KR102524577B1 - 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 및 이의 톨-유사 수용체 5(TLR5) 자극 활성을 이용한 용도에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 융합 단백질은 야생형 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체와 비교하여 톨-유사 수용체 5(TLR5) 경로 활성화능이 현저히 우수하여, TLR5 경로 활성화를 통해 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 질환의 치료제 개발 및/또는 백신 보조제 개발에 매우 유용하게 활용이 될 수 있다.

Description

플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도{Flagellin fusion protein and uses thereof}
본 발명은 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 및 이의 톨-유사 수용체 5(TLR5) 자극 활성을 이용한 용도에 관한 것이다.
편모(flagella)는 세균의 운동성을 결정하는 중요한 구성요소이며 크게 후크(hook), 기저체(basal body) 및 필라멘트(filament)로 구성되어 있다. 편모는 세균의 유영(swimming) 혹은 유주운동(swarming motility), 세균의 주성(taxis)을 결정하고, 바이오필름(biofilm)을 형성하여, 병원성 미생물의 부착능을 결정하는 기능이 있다고도 알려져 있다. 편모의 필라멘트를 구성하는 구성 단위 단백질을 플라젤린(flagellin)이라 하며, 플라젤린이 규칙적으로 조합되어(assembling) 필라멘트를 형성한다. Hayashi 등은 포유류가 발현하는 TLR5가 그람 음성 및 그람 양성 세균의 플라젤린을 인지하여 NF-κB를 활성화시킨다고 보고하였다(Hayashi F, Smith KD, Ozinsky A, Hawn TR, Yi EC, Goodlett DR, Eng JK, Akira S, Underhill DM, Aderem A: Nature 410:1099-1103, 2001).
플라젤린은 박테리아 편모의 채찍 줄기 모양의 필라멘트로 조립되는 구조 단백질로, 세포 표면에서 연장되어 박테리아가 움직일 수 있도록 기능한다. 플라젤린은 병원성 세균의 병원성 박테리아가 독성 인자로 작용하여 숙주 세포 내로 침투하고 침입하는 것을 촉진한다. 플라젤린은 박테리아에서 독점적으로 발견되며 편모성 박테리아(flagellated bacteria)에서 가장 풍부한 단백질 중 하나이기 때문에 플라젤린은 숙주 면역 감시의 주요 대상이 된다. 박테리아의 침입시, 플라젤린은 숙주에서 Toll-like receptor 5 (TLR5)와 NAIP5/NLRC4에 의해 검출되고 숙주에서 병원균의 즉각적인 제거에 기여하는 선천성 면역을 활성화시킨다.
TLR5는 세포 표면에 위치한 선천성 면역 수용체이며, 세포 외 leucine-rich repeat(LRR) 도메인, 막 횡단 도메인 및 세포 내 도메인으로 구성된다. TLR5는 플라젤린을 세포 외 도메인을 사용하는 병원체 관련 분자 패턴으로 인식하고 MyD88-의존성 신호전달 경로 및 NF-κB 매개 염증성 사이토카인 생성을 활성화시킨다.
플라젤린은 편모성-병원성 박테리아에 대한 첫 번째 방어선 역할을 하기 때문에 백신 담체 단백질 또는 백신 보조제 개발의 대상으로서 관심이 되어왔다. 항원과 플라젤린의 융합 단백질은 웨스트 나일 발열, 말라리아, 전염병 및 결핵을 비롯한 다양한 전염성 질병에 대한 실험용 백신으로 효과적임이 입증되었고, 플라젤린에 의한 TLR5 활성화는 또한 조혈 세포와 방사선으로 인한 위장 조직을 보호하고 암 세포의 생존과 성장에 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있다.
플라젤린은 2개 내지 4개의 도메인을 포함한다. 예를 들어, Bacillus subtilis Hag 편모, Pseudomonas aeruginosa A 형 FliC 편모, Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium FliC 플라젤린은 각각 2개 (D0 및 D1), 3개 (D0, D1 및 D2) 및 4개 (D0, D1, D2, 및 D3) 도메인을 포함한다. 이들에서 공통적인 D0 및 D1 도메인은 편모간 상호작용을 중재하여 편모 필라멘트의 중심에 위치해 있으며 필라멘트 형성의 기능적 중요성으로 인해 박테리아 종 사이에서 매우 높게 보존되어 있다. 플라젤린이 폴리머화 된 필라멘트가 아니라 플라젤린 단량체(monomer)가 TLR5를 활성화하기 때문에, 전술한 D0 및 D1 도메인이 TLR5의 주요한 자극제일 것이라고 생각되고 있다. 3 및 4-도메인의 플라렐린에서 D1 도메인은 편모 필라멘트의 표면에 있는 보조 도메인(D2 및 D3)으로 확장되어 필라멘트 형성에 거의 또는 전혀 기여하지 않는다. D0 및 D1 도메인과 달리, D2 또는 D3 도메인은 서열 및 구조에서 실질적인 변화를 나타내고, 적응성 면역을 활성화시키고 플라젤린 기반의 치료법에서 바람직하지 않은 독성을 유발하는 것으로 여겨지고 있다. 따라서 D0/D1을 함유한 방사선 치료 바이오 약물 CBLB502는 Salmonella flagellin에서 초가변영역(D2 및 D3 도메인)을 제거함으로써 개발되었다.
Bacillus subtilis 및 lostridium difficile과 같은 많은 그람-양성균은 초가변영역이 결핍된 플라젤린을 발현하므로 TLR5 활성화 및 플라젤린 중합에 필요한 최소영역(D0 및 D1 영역)을 편모성 필라멘트에 포함하기도 한다.
플라젤린-TLR5 상호작용 및 이의 세포성 결과는 살모넬라 플라젤린을 사용하여 광범위하게 연구되었다. Salmonella enterica subspecies enterica serovar Dublin flagellin D1-D2 영역(sdflagellin D1-D2)과 zebrafish TLR5의 N-말단 단편 사이의 복합체에 대한 구조적 및 생화학적 연구는 플라겔린과 TLR5가 '1 차 결합'을 통해서 1:1 복합체를 형성하고, 이후 '2 차 이량체화'를 통해 2:2 복합체로 동종이형화(homodimerize)되는 것으로 알려져 있다.
플라젤린과 TLR5의 상호작용에 대한 많은 연구 결과들을 토대로, 플라젤린의 변형을 통해 TLR5 활성화를 증대시키기 위한 연구들 또한 다양하게 진행되고 있으나, 플라젤린-TLR5 2:2 복합체 구조를 타겟으로 한 새로운 형태의 플라젤린 단백질에 대한 연구는 전무한 실정이다.
