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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
allgemein die Behandlung von verschiedenen viralen und parasitären Infektionen
und von Krebs, insbesondere durch eine Verstärkung der Erzeugung von zytotoxischen
T-Zellen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Interleukin-11 (IL-11) ist ein multifunktionelles
Zytokin, welches Aktivitäten
auf eine Reihe von Typen von hämopoetischen
Zellen und Immunzellen hat. Zusätzlich
zu seinen Wirkungen auf die Vorläufer von
Megakaryozyten, Myelozyten und Erythrozyten reguliert IL-11 auch
die entzündungsförderende
Zytokinproduktion von aktivierten Makrophagen sehr stark herunter.
Demzufolge wurde gezeigt, dass IL-11 in einer Reihe von Tiermodellen
akuter und chronischer Entzündung
die Entzündung
vermindert und ein Heilen fördert.
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Zytotoxische T-Zellen [CTL] sind
CD8+-Effektorzellen, deren primärer Zweck
darin besteht, Zielzellen in einer MHC Klasse I-restringierten Weise
zu erkennen und abzutöten.
Der Mechanismus der Zytotoxizität
ist die Freisetzung von elektrondichten zytoplasmatischen Granulen
sowie die Wechselwirkung von CD95L (Fast) mit CD95 (Fas) auf Zielzellen.
Die Immunüberwachungseigenschaften
von CTL führen
zu einem Schutz des Wirts von einer Vielzahl intrazellulärer Pathogene
wie etwa Viren und Parasiten. Zusätzlich kann die Erkennung von
Tumorantigenen durch CD8+-T-Zellen zur Induktion
einer zellspezifischen Immunreaktion gegen Tumoren führen (Zinkernagel,
R. M. and Hengartner, N., Antiviral Immunity Immunology Today, 18:
258–260
(1997)).
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Diese Erkrankungen und ihre Symptome werden
nachstehend kurz zusammengefasst. Gemäß der vorliegenden Erfindung
ist IL-11 in vivo oder ex vivo zu verabreichen um die CTL-Reaktion
des Wirts für
eine Erhöhung
der Immunüberwachung
zu verstärken,
wodurch die nachfolgenden Erkrankungen behandelt werden.
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KURZE ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Überraschenderweise
haben die jetzigen Erfinder festgestellt, dass IL-11 die Fähigkeit
aufweist, die Erzeugung von zytotoxischen T-Zellen [CTL] zu steigern.
Zellen, die in der Gegenwart von IL-2 und IL-11 restimuliert wurden,
zeigen gegenüber
Zellen, die nur mit IL-2 restimuliert wurden, eine signifikante Zunahme
der Antigen-spezifischen zytolytischen Aktivität. Weiterhin konnte bei der
Erzeugung von CTL-Aktivität
IL-2 gegen IL-11 ausgetauscht werden. Die Zugabe von IL-11 während in
vitro Restimulation führte
auch zu einem höheren
Gehalt an der Sezernierung von Interferon γ [IFN γ] und der Anzahl von Zellen,
die in Reaktion auf eine Antigen-Stimulation IFN γ produzieren.
