MX2007005866A - Anticuerpos monoclonales totalmente humanos para il-13. - Google Patents

Abstract

Se exponen anticuerpos dirigidos a IL-13 y los usos de estos anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos se dirigen a IL-13. Se proporcionan secuencias de polinucleotidos aislados que codifican para moleculas de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera y las secuencias de aminoacidos que comprenden las mismas moleculas, en particular las secuencias que corresponden a las secuencias contiguas de cadena pesada y ligera que fragmentan las regiones de trama (FR) y/o la regiones para determinacion de complementariedad (CDR). Adicionalmente, tambien se proporcionan los metodos para utilizar estos anticuerpos para el tratamiento de pacientes. Adicionalmente, tambien se proporcionan biomarcadores dependientes de IL-13 y los metodos para su identificacion y utilizacion.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES TOTALMENTE HUMANOS PARA IL-13 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona en general con compuestos que se relacionan con IL-13. Más específicamente, los compuestos se pueden unir a interleucina-13. Más específicamente, la invención se relaciona con anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a interleucina-13 y pueden afectar la actividad de IL-13.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La interleucina-13 (IL-13, por sus siglas en inglés) es una citosina que se reconoció primero por sus efectos sobre los linfocitos B y monocitos, en donde sobre-regula la expresión clase II, estimula la interconexión de la clase IgE e inhibe la producción inflamatoria de citosinas. El receptor de IL-13 comparte la cadena alfa del receptor IL-4 con el receptor IL-4. Como resultado, IL-13 tiene muchas actividades biológicas para IL-4 IL-13 inhibe la liberación pro-inflamatoria de citosinas y tiene una actividad anti-inflamatoria in vivo . IL-13 desempeña una función en las respuestas alérgicas provocadas por IgE y es la principal provocadora de asma alérgica (Will-Karp M. , Curr. Opin. Pulm. Med., 2003; 9-21-27). En el pulmón regula la inflamación eosinofílica, la secreción de mucosidad, y la hipersensibilidad de las vías respiratorias. Además del asma, IL-13 está implicada en la patogénesis de muchas enfermedades (Wynn TA. Annu. Rev. Immunol. 2003. 21-425-456).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Algunos aspectos de la invención se relacionan con un anticuerpo humano aislado que se une a la IL-13. En algunas modalidades, el anticuerpo humano aislado se une a la IL-13 humana con un KD menor a 170 pM. En algunas modalidades, el anticuerpo humano aislado se une a la IL-13 con un KD menor a 50 pM. En algunas modalidades, el anticuerpo puede inhibir la hipersensibilidad de las vías respiratorias. En algunas modalidades, el anticuerpo permite una inversión completa de la hipersensibilidad de la vía respiratoria. En algunas modalidades, el anticuerpo puede reducir la producción de mucosidad en el pulmón. En algunas modalidades, el anticuerpo permite la reducción de al menos aproximadamente el 30% de la producción de mucosidad. En algunas modalidades, el anticuerpo puede inhibir un trastorno relacionado con IL-13, seleccionado del grupo que consiste de: enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, enfisema, asma. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a un epítope de IL-13 que evita la señalización de IL-13 a través de una interacción con un receptor IL-13 alfa 1. En algunas modalidades, el anticuerpo tiene un IC50 no mayor a 60 pM en un análisis para liberación de eotaxina con 300 pM de IL-13. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a la IL-13 humana aunque no se puede unir perceptiblemente a la IL-13 murina. Algunos aspectos de la invención se relacionan con un método para tratar un trastorno relacionado con la IL-13. En algunas modalidades, el método comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo humano que se une a IL-13 a un sujeto que necesita del tratamiento, en donde el anticuerpo humano aislado se une a IL-13 con un KD no mayor a 170 pM, tratando así el trastorno relacionado con IL-13. En algunas modalidades, el tratamiento de la hipersensibilidad de las vías respiratorias, producción de mucosidad, o ambos en un sujeto se presenta como tratamiento profiláctico, y el método comprende además el paso de identificar a un paciente que esté en riesgo de desarrollar una hipersensibilidad de las vías respiratorias, producción de mucosidad o ambos. En algunas modalidades, el trastorno relacionado con IL-13 se selecciona del grupo que consiste de: hipersensibilidad de las vías respiratorias, producción de mucosidad, asma o alguna combinación de las mismas. En algunas modalidades, el anticuerpo tiene un KD no mayor a aproximadamente 10 pM. En algunas modalidades, el trastorno relacionado con IL-13 es linfoma de Hodgkin. En algunas modalidades, la cantidad eficaz es una cantidad que sea suficiente para disminuir una cantidad de un biomarcador perceptible en un paciente. En algunas modalidades, una cantidad eficaz es una cantidad que pueda reducir la cantidad de IL-13 presente en un sujeto mediante una cantidad significativa, por ejemplo 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, 99-100%. En algunas modalidades, el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de: CÍO, TARC, eotaxina, y alguna combinación de los mismos. En algunas modalidades, la cantidad eficaz es al menos una cantidad suficiente para inhibir al menos alguna proliferación celular de HDLM-2, células L-1236, o alguna combinación de los mismos. En algunas modalidades, el trastorno relacionado con IL-13 se relaciona con la expresión de CD23. Otros aspectos de la invención se relacionan con un anticuerpo humano aislado que se une a IL-13, en donde el anticuerpo humano aislado se une a IL-13 de tal forma que la IL-13 todavía se pueda unir al receptor alfa 2 de IL-13, y en donde el anticuerpo humano aislado se une a IL-13 de tal forma que evite la unión de IL-13 al receptor alfa 1 del IL-13. Otros aspectos de la invención se relacionan con un método para medir una inhibición de la actividad de IL-13. En algunas modalidades, el método comprende administrar un anticuerpo o una muestra a un sujeto y medir una cantidad del biomarcador liberado, en donde una disminución en la cantidad del biomarcador liberado se correlaciona con una inhibición de la actividad de IL-13. Otros aspectos de la invención se relacionan con un anticuerpo humano aislado para IL-13. El anticuerpo se une a IL-13 y IL-13Q110R con un KD que es menor a 170 pM y se une tanto a IL-13 como a IL-13Q110R con un KD que está dentro del 50% entre sí. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a IL-13 y IL-13Q110R con el mismo KD eficazmente. Otros aspectos de la invención se relacionan con un equipo para tratar los trastornos relacionados con IL-13. En algunas modalidades, el equipo comprende un anticuerpo IL-13 y un detector de biomarcadores para detectar los niveles del biomarcador. En algunas modalidades, el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de: eotaxina, TARC, CÍO, y alguna combinación de los mismos. En algunas modalidades, el detector de biomarcadores comprende un anticuerpo para una proteína seleccionada del grupo que consiste de: eotaxina, TARC, CÍO, o alguna combinación de los mismos. Otros aspectos de la invención se relacionan con un método para tratar un trastorno relacionado con IL-13. En algunas modalidades, el método comprende administrar una primera cantidad de un anticuerpo humano que se una a IL-13 a un sujeto que necesita del tratamiento, en donde el anticuerpo humano aislado se une a IL-13 con un KD no mayor a 100 pM, detectar una cantidad del biomarcador para determinar un nivel de la actividad relacionada con IL-13 que se presenta después de la administración de la primera cantidad del anticuerpo humano, y determinar si se requiere más o menos tratamientos con base en la cantidad de la actividad de IL-13 indicada por la detección del biomarcador. En algunas modalidades, el método comprende además administrar una segunda cantidad de un anticuerpo humano, en donde la segunda cantidad del anticuerpo se basa en la cantidad del biomarcador detectado. En algunas modalidades, la segunda cantidad de un anticuerpo humano es un anticuerpo que sea diferente de la cantidad del anticuerpo administrado en la primera cantidad del anticuerpo humano. En algunas modalidades, la determinación se alcanza al comparar la cantidad del biomarcador determinada ya sea para una cantidad estándar del biomarcador para un sujeto sano o con el ajuste de una cantidad buscada del biomarcador para un sujeto. En algunas modalidades, el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de: TARC, eotaxina, CÍO, y alguna combinación de los mismos. En algunas modalidades, el sujeto que necesita del tratamiento es un sujeto que se beneficiará de un tratamiento profiláctico para la prevención de los trastornos relacionados con IL-13. En algunas modalidades, el sujeto que necesita del tratamiento es un sujeto que se beneficiará de un tratamiento terapéutico con respecto a los trastornos relacionados con IL-13. Otros aspectos de la invención se relacionan con un método para tratar asma. En algunas modalidades, el método comprende identificar un sujeto con asma y administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo humano que se una a la IL-13 humana con un KD no mayor a aproximadamente 170 pM. En algunas modalidades, la cantidad eficaz se determina al supervisar un nivel de un biomarcador, en donde la cantidad eficaz se alcanza una vez que el nivel del biomarcador disminuya. En algunas modalidades, el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de: eotaxina, CÍO, TARC, y alguna combinación de los mismos, en donde un aumento o falta de una disminución suficiente en el nivel del biomarcador indica que se debe administrar un anticuerpo adicional. En algunas modalidades, el paciente con asma se identifica por el sujeto que tenga un mayor nivel del biomarcador de un grupo control. Otros aspectos de la invención se relacionan con un método para tratar un síntoma de un trastorno relacionado con IL-13. En algunas modalidades, el método comprende identificar a un sujeto que tenga un síntoma de un trastorno relacionado con IL-13 al identificar a un sujeto con un síntoma que sea común para asma y administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo humano de IL-13 al sujeto, en donde la cantidad eficaz es suficiente para reducir el síntoma. En algunas modalidades, el síntoma se selecciona del grupo que consiste de los siguientes: hipersensibilidad de las vías respiratorias, producción excesiva de mucosidad, reclutamiento de leucocitos en el fluido de lavado broncoalveolar (BALF, por sus siglas en inglés), y cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, el síntoma es uno que resulta en un sujeto cuando se administran al mismo cantidades significativas de IL-13. Otros aspectos de la invención se relacionan con el uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo humano que se une a IL-13 en la preparación de un medicamento para tratar un trastorno relacionado IL-13, en donde el anticuerpo humano aislado se une a IL-13 con un KD no mayor a 170 pM. En algunas modalidades, el trastorno relacionado con IL-13 es el tratamiento de la hipersensibilidad de las vías respiratorias, producción de mucosidad, o ambos, y en donde el tratamiento es un tratamiento profiláctico. En algunas modalidades, el trastorno relacionado con IL-13 se selecciona del grupo que consistir de: hipersensibilidad de las vías respiratorias, producción de mucosidad, asma o alguna combinación de los mismos. En algunas modalidades, el anticuerpo tiene un KD no mayor a 10 pM. En algunas modalidades, el trastorno relacionado con IL-13 es linfoma de Hodgkin. En algunas modalidades, la cantidad eficaz es una cantidad que sea suficiente para disminuir una cantidad de un biomarcador detectable en un paciente. En algunas modalidades, la cantidad eficaz es una cantidad que sea suficiente para disminuir la cantidad de IL-13 en un sujeto mediante cualquier cantidad significativa, por ejemplo, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, 99-100 por ciento. En algunas modalidades, el medicamento comprende además un detector de biomarcadores que pueda reportar un nivel de un biomarcador. En algunas modalidades, el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de: CÍO, TARC, eotaxina, y alguna combinación de los mismos. En algunas modalidades, el detector de biomarcadores comprende un anticuerpo que se une al biomarcador. En algunas modalidades, la cantidad eficaz es al menos una cantidad suficiente para inhibir al menos alguna proliferación celular de HDLM-2, células L-1236, o alguna combinación de los mismos. En algunas modalidades, el trastorno relacionado con IL-13 se relaciona con la expresión de CD23. Otros aspectos de la invención se relacionan con el uso de un detector de biomarcadores en la producción de un medicamento para supervisar el nivel de un biomarcador según se reporta sobre un trastorno relacionado con IL-13. Otros aspectos de la invención se relacionan con el uso de un anticuerpo para IL-13 en la producción de un medicamento, en donde el anticuerpo se une a IL-13 de tal forma que IL-13 todavía se pueda unir al receptor alfa 2 de IL-13, permitiendo con esto que el receptor alfa 2 de IL-13 todavía funcione como un colector para IL-13, mejorando con esto el aclaramiento o depuración de IL-13 de un sujeto. Algunas modalidades de la invención se relacionan con anticuerpos monoclonales aislados, o fragmentos de los mismos, que unen específicamente a IL-13. Se apreciará que en estas modalidades, los anticuerpos aislados pueden ser anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos y/o anticuerpos humanos o humanizados, de preferencia, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos o totalmente humanos y se unen a IL-13 con una constante de disociación en equilibrio menor a 200 pM. En una modalidad, los anticuerpos se unen a IL-13 con una constante de disociación menor a 100 pM. En otra modalidad, el anticuerpo se une a IL-13 con una constante de disociación en equilibrio menor a 55 pM. En algunas modalidades, los anticuerpos unen a IL-13 con un KD menor a 200 pM o incluso menor a 50 pM. En algunas modalidades, estos anticuerpos, cuando se administran a un paciente, inhiben parcialmente o completamente la hipersensibilidad de las vías respiratorias. En una modalidad, el anticuerpo es el anticuerpo "623" analizado más adelante que tiene la cadena pesada SEQ ID NO: 50 y la cadena ligera SEQ ID NO: 52. En otra modalidad el anticuerpo es el anticuerpo "731" que tiene la cadena pesada SEQ IN NO: 38 y la cadena ligera SEQ ID NO: 40. En otra modalidad de la invención, de preferencia los anticuerpos se unen a epítopes específicos de IL-13. En una modalidad, el anticuerpo se une a un epítope que incluye los aminoácidos 21-33 de la IL-13. En otra modalidad, el anticuerpo se une a un epítope que incluye los aminoácidos 109-121 de la IL-13. Todavía en otra modalidad, el anticuerpo se une a un epítope que incluye los aminoácidos 111-128. Todavía en otra modalidad el anticuerpo es uno que se une a un epítope que incluye los aminoácidos 45-108 de la IL-13. Otras modalidades incluyen los anticuerpos que se unen a los aminoácidos 70-80 ó 83-92 de la IL-13. Todavía en otra modalidad, el anticuerpo es uno que se une a una hélice específica de IL-13. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a la hélice A, hélice C o hélice D de la IL-13 quedan dentro del alcance de la invención. En otra modalidad, el anticuerpo se une a un epítope sobre la IL-13, en donde el epítope incluye los aminoácidos 20 hasta 29 de la IL-13. Otra modalidad de la invención es un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada específica. Por ejemplo, una modalidad es un anticuerpo que se une específicamente a IL-13 y tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en la Tabla 18 más adelante. De preferencia, estos anticuerpos tienen una secuencia de aminoácidos de cadena ligera según se muestra en la Tabla 19 ó 20 más adelante. En una modalidad, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina humana de cadena pesada representadas por las SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, y 81-88, por ejemplo, y las moléculas de inmunoglobulina humanas de cadena ligera kappa representadas por las SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, y 89-94, por ejemplo. Otras modalidades, incluyen las moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como por ejemplo, las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, así como también, los fragmentos y análogos de las mismas. En algunas modalidades, el anticuerpo tiene una secuencia proveniente de la cadena pesada CDRl, CDR2, CDR3, FRl, FR2, FR3, y/o FR4 o cualquiera de las secuencias listadas en la Tabla 18. En algunas modalidades, el anticuerpo tiene una secuencia proveniente de la cadena ligera CDRl, CDR2, CDR3, FRl, FR2 , de FR3, y/o J o cualquiera de las secuencias listadas en las Tablas 19 y 20. En algunas modalidades, el anticuerpo anterior, cuando se administra a un paciente, puede reducir la producción de mucosidad en el pulmón. La reducción puede ser parcial, o una reducción completa. En algunas modalidades, estos anticuerpos pueden ser eficaces para reducir la producción de mucosidad en un ratón. En algunas modalidades, el anticuerpo, cuando se administra a un paciente humano, puede inhibir la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, enfisema, y/o asma. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a una región de IL-13 que evita la señalización de IL-13 a través de una interacción con un receptor de IL-13 en algunas modalidades, el anticuerpo puede permitir la unión de IL-13 con un receptor alfa 2 de IL-13, mientras que inhiba la señalización de IL-13 a través de la interacción con el receptor alfa 1 de IL-13. En algunas modalidades, el anticuerpo totalmente humano aislado puede inhibir la señalización dependiente de IL-13 al bloquear la unión de IL-13 con el receptor alfa 1 de IL-13. En algunas modalidades el anticuerpo tiene un KD no mayor a 3 nm para una proteína IL-13 de macaco. Otra modalidad de la invención es un método para inhibir la hipersensibilidad de las vías respiratorias. El método comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo totalmente humano que se une a IL-13 a un sujeto que necesita del tratamiento. En una modalidad, el anticuerpo totalmente humano aislado se une a IL-13 con un KD no mayor a 100 pM y con esto inhibe la hipersensibilidad de las vías respiratorias.

Otra modalidad de la invención es un método para inhibir la producción de mucosidad, el método comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo totalmente humano que se una a IL-13 a un sujeto que necesita de este tratamiento. De preferencia, el anticuerpo totalmente humano aislado se une a IL-13 con un KD no mayor a 100 pM y con esto inhibe la producción de mucosidad. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a IL-13 con un KD no mayor a 50 pM. En otra modalidad, el anticuerpo se une a IL-13 con un KD no mayor a aproximadamente 10 pM. En algunas modalidades, el método se lleva a cabo en un ratón, mientras que en otras modalidades, el método se lleva a cabo en un ser humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anterior tiene un IC5o no mayor a aproximadamente 100 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 30 pM, y/o aproximadamente 20 pM. Todavía en otra modalidad el método es uno para intensificar el aclaramiento de IL-13 de un sujeto. En algunas modalidades, el método comprende administrar un anticuerpo que se pueda unir a la IL-13 a un sujeto. El anticuerpo de preferencia se une a la IL-13 de tal forma que la IL-13 todavía se pueda unir al receptor alfa 2 de IL-13 y con esto permite que el receptor alfa 2 de IL-13 todavía funcione como un "colector" para IL-13, intensificando con esto el aclaramiento de IL-13 de un sujeto. Un ejemplo de un anticuerpo que pueda ser capaz de realizar esto es el mAb 731. En otra modalidad, el anticuerpo se une a IL-13 de tal forma que la IL-13 no se pueda unir a ninguno de los receptores alfa 1 o alfa 2. Una modalidad distinta es un método para suprimir el nivel de actividad dependiente de IL-13 en un sujeto. En algunas modalidades, el método comprende administrar un anticuerpo para IL-13 a un sujeto. El anticuerpo se une a la IL-13 de tal forma que no evite que la IL-13 realice la señalización a través de su receptor endógeno. De preferencia, la señalización requiere que la IL-13 se una a un receptor alfa 1 de IL-13, y el anticuerpo que se une a la IL-13 no interfiera significativamente con la unión de IL-13 con un receptor alfa 2 de IL-13. En algunas modalidades, el método comprende además supervisar un nivel de un biomarcador dependiente de IL-13 y ajustar la cantidad del anticuerpo administrado por consiguiente. En algunas modalidades, el anticuerpo es el mAb 623, 731, y un anticuerpo que se une al mismo epítope como el anticuerpo 623 ó 731. En algunas modalidades, el biomarcador es eotaxina, CÍO (una quimiocina CC) , y/o una qumiocina regulada por timo y un activador (TARC, por sus siglas en inglés). Adicionalmente se contemplan detectores de biomarcadores, que son composiciones, tales como por ejemplo, proteínas (por ejemplo, anticuerpos) que se puedan emplear de alguna forma para detectar el nivel de un biomarcador en una muestra. En algunas modalidades, el método permite medir la inhibición de IL-13. El método comprende aplicar un anticuerpo candidato a una muestra que comprende IL-13 y medir la cantidad de eotaxina liberada. La inhibición de eotaxina se correlaciona con la unión de un anticuerpo a IL-13. En algunas modalidades, el método comprende medir la cantidad de CÍO y/o TARC. En algunas modalidades, el método se puede utilizar para identificar a un sujeto que padece de un trastorno relacionado con IL-13. En algunas modalidades, se proporciona una variante asilada de IL-13 que comprende una mutación puntual en la posición 110 de aminoácidos. La mutación puntual da por resultado en un cambio de una glutamina en la posición 110 a un residuo de arginina. Algunas modalidades de la invención incluyen un anticuerpo totalmente humano aislado para IL-13, en donde el anticuerpo se une específicamente a una variante de la IL-13. En algunas modalidades, el anticuerpo se puede unir específicamente a la variante de IL-13Q110R de la IL-13 de manera más importante que el anticuerpo que se une a IL-13. En algunas modalidades, el anticuerpo se puede unir específicamente a la variante IL-13Q110R, aunque no se une a la IL-13 tipo silvestre. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a la variante con un KD no mayor a 100 pM. En algunas modalidades, el anticuerpo se puede unir a la IL-13 de manera más importante de lo que lo hace la variante IL-13Q110R de IL-13. En algunas modalidades, el anticuerpo se puede unir específicamente a la IL-13 tipo silvestre, aunque no se une de manera perceptible a la variante IL-13Q110R. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a la IL-13 tan eficazmente como se une a la IL-13Q110R. En algunas modalidades, existe una diferencia menor al 20% en el KD del mAb totalmente humano para la IL-13 y la IL-13Q110R, por ejemplo, menor a 20-15, 15-10, 10-8, 8-6, 6-4, 4-2, 2-1, 1-0 por ciento de diferencia en los KD del anticuerpo. En algunas modalidades, se proporciona un ratón transgénico. El ratón se humaniza y expresa la IL-13 humana. En algunas modalidades, el ratón es susceptible a una hiperreactividad de las vías vía respiratorias inducida por alergénicos . En algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal anterior o porción de unión con antígenos del mismo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende el anticuerpo monoclonal anterior o la porción de unión con antígenos y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, un equipo para el tratamiento de trastornos relacionados con IL-13 contiene un anticuerpo IL-13. En algunas modalidades, el equipo comprende un anticuerpo IL-13 expuesto en la presente y las instrucciones para administrar el anticuerpo IL-13 a un sujeto. En algunas modalidades, el equipo incluye además un biomarcador dependiente de IL-13 para determinar si se requiere más o menos del anticuerpo para el tratamiento del trastorno relacionado con IL-13. También se apreciará que las modalidades de la invención no se limitan a ninguna forma particular de un anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos proporcionados pueden ser un anticuerpo de longitud total (por ejemplo, que tenga una región Fc humana intacta) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un Fab, Fab' o un F(ab')2). Además, los anticuerpos se pueden producir a partir de un hibridoma que secreta el anticuerpo, o, de manera recombinante, de una célula que se haya transformado o transfectado con un gen o genes que codifiquen para el anticuerpo. Otras modalidades incluyen, moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente. Todavía en modalidades adicionales, la invención proporciona una molécula de polinucleótidos aislada descrita en la presente. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, en algunas modalidades, se puede utilizar cualquiera de los anticuerpos o variantes expuestos actualmente en cualquiera de las modalidades o aspectos descritos o para cualquiera de los mismos, según sea adecuado .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención se comprenderá mejor a partir de la descripción detallada y los dibujos anexos, los cuales pretenden ilustrar y no limitar la invención. La Figura 1 muestra una gráfica de la concentración de anticuerpos relativa contra los datos de neutralización para cada cavidad. Los datos se utilizaron para identificar las cavidades con los anticuerpos de mayor potencia. La Figura 2 es una gráfica que representa la relación de ELISA OD de cada anticuerpo contra la concentración de anticuerpos en un recubrimiento antigénico de 31 ng/ml. La Figura 3 es una gráfica que muestra la inhibición porcentual de la liberación de eotaxina inducida por IL-13 mediante los anticuerpos recombinantes 643 y 731 en comparación con un control de coincidencia con isotipos. La Figura 4 es una gráfica de barras que compara la capacidad de IL-13 o IL-13Q110R para inhibir la unión de 731 ó 623 a placas ELISA recubiertas con IL-13. La Figura 5A es una gráfica de barras que compara la competición sobre el receptor celular entre el anticuerpo 643 y un control de isotipos. La Figura 5B es una gráfica de barras que compara la competición sobre el receptor celular entre el anticuerpo 731 y un control de isotipos. La Figura 5C es un dibujo que representa el protocolo y los diversos resultados predichos a partir de la Figura 5A y la Figura 5E. La Figura 5D es un dibujo que representa el protocolo y los diversos resultados predichos a partir de la Figura 5B. La Figura 5E es una gráfica de barras que compara la competición del receptor celular entre el anticuerpo 623 y un control de isotipos. La Figura 6A muestra la alineación de un péptido derivado de la exhibición de fagos reconocido por el anticuerpo 693 y parte de la secuencia IL-13. La Figura 6B es una gráfica que muestra la estructura secundaria de IL-13 (SEQ ID NO: 72) e indica cuáles regiones de la IL-13 humana se reemplazaron con la IL- 13 de ratón para la construcción de las proteínas quiméricas. La Figura 7A y la Figura 7B son gráficas de barras que muestran que los linfocitos T CD4+ provenientes de ratones humanizados con IL-13 producen la IL-13 humana pero no la IL-13 murina.

La Figura 8 es una gráfica que demuestra que los anticuerpos 731 y 623 anti-IL-13 inhiben la hipersensibilidad de las vías respiratorias. La Figura 9 es una gráfica de barras que demuestra que 731 y 623 inhiben la producción de mucosidad. La Figura 10 es una representación de una secuencia de aminoácidos que destaca un sitio de unión del mAb 623. Las Figuras 11A-D son gráficas que representan la inhibición porcentual de la liberación de eotaxina inducida por la IL-13 o la variante IL-13Q110R mediante los anticuerpos recombinantes 623 y 731 en comparación con un control para coincidencia de isotipos. Las Figuras 12A y 12B son gráficas que demuestran la inhibición de la proliferación de la línea celular L-1236 (A) y HDLM-2 (B) mediante 623 y 731. A las placas se agregaron mAb 623, mAb 731 o el control para coincidencia de isotipos para las concentraciones finales de 0.017 hasta 330 nm (valorado 1:3) . La Figura 13 es una gráfica que muestra el impacto de mAb 623 y 731 y hIL-13Ralfa2Fc sobre la expresión de CD23 en linfocitos B de sangre entera. La Figura 14 es una gráfica que muestra la inhibición de la producción de mucosidad inducido por OVA mediante mAb 623 y mAb 731 en ratones humanizados con IL-13. La Figura 15 es una gráfica que muestra un experimento en el cual el tratamiento con mAb 623 ó 731 tuvo poco efecto perceptible sobre el reclutamiento de leucocitos inducido por OVA en BALF. La Figura 16 es una gráfica que muestra la inhibición de AHR inducida por OVA mediante 623 y 731 en ratones humanizados con IL-13 de una forma sensible a la dosificación. La Figura 17 es una gráfica que muestra la inhibición de la producción de mucosidad inducida por OVA mediante 623 y 731 en ratones humanizados con IL-13 de una forma sensible a la dosificación. La Figura 18 es una gráfica que muestra un efecto de 623 y 731 sobre la infiltración de leucocito inducida por OVA en el BALF de ratones humanizados con IL-13 de una forma sensible a la dosificación. La Figura 19 es una gráfica que muestra una inhibición sensible a la dosificación de AHR inducida por HDM mediante la respuesta a la dosificación de 623 y 731 en ratones humanizados con IL-13. La Figura 20 es una gráfica que muestra una inhibición de respuesta a la dosificación de la producción de mucosidad inducida por HDM mediante 623 y 731 en ratones humanizados con IL-13. La Figura 21 es una gráfica que muestra una inhibición de la respuesta a la dosificación de 623 y 731 sobre la infiltración de leucocitos inducida por HDM en el BALF de ratones humanizados con IL-13. Las Figuras 22A y 22B son gráficas que representan el efecto de la administración profiláctica y terapéutica de 623 sobre AHR inducida por HDM y la infiltración de leucocitos en el BALF de ratones humanizados con IL-13. La Figura 23 es una gráfica que representa los niveles séricos inducidos por OVA de TARC en ratones tipo silvestre . La Figura 24 es una gráfica que representa los niveles séricos inducidos por OVA de eotaxina en ratones tipo silvestre . La Figura 25 es una gráfica que representa los niveles séricos inducidos por OVA de CÍO en ratones tipo silvestre. La Figura 26 es una gráfica que representa la inhibición del mAb 623 de los niveles séricos inducidos de OVA de TARC en ratones humanizados con IL-13. La Figura 27 es una gráfica que representa la inhibición del mAb 623 de los niveles séricos inducidos de OVA de eotaxina en ratones humanizados con IL-13 La Figura 28 es una gráfica que representa un mAb, el efecto del tratamiento con el mAb 623 sobre los niveles séricos inducidos por OVA de CÍO en ratones humanizados con IL-13.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Algunas modalidades de la invención se relacionan con anticuerpos aislados que se unen a IL-13 y los métodos para utilizar aquellos anticuerpos para el tratamiento de enfermedades en seres humanos. De preferencia, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales totalmente humanos que se unen a la IL-13 con alta afinidad, alta potencia, o ambas. En una modalidad, los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo, se unen específicamente a las regiones de la molécula de IL-13 que evitan que realice la señalización a través del complejo receptor de IL-13. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales totalmente humanos se neutralizan hacia la actividad con base en IL-13. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos se unen a la IL-13 mientras que permiten la unión a un receptor, distinto del receptor alfa 1 IL-13. Por ejemplo, en una modalidad, el anticuerpo se une a la IL-13 y permite que la IL-13 se una a un receptor simulado conocido como el receptor alfa 2 de IL-13. En este caso, el anticuerpo evita que IL-13 se una a su receptor de señalización, aunque no al receptor simulado. Las modalidades de la invención también incluyen células para la producción de estos anticuerpos. Además, las modalidades de la invención incluyen los métodos para utilizar estos anticuerpos anti-IL-13 como un agente para diagnóstico o tratamiento para una enfermedad.

