EP1456387A2 - Expressionsvektor zur herstellung von annexin v - Google Patents

Expressionsvektor zur herstellung von annexin v

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Publication number
EP1456387A2
EP1456387A2 EP02787950A EP02787950A EP1456387A2 EP 1456387 A2 EP1456387 A2 EP 1456387A2 EP 02787950 A EP02787950 A EP 02787950A EP 02787950 A EP02787950 A EP 02787950A EP 1456387 A2 EP1456387 A2 EP 1456387A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
expression vector
vector
annexin
expression
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02787950A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Swen Grein
Christian Reiser
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
responsif GmbH
Original Assignee
responsif GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by responsif GmbH filed Critical responsif GmbH
Priority to DE20221079U priority Critical patent/DE20221079U1/de
Publication of EP1456387A2 publication Critical patent/EP1456387A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4721—Lipocortins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to an expression vector and an E. coli cell for the production of Annexin V.
  • EP 0 351 826 A2 describes the expression of the placental coagulation inhibitor CPBII, which is also referred to as Annexin VI, in E. coli.
  • CPBII placental coagulation inhibitor
  • the expression vector pKK223-3 containing an ampicillin resistance gene and the E. coli strain JM105 are used.
  • Common elements of expression vectors are an origin, a gene which confers antibiotic resistance, a lac I gene coding for the lac repressor, a promoter under the control of the lac operator and an optimal ribosome binding agency. This is usually followed by a short open reading frame with a multiple cloning site for the insertion of a cDNA into the correct reading frame.
  • Such an expression vector is silent in bacteria if the lac repressor prevents transcription of the built-in cDNA.
  • the lac I gene is not required in the vector if the expression vector is used in bacteria in which the lac I gene is expressed in another way, for example because it is present on another vector. By adding the IPTG inductor, the transcription can be released in a simple manner.
  • the bacteria then often, but not always, produce the protein encoded by the cDNA.
  • the protein is often also insoluble and precipitates in the bacteria as a precipitate, so-called "inclusion bodies". Not every vector with the specified elements is equally suitable for the expression of a given protein.
  • the object of the present invention is to provide an expression vector which is well suited for the expression of annexin V which can be used systemically as a therapeutic agent.
  • an E. coli cell is to be provided, by means of which Annexin V, which can be used systemically as a therapeutic agent, can be produced.
  • an expression vector which contains the following elements:
  • an expression region which has a first promoter in succession in the reading direction, a binding site specific for a repressor, a sequence corresponding to a prokaryotic ribosome binding site, a cloning site with a gene coding for annexin V and at least one transcription terminator and
  • At least one kanamycin resistance gene with a second promoter at least one kanamycin resistance gene with a second promoter.
  • the vector pBR322 comes from the E. coli strain K12 SK1592, which is available from the DSMZ under the number DSM No. 3879 can be obtained.
  • the vector pKK223-3 is known from Brosius, J. and Holly, A. (1984) Proc Natl Acad Sei USA 81, pages 6929-6933 and can be obtained, for example, from Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg.
  • the components are to be understood as nucleotide sequences which correspond to the functional units contained in the vector pBR322 or pKK223-3. explosion. These functional units can be genes, such as the rop gene or nucleotide sequences, which have another function, for example in the replication of the vector.
  • All components of the vector pBR322 or pKK223-3, in particular the complete nucleotide sequence of the vector, can be contained in the expression vector. However, individual components of the vector may also be missing, provided that they are not necessary for the replication of the vector.
  • the binding site specific for the repressor allows induction of the expression of the gene coding for Annexin V.
  • the sequence corresponding to the prokaryotic ribosome binding site is a sequence, the transcription of which results in an mRNA sequence which represents a prokaryotic ribosome binding part (Shine-Dalgarno sequence).
  • the prokaryotic ribosome binding site is required to initiate translation.
  • the cloning site can be a simple, a multiple or a cloning site that can no longer be digested by restriction enzymes by inserting the gene coding for Annexin V.
  • a multiple cloning site is distinguished from a simple cloning site by more than one restriction site, which allow the incorporation of different DNAs.
  • a gene coding for Annexin V is contained in the reading frame in the cloning site. In the case of the gene, deviations from the native nucleotide sequence are possible in the nucleotide sequence, provided that they do not or only have an effect in the protein sequence that the function of the protein is not lost.
  • the function can also be just one of several Annexin V functions. Such functions include the ability to bind phosphatidylserine or to inhibit blood coagulation.
  • the expression region without the gene coding for annexin V can, at least in part, in particular in the case of an expression vector containing the components of the vector pKK223-3, from the im Vector pKK223-3 originate in the expression region contained in the nucleotide sequence 4146 to 72.
  • the expression vector according to the invention has a kanamycin resistance gene. It is particularly well suited for the expression of Annexin V, which can be used systemically as a therapeutic agent. Thanks to the kanamycin resistance gene, the use of ampicillin or tetracycline, which frequently causes allergy problems, can be dispensed with. In an Annexin V preparation resulting from the expression and purified for therapeutic use, the presence of kanamycin cannot be completely ruled out. When annexin V is purified, kanamycin can be depleted at least to the extent that its toxicity is safe with the amounts of annexin V that are usually administered.
  • the gene coding for Annexin V comes from a chicken.
  • This gene is particularly well suited for expression using the expression vector.
  • the expression vector with the 966 base pair annexin V gene from the chicken can have a size of about 4,000 base pairs and is therefore easy to handle.
  • all codons in the gene coding for Annexin V can be replaced by such sets that are preferably translated in E. coli. It is known to use optimal codons for E. coli at the 5 'end of an annexin gene. This measure is obviously considered sufficient to achieve an increased expression efficiency in E. coli.
  • a further increase in efficiency can be achieved by replacing all codons in the Annexin V gene with codons preferably translated in E. coli.
  • Codon can be overlooked in E. coli, the resulting protein may have additional undesirable amino acids.
  • At the 3 'end of the sequence of the gene coding for annexin V there is therefore preferably at least one additional stop codon in the reading frame of the gene. Two additional stop codons are particularly preferably present. This means that the expressed protein ends exactly at the intended location.
  • the first promoter is preferably a tac promoter.
  • the repressor can be a lac repressor.
  • the tac promoter corresponds to that of De Boer, HA et al. (1983) Proc Natl Acad Sei USA 80, pages 21-25 published tac promoter. It is a hybrid promoter which, in combination with the specific binding site for the lac repressor, permits expression of the annexin V gene which can be induced, for example with allolactose or isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside (IPTG). Transcription is suppressed in E. coli strains that produce a high level of lac repressor. Such strains are called lac I q strains.