In anderen Systemen zeigte IL-11 eine synergistische Wirkung mit
anderen Faktoren, wie etwa IL-12, wobei die Anzahl und lytische
Aktivität
von CTL erhöht
wurde. Diese Untersuchungen deuten darauf hin, dass IL-11 die Erzeugung
von CTL unterstützen
kann und eine Rolle in der Abwehr gegen intrazelluläre Pathogene
haben kann. Daher kann IL-11 somit als ein Hilfsfaktor bei der Induktion von
CTL wirken.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Behandlung einer Reihe von Erkrankungen, bei denen gezeigt worden
ist, dass die Verstärkung
der Aktivität von
zytotoxischen T-Zeilen
günstig
ist, umfassend akute virale Erkrankungen wie etwa Grippe (Influenza),
chronische virale Erkrankungen, wie etwa Epstein-Barr-Virus [EBV],
Humanimmundefizienzvirus [HIV], Herpes, Hepatitis und Varizella
zoster, parasitäre
Infektionen, wie etwa Malaria und Tuberkulose, und Krebs. Zusätzlich offenbart
die vorliegende Erfindung die ex vivo Verstärkung der T-Zellaktivität aus Zellen,
welche von Patienten mit den vorstehenden Erkrankungen stammen,
gefolgt von dem nachfolgenden erneuten Einbringen der modifizierten
Zellen in die Patienten.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
sind IL-11, Analoga und Derivate davon an Patienten zu verabreichen,
entweder prophylaktisch oder beim Einsetzen von mit den vorstehenden
Erkrankungen assoziierten Symptomen. IL-11 kann in geeigneten pharmazeutisch
akzeptablen Trägern
entweder alleine oder in Kombination mit anderen konventionellen Mitteln,
welche die mit den vorstehenden Erkrankungen assoziierten Symptome
lindern können,
verabreicht werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
kann IL-11 zusammen mit einem Impfstoff gegen virale oder bakterielle
Pathogene, wie etwa einem Grippeimpfstoff, verabreicht werden. In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
kann IL-11 zusammen mit einem Antitumormittel verabreicht werden,
und an Patienten verabreicht werden, die an Krebs oder einer anderen
Tumorbildung leiden.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Behandlung einer Reihe von Erkrankungen, bei denen gezeigt worden
ist, dass die Verstärkung
der Aktivität von
zytotoxischen T-Zellen
günstig
ist, umfassend akute virale Erkrankungen wie etwa Grippe, chronische
virale Erkrankungen, wie etwa EBV, HIV, Herpes, Hepatitis und Varizella
zoster, intrazelluläre
Pathogene, wie etwa Malaria und Tuberkulose, und Krebs. Zusätzlich offenbart
die vorliegende Erfindung die ex vivo Verstärkung der T-Zellaktivität aus Zellen, welche
von Patienten mit den vorstehenden Erkrankungen stammen, gefolgt
von dem nachfolgenden erneuten Einbringen der modifizierten Zellen
in die Patienten.
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Ruhende B-Zellen, Makrophagen, CD4+-T-Zellen und CD8+-T-Zellen
exprimieren die IL-11-Rezeptor-alpha-Kette, was auf eine mögliche Wechselwirkung
von IL-11 mit diesen Zellpopulationen hinweist. Um die Rolle von
IL-11 als ein immunmodulierendes Protein zu verstehen, wurde dessen Fähigkeit,
direkt mit verschiedenen Lymphozytpopulationen zu wechselwirken,
untersucht. IL-11 hat eine direkte Wechselwirkung mit einer Anigen-präsentierenden
Zelle [APC], dem Makrophagen, wobei die LPS-induzierte Produktion
von entzündungsfördernden
Zytokinen wie etwa TNF-α,
IL-1b und IL-12 inhibiert wird. IL-11 hat auch eine direkte Wechselwirkung
mit gereinigten Populationen von aktivierten CD4+-T-Zellen
aus Maus, wobei die Produktion von Zytokinen wie etwa IL-4, IL-5,
IL-10, IL-13 und IFN-g verstärkt
oder inhibiert wird. Diese Ergebnisse weisen auf eine Fähigkeit
von IL-11 hin, T-Zell-Helferaktivität entweder direkt oder indirekt
durch die APC zu verstärken.
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Angesichts der Fähigkeit von IL-11, die Effektoraktivität von Makrophagen
und CD4+-T-Zellen zu
modulieren, wurde dessen Fähigkeit,
die zytotoxische CD8+-T-Zell-Effektorfunktion
entweder direkt oder indirekt durch die APC oder T-Helferzellen
zu beeinflussen, untersucht. Milzzellen aus Balb/c Mäusen, die
mit Grippevirus immunisiert worden waren, wurden isoliert und sieben
Tage in vitro mit einem von Grippevirus stammenden, MHC Klasse 1-restringiertem
Peptid restimuliert. Zellen, die in der Gegenwart von sowohl IL-2
als auch rhIL-11 restimuliert worden waren, zeigten eine signifikante
Erhöhung
der Antigen-spezifischen zytolytischen Aktivität gegenüber Zellen, die in der Gegenwart
von IL-2 alleine restimuliert worden waren. Zellen, die in der Gegenwart
von rhIL-11 alleine restimuliert worden waren, zeigten ebenfalls
eine signifikante Erhöhung
der Antigen-spezifischen zytolytischen Aktivität. Dies weist darauf hin, dass
rhIL-11 das Erfordernis von exogenem IL-2 in diesem System ersetzen
kann. Die Zugabe von rhIL-11 während
der in vitro Restimulation führte
auch zu einem erhöhten
Gehalt sowohl der durch Antigen angetriebenen IFNγ Produktion
als auch der Anzahl von IFNγ-sezernierenden
Zellen.