Por ejemplo, los anticuerpos son útiles para el tratamiento de asma, incluyendo, asma bronquial tanto alérgica (atópico) como no alérgica (no atópica), bronquitis crónica, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés) , fiebre del heno, rinitis, urticaria, angioedema, dermatitis alérgica, incluyendo dermatitis por contacto, el síndrome de Stevens-Johnson, choque anafiláctico, alergias por alimentos, queratitis, conjuntivitis, síndrome nefrítico resistente a esteroides, mastocitosis, enfermedad fibrótica tal como por ejemplo, fibrosis pulmonar, incluyendo fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, fibrosis inducida por bleomicina, fibrosis hepática y esclerosis sistémica, cánceres, tales como por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, trastornos proliferativos de linfocitos B, tales como por ejemplo, linfoma de linfocitos B, en particular linfoma de linfocitos B grandes mediastínicos, leucemias por linfocitos B, carcinoma ovárico, enfermedades caracterizadas por la proliferación de linfocitos B no malignos, tales como por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, hepatitis activa crónica y crioglobulinemias, altos niveles de auto-anticuerpos, tales como por ejemplo, anemia hemolítica, trombocitopenia, síndrome por fosfolípidos y pénfigo, enfermedad inflamatoria del intestino y enfermedad de injerto contra hospedero. En algunas modalidades, el método de tratamiento comprende además verificar la eficacia de la administración del anticuerpo mediante el seguimiento del nivel de un biomarcador, tal como por ejemplo, eotaxina, TARC y/o CÍO. Junto con el tratamiento, las modalidades de la invención incluyen los artículos de fabricación que comprenden los anticuerpos. Una modalidad de la invención es un equipo para análisis que comprende anticuerpos IL-13 que se utiliza para clasificación de enfermedades o trastornos asociados con la actividad de IL-13. En algunas modalidades, el equipo incluye un biomarcador, lo cual permite determinar la eficacia del anticuerpo en un paciente particular. Adicionalmente, los anticuerpos para IL-13 se han utilizado para influir en la función de la interleucina-13 (IL-13) como una citosina efectora, que desempeña una función en la patogénesis del asma y otros trastornos. En animales, la administración directa de IL-13 induce asma, y el bloqueo de IL-13 inhibe el asma inducida por IL-13 o inducida por alergénicos. Como se muestra en la presente, mAb 623 se une con gran afinidad a la IL-13 (KD = 24 pM) y a la IL-13R130Q (KD = 39 pM) , una variante de IL-13 común asociada con alergia y asma. Además, actualmente se muestra que mAb 623 evita la unión de IL-13 a IL-13Ral y IL-13Ra2. In vi tro, mAb 623 inhibe la producción de eotaxina-1 inducida por IL-13 mediante células fibroblásticas dérmicas humanas (HDFa, por sus siglas en inglés) , y la sobre-regulación de CD23 inducida por IL-13 sobre linfocitos B en sangre entera. Adicionalmente, el mAb 623 también inhibe la proliferación celular de las células HDLM-2 y L-1236, dos líneas celulares derivadas del linfoma de Hodgkin que utilizan la IL-13 como un factor de crecimiento autocrino. De esta forma, el anticuerpo parece tener una amplia variedad de características convenientes que se relacionan con los trastornos relacionados con la IL-13. Adicionalmente, también se ha desarrollado y probado un modelo de ratón designado para examinar el asma. Debido a que el mAb 623 no se une a la IL-13 murina, los ratones KI/KO con IL-13 se generaron al reemplazar el primer exón del gen de IL-13 murina con el ADNc que codificaba para la IL-13 humana, permitiendo con esto que la IL-13 humana se exprese bajo el promotor de la IL-13 murina y elimine la expresión del gen endógeno de la IL-13 murina. Utilizando estos ratones para establecer un modelo de asma inducido por OVA, en la presente se muestra que la administración profiláctica del mAb 623 bloquea la hiper-reactividad de las vías respiratorias (AHR, por sus siglas en inglés) y suprime significativamente la hiperplasia de mucosidad. Además, en un modelo de asma inducido por ácaros domésticos, la administración profiláctica y terapéutica del mAb 623 inhibe la AHR, la hiperplasia de mucosidad y la infiltración eosinofílica en las vías respiratorias.

Adicionalmente, el mAb 623 también inhibe la elevación inducida por OVA de la TARC y los niveles séricos de eotaxina-1, demostrando que estos compuestos pueden ser útiles como biomarcadores. Adicionalmente, estos datos muestran que el mAb 623 y otros anticuerpos pueden neutralizar eficazmente la IL-13 in vi tro e in vivo los anticuerpos expuestos en la presente, así como también aquellos creados a partir de los métodos expuestos, también se pueden utilizar y pueden exhibir propiedades similares. Los métodos para clasificar y verificar las propiedades particulares de los anticuerpos se proporcionan en la presente . Los ácidos nucleicos descritos en la presente, y los fragmentos y variantes de los mismos, se pueden utilizar, a manera de ejemplo no limitante, (a) para dirigir la biosíntesis de las proteínas, polipéptidos, fragmentos y variantes codificados correspondientes como productos génicos recombinantes o heterólogos, (b) como soluciones de ensayo para la detección y cuantificación de los ácidos nucleicos expuestos en la presente, (c) como moldes de secuencia para preparar moléculas antisentido, y lo semejante. Estos usos se describen de manera más completa posteriormente. En algunos aspectos, se proporcionan los métodos para identificar estos anticuerpos. En una modalidad, el método incluye un análisis para liberación de eotaxina.

En algunos aspectos, también se proporcionan anticuerpos que se unen a una variante de IL-13.

Especialmente relevantes son aquellos anticuerpos que se unen a una variante de IL-13 con una glutamina en la posición 110 del polipéptido endógeno IL-13. En algunos aspectos, se proporciona un ratón que se altera genéticamente para producir únicamente la IL-13 humana. Este ratón es útil para proporcionar un sujeto de prueba para la hipersensibilidad de las vías respiratorias y la inhibición de la producción de mucosidad. En algunos aspectos, se pueden utilizar, los anticuerpos para el tratamiento o prevención profiláctica del asma o cualquiera de los trastornos expuestos en la presente. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo se puede utilizar para tratar profilácticamente cualquiera de las siguientes: enfermedades inflamatorias, cáncer, enfermedad fibrótica y enfermedades caracterizadas por proliferación celular no maligna; enfermedades inflamatorias o trastornos tales como por ejemplo, asma, incluyendo asma bronquial tanto alérgico (atópico) como no alérgico (no atópico) , bronquitis crónica, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), fiebre del heno, rinitis, urticaria, angioedema, dermatitis alérgica, incluyendo dermatitis por contacto, síndrome de Stevens-Johnson, choque anafiláctico, alergias por alimentos, queratitis, conjuntivitis, síndrome nefrítico resistente a esteroides; mastocitosis; enfermedad fibrótica, tal como por ejemplo, fibrosis pulmonar, incluyendo, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, fibrosis inducida por bleomicina, fibrosis hepática y esclerosis sistémica. En modalidades adicionales, los anticuerpos anti-IL-13 se utilizan para tratar cánceres, tales como por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, trastornos proliferativos de linfocitos B, tales como por ejemplo, linfoma de linfocitos B, en particular linfoma de linfocitos B grandes mediastínicos, leucemias por linfocitos B, carcinoma ovárico. El anticuerpo se puede administrar antes o durante cualquier riesgo de la enfermedad. En algunas modalidades, el anticuerpo se proporciona en una sola dosis o múltiples dosis. En algunas modalidades, el anticuerpo se administra continuamente. En condiciones crónicas, el anticuerpo se puede administrar en grandes dosis y/o continuamente. En condiciones agudas, el anticuerpo se puede administrar en una sola dosis o en dosis baja, o relativamente de forma poco frecuente . En algunas modalidades, los métodos expuestos en la presente se pueden utilizar para identificar biomarcadores para una enfermedad o casos biológicos que se relacionan o que impactan la IL-13. En algunas modalidades, el biomarcador se selecciona del grupo que consiste de: CÍO, TARC, eotaxina, y alguna combinación de los mismos. En algunas modalidades, se supervisa el nivel de CÍO, TARC y/o eotaxina en un sujeto que se pueda beneficiar de la supervisión de un biomarcador que se relaciona con la IL-13. En algunas modalidades, se administra el anticuerpo a un paciente, por ejemplo, el mAb 623, y luego se supervisa el nivel de los biomarcadores para verificar la eficacia del anticuerpo. En algunas modalidades, entonces se ajusta la cantidad del anticuerpo administrado al paciente. En algunas modalidades, se contemplan las moléculas que se unen y detectan estos biomarcadores ("detectores de biomarcadores") , y su utilización para detectar los biomarcadores, junto con la determinación de la eficacia para el tratamiento de un trastorno relacionado con IL-13. Por ejemplo, los anticuerpos para estos marcadores también son útiles para la detección de los biomarcadores.

Definiciones A menos que se defina de otra manera, los términos científicos y técnicos utilizados junto con la presente invención deben tener los significados que se comprenden en general por aquellos con experiencia normal en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por contexto, los términos en singular deben incluir sus formas en plural y los términos en plural deben incluir las formas en singular. En general, las nomenclaturas utilizadas junto con la biología molecular, y las técnicas, para cultivo celular y de tejidos, y la química de proteínas y oligo- o polinucleótidos y la hibridación descrita en la presente, son aquellas conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica, según se describe en diversas referencias generales y más específicas tales como aquellas que se citan y se analizan a lo largo de la presente especificación. Véase, por ejemplo, Singleton et al , Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) ) . Se utilizan técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se lleven a cabo comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. También se utilizan técnicas estándar para las síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéuticas, formulación, y suministro, y tratamiento de pacientes. En el sentido en el que se utiliza de acuerdo con la presente exposición, se debe entender que los siguientes términos, a menos que se indique de otra manera, tienen los siguientes significados.

"Reacción en cadena de polimerasa" o "PCR", se refiere a un procedimiento o técnica en el cual las cantidades en minutos de una porción específica de ácido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican según se describe en la patente de los Estados Unidos No. 4,683,195 otorgada el 28 de julio de 1987. En general, la información de secuencias de los extremos de la región de interés o más allá de las necesidades estará disponible, de tal forma que se puedan diseñar cebadores de oligonucleotidos; estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas del molde que será amplificado. Los nucleótidos 5' terminal de las dos cebadores pueden coincidir con el final del material amplificado. La PCR se puede utilizar para amplificar las secuencias específicas de ARN, las secuencias específicas de ARN, provenientes de un ADN genómico total, y el ADNc transcrito del ARN celular total, las secuencias de bacteriófagos o plásmidos, etc. Véase en general, Mullís et al , Cold Spring Harbor Symp . Quan t . Biol . 51:263 (1987), Erlich, ed, PCR Technology (Stockton Pres, NY, 1989) . En el sentido en el que se utiliza en la presente, la PCR se considera para ser uno, aunque no el único, ejemplo de un método de reacción de polimerasa con ácido nucleico para amplificar una muestra de prueba con ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como un cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar una porción específica del ácido nucleico. "Anticuerpos" (Abs, por sus siglas en inglés) e "inmunoglobulinas" (Igs, por sus siglas en inglés), son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben una especificidad de unión con un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad antigénica. Los polipéptidos del último tipo, por ejemplo, se producen a bajos niveles por el sistema linfático y a niveles aumentados por mielomas. "Anticuerpos naturales e inmunoglobulinas", por lo general son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H) . Cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también se ha separado regularmente en puentes disulfuro intracadena. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH, por sus siglas en inglés) seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL, por sus siglas en inglés) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Chothia et al . J Mol . Biol . 186:651 (1985), Novotny and Haber, Proc . Na ti . Acad. Sci . U. S . A. 82:4592 (1985), Chothia et al . , Na ture 342:877-883 (1989)). El término "anticuerpo", en la presente se utiliza en su más amplio sentido y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos que incluye Fab y F(ab)'2, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) provenientes de cualquier especie de vertebrados se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados K y ?, con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Los fragmentos de unión se producen mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, y anticuerpos de cadena individual, según se describirá con mayor detalle más adelante. Se entiende que un anticuerpo distinto a un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" cada uno tiene sus sitios de unión idénticos. Los anticuerpos preferidos son neutralizantes e inhiben la unión de IL-13 a un receptor de señalización, tal como por ejemplo, el receptor alfa-1 de IL-13 (IL-13Ral) mediante al menos aproximadamente 20%, 40%, 60% o 80%, y de manera más general mayor de aproximadamente 85% (según se mide en un análisis de unión competitiva in vi tro) en algunas modalidades, los anticuerpos también inhiben la unión al receptor simulado IL-13Ra2, mientras que en otras modalidades la capacidad de IL-13 para unirse a IL-13Ra2 se mantiene en el momento de la unión del anticuerpo a IL-13. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos se pueden asignar a diferentes "clases" existen cinco clases principales de anticuerpos intactos IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM y varias de estas se pueden dividir en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada cadena que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras sub-unitarias y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas también se conocen. El término "anticuerpo monoclonal", en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos prácticamente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para las posibles mutaciones que se presentan en la naturaleza que pueden estar presentes en menores cantidades. Los anticuerpos monoclonales son bastante específicos, se dirigen contra un solo sitio antigénico. Además, en contacto con las preparaciones del anticuerpo policlonal que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante individual del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que se pueden sintetizar sin contaminar mediante otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtendrá a partir de la población prácticamente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como la producción requerida del anticuerpo mediante ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizarán de acuerdo con la presente invención, se pueden producir mediante un método de hibridomas descrito primero por Kohier et al . , Na t ure, 256:495 (1975), o se pueden producir mediante métodos de ADN recombinantes (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4,816,567) los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al . , Na ture, 352:624-628 (1991) y Marks et al . , J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991), por ejemplo. Un anticuerpo "aislado", es uno que se haya identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos para diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95% en peso del anticuerpo según se determina por el método Lowry, y la secuencia de aminoácidos terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa centrífuga, o (2) para homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o sin reducción utilizando azul Coomassie o, de preferencia, solución colorante de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in si tu dentro de células recombinantes debido a que no estará presente al menos un componente del entono natural del anticuerpo. Sin embargo, normalmente el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos un paso de purificación. Un "anticuerpo neutralizante", es una molécula de anticuerpo que es estable para eliminar o reducir significativamente una función efectora de un antígeno blanco al cual se une. Por consiguiente, un anticuerpo IL-13 "neutralizante" es capaz de eliminar o reducir significativamente una función efectora, tal como por ejemplo, la actividad de señalización de IL-13 a través del receptor IL-13. En una modalidad, un anticuerpo neutralizante reducirá una función efectora en el 1-10, 10-20, 20-30, 30-50, 50-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, 99-100%. "Citotoxicidad suministrada por células dependientes de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción suministrada por células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan los receptores Ig Fc (FcRs) (por ejemplo, células citolíticas (NK, por sus siglas en inglés), neutrófilos, y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en un codocito y posteriormente provocan la lisis de los codocitos. Las células primarias para suministrar célula ADCC, NK, expresan únicamente Fc?RIII, mientras que los monocitos expresan Fc?Rl, Fc?RII y Fc?RIII. La expresión de FcRs en células hematopoieticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch and Kmet, Annu . Rev. Immunol . 9:457-492 (1991). Para valorar la actividad ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un análisis ADCC in vi tro, tal como el que se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,500,362 ó 5,821,337. Las células efectoras útiles para estos análisis incluyen células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC, por sus siglas en inglés) y células citolíticas (NK) . Alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés se puede valorar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el que se expone en Clynes et al PNAS ( E . U. A . ) 95:652-656 (1988) . El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) o ambas regiones hipervariables en los dominios variables de cadena ligera y pesada Ig. Las porciones mejor conservadas de dominios variables se denominan la trama (FR, por sus siglas en inglés) . Los dominios variables de cadenas naturales ligera y pesada cada uno comprenden cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de hoja ß, conectada por tres de las CDR, que forman secuencias de conexión, y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja ß. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana mediante las regiones FR y, con las CDR provenientes de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión con antígenos de los anticuerpos (véase, Kabat et al . (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como por ejemplo, la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos. La digestión de anticuerpos con la enzima, papaína, da por resultado en dos fragmentos de unión con antígenos idénticos, conocidos como fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc", que no tiene actividad de unión con antígenos pero que tiene la capacidad de cristalizarse. La digestión de anticuerpos con la enzima, pepsina, da por resultado en un fragmento F(ab')2 en el cual las dos ramificaciones de la molécula del anticuerpo permanecen enlazadas y comprenden sitios de unión con dos antígenos. El fragmento F(ab')2 tiene la capacidad de reticular antígenos. "Fv", cuando se utiliza en la presente se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que mantiene tanto el reconocimiento de antígenos como los sitios de unión con antígenos . "Fab", cuando se utiliza en la presente se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada . "Fv", es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un reconocimiento de antígenos completo y un sitio de unión. En una especie Fv de dos cadenas, esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación no covalente, ajustada. En una especie Fv de cadena individual, un dominio variable de cadena pesada y una de cadena ligera se pueden enlazar covalentemente por un enlazante peptídico flexible de tal forma que las cadenas ligera y pesada se asocien en un análogo de estructura "dimérica" al mismo en una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión con antígenos sobre la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDR confieren especificidad de unión con antígenos al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable individual (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres de las CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse con un antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio de unión total. El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión con antígenos. La región hipervariable en general comprende residuos de aminoácidos provenientes de una "región de terminal de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los residuos 24-34 (Ll), 50-62 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y y 31-55 (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunologi cal In terest , 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) y/o aquellos residuos provenientes de una "secuencia hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 ((Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia and Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987) ) . Los residuos de la "región de trama" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de región hipervariable según se define en la presente . El término "regiones determinantes de complementariedad" o "CDRs", cuando se utiliza en la presente se refiere a partes de receptores inmunológicos que hacen contacto con un ligando específico y determinan su especificidad. Las CDR de receptores inmunológicos son la parte más variable de la proteína receptora, que le proporciona a los receptores su diversidad, y se portan en seis secuencias en el extremo distal de los dominios variables del receptor. Tres secuencias que provienen de cada uno de los dos dominios variables del receptor. El término "epítope" se utiliza para hacer referencia a sitios de unión para anticuerpos en antígenos proteínicos. Los determinantes epitópicos usualmente constan de agrupamientos de superficie químicamente activa de moléculas tales como por ejemplo, aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y por lo general tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como también, características de carga específicas. Un anticuerpo es aquel que se une a un antígeno cuando la constante de disociación es < 1 µm, de preferencia < 100 nm y de mayor preferencia < 10 nm. Una constante de equilibrio aumentada o mayor ("KD", por sus siglas en inglés) significa que existe menos afinidad entre el epítope y el anticuerpo. En otras palabras, el anticuerpo y el epítope son menos favorables para unirse o permanecer unidos conjuntamente. Una constante de equilibrio disminuida o menor significa que existe una mayor afinidad entre el epítope y el anticuerpo. En otras palabras, es más probable que el anticuerpo y el epítope se unan o estén unidos juntos. Un anticuerpo con un KD "no mayor a" cierta cantidad significa que el anticuerpo se unirá al epítope con el KD determinado, o con mayor fuerza (o ajustadamente) . En algunas modalidades, el anticuerpo se une con un KD no mayor a 200 pM, por ejemplo, 200-180, 180-170, 170-60, 160-150, 150-140, 140-130, 130-120, 12-100, 100-80, 80-60, 60-50, 50-40, 40-30, 30-20, 20-10, 10-1, 1-0.1 pM o menos . Mientras que KD describe las características de unión de un epítope y un anticuerpo, "potencia" describe la eficacia del anticuerpo mismo para una función del anticuerpo. Un KD relativamente bajo no significa automáticamente una alta potencia. De esta forma, los anticuerpos pueden tener un KD relativamente bajo y una alta potencia (por ejemplo, los mismos se unen bien y alteran la función de manera importante) , un KD relativamente alto y una potencia alta (por ejemplo, los mismos no unen bien pero tienen un fuerte impacto sobre la función) , un KD relativamente bajo y una baja potencia (por ejemplo, se unen bien, pero no de una manera eficaz para alterar una función particular) o un KD relativamente alto y una potencia baja (por ejemplo, simplemente no se unen bien al blanco) . En una modalidad, alta potencia significa que existe un alto nivel de inhibición con una baja concentración del anticuerpo. En una modalidad, un anticuerpo es potente o tiene una alta potencia cuando su IC50 es un valor pequeño, por ejemplo, 130-110, 110-90, 90-60, 60-30, 30-25, 25-20, 20-15, o menos pM. "Prácticamente", a menos que se especifique de otra raanera junto con otro término, significa que el valor puede variar dentro de cualquier cantidad que sea susceptible de errores en la medición que se puedan presentar durante la creación o práctica de las modalidades. "Significativo" significa que el valor puede variar siempre y cuando sea suficiente para permitir que la invención reivindicada funcione para su uso destinado. El término "unir selectivamente", haciendo referencia a un anticuerpo no significa que el anticuerpo sólo se una a una sola sustancia. En lugar de esto, denota que el KD del anticuerpo a una primera sustancia es menor que el KD del anticuerpo a una segunda sustancia. Los anticuerpos que se unen exclusivamente a un epítope sólo se pueden unir a ese único epítope. El término "aminoácido" o "residuo de aminoácidos" en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a aminoácidos L o a aminoácidos D que se presentan en la naturaleza según se describirá más adelante adicionalmente con respecto a las variantes. Se utilizan en la presente las abreviaturas para aminoácidos comúnmente utilizadas de una y tres letras (Bruce Alberts et al , Molecular Biology of the Cel l , Garland Publishing, Inc., New York (3a ed. 1994)). El término "y/o" denota 1) que incluye todas las opciones relevantes, 2) que incluye sólo una (o un subconjunto) de varias de opciones alternativas, 3) que incluye tanto las descripciones anteriores (1) o (2), y 4) que incluye sólo una de las descripciones anteriores (1) o 2) ) El término "mAb", se refiere a anticuerpo monoclonal . El término "XENOMOUSE®", se refiere a cepas de ratones que se han sometido a ingeniería y que contienen fragmentos de configuración en línea germinal con un tamaño de 245 kb y 190 kb del locus de cadena pesada humana y el locus de cadena ligera kappa, según se describe en Green et al. Na ture Geneti cs 7:13-21 (1994). Las cepas de XENOMOUSE® están disponibles de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) . El término "XENOMAX®", se refiere al uso del "método de anticuerpos con linfocitos seleccionados" (Babcook et al . , Proc . Na ti . Acad . Sci . USA, 93:7843-7848 (1996)), cuando se utiliza con animales XENOMOUSE®. El término "SLAM®", se refiere al método de anticuerpos con linfocitos seleccionados (Babcook et al . , Proc . Na ti . Acad . Sci . USA, 93:7843-7848 (1996), y Schrader, patente de los Estados Unidos No. 5,627,052). Los términos "enfermedad", "estado de enfermedad" y "trastorno", se refieren a un estado fisiológico de una célula o de un mamífero total en el cual se ha presentado una interrupción, término, o trastorno de las funciones, sistemas, u órganos celulares o corporales. El término "síntoma", significa cualquier manifestación física u observable de un trastorno, sin importar que sea o no una característica general de este trastorno. El término "síntomas", puede significar todas estas manifestaciones o cualquier subconjunto de las mismas. El término "tratar" o "tratamiento", se refiere tanto a un tratamiento terapéutico como a mediciones profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o disminuir (aminorar) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como por ejemplo, el desarrollo o diseminación de cáncer o asma. "Tratamiento profiláctico", incluye los acontecimientos cuando un tratamiento disminuye la probabilidad de que un sujeto se enferme o aumente la cantidad de tiempo requerido para que el sujeto enferme o exhiba los síntomas o condiciones asociados con el trastorno. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, de manera enunciativa: alivio de los síntomas, disminución del grado de enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeorar) de la enfermedad, retraso o disminución del progreso de la enfermedad, mejora o mitigación del estado de enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. "Tratamiento", también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se está recibiendo ningún tratamiento. Aquellos que necesitan de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen la condición o trastorno así como también aquellos propensos a tener la condición o trastorno o aquellos en los cuales se evitará la condición o trastorno. El término "inhibir", cuando se utiliza junto con una enfermedad o síntoma puede significar que el anticuerpo puede reducir o eliminar la enfermedad o síntoma. Un tratamiento profiláctico no necesariamente evitará por completo la enfermedad o los síntomas. En algunas modalidades, retarda la aparición de la enfermedad. En otras modalidades, reduce la intensidad de la enfermedad o los síntomas. En algunas modalidades, la reducción pueden ser cualquier cantidad, por ejemplo, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, 99-100% de reducción. El término tratamiento también puede incluir cantidades similares de mejora o recuperación . El término "paciente", incluye sujetos humanos y veterinarios. "Administrar", para los fines de tratamiento, significa el suministro a un paciente. Por ejemplo y sin limitación, este suministro puede ser intravenoso, intraperitoneal, mediante inhalación, intramuscular, subcutáneo, oral, tópico, transdérmico o quirúrgico. "Cantidad terapéuticamente eficaz", para los fines del tratamiento, significa una cantidad de tal forma que un síntoma perceptible en la condición y/o síntomas del paciente pudiera resultar de su administración, ya sea sola o en combinación con otro tratamiento. En el sentido en el que se utiliza en la presente, y como se apreciará por aquellos con experiencia en la técnica, existe una variedad de formas en las cuales se puede determinar una cantidad eficaz. Por ejemplo, una cantidad eficaz puede ser una cantidad requerida para reducir la cantidad de un biomarcador mediante cualquier cantidad significativa, incluyendo, por ejemplo, 0-1, 1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, 99-100% de una reducción en el biomarcador. Alternativamente, la cantidad puede ser una cantidad requerida para reducir un porcentaje similar de la cantidad de IL-13 presente en un sujeto. Un "trastorno relacionado con IL-13", es cualquier enfermedad, trastorno, o similar a este término en el cual la IL-13, regula o influye en la enfermedad, incluyendo opcionalmente los síntomas de la enfermedad. Los ejemplos incluyen, enfermedades inflamatorias, cáncer, enfermedad fibrótica, enfermedades caracterizadas por proliferación celular no maligna, asma, incluyendo tanto alérgico (atópico) , como no alérgico (no atópico) , asma bronquial, bronquitis crónica, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), fiebre del heno, rinitis, urticaria, angioedema, dermatitis alérgica, incluyendo dermatitis por contacto, síndrome de Stevens-Johnson, choque anafiláctico, alergias por alimentos, queratitis, conjuntivitis, síndrome nefrítico resistente a esteroides, enfermedad fibrótica por mastocitosis tal como por ejemplo, fibrosis pulmonar, incluyendo, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, fibrosis inducida por bleomicina, fibrosis hepática y esclerosis sistémica, cánceres, tales como por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, trastornos proliferativos de linfocitos B, tales como por ejemplo, linfoma por linfocitos B, en particular linfoma por linfocitos B grandes mediatínicos, leucemias por linfocitos B, carcinoma ovárico, enfermedades caracterizadas por proliferación de linfocitos B no malignos, tales como por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, hepatitis activa crónica y crioglobulinemias; y una enfermedad caracterizada por altos niveles de auto-anticuerpos, tales como por ejemplo, anemia hemolítica, trombocitopenia, síndrome por fosfolípidos y pénfigo; enfermedad inflamatoria del intestino; y enfermedad de injerto contra hospedero. En algunas modalidades, "trastorno dependiente de ligando IL-13", es cualquiera de los anteriores que se pueda influir directamente por la unión de un anticuerpo a IL-13. En otras palabras, el trastorno es directamente el resultado de cantidades excesivas de IL-13. En algunas modalidades, un trastorno tratable por el anticuerpo IL-13, es cualquiera de los anteriores que se pueda aceptar eficazmente mediante la adición de uno de los anticuerpos expuestos actualmente. Alterar la "actividad relacionada con IL-13" incluye tratar cualquiera de los trastornos anteriores con un anticuerpo; también puede incluir otros usos no terapéuticos o profilácticos del anticuerpo que puedan alterar la actividad de IL-13. En algunas modalidades, "trastorno relacionado con IL-13", puede abarcar cualquier trastorno en el cual esté presente en el paciente un nivel elevado de IL-13. En algunas modalidades, "trastorno relacionado con IL-13", puede abarcar cualquier trastorno que tenga un fenotipo que sea característico de IL-13. Los fenotipos que son característicos de un paciente con un trastorno relacionado con IL-13 se pueden determinar y observar al administrar una cantidad de IL-13 a un paciente para inducir diversos fenotipos. La cantidad de IL-13 administrada puede variar y se puede determinar rutinariamente por alguien con experiencia en la técnica. En algunas modalidades, el trastorno relacionado con IL-13 es uno que sea un trastorno provocado o relacionado por la citosma TH2. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "biomarcador", puede abarcar cualquier molécula que pueda rastrear o seguir el nivel de actividad relacionada con IL-13 o la concentración en una muestra. Los ejemplos de biomarcadores IL-13 incluyen CÍO, TARC y eotaxina. Un "detector de biomarcadores", es cualquier molécula o técnica, que permita que se determine la cantidad, y en algunas modalidades, el cambio en la cantidad, del biomarcador en una muestra. Por ejemplo, los anticuerpos para el biomarcador, ligandos o receptores para el biomarcador, diversos peptidos pequeños que se unen al receptor todos se podrían incluir como tipos de detectores de biomarcadores. Un "vehículo farmacéutico aceptable", para los fines del tratamiento, es una modalidad física que se puede administrar a un paciente. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser de manera enunciativa: pildoras, cápsulas, comprimidos, tabletas, fluidos administrados oralmente, fluidos inyectables, rocíos, aerosoles, pastillas, neutracéuticos, cremas, lociones, aceites, soluciones, pastas, polvos, vapores, o líquidos. Un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable es una solución isotónica tampón, tal como por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés). "Neutralizar", para los fines de tratamiento, significa suprimir parcial o completamente la actividad química y/o biológica. "Sub-regular", para los fines de tratamiento, significa disminuir el nivel de una composición blanco particular . "Mamífero", para los fines de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, para deportes, o mascotas, tales como por ejemplo, monos, perros, caballos, gatos, vacas, etc. El término "poliucleótido" según se denomina en la presente, significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de cadena individual o doble del ADN. El término "polinucleótido aislado", en el sentido en que se utiliza en la presente, se debe entender como un polinucleótido de origen genómico, ADNc, o sintético o alguna combinación de los mismos, el cual en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" (1) no se asocia con la totalidad o una porción de un polinucleótido en el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) se enlaza funcionalmente a un polinucleótido que no está enlazado en la naturaleza, o (3) no se presenta en la naturaleza como una porción de una secuencia mayor. El término "oligonucleótido", al que se hace referencia en la presente, incluye los nucleótidos que se presentan en la naturaleza, y los modificados vinculados conjuntamente por enlaces de oligonucleótidos que se presentan en la naturaleza y que no se presentan en la naturaleza. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que comprende en general una longitud de 200 bases o menos. De preferencia, los oligonucleótidos tienen de 10 hasta 60 bases de longitud y la mayoría de preferencia 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 hasta 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos por lo general son de cadena individual, por ejemplo, para soluciones de ensayo; aunque los oligonucleótidos también pueden ser de doble cadena, por ejemplo, para utilizarse en la construcción de un mutante génico. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos ya sea sentido o antisentido. El término "nucleótido que se presenta en la naturaleza", en el sentido en el que se utiliza en la presente, incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos el término "nucleótidos modificados", al que se hace referencia en la presente incluyen nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y lo semejante. El término "enlaces de oligonucleótido", al que se hace referencia en la presente incluye enlaces de oligonucleótidos tales como por ejemplo, fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y lo semejante. Véase, por ejemplo, LaPlanche et al. Nucí . Acids Res . 14-9081 (1986); Stec et al. J. Am . Chem . Soc . 106:6077 (1984); Stein et al. Nucí . Acids Res . 16:3209 (1988); Zon et al. An ti -Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues : A Pra ctical Approa ch, pp. 87-108 (F Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)), Stec et al. patente de los Estados Unidos No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir una marca para detección, si se desea. El término "hibridar selectivamente", al que se hace referencia en la presente, significa que se une detectable y específicamente. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos se hibridan selectivamente a cadenas de ácido nucleico bajo hibridación y condiciones de lavado que reducen al mínimo las cantidades apreciables de la unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden utilizar condiciones bastante severas para alcanzar las condiciones de hibridación selectiva como se sabe en la técnica y se analiza en la presente. En general, la homología de secuencias de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos, o fragmentos de anticuerpo y una secuencia de ácido nucleico de interés será al menos del 80%, y más típicamente con homologías en aumento de preferencia de al menos 85%, 90%, 95%, 99% y 100%. El término "secuencia control", en el sentido en que se utiliza en la presente, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para llevar a cabo la expresión y procesamiento de las secuencias codificantes a las cuales se conectan. La naturaleza de estas secuencias control difiere dependiendo del organismo hospedero; en procariotas, estas secuencias control en general incluyen un promotor, sitio de unión ribosómica, y una secuencia para la terminación de transcripción; en eucariotas, en general, estas secuencias control incluyen promotores y una secuencia para la terminación de transcripción. El término "secuencias control" pretende incluir, en un mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias asociadas para fusión. El término "enlazado funcionalmente", en el sentido en que se utiliza en la presente, se refiere a las posiciones de los componentes así descritos, que están en una relación que les permita funcionar en su forma destinada. Por ejemplo, una secuencia control "enlazada funcionalmente" a una secuencia codificante se conecta de tal forma que se alcance la expresión de la secuencia codificante bajo condiciones compatibles con las secuencias control. El término "proteína aislada" al que se hace referencia en la presente, significa una proteína de ADNc, ARN recombinante, o el origen sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, o fuente de derivación, la "proteína aislada" (1) no se asocia con las proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas murinas, (3) se expresa mediante una célula a partir de una especie diferente, o (4) no se presenta en la naturaleza . El término "polipéptido", en el sentido en el que se utiliza en la presente como un término genérico, hace referencia a una proteína natural fragmentos o análogos de una secuencia de polipéptidos. Por lo tanto, una proteína natural, fragmentos y análogos son especies del género de polipéptidos. Los polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humanas representadas por las SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, y 81-88, por ejemplo, y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana mediante las SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, y 89-94, por ejemplo, así como también, las moléculas de anticuerpos formadas por las combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como por ejemplo, las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, así como también los fragmentos y análogos de los mismos. En algunas modalidades, el anticuerpo tiene una secuencia proveniente de la cadena pesada CDRl, CDR2, CDR3, FRl, FR2, FR3, y/o FR4 o cualquiera de las secuencias listadas en la Tabla 18. En algunas modalidades, el anticuerpo tiene una secuencia proveniente de la cadena ligera CDRl, CDR2, CDR3, FRl, FR2 , de FR3, y/o J o cualquiera de las secuencias listadas en las Tablas 19 y 20. A menos que se especifique de otra manera, las secuencias de polinucleótidos al extremo izquierdo de la cadena individual es el extremo 5' ; las secuencias de polinucleótidos en la dirección derecha de doble cadena es la que se denomina como la dirección 5' . La dirección de adición 5' a 3' de transcripciones de ARN incipiente se denomina como la dirección de transcripción, las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tiene la misma secuencia como el ARN y las cuales son el extremo 5' a 5' de la transcripción de ARN se denominan como "secuencias en la dirección 5'"; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tiene la misma secuencia que el ARN y las cuales son el extremo 3' al 3' de la transcripción de ARN se denominan como "secuencias en la dirección 3'". En el sentido en que se utiliza en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen la utilización convencional. Véase, Immunology-A Synthesis (2a Edición, E. S. Golub and D. R Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, los aminoácidos no naturales, tales como por ejemplo, aminoácidos alfa, alfa-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen 4-hidroxiprolina, ?-carboxyilutamato, e- N, N, N-trimetillisina, e-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3- metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la notación de polipéptidos utilizado en la presente, la dirección izquierda es la dirección amino terminal y la dirección derecha es la dirección carboxiterminal, de acuerdo con la utilización y convención estándar. El término "corresponde a", en el sentido en el que se utiliza en la presente, significa que una secuencia de polinucleótidos es homologa (es decir, es idéntica, no relacionada estrictamente con la evolución) a la totalidad o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia, o que una secuencia de polipéptidos es idéntica a una secuencia de polipéptidos de referencia. En contradistinción, el término "complementario a", en el sentido en el que se utiliza en la presente para significar que la secuencia complementaria es homologa a la totalidad o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA" . Los siguientes términos se encuentran entre aquellos utilizados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de polinucleótidos o aminoácidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de la secuencia", "porcentaje de la identidad de la secuencia", "identidad sustancial", y "homología". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida, utilizada como una base para una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de ADNc o génica de longitud total en un listado de secuencias o puede comprender una secuencia de ADNc o génica completa. En general, una secuencia de referencia es al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos de longitud, con frecuencia al menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de longitud, y con frecuencia al menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos de longitud. Debido a que dos polinucleótidos o secuencias de aminoácidos cada uno (1) puede comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia completa de polinucleótidos o aminoácidos) que es similar entre las dos moléculas, y (2) además puede comprender una secuencia que sea divergente ente las dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) moléculas se realizan típicamente mediante secuencias de comparación de las dos moléculas con respecto a una "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a un segmento conceptual de al menos aproximadamente 18 posiciones de nucleótidos contiguos o aproximadamente 6 aminoácidos, en donde la secuencia de polinucleótidos o la secuencia de aminoácidos se compara con una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos contiguos o 6 secuencias de aminoácidos y en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede incluir adiciones, supresiones, sustituciones y lo semejante (es decir, intervalos) del 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias la alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede conducir mediante un algoritmo de homología local de Smith and Waterman Adv. Appl . Ma th . 2:482 (1981) mediante un algoritmo para alineación de homología de Needleman and Wunsch J. Mol . Biol . 48:443 (1970) mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson and Lipman Proc .

