel 12(A) bzw. 12(B) unter Verwendung von pBR322/pLaS2 bzw_o der modifizierten pLaS2-Einlagerung dargestellt· Die Erzeugung eines Präpro-S2-enthaltenden Pusionsproteins oder die Produktion von Präpro S2 direkt wird durch Inkorporation einer radioaktiven Aminosäure nachgewiesen. Die Vorgehsnweise entspricht der in Ausführungsbeispiel 12(A) oder 12(B) beschriebenen mit der Ausnahme, daß anstelle des radioaktiv markierten Methionins radioaktiv markiertes Tyrosin verwendet wird. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein einer in nichttransform!erten KuI-türen nicht beobachteten Proteinbande zur Herstellung eines Pusionsproteins sowie die Existenz einer in nichtinduzierten oder nichttransformierten Kulturen nicht beobachteten Proteinbande mit einer relativen Molekülmasse von 14 100 zur Produktion von Präpro S2.

(D) Ein spezifischer Verbinder mit der Sequenz 5' CCGGATGCGGATG - 3^f auf einem Strang und seiner komplementären Sequenz auf dem anderen wird der S1- oder S2-codierenden DHS, wie sie in den Ausführungsbeispielen 9 und 10 hergestellt wurde, stumpfendig verbunden· Diese modifizierte DHS wird dann gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 12(B) in das modifizierte Plasmid ptrpE30 inseriert· Wirtsbakterien werden laut Ausführungsbeispiel 12(B) oder 12(C) transformiert, kultiviert und analysiert. Die Ergebnisse deuten auf die Produktion von S1 oder S2 hin· Dies bestätigt sich bei Durchführung einer Aminosäureanalyse·

2Λ o«70«7 r- - 46 - 59 67S 18/32/36 ά Δ / Ό / D _3β6·82

Wenn auch die Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen Verkörperungen beschrieben worden ist, so versteht es sich von selbst, daß sie weiterer Modifikationen fähig ist. Mit der vorliegenden Anmeldung sollen einige Varianten, Anwendungen oder Bearbeitungen der Erfindung bezüglich ihrer Grundsätze geschützt werden; dies schließt auch solche Abweichungen von der hier dargestellten Offenlegung ein, die sich aus der bekannten und üblichen Präzis in jenem Fachgebiet ergeben, auf das sich die Erfindung bezieht·

Claims (11)

23 2 7 8 7 6 ~47~ 59 676 is/32/36

1. Verfahren zur Herstellung eines DUA-Transfer-Vektors für die Verwendung zur Aufrechterhaltung und Replikation einer Desoxynucleotid-Sequenz, die für ein Somatostatin oder einen.Somatostatin-Vorläufer, ausgewählt aus der Präprosomatostatin-1, Prosomatostatin-1, Präprosomatostatin-2, Prosomatostatin-2 und Somatostatin-2 umfassenden Gruppe, kodiert, gekennzeichnet dadurch, daß die Desoxynucleotid-Sequena mit einem durch Spalten eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym hergestellten DHA-Molekül umgesetzt- wird.

2ο Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Desoxynucleotid-Sequenz für Somatostatin-2 kodiert.

2&QKT. 1982*043140

, AP C 12 N /232 787/6 Sc ' 59 676 18

232787 6 -**-

3· Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die für Somatostatin-2 kodierende Desoxynucleotid-Sequenz einen Plusstrang mit folgender Sequenz aufweist: 5' - GCT GGC TGT AAG AAC TTC TAT TGG AAG GGC TTC ACT TCC TGT TAA - 3»
worin

A = Desoxyadenyl ist
G = Desoxyguanyl ist
D = Desosycytosyl ist und
T = Thymidyl ist.

. 3·6,82

Erfindungsanspruch

4« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Desoxynucleotid-Sequenz für Präprosomatostatin-1 kodiert.

5'-ATG CAG TGT ATC CGT TGT CCC GCC ATC TTG GCT CTC CTG GCG TTG GTT CTG TGC GGC CCA AGT GTT TCC TCC CAG CTC GAC AGA GAG CAG AGC GAC AAC CAG GAC CTG GAC CTG GAG CTG CGT CAG CAC TGG CTG CTG GAG AGA GCC CGG AGC GCC GGA CTC CTG TCC CAG GAG TGG AGT AAA CGG GCG GTG GAG GAG CTG CTG GCT CAG ATG TCT CTG CCA GAG GCC ACG TTC CAG CGG GAG GCG GAG GAC GCG TCC ATG GCA ACA GAA GGA CGG ATG AAC CTA GAG CGG TCC GTG GAC TCT ACC AAC AAC CTA CCC CCT CGT GAG CGT AAA GCT GGC TGT AAG AAC TTC TAT TGG AAG GGC TTC ACT TGG TGT TAA - 3¹ '

worin A Desoscyadesyl, G ^esoixyguasyl, C Desoxycytosyl uad T Thymidyl ist.