이에, 본 발명자는 플라젤린이 TLR5를 활성화시킴에 있어서 2:2 복합체 구조가 형성된다는 것에 주목하여 TLR5 활성화능이 향상된 새로운 형태의 단백질을 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 플라젤린과 면역글로불린 Fc가 융합된 새로운 형태의 융합단백질이 야생형(wild-type) 플라젤린, 공지된 플라젤린 단편 등과 비교하여 현저히 우수한 TLR5 활성화능을 나타냄을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 보조제를 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 보조제를 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명에서 상기 플라젤린은 편모성 세균이 감염된 경우에 감염된 숙주 내에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 보다 구체적으로 인체의 세포막 표면에 존재하는 톨-유사수용체 5(TLR5; Toll like receptor 5)는 상기 플라젤린과 상호작용을 통하여 세포 내 신호 전달을 유발하고, 이를 통하여 전사인자인 NF-kB의 발현이 증가되어 선천성 면역신호 활성화를 유도할 뿐만 아니라, 획득 면역 반응을 조절할 수 있다.
플라젤린 단백질은 예를 들어, 미국 특허 제6,585,980호, 제6,130,082호; 5,888,810; 5,618,533; 4,886,748 및 미국 특허 공개 번호 US2003/0044429 A1; 및 Donnelly등 (2002) J. Biol. Chem. 43:4045 등을 통해서 잘 공지되어 있다. 대부분의 그람-음성 박테리아는 편모를 발현하는데, 이는 운동성을 제공하는 표면 구조이다. 편모는 기초 몸체, 필라멘트 및 이 둘을 연결하는 갈고리로 구성된다. 필라멘트는 단일 단백질인 플라젤린의 긴 중합체로 이루어지며 끝에 작은 캡 단백질이 형성되어 있다.
플라젤린의 중합은 N-및 C-말단에서 보존된 영역에 의해 매개되는 반면, 플라젤린 단백질의 중간에 위치한 초가변영역(hypervariable region)은 종간의 서열 및 길이가 매우 다양하다.
본 발명에서 상기 플라젤린은 임의의 적합한 박테리아로부터 유래된 플라젤린일 수 있다. 당업계에서는 다수의 플라젤린 유전자가 클로닝되고 서열화되어 있어 이들이 참고될 수도 있다.
본 발명에서 상기 플라젤린의 비제한적인 공급원으로는 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 세라티아(Serratia) 속, 시겔라(Shigella) 속, 트레포네마(Treponema) 속, 레기오넬라(Legionella) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 바르토넬라(Bartonella) 속, 프로튜스(Proteus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 여시니아(Yersinia) 속, 캄필로박터(Campylobacter) 속, 로세부리아(Roseburia) 속 또는 마리노박터(Marinobacter) 속 미생물을 들 수 있으며, 바람직하게는 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속 또는 비브리오(Vibrio) 속 미생물을 들 수 있다.
더 바람직하게는, 본 발명에서 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 세라티아 마세센스(Serratia marcesens), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 보렐리아 버그도페레이(Borrelia burgdorferei), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바르토넬라 클라리제이애(Bartonella clarridgeiae), 프로튜스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에스테리키아 콜라이(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 여시니아 페스티스(Yersinia pestis), 캄필로박터(Campylobacter spp), 로세부리아(Roseburia spp) 또는 마리노박터(Marinobacter spp) 유래의 플라젤린일 수 있으며,
보다 더 바람직하게는, 본 발명에서 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans) 유래의 플라젤린일 수 있으며,
가장 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 플라젤린일 수 있다.
TLR5는 편모 필라멘트 조립 및 운동에 필요한 박테리아 플라젤린의 진화적으로 보존된 부위를 인식하지만 일부 α 및 ε Proteobacteria (Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, and Bartonella bacilliformis)의 플라젤린은 TLR5에 인식되지 않는 것으로 다음과 같은 논문들을 통해 보고되고 있다. [(2003) Microbes Infect. 5 , 1345-1356.; J. Infect. Dis. 189 , 1914-1920.; (2002) Nat. Rev. Cancer 2 , 28-37; (2001) Clin. Infect. Dis. 32 , 1201-1206. pmid:11283810]. TLR5에 인식되는 박테리아의 플라젤린들은 D0와 D1 도메인에 주요 아미노산 서열이 유사하게 보존되어 있으며 TLR5에 인식되지 않는 박테리아의 플라젤린에서는 아미노산 서열이 다르다(PNAS June 28, 2005 102 (26) 9247-9252; Scientific Reports | 7:40878 | DOI: 10.1038/srep40878). 따라서, 본 발명에서 상기 플라젤린은 D0 및 D1 도메인에 TLR5에 의해 인식되는 보존된(conserved) 서열을 포함하고 있는 플라젤린일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 종래 보고된 논문들을 참고하여 TLR5에 인식되는 공통적인 아미노산 서열이 D0 및 D1 도메인에 보존되어 있는 대표적인 박테리아 5종의 플라젤린을 Fc-융합단백질로 제작하였다.
플라젤린의 N-말단 및 C-말단 불변 영역은 당해 기술 분야에서 그 특징이 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Mimori-Kiyosue et al., (1997) J. Mol. 바이롤. 270: 222-237; Iino et al., (1977) Ann. Genet. 11: 161-182; 및 Schoenhals 등 (1993) J. Bacteriol. 175: 5395-5402을 참고할 수 있다. 당업자에 의해 잘 이해되는 바와 같이, 불변 영역의 크기는 플라젤린 단백질의 공급원에 따라 다소 변할 수 있다. 일반적으로, N-말단 불변 도메인은 단백질의 약 170 개 또는 180 개의 N-말단 아미노산을 포함하는 반면, C-말단 불변 도메인은 전형적으로 약 85 내지 100 개의 C-말단 아미노산을 포함한다. 중심의 초가변영역은 박테리아 사이의 크기와 순서에 따라 상당히 다양하며, 분자 질량의 차이 대부분이 상기 초가변영역에 의해서 설명될 수 있다. 다양한 박테리아로부터 유래된 플라젤린 단백질의 N- 및 C-말단 불변 영역은 공지되어 있고, 아직 공지되지 않은 박테리아 유래의 플라젤린 또한 통상의 기술자가 당업계에 공지된 테크닉을 이용하여 플라젤린 단량체의 결정 구조를 쉽게 규명할 수 있다.