Na ti . Acad . Sci . (E.U.A.) 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), GENEWORKSMR, o los paquetes de software MACVECTOR®, o mediante inspección, y la mejor alineación (es decir, la que resulta en el porcentaje mayor de homología con respecto a la ventana de comparación) generada por diversos métodos se selecciona. El término "identidad de secuencia", significa que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos son idénticas (es decir, sobre una base de nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) con respecto a la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula al comparar dos secuencias alineadas óptimamente con respecto a la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales se presenta la base de aminoácidos idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) o el residuo de aminoácidos en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones que coinciden, dividiendo el número de posiciones que coinciden entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, tamaño de la ventana) , y multiplicar el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de la identidad de secuencia. Los términos "identidad sustancial", en el sentido en el que se utiliza en la presente, denota una característica de una secuencia de polinucleótido o aminoácidos, en donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tenga una identidad de secuencia de al menos el 85 por ciento, de preferencia una identidad de secuencia de al menos 90 al 95 por ciento, de mayor preferencia una identidad de secuencia de al menos 99 por ciento, en comparación con una secuencia de referencia con respecto a una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos), con frecuencia respecto a una ventana de posiciones de al menos 24-48 nucleótidos (8-16 aminoácidos), en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula para compararse con la secuencia de referencia para la secuencia que puede incluir supresiones o adiciones con un 20 por ciento total o menor de la secuencia de referencia con respecto a la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor. Dos secuencias de aminoácidos o secuencias de polinucleótidos son "homologas" si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, una homología del 85% significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para una máxima coincidencia. Se permiten intervalos (en cualquiera de las dos secuencias que se harán coincidir) para aumentar al máximo la coincidencia; longitudes de intervalo de 5 o menos se prefieren con 2 o menos que son las más preferidas.

Alternativamente y de preferencia, dos secuencias proteínicas (o secuencias de polipéptidos derivadas de las mismas de al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud) son homologas, en el sentido en que se utiliza en la presente este término, si las mismas tienen una marca de alineación de mas de 5 (en unidades de desviación estándar) utilizando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalidad de intervalo de 6 o mayor. Véase Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y el suplemento 2 para este volumen, pp 1-10. Las dos secuencias o porciones de las mismas son de preferencia más homologas si sus aminoácidos son mayores o iguales al 50% idénticos cuando se alinean óptimamente utilizando el programa ALIGN. Según se aplique a polipéptidos, el término "identidad sustancial", significa que dos secuencias de péptidos, cuando se alinean óptimamente, tales como por ejemplo, mediante los programas GAP o BESTFIT se utilizan pesos de intervalo por omisión, comparten al menos el 80 por ciento de identidad de secuencia, de preferencia al menos el 90 por ciento de identidad de secuencia, de mayor preferencia al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia, y con la máxima preferencia una identidad de secuencia de al menos el 99 por ciento. De preferencia, las posiciones de los residuos que no son idénticos difieren en las sustituciones de aminoácidos conservadoras. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la capacidad de intercambio de los residuos que tengan cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tenga cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas-hidróxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre, cisteina y metionina. Los grupos de sustitución con aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutámico-aspártico y asparagina-glutamina . Como se analiza en la presente, se contemplan variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de las moléculas de anticuerpos o inmunoglobulina según se abarquen por la presente invención, proporcionando las variaciones en la secuencia de aminoácidos que se mantienen al menos al 75%, de mayor preferencia al menos al 80%, 90%, 95%, y con la máxima preferencia al 99%. En particular, se contemplan reemplazos aminoácidos conservadores. Los reemplazos conservadores son aquellos que se llevan a cabo dentro de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente en general se dividen en familias: (1) ácidas=aspartato, glutamato; (2) básicas=lisina, arginina, histidina; (3) no polares=alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) sin carga polar=glicina, asparagina, glutamina, cisteina, serina, treonina, tirosina. Las familias más preferidas son: serina y treonina son la familia alifática-hidroxi; asparagina y glutamina son una familia que contiene amida; alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptofano y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente, no tendrá un mayor efecto sobre la unión o las propiedades de la molécula resultante, en especial si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio de trama. Ya sea que un aminoácido cambie los resultados en un péptido funcional se puede determinar fácilmente al analizar la actividad específica del derivado de polipéptido. Los análisis se describen en detalle en la presente . Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se pueden preparar fácilmente por aquellos con experiencia normal en la técnica. Los términos amino y carboxi preferidos de fragmentos o análogos se presentan cerca de los límites de dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar mediante la comparación de los datos de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de las secuencias públicas o patentadas. De preferencia, se utilizan métodos de comparación computarizada para identificar los motivos de secuencia o los dominios predichos de la conformación proteínica que se presentan en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen los métodos para identificar secuencias proteínicas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al., Science 253:164 (1991). Los ejemplos anteriores demuestran que aquellos con experiencia en la técnica podrán reconocer los motivos de secuencia y conformaciones estructurales que se puedan utilizar para definir los dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la invención. Las sustituciones preferidas de aminoácidos son aquellos que: (1) se reducen susceptiblemente a proteólisis, (2) se reducen susceptiblemente a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteínicos, (4) alteran las afinidades de unión, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de estos análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia de péptidos que se presenta en la naturaleza. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (de preferencia sustituciones de aminoácidos conservadoras) en la secuencia que se presente en la naturaleza (de preferencia, en la porción del extremo externo del polipéptido, los dominios que forman los contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservadora no deberá cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no deberá tender a romper una hélice que se presenta en la secuencia original, o romper otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia original). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidos en la técnica se describen en: Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et at . Nature 354:105 (1991) . El término "fragmento polipeptídico", en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una supresión amino-terminal y/o carboxi-terminal, aunque en donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia que se presenta naturalmente deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud total. Los fragmentos típicamente tienen al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud, de preferencia al menos 14 aminoácidos de longitud, de mayor preferencia al menos 20 aminoácidos de longitud. En otras modalidades, los fragmentos polipeptídicos tienen al menos 25 aminoácidos de longitud, de mayor preferencia al menos 50 aminoácidos de longitud, e incluso de mayor preferencia al menos 70 aminoácidos de longitud. Los análogos peptídicos se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a aquellas del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan "imitadores peptídicos" o "peptidomimético". Fauchere, J. Adv. Drug. Res . 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans et al. J. Med . Chem . 30: 1229 (1987). Estos compuestos con frecuencia se desarrollan con la ayuda de modelado molecular computarizado. Los imitadores peptídicos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles se pueden utilizar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica) , tal como por ejemplo, un anticuerpo humano, pero que tienen uno o más enlaces peptídicos remplazados opcionalmente por un enlace seleccionado del grupo que consiste de: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- y -CH2SO-, mediante métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consensual con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se puede utilizar para generar más péptidos estables. Además, mediante métodos conocidos en la técnica se pueden generar péptidos restringidos que comprenden una secuencia consensual o una variación de secuencia consensual prácticamente idéntica (Rizo and Gierasch Ann . Rev. Biochem . 61:387 (1992); por ejemplo, al agregar residuos de cisteina interna capaz de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclizan el péptido. En el sentido en el que se utiliza en la presente, los términos "marca" o "marcado", se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de entidades con biotinilo que se puedan detectar mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o una actividad enzimática que se pueda detectar mediante métodos ópticos o colorimétricos) . En ciertas situaciones, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutico. Se conocen en la técnica y se pueden utilizar diversos métodos para marcar polipéptidos y glucoproteínas . Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen de manera enunciativa los siguientes: radioisótopos o radionuclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Te, n?In, 125I, 131I), marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de la serie lantánida) , marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , grupos biotinilo, quimioluminiscentes, epítopes polipeptídicos predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, pares de secuencias con leucina zíper, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión metálica, etiquetas de epítopes). En algunas modalidades, las marcas se unen mediante ramificaciones separadoras de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. El término "agente o fármaco farmacéutico", en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente. Otros términos químicos en la presente se utilizan de acuerdo con el uso convencional en la técnica, según se ejemplifica por: The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)). En el sentido en el que se utiliza en la presente, "prácticamente puro", significa una especie objetivo en la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar que sea más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) , y de preferencia una fracción prácticamente purificada es una composición en donde la especie objetivo comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (sobre una base molar) de la totalidad de especies macromoleculares presentes. En general, una composición prácticamente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de la totalidad de especies macromoleculares presentes en la composición, de mayor preferencia más de aproximadamente el 85%, 90%, 95%, y 99%. Con la máxima preferencia, la especie objetivo se purifica para una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se podrán detectar en la composición mediante métodos convencionales de detección) en donde la composición consiste esencialmente de una especie macromolecular individual.

Estructura del anticuerpo La unidad estructural del anticuerpo básico se sabe que comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 hasta 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento antigénico. La porción carboxi-terminal de cada cadena, define una región constante responsable principalmente para la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variables y constantes se unen mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. ( Véase en genera l , Fundamen ta l Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed , 2a ed. Raven Press, N. Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión con anticuerpos. De esta forma, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales. La totalidad de cadenas exhiben la misma estructura general de regiones trama relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR provenientes de dos cadenas de cada par se alinean mediante las regiones trama, permitiendo la unión con un epítope específico. Desde N-terminal hasta C-terminal, ambas cadenas ligera y pesada comprenden los dominios FRl, CDRl, FR2 , CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos para cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987); Chothia et al. Na ture 342:878-883 (1989). Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos diferentes pares de cadena pesada/ligera y dos diferentes sitios de unión. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una variedad de métodos entre los que se incluyen la fusión de hibridomas o la vinculación de fragmentos Fab' {Idéase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann Clin . Exp . Immunol . 79:315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol . 148:1547-1553 (1992)). La producción de anticuerpos biespecíficos puede ser un proceso intensivo relativamente laborioso en comparación con la producción de anticuerpos convencionales y los rendimientos y grado de pureza en general son inferiores para los anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos no existen en la forma de fragmentos que tengan un sitio de unión individual (por ejemplo, Fab, Fab', y Fv) .

Anticuerpos humanos y humanización de anticuerpos Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes murinas o de rata. La presencia de estas proteínas derivadas murinas o de rata puede conducir al rápido aclaramiento de los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmunológica en contra de los anticuerpos por un paciente. Con el fin de evitar la utilización de los anticuerpos derivados murinos o de ratas, se pueden generar anticuerpos totalmente humanos a través de la introducción de una función de anticuerpo humano en un roedor de tal forma que el roedor produzca anticuerpos totalmente humanos. A menos que se identifique específicamente en la presente, anticuerpos "humanos" y "totalmente humanos", se pueden utilizar de manera indistinta en la presente. El término "totalmente humano", se puede utilizar cuando se distingan los anticuerpos que sean sólo parcialmente humanos de aquellos que sean completamente o totalmente humanos. Un método para generar anticuerpos totalmente humanos es a través del uso de cepas de XENOMOUSE® de ratones que se hayan sometido a ingeniería para que contengan fragmentos con configuración de línea germinal con tamaño de 245 kb y 190 kb de locus de cadena pesada humana y el locus de cadena ligera kappa. Véase, Green et al. Na ture Geneti cs 7:13-21 (1994). Las cepas de XENOMOUSE® están disponibles de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) . La producción de XENOMOUSE® se analiza y delinea adicionalmente en las solicitudes de patente de los Estados Unidos Nos. de serie 07/466,008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/610,515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919,297, presentada el 24 de julio de 1992, 07/922,649, presentada el 30 de julio de 1992, 08/031,801, presentada el 15 de marzo de 1993, 08/112,848, presentada el 27 de agosto de 1993, 08/234,145, presentada el 28 de abril de 1994, 08/376,279, presentada el 20 de enero de 1995, 08/430,938, presentada el 27 de abril de 1995, 08/464,584, presentada el 5 de junio de 1995, 08/464,582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/463,191, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,857, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,513, presentada el 5 de junio de 1995, 08/724,752, presentada el 2 de octubre de 1996, y 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y las patente de los Estados Unidos Nos. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181 y 5,939,598 las patentes japonesas Nos. 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, y 3 068 507 B2. También véase Méndez et al. Na ture Genetics 15:146-156 (1997) y Green and Jakobovits J. Exp . Med. 188:483-495 (1998). También véase la patente europea No. EP 0 463 151 Bl, otorgamiento publicado el 12 de junio de 1996, la solcitud de patente interncional No. WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, la solicitud de patente internacional No. WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. En un procedimiento alternativo, incluyendo otros GenPharm International, Inc., han utilizado un procedimiento de "minilocus". En el procedimiento minilocus, un locus Ig exógeno se limita a través de la inclusión de piezas (genes individuales) provenientes del locus Ig. De esta forma, uno o más genes VH, unos o más genes DH, unos o más genes JH, una región constante mu, y una segunda región constante (de preferencia una región constante gamma) se forman en una construcción para inserción en un animal. Este procedimiento se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,545,807 de Surani et al., y las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, y 6,255,458 cada una de Lonberg and Kay, la patente de los Estados Unidos No. 5,591,669 y 6,023,010 para Knmpenfort and Berns, las patente de los Estados Unidos Nos. 5,612,205, 5,721,367 y 5,789,215 de Berns et al., y la patente de los Estados Unidos No. 5,643,763 de Choi and Dunn, y las solicitudes de patente de los Estados Unidos de GenPharm Internacional Nos. de serie 07/574,748, presentada el 29 de agosto de 1990, 07/575,962, presentada el 31 de agosto de 1990, 07/810,279, presentada el 17 de diciembre de 1991, 07/853,408, presentada el 18 de marzo de 1992, 07/904,068, presentada el 23 de junio de 1992, 07/990,860, presentada el 16 de diciembre de 1992, 08/053,131, presentada el 26 de abril de 1993, 08/096,762, presentada el 22 de julio de 1993, 08/155,301, presentada el 18 de noviembre de 1993, 08/161,739, presentada el 3 de diciembre de 1993, 08/165,699, presentada el 10 de diciembre de 1993, 08/209,741, presentada el 9 de marzo de 1994. También véase la patente europea No. 0 546 073 Bl, las solicitudes de patente internacional Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884 y la patente de los Estados Unidos No. 5,981,175. Además véase, Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), y Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996). Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los cuales, a través de la fusión microcelular, se han introducido grandes porciones de cromosomas, o cromosomas completos. Véanse las solicitudes de patente europea Nos. 773 288 y 843 961. Las respuestas al anticuerpo anti-ratón humano (HAMA, por sus siglas en inglés) también han conducido la industria al preparar anticuerpos quiméricos o de otra manera humanizados. Mientras que los anticuerpos quiméricos tienen una región constante humana y una región variable murina, se espera que se observaran ciertas respuestas al anticuerpo anti-quimérico humano (HACA, por sus siglas en inglés), en particular en las utilizaciones crónicas o de dosis múltiple del anticuerpo. De esta forma, podría ser conveniente proporcionar anticuerpos totalmente humanos contra enzimas multiméricas con el fin de menoscabar los problemas y/o efectos de la respuesta HAMA o HACA.

Preparación de anticuerpos Los anticuerpos, según se describen en la presente, se prepararon utilizando la tecnología XENOMOUSE®, como se describirá más adelante. Estos ratones fueron capaces de producir moléculas de inmunoglobulina humana y anticuerpos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina murina y anticuerpos. Las tecnologías utilizadas para alcanzar los mismos se exponen en las patentes, solicitudes y referencias citadas en la presente.