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Interleukin 11 [IL-11] ist ein pleiotropes
Zytokin, das primitive lymphohämopoetische
Vorläuferzellen
stimuliert und eine synergistische Wirkung mit anderen hämopoetischen
Wachstumsfaktoren aufweist, wobei die Proliferation und Reifung
von Megakanozyten stimuliert wird. IL-11 ist ausführlich in
WO 91/07495, sowie in US Patent Nr. 5,215,895, erteilt am 1. Juni
1993, beschrieben. Ein kloniertes humanes IL-11 wurde früher, am
30. März
1990, bei der ATCC, 12301 Parklaven Drive, Rockville, Maryland, unter
der ATCC Nr. 68284 hinterlegt. Darüber hinaus kann IL-11 auch
rekombinant als ein Fusionsprotein mit einem anderen Protein produziert
werden, wie in US Patent Nr. 5,270,181, erteilt am 14. Dezember 1993,
und in US Patent Nr. 5,292,646, erteilt am 8. März 1994, beschrieben. IL-11
kann in einer Reihe von Wirtszellen produziert werden, mittels heutzutage
konventioneller gentechnischer Methoden. Zusätzlich kann IL-11 aus verschiedenen
Zelllinien erhalten werden, beispielsweise der humanen Lungenfibroblastenzelllinie
MRC-5 (ATCC Zugangsnr. CCL 171) und Paul et al., der humanen Trophoblastenzelllinie
TPA30-1 (ATCC Zugangsnr. CRL 1583). In Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87: 7512 (1990) ist eine für
humanes IL-11 kodierende cDNA beschrieben, sowie die abgeleitete
Aminosäuresequenz
(Aminosäuren
1 bis 199). Das US Patent Nr. 5,292,646, vorstehend, beschreibt
eine des-Proform von IL-11, bei der das N- terminale Prolin der reifen Form von
IL-11 (Aminosäuren
22 bis 199) entfernt worden ist (Aminosäuren 23 bis 199). Wie für den Fachmann
ersichtlich, ist jede Form von IL-11, welche IL-11-Aktivität aufweist, gemäß der vorliegenden
Erfindung geeignet.
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Zusätzlich zu rekombinanten Techniken kann
IL-11 auch durch bekannte, herkömmliche
chemische Synthese produziert werden. Methoden, um die in der vorliegenden
Erfindung geeigneten Peptide mittels synthetischer Mittel zu konstruieren,
sind dem Fachmann bekannt. Es wird davon ausgegangen, dass die synthetisch
konstruierten Zytokinpolypeptidsequenzen aufgrund gemeinsamer primärer, sekundärer und
tertiärer
Struktur- und Konformationscharakteristika mit den natürlichen
Zytokinpolypeptiden mit diesen gemeinsame biologische Aktivitäten aufweisen.
Derartige synthetisch konstruierte Zytokinpolypeptidsequenzen oder
Fragmente davon, welche die Funktionalität davon duplizieren oder teilweise duplizieren,
können
im erfindungsgemäßen Verfahren
auch verwendet werden. Somit können
sie als biologisch aktive oder immunologische Ersatzsubstanzen für die in
der vorliegenden Erfindung geeigneten natürlichen, gereinigten Zytokine
verwendet werden.
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Modifikationen in den Protein-, Peptid-
oder DNA-Sequenzen dieser Zytokone oder aktiven Fragmente davon
können
auch Proteine produzieren, welche in den Verfahren dieser Erfindung
verwendet werden können.
Derartige modifizierte Zytokine können vom Fachmann unter Verwendung
bekannter Techniken hergestellt werden. Interessante Modifikationen
in den Zytokinsequenzen, z. B. der IL-11-Sequenz, können den Austausch, die Insertion
oder Deletion eines oder mehrerer ausgewählter Aminosäurereste
in den kodierenden Sequenzen umfassen. Mutationstechniken für einen
derartigen Austausch, eine derartige Insertion oder Deletion sind
dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. US Patent Nr. 4,518,584).