본 발명에서 "플라젤린", "플라젤린 N-말단 불변 영역" 및 "플라젤린 C- 말단 불변 영역"이란 용어는 상기 예를 든 박테리아 중 임의의 것으로부터 유래한 플라젤린 활성 단편 및 변이체를 포함한다. 또한, 야생형(wild-type)의 플라젤린 또는 플라젤린의 일 부분은 안전성 및/또는 면역 반응을 증가시키기 위해 및/또는 클로닝 절차 또는 다른 실험실 조작의 결과로서 변형될 수 있으며 이러한 변형들(또는 변이체) 또한 본원발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서, 상기 플라젤린은 전장(full-length) 플레젤린을 포함하거나, 또는 이의 활성 단편(active fragment)을 포함할 수 있다. 또한, "플라젤린", "플라젤린 N-말단 불변 영역" 및 "플라젤린 C- 말단 불변 영역"등의 용어는 자연 발생 아미노산 서열을 포함하거나, 각각 자연적으로 발생하는 플라젤린, 플라젤린 N- 말단 불변 영역 또는 플라젤린 C- 말단 불변 영역의 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나 유사한 아미노산 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에서 플라젤린, 플라젤린 N-말단 불변 영역, 플라젤린 C-말단 불변 영역 또는 플라젤린의 다른 어떤 부분의 "활성 단편"은 적어도 약 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250 또는 300개 이상의 인접 아미노산 및/또는 인접한 아미노산의 약 300, 250, 200, 150, 125, 100 또는 75 개 미만의 아미노산을 포함하며, 하한이 상한보다 작은 한 이들의 조합도 포함할 수 있다. 상기 활성 단편은 숙주 내에서 TLR5 경로를 활성화시키는 작용을 나타낼 수 있는 단편을 의미할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 활성 단편은 전장 플라젤린의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 활성 단편은 TLR5 경로 활성능을 나타내는 플라젤린의 적어도 한 부분을 의미하는 것일 수 있다. 상기 “적어도 한 부분”이란 플라젤린의 도메인 0, 1, 2 및 3에서 TLR5 경로 활성능을 나타내는 부분을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 활성 단편이란 전장 플라젤린에서 초가변영역(hypervariable region)이 제거된 것일 수 있다. 상기 초가변영역이란 플라젤린의 유래가 되는 박테리아의 종류에 따라서 달라질 수 있으며, 특정 플라젤린의 전체 서열 중 초가변영역에 해당하는 서열은 통상의 기술자가 용이하게 파악하여 제거할 수 있다. 예를 들어, N-말단 도메인 0, 1, 2; 도메인 3; 및 C-말단 도메인 2, 1, 0을 포함하는 전장 플라젤린의 경우 도메인 3, 또는 도메인 2 및 3이 초가변영역일 수 있으며, N-말단 도메인 0, 1; 도메인 2; C-말단 도메인 1, 0을 포함하는 전장 플라젤린의 경우 도메인 2가 초가변영역일 수 있다. 또는, 초가변영역이 포함되지 않은 형태의 플라젤린의 경우(예를 들어, 많은 그람-양성균 유래의 플라젤린은 초가변영역이 포함되지 않을 수 있다.)에는 플라젤린 단백질의 접힘(folding)이 일어나는 힌지(hinge) 영역의 서열이 일부 제거된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “초가변영역”은 프로펠러(propeller) 도메인 또는 부위(region), 힌지(hinge), 초가변부위, 가변(variable) 도메인 또는 부위 등으로 표현될 수도 있다.
본 발명에서, 상기 초가변영역에 제거되었다는 것은 초가변영역에 해당되는 도메인 전체가 제거된 것일 수 있으며, 또는 초가변영역의 서열 중 일부가 제거된 것일 수도 있다.
본 발명에서, 상기 활성 단편이란 야생형 플라젤린의 초가변영역이 제거되고, 제거된 초가변영역에 인공의 서열(즉, 인공서열의 힌지 또는 링커)이 삽입된 형태의 플라젤린일 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 상기 플라젤린 단편은 야생형(wild type) 플라젤린의 C-말단 도메인 0, C-말단 도메인 1, C-말단 도메인 2, N-말단 도메인 2, N-말단 도메인 1, N-말단 도메인 0 및 상기 각 도메인들과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내는 부분(region)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하면서 TLR5 경로 활성능을 나타내는 단편을 의미할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 플라젤린의 활성 단편은 전장 플라젤린의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명은 또한 야생형 플라젤린의 전장 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에서 변이체란 야생형의 플라젤린 또는 이의 단편 단백질의 일부 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성(즉, TLR5 경로 활성화능)을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
경우에 따라서, 본 발명의 상기 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)된 전장 플라젤린 또는 이의 단편일 수도 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 플라젤린 또는 이의 단편의 변이체는 전장 플라젤린 또는 이의 단편의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 이의 단편과 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 이의 단편과 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 다른 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 플라젤린은 하나 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 상기 항원의 비제한적인 예시로는 S. pneumoniae PspA1 항원, S. pneumoniae PspA2 항원, S. pneumoniae PspA3 항원, S. pneumoniae PspA4 항원, S. pneumoniae PspA5 항원 및/또는 S. pneumoniae PspA6 항원을 들 수 있다. 또는, 예를 들어, 상기 플라젤린은 하나 이상의 면역 조절성 물질이 결합된 융합 단백질의 형태일 수 있다. 상기 면역 조절성 물질은 당업계에서 면역반응을 증가시키는 것으로 알려진 것이라면 제한없이 포함될 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로는 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터페론-ω, 인터페론-τ, 인터류킨-1α, 인터류킨-1β, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-4, 인터류킨-5, 인터류킨-6, 인터류킨-7, 인터류킨-8, 인터류킨-9, 인터류킨-10, 인터류킨-11, 인터류킨-12, 인터류킨-13, 인터류킨-14, 인터류킨-18, B세포 성장 인자, CD40 리간드, TNF- α, TNF- β, CCL25, CCL28 또는 이의 활성 단편 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “퍼센트(%) 서열 상동성”은 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 기준 폴리펩타이드 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의한다. 퍼센트 아미노산 상동성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법, 예를 들어 참고문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 외, eds., 1987)]에 기재된 방법, 및 블라스트(BLAST), 블라스트-2, 얼라인(ALIGN) 또는 메갈라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본 명세서에서의 목적을 위해, 주어진 아미노산 서열 B와 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 퍼센트(%) 아미노산 서열 상동성은 다음과 같이 계산된다: 분율(fraction) X/Y의 100 배, 여기서 X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일하게 일치하는 아미노산 잔기 점수의 수이며, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 퍼센트(%) 아미노산 서열 상동성은 B 대 A의 퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성과 같지 않음을 이해할 것이다.
특정 실시양태에서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 "Fc 영역"은 면역글로불린 연쇄 불변 영역의 C-말단 부분을 의미하고, 구체적으로는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 또는 이의 일부를 의미한다.
본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 당쇄의 제거(Deglycosylation)는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성 (hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래일 수 있다.