En particular, sin embargo, una modalidad de la producción transgénica de ratones y anticuerpos de los mismos se exponen en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de serie 08/759.620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y las solicitudes de patente internacional Nos. WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. También véase, Méndez et al., Na ture Geneti cs 15:146-156 (1997). A través del uso de esta tecnología, se produjeron anticuerpos monoclonales totalmente humanos para IL-13, según se describirá en detalle más adelante. Esencialmente, las líneas XENOMOUSE® de ratones se inmunizaron con IL-13 humana, las células linfáticas (tales como por ejemplo, linfocitos B) se recuperaron de los ratones que expresaron anticuerpos, y las líneas celulares recuperadas se fusionaron con una línea celular tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortal. Estas líneas celulares de hibridoma se clasificaron y seleccionaron para identificar las líneas celulares de hibridoma que produjeron los anticuerpos específicos para la IL-13. Además, en la presente se proporciona la caracterización de los anticuerpos producidos mediante estas líneas celulares, incluyendo los análisis de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de estos anticuerpos. Alternativamente, en lugar de fusionarse a células del mieloma para generar hibridomas, las células recuperadas, aisladas de las líneas XENOMOUSE® inmunizadas de ratones, se pueden clasificar adicionalmente para la actividad contra el antígeno inicial, de preferencia la IL-13 humana. Esta clasificación incluye un ELISA con la proteína IL-13 deseada de y los análisis funcionales tales como por ejemplo, la producción de eotaxina-1 inducida por IL-13. Los linfocitos B individuales que secretan anticuerpos que se unen específicamente a la IL-13 entonces se pueden aislar utilizando un análisis en placa hemolítica IL-13 específica deseada (Babcook et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA. 193-7843-7848 (1996)). Los codocitos para lisis de preferencia son glóbulos rojos de oveja (SRBCs, por sus siglas en inglés) recubiertos con IL-13. En presencia de un cultivo de linfocitos B que secretan la inmunoglobulina de interés y el complemento, la formación de una placa indica la lisis suministrada por IL-13 específica de los codocitos. Una célula plasmática antígena-específica individual en el centro de la placa se puede aislar y la información genética que codifica la especificidad del anticuerpo aislado proveniente de la célula plasmática individual. Utilizando PCR con transcriptasa inversa, el ADN que codifica para la región variable del anticuerpo secretado se puede clonar. Este ADN clonado entonces se puede insertar adicionalmente en un vector de expresión adecuado de preferencia un cásete con el vector tal como por ejemplo, un ADNpc (Invitrogen, Carlsbad, CA) , de mayor preferencia un vector de ADNpc que contenga los dominios constantes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina. El vector generado entonces se puede transfectar en células hospederas, de preferencia células CHO, y se puede cultivar en medios con nutrientes convencionales modificados según sea adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. En la presente, se describe el aislamiento de múltiples células plasmáticas individuales que producen anticuerpos específicos para IL-13. Además, el material genético que codifica para un anticuerpo que se une específicamente a IL-13 se aisló, y ese material se introdujo en un vector de expresión adecuada y después de esto se transfectó en células hospederas. En general, los anticuerpos producidos mediante las líneas celulares mencionadas anteriormente poseyeron las cadenas pesadas IgGl o IgG2 totalmente humanas con las cadenas ligeras kappa humanas. Los anticuerpos poseyeron altas afinidades, típicamente poseyeron los KD entre aproximadamente 10~9 hasta aproximadamente 10"13 M, cuando se midieron mediante cualquier fase en sólidos y fase en solución. Como se mencionó anteriormente, los anticuerpos anti-IL-13 se pueden expresar en líneas celulares distintas que las líneas celulares de hibridomas. Las secuencias que codifican para anticuerpos particulares se pueden utilizar para la transformación de una célula hospedera de mamífero adecuada, tal como por ejemplo, una célula CHO. La transformación puede ser cualquier método conocido para la introducción de polinucleótidos en una célula hospedera, incluyendo, por ejemplo, empacar el polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y la transducción a una célula hospedera con el virus (o vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica por las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455. El procedimiento de transformación utilizado depende del hospedero que será transformado. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células mamíferas son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección suministrada por dextrano, precipitación de fosfato calcico, transfección suministrada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos. Las líneas celulares mamíferas disponibles como hospederos para la expresión son bien conocidos en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la colección de cultivos tipo americano (ATCC, por sus siglas en inglés) , incluyendo de manera enunciativa células ováricas de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), células HeLa, células renales de hámster bebé (BHK, por sus siglas en inglés) , células renales de mono (COS, por sus siglas en inglés), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), y otras diversas líneas celulares. Las líneas celulares de particular preferencia se seleccionan a través de la determinación de cuáles líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades de unión con IL-13.

Secuencias de anticuerpos Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos con región variable de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos representativos de anti-IL-13 humana se proporcionan en el listado de secuencia, el contenido del mismo se resume en la siguiente Tabla 1.

TABLA 1 Terapéutica del anticuerpo Los anticuerpos anti-IL-13 tienen valor terapéutico para tratar síntomas y condiciones relacionadas con la actividad de IL-13 (por ejemplo, un trastorno relacionado con IL-13) . IL-13 se ha implicado en una amplia variedad de enfermedades y de trastornos, incluyendo enfermedades inflamatorias, cáncer, enfermedad fibrótica y enfermedades caracterizadas por proliferación celular no maligna. En modalidades específicas, los anticuerpos anti-IL-13 expuestos en la presente se utilizan en el tratamiento de enfermedades inflamatorias o trastornos tales como por ejemplo, asma, incluyendo tanto alérgico (atópico) como no alérgico (no atópico), asma bronquial, bronquitis crónica, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , fiebre del heno, rinitis, urticaria, angioedema, dermatitis alérgica, incluyendo dermatitis por contacto, síndrome de Stevens-Johnson, choque anafiláctico, alergias por alimentos, queratitis, conjuntivitis, síndrome nefrítico resistente a esteroides. En otras modalidades, los mismos se utilizan para tratar mastocitosis. Todavía en otras modalidades los mismos se utilizan para tratar una enfermedad fibrótica, tal como por ejemplo, fibrosis pulmonar, incluyendo fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, fibrosis inducida por bleomicina, fibrosis hepática y esclerosis sistémica. En modalidades adicionales, los anticuerpos anti-IL-13 se utilizan para tratar cánceres, tales como por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, trastornos proliferativos de linfocitos B, tales como por ejemplo, linfoma de linfocitos B, en particular linfoma de linfocitos B grandes, mediastínicos, leucemias por linfocitos B, carcinoma ovárico. Todavía en otras modalidades, los anticuerpos anti- IL-13 se utilizan para tratar enfermedades caracterizadas por proliferación de linfocitos B no malignos, tales como por ejemplo, lupus eritematosos sistémico, artritis reumatoide, hepatitis activa crónica y crioglobulinemias; una enfermedad caracterizada por altos niveles de auto-anticuerpos, tales como por ejemplo, anemia hemolítica, trombocitopenia, síndrome por fosfolípidos y pénfigo; enfermedad inflamatoria del intestino; y enfermedad de injerto contra hospedero. En algunas modalidades, los anticuerpos se utilizan para el tratamiento o prevención de asma en seres humanos, ratones, u otros animales. En algunas modalidades, se contempla el uso de los anticuerpos en un medicamento para el tratamiento de un trastorno relacionado con IL-13 (una enfermedad, condición, etc., que se relaciona con IL-13) . El medicamento puede contener una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo. En algunas modalidades, la cantidad de IL-13 en el medicamento es suficiente de tal forma que se observe al menos un resultado benéfico, por ejemplo, una disminución de un síntoma. En algunas modalidades, la cantidad que se administra elimina toda la totalidad de los síntomas del trastorno relacionado con IL-13. En algunas modalidades, la cantidad es suficiente de tal forma que el nivel de un biomarcador disminuya en un sujeto después de que el medicamento se haya administrado. En algunas modalidades, la cantidad del anticuerpo administrada es de aproximadamente 0.001 hasta 1000, 0.1 hasta 100, 0.5 hasta 50, 1 hasta 10, 1, 3 o 10 mg del anticuerpo/kg del sujeto. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, la cantidad real del anticuerpo puede depender del trastorno particular (por ejemplo, asma, ya sea agudo o crónico), el método de administración, la frecuencia de administración, el resultado deseado, las características del paciente y las características del anticuerpo. La cantidad real administrada se puede determinar por alguien con experiencia en la técnica, a través de una experimentación rutinaria, a la luz de la presente exposición. En algunas modalidades, una sola dosis será suficiente. En otras modalidades, pueden ser benéficas dosis múltiples o continuas. La cantidad real y el método de administración se pueden determinar a través del uso de, entre otras técnicas, los biomarcadores y ejemplos descritos en la presente. Por ejemplo, los niveles de eotaxma, CÍO, y/o TARC se pueden supervisar para proporcionar el nivel óptimo de eficacia en el tratamiento del trastorno relacionado con IL-13. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, el uso del anticuerpo en la preparación o elaboración de un medicamento puede implicar cualquiera de los anticuerpos expuestos en cualquier cantidad, suficiente para tratar la condición particular a la cual se dirige. Cualquiera de las condiciones expuestas, o cualquiera de los trastornos relacionados con IL-13 puede ser la condición que será tratada. En algunas modalidades, el uso del anticuerpo en la preparación de un medicamento es con uno de los anticuerpos particulares, tales como por ejemplo, mAb 731, 643 ó 623, o cualquiera de los anticuerpos listados en la Tabla 1. En algunas modalidades, el anticuerpo utilizado tiene un KD menor a 50 ó 10 pM. En algunas modalidades, el anticuerpo utilizado da por resultado en una disminución de la producción de mucosidad de al menos 30%. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, los métodos de uso expuestos actualmente se pueden emplear para crear un medicamento para el uso. En algunas modalidades, el medicamento comprende además un anticuerpo o detector de biomarcadores, para un biomarcador. En otros aspectos, el detector de biomarcadores se utiliza en la producción de un medicamento sin el anticuerpo para IL-13. El detector de biomarcadores en el medicamento puede ser un anticuerpo u otra proteína que se una específicamente al biomarcador . Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, la naturaleza del trastorno puede desempeñar una función en la cantidad, frecuencia, y método de administración. Por ejemplo, en trastornos crónicos, se pueden requerir cantidades relativamente mayores, anticuerpos más potentes, y/o dosis administradas con mayor frecuencia del anticuerpo. De manera similar, en trastornos agudos, la cantidad del anticuerpo requerido para el tratamiento, incluyendo la profilaxis, puede ser relativamente menor. En sujetos en los cuales la sensibilización se requiere inicialmente antes de la inoculación, pueden ser benéficas cantidades menores del anticuerpo en comparación con la cantidad requerida para sujetos que son naturalmente alérgicos. En estos sistemas crónicos, puede ser ventajosas cantidades aumentadas del anticuerpo, así como también, una frecuencia aumentada de administración. La cantidad exacta se puede determinar fácilmente por alguien con experiencia en la técnica, a la luz de la presente exposición. Alguien con experiencia en la técnica apreciará adicionalmente otros factores y la forma de ajustar la administración del anticuerpo por consiguiente. Si se desea, se puede cambiar el isotipo de un anticuerpo anti-IL-13, por ejemplo, para aprovechar una propiedad biológica de un isotipo diferente. Por ejemplo, en algunas circunstancias, puede ser conveniente para los anticuerpos terapéuticos contra IL-13 que sean capaces de fijar el complemento y participar en una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés) . Existen varios isotipos de anticuerpos que son capaces de lo mismo, incluyendo de manera enunciativa los siguientes: IgM murino, IgG2a murino, IgG2b murino, IgG3 murino, IgM humano, IgGl humano, e IgG3 humano. Se apreciará que los anticuerpos que se generan no necesitan poseer inicialmente este isotipo, sino que más bien, el anticuerpo según se genera puede poseer cualquier isotipo y el anticuerpo puede ser el isotipo cambiado después de esto utilizando técnicas convencionales que son bien conocidas en este campo. Estas técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas ( véase, por ej emplo, la patente de los Estados Unidos No. 4,816,397), las técnicas de fusión célula-célula (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,916,771 y 6,207,418), entre otros. A manera de ejemplo, los anticuerpos anti-IL-13 analizados en la presente son anticuerpos humanos. Si un anticuerpo posee la unión deseada a IL-13, éste podría ser fácilmente el isotipo cambiado para generar un isotipo IgM humano, IgGl humano, o IgG3 humano, mientras que siga poseyendo la misma región variable (que define la especificidad del anticuerpo y algo de su afinidad) . Esta molécula podría ser capaz de fijar el complemento y participar en CDC. En la técnica de fusión célula-célula, se prepara un mieloma u otra línea celular que posea una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y se prepara otro mieloma u otra línea celular que posea la cadena ligera. Por lo tanto, estas células se pueden fusionar y se puede aislar una línea celular que exprese un anticuerpo intacto. Por consiguiente, se generan candidatos de anticuerpo que cumplan con los atributos "estructurales" deseados según se analizó anteriormente, los mismos en general se pueden proporcionar con al menos ciertos de los atributos "funcionales" deseados a través del cambio de isotipos . Los anticuerpos biológicamente activos que se unen a IL-13 de preferencia se utilizan en una preparación o formulación farmacéutica estéril para reducir la actividad de la IL-13. Los anticuerpos anti-IL-13 de preferencia poseen una afinidad adecuada para suprimir potencialmente la actividad IL-13 dentro de la variación terapéutica blanco. La supresión de preferencia resulta de la capacidad del anticuerpo para interferir con la unión de IL-13 a un receptor de señalización, tal como por ejemplo, IL-13Ral (también conocido como, IL-13 Ral, Ral, IL-13R alfa 1, receptor alfa 1 de IL-13, u otros términos similares) . En otras modalidades el anticuerpo puede suprimir la actividad de IL-13 al interferir con la capacidad de IL-13 para la señalización a través del receptor, incluso si es capaz de unirse. Por ejemplo, el anticuerpo puede prevenir la interacción de la IL-13Ral con un co-receptor que sea necesario para la señalización, tal como por ejemplo, la cadena alfa del receptor IL-4. En algunas modalidades, el anticuerpo es capaz de prevenir la actividad de IL-13 a través de un receptor de señalización mientras que permita la unión de IL-13 a un receptor simulado, tal como por ejemplo, IL-13Ra2. En este caso, la unión al receptor simulado puede permitir el aclaramiento de la IL-13 unida y mejora la capacidad del anticuerpo para suprimir la actividad de IL-13. Cuando se utiliza para la administración m vivo, la formulación del anticuerpo de preferencia es estéril. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estéril. El anticuerpo normalmente se almacenará en forma liofilizada o en solución. La filtración estéril se puede realizar antes o después de la liofílizacion y reconstitución. Las composiciones del anticuerpo terapéutico en general se colocan en un recipiente que tenga un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa con solución intravenosa o vial que tenga un adaptador que permita la recuperación de la formulación, tal como por ejemplo, un obturador perforable mediante una aguja para inyección hipodérmica . La modalidad de la administración del anticuerpo está de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión mediante vías subcutáneas, intravenosas, mtrapeptoneales, mtracerebrales, intradérmicas, intramusculares, intraoculares, intrarteriales, intratraqueales, o intralesionales, o mediante inhalación o mediante sistemas de liberación sostenida como se observará más adelante. En algunas situaciones, el anticuerpo de preferencia se administra mediante infusión o mediante inyección en bolo. En otras situaciones, una composición terapéutica que comprende el anticuerpo se puede administrar a través de la nariz o pulmón, de preferencia como un líquido o aerosol en polvo (liofilizado). La composición también se puede administrar intravenosa, parenteral o subcutáneamente según se desee. Cuando se administra sistémicamente, la composición terapéutica debe ser estéril, libre de pirógenos y en una solución parenteralmente aceptable que haya considerado el pH, isotonicidad y estabilidad. Estas condiciones son conocidas por aquellos con experiencia en la técnica . Los anticuerpos para uso terapéutico, como se describe en la presente, se preparan típicamente con portadores, excipientes, u otros agentes adecuados que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una transferencia, suministro, tolerancia, y lo semejante mejorados. En resumen, las formulaciones de dosificación de los anticuerpos descritos en la presente se preparan para almacenamiento o administración al mezclar el anticuerpo que tenga el grado deseado de pureza con uno o más portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables. Estas formulaciones pueden incluir, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contengan lípidos (catiónicos o aniónicos) (tal como por ejemplo, LipofectinMR) , conjugados de ADN, pastas anhidras para absorción, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, carbocera (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbocera. La formulación pueden incluir soluciones tampón tales como por ejemplo, TRIS HCl, fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácido orgánico; antioxidantes tales como por ejemplo, ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (menor a aproximadamente 10 residuos) tales como por ejemplo, poliarginina, proteínas, tales como por ejemplo, albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como por ejemplo, polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como por ejemplo, glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos entre los que se incluyen celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa, o dextrina; agentes quelantes tales como por ejemplo, EDTA; alcoholes de azúcar tales como por ejemplo, manitol o sorbitol, contraiones tales como por ejemplo, sodio y/o surfactantes no iónicos tales como por ejemplo, TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol.

Otros portadores, excipientes y estabilizantes aceptables son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser adecuada en el tratamiento y terapias de acuerdo con la presente invención, con la condición de que el ingrediente activo en la formulación no se inactive por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también , Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul . Toxicol . Pharmacol . 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophihzation and development of solid protein pharmaceuticals". In t . J. Pharm . 203 (1-2) : 1-60 (2000) , Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts". J. Pharm . Sci . 89(8): 967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excrpients for parenteral formulations" PDA J. Pharm . Sci Technol . 52:238-311 (1998) y las citas en las mismas para información adicional . Las composiciones estériles para inyección se pueden formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional según se describe en Remington : The Science and Practi ce of Pharmacy (20a ed, Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003)). Por ejemplo, la disolución o suspensión del compuesto activo en un vehículo tal como por ejemplo, agua o aceite vegetal que se presenta en la naturaleza similar a aceite de ajonjolí, cacahuete, o de semilla de algodón o un vehículo graso sintético similar a oleato de etilo o lo semejante pueden ser convenientes. De acuerdo con la práctica farmacéutica aceptada, se pueden incorporar soluciones tampón, conservadores y antioxidantes y lo semejante . Los anticuerpos también se pueden administrar y liberar a través del tiempo a partir de preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen, matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contengan el polipéptido. Las matrices pueden estar en la forma de artículos, películas o microcápsulas formados. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) como se describe por: Langer et al . , J. Biomed Ma ter Res . , (1981) 15:167-277 and Langer, Chem . Tech . , (1982) 12:98-105, o poli (vinilalcohol) ) , poliláctidos (patente de los Estados Unidos No. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al , Biopolymers, (1983) 22:547-556), acetato etilen-vinílico no degradable (Langer et a l . , supra ) , copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradable tal como por ejemplo, el LUPRON DepotMR (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico (EP 133, 988) . Mientras que polímeros tales como por ejemplo, acetato etilen-vinílico y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante un tiempo mayor de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un tiempo mayor, las mismas se desnaturalizan o se agregan como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, dando por resultado en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden prever estrategias racionales para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre un mecanismo de agregación para que sea la formación del enlace S-S intermolecular a través de intercambio de disulfuro, la estabilización se puede alcanzar al modificar los residuos de sulfidrilo, liofilizar a partir de soluciones acidas, controlar el contenido de humedad, utilizar aditivos adecuados y desarrollar composiciones de matriz polimérica específicas . Las composiciones de liberación sostenidas también incluyen preparaciones de cristales del anticuerpo suspendido en formulaciones adecuadas capaces de mantener los cristales en suspensión. Estas preparaciones cuando se inyectan subcutánea o intraperitonealmente pueden producir un efecto de liberación sostenida. Otras composiciones también incluyen anticuerpos atrapados liposomalmente . Los liposomas que contienen estos anticuerpos se preparan mediante los métodos conocidos per se : patente de los Estados Unidos No.

DE 3,218,121; Epstein et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA (1985) 82:3688-3692; Hwang et a l . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046, EP 143,949; 142,641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes de los Estados Unidos Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. La dosificación de la formulación de anticuerpos para un paciente determinado se puede determinar mediante el médico que está atendiendo. Para determinar la dosificación adecuada, el médico puede tomar en consideración diversos factores conocidos para modificar la acción de la terapéutica, incluyendo, por ejemplo, la gravedad y tipo de enfermedad, peso corporal, sexo, dieta, tiempo y vía de administración, otros medicaciones y otros factores clínicos relevantes. Las dosificaciones terapéuticamente eficaces se pueden determinar mediante métodos ya sea in vi tro o in vivo . Una cantidad eficaz de los anticuerpos, descritos en la presente, que se empleará terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración, y la condición del paciente. Por consiguiente, se prefiere que el terapista valore la dosificación y modifique la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 0.001 mg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Típicamente, el médico administrará el anticuerpo terapéutico hasta que se alcance una dosificación que logre el efecto deseado. El progreso de esta terapia se supervisa fácilmente mediante análisis convencionales. Se espera que los anticuerpos descritos en la presente tengan un efecto terapéutico en el tratamiento de los síntomas y condiciones que resultan o están relacionados con la actividad de la IL-13 Una forma en que se pueda determinar la dosis real administrada (o utilizada en un equipo) o verificada es a través de la identificación y utilización de biomarcadores dependientes de IL-13. Estos biomarcadores se destacan en los ejemplos más adelante y las Figuras 23-28, ya que son métodos para identificar los biomarcadores y su utilización. Los ejemplos de biomarcadores relevantes incluyen CÍO, eotaxina, y TARC. En general, para identificar un biomarcador, se puede medir la cantidad del biomarcador candidato en un sujeto que tenga un estado sano y/o trastornado por IL-13 (por ejemplo, asma inducida por OVA) , y comparar el nivel del biomarcador en el sujeto con el nivel del biomarcador cuando se administre uno de los anticuerpos eficaces al sujeto (por ejemplo, mAb 623, 731, etc.). A medida que la administración del anticuerpo pueda bloquear la actividad de IL-13, el nivel del biomarcador candidato también debe declinar (suponiendo que sea un biomarcador real) debido a la administración del anticuerpo al sujeto. El biomarcador, y/o un método para probarlo, se puede utilizar en una variedad de formas. Por ejemplo, el nivel del biomarcador en un sujeto se puede seguir a través del tratamiento de un sujeto con un anticuerpo, u otro método terapéutico o composición con un efecto similar, para permitir que se rastree la eficacia del tratamiento. Se puede determinar la cantidad del biomarcador presente en el sujeto inicialmente y determinar cualquier cambio en el momento de la adición del anticuerpo. Si el nivel del biomarcador no cambia en el momento de la administración inicial del anticuerpo, se puede aplicar un anticuerpo adicional al sujeto, aplicado con mayor frecuencia, o mediante una vía alternativa. Alguien con experiencia en la técnica apreciará que el nivel del biomarcador se puede determinar en una variedad de formas y no deberá limitar indebidamente la técnica. Se puede utilizar cualquier técnica que pueda determinar la cantidad de una proteína (o ARNm, etc.), por ejemplo, ELISA, o técnicas BiacoreMR.

Adicionalmente, en algunas modalidades, se pueden seguir simultáneamente biomarcadores múltiples. Esto puede permitir más certeza con respecto al aspecto relacionado con IL-13 que será supervisado. Por supuesto, en algunas modalidades, los biomarcadores simplemente se utilizan para seguir la progresión del trastorno, sin la variable adicional de supervisar el tratamiento. Adicionalmente, el nivel del biomarcador en un sujeto se puede utilizar para determinar si el sujeto tiene un trastorno relacionado con IL-13. Los sujetos con niveles de biomarcador que sean significativamente superiores o inferiores a un nivel estándar de variación para un individuo o individuos sanos se podría considerar que padece de un trastorno relacionado con IL-13 El biomarcador, o un método para probarlo, se pueden incluir en un equipo para tratamiento de un trastorno relacionado con IL-13. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, mientras que la presente analiza ampliamente las condiciones o trastornos que implican cantidades excesivas de IL-13, las composiciones y métodos también se podrían aplicar a situaciones en las cuales el nivel eficaz de IL-13 es demasiado bajo. Por ejemplo, los anticuerpos no tienen que evitar la unión de IL-13 a su receptor normal y en su lugar pueden evitar la unión de IL-13 a su receptor simulado, aumentando con esto eficazmente la cantidad de IL-13 disponible en el sistema. Sin embargo, en muchas modalidades, los anticuerpos al menos evitarán que la IL-13 se una al receptor de señalización.

Diseño y generación de otra terapéutica De acuerdo con la presente invención y con base en la actividad de los anticuerpos que se producen y caracterizan en la presente con respecto a la IL-13, para tratar enfermedades específicas se puede emplear la terapéutica avanzada de anticuerpos. Estas terapéuticas avanzadas pueden incluir anticuerpos biespecíficos, inmunotoxinas, terapéutica radiomarcada, terapéutica de péptidos, terapias génicas, en particular intracuerpos, terapéutica antisentido y pequeñas moléculas. Junto con la generación de la terapéutica avanzada de anticuerpos, en donde la fijación complementaria es un atributo conveniente, puede ser posible eludir la dependencia sobre el complemento para el extermino de células a través de la utilización de biespecíficos, inmunotoxinas o radiomarcas, por ejemplo. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos biespecíficos que comprenden (i) dos anticuerpos, uno con una especificidad para IL-13 y otro para una segunda molécula, que se conjuga conjuntamente, (ii) un anticuerpo individual que tenga una cadena específica para IL-13 y una segunda cadena específica para una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo de cadena individual que tenga especificidad tanto para IL-13 como para la otra molécula. Estos anticuerpos biespecíficos se puede generar utilizando técnicas que son bien conocidas, por ejemplo, junto con (i) y (ii) véase, por ej emplo, Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) and Wright and Harris, supra . y junto con (iii) véase por ej emplo, Traunecker et al Int. J. Cáncer (Suppl . ) 7:51-52 (1992) . En cada caso, se puede realizar según se desee la segunda especificidad. Por ejemplo, la segunda especificidad se puede realizar para los receptores de activación de cadena pesada, incluyendo, de manera enunciativa: CD16 o CD64 ( véase por ej emplo, Deo et al., 18:127 (1997)) o CD89 (véase por ejemplo, Valerius et al., Blood 90:4485-4492 de (1997)). En algunas modalidades, se proporciona un artículo de fabricación que comprende un recipiente, que comprende una composición que contiene un anticuerpo anti-IL-13, y un inserto o etiqueta en el envase que indica que la composición se puede utilizar para tratar una enfermedad provocada por IL-13. De preferencia, un mamífero y, de mayor preferencia, un ser humano, recibe el anticuerpo anti-IL-13 en modalidades preferidas, la enfermedad que será tratada se selecciona del grupo que consiste de asma; incluyendo asma bronquial tanto alérgica (atópico) como no alérgica (no atópica), bronquitis crónica, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , fiebre del heno, rinitis, urticaria, angioedema, dermatitis alérgica, incluyendo dermatitis por contacto, síndrome de Stevens-Johnson, choque anafiláctico, alergias por alimentos, queratitis, conjuntivitis, síndrome nefrítico resistente a esteroides, mastocitosis, enfermedad fibrótica tal como por ejemplo, fibrosis pulmonar, incluyendo fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, fibrosis inducida por bleomicina, fibrosis hepática y esclerosis sistémica, cánceres, tales como por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, trastornos proliferativos de linfocitos B, tales como por ejemplo, linfoma de linfocitos B, en particular linfoma de linfocitos B grandes mediastínicos, leucemias por linfocitos B, carcinoma ovárico, enfermedades caracterizadas por la proliferación de linfocitos B no malignos, tales como por ejemplo, lupus eritematosos sistémico, artritis reumatoide, hepatitis activa crónica y crioglobulinemias, altos niveles de auto-anticuerpos, tales como por ejemplo, anemia hemolítica, trombocitopenia, síndrome por fosfolípidos y pénfigo, enfermedad inflamatoria del intestino y enfermedad de injerto contra hospedero. En algunas modalidades, se utiliza un anticuerpo anti-IL-13 para tratar el asma. En una modalidad particular, el anticuerpo es el anticuerpo 623 o variantes del mismo descritos en la presente. En otra modalidad particular el anticuerpo es el anticuerpo 731 o variantes del mismo descritos en la presente. Los ejemplos específicos de cómo estos anticuerpos se pueden utilizar para tratar el asma y otros trastornos se describen enseguida en los ejemplos.

EJEMPLOS Se proporcionan los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos conducidos y los resultados alcanzados para fines ilustrativos únicamente y no se deben interpretar como limitantes de las enseñanzas en la presente.

EJEMPLO 1: GENERACIÓN DE ANTICUERPOS Preparación de la IL-13 y el antigeno de IL-13 En los experimentos descritos enseguida se utilizaron los siguientes péptidos IL-13.