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Andere spezifische Mutatioen der
Sequenzen der Zytokinpolypeptide, welche wie hierin beschrieben
therapeutisch nützlich
sein können,
können
z. B. das Einführen
einer oder mehrerer Glykosilierungsstellen umfassen. Eine Asparagin-verknüpfte Glykosilierungserkennungsstelle
kann in die Sequenz eingeführt
werden durch die Deletion, Substitution oder Addition von Aminosäuren in
der Peptidsequenz oder von Nukleotiden in der DNA-Sequenz. Derartige
Veränderungen
können
an jeder Stelle des Moleküls
eingeführt
werden, welche durch das Hinzufügen
von O-verknüpftem
Kohlehydrat modifiziert wird. Die Expression derart veränderter
Nukleotid- oder Peptidsequenzen produziert Varianten, die an diesen
Stellen glykosiliert werden können.
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Zusätzliche Analoga und Derivate
der Sequenz des ausgewählten
Zytokins, von denen erwartet werden würde, dass sie dessen Aktivität teilweise oder
vollständig
beibehalten oder verlängern,
und von denen erwartet wird, dass sie im vorliegenden Verfahren
geeignet sind, können
vom Fachmann leicht hergestellt werden. Eine derartige Modifikation kann
die Bindung von Polyethylenglykol (PEG) an existierende Lysinreste
in der Zytokinsequenz sein, oder das Einführen von einem oder mehreren
Lysinresten oder von anderen Aminosäuren, die mit PEG oder PEG-Derivaten
reagieren in können,
in die Sequenz, um die Bindung von PEG-Resten zu ermöglichen.
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Zusätzliche Analoga dieser ausgewählten Zytokine
können
auch durch allelische Variationen in den für sie kodierenden DNA-Sequenzen,
oder durch induzierte Variationen in den für sie kodierenden DNA-Sequenzen
charakterisiert werden. Es wird davon ausgegangen, dass alle in
den vorstehend erwähnten
Publikationen erwähnten
Analoga, einschließlich
diejenigen, welche durch DNA-Sequenzen charakterisiert sind, die
unter stringenten Hybridisierungsbedingungen oder nichtstringenten
Bedingungen (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual,
2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)) an die
offenbarten Zytokinsequenzen hybridisieren können, in dieser Erfindung ähnlich geeignet
sind.
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Zusätzlich ist von der Technik
umfasst, Peptidliganden oder kleine Molekülanaloga von IL-11 zu erzeugen,
welche mit dem IL-11-Rezeptor wechselwirken können und somit die Wirkungen
blockieren [Antagonisten] oder die gleichen oder ähnliche
Wirkungen wie diejenigen von IL-11 produzieren [Agonisten]. Methoden
zur Erzeugung und zum Testen derartiger Liganden und kleiner Moleküle sind
in der PCT Patentveröffentlichung
WO 96/19574 offenbart. Derartige Liganden und kleine Molekülanaloga
sind in der vorliegenden Erfindung auch geeignet.
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In diesen Verfahren werden auch Fusionsmoleküle als geeignet
erachtet, hergestellt durch Fusionieren der Sequenz oder eines biologisch
aktiven Fragments der Sequenz eines Zytokins an ein anderes Zytokin
oder ein proteinhaltiges therapeutisches Mittel, z. B. IL-11 an
IL-6 fusioniert (siehe z. B. Fusionsmethoden, beschrieben in PCT/US91/06186 (WO
92/04455), veröffentlicht
am 19. März
1992). Alternativ können
gemäß dem Verfahren
Kombinationen der Zytokine zusammen verabreicht werden.
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Die vorliegende Erfindung beinhaltet
somit die Behandlung von Patienten mit akuten viralen Erkrankungen
wie etwa Grippe, chronischen viralen Erkrankungen, wie etwa EBV,
HIV, Herpes, Hepatitis und Varizella zoster, parasitären Infektionen,
wie etwa Malaria und Tuberkulose, und Krebs, und sie beinhaltet
das Verabreichen einer wirksamen Menge von IL-11 in einem pharmazeutischen
Träger.