한편, 본 발명에서 조합(combination)이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이 드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 인간 면역글로불린 IgG1의 Fc로부터 유도된 것일 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 중쇄 불변영역의 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질 제조에 이용될 수 있는 면역글로불린 Fc 영역은 (a) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인; (b) CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인; (c) CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH4 도메인; (d) CH1 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인; (e) CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인; (f) CH1 도메인 및 CH4 도메인; (g) CH1 도메인 및 CH3 도메인; (h) CH1 도메인 및 CH2 도메인; (i) CH2 도메인 및 CH4 도메인; (j) CH2 도메인 및 CH3 도메인; (k) CH3 도메인 및 CH4 도메인; 또는 2개 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역의 조합을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역의 CH2 및 CH3 도메인으로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명은 인간 면역글로불린 Fc 영역 이외에도 GenBank 및/또는 EMBL 데이터베이스에 개시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열, 예를 들어 AF045536.1(Macaca fuscicularis), AF045537.1(Macaca mulatta), AB016710(Felix catus), K00752(Oryctolagus cuniculus), U03780(Sus scrofa), Z48947(Camelus dromedarius), X62916(Bos taurus), L07789(Mustela vision), X69797(Ovis aries), U17166(Cricetulus migratorius), X07189(Rattus rattus), AF57619.1(Trichosurus vulpecula) 또는 AF035195(Monodelphis domestica) 등을 포함하는 다른 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 단편 서열도 이용될 수 있다.
본 발명에서 상기 융합단백질은 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단 또는 C-말단이 상기 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 결합된 것일 수 있다. 구체적으로 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단이 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단에 결합된 것이거나, 또는 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 C-말단이 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 결합된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 C-말단이 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 결합된 것일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 6 또는 7의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
한편, 본 발명에서 융합 단백질을 구성하는 각 구성요소, 즉 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체, 및 면역글로불린 Fc 영역은 서로 직접 연결되거나 링커를 통해 연결될 수 있다. 일반적으로, 용어 “링커”는 하나 이상의 분자, 예를 들면, 하나 이상의 성분 도메인 사이에 삽입될 수 있는 핵산, 아미노산 또는 비-펩타이드 잔기를 의미한다. 예를 들어, 링커는 조작을 용이하게 하기 위해 성분간에 관심있는 바람직한 부위를 제공하는데 사용될 수 있다. 링커는 또한 형질전환체로부터 융합 단백질의 발현을 증진시키고, 성분이 이의 최적의 3차 구조를 취하고/취하거나 표적 분자와 적절하게 상호 작용할 수 있도록 입체 장애를 감소시키기 위해 제공될 수 있다. 링커 서열은, 수용체 성분에 자연적으로 연결된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 융합 단백질의 발현을 증진시키기 위해, 특이적으로 관심있는 바람직한 부위를 제공하기 위해, 성분 도메인이 최적의 3 차 구조를 형성할 수 있도록 하기 위해, 및/또는 성분과 이의 표적 분자와의 상호 작용을 증진시키기 위해 사용되는 첨가된 서열일 수 있다.
바람직하게는, 상기 링커는 융합 단백질 내의 각각의 구성요소의 구조를 간섭하지 않고 융합 단백질의 유연성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 잔기는 2 내지 100 개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드 링커이다. 예시적인 링커는 Gly-Gly, Gly-Ala-Gly, Gly-Pro-Ala, Gly (G)n 및 Gly-Ser (GS) 링커와 같은 적어도 2 개의 아미노산 잔기를 갖는 선형 펩타이드를 포함한다. 본 명세서에 기재된 GS 링커는 (GS)n, (GSGSG)n, (G2S)n,G2S2G, (G2SG)n, (G3S)n, (G4S)n, (GGSGG)nGn, GSG4SG4SG 및 (GGGGS)n을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 n은 1 이상이다. (G)n 링커의 하나의 예는 G9 링커를 포함하며, (GGGGS)n 링커의 예시는 GGGGS 또는 (GGGGS)3 링커를 포함한다. 적합한 선형 펩타이드는 알라닐 및/또는 세리닐 및/또는 프롤리닐 및/또는 글리실 아미노산 잔기로 구성된 폴리글리신, 폴리세린, 폴리프롤린, 폴리알라닌 및 올리고펩타이드를 포함한다. 링커 잔기는 본 발명에 개시된 융합 단백질의 구성성분을 연결시키는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 링커는 서열번호 8 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 기재된 융합 단백질은 숙주 세포로부터 융합 단백질을 분비하기 위해 기능하는 신호 펩타이드를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 신호 펩타이드를 포함하지 않는다.
또한, 본 발명에서 기술된 융합 단백질은 단백질 결합 펩타이드의 변형된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질 성분은 예를 들어 임의의 단백질 결합 펩타이드에 대한 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화 및 인산화를 포함하는 번역 후 변형을 가질 수 있다.
다른 언급이 없는 한, 본 발명의 융합 단백질은 그 자체로 생균, 사멸 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스 벡터화 백신의 일부가 아닌 폴리펩타이드 (또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)로서 투여된다. 또한, 달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 융합 단백질은 분리된 융합 단백질로서, 예를 들어, 편모에 혼입되지 않는다.
본 발명에 있어서 “융합”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 구성하는 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서 상기 융합 단백질은 서열번호 10 내지 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 한 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기 조합이 특별히 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함하여 단쇄 또는 이중쇄의 형태의 핵산분자로서 제공될 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17 내지 23으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터는 통상의 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것으로, 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제기원을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
상기 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)을 이용할 수 있다.
상기 용어'형질전환체'는'숙주세포'등과 호환성 있게 사용될 수 있으며, 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.
본 발명에서 상기 형질전환체는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 종류의 단세포 유기체, 예컨대 각종 박테리아 (예컨대, Clostridia속, 대장균, 등) 등의 원핵세포 미생물, 효모 등의 하등 진핵세포 미생물과 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 융합 단백질은 야생형 플라젤린과 비교하여 현저히 향상된 TLR5 경로 활성화능을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 상기 융합 단백질은 TLR5 경로의 활성화를 통해 예방, 개선 또는 치료가 가능한 것으로 공지된 질환, 증후군 등에 대하여 예방, 개선 또는 치료효과를 나타낼 수 있다.
TLR5 경로의 활성화를 통해 예방, 개선 또는 치료가 가능한 것으로 공지된 질환, 증후군은 방사선 노출에 의한 손상; 재관류 손상; 염증성 장 질환; 자가면역질환; 바이러스 감염; 노화; 면역기능 감퇴; 또는 암일 수 있다.