IL-13 humana recombinante (R&D 213-IL-005 ; SEQ ID NO : 61) : GPVPPSTA RELIEELVN1TQNQ- APLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIF.KT QRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFV DLLi K LFREGQFN IL-13 humana recombinante (Peprotech 200-13A; SEQ ID NO : 62) : SPGPVPPSTALRELIEEL\^pTQNQKAPLCNGSMV SlNLTAGMYCAALES lNVSGCSAIE KTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTK1EVAQFVKDLLLHL K FREGRFN IL-13 humana recombinante (Peprotech 200-13A; SEQ ID NO : 63) : MSPGPVPPSTALREL1EELVNTTQNQ . PLCNGSMVWS1NLTAGMYCAALESLINVSGCSAI EKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDT1 1EVAQFV DLLLHL KLFREGQFN Proteina humana de fusión Fc con IL-13-humana (con la secuencia lider SEQ ID NO: 64) : MALLLTTV1ALTCLGGFASPGPVPPSTALREIJEELVN1TQNQKAPLCNGSMVWSINLTAG YCAALESL1NVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVK.DLLLHLK K .FREGRFNEPKSCD THTCPPCPAPELLGGPSVFL.FPP P D?LMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHN.AXTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK .? PAPIEKTISKAKG PREPQVY-GLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPE NNYK'? PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGM SCSVMHEALHNFTH'QKSLSLSPGK Proteina humana de fusión Fc con IL-13-conejo (con la secuencia lider SEQ ID NO : 65) : MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNlTQNQ- APLCNGS-vfVWSINLTAGM YCA?LESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLK KLFREGRFNRYLDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVF1FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQDDPEVQFTWYI NEQVRTARPPLREQQFNSTrRWSTLPlAHQDWLRG EFKCKVHNKA 0 LPAPIEKTISKARGQPEEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAED NYKTTPAVLDSDGSWLYNKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQ SISRSPGK Hélice A humana de IL-13 con IL-13-ratón (subrayado ; SEQ ID NO : 66) HPI 1.NP- .) I Al -Gl .M ALLÍ .ITVI ALTCLGGFASPGPVPRSVSLPLTLKEL1EELVNITONO A PLCNGS VWSÍNITAGMYCA?LESLINVSGCSAÍEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRD TKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN 5 Hélice B humana de IL-13 con IL-13-ratón (subrayado ; SEQ ID NO : 67) MHPLLNPLLLALGLMALLLTTV1ALTCLGGFASPGPVPPSTALREL1EELVNITQNQKAPLC NGSMVWSINL GAGGFCVALÜSLTNVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGOFSSLHVRDTK! EVAQFVKDLLLHL KLFREGQFN Hélice C humana de IL-13 con IL-13-ratón (subrayado; SEQ ID NO: 68) o MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALREL?EELVNITQNQKAPLC NGSNÍVWSINLTAGMYCAALESLIN GCSAIYRTQRILHGLCPHKVSAGQFSSLHVR T I EVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN Hélice D de humana de IL-13 con IL-13-ratón ( s ibrayado ; SEQ ID NO : 69) MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLC NGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKI EVAHFITKLLSYTKOLFRHGOQFN 5 Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, únicamente un subconjunto de los residuos anteriores realmente puede estar implicado en la formación de un epítope. Por ejemplo, en las SEQ ID NO: 66-69 anteriores, los epítopes pueden realmente pueden ser la porción de hélice de cada péptido (la sección subrayada) . En una modalidad, los anticuerpos descritos en la presente se dirigen a cualquiera de los epítopes IL-13 o fragmentos de los mismos, incluyendo la porción de hélice de cada péptido.

Inmunización de animales Los anticuerpos monoclonales contra IL-13 se desarrollaron al inmunizar ratones XenoMouse® (XenoMouse® XMG2L3 y XenoMouse® XMG2, Abgenix, Inc. Fremont, CA) . La proteína humana de fusión Fc con IL-13-humana (SEQ ID NO: 64) o la proteína de fusión humana Fc con IL-13-conejo (SEQ ID NO: 65) se utilizó como el inmunógeno para la generación de anticuerpos. Cada ratón se inmunizó vía la planta de la pasta como ruta de administración. Los animales se inmunizaron en los días 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21 y 25. La inmunización inicial se realizó con 10 µg de antígeno en CpG/Alum por ratón. Se administraron refuerzos posteriores con 5 µg de antígeno en CpG/alum por ratón. El refuerzo final en el día 25 se realizó con 5 µg de antígeno en PBS sin adyuvante por ratón. Los animales se hicieron sangrar en el día 20 para obtener los sueros para la determinación de la valoración como se describe enseguida.

Análisis de valoración La valoración se determinó utilizando un protocolo estándar. En resumen, placas Costar 3368, se recubrieron con ya sea la proteína de fusión con Fc de IL-13 conejo (SEQ ID NO: 65) o el anticuerpo de conejo de longitud total durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron utilizando Titertek Program ADG9, se secaron, y se bloquearon con 250 µl, 1% de leche descremada/lXPBS . Después del bloqueo, las placas se lavaron nuevamente utilizando Titertek Program ADG9, y se secaron. Los sueros que serán probados se valoraron verticalmente 1:2 por duplicado a partir de una dilución inicial 1:100. Las muestras se corrieron en 1% de leche descremada/lx PBS a 50 µl/cavidad y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, utilizando Titertek Program ADG9, y el secado, las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo Fc anti-humano de conejo secundario conjugado con POD (dilución de 1:8000; 50 µl/cavidad) con reactividad cruzada mínima para Fc de conejo en 1% de leche descremada/lxPBS . Las placas luego se lavaron a un tiempo final, utilizando Titertek Program ADG9, y se secaron. Se agregó una solución TMB en un solo paso con el sustrato POD (50 µl/cavidad) y se dejó desarrollar durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 1 N HCL (50 µl/cavidad) y la densidad óptica se leyó inmediatamente con un lector de placas Titertek. Tres animales con altas valoraciones para el inmunógeno IL-13, como se muestra en la Tabla 2, se seleccionaron para la recolección.

Tabla 2 Clasificación primaria Se recolectaron animales hiper-inmunes y se aislaron los linfocitos B CD19+ para un posterior cultivo de linfocitos B. Se indujeron a las células para que proliferaran y se diferenciaran terminalmente en células plasmáticas. Se clasificaron los sobrenadantes provenientes de estas células plasmáticas mediante ELISA para identificar las cavidades primarias que contuvieron los anticuerpos anti- IL-13-específicos . Los cultivos se corrieron comúnmente con 50 a 500 linfocitos B CD19+ por cavidad para permitir la identificación de los cultivos de linfocitos B antígeno-específieos monoclonales. En resumen, IL-13-RbFc se recubrió sobre placas de 96 cavidades Costar 3368 a 1 µg/ml durante la noche. Cada placa se lavó 5 veces con dH20 y se agregaron a la placa 40 µl de leche al 1% en PBS. Posteriormente, a cada cavidad se agregaron 10 µl del sobrenadante de linfocitos B. Después de una hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron nuevamente 5 veces con dH20. A cada cavidad se agregaron 50 µl del Fc-HRP anti-humano de conejo con un mínimo de reactividad cruzada anti-conejo (Jackson Laboratories; dilución de 1:8000). Después de 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron nuevamente 5 veces con dH20 y a cada cavidad se agregaron 50 µl de sustrato TMB (Neogen) . La reacción se detuvo después de 30 minutos mediante la adición de 50 µl de ácido clorhídrico 1 N a cada cavidad y las placas se diluyeron a una longitud de onda de 450 nm. Los datos representativos resultantes de la clasificación primaria se muestran enseguida en la Tabla 3. Las cavidades positivas se identificaron como aquellas que se encontraron para tener una señal de al menos tres veces la de una cavidad control. En la clasificación primaria se identificaron un total de 968 cavidades de linfocitos B antígeno-específicos positivo. Todas estas cavidades se tomaron para clasificación en un análisis funcional, como se describe enseguida.

Tabla 3 Análisis para la producción de eotaxina inducida por IL-13 Todas las cavidades positivas mediante 968 ELISA se clasificaron dos veces en un análisis para liberación de eotaxina-1 inducida por IL-13. El análisis se realizó de tal forma que sólo las cavidades que contenían una alta concentración de anticuerpos o las cavidades que contenían un anticuerpo de alta afinidad se identificaron como neutralizantes. Se identificó un total de 78 anticuerpos neutralizantes como la neutralización en este análisis. Los datos específicos provenientes de varias cavidades de interés también se muestran para fines ilustrativos en la Tabla 4. Para el análisis, la mitad del área de las placas de análisis con 96 cavidades se sembraron con 4000 células/cavidad en 50 µl en medio HDFa suplementado con suplemento para crecimiento con bajo contenido sérico (Cascade) . Las placas entonces se incubaron durante la noche a 37 °C en C02 al 5%. En una placa por separado se prorrateo el control negativo o control positivo de 12.5 µl del anticuerpo muestra en placas para análisis de 96 cavidades estéril. Se prepararon aproximadamente 600 pM de IL-13 en medio 106 (4X concentración final) y se prepararon aproximadamente 100 ng/ml de TNF-alfa en medio 106 (2X concentración final). Para iniciar el análisis, se agregaron 12.5 µl de IL-13 o medio solo a cada cavidad y se dejó incubar a 37°C en C02 al 5% durante 1 hora. Después de la incubación de 1 hora, la mitad de las células HDFa se retiró cuidadosamente utilizando una pipeta con canales múltiples. Se agregaron 25 µl de TNF-alfa a cada cavidad. Se transfirieron 25 µl de la muestra/IL-13 a las cavidades HDFa/TNF-alfa y las células se incubaron a 37 °C en C02 al 5% durante 48 horas. Después de las 48 horas de incubación, se recolectó el sobrenadante proveniente de las cavidades para análisis HFDa en el fondo de la placa de VEE de 96 cavidades. Las muestras se sometieron a centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos . 30 µl de la muestra se analizaron para la liberación de eotaxina-1 en un equipo para análisis (R&D systems) de acuerdo con un protocolo estándar con las siguientes modificaciones. (1) 50 µl de Capture Ab se recubrió a 2 µg/ml; (2) se utilizaron 50 µl de la muestra o estándar (30 µl de la muestra + 20 µl del medio para un volumen final de 50 µl) ; (3) se utilizaron 50 µl del Ab para detección a 0.1 µg/ml; (4) se utilizaron 50 µl de estreptavidina-HRP a 0.5 µg/ml; y (5) se utilizaron 50 µl de solución del sustrato.

Tabla 4 Análisis con alto contenido de antigenos (HA) de las cavidades para cultivo de linfocitos B especificos con anti-IL-13 Utilizando un método de ELISA, se normalizaron los sobrenadantes para la concentración del anticuerpo antígeno-específico. Utilizando un anticuerpo anti-blanco (IL-13) de concentración conocida valorada en paralelo, se generó una curva estándar y la cantidad del anticuerpo antígeno-específico en el sobrenadante se comparó con el estándar y su concentración determinada, véase la siguiente Tabla 5.

Tabla 5 La cantidad del anticuerpo antígeno-específico en cada cavidad se cuantificó y se gráfico contra los datos de neutralización para cada cavidad para identificar las cavidades con mayor potencia (Figura 1) . Las cavidades que contuvieron los anticuerpos con mayor potencia son aquellas con la mejor inhibición con la menor concentración del anticuerpo (cuadrante izquierdo superior de la gráfica) .

Análisis del antigeno limitante (LA) de las cavidades para cultivo de linfocitos B especificos para anti-IL-13 El análisis antigénico limitado es un método que ordena la afinidad de los anticuerpos antígeno-específieos preparados en los sobrenadantes de cultivo de linfocitos B con relación a la totalidad de otros anticuerpos antígeno-específicos. En presencia de un recubrimiento muy bajo de antígenos, únicamente los anticuerpos con mayor afinidad deben ser capaces de unirse a cualquier nivel detectable en equilibrio. ( Véase , por ej emplo, la publicación del PCT WO 03/048730 A2) . Aquí, la IL-13 biotinilada se unió a placas de estreptavidina a cuatro concentraciones (250 ng/ml; 125 ng/ml; 62 ng/ml; y 31 ng/ml) durante 1 hora a la temperatura ambiente en placas para cultivo de 96 cavidades. Cada placa se lavó 5 veces con dH20 y a la placa se agregaron 45 µl de leche al 1% en PBS con 0.05% de azida de sodio. Esto se siguió por la adición de 5 µl del sobrenadante de lifocitos B a cada cavidad. Después de 18 horas a temperatura ambiente en un agitador, las placas se lavaron nuevamente 5 veces con dH20. A cada placa se agregaron 50 µl (Fc)-HRP anti-humano de Gt a 1 µg/ml. Después de 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron nuevamente 5 veces con dH20 y a cada cavidad se agregaron 50 µl de sustrato TMB. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 µl de ácido fosfórico 1 M a cada cavidad y las placas se leyeron a una longitud de onda de 450 nm. Sin embargo, varias de las cavidades que incluyen 2388A10 y 2357G11 fueron claramente superiores según se midió mediante OD al recubrimiento menor de antígenos, según se ilustra en la Figura 2. Los resultados presentados en la Figura 2, demuestran la capacidad de los diferentes anticuerpos para unirse a una baja concentración del recubrimiento con antígeno. Los anticuerpos que proporcionan las mayores señales OD tienen la mayor afinidad bajo las condiciones de este análisis. Los clones restantes se analizaron adicionalmente al combinar los datos con alto contenido antigénico los cuales midieron la concentración específica de anticuerpos y la producción limitada de antígenos. De esta forma fue posible comparar la afinidad de los anticuerpos a diferentes concentraciones en los sobrenadantes de cultivo de linfocitos B. Las cavidades que contuvieron los anticuerpos de mayor afinidad son aquellas con el mayor ELISA OD en el contexto de menor concentración del anticuerpo Ag-específico . Con base en todos los datos de clasificación, las cavidades listadas en la Tabla 6 se identificaron para análisis adicional (análisis de placas y micromanipulación, PCR celular individual y expresión recombinante) . Cinco cavidades se seleccionaron con base en la potencia (inhibición/Ab específico total) : 2372B8, 2383H5, 2398C5, 2401G12 y 2413G11. Se seleccionaron tres cavidades con base en la afinidad e inhibición: 2357G11, 2361G5 y 2384G12, y se seleccionaron dos cavidades con base en los datos de neutralización solos: 2388A10 y 2407G11.

Tabla 6 Análisis de placas hemoliticas IL-13-especificas Se aislaron células que secretan los anticuerpos IL-13-específicos de interés utilizando un análisis de placas hemolíticas IL-13 específicas, en general como se describe en Babcook et al., ( Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 93:7843-7848 (1996)). Las células que se aislaron se identificaron en la próxima Tabla 7.

Biotinilación de glóbulos rojos de oveja (SRBC) Los SRBC se almacenaron en medio RPMI como una concentración al 25%. Se obtuvo un sedimento celular envasado de 250 µl de SRBC mediante el prorrateo de 1.0 ml del concentrado en un tubo eppendorf, con centrifugación inferior de las células (giro de pulso a 8000 rpm (6800 ref) en una microcentrífuga) y eliminando el sobrenadante. Las células entonces se lavaron dos veces con 1 ml de PBS pH 8.6. El sedimento celular luego se volvió a suspender en 4.75 ml de PBS a pH 8.6 en un tubo de 15 ml . En un tubo de 50 ml por separado, se agregaron 2.5 mg de sulfo-NHS biotina a 45 ml de PBS a pH 8.6. Una vez que la biotina se había disuelto completamente, se agregaron los 5 ml de SRBC y el tubo se hizo girar a temperatura ambiente durante 1 hora. Los SRBC se sometieron a centrifugación a 3000 g durante 5 minutos, el sobrenadante se extrajo y los SRBC se volvieron a suspender en 1 ml de PBS a pH 7.4 , en un tubo Eppendorf. Los SRBC se lavaron 3 veces con 1 ml de PBS a pH 7.4. Los SRBC luego se volvieron a suspender en 4.75 ml de medio inmunocelular (RPMI 1640 con 10% de FCS) en un tubo de 15 ml (concentración de B- SRBC al 5S La concentración se almacenó a 4°C hasta que se necesitó .

Recubrimiento de B-SRBC con estraptavidina (SA) 1 ml del concentrado de B-SRBC al 5% se transfirió en un tubo eppendorf recién preparado. Los B-SRBC se sedimentaron, el sobrenadante se extrajo, el sedimento se volvió a suspender en 1.0 ml de PBS a pH 7.4 , y se repitió la centrifugación. El ciclo de lavado se repitió 2 veces, y luego el sedimento de B-SRBC se volvió a suspender en 1.0 ml de PBS a pH 7.4 para proporcionar una concentración final del 5% (v/v) . Se agregaron 10 µl de una solución madre de 10 mg/ml de estreptavidina (CalBiochem, San Diego, CA) y el tubo se sometió a mezclado y se hizo girar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Los pasos de lavado se repitieron y el SA-SRBC se volvió a suspender en 1 ml de PBS a pH 7. (5% (v/v) ) .

Recubrimiento de SA-SRBC con IL-13 humana El SA-SRBC se recubrió con la fusión de IL-13-RbFc humana fotobiotinilada a 100 µg/ml, luego se mezcló y se hizo girar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Los SRBC se lavaron dos veces con 1.0 ml de PBS a pH 7.4 como el anterior. Los SRBC recubiertos con IL-13 se volvieron a suspender en RPMI ( +10% FCS) a una concentración final de 5% (v/v) Determinación de la calidad de IL-13-SRBC mediante Inmunofluorescencia (IF) Aproximadamente 10 µl del SA-SRBC al 5% y 10 µl del SRBC recubierto con IL-13 al 5% cada uno se agregaron a un tubo eppendorf de 1.5 ml fresco por separado que contenía 40 µl de PBS. A cada muestra de SRBC a 45 µg/ml se agregó un anticuerpo anti-IL-13 humano control. Los tubos se hicieron girar a temperatura ambiente durante 20 minutos, y las células luego se lavaron tres veces con 100 µl de PBS. Las células se volvieron a suspender en 50 µl de PBS y se incubaron con 20 µg/ml del anticuerpo IgG Fc Gt-antihumano conjugado para Alexa488 (Molecular Probes, Eugene, OR) . Los tubos se hicieron girar a temperatura ambiente durante 20 minutos, y luego se lavaron con 100 µl de PBS y las células se volvieron a suspender en 10 µl de PBS. 10 µl de las células teñidas se marcaron sobre un portaobjetos de vidrio limpio para microscopio, cubierto con un cubreobjetos de vidrio, observado bajo luz fluorescente, y marcado a una escala arbitraría de 0-4.

Preparación de células plasmáticas Se recolectaron los contenidos de una cavidad para cultivo de linfocitos B individual identificado anteriormente por los diversos análisis descritos anteriormente que contenían un clon de linfocitos B que secreta la inmunoglobulina de interés. Utilizando una pipetteman de 100-1000 µl, se recuperaron los contenidos de la cavidad al agregar 37C RPMI ( +10% FCS) . Las células se volvieron a suspender mediante pipeteo y luego se transfirieron a un tubo Eppendorf de 1.5 ml fresco (volumen final aproximadamente 700-1000 µl) . Las células se sometieron a centrifugación en una microcentrífuga a 2500 rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente. El tubo luego se hizo girar 180 grados y giró nuevamente durante 1 minuto a 2500 rpm. El medio congelado se extrajo y las células inmunes se volvieron a suspender en 100 µl RPMI (10% FCS), luego se sometieron a centrifugación. Este lavado con RPMI ( +10% FCS) se repitió y las células se volvieron a suspender en 75 µl RPMI (+10% FCS) y se almacenaron sobre hielo hasta que estuvieron listas para utilizarse .

Análisis en placa A una muestra de células de 75 µl, se agregaron 75 µl cada uno de una concentración de SRBC recubierto con IL-13 (5% (v/v) , diluido según lo necesario si el tamiz para SRBC fue muy viscoso) , una concentración de complemento de cobayo 4x (Sigma, Oakville, ON) se preparó en RPMI ( +10% FCS), y la concentración sérica mejorada 4x (1:900 en RPMI (+10% FCS)). La mezcla (3-5 µl) se marcó sobre tapas para la placa TC (BD Biosciences, San José, CA) y las marcas se recubrieron con aceite de parafina sin diluir. Los portaobjetos se incubaron a 37 °C durante un mínimo de 1 hora.

Tabla 7 Clonación y expresión Después del aislamiento de células plasmáticas individuales, el ARNm se extrajo y se condujo PCR en transcriptasa inversa para generar el ADNc que codifica para las cadenas pesada y ligera variables del anticuerpo secretado por cada célula. La región de cadena pesada variable humana se clonó en un vector de expresión IgG2. Este vector se generó al clonar el dominio constante del IgG2 humano en el sitio de clonación múltiple de ADNpc 3.1+/Hygro (Invitrogen, Burlington, ON) . La región de cadena ligera variable humana se clonó en un vector de expresión IgK o IgL. Estos vectores se generaron mediante la clonación del dominio constante de IgK humano o IgL humano en el sitio de clonación múltiple de ADNpc 3.1+/Neo (Invitrogen, Burlington, ON) . Los vectores de expresión de cadena pesada y cadena ligera luego se co-transfectaron utilizando lipofectamina en un disco de 60 milímetros de 293 células de riñon embrional humano (HEK, por sus siglas en inglés) confluente al 70%. Las células transfectadas secretaron un anticuerpo recombinante con la especificidad idéntica como la célula plasmática original durante 24-72 horas. Se recolectaron 3 ml del sobrenadante a partir de las células HEK 293 y se demostró la secreción de un anticuerpo intacto con un emparedado ELISA para detectar específicamente el IgG humano. La especificidad se confirmó a través de la unión del anticuerpo recombinante a IL-13 utilizando ELISA. Las pruebas ELISA por secreción se realizaron como sigue. Las placas control se recubrieron con 2 mg/ml de IgG H+L anti-humano de cabra durante la noche al igual que para las placas de unión, IL-13 se recubrió sobre placas de 96 cavidades Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene y se mantuvo durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron 5 veces con dH20. Los anticuerpos recombinantes se valoraron 1:2 para 7 cavidades a partir del sobrenadante de lipofección sin diluir. Las placas se lavaron cinco veces con dH20. Se agregó un anticuerpo conjugado con HRP Fc-específico IgG anti-humano de cabra a una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a temperatura ambiente para la secreción y los dos análisis de unión. Las placas se lavaron cinco veces con dH20. Las placas se desarrollaron con la adición de TMB durante 30 minutos y el ELISA se detuvo mediante la adición de acido fosfórico 1 M. Cada placa ELISA se analizo para determinar la densidad óptica de cada placa a 450 nm.

Purificación de los anticuerpos anti-IL-13 recombinantes Para una producción a gran escala, los vectores de expresión de cadena pesada y ligera (2.5 µg de cada cadena/disco) se lipofectaron en células HEK293 en diez discos de 100 mm que fueron confluentes al 70%. Las células transfectadas se incubaron a 37°C durante 4 días, en este tiempo se recolectó el sobrenadante (6 ml) y se reemplazó con 6 ml de medio recién preparado. En el día 7, el sobrenadante se retiró y se reunió con la recolección inicial (120 ml total de 10 placas) . Cada anticuerpo se purificó a partir del sobrenadante utilizando cromatografía de afinidad (1 ml) con proteína A sefarosa (Amersham Biosciences, PiscataWay, NJ) . Los anticuerpos se eluyeron a partir de la columna de proteína-A con 500 ml de glicina 0.1 M (pH 2.5) . Los eluatos se dializaron en PBS (pH 7.4) y se esterilizaron en filtros. Los anticuerpos se analizaron mediante SDS-PAGE sin reducción para valorar la pureza y rendimiento. La concentración también se midió mediante análisis UV a OD 280.

EJEMPLO 2 : CARACTERIZACIÓN DEL ANTICUERPO RECOMBINANTE Los anticuerpos recombinantes se analizaron para potencia en el análisis de eotaxina según se describió anteriormente. Los resultados se presentan en la próxima Tabla 8. También se incluyen los IC50 medidos en este análisis para el receptor a2/FC de IL-13 murino y el receptor 2/Fc de IL-13 humano. La Figura 3 muestra la inhibición porcentual de IL-13 inducida por la liberación de eotaxina mediante los anticuerpos recombinantes 643 y 731 en comparación con un control coincidente con isotipos, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal IgG2 irrelevante.

Tabla 8 Afinidad de BiaCore La afinidad para la IL-13 humana (R&D) se investigó mediante un análisis BiaCore para seis de los anticuerpos (602, 623, 643, 693repl, 693rep2 y 7310). En primer lugar, se prepararon dos superficies con el anticuerpo a-humano de cabra a alta densidad sobre una microplaqueta CM5 Biacore utilizando acoplamiento con amina rutinario para la captura de los tres de los mAb a la vez. Todos los mAb se diluyeron a ~5 µg/ml utilizando HBS-P en ejecución con solución tampón que contuvo 100 µg/ml de BSA. Cada mAb purificado se capturó durante un minuto sobre una superficie celular de flujo diferente para cada ciclo de inyección con IL-13 utilizando un instrumento Biacore 2000. IL-13 (R&D) se inyectó utilizando el comando KINJECT a concentraciones de 100.9, 50.4, 25.2, 12.6, 6.30, 3.15, 1.58 y 0.788 nm para los mAb 693, 713 y 731, y 25.2, 12.6, 6.30, 3.15, 1.58, 0.788 y 0.394 nm para los mAb 602, 623, y 643, sobre todas las superficies durante 1.5 minutos, seguidos por una disociación de veinte minutos. Las muestras con IL-13 se prepararon en HBS-P ejecutando con solución tampón que contuvo 100 µg/ml de BSA. Todas las muestras se inyectaron aleatoriamente por duplicado con varios ciclos de captura/solución tampón KINJECT de mAb dispersos para doble referencia . Las superficies con el anticuerpo a-humano de cabra de alta densidad se regeneraron con un pulso de 12 segundos de ácido fosfórico concentrado diluido 1/100 (146 mm, pH 1.5) después de cada ciclo. mAb 693 se ejecutó dos veces debido a que hubo un flujo extra de células disponible sobre el instrumento durante la última serie de experimentos para resolución del medio. Los datos se ajustaron al modelo de interacción 1:1 con un término para transporte másico utilizando CLAMP. Los datos para los seis anticuerpos se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9 Análisis cinético Las mediciones cinéticas de diversos anticuerpos se evaluaron utilizando el método KinExA®. Este método implica la determinación con base en soluciones de las mediciones con afinidad formal en equilibrio. Se acoplaron 100 µg de cada mAb para sefarosa 4B activada por CNBr o perlas de Aziactona. Los grupos activos restantes sobre las perlas se bloquearon según se recomendó por el fabricante. Las perlas luego se bloquearon con 10 mg/ml de BSA en Tris 1 M y se almacenaron en la solución de bloqueo. Para algunos experimentos, el mAb se recubrió por absorción directamente para las perlas PMMA según se recomendó por el fabricante y se bloquearon con 10 mg/ml de BSA en PBS y se almacenaron en la solución de bloqueo. Los experimentos de KinExA se realizaron utilizando un sistema de inmnoanálisis de flujo automático, KinExA 3000, en el cual las perlas acopladas con los mAb relevantes sirvieron como la fase sólida. En resumen, una cantidad constante de la IL-13 natural humana o de mono macaco (10-650 pM) , preparada mediante la purificación y estimulación de las PBMC de acuerdo con protocolos estándar, se incubó con concentraciones de valoración de los mAb anti-h-IL-13 iniciando a 25 nm en la solución tampón muestra (PBS con 0.1% de BSA para reducir la unión específica) . Los complejos de antígenos/anticuerpos se incubaron a temperatura ambiente durante 48 horas hasta 168 horas para permitir que se alcanzara un equilibrio. La mezcla se extrajo a través de las perlas acopladas con anticuerpos correspondientes para acumular el antígeno disgregado. Los volúmenes y velocidades de flujo de la mezcla variaron dependiendo de la señal específica obtenida en cada experimento.

La IL-13 capturada se detectó utilizando solución que contuvo un Ab secundario (ya sea un anti-IL-13 poliolonal o un Ab monoclonal que se une a otro epítope) y el Ig antiespecie conjugado con Cy5 para el anticuerpo secundario en la solución tampón de muestra. En algunos casos, la perla unida a IL-13 se detectó utilizando una mezcla de SA-Cy5 y un anticuerpo biotinilado que se une a un epítope distinto el que se une mediante el Ab inmovilizado en perlas. La concentración, volúmenes, y velocidades de flujo de las soluciones con el anticuerpo secundario variaron para optimizar la proporción de señal a ruido en cada experimento. Las señales de unión se convirtieron en valores relativos como una proporción de control en ausencia de hIL-13. Tres replicados de cada muestra se midieron para la totalidad de experimentos de equilibrio. La constante de disociación de equilibrio (KD) se obtuvo a partir de análisis de regresión no lineal de los datos utilizando un modelo de unión homogénea de un solo sitios contenido dentro del software KinExA. El software calcula el KD y determina el intervalo de confianza del 95% al ajustar los puntos de datos a una curva KD teórica. El intervalo de confianza del 95% se proporciona como KD bajo y KD alto. Las afinidades se resumen en las Tablas 10 para la IL-13 natural de humano y 11 para la IL-13 natural de macaco.