Die Behandlung kann therapeutisch oder prophylaktisch sein, oder
sie kann beim Einsetzen von mit den vorstehenden Erkrankungen assoziierten
Symptomen erfolgen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
ist IL-11 zusammen mit einem Impfstoff gegen virale oder bakterielle
Pathogene, wie etwa denjenigen, welche die vorstehenden Erkrankungen
hervorrufen, zu verabreichen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ist IL-11 zusammen mit einem Antitumormittel zu verabreichen, und
kann an Patienten verabreicht werden, die an Krebs oder einer anderen Tumorbildung
leiden.
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Geeignete pharmazeutisch akzeptable
Träger
erleichtern die Verabreichung von IL-11 und sind in der Technik gut bekannt.
Beispiele für
Träger
umfassen sterile Salzlösung,
Lactose, Sucrose, Calciumphosphat, Gelatine, Dextrin, Agar, Pektin,
Erdnussöl,
Olivenöl,
Sesamöl
und Wasser. Zusätzlich enthält der Träger oder
das Verdünnungsmittel
ein Verzögerungsmaterial,
wie etwa Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat alleine oder
mit einem Wachs. Zusätzlich
können
Polymerformulierungen mit langsamer Freisetzung verwendet werden.
Geeignete Matrices mit lang anhaltender Freisetzung enthalten den
Wirkstoff in einem Gemisch aus einem oder mehreren der nachfolgenden
Substanzen: Natriumbentonit, Ethylcellulose, Stearinsäure, Calciumstearat,
Adipinsäure,
Fumarsäure, Polyethylenglykol, desacetyliertes
Chitin und Celluloseacetat. Geeignete Konservierungsmittel und/oder
Stabilisierungsmittel können
aufgenommen sein.
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Alternativ kann IL-11 mit anderen
biologischen Faktoren und/oder herkömmlichen Mitteln, welche die
mit den vorstehend genannten Erkrankungen assoziierten Symptome
lindern können,
kombiniert werden, wie für
den Fachmann offensichtlich ist. Beispielsweise kann IL-11 zusammen
mit CSF, wie etwa GCSF, GMCSF oder MCSF, mit Erythropoetin, Hepatopoetin,
oder Interleukinen, wie etwa IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6,
IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14 oder IL-15, oder mit
Rezeptoren für
jedes der vorstehenden Moleküle
verabreicht werden. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen die gemeinsame
Verabreichung mit IL-12, IL-6 oder IL-2. Eine geeignete IL-11-Formulierung
umfasst beispielsweise 5 mg IL-11, 3,10 mg Histidin und 22,5 mg
Glycin, beispielsweise als ein lyophilisiertes Pulver, das mit 1 ml
sterilem Wasser zur Injektion rekonstituiert werden kann. Wie für den Fachmann
ersichtlich, sind andere geeignete Formulierungen gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung ebenso wirksam.
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Bei der Behandlung der vorstehend
genannten Erkrankungen kann IL-11 mittels jedes geeigneten Verabreichungswegs
verabreicht werden, aber für
bestimmte Erkrankungen sind bestimmte Verabreichungswege bevorzugt,
z. B. systemische Verabreichung, d. h. parenteral. Von den parenteralen
Verabreichungswegen sind subkutan und intravenös bevorzugt. IL-11 kann intravenös bereitgestellt
werden oder topisch in Formulierungen auf die Nasenschleimhaut oder
die Bindehaut oder die Mundschleimhaut aufgebracht werden, als wässrige Tropfenformulierung
bzw. eine Mundspülung.
In lokalisierten Oberflächenreaktionen
ist eine topische Formulierung bevorzugt, während in schwerwiegenderen Erkrankungen
im Allgemeinen über
den ganzen Körper
parenterale Verabreichungswege, wie etwa subkutane oder intravenöse Injektion
bevorzugt sind. Geeignete Dosismengen von IL-11 liegen im Bereich von
1–50 μg/kg subkutan
für mehrere
Dosierungen täglich,
und für
kürzere
Behandlungszeiträume
bei schwerwiegenden T-Zell-Zuständen
werden die Dosismengen auf 50 bis 100 μg/kg subkutan oder intravenös erhöht. Im Allgemeinen
variiert eine geeignete Zytokindosis, z. B. von IL-11, über einen
breiten Bereich, bevorzugt zwischen 1 und 100 μg/kg Körpergewicht. Eine andere geeignete
Dosis kann im Bereich von etwa 10 bis 50 μg/kg liegen und etwa 50 μg/kg betragen,
mit einer bevorzugten Menge von etwa 25 μg IL-11 pro Kilogramm Körpergewicht.