  • the transcription terminator can be the rrnB Tl or rrnB T2 transcription terminator. It is also possible that both rrnBl Tl and rrnB T2 are contained as transcription terminators in the expression vector.
  • the transcription terminators rrnB Tl and T2 come from the rrnB operon in E. coli.
  • the ampicillin resistance gene and / or the tetracycline resistance gene of the components of the vector pBR322 and the ampicillin resistance gene of the components of the vector pKK223-3 are preferably not contained in the expression vector, at least in part. This enables a small size of the expression vector.
  • the kanamycin resistance gene contained in the expression vector preferably originates from the vector pACYC177 or the transposon Tn903 originating from E. coli.
  • the kanamycin resistance gene from the transposon Tn903 can be obtained as a fragment by digesting the plasmid pUC4K with the restriction endonuclease Barn HI.
  • the plasmid pUC4K can be obtained, for example, from Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg.
  • the vector pACYC177 comes from the E. coli strain PC2166, which is available from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig (DSMZ) under the number DSM No. 5587 can be obtained.
  • the second promoter is preferably the promoter pK from the vector pACYC177.
  • This promoter is strong enough to ensure expression of the kamanycin resistance gene which is sufficiently high for kanamycin resistance.
  • the promoter pK does not cause such a strong expression that the expression of Annexin V is significantly reduced.
  • the kanamycin resistance gene with the second promoter can be inserted into the expression vector at the restriction sites Eco RI and Sty I originating from the vector pBR322 or at the restriction site Eco RI originating from the vector pKK223-3.
  • the kanamycin resistance gene with the second promoter pK is preferably contained in the nucleotide sequence 1816 to 2771 of the vector pACYC177 in the expression vector.
  • the expression region can be inserted into the expression vector at the restriction sites Ban I and Eco RI originating from the vector pBR322.
  • the expression vector does not contain an interface for a class II restriction endonuclease which is located outside the cloning site and which has a recognition sequence with the nucleotide sequence ATG.
  • Class II restriction endonucleases recognize a specific nucleotide sequence and cut specifically in or near this sequence.
  • a class II restriction endonuclease which has a recognition sequence with the nucleotide sequence ATG allows the cloning of the start codon ATG of a gene to be expressed in a simple manner.
  • the optimal distance to the ribosome binding site ensuring efficient translation of the mRNA is 4 to 8 nucleotides between the last nucleotide of the ribosome binding site and the A of the start codon. If there is no interface for the restriction endonuclease mentioned outside the cloning site, it is possible to use this interface specifically in the cloning site in order to enable the start codon of the annexin V gene to be expressed to be cloned in a simple manner at the optimal distance from the ribosome binding site , The restriction sites can be removed by directed mutagenesis.
  • the restriction endonucleases Nde I and Nco I are preferred.
  • the recognition sequence of both restriction endonucleases contains the nucleotide sequence ATG.
  • the recognition sequences are otherwise rare, so that only a few interfaces located outside the cloning site have to be removed.
  • An interface to be removed for the restriction endonuclease Nde I can originate from the vector pBR322.
  • the expression vector without the gene coding for annexin V can have the sequence SEQ ID NO: 2 according to the attached sequence listing.
  • the expression vector with components of the vector pBR322 and an annexin V gene derived from the chicken annexin V gene by codon optimization can have the sequence SEQ ID NO: 3 according to the attached sequence listing. This sequence contains two additional stop codons in the reading frame for Annexin V.
  • the expression vector with components of the vector pKK223-3 and the chicken anxin V gene can have the sequence SEQ ID NO: 4 according to the attached sequence listing.
  • the invention further relates to an E. coli cell which contains an expression vector according to the invention.
  • the E. coli cell preferably belongs to the BL21 strain. This strain can be obtained, for example, from Novagen, Inc., 601 Science Drive, Madison, WI 53711, USA. This cell has proven to be particularly suitable for the expression of Annexin V.
  • the E. coli cell can also belong to a lac I q strain, in particular the JM105 strain.
  • E. coli cells from the JM105 strain can be obtained, for example, from the American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20108, USA.
  • An expression vector according to the invention for the expression of Annexin V can be produced by a method with the following steps:
  • step a1 the removal or the PCR amplification can take place on the vector pBR322 or on a vector created by the method, in particular by inserting the expression area.
  • An expression region already present in steps a1 and a2 in the vector is amplified during PCR amplification in connection with the components of the vector. The ligation is necessary to close the free ends resulting from the PCR amplification into a vector.
  • the free ends of the vector can be ligated to one another or to free ends of a DNA to be inserted, in particular the expression region or the gene coding for Annexin V.
  • the kanamycin resistance gene is functionally active if, after insertion, a second promoter enables expression of the kanamycin resistance gene.
  • the functionally active kanamycin resistance gene includes the second promoter if it is not present in the vector.
  • the gene coding for Annexin V can come from a chicken.
  • the codons are preferably replaced by those which are preferably translated in E. coli. Such codon optimization can be done by directed mutagenesis or new synthesis.
  • at least one additional stop codon is inserted in the reading frame of the gene at the 3 ′ end of the sequence of the gene coding for annexin V.
  • the insertion of two additional stop codons is particularly advantageous.
  • the stop codon is preferably determined by means of a, in particular the sense strand sequence SEQ ID NO: 5 and the tisinnstrang sequence SEQ ID NO: 6 according to the attached sequence listing linker.
  • the insertion is preferably carried out in a cDNA coding for Annexin V before the insertion into the cloning site, whereby insertion here also means a terminal attachment.
  • the attachment of the linker with the sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 according to the attached sequence listing is preferably carried out via a Bse RI restriction site present in the Annexin V cDNA.
  • the first promoter is preferably a tac promoter.
  • the repressor can be a lac repressor.
  • the transcription terminator is preferably the rrnB Tl or rrnB T2 transcription terminator derived from E. coli. It is also possible that both rrnBl Tl and rrnB T2 are transcription terminators.
  • the ampicillin resistance gene and / or at least part of the tetracycline resistance gene is preferably removed or not amplified by means of PCR.
  • the kanamycin resistance gene may have been amplified by PCR before insertion or isolated from a plasmid.
  • the insertion of the second promoter is not necessary if a promoter is present in the vector which enables expression of the kamanycin resistance gene.
  • the kanamycin resistance gene preferably originates from the vector pACYC177 or the transposon Tn903 derived from E. coli.