Tabla 10 Tabla 11 La constante de velocidad de asociación se investigó utilizando KinExa para dos de los anticuerpos, 623 y 731. Las mismas perlas acopladas con IL-13 se utilizaron como la solución de ensayo y se utilizaron métodos "directos" o "de inyección". Estos métodos son idénticos a los análisis de equilibrio con KinExA con respecto a la captura de antígenos, concentración de antígenos y detección de antígenos. En el método directo, el antígeno y el anticuerpo se mezclaron por adelantado y luego se ejecutaron sobre el KinExA. En el método de inyección, el anticuerpo y una valoración del antígeno se mezclaron conjuntamente durante un tiempo antes de la lectura. En resumen, hIL-13 se mezcló con una cantidad de mAb que podría unirse aproximadamente al 80% del antígeno con base en los experimentos de equilibrio. El antígeno libre presente en la muestra se probó repetidamente, en pre-equilibrio . Debido a que las señales de unión son proporcionales a la concentración del antígeno libre en la solución, las señales disminuyeron a través del tiempo hasta que la solución alcanzó el equilibrio. Los volúmenes y velocidades de flujo de flujo de las mezclas de antígeno-mAb y el anticuerpo secundario marcado con Cy5 variaron dependiendo del mAb probado. Los datos se analizaron itilizando el software de análisis KinExA. Este software representa gráficamente la disminución en las señales de unión a través del tiempo, y ajusta los puntos de datos recolectados a una solución exacta de las ecuaciones diferenciales cinéticas para unión. A partir de esta curva, se determinó una solución óptima para el Kon (Tabla 12; El kof f se calculó indirectamente a partir de las soluciones para el kon y Kc Tabla 12 Unión a la proteina variante IL-13 Se investigó la capacidad de los anticuerpos 623 y 731 para unirse a una proteína variante IL-13 en la cual la arginina tipo silvestre 110 se reemplaza con glutamina (IL-13Q110R) . En resumen, las placas se recubrieron en IL-13RbFc (50 µl de 2.5 µg/ml) mediante la incubación en lxPBS (pH 7.4) y azida al .05% durante la noche a 4°C. Las placas luego se lavaron con lxPBS y se bloquearon durante 30 minutos con 100 µl de 1% de leche descremada/lxPBS a temperatura ambiente. IL-13 o IL-13Q110R se pre-incubaron con anticuerpos anti-IL-13 durante 1 hora a temperatura ambiente. La IL-13 se valoró verticalmente a partir de 2000 ng/ml con un volumen final de 30 µl/cavidad. Se agregaron 30 µl de mAb por cavidad a 40 ng/ml (sc731, 623) y 80 ng/ml (sc693), dando por resultado en una concentración final de IL-13 en el primer punto en la valoración de 1000 ng/ml, una concentración final de los anticuerpos 623 y 731 en el primer punto en la valoración de 20 ng/ml a una concentración final del anticuerpo 693 en el primer punto en la valoración de 40 ng/ml. Después de la pre-incubación, se transfirieron 50 µl/cavidad a partir de la solución de pre-incubación a una placa recubierta con IL-13RbFc y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se agregó Fc HRP de IgG anti-Hu de conejo a una concentración de 200 ng/ml. Después de una incubación de 30 minutos adicionales y un posterior lavado, se agregó TMB y se incubó durante unos 30 minutos adicionales. Las reacciones se detuvieron con HCL ÍN y las placas se eluyeron tan pronto como fue posible un lector de microplacas de 96 cavidades Powerwave X340 (Biotek) . Como se puede observar en la Figura 4, la preincubación con IL-13 inhibió la unión de ambos anticuerpos 623 y 731 a las placas ELISA recubiertas con IL-13, mientras que la pre-incubación con IL-13Q110R variante de IL-13 inhibió la unión de 731 a un grado mucho mayor que la unión de 623. Se observó que los anticuerpos para esta variante particular pueden ser particularmente útiles en el tratamiento de ciertas enfermedades. Se observó que los anticuerpos de esta variante particular, pueden ser particularmente útiles en el tratamiento de ciertas enfermedades. Por ejemplo, como se observó en la publicación de patente de los Estados Unidos No. 2005/0065327, varios polimorfismos genéticos en el gen IL-13 se habían vinculado a la enfermedad alérgica. En particular, una variante del gen IL-13 en el cual el residuo de argnina en el aminoácido 130 se sustituye con glutamina (Q130R) se ha asociado con asma bronquial, dermatitis atópica y altos niveles de IgE sérico (véase, por ejemplo, Hemzmann, A., et al. Hum Mol Genet, 2000. 9(4): p.549-59; Howard, T.D., et al. Am J Hum Genet, 2002. 70(1): p.230-6; Kauppi, P., et al. Genomics, 2001. 77(1-2): p.35-42; and Graves, P.E., et al. J Allergy Clin Immunol, 2000. 105(3): p.506-13). Esta variante IL-13 particular se denomina en la presente como la variante QllOR (el residuo de arginina en el aminoácido 110 se sustituye con glutamina) debido a que una secuencia de señal de 20 aminoácidos se ha retirado del conteo de aminoácidos. Arima et al., (J Allergy Clin Immunol, 2002 109(6): p. 980-7) reportan que esta variante está asociada con los altos niveles de IL-13 en suero. La variante IL-13 (QllOR) y los anticuerpos para esta variante se exponen en la WO 01/62933. Un polimorfismo del promotor IL-13, que altera la producción del IL-13, también se ha asociado con un asma alérgico (van der Pouw Kraan, T.C., et al. Genes Immun, 1999. 1(1): p. 61- 5) . Se cree que la variante induce un aumento en la incidencia de asma a través del aumento de la vida media eficaz del ligando IL-13. Se cree que IL-13Q110R puede tener una baja afinidad para el receptor IL-13 simulado. Como se apreciará por alguien con experiencia con la técnica, a la luz de la presente exposición, en algunas modalidades, los anticuerpos se pueden unir tanto a IL-13 como a una variante de IL-13 con aproximadamente iguales afinidades o KD. Esto puede permitir el tratamiento de pacientes con ambas formas de IL-13 (tipo silvestre y una variante) con un anticuerpo individual. De esta forma, en algunas modalidades, un anticuerpo que se puede unir a IL-13 y una variante de IL-13 con un KD igual o similar pueden ser útiles. En algunas modalidades, existe menos de un 20% de diferencia en el KD del mAb totalmente humano para IL-13 y IL-13Q110R, por ejemplo, menor que 20-15, 15-10, 10-8, 8-6, 6-4, 4-2, 2-1, 1-0 por ciento de diferencia en los KD del anticuerpo. En algunas modalidades, los KD entre la variante tipo silvestre y IL-13Q110R difieren en menos de 1000 veces, 1000-100, 100-10, 10-1, ó 1-0.2 veces. También se pueden utilizar para la selección o utilización de los anticuerpos similitudes para otras variantes de IL-13.

Competición de la cadena receptora Se investigó la capacidad de los anticuerpos anti- IL-13 para bloquear la unión IL-13 a los receptores IL-13Ral y IL-13Ra2. Las muestras se analizaron utilizando el citómetro de flujo. Los resultados se presentan en la Figura 5A y la Figura 5B. Los datos demostraron la capacidad de Ab 643 (Figura 5A) y de Ab 731 (Figura 5B) o un anticuerpo control de isotipos para unirse a IL-13 y los receptores implicados en el proceso de unión. El receptor particular (por ejemplo, IL-13Ra2, IL-13Ral, o IL-4R) que fue la IL-13 de unión y permite que el anticuerpo interactúe con las células, se determinó utilizando los anticuerpos neutralizantes contra todos los posibles receptores de IL-13 expresados sobre células HDFa. Un resumen de los diversos experimentos y resultados predichos se exhiben en la Figura 5C y la Figura 5D. En resumen, las células HDFa se resuspendieron en solución tampón FACS para proporcionar aproximadamente 200 000 células/cavidad/100 µl y 100 µl de las células se prorratearon en placas inferiores VEE de 96 cavidades. Los anticuerpos anti-receptores neutralizantes (IL-13Ral anti-humana (R&D Systems) , IL-13Ra2 anti-humana (R&D Systems) o IL-4R anti-humana (R&D Systems)) se diluyeron en solución tampón FACS al doble de la concentración final (10 µg/ml FINAL) . También se diluyeron anti-IL-13 y los Ab control en solución tampón FACS a 2X de la concentración final (1 µg/ml) , según fue IL-13 (R&D humano, de 10 ng/ml FINAL) .

Una placa inferior VEE de células HDFa se sometió a centrifugación a 180xg durante 7 minutos y el sobrenadante se retiró mediante inversión (PLACA #1). Las células se resuspendieron en 50 µl de solución tampón FACS y se agregaron a las cavidades adecuadas unos 50 µl adicionales de IL-13Ral anti-humana, IL-13Ra2 anti-humana, IL-4R anti-humana o solución tampón FACS (control de Ab sin receptor) . Las células y los anticuerpos luego se incubaron en HIELO durante aproximadamente 1.5 horas. Se utilizó una segunda placa inferior VEE para la pre-incubación de Ab/IL-13 (PLACA #2). Se prorratearon 60 µl del anticuerpo de prueba en una placa inferior VEE. Se agregaron 60 µl de IL-13 a las cavidades adecuadas y la mezcla se incubó sobre hielo durante aproximadamente 1.5 horas. Después de la incubación, las células HDFa se sometieron a centrifugación a 180xg durante 7 minutos y el sobrenadante se retiró por inversión. Las células en la PLACA #1 se resuspendieron en 100 µl de solución tampón FACS o 100 µl de Ab/IL-13 y se incubaron durante 1.5 horas adicionales . Después de la segunda incubación las células se sometieron a centrifugación, se lavaron IX con solución tampón FACS y 100 µl de solución tampón FACS, se agregaron a las cavidades adecuadas IgG-Fc-Cy5 o 2 µg/ml de 7AAD anti-Hu de cabra . Las células y el anticuerpo secundario se incubaron en hielo durante 20 minutos, seguido por un lavado con solución tampón FACS. Las células luego se resuspendieron en 100 µl de solución tampón FACS y se prorratearon en tubos FACS pre-marcados que contuvieron 300 µl de solución tampón FACS frío. Las muestras se analizaron utilizando el citómetro de flujo. Los resultados se presentan en la Figura 5A y en la Figura 5B. Un resumen del protocolo anterior y los resultados predichos para cada uno de los anticuerpos se muestra en la Figura 5C y en la Figura 5D. Como se muestra por la Figura 5A, la IL-13 no se unió a las células con HDFa en presencia del Ab 643. Parece que el Ab 643 evita la unión de IL-13 con sus receptores sobre las células HDFa, como se muestra en cada uno de los paneles de la Figura 5C. Como se puede observar en la Figura 5B, éste no es el caso para Ab 731. La IL-13 permitió que el Ab731 se uniera a las células HDFa. Esta unión no se bloqueo por los Ab contra IL-13Ralfal o IL-4R aunque se bloqueo por los anticuerpos contra IL-13Ralfa2, indicando que el Ab 731 evita que la IL-13 se una a IL-13Ralfal o IL-4R pero no a IL-13Ralfa2, como se muestra en la Figura 5D. Los resultados para el mAb 623, un anticuerpo que es similar al mAb 643, también se presentan más adelante. La cantidad de IL-13 Ral, IL-13 Ra2 y la expresión superficial de IL-4R sobre las células HDFa se determinó mediante análisis FACS utilizando anticuerpos antireceptores. Las células HDFa preparadas como se describió anteriormente se incubaron con anticuerpos anti-receptores a una concentración de 5 µg/ml sobre hielo durante 1 hora. Las células se lavaron con solución tampón FACS y se incubaron con el anticuerpo secundario Cy5 (anti-hum) a 2 µg/ml sobre hielo durante 30 minutos. Después del lavado, las muestras se analizaron mediante citometría de flujo. Los resultados se presentan en la siguiente Tabla 13.

Tabla 13 Además de los resultados anteriores para el mAb 643 y el mAb 731, para el mAb 623 se realizó un experimento similar. Los resultados se muestran en la Figura 5E. Los resultados para el mAb 623 son similares a aquellos para el mAb 643, lo que sugiere una interacción representada en la Figura 5C, en lugar de que se represente para el mAb 731 en la Figura 5D.

Mapeo de Epitope Los epítopes para los complejos del anticuerpo-IL-13 se analizaron mediante tres métodos, 1) SELDI, 2) clasificación de las bibliotecas que exhiben el fago para péptidos aleatorios y 3) expresión de moléculas de IL-13 humano/ratón quiméricas. Estas tres técnicas combinadas con el conocimiento de la estructura de la IL-13 produjeron una vista coherente de los sitios de unión relativos y las regiones antigénicas de estos Ab. Esto ha permitido la identificación de epítopes funcionales, en particular para las regiones implicadas en la unión al receptor de señalización. Como un examen inicial, el análisis de transferencia puntual del mAb que se une a la proteína purificada de IL-13 reveló que los anticuerpos unidos a la misma forman el epítope (linear o conformacional) . Los mAb 693 y 785, se unen al antígeno desnaturalizado reducido, el epítope lineal. Los mAb 602, 623, 643, y 713, se unen a la IL-13 no reducida (epítope conformacional) pero no al antígeno desnaturalizado reducido. El mAb 763 no exhibió unión. Después de esto, los epítopes lineales se mapearon utilizando una biblioteca para exhibición de fagos peptídicos aleatorios. Después de dos ciclos de lavado del mAb 693 contra una biblioteca de péptidos aleatorios 12-mer expresados en el fago, se secuenció un aglutinante específico e individual y se alineó a los residuos 109-120 (hélice D) de IL-13 (Figura 6A) . Los anticuerpos IL-13 se agruparon en 3 diferentes recipientes, aunque los recipientes no siempre se correlacionaron con los epítopes determinados por otros medios. Un anticuerpo proveniente de cada recipiente se eligió para el mapeo mediante SELDI . La Tabla 14 demuestra los resultados de unión de los anticuerpos IL-13.

Tabla 14 Mapeo de epitopes utilizando SELDI El complejo de anticuerpo-antígeno se digirió con una alta concentración de Lys-C y ASP-n. El epítope luego se determinó mediante SELDI e se identificó mediante la masa del fragmento. La Tabla 15 exhibe las masas predichas para los péptidos derivados por la digestión de IL-13 digerida con la endoproteinasa Lys-C.

Tabla 15 Las masas identificadas después de la escisión fueron 6842.8 (para el fragmento peptídico 45-108), 7733.7 (para el fragmento peptídico 45-116), y 9461.4 (para fragmento peptídico 21-108). De esta forma, el sitio de unión para el mAb 713 se determinó para que estuvieran dentro de los residuos 45-108 de IL-13.

Disposición de los péptido para el mapeo de epitopes conformacionales Se genero (SIGMA-Genosys) una disposición peptídico de 101, 12-mer péptidos, que abarcan los residuos 21-132 de la secuencia de IL-13. Cada péptido consecutivo se desvió por un aminoácido del anterior, proporcionando una biblioteca de superposición, jerarquizada. La disposición se probó con el mAb 713 y la unión de mAb 713 a los péptidos se detectó durante la incubación de membranas PVDF con el anticuerpo secundario conjugado con HRP seguido por quimioluminiscencia mejorada. Se observaron dos marcas consecutivas, que corresponden a los aminoácidos 70 a 80 de la IL-13 y tres marcas consecutivas, que corresponden a los aminoácidos 83 a 92 de la IL-13. La disposición también se probó con mAb 731. Se observó una marca, que corresponde a los aminoácidos 70 a 80 de la IL-13. También se realizó un experimento similar para determinar el epítope para mAb 623, y se describe en el próximo ejemplo 10. Los resultados indicaron que el mAb 623 se une a los residuos 21-29.

Mapeo de epitopes utilizando moléculas quiméricas de IL-13 de ratón Las secuencias de ratón de la hélice A, hélice B, hélice C, y hélice D se mezclaron con las secuencias humanas generando cuatro nuevas quimeras de ratón. En la Figura 6B se muestra una representación de la ubicación de las hélices. Ningunos de los mAb se unió a la IL-13 de ratón. Las cuatro quimeras son como sigue: MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPRSVSLPLTLKELIEELVNITQNQ KAPLCNGSMV SINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHV RDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN (SEQ ID NO: 77); MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPL CNGSMV SINLTAGGFCVALDSLTNVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTK IEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN (SEQ ID NO: 78) ; MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPL CNGSMV SINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIYRTQRILHGLCPHKVSAGQFSSLHVRDTK IEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN (SEQ ID NO: 79); MHPLLNPLLLALGLMALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPL CNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTK IEVAHFITKLLSYTKQLFRHGQQFN (SEQ ID NO: 80) .

Las quimeras que expresaron y secretaron proteínas quiméricas IL-13 se detectaron en un análisis ELISA. Los resultados se resumen en la Tabla 16, el "*" denota que la unión fue débil en el ELISA emparedada.

Tabla 16 Los resultados de los tres estudios anteriores de os epítopes de IL-13 se resumen en la Tabla 17.1.

Tabla 17.1 De esta forma, parece que varias de las diferentes posiciones de los epítope posibles se utilizan por los diversos anticuerpos expuestos en la presente.

Análisis de reunión de anticuerpos Los anticuerpos anti-IL-13 se agruparon en tres diferentes recipientes al medir la capacidad de dos anticuerpos para unirse al antígeno al mismo tiempo (un anticuerpo que captura al antígeno en una perla y el otro anticuerpo utilizado para detección) . La señal sobre las perlas en ausencia del antígeno se restó de la señal obtenida en presencia del antígeno. La señal de cada anticuerpo para detección se dividió entre la señal del anticuerpo de captura para determinar el aumento de veces en la reunión según se muestra en la Tabla 17.2. Los anticuerpos luego se reunieron con base en patrones de unión similares sobre los anticuerpos capturados. Los datos se identificaron en la presencia de tres reuniones del anticuerpo que se reúne para los nueve anticuerpos de detección probados (Tabla 17.2).

Tabla 17.2 En resumen, se agregaron perlas conjugadas con el IgGl,2,3,4 anti-humano de ratón, (BD Pharmingen 555784) para capturar el anticuerpo (353 & 11.18; 5 ug/ml) en tubos eppendorf oscurecidos similares. Los tubos se hicieron girar en la oscuridad a 4 o durante la noche. Las perlas se prorratearon para cada cavidad de una placa de filtro (2500 de cada perla/cavidad) y se lavaron. IL-13-RbIg (5 µg/ml) y los controles (sólo medio) se agregaron a la placa de filtro 60 µl/cavidad, que luego se incubó en la oscuridad en temperatura ambiente durante 1 hora sobre una agitadora y posteriormente se lavó 2 veces. Se agregaron anticuerpos secundarios diluidos en los medios a 60 µl/cavidad (1 anticuerpo por cavidad) . Los anticuerpos se utilizaron a las siguientes concentraciones (353B-5 g/ml; 11.18.31-5 µg/ml; 713-0.56 µg/ml; 731-1.28 µg/ml; 693-2.7 µg/ml; 623-5.7 µg/ml; 602-11 µg/ml; 643-4.3 µg/ml; 785-5.5 µg/ml; 763-5.7 µg/ml; Control G2 - 5 µg/ml). Las placas luego se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente y se lavaron. A cada cavidad (60 µl/cavidad) se agregó Gl,2,3,4 Mo-anti-Hulg biotinilado (BD Pharmmgen # 555785) diluido en el medio a 5 µg/ml y las placas se incubaron en la oscuridad durante 1 hora sobre un agitador a temperatura ambiente. Después del lavado, se agregaron 60 µl/cavidad de estreptavidina-PE (5 µg/ml; Pharm # 554061) diluido en el medio. Las placas se incubaron en la oscuridad durante 20 minutos en la agitadora a temperatura ambiente y se lavaron 2 veces . Cada cavidad se resuspendió en 80 µl de solución tampón de bloqueo almacenada (PBS, 10 mg/ml BSA, 0.05% p/v de azida de sodio) al agregar cuidadosamente mediante pipeta varias veces las perlas resuspendidas. Cada cavidad se analizó mediante lectura sobre Luminex con el ajuste de compuerta entre 8,400 y 14,500. La placa Luminex es una perla de fluorescencia con base en la tecnología que permite ejecutar múltiples análisis a la vez. El lector Luminex es capaz de determinar los eventos de señalización positiva en diferentes microesferas codificadas. Esto permite recubrir cada perla por separado, luego mezclar las microesferas recubiertas de manera diferencial juntas y luego en un análisis de un solo paso unido al anticuerpo a cada una de las diferentes microesferas. Para los anticuerpos isotipo, las microesferas se recubrieron de tal forma que cada perla fuera capaz de unirse específicamente a un isotipo de cadena pesada o cadena ligera particular. Las microesferas luego se mezclaron juntas y se agregó el sobrenadante de hibridomas para cada anticuerpo. Después de 20 minutos de incubación, las microesferas se lavaron, y el anticuerpo unido se detectó utilizando un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente. Las microesferas luego se diluyeron utilizando el lector Luminex.

EJEMPLO 3. DATOS JN VIVO Ratones con IL-13 humanizada Los ratones con IL-13 humanizada, en los cuales el gen que codificaba para la IL-13 murina se rompió mediante la inserción de un AD?c que codifica para la IL-13 humana, se generaron en Léxico (The Woodlands, Texas) . Los ratones se retro-cruzaron sobre la cepa A/J para asegurar de los ratones fueran susceptibles a la hiper-reactividad de las vías respiratorias inducida por alergénicos como se describió anteriormente (Ewert et al., (2000). Am. J. Cell. Mol. Biol. ) . Para demostrar que los ratones con IL-13 humanizada produjeron únicamente la IL-13 humana y no la IL-13 murina, la producción de citosinas a partir de linfocitos T CD4+ OVA-específicos derivado de ratones con IL-13 humanizada (6-8 semanas de edad) se comparó con los linfocitos T CD4+ derivados de ratones tipo silvestre. Los ratones se sensibilizaron mediante inyección i.p. con 50 µl de OVA/1 mg Imject Alum (Pierce, Rockford, IL) en 0.9% de solución salina estéril o con PBS (3 ratones por tratamiento) . Siete días después de la sensibilización, los ratones se sacrificaron, y se prepararon suspensiones de células individuales de los bazos. Los eritrocitos se lisaron, y los esplenocitos lavados se resuspendieron a 5 x 106 células/ml en medio completo que consistió de HL-1 (Bio hittaker, alkersville, MD) con 10% de FCS inactivado con calor, 2 mm L-glutamina y 50 mg/l de sulfato de neomicina. Los esplenocitos luego se cultivaron durante 4 días a 37°C en presencia de 200 µg/ml de OVA para generar los linfocitos T CD4+ Ag-reactivos . Los linfocitos T CD4+ (5 x 105 células/cavidad) se aislaron y luego se incubaron con esplenocitos tratados con mitomicina aislada recientemente (25 µg/ml) (5 x 105 células/cavidad) provenientes de ratones tipo silvestre en medio completo en presencia de 200 µg/ml de OVA en placas de 96 cavidades (250 µl/cavidad) durante 96 horas. Los sobrenadantes de cultivo sin células se recolectaron y se probaron para la producción de citosinas. Las concentraciones de IL-13 humana y murina (DuoSet, los R&D Systems, Minneapolis, MN) se determinaron mediante ELISA de acuerdo con el protocolo del fabricante. Como se esperaba, los linfocitos T CD4+ derivados de ratones con IL-13 humanizada después de una re-estimulación OVA in vi tro produjeron la IL-13 humana y no la IL-13 murina (Figura 7A) . Por el contrario, los linfocitos T CD4+ derivados de ratones tipo silvestre produjeron la IL-13 murina y no la IL-13 murina (Figura 7B) .

Hiper-reactividad de la vias respiratorias Los anticuerpos anti-IL-13, 731 y 623 se probaron en modelos de asma inducido en OVA utilizando los ratones con IL-13 humanizada descritos anteriormente. Para la medición de la reactividad de las vías respiratorias a la administración intravenosa de acetilcolina, se utilizó un protocolo de 24 días. En resumen, los ratones se inmunizaron mediante una inyección intraperitoneal de OVA (10 µg; grado crudo IV; Sigma) en PBS (0.2 ml) . Se utilizó como un control PBS solo. Catorce días después de la inmunización, los ratones se anestesiaron con una mezcla de cetamina y xilazina [45 y 8 mg por kilogramo de peso corporal (mg/kg) , respectivamente] y se inocularon intratraquealmente con 50 µl de una solución al 1.5% de OVA o un volumen equivalente de PBS como un control. Siete días después de la primera inoculación antigénica, los ratones se inocularon nuevamente intratraquealmente con ya sea OVA o PBS. Los anticuerpos 731 y 623 se administraron intraperitonealmente a una dosis de 100 µg/ratón un día antes de cada inoculación (días 13 y 20) . Los ratones control, recibieron PBS o un IgG2 irrelevante como control de isotipo. Tres días después de la inoculación intratraqueal, los ratones se anestesiaron con pentobarbital sódico (90 mg/kg), se intubaron, se ventilaron a una velocidad de 120 respiraciones/minuto con un volumen constante total de respiraciones de aire (0.2 ml), y se paralizaron con bromuro de decametonio (25 mg/kg) después de que se estableció una presión de las vías respiratorias estable, se inyecto intravenosamente acetilcolina (50 µg/kg), y la presión dinámica de las vías respiratorias se midió durante 5 minutos. Se midió la hipersensibilidad de las vías respiratorias (AHR) a la inoculación de acetilcolina. La hipersensibilidad de las vías respiratorias a la inoculación de acetilcolina se define por el aumento de tiempo integrado en la presión pico de las vías respiratorias [índice de tiempo por presión de las vías respiratorias (APTI, por sus siglas en ingles) en centímetros de H20 x segundo] * P < 0.05, comparado con el grupo control OVA + IgG2 [análisis de varianza de un factor (ANOVA) seguido por una prueba de diferencia al menos significativa de Fisher para múltiples comparaciones] . El tratamiento con 731 ó 623 dio por resultado en una inversión completa de la AHR inducida por OVA (Figura 8) . En este ejemplo, inversión completa significa que la adición del anticuerpo con OVA dio por resultado en un efecto similar a uno en el cual no hubo OVA y sólo se agregaron anticuerpos (por ejemplo, IgG2) . n=4 ratones/grupo en los grupos PBS, PBS+IgG2, PBS+731 y OVA, n=5 ratones/grupo en el grupo OVA+IgG2; n=6 ratones/grupo en el grupo PBS+623 y OVA+731; n=8 ratones/grupo en el grupo OVA+623. Los datos son la media + SE.

Producción de mucosidad inducida por OVA Se utilizó un protocolo de 18 días para la medición de la producción de mucosidad inducida por OVA. Después de un cebado subcutáneo con Ovalbumina (OVA, 25 µg; grado crudo IV) (sigma) en 2 mg de Imject Alum en los días 0 y 7, los ratones se anestesiaron con isofluorano y se inocularon intranasalmente con 50 µl de una solución al 1.5% de OVA en PBS en los días 14, 15, y 17. Los ratones control recibieron Alum como el cebado o PBS como inoculación. Los anticuerpos 731 y 623 se administraron intraperitonealmente a una dosis de 100 µg/ratón en los días 13, 15, y 17. Los ratones control recibieron PBS. En el día 18, los ratones se sacrificaron y los pulmones se recolectaron después de someterlos a perfusión. El tejido pulmonar, incluyendo las vías respiratorias central y periférica, se fijó en formalina al 10%, se lavó en etanol al 70%, se deshidrató, se incorporó en glicolmetacrilato, se cortó en secciones de 4 µm, se montó en portaobjetos, y se tiñó con hematoxilina y eosina, más ácido periódico-Schiff (PAS, por sus siglas en inglés) . Las secciones de pulmón (una sección por animal) se examinaron a 20x de aumento. Se seleccionaron aleatoriamente cinco campos y para cada sección el número de bronquios se contó en cada campo. Las secciones se marcaron a una escala de 0 a 4 (0: <5% de células PAS+ globet; 1: 5 al 25%; 2: 25 al 50%; 3: 50 al 75%, 4: >75%).