Falls erwünscht,
können
die Dosismengen auf Einheiten abgestellt werden. Eine Einheit wird
herkömmlich
beschrieben als diejenige Konzentration an Polypeptid, welche zu
einer halbmaximalen Stimulierung in einem geeigneten Assay führt, z.
B. für
IL-11 dem in WO 91/07495 beschriebenen Assay T1165. Dosierungen
können
während
zwischen einem Tag und sechs Monaten verabreicht werden, oder so
lange, wie es erforderlich und sicher erscheint, wie durch den behandelnden
Arzt mittels Standardtests leicht ermittelt wird, in Abhängigkeit
von der Natur der zu behandelnden Erkrankung. Wenn angemessen können die
Dosismengen nach oben oder nach unten geregelt werden, beispielsweise
ein Dosierungsplan, welcher je nach Indikation die Verabreichung
von IL-11 in einer Dosis von 25 μg/kg
täglich
während
einer Woche oder weniger Tage oder mehrerer Wochen erfordert. Der
Behandlungsfortschritt wird durch Messung von Markern, die mit der
zu behandelnden Erkrankung assoziiert sind, entsprechend überwacht, um
zu bestimmen, ob eine derartige Dosis zu einem Anstieg von beispielsweise
Perforin (oder einem entsprechenden Marker) führt, und wenn nicht, wird die Dosis
während
eines zusätzlichen
Behandlungszeitraums auf das Zweifache erhöht und die Gehalte an Markern
gemessen, bis ein wirksamer Dosierungsplan erreicht wird.
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Ein alternativer Modus einer therapeutischen Behandlung
ist die ex vivo Expansion von CTL aus betroffenen Patienten. Beispielsweise
können
mononukleare Zellen aus peripherem Blut [PBMC] aus dem Blut von
Patienten isoliert werden und in vitro mit verschiedenen Dosismengen
von rhIL-11 stimuliert werden, um die Erzeugung von CTL zu verstärken. Zweckmäßige in
vitro Dosismengen von 10 ng/ml bis 500 ng/ml sind wünschenswert.
Zytotoxische T-Zell-Assays können
durchgeführt
werden um die maximal wirksame Dosis zu bestimmen. Danach können Zellen
in den Patienten zurückgeführt werden.
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Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen
die vorliegende Erfindung und insbesondere die Verwendung von IL-11
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von akuten viralen
Infektionen wie etwa Grippe, chronischen viralen Infektionen, wie
etwa EBV, HIV, Herpes, Hepatitis und Varizella zoster, parasitären Infektionen,
wie etwa Malaria und Tuberkulose, und Krebs. Zusätzlich werden von der vorliegenden
Erfindung bereitgestellt die ex vivo Verstärkung der T-Zellaktivität aus Zellen,
welche von Patienten mit den vorstehenden T-Zell-Erkrankungen stammen,
gefolgt von dem nachfolgenden erneuten Einbringen der modifizierten
Zellen in die Patienten. Für
den Fachmann, der die vorliegende Beschreibung gelesen hat, werden
jedoch viele Modifikationen und Alternativen der Erfindung offensichtlich
sein. Beispielsweise wird vom Fachmann verstanden werden, dass IL-11 das von den derzeit im
Stand der Technik offenbarten Sequenzen produzierte Protein umfasst,
sowie Proteine, welche durch die vorstehend beschriebenen Modifikationen
charakterisiert sind, welche eine im Wesentlichen ähnliche
Aktivität
wie IL-11 beibehalten. Zusätzlich
wird erkannt werden, dass die vorstehenden Modifikationen, Analoga
von IL-11 in den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
Somit schränken die
Beispiele den Umfang der Erfindung in keiner Weise ein.