  • the kanamycin resistance gene can be inserted with a second promoter, in particular the promoter pK from the vector pACYC177.
  • the kanamycin resistance gene with the second promoter is preferably inserted at the restriction sites Eco RI and Sty I originating from the vector pBR322 or at the restriction site Eco RI originating from the vector pKK223-3. This also includes insertion into the vector pBR322 or pKK223-3 itself.
  • the kamanycin resistance gene with the second promoter pK is PCR Amplification of the nucleotide sequence 1816 to 2771 of the vector pACYC177 obtained.
  • the expression region is preferably inserted at the restriction sites Ban I and Eco RI originating from the vector pBR322. It can also be inserted into the vector pBR322 itself.
  • the expression region without the gene coding for annexin V has the sequence SEQ ID NO: 1 in accordance with the attached sequence listing.
  • an interface for a class II restriction endonuclease which has a recognition sequence with the nucleotide sequence ATG, is located outside the cloning site, in particular by directed mutagenesis, is removed or changed so that the restriction endonuclease no longer cuts at this interface can.
  • the restriction endonuclease is preferably Nde I or Nco I.
  • the expression vector without the gene coding for Annexin V has the sequence SEQ ID NO: 2 in accordance with the attached sequence listing.
  • the complete expression vector can have the sequence SEQ ID NO: 3 according to the attached sequence listing. This sequence contains a gene derived from the chicken annexin V gene by codon optimization. Two additional stop codons have been inserted in the reading frame for Annexin V in this sequence.
  • the expression vector can also have the sequence SEQ ID NO: 4 according to the attached sequence listing.
  • the nucleotides 1816-2771 comprising the kanamycin resistance gene with the associated promoter pK are amplified from the vector pACYC177 shown in FIG. 1 by means of a PCR reaction.
  • the product of this reaction is digested with the restriction enzymes Eco RI and Sty I. It is cloned into the vector pBR322, which is also digested with these enzymes.
  • the restriction site Nde I is removed from the resulting vector by directed mutagenesis. This is shown schematically in Fig. 2. 3. 3 shows schematically how the synthetically produced expression region is cloned into the resulting vector at the restriction sites Ban I and Eco RI.
  • RNA from chicken liver is reverse transcribed to produce total cDNA.
  • the cDNA encoding Annexin V is amplified from the total cDNA by means of PCR.
  • the amplified cDNA is attached to the corresponding primer at the
  • This cDNA is also present in the vector in the region between the ribosome binding site labeled SD and the transcription terminator labeled Tl Restriction sites Barn HI and Nde I cloned into the vector.
  • the entire sequence of the vector pKK223-3 is amplified by means of a PCR.
  • the primers used for this have the sequences SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 in accordance with the attached sequence listing. The amplified sequence is added to that introduced by each of the primers
  • the kanamycin resistance gene derived from the transposon Tn903 from E. coli is obtained as a fragment of the vector pUC4K by digestion of this vector with the restriction endonuclease Barn HI.
  • the fragment exhibiting the kanamycin resistance and the amplified sequence are ligated to the compatible cohesive ends of the interfaces resulting from the digestion with Barn HI and Bgl II to form a first vector.
  • the cloning site contained therein in the expression region originating from the vector pKK223-3 is cut with the restriction endonuclease Eco RI.
  • the resulting nucleotide overhangs are filled in by the Klenow fragment of DNA polymerase I and dephosphorylated with alkaline phosphatase.
  • RNA is isolated from embryonic chicken fibroblasts.
  • CDNA is obtained from this by means of reverse transcription.
  • cDNA coding for Annexin V is amplified by means of PCR.
  • the amplified cDNA is digested with the restriction endonuclease Nco I and then with the restriction endonuclease Barn HI.
  • the nucleotide overhangs of the fragment coding for Annexin V are filled in using the Klenow fragment of DNA polymerase I.
  • the resulting fragment is filled in with the Eco RI cut and dephosphorylated first vector ligated to an expression vector according to the invention.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Expressionsvektor enthaltend- zumindest die Komponenten des Vektors pBR322 oder pKK223-3, welche für dessen Replikation erforderlich sind - einen Expressionsbereich, welcher in Leserichtung aufeinander folgend einen ersten Promotor, eine für einen Repressor spezifische Bindungsstelle, eine einer prokaryotischen Ribosomenbindungsstelle entsprechende Sequenz, eine Klonierungsstelle mit einem für Annexin V kodierenden Gen und mindestens einen Transkriptionsterminator aufweist und- mindestens ein Kanamycin-Resistenz-Gen mit einem zweiten Promotor.

Description

Expressionsvektor zur Herstellung von Annexin V
Die Erfindung betrifft einen Expressionsvektor und eine E. coli-Zelle zur Herstellung von Annexin V.
Es ist allgemein bekannt, eukaryotische Gene in Bakterien mittels Plasmiden bzw. Vektoren als Expressionsvektoren zur Expression zu bringen. Aus der DE 37 10 364 AI ist es be- kannt, ein VAC-Protein mittels eines Expressionsvektors, z.B. pBR322, in E. coli zu exprimieren. Als Antibiotika-Resistenz- Gene werden Gene für die Tetracyclin- oder die Ampicillin- Resistenz vorgeschlagen. VAC-Proteine werden auch als Annexine bezeichnet.
Aus der EP 0 351 826 A2 ist die Expression des Plazenta- Koagulationsinhibitors CPBII, welcher auch als Annexin VI bezeichnet wird, in E. coli bekannt. Zur Expression wird der ein Ampicillin-Resistenz-Gen enthaltende Expressionsvektor pKK223-3 und der E. coli-Stamm JM105 verwendet.
Aus der WO 00/73332 AI ist die Expression von Annexin V im E . coli-Stamm BL21 bekannt. Expressionsvektoren sind auf Basis des Vektors pET12a konstruiert worden und enthalten ein Ampi- cillin-Resistenz-Gen.
Aus Turnay J. et al . , Journal of Cellular Biochemistry 58 (1995), Seiten 208 bis 220, ist es bekannt, ein Annexin V-Gen aus dem Huhn in E. coli mittels des ein Ampicillin-Resistenz- Gen enthaltenden Expressionsvektors pTrc99A zu exprimieren.