Para obtener la marca de células globet histológicas (expresadas como unidades arbitrarias; U) la suma de las marcas en las vías respiratorias provenientes de cada pulmón se dividió entre el número de bronquios examinados. Cinco de ocho ratones murieron en el grupo tratado con OVA. En los otros grupos no murió ningún ratón. La administración de 731 y 623 invirtió eficazmente el aumento de mucosidad inducida por OVA que contenía células en las vías respiratorias (Figura 9) . Los datos son la media ± SE. n= 3 para el grupo OVA/OVA/PBS (inicialmente n=8); n=8 para el grupo OVA/OVA/731, n=4 para el grupo OVA/OV A/623; n=4 para grupo de OVA/PBS/PBS, n=5 para los grupos Alum/OVA/PBS, y Alum/PBS/PBS. *p< 0.01 contra el grupo OVA/OVA/PBS mediante la prueba t de Student no pareada. El uso anterior de los modelos murinos y la mucosidad y las mediciones de AHR para el asma de prueba es un modelo preciso y científicamente aceptado para probar la eficacia de un fármaco para el tratamiento del asma.

(Willis-Karp M., Murine models of asthma in understanding dysregulation in human asthma, Immunopharma cology, 25:48:263-8 (2000)) . Además, se predice que el modelo será confiable para aquellos trastornos relacionados con IL-13 que compartan los síntomas que son similares al menos uno de los síntomas mostrados en estos modelos de ratón. Como tales, este y modelos de animal similares serán suficientes para probar similarmente los otros trastornos identificados relacionados IL-13.

EJEMPLO 4: ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE ANTICUERPOS Las cadenas pesadas variables y las cadenas ligeras variables para los anticuerpos mostrados en la Tabla 1 se secuenciaron para determinar sus secuencias de ADN. La información completa de secuencia para todos los anticuerpos anti-IL-13 se muestra en el listado de secuencia presentado con la misma, incluyendo las secuencias de nucleótidos y aminoácidos . La Tabla 18 muestra las secuencias de aminoácidos de los genes de cadena pesada para una variedad de los anticuerpos IL-13 descritos en la presente. La Tabla 18 también muestra las secuencias de aminoácidos que corresponden a las CDR y a las regiones trama para cada anticuerpo, junto con una comparación con su secuencia de línea germinal. La Tabla 19 muestra las secuencias de aminoácidos de los genes de cadena ligera kappa para una variedad de anticuerpos IL-13 descritos en la presente. La Tablas 19 también muestra las secuencias de aminoácidos que corresponden a las CDR y las regiones trama para cada anticuerpo, junto con una comparación para su secuencia de línea germinal.

La Tabla 20 muestra las secuencias de aminoácidos de los genes de cadena ligera lambda para una variedad de anticuerpos IL-13 descritos en la presente. La Tabla 20 también muestra las secuencias de aminoácidos que corresponden a las CDR y las regiones trama para cada anticuerpo, junto con una comparación para su secuencia de línea germinal.

Tabla lí s. 10 15 Tabla 18 (Continuación) 10 15 Tabla 19 o. 10 Tabla 19 (Continuación) 15 Tabla 20 * 10 Tabla 20 (Continuación) 15 En algunas modalidades, se utilizaron las secuencias anteriores para generar variantes de los anticuerpos Por ejemplo, la creación de variantes puede implicar utilizar las secuencias anteriores y la descomposición estructural (por secciones o regiones del anticuerpo) de las secuencias para identificar regiones del anticuerpo, idénticas, similares, y no conservadas. Las secciones del anticuerpo que se conservan bastante o que son idénticas se mantendrán en la variante, mientras que las secciones que varíen en gran medida entre los anticuerpos se pueden dejar que varíen en la nueva variante. De esta forma, se pueden crear fácilmente variantes "conservadas" al utilizar el listado anterior de secuencias de anticuerpos. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, ya existen muchas variantes listadas anteriormente, por ejemplo, 713 y 731 ó 623 y 643 que difieren en sus secuencias de aminoácidos. En algunas modalidades, no más del 40% de los aminoácidos en cada una de las secciones anteriores (por ejemplo, CDRl, CDR2, CDR3, FRl, J, etc.) se dejó diferir, por ejemplo, 40-30, 30-20, 20-15, 15-10, 10-5, 5-2, 2-1, o 1% o menos de los aminoácidos en cada sección se dejó que cambiaran a aminoácidos no conservadores para el anticuerpo resultante que se considerará como un anticuerpo variante. Según se demuestra en la presente, las variantes parecen conservar sus diversas funciones. Una guía adicional se puede encontrar en los anticuerpos de identificación que se unen al mismo epítope y luego analizar las secuencias para similitudes estructurales (primarias, secundarias, terciarias, etc.) sólo entre aquellos anticuerpos. En algunas modalidades, también se contemplan los anticuerpos que se unen a IL-13, con al menos un subconjunto de la secuencia identificada anteriormente. Por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo totalmente humano IL-13 con una región CDRl según se describió anteriormente, o, más particularmente, con una región CDRl que tenga la secuencia GFTF en el mismo. De manera similar, también se puede utilizar un anticuerpo con una región CDR2 de cadena ligera que termina en Kn o una región CDR2 de cadena pesada que termina en VKG, o una región CDR3 que inicia con GMDV. Se pueden utilizar similarmente cualquiera de las secuencias o subsecuencias anteriores, en especial cuando las secuencias son anticuerpos de cruce común. Según se observa en la presente, en algunas modalidades, los anticuerpos se unen con la misma afinidad a IL-13 al igual que no a otras variantes de IL-13. En algunas modalidades, las otras variantes de IL-13 incluyen la variante de QllOR. Estos anticuerpos, y variantes de los mismos, se pueden crear mediante los métodos expuestos anteriormente. Se puede encontrar una guía adicional mediante las comparaciones de secuencias para identificar las regiones conservadas en los anticuerpos que se unen con afinidad similar a las variantes de IL-13 tipo silvestre y otra. Las variantes IL-13 se conocen en la técnica y se identifican fácilmente por alguien con experiencia en la técnica. Los ejemplos de variantes IL-13 se pueden encontrar en Heinzmann et al., (Genentic variants of IL-13 signaling and human asthma and atopy, Human Molecular Geneti cs, 9:549-559 (2000) ) .

EJEMPLO 5: USO DE ANTICUERPOS ANTI-IL-13 COMO UNO DE LOS AGENTES PARA DIAGNÓSTICO PARA LA DETECCIÓN DE IL-13 ?N UNA MUESTRA Se puede desarrollar un ensayo inmunoenzimático (ELISA, por sus siglas en inglés) para la detección de IL-13 en una muestra. En el ensayo, las cavidades de una placa microtituladora, tal como por ejemplo, una placa microtituladora de 96 cavidades o una placa microtituladora de 384 cavidades, se adsorbieron durante varias horas con un primer anticuerpo monoclonal totalmente humano dirigido contra IL-13. El anticuerpo inmovilizado sirvió como un anticuerpo de captura para IL-13 y puede estar presente en una muestra de prueba. Las cavidades se enjuagaron y se trataron con un agente de bloqueo tal como por ejemplo, proteína láctea o albúmina para prevenir la adsorción monoespécifica del analito.

Posteriormente, las cavidades se trataron con una muestra de prueba con sospecha de contener IL-13, o con una solución que contuvo una cantidad estándar del antígeno. Después de enjuagar la muestra de prueba o estándar, las cavidades se trataron con un segundo anticuerpo anti-IL-13 monoclonal totalmente humano que se marcó mediante conjugación con biotina. El anticuerpo anti-IL-13 marcado sirvió como un anticuerpo para detección. Después de enjuagar el segundo anticuerpo en exceso, las cavidades se trataron con peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés) conjugada con avidita y un sustrato cromosómico adecuado. La concentración del antígeno en las muestras de prueba se determinó mediante comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándar .

EJEMPLO 6: TRATAMIENTO DE COPD EN SERES HUMANOS Se identificó un paciente que sufría de COPD. Una dosificación de 5 mg/kg del anticuerpo IL-13 623 y/o 731 se administró mediante inyección intravenosa al paciente. Se determinó el nivel de eotaxina, CÍO, y/o TARC en el paciente. Si el nivel de eotaxina, CÍO, y/o TARC es muy alto, se administró un mAb adicional al paciente hasta que se obtuvo un nivel "normal" de eotaxina, CÍO, y/o TARC. El anticuerpo anti-IL-13 provocó una inhibición en la producción de mucosidad, el desarrollo de hiperplasia del epitelio bronquial, y espasmo de músculo liso bronquial. Esta inhibición de la producción de mucosidad y la contracción de músculo liso redujo el bloqueo del paso de aire con una ventilación mejorada.

EJEMPLO 7: TRATAMIENTO DE BRONQUITIS CRÓNICA EN SERES HUMANOS Se identificó un paciente que padecía de COPD caracterizada por bronquitis crónica. Se administró una dosificación de 5 mg/kg de un anticuerpo anti-IL-13 expuesto en la presente, de preferencia 623 ó 731, mediante inyección intravenosa al paciente. Se determinó el nivel de eotaxina, CÍO, y/o TARC en el paciente. Si el nivel de eotaxina, CÍO, y/o TARC es muy alto, se administró mAb adicional al paciente hasta que se obtuvo un nivel "normal" de eotaxina, CÍO, y/o TARC. El anticuerpo anti-IL-13 provocó una inhibición parcial o completa de la producción de mucosidad y la contracción de músculo liso bronquial en los tejidos respiratorios inflamados. Esta inhibición de la producción de mucosidad y la contracción de músculo liso redujo el bloqueo del paso de aire con ventilación mejorada.

EJEMPLO 8: TRATAMIENTO DE ENFISEMA EN SERES HUMANOS Se identificó un paciente que padecía de enfisema Se administró mediante inyección intravenosa al paciente una dosificación de 5 mg/kg del anticuerpo IL-13. Se determinó el nivel de eotaxina, CÍO, y/o TARC. Si el nivel de eotaxina, CÍO, y/o TARC fue muy alto, se administró mAb adicional al paciente hasta que se obtuvo un nivel "normal" de eotaxina, CÍO, y/o TARC. El anticuerpo anti-IL-13 provocó una disminución parcial o completa del infiltrado celular inflamatorio en los tejidos respiratorios. Adicionalmente, el anticuerpo anti-IL-13 puede bloquear la capacidad que IL-13 tiene para inducir proteasas para dañar el tejido.

EJEMPLO 9: TRATAMIENTO DE ASMA EN SERES HUMANOS Se identificó un paciente que padecía asma. Se administró mediante inyección intravenosa a un paciente una dosificación de 5 mg/kg de un anticuerpo anti-IL-13 descrito en la presente, de preferencia 623 ó 731. Se determinó el nivel de eotaxina, CÍO, y/o TARC en el paciente. Si el nivel de eotaxina, CÍO, y/o TARC fue muy alto, se administró mAb adicional al paciente hasta que se obtuvo un nivel "normal" de eotaxina, CÍO, y/o TARC. Más tarde se proporcionó una administración de refuerzo. El anticuerpo anti-IL-13 redujo la gravedad del daño a tejidos para los pulmones y los pasos de aire provocados por la respuesta inmunológica del paciente .

EJEMPLO 10: MAPEO DEL EPITOPE IL-13 CONFORMACIONAL RECONOCIDO POR MAB 623 Se generó una disposición de péptidos superpuestos (similar a lo descrito en el Ejemplo 2) abarcando la secuencia de IL-13 humana para determinar con mayor especificidad en donde mAb 623 se une a IL-13. Debido a que el mapeo fue insuficiente con procedimientos estándar, se utilizó un protocolo optimizado especialmente adecuado para la detección de sitios de unión conformacional. Las exploraciones de péptidos que contuvieron péptidos derivados de IL-13 humana 12-mer desplazados por un aminoácido se probaron con un mAb 623. La unión del mAb 623 a estos péptidos derivados de IL-13 humana se analizó mediante transferencia electroquímica del anticuerpo unido al péptido sobre membranas PVDF, seguido por detección con un anticuerpo IgG anti-humano marcado con peróxidos y quimioluminiscencia. Se identificó una región de unión. Parece que el epítope para mAb 623 para IL-13 incluyó TQNQKAPLCN (SEQ ID NO: 95) secuencia (residuos 20-29 en secuencias A, de SEQ ID NO: 96, de la Figura 10) .

EJEMPLO 11: CLASIFICACIÓN DE ALTA RESOLUCIÓN DE IL-13 HUMANA CON MAB 623 Este ejemplo proporciona un análisis de alta resolución adicional y resulta de las características de unión del mAb 623 a la IL-13 humana. Un Ab policlonal antihumano de cabra ( FC específico) fue amina acoplada a la totalidad de cuatro células de flujo de una microplaqueta con CM5 Biacore™ a una alta capacidad superficial (4800-5400 unidades de resonancia, RUs, de pAb) con un instrumento Biacore 2000MR. La solución tampón de ejecución y la solución tampón para la preparación de la muestra para todos los experimentos fue HBS-P desgasificado que contuvo 100 µg/ml de BSA. El mAb 623 se diluyó a 10.1 µg/ml en HBS-P para la captura del mAb sobre la superficie biodetectora . El mAb 623 se capturó en las células de flujo 1, 2 y 4. En promedio se capturaron 552, 211, y 390 RUs del mAb, respectivamente, para las tres células de flujo experimentales para cada ciclo utilizando velocidades de flujo que varían entre 10-50 µl/mm hasta alcanzar una variación de tiempos de contacto entre 12-60 segundos. Las tres células de flujo sirvieron como un control. Las inyecciones con el antígeno IL-13 (R&D Systems) se realizaron a 23°C con un caudal de 100 µl/min. Las muestras de IL-13 diluidas en serie (2 veces) provenientes de 12.6-0.394 nm se inyectaron aleatoriamente por triplicado durante 60 segundos con varias inyecciones de solución tampón dispersas para doble referencia. Durante 30 minutos se siguió la fase de disociación de los sensogramas. La superficie de captura se regeneró con una inyección, 15 segundos, de ácido fosfórico 146 mm, pH 1.5. Los datos del sensograma se procesaron utilizando Scrubber versión 1.1 g. Los datos provenientes de la totalidad de tres células de flujo se ajustaron globalmente a un modelo de interacción 1.1 con un término para transporte másico incluido; los valores Rmax para cada célula de flujo se dejaron ajustar localmente según fue adecuado en este caso debido a que los niveles de captura fueron diferentes en cada una de las tres células de flujo. El modelo ajustó los datos satisfactoriamente y proporcionó los resultados ka=7.3 X 106 M"1s"1, kd=2.5 X 10" s_1, KD=34 pM.

EJEMPLO 12: AFINIDAD DE KINEXA 623 Y 731 PARA MARMOSET IL- 13 Este ejemplo proporciona los datos de afinidad para el mAb 623 y mAb 731 para la IL-13 marmoset a partir del análisis KINEXA. Se realizaron experimentos controlados por KD así como también controlados por antígenos, similarmente a otros experimentos KINEXA, para IL-13 marmoset con el mAb 623. El análisis de curva n reveló que el KD fue 403 pM. También se realizaron varios experimentos para el mAb 731 y se determinó mediante el análisis de curva n , que el KD para 731 será <7 pM.

EJEMPLO 13: CLASIFICACIÓN DE RESOLUCIÓN DE MEDIOS DE LOS MABS 623 y 731 SIN LA VARIANTE IL-13 HUMANA (IL-13Q110) Este ejemplo presenta las características de unión de mAb 623 y mAb 731 a IL-13Q110R. Se utilizó resonancia con plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) sin marca, o un dispositivo BiacoreMR, para medir la afinidad de anticuerpos con el antígeno. Para este fin, se preparó una superficie del anticuerpo a humano de cabra de alta densidad sobre una microplaqueta de CM5 BiacoreMR utilizando acoplamiento con amina de rutina sobre un instrumento Biacore 2000MR. El mAb 731 se diluyó a 4.7 µg/ml y el mAb 623 a 5.2 µg/ml en HBS-P desgasificado (solución salina amortiguada con hepes que contuvo 0.005% de polisorbate 20) solución tampón para ejecución que contuvo 100 µg/ml de BSA. Se desarrolló un protocolo de captura para ambos de los mAb. Antes de cada inyección con la muestra de antígeno, se capturó cada mAb sobre una célula de flujo diferente durante 30 segundos a un caudal de 10 µl/min. Se realizó un paso de lavado de cuatro minutos a 100 µl/mm seguido para estabilizar los valores de iniciales del mAb. La variante de IL-13 humana se -inyectó (Peprotech, Inc.) durante 90 segundos a una variación de concentración de 23.6-0.185 nm (2x dilución en serie) seguida por una disociación de 15 minutos. Las muestras de la variante IL-13 se prepararon en HBS-P que contenía 100 µg/ml todas las muestras se inyectaron aleatoriamente por triplicado con diversas inyecciones de solución tampón dispersas para doble referencia. Se generaron superficies del anticuerpo a-humano de cabra de alta densidad con un pulso de 15 segundos de ácido fosfórico 146 mm (pH 1.5) después de cada ciclo. Se utilizó un caudal de 100 µl/mm para todos los ciclos de inyección con IL-13 variante. Los datos del sensograma se procesaron utilizando Scrubber 1.1 g y se ajustaron en Clamp 2000 a un modelo de interacción 1:1 con la inclusión de un término para transporte másico. Las constantes de unión resultantes se listan en la Tabla 21. Los ajustes de datos para ambos de los mAb fueron de alta calidad los que muestra alta reproductibilidad. Un modelo de interacción 1:1 describió ambos IL-13/mAb complejos adecuadamente .

Tabla 21 EJEMPLO 14: INHIBICIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE EOTAXINA INDUCIDA POR IL-13 Y LA VARIANTE IL13Q110R Este ejemplo presenta los datos adicionales que consideran la capacidad de los anticuerpos para inhibir las variantes de IL-13 e inhibir la producción de eotaxina. Los anticuerpos anti-IL-13 se probaron por su capacidad para inhibir la producción de eotaxina en células HDFa, una línea celular fibroblástica dérmica humana primaria que expresa IL-13Ral, IL-13Ra2 e IL-4Ra. Las células se sembraron durante la noche a 4000 células/cavidad en placas de 96 cavidades. Por separado, se preincubaron IL-13 o IL-13Q110R durante una hora a 37°C a 300 pM con o sin los anticuerpos anti-IL-13 a una concentración inicial de 10 nm. La IL-13 o la IL-13Q110R y la mezcla de anticuerpos luego se agregaron a las células tratadas con 50 ng/ml de TNFa y se incubaron durante 2 días a 37°C. En este punto, se recolectaron los sobrenadantes y se analizaron para la presencia de de eotaxina utilizando un ELISA cuantitativo. Los experimentos se condujeron dos o tres veces con puntos de datos por triplicados. Los resultados se presentan en la siguiente Tabla 22. También se incluyen los IC50 para la IL-13 medida en este ensayo. Las Figuras 11A-D muestran la inhibición porcentual de la liberación de eotaxina inducida por IL-13 o la variante IL-13Q110R mediante los anticuerpos recombinantes 623 y 731 en comparación con un control de coincidencia isotópica, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal control IgG2.

Tabla 22 EJEMPLO 15: NEUTRALIZACIÓN DE LA BIOACTIVIDAD DE IL-13 IN VITRO MEDIANTE 623 Y 731 Este ejemplo demuestra la capacidad de los anticuerpos para inhibir la proliferación de células HDLM-2 y L-1236, dos líneas celulares derivadas de linfoma de Hodgkin susceptible a IL-13. Se ha demostrado que estas células no sólo secretan la IL-13 sino que también utilizan esta citosina como un factor de crecimiento, posiblemente mediante un mecanismo autocrino o paracrino (Trieu et al., Claudio JO et al., Soluble interleukin-13Ralpha2 decoy receptor inhibits Hodgkin's lymphoma growth in vitro and in vivo, Cáncer Res, 64-3271-3275 (2004)). Después de 72 horas de incubación con el compuesto relevante, la proliferación celular se valoró mediante incorporación de 3H-timidina. La proliferación celular porcentual en presencia del inhibidor se calculó en comparación con cavidades control con células solas (100% de producción) . Los valores se graficaron como la concentración inhibidora de IL-13 (nm) contra la proliferación celular porcentual. Los datos representan el promedio de cinco experimentos (análisis L-1236) cuatro experimentos 'análisis HDLM-2 La neutralización de IL-13 mediante mAb 623 y mAb 731 dio por resultado en una inhibición dependiente de la dosis de proliferación de ambas líneas celulares (Figura 12A y Figura 121 mAb 623 tuvo los EC50 de 390 pM en el análisis de proliferación L-1236 (Figura 12A) y 4.5 nm en el análisis de proliferación HDLM-2 (Figura 12B) . 731 tuvo los EC50 de 5.2 pM en el análisis de proliferación 1236 (Figura 12A) y 0.18 nm en el análisis de proliferación HDLM-2 Figura 12B) hIL-13Ra2/Fc tuvo los EC50 de 59 pM en el analisis de proliferación L-1236 (Figura 12A) y 0.6 nm en el análisis de proliferación HDLM-2 (Figura 12B) . Los niveles de IL-13 medidos en el sobrenadante de las células HDLM-2 y L-1236 fueron 2.6 ng/ml y 118 ng/ml respectivamente.

EJEMPLO 16: INHIBICIÓN DE LA EXPRESIÓN DE CD23 INDUCIDA POR IL-13 EN LINFOCITOS B. Se ha mostrado que IL-13 induce la sobre-regulación de CD23 en linfocitos de B (Punnonen et al., Interleukin 13 induces interleukin 4-independent IgG4 and IgE synthesis and CD23 expression by human B cells, Proc . Na ti . Acad. Sci . U. S . A . , 90:3730-3734 (1993)). Este ejemplo demuestra la capacidad de mAb 623 y mAb 731 para inhibir la expresión inducida por IL-13 de CD23 sobre linfocitos B en sangre entera. Se agregaron concentraciones cada vez mayores de mAb 623, mAb 731 o control de isotipos a sangre entera humana en presencia de la IL-13 humana recombinante (10 ng/ml). Después de 24 horas a 37°C, se inmunotiñeron linfocitos B utilizando anticuerpos anti-CD19 y anti-CD23 y se analizaron mediante FACS. Los resultados (Figura 13) se expresaron como la expresión de la media geométrica de las células CD23 o CD19+ superficiales en comparación con las cavidades control que contuvieron IL-13 sola. Los datos representan el promedio de cuatro (hIL-13Ra2/Fc) , seis (731) y once (623 e hIgG2) donantes. La neutralización de IL-13 mediante mAb 623 y mAb 731 dio por resultado en una inhibición dependiente de la dosis de la expresión de CD23 con un IC50 de 6 2 nm y 0.87 nm respectivamente. IL-13Ra2/Fc tuvo un IC50 de 4.0 nm (Figura 13) .

EJEMPLO 17: PRUEBA ADICIONAL DEL MAB 623 Y 731 EN MODELOS CON ASMA Como se observó anteriormente, debido a que mAb 623 y mAb 731 no tuvieron una reacción cruzada con IL-13 murina, se generaron ratones humanizados con IL-13 a partir de ratones 129 x C57BL/6 mediante el rompimiento genético del gen con IL-13 murina a través de la introducción del ADNc que codifica para el gen de IL-13 humana (Lexicón, The oodland, Texan) ASMA INDUCIDA POR OVALBUMINA (OVA) ADICIONAL EN ESTUDIOS PROFILÁCTICOS CON RATONES CON IL-13 HUMANIZADA ESTUDIO OVA PROFILÁCTICO CON DOSIS FIJA DE MAB 623 Y MAB731 Este experimento se realizó de manera similar al ejemplo 3 anterior, utilizando el protocolo de 24 días. Las muestras se examinaron para la eficacia de los anticuerpos sobre la reducción de la producción de mucosidad inducida por OVA en las vías respiratorias. De esta forma, el ejemplo demuestra la eficacia de los anticuerpos para el tratamiento de asma y trastornos relacionados con IL-13 similares. Para examinar el efecto de mAb 623 y mAb 731 sobre el contenido de mucosidad del epitelio de las vías respiratorias, se tiñeron muestras pulmonares con hematoxilina y eosina más ácido periódico-Schiff (PAS). Las secciones pulmonales (una sección por animal) se examinaron a un aumento de 20x. Se seleccionaron aleatoriamente cinco campos en cada sección. En cada campo, se contó el porcentaje de células globet PAS-positivas en cada bronquio. Los datos se expresaron como el porcentaje promedio de células/bronquios globet PAS-positivos . Los datos son la media ± SE (mostrada en la Figura 14) . En los grupos control, el número de células globet que contienen mucosidad por bronquios es menor al 4%. La inoculación con OVA aumentó el número de células que contienen mucosidad en los bronquios a 19% en el grupo OVA y a 37% en el grupo 0VA+IgG2. Como se puede observar en la figura, el tratamiento con mAb 623 redujo el porcentaje de células que contienen mucosidad en los bronquios al 9%. El tratamiento con mAb 731 redujo el porcentaje de células que contienen mucosidad en los bronquios al 2%. Para examinar adicionalmente el efecto del mAB 623 y el mAb 731 sobre la reunión de leucocitos en las vías respiratorias, después de las mediciones AHR (ejemplo 3), los ratones se sacrificaron y se recolectó el fluido de lavado bronquialveolar (BALF) mediante el lavado de los pulmones dos veces con 1 ml de PBS. Los conteos celulares se determinaron mediante evaluación microscópica de luz de preparaciones con citospina. Los datos son la media ± SE y se muestran en la Figura 15. El tratamiento con 623 ó 731 no tuvo ningún efecto observable sobre la reunión de leucocitos inducida por OVA en BALF.

RESPUESTA OVA A LA DOSIS PROFILÁCTICA DE MAB 623 Y MAB 731 Este ejemplo demuestra la dependencia de las dosis en el efecto inhibitorio de mAb 623 y mAb 731 sobre la AHR inducida por OVA, la producción de mucosidad y reunión de leucocitos en el BALF. Los ratones se inmunizaron de acuerdo con el protocolo de 24 días descrito anteriormente en el Ejemplo 3 (utilizado para obtener los datos para la Figura 8) . En los días 13 y 20, se administraron ya sea el mAb 623 o el mAb 731 IP a las dosificaciones de 0.3, 1, 3 ó 10 mg/kg. Los ratones control recibieron PBS o un Ig2 irrelevante (10 mg/kg) como control de isotipos. APTI se determinó como se describió anteriormente (para la Figura 8). n=4 ratones/grupo en el PBS, y los grupos OVA; n=6 ratones/grupo en el PBS+lgG2, y los grupos OVA+IgG2; n=7 ratones/grupo en el OVA+623 (3 mg/kg), y los grupos OVA+731 (0.3 mg/kg), n=8 ratones/grupo en el OVA+623 (10 mg/kg), OVA+623 (1 mg/kg), OVA+623 (0.3 mg/kg), OVA+731 (10 mg/kg), OVA+731 (3 mg/kg), y OVA+731 (1 mg/kg) . Los datos son la media ± SE. En la dosificación de 0.3 mg/kg, ni 623 ni 731 inhibieron la AHR inducida por OVA, mientras que las dosificaciones de 1 mg/kg y mayores inhibieron la AHR hacia acetilcolina a los valores iniciales (PBS) (véase, la Figura 16) . Esta sección del ejemplo demuestra adicionalmente la dependencia a la dosificación del efecto inhibidor del mAb 623 y el mAb 731 sobre la producción de mucosidad inducida por OVA. Los pulmones se recolectaron y se trataron como se describió anteriormente. (Para la Figura 14). Los datos se expresaron como el porcentaje promedio de células globet PAS-positivas/bronquios. Los datos son la media ± SE. Tanto el mAb 623 como el mAb 731 mostraron una inhibición dependiente de la dosis similar del porcentaje de PAS+ células en las vías respiratorias de ratones tratados con OVA (Figura 17). Esta sección del ejemplo demuestra adicionalmente que el mAb 623 y el mAb 731 no inhibieron la reunión de leucocitos inducida por OVA en el BALF a ninguna de las dosis probadas (Figura 18) . El BALF se recolectó y se realizaron conteos celulares como se describió anteriormente (con referencia a la Figura 15) . Los datos son la media ± SE. En este experimento, el IgG2 para control de isotipos probado a la dosis de 10 mg/kg inhibió la AHR inducida por OVA en un 85%. Por otro lado, el IgG2 para control de isotipos no tuvo efecto sobre la hiperplasia de mucosidad y provocó un aumento evidente en el número de leucocitos en el BALF en comparación con el grupo OVA en un 146%. De esta forma, se espera alguna variabilidad en la eficacia de los anticuerpos y la superación de esta variabilidad será rutinaria a la luz de las enseñanzas presentes y el conocimiento de alguien con experiencia en la técnica. Los resultados indican que niveles elevados de los anticuerpos se pueden requerir para observar el fenotipo particular de inhibición de reunión de leucocito inducida por OVA en el BALF.