따라서, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 방사선 노출에 의한 손상 예방 또는 치료용; 재관류 손상 예방 또는 치료용; 염증성 장 질환 예방 또는 치료용; 자가면역질환 예방 또는 치료용; 바이러스 감염 예방 또는 치료용; 노화 예방 또는 치료용; 면역기능 증강용; 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.
특히, 본 발명의 상기 융합 단백질은 TLR5 경로 활성화를 통해 예방, 개선 또는 치료가 가능한 것으로 향후 밝혀질 질환에 대해서도 예방, 개선 또는 치료 효과를 발휘할 것으로 이해될 수 있으므로, 본 발명의 상기 약학적 조성물의 치료 대상 질환은 그 범위가 특별히 제한되는 것은 아니다.
TLR5 경로의 활성화와 방사선 노출에 의한 손상 치료와의 관련성은 KR20067010934A 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 재관류로 인한 조직 손상 치료와의 관련성은 US8324163 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 염증성 장 질환 치료와의 관련성은 US7361733 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 자가면역질환 치료와의 관련성은 EP03010523B1 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 바이러스 감염 치료와의 관련성은 US9872895 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 노화로 인한 질환과의 관련성은 KR20150049811A 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 면역 증진과의 관련성은 WO17031280A1 등을 참고할 수 있으며, TLR5 경로의 활성화와 암 치료와의 관련성은 KR20177005615A 등을 참고할 수 있다.
본 발명에서 상기 방사선 노출에 의한 손상은 방사선 노출에 의한 위장 증후군 또는 조혈 증후군일 수 있다.
본 발명에서 상기 노화에 의한 질환은 노화에 의한 탈모, 백내장, 탈장, 대장염, 골다공증 또는 골연화증일 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 유방암, 폐암, 결장암, 신장 암, 간암, 난소 암, 전립선 암, 고환암, 비뇨 생식관 암, 림프계 암, 직장암, 췌장암, 식도암, 위암, 자궁 경부암, 갑상선암, 피부암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모발세포 림프종, 조직구 림프종 및 버킷 림프종, 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상증후군, 골수성 백혈병, 전골수구백혈병, 성상세포종, 신경아세포종, 신경 교종, 신경초종, 섬유육종, 횡문근육종, 골육종, 색소성 건피증, 각질극 세포종, 정상피종, 갑상선 여포암, 기형암종, 또는 위장관의 암일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 융합 단백질 외에 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 물질을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 “경피 투여”는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 나열한 각 질환들의 예방 또는 치료하는 효과가 있는 공지의 물질과 병용하여 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 보조제를 제공한다.
백신보조제(adjuvant)의 가장 중요한 요건 중의 하나가 항원제공세포 표면의 공동자극 분자 발현 조절과 항원 특이적 T 세포의 유도로 인한 사이토카인 분비조절과 같은 면역조절기능을 가지고 있는 것이다.
그런데, TLR5와 같은 PRR은 숙주세포의 세포 표면 혹은 세포질 내에 분포하며, 다양한 PAMP의 자극에 의해 '선천성 면역 반응(innate immune response)'을 유도하고 나아가 '획득 면역 반응(adaptive immune response)'을 조절한다. 따라서, TLR5 작동제(agonist)들은 다양한 '면역 조절제', 특히 '백신 보조제' 개발에 적합한 표적이 될 수 있다.
따라서, TLR5 경로 활성화능이 있는 본 발명의 융합 단백질은 TLR5 경로를 활성화하여 선천성 면역 반응 및 획득 면역 반응을 증강시킴으로써, 함께 투여된 항원에 대한 숙주의 면역능이 월등히 향상될 수 있다.
본 발명이 상기 백신 보조제는 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법으로 제조될 수 있고, 당업계에서 백신 제조 시 사용할 수 있는 여러 첨가물들을 임의로 더 포함할 수도 있다.
본 발명이 제공하는 융합 단백질은 야생형 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체와 비교하여 톨-유사 수용체 5(TLR5) 경로 활성화능이 현저히 우수하여, TLR5 경로 활성화를 통해 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 질환의 치료제 개발 및/또는 백신 보조제 개발에 매우 유용하게 활용이 될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 제공하는 다양한 미생물 유래의 플라젤린(flagellin)과 human IgG4-Fc(hIgG4)의 Fc융합 플라젤린 제작을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 2는 제작한 미생물 유래의 Fc-hIgG4-flagellin의 융합을 확인하기 위해 각 균주의 콜로니를 배양하여 효소로 절단 후 각각의 균주의 flagellin과 벡터의 사이즈 확인을 통해 클로닝을 확인한 결과이다(BS, BsFlagellin; EC, EcFlagellin; PA, PaFlagellin; SD, SdFlagellin; SH, ShFlagellin).
도 3은 각각의 Fc-hIgG4-flagellin 융합 단백질이 이량체(dimer)를 형성하는 것을 보여주는 결과이다.
도 4는 각 미생물 유래의 Fc-hIgG4-flagellin 융합단백질들에 의한 TLR5-의존적 NF-
Figure 112020041183654-pat00001
B 활성을 비교하여 나타낸 결과이다.
도 5는 가장 높은 TLR5의 활성을 유도하는 Bsflagelliln의 동물 실험을 위해 제작한 Fc-mIgG1-Bsflagellin의 제작 모식도이다. 길이가 다른 2개의 링커를 사용하여 융합단백질을 제작하였다.
도 6은 길이가 다른 2개의 링커를 이용하여 제작한 Fc-mIgG1-Bsflagellin의 클로닝을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 융합단백질의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과이다(#1: Fc-mIgG1-링커-bsflagellin, #2: Fc-mIgG1-링커*3-bsflagellin).
도 8은 본 발명의 융합단백질이 이량체(dimer)를 형성하는지 여부를 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과이다.
도 9는 Fc 융합된 bsflagellin (mIgG1-Fc2-Bsflagellin)과 Bacillus subtilis의 정제된 flagellin 단백질(FLA-BS), 및 Salmonella typhimurim의 정제된 flagellin 단백질의 (FLA-ST) NF-κB 활성화능을 평가한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: Fc-flagellin 융합단백질의 제작 (클로닝)
(1) 실험방법
다양한 미생물 유래의 플라젤린과 항체의 Fc 영역이 융합된 Fc-flagellin융합단백질을 제작하고자 하였다(도 1).
도 1에 나타낸 바와 같은 Bacillus subtilis (Bs), Salmonella dublin (Sd), Pseudomonas aeruginosa (Pa), Shigella flexneri (Sf) 및 Escherichia coli (Ec) 유래의 플라젤린이 human IgG4-Fc(hIgG4)에 결합된 형태를 각각 발현하는 플라스미드를 제작하기 위해 아래 방법에 따라 클로닝을 진행하였다.