Übliche Elemente von Expressionsvektoren sind ein Origin, ein Gen, welches eine Antibiotika-Resistenz vermittelt, ein für den Lac-Repressor kodierendes lac I-Gen, ein Promotor unter der Kontrolle des lac-Operators und eine optimale Ribosomen- bindungsstelle . Daran schließt sich üblicherweise ein kurzes offenes Leseraster mit einer multiplen Klonierungsstelle für den Einbau einer cDNA in das richtige Leseraster an. Ein solcher Expressionsvektor ist in Bakterien stumm, wenn der Lac- Repressor die Transkription der eingebauten cDNA verhindert. Das lac I-Gen ist in dem Vektor nicht erforderlich, wenn der Expressionsvektor in Bakterien eingesetzt wird, in welchen das lac I-Gen auf andere Weise exprimiert wird, etwa weil es auf einem weiteren Vektor vorhanden ist. Durch Zusatz des In- duktors IPTG kann die Transkription auf einfache Weise freigegeben werden. Die Bakterien produzieren dann oft, aber nicht immer das durch die cDNA kodierte Protein. Häufig ist das Protein auch unlöslich und fällt schon in den Bakterien als Präzipitat, so genannte "inclusion bodies", aus. Nicht jeder Vektor mit den angegebenen Elementen ist zur Expression eines vorgegebenen Proteins gleich gut geeignet.
Weiterhin ist selbst ein mittels eines zur Expression gut geeigneten Vektors hergestelltes Protein nicht unbedingt als Therapeutikum einsetzbar. Der Grund dafür ist insbesondere, dass sich die üblicherweise zur Selektion erfolgreich trans- fizierter Zellen verwendeten Antibiotika nicht restlos vom Protein abtrennen lassen. Das Vorhandensein von Antibiotika in geringen Mengen des verabreichten Proteins kann zur Ent- stehung von Resistenzen gegen dieses Antibiotikum führen.
Weiterhin haben die Antibiotika teilweise erhebliche Nebenwirkungen. So bestehen häufig Allergien gegen Ampicillin und Tetracycline, welche in einer Präparation des Proteins noch in Spuren enthalten sind. Bei Verabreichung einer solchen Präparation kann es zu einem lebensbedrohlichen anaphylak- tischen Schock kommen. Kanamycin weist eine hohe systemische Toxizität auf und sollte daher nicht systemisch verabreicht werden. Es wird daher heute als Therapeutikum nur noch in Augenpräparaten eingesetzt. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Expressionsvektor anzugeben, der für die Expression von als Therapeutikum systemisch einsetzbarem Annexin V gut geeignet ist. Weiterhin soll eine E. coli-Zelle bereitgestellt werden, mittels der als Therapeutikum systemisch einsetzbares Annexin V hergestellt werden kann.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 19 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 18 und 20.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Expressionsvektor vorgesehen, welcher die folgenden Elemente enthält:
zumindest die Komponenten des Vektors pBR322 oder pKK223-3, welche für dessen Replikation erforderlich sind
einen Expressionsbereich, welcher in Leserichtung aufeinander folgend einen ersten Promotor, eine für einen Repressor spezifische Bindungsstelle, eine einer pro- karyotischen Ribosomenbindungsstelle entsprechende Sequenz, eine Klonierungsstelle mit einem für Annexin V kodierenden Gen und mindestens einen Transkriptions- terminator aufweist und
mindestens ein Kanamycin-Resistenz-Gen mit einem zwei- ten Promotor.
Der Vektor pBR322 stammt aus dem E. coli-Stamm K12 SK1592, welcher von der DSMZ unter der Nummer DSM No . 3879 bezogen werden kann. Der Vektor pKK223-3 ist aus Brosius, J. und Ho- ly, A. (1984) Proc Natl Acad Sei USA 81, Seiten 6929 - 6933 bekannt und kann z.B. von der Firma Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg bezogen werden. Unter den Komponenten sind Nu- kleotidsequenzen zu verstehen, welche für die in dem Vektor pBR322 oder pKK223-3 enthaltenen funktionellen Einheiten ko- dieren. Diese funktioneilen Einheiten können Gene, wie beispielsweise das rop-Gen oder Nukleotidsequenzen sein, welche eine sonstige Funktion, etwa bei der Replikation des Vektors, aufweisen. Es können sämtliche Komponenten des Vektors pBR322 oder pKK223-3, insbesondere die vollständige Nukleotidsequenz des Vektors in dem Expressionsvektor enthalten sein. Es können aber auch einzelne Komponenten des Vektors fehlen, sofern sie nicht für die Replikation des Vektors erforderlich sind.
Die für den Repressor spezifische Bindungsstelle erlaubt eine Induktion der Expression des für Annexin V kodierenden Gens. Die der prokaryotischen Ribosomenbindungsstelle entsprechende Sequenz ist eine Sequenz, durch deren Transkription eine mRNA-Sequenz entsteht, die eine prokaryotische Ribosomenbin- dungssteile (Shine-Dalgarno-Sequenz) darstellt. Die prokaryotische Ribosomenbindungsstelle ist für die Einleitung der Translation erforderlich. Bei der Klonierungsstelle kann es sich um eine einfache, um eine multiple oder um eine durch ein Einfügen des für Annexin V kodierenden Gens nicht mehr durch Restriktionsenzyme verdaubare Klonierungsstelle handeln. Eine multiple Klonierungsstelle zeichnet sich gegenüber einer einfachen Klonierungsstelle durch mehr als eine Restriktionsschnittstelle aus, welche den Einbau verschiedener DNAs erlauben. In der Klonierungsstelle ist ein für Annexin V kodierendes Gen im Leseraster enthalten. Bei dem Gen sind in der Nukleotidsequenz Abweichungen von der nativen Nukleotidsequenz möglich, sofern sie sich nicht oder nur so in der Proteinsequenz auswirken, dass die Funktion des Proteins nicht verloren geht. Bei der Funktion kann es sich auch um nur eine von mehreren Funktionen von Annexin V handeln. Solche Funktionen sind z.B. die Fähigkeit Phosphatidylserin zu binden oder die Blutkoagulation zu inhibieren. Der Expressionsbereich ohne das für Annexin V kodierende Gen kann, insbesondere bei einem die Komponenten des Vektors pKK223-3 ent- haltenden Expressionsvektor, zumindest teilweise, aus dem im Vektor pKK223-3 in der Nukleotidsequenz 4146 bis 72 enthaltenen Expressionsbereich stammen.