AP G 12 N /232 787/6 hq 59 676 18

232787 6 -*"-

5» - ATG AAG ATG GTC TCC' TCC TCG CGC CTC CGC TGC CTC CTC GTG CTC CTG CTG TCC CTG ACC GCC TCC ATC AGC TGC TCC TTG GCC GGA CAG AGA GAC TCC AAA CTC CGC CTG CTG CTG CAC CGG TAG CCG CTG CAG GGC TCC AAA CAG GAC ATG ACT CGC TCC GCC TTG GCC GAG CTG CTC CTG TCG GAC CTC CTG CAG GGG GAG AAC GAG GCT CTG GAG GAG GAG AAC TTC CCT CTG GCC GAA GGA GGA CCC GAG GAC GCC CAC GCC GAC CTA GAG CGG GCC GCC AGC GGG GGG GCT CTG CTC GCC CCC CGG GAG AGA AAG GCC GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAA ACC TTC ACC TCC TGC TGA - 3'

worin

A = Desoxyadenyl ist

G = Desoxyguanyl ist

C = Desosycytosyl ist und

T = Thymidyl ist,

5. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß die für Präprosomatostatin-T kodierende Desoxynucleotid-Sequenz einen Plusstrang mit.folgender Sequenz aufweist;

0 O *7 O η /-» ' - ⁴⁸ - 59 676 18/32/36
O Δ / 0/ 0 3.6.82

6, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Desosynucleotid-Sequenz für Präprosomatostatin-2,kodiert.

7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß die für Präprosomatostätin-2 kodierende Desoxynucleotid-Sequenz einen Plusstrang mit folgender Sequenz aufweist:

8. Verfahren zur Erzeugung des Plasmids pBE322/pLaS1 oder pBE322/pLaS2 nach Punlrt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das durch Spalten eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym hergestellte DNS-Molekül pBE322 und das Eestriktionsenzym Pst I ist.

9. Verfahren zur Erzeugung eines Bxpressions-TransferVektors nach Punkt 1 für die Verwendung bei der Expression einer für ein Somat'ostatin oder einen Somatostatin-Vorlä'ufer kodierenden Desoxynucleotid-Sequenz, gekennzeichnet dadurch, daß das Spalten eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym hergestellte BUS-lolekül an einer Stelle innerhalb einer expressiblen Eontrollregion gespalten ist.

10«,' Verfahren nach Punkt. 1 zur Herstellung und Verwendung eines DNS—Transfervektors zur Aufrechterhaltung, und Eeplikation einer Deosynukleotidsequenzkodierung für ein Somatostatin oder eine Somatostatinvorstufe, ausgewählt aus der Gruppe, die Preprosomatostatin-1, Prosoma-

to.stat.iB—1, Preprosomatostatin-2, Prosomatostatin-2 und Somatostatin—2 enthält₇ gekennzeichnet durch die Reaktion.rder Deoxynukleotidsequenz mit einem DHS-lolekül, das durch Spaltung eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym an einem Punkt innerhalb einer ausdrückbaren Steuerregion hergestellt wird, wobei der auf diese Weise hergestellte Transfervektor verwendet wird, um einen Mikroorganismus umzuwandeln und wobei der umgewandelte Mikroorganismus bebrütet wird, um ein Fusionsprotein herzustellen, das eine Aminosäuresequenz eines Somatostatins oder einer Somatostatinvorstufe als C-endständig und ein Teil eines prokaryotisehen Proteins als IT-end ständig enthält.

11. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung und Verwendung eines DNS-Transfervektors zur Synthese eines Somatostatins oder einer Somatostatinvorstufe, ausgewählt aus der Gruppe, die Preprosomatostatin-1, Preprosomatostatin-2 und Somatostatin-2 enthält, gekennzeichnet durch Bebrütung eines Mikroorganismus, der durch einen Vektor umgewandelt wird, der eine Seoxynukleotidsequenzkodierung für das Somatostatin oder die Somatostatinvorstufe

enthält, hergestellt in Übereinstimmung mit dem Verfahren des Punktes 1, wobei die Deoxynukleotidsequenz Somatostatin-2, Pregrosomatostatin-1 oder Preprosomatistatin—2 kodiert, unter Bedingungen, die für den Ausdruck der Beoxynukleotidsequenz geeignet sind, und gekennzeichnet durch dös Purifikation des Somatostatins oder der Somatostatinvorstufe aus dem lysat oder Hährmedium des Mikroorganismus.

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen bzw. iOrmeln