1) 아래 표 1에 나타낸 조건에 따라 EcoRV 및 NcoI 제한 효소 자리 프라이머(표 2)를 이용하여 모든 플라젤린에 대해 PCR을 수행하였다:
Figure 112020041183654-pat00002
Figure 112020041183654-pat00003
2) 상기 PCR product에 10x DNA dye 4.4 uL를 첨가한 후 Gel Electrophoresis를 수행하고, 사이즈를 확인하여 플라젤린 밴드를 MEGAquick-spinTM plus (cat#17290)를 이용하여 추출하였다.
3) 정제된 DNA를 아래 표 3의 조건에 따라 EcoRV와 NCoI로 절단하였다:
Figure 112020041183654-pat00004
4) 상기 vector cut 샘플에 1ul의 Caff Alkaline Phosphatase를 첨가하고 37
Figure 112020041183654-pat00005
에서 2시간 반응하였다.
5) 10x DNA dye 4.4 uL 를 첨가하여 Gel Electrophoresis 후 MEGAquick-spinTM plus (cat#17290)를 이용하여 각 밴드를 추출하였다.
6) 벡터: 인서트=1:3의 분자비로 맞추어 아래 표 4의 조건에 따라 라이게이션을 진행했다.
Figure 112020041183654-pat00006
7) Zeocin(+) LB plate에서 형질전환을 하고, 18시간 동안 배양하였다.
8) Mini Prep을 진행하고 EcoRV 및 NcoI를 이용해 효소 절단을 수행했다.
(2) 실험결과
먼저 각 콜로니(colony)를 3개씩 따서 gel electrophoresis 진행한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, Bsflagellin, Ecflagellin, Paflagellin, Sdflagellin, Shflagellin 5종류 모두 vector size가 일치함으로 확인하였고, 시퀀싱을 통해서 변이(mutation) 없이 서열이 100% 일치함을 확인하였다.
실시예 2: Fc-hIgG4-flagellin 융합단백질의 제작 (분리 정제)
(1) 실험방법
- Protein A Resin [Repligen, #10-2500-01] 5 mL을 20 mL의 Binding Buffer (pH 5.0; contains 0.02% sodium azide) [Thermo Fisher Scientific, 21019]로 총 3회 세척해준다.
1) 세척 시 매회 5분 동안 Resin을 자연적으로 가라앉도록 한 후, 상층액을 제거한다.
- 세척된 Resin은 Disposable Columns [Thermo Fisher Scientific, 29920]에 천천히 부어준다. 준비된 Column에 Binding Buffer를 부어서 Column과 Resin을 동일한 상태로 만들어준다.
- 그 후에 상온에서 준비된 세포 배양액을 Column에 천천히 흘려준다. 그리고 천천히 용액을 Column밖으러 흘려 내보낸다. 세포 배양액이 모두 빠지면 Binding Buffer로 Column을 세척해준다.
- Elution 전에 미리 microfuge tube에 중화 용액 (1M Tris, pH 9.2)을 담아둔 다음에, Column을 준비된 microfuge tube에 대고 Elution Buffer (pH 2.8; amine-based)[Thermo Fisher Scientific, 21004]를 Resin이 잘 섞이도록 넣어준다. Resin이 모두 다 가라앉을 때까지 기다린 후에, 용액을 천천히 흘려 내보내다.
- 분리된 단백질의 완충용액을 Phosphate Buffered Saline (PBS)로 바꾸기 위하여 Spin Desalting Column [Thermo Fisher Scientific, 89891]을 사용한다.
1) PBS를 5 ml씩 총 5회 Column에 넣어 평형화 (equilibrate) 시킨 다음에 추출된 단백 용액을 Column에 천천히 부어주고 처음 용액의 일부는 흘려 내보낸다. 다시 Column에 PBS 용액을 첨가하고 천천히 용액을 새 tube에 취득한다.
- Endotoxin Removal Spin Column [Thermo Fisher Scientific, 88273]을 이용하여 단백 용액에 존재하는 endotoxin을 제거한다.
1) Spin Column을 tube에 넣고 500 g의 속력으로 1분 동안 원심 분리하여 안에 든 용액을 비워준 다음에 2M Sodium Chloride (NaCl)을 넣고 Resin이 용액에 현탁 될 때까지 Column을 천천히 흔들어준다. Column을 tube에 넣고 500 g의 속력으로 1분 동안 원심 분리하여 안에 든 용액을 비워준다.
2) Resin에 endotoxin이 없는 순수한 물을 첨가하여 용액이 현탁 될 때까지 Column을 천천히 흔들어준 다음에 Column을 tube에 넣고 500 g의 속력으로 1분동안 원심 분리하여 안에 든 용액을 비워준다.
3) 그 후에 endotoxin이 없는 Buffer (25mM Sodium Phosphate, pH 7.0)를 첨가하고 Resin이 용액에 현탁 될 때까지 Column을 천천히 흔들어준다. Column을 tube에 넣고 500 g 속력으로 1분 동안 원심 분리하여 안에 든 용액을 비워준다. 이 과정은 두 번 반복한다.
4) 추출한 단백질 용액을 천천히 부어주고 Resin이 용액에 현탁 될 때까지 Column을 천천히 흔들어준 다음에 4℃에서 1시간 동안 Column을 부드럽게 위아래가 섞이도록 돌리면서 배양해준다.
5) Column을 tube에 넣고 500 g의 속력으로 1분동안 원심 분리하여 안에 든 용액을 tube에 취득한다.
- LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit [Thermo Fisher Scientific, 88282]를 사용하여 정제된 단백 용액의 endotoxin 정도를 측정한다.
1) 37℃에서 96-well plate에 표준 곡선 (standard curve)을 측정하기 위하여 endotoxin이 없는 순수한 물 (0 EU/mL)과 표준 단백 용액(0.1, 0.25, 0.5, 1 EU/mL)을 well에 각 50 μL씩 넣는다.
2) 정제된 단백 용액은 각 시료당 2개 well에 50 μL씩 넣는다.
3) 각 well에 Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 시약을 50 μL씩 첨가한 후 plate를 천천히 흔들어 섞어주고 37℃에서 10분 동안 배양한다. 10분 후 각 well에 Chromogenic Substrate 시약을 100 μL씩 넣고 plate를 천천히 흔들어 섞어주고 37℃에서 6분 동안 배양한다. 6분 후, 각 well에 Stop Reagent (25% acetic acid)를 100 μL씩 넣고 plate를 상온에서 천천히 섞어준다.
4) 바로 마이크로 멀티리더기 (micro-multi reader machine)에서 410nm의 파장대로 광학밀도 (optical density, OD) 값을 측정한다.