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Beispiel 1 Die IL-11-Rezeptor-alpha-Kette
wird auf B- und T-Lymphozyten exprimiert
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B-Zellen und CD4+-
und CD8+-T-Zellen aus Maus wurden aus Balb/c-Milzen
unter Verwendung von positiver Selektion mit MACS (magnetische Zellsortierung)
Mikrokügelchen,
konjugiert an anti-Maus-B220-, anti-Maus-CD4- oder anti-Maus-CD8-Antikörper gereinigt,
gemäß dem Herstellerprotokoll
(Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA). RNA wurde aus vorstehend beschriebenen
gereinigten Zellpopulationen unter Verwendung von RNA Stat-60 (Tel-test,
Inc., TX) gemäß dem Herstellerprotokoll
extrahiert. RNA wurde 30 min bei 37°C mit DNase (RQ1 DNase, Promega,
Madison, WI) behandelt, danach 5 min bei 75°C wärmeinaktiviert. RT-PCR wurde durchgeführt (GeneAmp
RNA PCR Kit, Perkin Elmer), unter Verwendung von 40 ng RNA (10 ng
für GAPDH)
und Oligopaaren, die für
GAPDH, IL-11-Rezeptor-alpha-Kette,
IL-10-Rezeptor, IL-6-Rezeptor oder gp130 aus Maus spezifisch waren,
und auf einem mit Ethidium angefärbten
Agarosegel (gezeigt) sichtbar gemacht. PCR-Reaktionen mit RNA-Proben
in der Abwesenheit von reverser Transkriptase waren für jedes
Oligopaar negativ, und dienten als eine Kontrolle auf DNA-Kontamination. Das
Beispiel zeigt, dass die mRNA der IL-11-Rezeptor-alpha-Kette in hoch gereinigten
Populationen von CD4+-, CD8+-
und B220+-Lymphozyten nachgewiesen wird
[siehe 1].
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Beispiel 2 IL-11 erhöht die Antigen-spezifische
zytolytische Aktivität
in Massenkulturen aus Milz
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Sieben Tage alte Massenkulturen aus
Milz, von Zellen, die mit IL-2 oder IL-2 und IL-11 behandelt worden waren, wurden in
Reihe verdünnt
und zu 1 × 104 51Crmarkierten
P815.P1HTR-Zellen zugegeben, die eine Stunde in der Gegenwart oder
Abwesenheit von NP-Peptid gepulst wurden. Die Zellen wurden 4 Stunden
inkubiert. Überstände wurden
geerntet, und die 51Cr-Freisetzung wurde
bestimmt. Maximale Lyse der Zielzellen wurde mit 2% Triton-X 100
induziert. % Lyse = [(CPM – spontane
CPM von NP-Peptid-gepulsten Zielen)/(maximale CPM von NP-gepulsten Zielen – spontane
CPM von NP-Peptid-gepulsten Zielen)] × 100% spezifische Lyse = (%
Lyse von NP-Peptid-gepulsten Zielzellen) – (% Lyse von Kontrollzielzellen).
Das Bespiel zeigt an, dass IL-11 die prozentuale spezifische lytische
Aktivität
von NP-Peptid-spezifischen
zytotoxischen T-Zellen signifikant verstärken kann. Bei einem Verhältnis von
Effektorzellen zu Zielzellen von 50 : 1 wird eine 250% Verstärkung der
prozentualen spezifischen Lyse in Zellen, die mit IL-2 und IL-11
behandelt worden waren, gegenüber
Zellen, die nur mit IL-2 behandelt worden waren, beobachtet [siehe 2].
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Beispiel 3 IL-11 kann
das Erfordernis von exogenem IL-2 bei der Erzeugung von Antigen-spezifischer
zytolytischer Aktivität
in Massenkulturen aus Milz ersetzen
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Sieben Tage alte Massenkulturen aus
Milz, von Zellen, die mit muIL-2, muIL-6 oder rhIL-11 behandelt
worden waren, wurden in Reihe verdünnt und zu 1 × 104 51Crmarkierten
P815.P1 HTR-Zellen zugegeben, die eine Stunde in der Gegenwart oder
Abwesenheit von NP-Peptid gepulst wurden. Die Zellen wurden 4 Stunden
inkubiert. Überstände wurden
geerntet, und die 51Cr-Freisetzung wurde
bestimmt. Die prozentuale spezifische Lyse wurde berechnet wie in 3 beschrieben. Das Beispiel
zeigt an, dass eine Behandlung von Zellen mit IL-11 alleine in der
Abwesenheit von exogenem IL-2 die prozentuale lytische Aktivität von NP-Peptidspezifischen
zytotoxischen T-Zellen signifikant verstärken kann. Bei einem Verhältnis von
Effektor zu Ziel von 50 : 1 wird eine siebenfache Erhöhung der
prozentualen spezifischen Lyse zwischen Zellen, die mit IL-11 behandelt
worden waren, gegenüber
Zellen, die mit keinem exogen zugegebenem Zytokin behandelt worden
waren, beobachtet [siehe 3].