Trotz der Toxizität von Kanamycin und der herrschenden Mei- nung, dass dessen Einsatz deswegen vermieden werden sollte, weist der erfindungsgemäße Expressionsvektor ein Kanamycin- Resistenz-Gen auf. Er ist besonders gut zur Expression von als Therapeutikum systemisch einsetzbarem Annexin V geeignet. Durch das Kanamycin-Resistenz-Gen kann bei der Expression auf die Verwendung von häufig Allergieprobleme verursachendem Am- picillin oder Tetracyclin verzichtet werden. In einer aus der Expression resultierenden für den therapeutischen Einsatz aufgereinigten Annexin V-Präparation kann das Vorhandensein von Kanamycin nicht völlig ausgeschlossen werden. Bei der Aufreinigung von Annexin V kann Kanamycin aber mindestens so weit abgereichert werden, dass dessen Toxizität bei den üblicherweise verabreichten Mengen an Annexin V unbedenklich ist. Die Abreicherung von Ampicillin oder Tetracyclin unter die zur Auslösung eines anaphylaktischen Schocks ausreichenden sehr niedrigen Konzentrationen ist dagegen schwierig. Ein weiterer entscheidender Vorteil besteht darin, dass Kanamycin wegen seiner Toxizität therapeutisch nicht mehr systemisch eingesetzt wird. Dadurch stellt die Entstehung Kanamycin- resistenter Krankheitserreger keine wesentliche, ansonsten bei einem Notfalleinsatz möglicherweise lebensbedrohliche, Gefahr dar.
Vorzugsweise stammt das für Annexin V kodierende Gen aus einem Huhn. Dieses Gen ist besonders gut für die Expression mittels des Expressionsvektors geeignet. Der Expressionsvektor mit dem 966 Basenpaare großen Annexin V Gen aus dem Huhn kann eine Größe von etwa 4000 Basenpaaren aufweisen und ist damit gut zu handhaben. Um eine besonders effiziente Expression von Annexin V in E. coli zu erreichen, können in dem für Annexin V kodierenden Gen sämtliche Codons durch solche er- setzt sein, die in E. coli bevorzugt translatiert werden. Es ist bekannt, am 5 ' -Ende eines Annexin-Gens für E. coli optimale Codons zu verwenden. Diese Maßnahme wird offensichtlich für ausreichend erachtet, um eine erhöhte Expressionseffizi- enz in E. coli zu erreichen. Überraschenderweise kann durch den Ersatz sämtlicher Codons im Annexin V-Gen durch in E. coli bevorzugt translatierte Codons eine weitere Erhöhung der Effizienz erreicht werden.
Weil das im Annexin V-Gen natürlicherweise vorhandene Stop-
Codon in E. coli überlesen werden kann, kann das resultierende Protein zusätzliche unerwünschte Aminosäuren aufweisen. Am 3 ' -Ende der Sequenz des für Annexin V kodierenden Gens ist deshalb vorzugsweise mindestens ein zusätzliches Stop-Codon im Leseraster des Gens vorhanden. Besonders bevorzugt sind zwei zusätzliche Stop-Codons vorhanden. Das bewirkt, dass das exprimierte Protein exakt an der vorgesehenen Stelle endet.
Vorzugsweise ist der erste Promotor ein tac-Promotor. Der Re- pressor kann ein Lac-Repressor sein. Der tac-Promotor entspricht dem von De Boer, H.A. et al . (1983) Proc Natl Acad Sei USA 80, Seiten 21 - 25 publizierten tac-Promotor. Er ist ein hybrider Promotor, der in Kombination mit der spezifischen Bindungsstelle für den Lac-Repressor eine, z.B. mit Al- lolactose oder Isopropyl-ß-D-thiogalactosid (IPTG) , induzierbare Expression des Annexin V-Gens erlaubt. Die Transkription wird in E. coli-Stämmen unterdrückt, welche einen hohen Pegel an Lac-Repressor erzeugen. Solche Stämme werden als lac Iq- Stämme bezeichnet. Bei dem Transkriptionsterminator kann es sich um den Transkriptionsterminator rrnB Tl oder rrnB T2 handeln. Es ist auch möglich, dass sowohl rrnBl Tl als auch rrnB T2 als Transkriptionsterminatoren in dem Expressionsvektor enthalten sind. Die Transkriptionsterminatoren rrnB Tl und T2 stammen aus dem rrnB Operon in E. coli. Bevorzugt sind in dem Expressionsvektor von den Komponenten des Vektors pBR322 das Ampicillin-Resistenz-Gen und/oder das Tetracyclin-Resistenz-Gen und von den Komponenten des Vektors pKK223-3 das Ampicillin-Resistenz-Gen, zumindest teilweise, nicht enthalten. Dadurch wird eine geringe Größe des Expressionsvektors ermöglicht. Vorzugsweise stammt das in dem Expressionsvektor enthaltene Kanamycin-Resistenz-Gen aus dem Vektor pACYC177 oder dem aus E. coli stammenden Transposon Tn903. Das Kanamycin-Resistenz-Gen aus dem Transposon Tn903 kann als Fragment durch Verdau des Plasmids pUC4K mit der Re- striktionsendonuklease Barn HI erhalten werden. Das Plasmid pUC4K ist z.B. von der Firma Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg zu beziehen. Der Vektor pACYC177 stammt aus dem E. coli-Stamm PC2166, welcher von der Deutschen Sammlung von Mi- kroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig (DSMZ) unter der Nummer DSM No . 5587 bezogen werden kann.
Vorzugsweise ist der zweite Promotor der Promotor pK aus dem Vektor pACYC177. Dieser Promotor ist stark genug, um eine für eine Kanamycin-Resistenz ausreichend hohe Expression des Ka- namycin-Resistenz-Gens sicherzustellen. Gleichzeitig wird durch den Promotor pK keine so starke Expression bewirkt, dass dadurch die Expression von Annexin V wesentlich vermindert wird. Das Kanamycin-Resistenz-Gen mit dem zweiten Promo- tor kann an den aus dem Vektor pBR322 stammenden Restriktionsschnittstellen Eco RI und Sty I oder der aus dem Vektor pKK223-3 stammenden Restriktionsschnittstelle Eco RI in den Expressionsvektor eingefügt sein. Vorzugsweise ist das Kanamycin-Resistenz-Gen mit dem zweiten Promotor pK in der Nu- kleotidsequenz 1816 bis 2771 des Vektors pACYC177 in dem Expressionsvektor enthalten.
Der Expressionsbereich kann an den aus dem Vektor pBR322 stammenden Restriktionsschnittstellen Ban I und Eco RI in den Expressionsvektor eingefügt sein. Vorzugsweise weist der Ex- pressionsbereich ohne das für Annexin V kodierende Gen die Sequenz SEQ ID NO: 1 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll auf.