5) 표준 단백 용액에서 얻은 OD 값을 가지고 표준 곡선을 그린 후에 지수함수 형태의 피팅 함수를 확인한 다음 정제된 단백 용액에서 얻은 OD 값을 피팅 함수에 대입하여 endotoxin 농도를 확인한다.
- BCA Protein Assay Kit [Thermo Fisher Scientific, 23227]을 사용하여 최종적으로 수확한 정제된 단백 용액의 농도를 측정한다.
1) 96-well plate에 정제된 단백 용액, PBS (0 ug/mL), 표준 단백 용액을 PBS에 연속 희석 (serial dilution)하여 농도 별로 (25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 ug/mL) 준비한 표준 단백 용액을 각 well 마다 10 μL씩 넣어준다.
2) Kit에 동봉된 Solution A와 Solution B를 50:1의 비율로 섞어주고 각 well에 200 μL씩 첨가한 다음 빛이 들지 않도록 37℃배양기에서 30분 동안 배양한다.
3) 30분 후 바로 마이크로 멀티리더기에서 562nm의 파장대로 OD 값을 측정한다.
4) 표준 단백 용액에서 얻은 OD 값을 가지고 표준 곡선을 그린 후에 지수함수 형태의 피팅 함수를 확인한 다음 정제된 단백 용액에서 얻은 OD 값을 피팅 함수에 대입하여 단백질 농도를 확인한다.
(2) 실험결과
상기 실험방법에 따라 분리 정제 후 각 단백질의 농도를 하기 표 5에 나타냈다:
Figure 112020041183654-pat00007
실시예 3: 융합 단백질의 이량체 형성(dimerization) 확인
상기 단백질의 발현이 확인된 다양한 균주의 Fc-flagellin 융합 단백질이 이량체를 형성하는지를 확인해 보고자 하였다.
(1) 실험방법
- 사용한 세포주 : HEK293T
- 24 well plate 에 transfection 당일 cell confluence 가 70% 가 되게끔 seeding 한다
- 실험 당일 JetPrime transfection reagent 를 well 당 1 ul 씩 각각의 DNA (EV, #1, #2, TdTmt) 500 ng 섞은 후 프로토콜에 따라 transfection 한다 (transfection 할 때는 10% FBS DMEM 을 사용한다. transfection volume 은 500 ul).
- transfection 한 후 24시간이 지난 뒤 0.5% FBS media 로 바꿔준다.
- 48시간이 지난 뒤 media 400 ul 를 harvest 한다.
- media 는 debris 제거를 위해 12,300g에서 1분간 원심 분리하여 상층액을 샘플로서 사용한다.
- 각각의 샘플을 200ul 씩 나누어서 2가지 종류의 5X sample buffer 50 ul 를 첨가한다.
1) reducing 5X sample buffer : 일반적으로 사용하는 라멜리 샘플 버퍼 조성
2) non-reducing 5X sample buffer : 라멜리 샘플 버퍼 조성에서
Figure 112020041183654-pat00008
-mercaptoethanol을 넣지 않음
- reducing 샘플들을 5분 동안 99℃ lock에서 가열한다.
- non-reducing 샘플들은 가열하는 과정을 생략한다
- SDS-PAGE 로 단백질 크기별로 분리한다.
- Commasie staining으로 사이즈를 확인한다.
(2) 실험결과
이에 대한 결과를 도 3에 나타냈다. 각각의 Fc-flagellin 융합 단백질이 Non-reducing condition 조건에서, reducing condition에서 신호가 나오는 size의 약 2배에 해당되는 이량체 형성 신호가 관찰되었다. 이로써, Fc-flagellin 융합 단백질이 이량체(dimer)를 형성한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: Fc-flagellin 융합단백질의 TLR5 경로 활성화능 평가
상기 제작된 Fc-flagellin 융합단백질이 TLR5 작용제(agonist)로서 활성을 나타내는지 확인하고자 세포 내 NF-κB 활성을 평가하였다. 세포는 HEK293T에 TLR5의 활성을 유도하는 작용제를 선별하기 위해 제작된 세포주 모델인 HEK-Blue hTLR5(Invivogen, Cat No. hkb-htrl5)을 사용하였으며 hTLR5와 pNF-κB가 과발현 되어 있어 제작한 Fc-flagellin에 의한 TLR5활성을 확인할 수 있다.
(1) 실험방법
HEK-Blu hTLR5세포는 Zeocin (100ug/mL) (Invivogne, Cat No. ant-zn-1), blasticidin (15 ug/mL) (Invivogen, Cat No. ant-bl-1), 그리고 normocin (100ug/mL) (invivogen, Cat No. ant-nr-1)이 포함된 배양 배지로 세포를 유지한다.
- NF-kB 활성도 측정 방법은 다음과 같다.
① 배양된 HEK-Blue hTLR5세포를 떼어서 원심 분리한 후, 상층액을 제거한 후에 세포 pellet을 1X PBS로 잘 섞어준다.
② 세포를 seeding하기 전, 96-well plates에 각 4 nM, 16 nM, 그리고 64 nM의 농도로 미리 준비된 단백 시료 (20 ul)를 미리 96-well plates에 첨가해준다.
- Tri-plates 조건으로 실험을 진행한다.
- 대조군은 1XPBS (20 ul) 첨가한 군으로 한다.
③ 계산된 HEK-Blue hTLR5세포를 HEK-Blue Dection medium (Invivogen, Cat No. hb-det2)으로 잘 섞은 후, 약 2.5x104/96-well에 동일한 세포 수를 180 ul 볼륨으로 96-well plates에 seeding해준다.
④ 단백과 함께 첨가된 세포를 37℃ incubator에서 약 16시간 동안 반응해준다.
⑤ 약 16시간 후, 마이크로 멀티리더기에서 620 nm 파장대로 광학밀도 (optical density, OD) 값을 측정하여 NF-kB 활성을 비교 계산한다.
(2) 실험결과
이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 각 Fc-hIgG4-flagellin 융합단백질들은 모두 TLR5-의존적 NF-
Figure 112020041183654-pat00009
B 활성을 농도 의존적으로 증가시키는 것으로 확인되었으며, 이 중에서 특히 Fc-hIgG4-bsflagellin 융합단백질의 활성이 모든 농도에서 가장 우수한 것으로 확인되었다. 낮은 농도인 4 nM에서 다른 Fc-hIgG4-flagellin 융합단백질들은 TLR5의 활성을 유도하지 못하는 반면, Fc-hIgG4-bsflagellin만 의미있는 TLR5의 활성을 유도할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5: 동물실험을 위한 Fc-mIgG1-bsflagellin 융합단백질의 제작
상기 실시예 1 내지 4를 통해 가장 우수한 활성을 나타내는 것으로 확인된 Fc-hIgG4-Bsflagellin을 마우스 동물 모델에서 검증하기 위해 마우스 IgG1 유래의 Fc 영역이 융합된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 다음과 같은 방법으로 제조하였다(도 5). 링커 사이즈가 Fc융합 flagelllin의 기능에 영향을 주는지 비교하기 위해 링커 GGGGS 1개를 사용한 경우와 링커 GGGGS 3개를 각각 사용하여 제작하였다.