EJEMPLO 18: ASMA INDUCIDO POR ACAROS DEL POLVO DOMESTICO (HDM) EN RATONES CON IL-13 HUMANIZADA: ESTUDIOS PROFILÁCTICOS Y TERAPÉUTICOS EJEMPLO DE HDM PROFILÁCTICO DE RESPUESTA A LA DOSIS A MAB623 Y MAB 731 El principal alergénico en polvo del hogar proviene de ácaros. Este ejemplo utiliza un alergénico clínicamente relevante y representativo para un modelo de asma. Alguien con experiencia en la técnica podría considerar este ejemplo y sus resultados para ser representativos de la eficacia de los anticuerpos en otros organismos, incluyendo seres humanos . En los días 1, 7 y 14 los ratones se inocularon con tres administraciones intratraqueales de HDM (100 µg) en 50 µl de PBS. En los días -1, 6 y 13, se administraron intraperitonealmente 623 ó 731 a las dosificaciones de 10, 3, 1, 0.3 mg/kg. Los ratones control recibieron PBS o un IgG2 irrelevante (por ejemplo, control negativo) como el control de isotipos a la dosificación de 10 mg/kg. En el día 17, se midió la reactividad de las vía respiratorias de los ratones a la administración intravenosa de acetilcolina según se describió anteriormente (Figura 8). n=2 ratones/grupo en el grupo PBS; n=3 ratones/grupo en los grupos HDM, HDM+IgG2; n=4 ratones/grupo en el grupo PBS+IgG2, n=6 ratones/grupo en los grupos HDM+731 (10 mg/kg), y HDM+731 (0.3 mg/kg); n=8 ratones/grupo en los grupos HDM+623 (10 mg/kg), HDM+623 (3 mg/kg), OVA+623 (1 mg/kg), HDM+623 (0.3 mg/kg), HDM+731 (3 mg/kg), y HDM+731 (1 mg/kg). Los datos son la media ± SE. Los resultados se muestran en la Figura 19. A la dosificación de 0.3 mg/kg 623 y 731 no tuvieron ningún efecto sobre la AHR inducida por HDM, mientras que las dosificaciones de 1 mg/kg y superiores inhibieron la AHR a los niveles de valores iniciales (Figura 19) . Debido a los pocos animales en los grupos de HDM y HDM+IgG2, la AHR medida en estos grupos fue muy variable (APTI 579 ± 463 y 415 ± 213 en los grupos de HDM y HDM+IgG2 respectivamente) . A la dosificación de 10 mg/kg, el mAb 623 redujo el porcentaje de células PAS+ en el pulmón de ratones inoculados con HDM a los valores iniciales (grupo PBS) . De forma similar, a lo descrito anteriormente, se examinó la sensibilidad a la dosis de la inhibición de la producción de mucosidad inducida por HDM mediante Ab 623 y mAb 731 en ratones con IL-13 humanizada. Los pulmones se recolectaron y se trataron como se describe con referencia a la Figura 14 y se examinaron. Los datos se expresan como el porcentaje promedio de células globet/broquios PAS-positivos . Los datos son la media ± SE. A la dosis de 10 /mg/kg, el mAb 623 redujo el porcentaje de células PAS+ a los valores iniciales, mientras que menores dosificaciones no fueron tan eficaces. A la dosis de 0.3 mg/kg de mAb 731 no tuvo ningún efecto sobre el porcentaje de células PAS+, aunque a dosis mayores, se redujo el porcentaje de células PAS+ a los niveles de valores iniciales (grupo PBS) (Figura 20). De una forma similar a los experimentos descritos anteriormente, se probaron el mAb 623 y el mAb 731 y se determinaron para inhibir la reunión de leucocitos inducida por HDM de una manera dependiente de la dosificación, iniciando a la dosis de 1 mg/kg (véase la Figura 21) . Se recolectó el BALF y los conteos celulares se realizaron como se describe con relación a los datos de la Figura 15. Los datos son la media ± SE. El control de isotipos provocó un aumento evidente en el número de leucocitos reunidos por los HDM en el BALF (497 ± 156 en comparación con 198 ± 42.103 células/ml de BALF en el grupo HDM+IgG2 y HDM respectivamente) .

ESTUDIO TERAPÉUTICO Y PROFILÁCTICO DE HDM CON DOSIS FIJA DE MAB 623 Este ejemplo demuestra la eficacia del mAb 623 como un terapéutico y profiláctico en el modelo de HDM. En este ejemplo, el mAb 623 se administró a la dosis fija de 100 µg/ratón de acuerdo con 3 diferentes programas: i) un día antes de cada uno de las inoculaciones con HDM (tratamiento profiláctico) ; ii) un día antes de la última inoculación con HDM y iii) en el mismo día de la última inoculación con HDM (tratamientos terapéuticos). El fenotipo alérgico se valoró 3 días después de la última inoculación con HDM. De esta forma, se determinaron el tiempo de administración del anticuerpo, y la eficacia resultante. En modalidades alternativas, este procedimiento se puede aplicar para otros anticuerpos . Los ratones se inocularon con tres administraciones intratraqueales de HDM (100 µg) en 50 µl de PBS en el día 1, 7 y 14. Se administraron intraperitonealmente el control de isotipo 623 o uno IgG2 a la dosificación de 100 µg/ratón de acuerdo con 3 diferentes programas: en los días -1, 6 y 13 (tratamiento profiláctico) , en el día 13 o en el día 14 (tratamiento terapéutico) . Los ratones control recibieron PBS o un IgG2 irrelevante como control de isotipos. En el día 17, la reactividad de las vías respiratorias a la administración intravenosa de acetilcolina e infiltración de leucocitos en BALF se valoraron como se describió anteriormente (con referencia a la Figura 8 y a la Figura 15) . n=8 ratones/grupo en los grupos PBS, HDM, HDM+IgG2 (día -1, 6 y 13), HDM+IgG2 (día 13), HDM+IgG2 (día 14), HDM+623 (día 13); n=10 en los grupos HDM+623 (día -1, 6 y 13), HDM+623 (día 14). Los datos son la media ± SE. Como se muestra en la Figura 22A, cuando se administra profilácticamente antes de cada inoculación con HDM, el mAb 623 inhibió completamente la AHR inducida por HDM. Además, 623 inhibió completamente la AHR inducida por HDM cuando se administró terapéuticamente en el día antes de la última inoculación de HDM. Por el contrario, la administración terapéutica en el mismo día de la última inoculación tuvo poco efecto sobre la AHR (Figura 22A) . El mAb 623 inhibió la reunión de leucocitos en el BALF cuando se administró profilácticamente antes de cada inoculación de HDM (Figura 22B) . Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, los ejemplos utilizados para caracterizar estos anticuerpos se pueden aplicar fácilmente a cualquier anticuerpo para IL-13 y la variante de los mismos. De esta forma, los ejemplos representan la forma de que alguien con experiencia en la técnica pudiera determinar fácil y rutinariamente ya sea un anticuerpo, o una variante de un anticuerpo expuesto en la presente, que pudiera funcionar en una actividad de IL-13 alternativa. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, mientras que los resultados anteriores con frecuencia se enfocan a los aspectos profilácticos de los anticuerpos, los métodos y resultados anteriores se pueden extender a los métodos para tratamiento como una terapia. Por ejemplo, una vez que se haya identificado un sujeto que este padeciendo de un trastorno relacionado con IL-13, se puede administrar una cantidad eficaz del anticuerpo. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, se pueden requerir cantidades adicionales del anticuerpo en comparación con la cantidad para un uso profiláctico. Por ejemplo, la cantidad además puede ser de 1-10, 10-100, 100-1000 veces o más superior a la cantidad para la prevención, descrita anteriormente. Esto se puede requerir en donde el trastorno de por resultado en grandes cantidades de IL-13 o cuando se hayan retirado grandes cantidades de IL-13 con el fin de reducir los síntomas del trastorno. En situaciones alternativas, se pueden requerir menores cantidades del anticuerpo para tratar a un sujeto con un trastorno relacionado con IL-13 que para evitar el trastorno. Por ejemplo, en situaciones en las cuales una dosificación individual del anticuerpo sea suficiente para unir y retirar prácticamente todo el exceso de IL-13, mientras tanto, para evitar el trastorno, puede tener que administrarse una cantidad similar, aunque se administre continuamente una cantidad. Adicionalmente, la cantidad se puede determinar de diversas formas, por ejemplo, una i.v., y la cantidad se puede administrar continuamente, si se desea. Los resultados anteriores son totalmente consistentes y sugiere el hecho de que los anticuerpos funcionarán como un terapéutico así también como un profiláctico. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, en algunas situaciones se pueden requerir dosis múltiples y/o continuas, por ejemplo, el tratamiento durante la vida del sujeto. Adicionalmente, como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, la naturaleza del hospedero particular también puede influir en la forma y cantidad de tratamiento. Por ejemplo, en un sujeto que sea crónico (naturalmente sensible al compuesto y no es necesario que se sensibilice al mismo) para un trastorno (por ejemplo, asma) , cantidades adicionales, proporcionadas por medios más eficientes (por ejemplo, i.v. en lugar de s.c.) durante un mayor periodo de tiempo, se puede esperar que tengan una mayor probabilidad de funcionamiento, a la luz de los resultados anteriores y el conocimiento de alguien con experiencia en la técnica. Por ejemplo, mientras que los modelos y dosificaciones anteriores pueden ser representativos de modelos agudos de infección, las dosificaciones anteriores pueden ser insuficientes cuando se administran como se describió anteriormente, en una forma de modelo crónico (por ejemplo, en monos que se hayan expuesto a diversos agentes durante periodos prolongados de tiempo) . Este resultado es consistente con lo que alguien con experiencia en la técnica podría esperar como niveles elevados de la IL-13 que podría requerir lógicamente cantidades adicionales del anticuerpo. Además, alguien con experiencia en la técnica podría esperar que, dadas las dosis mayores del anticuerpo, administradas muy frecuentemente, que los mismos o resultados similares, como se describió anteriormente, podrían resultar. Los solicitantes observaron que esto es consistente con los resultados mostrados en la publicación del PCT No. WO 2005/007699, que demuestra que mientras que bajos niveles de anticuerpos para IL-13 no fueron sustancialmente eficaces en modelos de mono, mayores niveles proporcionaron resultados significativos y predichos. Como se observó anteriormente, un método mediante el cual se pueden determinar los niveles de anticuerpos requeridos (para cualquier trastorno dependiente de IL-13) es a través de la supervisión de los niveles de biomarcadores en el sujeto. Los ejemplos de estos biomarcadores se describen en la presente .

EJEMPLO 19: CARACTERIZACIÓN DE BIOMARCADORES DEPENDIENTES DE IL-13: EFECTO DE MAB 623 SOBRE LOS NIVELES SÉRICOS DE TARC, EOTAXINA Y CÍO EN EL MODELO DE ASMA INDUCIDO POR OVA EN RATONES CON IL-13 HUMANIZADA Este ejemplo demuestra y verifica los biomarcadores séricos dependientes de IL-13 que se pueden utilizar en la preparación clínica. Se midieron los niveles séricos de TARC, CÍO y eotaxina inducida por OVA y se estudió el efecto de la inhibición de IL-13 sobre esos niveles. Se ha mostrado que IL-13 induce la liberación de TARC, CÍO, y eotaxina ( véase , por ej emplo, Ma et al., The C10/CCL6 chemokine and CCRl play critical roles in the pathogenesis of IL-13-induced inflammation and remodeling, J. Immunol . , 172 ( 3) : 1872-81 (2004); Zhu et al., IL-13-induced chemokine responses in the lung: role of CCR2 in the pathogenesis of IL-13-induced inflammation and remodeling, J. Immunol . 168 ( 6) : 2953-62 (2002); Nomura et al., Interleukin-13 induces thymus and activation-regulated chemokine (CCL17) in human peripheral blood mononuclear cells, Cytokin , . 20(2): 49-55 (2002); Zhu et al., Pulmonary expression of interleukin-13 causes inflammation, mucus hypersecretion, subepithelial fibrosis, physiologic abnormalities, and eotaxin production, J. Clin. Invest., 103 (6) :779-88 (1999))). Como se apreciará por alguien con experiencia en este campo, se podría utilizar la técnica señalada en este procedimiento para identificar también otros marcadores. Un estudio de asma inducido por OVA en ratones tipo silvestre A/J se realizó primero para establecer el tiempo de inducción sérica TARC, eotaxina y CÍO. En los días 1 y 7, los ratones se inmunizaron con OVA (25 µg OVA en 2 mg de Alum, ip) o Alum como control. En los días 14, 15 y 17, los ratones se anestesiaron con una mezcla de cetamina y xilazina [45 y 8 mg/kg, respectivamente] y se inocularon con OVA (750 µg en 50 µl, intranasal) o un volumen equivalente de PBS como un control. Se recolectó la sangre 3, 6 y 24 horas después de la inoculación final. Mediante ELISA se midieron los niveles séricos de TARC y eotaxina (Duoset, R&D System). Se midieron los niveles séricos de CÍO mediante ELISA emparedado. En resumen, las muestras séricas se valoraron 1:2 sobre placas recubiertas con el anticuerpo anti-ClO (R&D system) durante 1 hora. Se agregó el anticuerpo para detección de anti-ClO biotinilado (R&D system) , seguido por una incubación de 1 µg/ml de estreptavidina-HRP . Se determinó el CÍO capturado utilizando una reacción con sustrato TMB y se cuantificaron los valores en cada muestra a partir de una curva estándar en la placa. n=6 ratones/grupos. Los datos son la media ± SE. En el grupo OVA/OVA los niveles séricos de TARC y eotaxina se aumentaron a 3 y 6 horas en comparación con el grupo de Alum/PBS; los niveles séricos de TARC todavía se elevaron a 24 horas en comparación con el grupo Alum/PBS, aunque a un menor grado que a 3 y 6 horas; los niveles séricos de CÍO se aumentaron a 3, 6 y 24 horas en comparación con el grupo Alum/PBS, con inducción máxima a 24 horas (resultados mostrados en la Figura 23, Figura 24, y Figura 25). Después, se valoró la capacidad de la administración profiláctica de mAb 623 para inhibir los niveles séricos de TARC, eotaxina y CÍO utilizando ratones con IL-13 humanizados. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, esto se puede utilizar únicamente para los anticuerpos de la presente. Los ratones se inmunizaron de acuerdo con el protocolo de asma inducido por OVA descrito con referencia a la Figura 23, Figura 24, y Figura 25. Se administró el mAb 623 intraperitonealmente a la dosificación de 100 µg/ratón (5 mg/kg) en los días 13, 15 y 17 del estudio. Los ratones control recibieron PBS o un IgG2 irrelevante como control de isotipos. La sangre se recolectó ya sea a 1 y 4 horas o 2 y 6 horas después de la inoculación final. Se midieron los niveles séricos de TARC mediante ELISA (equipo Duoset, R&D system) . n=15 ratones/grupo en el grupo OVA (n=8 para el grupo de 1 y 4 horas y n=7 para el grupo de 2 y 6 horas) ; n=14 ratones/grupo en el grupo OVA+IgG2 (n=7 para el grupo de 1 y 4 horas y n=7 para el grupo de 2 y 6 horas) , n= 17 ratones/grupo en el grupo OVA+623 (n=8 para el grupo de 1 y 4 horas y n=9 para el grupo de 2 y 6 horas); n=15 ratones/grupo en el grupo Alum (n=7 para el grupo de 1 y 4 horas y n=8 para el grupo de 2 y 6 horas); los datos son la media ± SE. mAb. El mAb 623 inhibió la inducción de TARC, con una inhibición máxima en los puntos de tiempo de 2 y 4 horas (véase la Figura 26) . De esta forma, TARC parece ser un marcador adecuado . Para seguir la influencia sobre eotaxina, los ratones se trataron como se describió y se analizó anteriormente con referencia a la Figura 26. Se midieron los niveles de eotaxina sérica mediante ELISA (equipo Duoset, R&D system) . Los datos son la media ± SE. El mAb 623 inhibió la inducción de eotaxina a las 1, 2, 4 y 6 horas (véase la Figura 27). De esta forma, la eotaxina parece ser un marcador adecuado. Para seguir la influencia de los niveles de CÍO, los ratones se trataron como se describió anteriormente, haciendo referencia a la Figura 26. Los niveles séricos de CÍO se midieron mediante ELISA como se describe con referencia a la Figura 25. Los datos son la media ± SE. El mAb 623 tuvo poco efecto visible sobre los niveles de CÍO en cualquiera de los puntos de tiempo probados (Figura 28) . Se cree que, ya que CÍO tiene un tiempo mayor al pico (por ejemplo, como se muestra en la Figura 25) y probablemente se requiere este tiempo adicional para observar el impacto en CÍO a partir del anticuerpo como un biomarcador y para la utilización de CÍO como un biomarcador. De esta forma, mediante los métodos descritos anteriormente, alguien con experiencia en la técnica, podrá ser capaz de identificar fácilmente los marcadores adicionales que se pueden utilizar en los siguientes trastornos relacionados con IL-13 y el tratamiento de los mismos .

EJEMPLO 20: USO DE BIOMARCADORES EN UN SUJETO QUE ESTÁ RECIBIENDO MAB 623 Y/O MAB 731 Este ejemplo señala la forma en que un biomarcador, tal como por ejemplo, uno de los caracterizados anteriormente, se puede utilizar para supervisar y ajustar la cantidad o frecuencia de un anticuerpo que se administra al sujeto Se identificó un sujeto con asma. El sujeto se le administró una cantidad inicial de mAb 623 y/o 731, por ejemplo, 1-10 mg/kg, cada unidad de tiempo particular. Después de esto, se midieron los niveles de eotaxina en el sujeto cada hora vía ELISA. La cantidad y/o frecuencia del mAb administrado se aumentó hasta que se redujo el nivel de eotaxina a un nivel indicativo de un tratamiento adecuado para el sujeto. Este nivel puede ser cualquier disminución significativa, por ejemplo, cualquier disminución mostrada en los experimentos anteriores o la disminución máxima que se puede alcanzar a través de la administración del anticuerpo. Una vez que se observa esta disminución, la cantidad y/o frecuencia de administración del anticuerpo se puede mantener constante e incluso disminuir, si es lo adecuado. De esta forma, los biomarcadores pueden permitir determinar la cantidad óptima necesaria del anticuerpo. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, este ejemplo permite que alguien con experiencia en la técnica determine cuál cantidad sea suficiente o terapéuticamente suficiente del anticuerpo para cada sujeto. Al administrar una cantidad inicial de un anticuerpo, se puede aumentar la cantidad del anticuerpo, hasta que la presencia del biomarcador comience a declinar, identificando así, una cantidad terapéuticamente suficiente o dosis para el sujeto. Adicionalmente, esto también se puede utilizar para identificar cómo (por ejemplo, subcutáneamente, intramuscular, etc.), y con cuánta frecuencia (por ejemplo, 1, más de una vez, una dosis por unidad de tiempo, continuamente, etc.), el anticuerpo se debe administrar para el resultado deseado. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, se podrían utilizar cualquiera de los anticuerpos en cualquier trastorno relacionado con IL-13, en especial aquellos listados en la presente.

EJEMPLO 21: EL USO DE BIOMARCADORES COMO UN DIAGNOSTICO Este ejemplo detalla cómo se pueden utilizar los biomarcadores para identificar a un paciente con un trastorno relacionado con IL-13. Se identificó el nivel de eotaxina, de TARC, y/o CÍO presente en un individuo sano (por ejemplo, un sujeto sin un trastorno relacionado con IL-13). Después de esto, se caracterizó el nivel de eotaxina, TARC, y/de CÍO en otro sujeto. Aquellos con niveles elevados (en comparación con los individuos sanos) de eotaxina, TARC, y/o CÍO serán aquellos que puedan estar padeciendo de un trastorno relacionado con IL-13. Para una confirmación adicional, los sujetos con niveles elevados de eotaxina, TARC, y/o CÍO además pueden tener sus niveles de los otros biomarcadores en comparación con los niveles del otro biomarcador en un sujeto sano. De esta forma, este ejemplo proporciona un método que permite que alguien con experiencia en la técnica identifique a un paciente con un trastorno o enfermedad relacionado con IL-13. Alternativamente, el nivel de IL-13 en un sujeto o las propiedades de IL-13 en el sujeto se pueden examinar en comparación con aquellos sin un trastorno relacionado con IL-13. Por ejemplo, uno de los anticuerpos expuestos actualmente se puede utilizar como un diagnóstico, permitiendo que se detecte cualesquiera cambios en una IL-13 disponible del sujeto y ya sea comparando la cantidad detectada con una cantidad control estándar de salud, o para una cantidad de pre-enfermedad para el individuo (por ejemplo, un control interno). Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, en algunas modalidades, cada trastorno relacionado con IL-13 no necesariamente tendrá que estar asociado con un aumento en eotaxina, TARC o CÍO. Diferentes enfermedades podrían tener diferentes biomarcadores, algún subconjunto de los anteriores, y algún trastorno relacionado con IL-13 podría no tener biomarcadores en su totalidad. El ejemplo anterior se puede utilizar para ayudar a la identificación de un individuo que padece de uno de los trastornos relacionados con IL-13 analizados en la presente. De esta forma, en algunas modalidades, el uso de los detectores de biomarcadores (por ejemplo, anticuerpos para los biomarcadores) es como un diagnóstico. En otras modalidades, tales como aquellas descritas en el Ejemplo 5, los anticuerpos por sí mismos se pueden utilizar como una herramienta de diagnóstico para identificar a pacientes con niveles elevados de IL-13. Según se conoce el KD de los anticuerpos, se puede determinar la cantidad de la IL-13 en una muestra vía la unión de la IL-13 en una muestra al mAb.

EJEMPLO 22: DETERMINACIÓN DE TRASTORNOS RELACIONADOS CON IL-13 Este ejemplo demuestra un método mediante el cual se pude determinar si un trastorno es uno relacionado con IL-13 o un trastorno dependiente. Se identificó a un sujeto con un trastorno candidato. Esto se puede realizar mediante la selección aleatoria de un sujeto proveniente de una población. En la alternativa, se puede realizar al seleccionar un candidato que esté demostrando los síntomas que son característicos de uno de los trastornos expuestos en la presente. Se examinaron los niveles de eotaxina, TARC, y/o CÍO del sujeto. Al paciente se le administraron 10 mg/kg del mAb 623 ó 731. Se examinaron nuevamente los niveles de eotaxina, TARC, y/o CÍO del sujeto. Esto se puede repetir muchas veces. Si se observa una disminución en el nivel de los biomarcadores, entonces el trastorno se puede caracterizar como un trastorno relacionado con IL-13. En modalidades alternativas, se utiliza una mayor cantidad del anticuerpo en administraciones progresivas del anticuerpo. En modalidades alternativas, la totalidad de tres biomarcadores se examina y la totalidad de los tres deben mostrar disminuciones para el trastorno será caracterizado como un trastorno relacionado con IL-13. En modalidades alternativas, se correlaciona adicionalmente una disminución en los síntomas del trastorno candidato junto con la disminución en los biomarcadores. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, mientras que la presente solicitud ha señalado muchos anticuerpos y ha probado su funcionalidad, alguien con experiencia en la técnica podría ajustar fácilmente los anticuerpos mediante un solo aminoácido (o varios) y obtener un "nuevo" anticuerpo. Con el fin de probar estas variantes de anticuerpos, se puede repetir cualquiera o la totalidad de los ejemplos expuestos anteriormente para determinar si el anticuerpo funciona como se desea. Como se apreciará por alguien con experiencia en la técnica, los ejemplos anteriores señalan la forma de alcanzar ciertos resultados con anticuerpos particulares; sin embargo, a la luz de la presente enseñanza, alguien con experiencia en la técnica podrá ser capaz de aplicar fácilmente las otras modalidades, u otros anticuerpos similares en los ejemplos y modalidades anteriores.

EQUIVALENTES La especificación descrita anterior se considera que es suficiente para permitir que alguien con experiencia en la técnica practique la invención. La descripción anterior y los ejemplos detallan ciertas modalidades preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Sin embargo, se apreciará que no importa cómo lo detallado anteriormente pueda aparecer en el texto, la invención se puede practicar de muchas formas y la invención se debe interpretar de acuerdo con las reivindicaciones anexas y cualesquiera equivalentes de las mismas .

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un anticuerpo humano aislado que se une a IL-13, caracterizado porque el anticuerpo humano aislado se une a IL-13 humano con un KD menor a 170 pM. 2 El anticuerpo humano aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo humano aislado se une a la IL-13 con un KD menor a 50 pM. 3. El anticuerpo humano aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo puede inhibir la hipersensibilidad de las vías respiratorias. 4 El anticuerpo humano aislado según la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo permite una inversión completa de la hipersensibilidad de las vías respiratorias. 5. El anticuerpo humano aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo puede reducir la producción de mucosidad en el pulmón. 6. El anticuerpo humano aislado según la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo permite la reducción en al menos el 30% de la producción de mucosidad. 7. El anticuerpo humano aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo puede inhibir un trastorno relacionado con IL-13 seleccionado del grupo que consiste de: enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, enfisema y asma. 8. El anticuerpo humano aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se une al la IL-13 de tal forma que el anticuerpo interfiera con la unión de IL-13 a un receptor alfa 1 IL-13. 9. Un anticuerpo humano aislado para IL-13, caracterizado porque el anticuerpo se une a IL-13 y IL-13Q110R con un KD que es menor a 170 pM y se une tanto a IL-13 como a IL-13Q110R con los KD que están dentro del 50% de entre sí. 10 El anticuerpo humano aislado según la reivindicación 9, caracterizado porque el anticuerpo se une a IL-13 y IL-13Q110R con efectivamente el mismo KD. 11. El uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo humano que se une a IL-13 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno relacionado con IL-13, caracterizado porque el anticuerpo humano aislado se une a IL-13 con un KD no mayor a 170 pM. 12. El uso según la reivindicación 11, caracterizado porque el trastorno relacionado con IL-13 se selecciona del grupo que consistir de hipersensibilidad de las vías respiratorias, producción de mucosidad, asma o alguna combinación de los mismos. 13. El uso según la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo tiene un KD no mayor a 10 pM. 14 El uso según la reivindicación 11, caracterizado porque el trastorno relacionado con IL-13 es linfoma de Hodgkin. 15 El uso según la reivindicación 11, caracterizado porque la cantidad eficaz es al menos una cantidad suficiente para inhibir al menos alguna proliferación celular de HDLM-2, células L-1236, o alguna combinación de los mismos. 16. El uso según la reivindicación 11, caracterizado porque el trastorno relacionado con IL-13 se relaciona con la expresión de CD23. 17. El anticuerpo humano aislado según la reivindicación 1 ó 9, caracterizado porque el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que consiste de los aminoácidos 21-33, 109-121, 111-128, 45-108, 70-80, 83-92 ó 20-29 de la IL-13. 18. Un anticuerpo humano aislado que se une a la IL-13 de tal forma que reduzca la señalización de la IL-13 a través de una interacción con un receptor alfa 1 IL-13. 19. El anticuerpo humano aislado según la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo se une a la IL-13, la IL-13 se puede unir a un receptor alfa 2 IL-13, y en donde cuando el anticuerpo se une a la IL-13, el anticuerpo reduce la señalización de la IL-13 a través de la interacción de la IL-13 con el receptor alfa 1 IL-13. 20. El anticuerpo aislado según la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo, cuando se une a la IL-13 interfiere con la unión de IL-13 al receptor alfa 1 IL-13, en donde el anticuerpo, cuando se une a la IL-13 interfiere con la unión IL-13 para el receptor alfa 2 IL-13, y en donde el anticuerpo, cuando se une a la IL-13 permite que la IL-13 se una a un receptor IL-4.