Bei einem Ausführungsbeispiel ist in dem Expressionsvektor keine außerhalb der Klonierungsstelle gelegene Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease der Klasse II, welche eine Erkennungssequenz mit der Nukleotidfolge ATG aufweist, enthalten. Restriktionsendonukleasen der Klasse II erkennen eine spezifische Nukleotidsequenz und schneiden spezifisch in dieser Sequenz oder in der Nähe dieser Sequenz. Eine Restriktionsendonuklease der Klasse II, welche eine Erkennungssequenz mit der Nukleotidfolge ATG aufweist, erlaubt auf einfache Weise die Klonierung des Startcodons ATG eines zu exprimie- renden Gens. Der eine effiziente Translation der mRNA gewährleistende optimale Abstand zur Ribosomenbindungsstelle beträgt in Prokaryoten 4 bis 8 Nukleotide zwischen dem letzen Nukleotid der Ribosomenbindungsstelle und dem A des Startcodons. Wenn außerhalb der Klonierungsstelle keine Schnittstel- le für die genannte Restriktionsendonuklease vorhanden ist, ist es möglich, diese Schnittstelle spezifisch in der Klonierungsstelle zu verwenden, um auf einfache Weise die Klonierung des Startcodons des zu exprimierenden Annexin V-Gens im optimalen Abstand zur Ribosomenbindungsstelle zu ermöglichen. Das Entfernen der Restriktionsschnittstellen kann durch gerichtete Mutagenese erfolgen. Bevorzugt sind die Restriktionsendonukleasen Nde I und Nco I . Die Erkennungssequenz beider Restriktionsendonukleasen enthält die Nukleotidfolge ATG. Die Erkennungssequenzen kommen ansonsten aber selten vor, so dass nur wenige außerhalb der Klonierungsstelle gelegene Schnittstellen zu entfernen sind. Eine zu entfernende Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease Nde I kann aus dem Vektor pBR322 stammen. Der Expressionsvektor ohne das für Annexin V kodierende Gen kann die Sequenz SEQ ID NO: 2 gemäß dem anliegenden Sequenz- Protokoll aufweisen. Der Expressionsvektor mit Komponenten des Vektors pBR322 und einem vom Annexin V-Gen aus dem Huhn durch Codon-Optimierung abgeleiteten Annexin V-Gen kann die Sequenz SEQ ID NO: 3 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll aufweisen. In dieser Sequenz sind zwei zusätzliche Stop- Codons im Leseraster für Annexin V enthalten. Der Expressionsvektor mit Komponenten des Vektors pKK223-3 und dem Anne- xin V-Gen des Huhns kann die Sequenz SEQ ID NO: 4 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll aufweisen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine E. coli- Zelle, welche einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor ent- hält. Vorzugsweise gehört die E. coli-Zelle dem Stamm BL21 an. Dieser Stamm kann z.B. von der Firma Novagen, Inc., 601 Science Drive, Madison, WI 53711, USA bezogen werden. Diese Zelle hat sich als besonders geeignet für die Expression von Annexin V erwiesen. Die E. coli-Zelle kann auch einem lac Iq- Stamm, insbesondere dem Stamm JM105, angehören. Eine E. coli-
Zelle eines lac Iq-Stamms ist besonders geeignet für die Expression von Annexin V in einem Expressionsvektor, in welchem der erste Promotor der tac-Promotor ist. E. coli-Zellen vom Stamm JM105 können z.B. von der American Type Culture Collec- tion (ATCC) , Manassas, VA 20108, USA bezogen werden.
Ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor zur Expression von Annexin V kann durch ein Verfahren mit folgenden Schritten hergestellt werden:
al) Herstellen eines ersten Vektors durch vollständiges oder parzielles Entfernen der für die Replikation nicht erforderlichen Komponenten des Vektors pBR322 oder durch eine PCR-Amplifikation zumindest der Komponenten des Vektors pBR322, welche für die Replika- tion des Vektors erforderlich sind und anschließender Ligation,
Synthese eines Expressionsbereichs, welcher in Leserichtung aufeinander folgend einen ersten Promotor, eine für einen Repressor spezifische Bindungsstelle, eine einer prokaryotisehen Ribosomenbindungsstelle entsprechende Sequenz, eine Klonierungsstelle und einen Transkriptionsterminator aufweist und
Einfügen des Expressionsbereichs in den Vektor pBR322, den ersten Vektor oder einen aus diesen Vektoren durch einen der Schritte dieses Verfahrens entstandenen Vektor
oder
a2) Herstellen eines ersten Vektors durch vollständiges oder parzielles Entfernen der für die Replikation nicht erforderlichen Komponenten mit Ausnahme des eine Klonierungsstelle aufweisenden Expressionsbereichs des Vektors pKK223-3 oder durch eine PCR-Amplifika- tion des eine Klonierungsstelle aufweisenden Expres- sionsbereichs und zumindest der Komponenten des Vektors pKK223-3, welche für die Replikation des Vektors erforderlich sind und anschließender Ligation
und
b) Einfügen mindestens eines funktioneil aktiven Ka- namycin-Resistenz-Gens in den Vektor pBR322, den Vektor pKK223-3, den ersten Vektor oder einen aus diesen Vektoren durch einen der Schritte dieses Verfahrens entstandenen Vektor, wenn in dem ersten Vektor ansonsten kein funktionell aktives Kanamycin-Resistenz-Gen vorhanden ist und c) Einfügen eines für Annexin V kodierenden Gens in die Klonierungsstelle .
Das Einfügen und Entfernen erfolgt im Allgemeinen durch übliche Klonierungsschritte . Es versteht sich, dass die Schritte lit. b und lit. c sowohl bei einem Verfahren mit dem Schritt lit. al als auch bei einem Verfahren mit dem Schritt lit. a2 durchgeführt werden. Beim Schritt al kann das Entfernen oder die PCR-Amplifikation an dem Vektor pBR322 oder einem durch das Verfahren, insbesondere durch Einfügen des Expressionsbe- reichs, entstandenen Vektor erfolgen. Ein bei den Schritten al und a2 in dem Vektor bereits vorhandener Expressionsbereich wird bei der PCR-Amplifikation zusammenhängend mit den Komponenten des Vektors amplifiziert . Die Ligation ist erforderlich, um die bei der PCR-Amplifikation entstehenden freien Enden zu einem Vektor zu schließen. Dabei können die freien Enden des Vektors miteinander oder mit freien Enden einer einzufügenden DNA, insbesondere des Expressionsbereichs oder des für Annexin V kodierenden Gens, ligiert werden. Das Kanamycin-Resistenz-Gen ist funktionell aktiv, wenn nach dem Einfügen ein zweiter Promotor die Expression des Kanamycin- Resistenz-Gens ermöglicht. Das funktionell aktive Kanamycin- Resistenz-Gen umfasst den zweiten Promotor, wenn er nicht im Vektor vorhanden ist .