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Beispiel 4 IL-11 erhöht die Anzahl
von Grippe-spezifischen IFNγ-produzierenden Zellen
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Sterile Flachbodenplatten mit 96
Vertiefungen (Costar) wurden 2 h bei 37°C mit einem anti-IFNγ-Antikörper (R46A2,
10 μg/ml,
50 μl/Vertiefung) beschichtet
und 1 Stunde bei 37°C
mit PBS + 1% BSA + 0,05% Tween 20 blockiert und mit PBS gewaschen.
Reihenverdünnungen
von Milzzellen, verdünnt
in RPMI + 10% FCS, wurden zu den Platten zugegeben und 16 h bei
37°C inkubiert,
und danach sechsmal gewaschen. Biotinylierter anti-IFNy-Antikörper XGM.1
(1,19 μg/ml)
wurde zu jeder Vertiefung zugegeben und 90 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach 4 weiteren Waschschritten wurde Streptavidin-alkalische
Phosphatase zugegeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
4 Waschschritten wurden die Platten entwickelt, mit einer Lösung von 0,6%
niedrig schmelzender Agarose in 0,1 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol, pH 10,5,
enthaltend 1 mg/ml BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indonylphosphat). Die Platten wurden
16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und danach wurden die Spots
ausgezählt.
Das Beispiel zeigt an, dass IL-11 die Anzahl von Grippe-spezifischen
IFN-g-produzierenden Zellen verstärkt. Zellen, die mit IL-2 und
entweder 10 ng/ml oder 100 ng/ml IL-11 behandelt worden waren, hatten eine
2-3,5-fach erhöhte Anzahl
von IFN-g-produzierenden Zellen, im Vergleich zu Zellen, die nur
mit IL-2 behandelt worden waren [siehe 4].
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Beispiel 5 IL-11 erhöht die IFNγ-Produktion
von Grippe-spezifischen CTL
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ELISA-Platten (EIA capture plates,
Costar) wurden 16 h bei 4°C
mit einem anti-IFNγ-Antikörper (R46A2,
3 μg/ml,
50 μl/Vertiefung)
beschichtet und 2 Stunden bei 37°C
mit THSG (Tris-Hochsalz-Gelatine) blockiert und 4-mal gewaschen.
Reihenverdünnungen
von IFNγ-Kontrollüberständen und
unbekannten Proben, verdünnt
in PBS + 10% FCS, wurden zu den Platten zugegeben und 2 h bei Raumtemperatur
inkubiert, und danach 3 mal gewaschen. Biotinylierter Antikörper XGM.1
(1,19 μg/ml)
wurde zu jeder Vertiefung zugegeben und 90 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach weiteren 4 Waschschritten wurde Peroxidkonjugiertes
Avidin (Vector) zugegeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach 4 Waschschritten wurden die Platten 9 min im Dunkeln mit ABTS (Kirkegaard
and Perry) entwickelt und mit 1% SDS gestoppt. Die Absorption bei
405 nm wurde mit einer Vmax kinetischen Mikroplattenauslesevorrichtung (Molecular
Devices) bestimmt. Das Beispiel zeigt an, dass IL-11 die Menge von
IFN-g, das von Grippespezifischen zytotoxischen T-Zellen produziert
wird, verstärken
kann. In dem konditionierten Medium von Zellen, die mit IL-2 und
entweder 10 ng/ml oder 100 ng/ml IL-11 behandelt worden waren, wurden 2-4-fach
erhöhte
IFN-g-Gehalte nachgewiesen [siehe 5].
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Obwohl die vorliegende Erfindung
anhand spezifischer Verfahren und Zusammensetzungen beschrieben
wurde, wird verstanden, dass dem Fachmann in Kenntnis der vorliegenden
Erfindung Variationen und Modifikationen einfallen werden. Es wird erwartet,
dass dem Fachmann zahlreiche Modifikationen und Variationen der
Erfindung, wie in den vorstehenden veranschaulichenden Beispielen
beschrieben, einfallen werden, und folglich sollten ihr nur solche
Einschränkungen
auferlegt werden, wie in den beigefügten Ansprüchen definiert.