Das für Annexin V kodierende Gen kann aus einem Huhn stammen. Vorzugsweise werden in dem für Annexin V kodierenden Gen die Codons durch solche ersetzt, welche in E. coli bevorzugt translatiert werden. Eine solche Codon-Optimierung kann durch gerichtete Mutagenese oder Neusynthese erfolgen. In einem Ausführungsbeispiel des Verfahrens wird am 3 ' -Ende der Sequenz des für Annexin V kodierenden Gens mindestens ein zusätzliches Stop-Codon im Leseraster des Gens eingefügt. Besonders vorteilhaft ist das Einfügen von zwei zusätzlichen Stop-Codons. Vorzugsweise wird das Stop-Codon mittels eines, insbesondere die Sinnstrang-Sequenz SEQ ID NO : 5 und die An- tisinnstrang-Sequenz SEQ ID NO: 6 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll aufweisenden, Linkers eingefügt. Das Einfügen erfolgt bevorzugt in eine für Annexin V kodierende cDNA vor dem Einfügen in die Klonierungsstelle, wobei hier unter Einfügen auch ein endständiges Anfügen zu verstehen ist. Das Anfügen des Linkers mit den Sequenzen SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll erfolgt bevorzugt über eine in der Annexin V-cDNA vorhandene Bse RI- Restriktionsschnittstelle .
Bevorzugt ist der erste Promotor ein tac-Promotor. Der Repressor kann ein Lac-Repressor sein. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Transkriptionsterminator um den aus E. coli stammenden Transkriptionsterminator rrnB Tl oder rrnB T2. Es ist auch möglich, dass sowohl rrnBl Tl als auch rrnB T2 Transkriptionsterminatoren sind. Vorzugsweise wird beim Herstellen des ersten Vektors das Ampicillin-Resistenz-Gen und/oder zumindest ein Teil des Tetracyclin-Resistenz-Gens entfernt oder nicht mittels PCR amplifiziert . Das Kanamycin-Resistenz- Gen kann vor dem Einfügen durch eine PCR amplifiziert oder aus einem Plasmid isoliert worden sein. Das Einfügen des zweiten Promotors ist nicht erforderlich, wenn in dem Vektor ein Promotor vorhanden ist, welcher die Expression des Ka- namycin-Resistenz-Gens ermöglicht. Vorzugsweise stammt das Kanamycin-Resistenz-Gen aus dem Vektor pACYC177 oder dem aus E. coli stammenden Transposon Tn903. Das Kanamycin-Resistenz- Gen kann mit einem zweiten Promotor, insbesondere dem Promotor pK aus dem Vektor pACYC177, eingefügt werden. Das Kanamycin-Resistenz-Gen mit dem zweiten Promotor wird vorzugs- weise an den aus dem Vektor pBR322 stammenden Restriktionsschnittstellen Eco RI und Sty I oder der aus dem Vektor pKK223-3 stammenden Restriktionsschnittstelle Eco RI eingefügt. Das umfasst auch ein Einfügen in den Vektor pBR322 oder pKK223-3 selbst. Bei einem Ausführungsbeispiel wird das Ka- namycin-Resistenz-Gen mit dem zweiten Promotor pK durch PCR- Amplifikation der Nukleotidsequenz 1816 bis 2771 des Vektors pACYC177 erhalten. Bevorzugt wird der Expressionsbereich an den aus dem Vektor pBR322 stammenden Restriktionsschnittstellen Ban I und Eco RI eingefügt. Das Einfügen kann dabei auch in den Vektor pBR322 selbst erfolgen. In einer Ausgestaltung weist der Expressionsbereich ohne das für Annexin V kodierende Gen die Sequenz SEQ ID NO : 1 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll auf.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn eine außerhalb der Klonierungsstelle gelegene Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease der Klasse II, welche eine Erkennungssequenz mit der Nukleotidfolge ATG aufweist, insbesondere durch gerichtete Mutagenese, entfernt oder so verändert wird, dass die Re- striktionsendonuklease an dieser Schnittstelle nicht mehr schneiden kann. Um die oben erläuterten Vorteile einer ATG- Sequenz in der Erkennungssequenz ausnutzen zu können, muss das Entfernen oder Verändern vor dem Einfügen eines zu expri- mierenden Gens erfolgen. Vorzugsweise handelt es sich bei der Restriktionsendonuklease um Nde I oder Nco I. In einer Ausführungsform weist der Expressionsvektor ohne das für Annexin V kodierende Gen die Sequenz SEQ ID NO: 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll auf. Der vollständige Expressionsvektor kann die Sequenz SEQ ID NO: 3 gemäß dem anliegenden Sequenz- protokoll aufweisen. Diese Sequenz enthält ein vom Annexin V- Gen aus dem Huhn durch Codon-Optimierung abgeleitetes Gen. In diese Sequenz sind zwei zusätzliche Stop-Codons im Leseraster für Annexin V eingefügt worden. Der Expressionsvektor kann auch die Sequenz SEQ ID NO: 4 gemäß dem anliegenden Sequenz- protokoll aufweisen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand möglicher Klonierungs- schemas erläutert. Es zeigen: Fig. 1 das Einfügen des Produkts der PCR-Amplifikation des Kanamycin-Resistenz-Gens mit dem zugehörigen Promotor pK aus dem Vektor pACYC177 in den Vektor pBR322,
Fig. 2 das Entfernen der Restriktionsschnittstelle Nde I in dem daraus resultierenden Vektor und
Fig. 3 das Einfügen des Expressionsbereichs in den resul- tierenden Vektor.
Aus dem in Fig. 1 gezeigten Vektor pACYC177 werden die das Kanamycin-Resistenz-Gen mit dem zugehörigen Promotor pK umfassenden Nukleotide 1816 - 2771 mittels einer PCR-Reaktion amplifiziert . Das Produkt dieser Reaktion wird mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sty I verdaut. Es wird in den ebenfalls mit diesen Enzymen verdauten Vektor pBR322 einklo- niert .
Aus dem daraus resultierenden Vektor wird durch eine gerichtete Mutagenese die Restriktionsschnittstelle Nde I entfernt. Das ist schematisch in Fig. 2 dargestellt. Fig. 3 zeigt schematisch, wie der synthetisch hergestellte Expressionsbereich in den resultierenden Vektor an den Restriktionsschnittstel- len Ban I und Eco RI einkloniert wird.
Poly A+-RNA aus Hühnerleber wird zur Herstellung von Gesamt- cDNA revers transkribiert. Für Annexin V kodierende cDNA wird aus der Gesamt-cDNA mittels PCR amplifiziert . Die amplifi- zierte cDNA wird an den durch entsprechende Primer bei der
PCR eingeführte Restriktionsschnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Nde I und Barn HI enzymatisch verdaut. Diese cDNA wird an den im Vektor in dem Bereich zwischen der mit SD gekennzeichneten Ribosomenbindungsstelle und dem mit Tl ge- kennzeichneten Transkriptionsterminator ebenfalls vorhandenen Restriktionsschnittstellen Barn HI und Nde I in den Vektor einkloniert .
Bei einem weiteren Klonierungsschema wird die gesamte Sequenz des Vektors pKK223-3 mit Ausnahme des für die Ampicillin- Resistenz kodierenden Gens und des dazugehörenden Promotors mittels einer PCR amplifiziert . Die dazu verwendeten Primer weisen die Sequenzen SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll auf. Die amplifizierte Sequenz wird an den durch jeden der Primer jeweils eingeführten
Schnittstellen für das Restriktionsenzym Bgl II geschnitten. Das aus dem Transposon Tn903 aus E. coli stammende Kanamycin- Resistenz-Gen wird als Fragment des Vektors pUC4K durch einen Verdau dieses Vektors mit der Restriktionsendonuklease Barn HI gewonnen. Das die Kanamycin-Resistenz aufweisende Fragment und die amplifizierte Sequenz werden an den durch den Verdau mit Barn HI und Bgl II entstandenen kompatiblen kohäsiven Enden der Schnittstellen zu einem ersten Vektor ligiert. Die darin in dem aus dem Vektor pKK223-3 stammenden Expressions- bereich enthaltene Klonierungsstelle wird mit der Restriktionsendonuklease Eco RI geschnitten. Die dabei entstandenen Nukleotidüberhänge werden mittels des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I aufgefüllt und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert .
Aus embryonalen Hühnerfibroblasten wird Poly A+-RNA isoliert. Daraus wird mittels einer reversen Transkription cDNA gewonnen. Für Annexin V kodierende cDNA wird daraus mittels PCR amplifiziert . Die amplifizierte cDNA wird mit der Restrikti- onsendonuklease Nco I und anschließend mit der Restriktionsendonuklease Barn HI verdaut. Die Nukleotidüberhänge des für Annexin V kodierenden Fragments werden mittels des Klenow- Fragments von DNA-Polymerase I aufgefüllt. Das resultierende Fragment wird mit dem Eco RI -geschnittenen aufgefüllten und dephosphorylierten ersten Vektor zu einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor ligiert .

Claims

Patentansprüche
1. Expressionsvektor enthaltend
- zumindest die Komponenten des Vektors pBR322 oder pKK223-3, welche für dessen Replikation erforderlich sind
einen Expressionsbereich, welcher in Leserichtung aufeinander folgend einen ersten Promotor, eine für einen Repressor spezifische Bindungsstelle, eine einer prokaryotisehen Ribosomenbindungsstelle entsprechende Sequenz, eine Klonierungsstelle mit einem für Annexin V kodierenden Gen und mindestens einen Transkriptions- terminator aufweist und
mindestens ein Kanamycin-Resistenz-Gen mit einem zweiten Promotor.
2. Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei das für Annexin
V kodierende Gen aus einem Huhn stammt .
3. Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei in dem für Annexin V kodierenden Gen sämtliche Codons durch solche ersetzt sind, die in E. coli bevorzugt translatiert werden.
4. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei am 3 ' -Ende der Sequenz des für Annexin V kodierenden Gens mindestens ein zusätzliches Stop-Codon, vorzugsweise zwei zusätzliche Stop-Codons, im Leseraster des Gens vorhanden ist/sind.
5. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste Promotor ein tac-Promotor ist.
6. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Repressor ein Lac-Repressor ist.
7. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei der Transkriptionsterminator der Transkriptionsterminator rrnB Tl oder rrnB T2 ist.
8. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei von den Komponenten des Vektors pBR322 das Ampi- cillin-Resistenz-Gen und/oder das Tetracyclin-Resistenz-Gen und von den Komponenten des Vektors pKK223-3 das Ampicillin- Resistenz-Gen, zumindest teilweise, nicht enthalten sind.
9. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei das Kanamycin-Resistenz-Gen aus dem Vektor pACYC177 oder dem aus E. coli stammenden Transposon Tn903 stammt .
10. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei der zweite Promotor der Promotor pK aus dem Vektor pACYC177 ist.
11. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Kanamycin-Resistenz-Gen mit dem zweiten Promo- tor an den aus dem Vektor pBR322 stammenden Restriktionsschnittstellen Eco RI und Sty I oder der aus dem Vektor pKK223-3 stammenden Restriktionsschnittstelle Eco RI in den Expressionsvektor eingefügt ist.
12. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Kanamycin-Resistenz-Gen mit dem zweiten Promotor pK in der Nukleotidsequenz 1816 bis 2771 des Vektors pACYC177 in dem Expressionsvektor enthalten ist.
13. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei der Expressionsbereich an den aus dem Vektor pBR322 stammenden Restriktionsschnittstellen Ban I und Eco RI in den Expressionsvektor eingefügt ist.
14. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei der Expressionsbereich ohne das für Annexin V kodierende Gen die Sequenz SEQ ID NO: 1 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll aufweist.
15. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei keine außerhalb der Klonierungsstelle gelegene
Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease der Klasse II, welche eine Erkennungssequenz mit der Nukleotidfolge ATG aufweist, enthalten ist.
16. Expressionsvektor nach Anspruch 15, wobei die Restriktionsendonuklease Nde I oder Nco I ist.
17. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Expressionsvektor ohne das für Annexin V ko- dierende Gen die Sequenz SEQ ID NO : 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll aufweist.
18. Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Expressionsvektor die Sequenz SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll aufweist .
19. E. coli-Zelle enthaltend einen Expressionsvektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche .
20. E. coli-Zelle nach Anspruch 19, wobei die E. coli-Zelle dem Stamm BL21 oder einem lac Iq-Stamm, insbesondere dem Stamm JM105, angehört.
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