Bsflagelliin, 링커 및 마우스 IgG1 유래의 Fc 영역이 융합된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 다음과 같은 방법으로 제조하였다(도 5).
구체적으로, B.subtilis flagellin (bsflagellin) 유전자가 삽입되어 있는 pET49b-bsflagellin 벡터 (Scientific Reports, 7, 40878 (2017))에서 정방향 프라이머 (5’- CCG GAA TTC ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC -3)와 역방향 프라이머 (5’- GAC CAT GGT AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3’와 5’- GAC CAT GGT AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3')를 이용하여　PCR을 수행하였다. PCR은 pfu turbo DNA 중합효소 (Invitrogen, 2.5 unit/ul, #600252)를 이용하여 92oC에서 30초 동안 반응시키고, 92oC에서 30초, 56oC에서 30초, 68oC에서 1분 동안 반응시키는 것을 1 사이클로 하여 30 사이클 반응시킨 후, 68oC에서 5분간 반응시켜 종결하였다.
이렇게 획득한 PCR 산물을 EcoRI/NcoI으로 처리한 다음, EcoRI/NcoI 효소로 처리한 pFUSE-mIgG1-Fc1 벡터에 T4 DNA 라이게이즈 (Takara, #2011A)를 이용하여 라이게이션하여 제조된 "pFUSE-mIgG1-Fc1-bsflagellin" 발현벡터를 시퀀싱을 통하여 확인하였다(도 6).
상기 제작한 벡터를 이용하여 세포를 형질감염시킨 후 Fc-Bsflagellin 융합 단백질의 발현을 확인해 보았다.
이에 대한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, EV 에서는 conjugation 되지 않은 Fc protein (26kDa) 이 확인되었고, #1(Fc-bsflagellin, 즉, Fc-링커-bsflagellin 융합단백질), #2(Fc-bsflagellin3, 즉, Fc-링커 3 반복-bsflagellin 융합단백질) 에서는 각각 Bsflagellin conjugation 된 Fc protein 이 각각 55kDa 크기에서 확인되었다. Negative control 로 사용한 TdTmt lane 에서는 아무런 신호도 감지되지 않았다. 상기 Fc-bsflagellin 융합단백질은 bsflagellin-링커(GGGGS)-Fc 구조의 융합단백질이며, 상기 Fc-bsflagellin3은 bsflagellin-링커(GGGGS 3반복)-Fc 구조의 융합단백질을 의미한다.
실시예 6: Fc-mIgG1-bsflagellin 융합 단백질의 이량체 형성(dimerization) 확인
상기 단백질의 발현이 확인된 Fc-mIgG1-bsflagellin 융합 단백질이 이량체를 형성하는지를 확인해 보고자 하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, Non-reducing condition 조건에서, reducing condition에서 신호가 나오는 size의 약 2배에 해당되는 이량체 형성 신호가 관찰되었다. 이로써, Fc-bsflagellin 융합 단백질이 이량체(dimer)를 형성한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: Fc-flagellin과 야생형 flagellin의 TLR5 작용제로서의 활성 비교
상기 제작된 Fc-bsflagellin 융합 단백질이 TLR5 작용제(agonist)로서 활성을 나타내는지 확인하고자 세포 내 NF-κB 활성을 상기 실시예 4의 방법과 동일한 방법으로 평가하였다.
이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.
HEK293T 세포에 Fc-mIgG1-Bsflagellin을 transfection한 후 48시간 뒤에 획득한 세포 배양액을 가지고 톨-유사 수용체 (Toll-like receptor, TLR) 5-의존적인 NF-κB의 활성 (activity)을 확인하였다. 비교를 위해 Invivogen에서 99 %의 순도로 판매하는 Bacillus subtilis의 정제된 flagellin(FLA-BS, 제품정보)과 Salmonella typhimurium의 정제된 flagellin(FLA-ST, 제품정보)을 사용하였다. 각 시험물질을 처리한 경우, Fc-bsflagellin에 의한 TLR5-의존적 NF-
Figure 112020041183654-pat00010
B 활성이 표준 단백으로 사용된 FLA-BS나 FLA-ST에 비해 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 통해서 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 플라젤린이 야생형 플라젤린, 야생형 플라젤린의 단편 또는 야생형 플라젤린의 변이체와 비교하여 현저히 향상된 TLR5 경로 활성화능을 나타냄을 의미한다고 할 수 있다.
전술한 실험에서 사용된 각 단백질의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:
Bsflagellin 아미노산 서열: 서열번호 1
Sdflagellin 아미노산 서열: 서열번호 2
Paflagellin 아미노산 서열: 서열번호 3
Shflagellin 아미노산 서열: 서열번호 4
Ecflagellin 아미노산 서열: 서열번호 5
Human IgG4 Fc 아미노산 서열: 서열번호 6
Mouse IgG1 Fc 아미노산 서열: 서열번호 7
링커 1 아미노산 서열: 서열번호 8
링커 2 아미노산 서열: 서열번호 9
hIgG4-Fc-Bsflagellin 융합단백질 아미노산 서열: 서열번호 10
mIgG1-Fc-Bsflagellin 융합단백질(링커 1) 아미노산 서열: 서열번호 11
mIgG1-Fc-Bsflagellin 융합단백질(링커 2) 아미노산 서열: 서열번호 12
hIgG4-Fc-Sdflagellin 융합단백질 아미노산 서열: 서열번호 13
hIgG4-Fc-Paflagellin 융합단백질 아미노산 서열: 서열번호 14
hIgG4-Fc-Shflagellin 융합단백질 아미노산 서열: 서열번호 15
hIgG4-Fc-Ecflagellin 융합단백질 아미노산 서열: 서열번호 16
hIgG4-Fc-Bsflagellin 폴리뉴클레오티드 서열: 서열번호 17
mIgG1-Fc-Bsflagellin (링커 1) 폴리뉴클레오티드 서열: 서열번호 18
mIgG1-Fc-Bsflagellin (링커 2) 폴리뉴클레오티드 서열: 서열번호 19
hIgG4-Fc-Sdflagellin 폴리뉴클레오티드 서열: 서열번호 20
hIgG4-Fc-Paflagellin 폴리뉴클레오티드 서열: 서열번호 21
hIgG4-Fc-Shflagellin 폴리뉴클레오티드 서열: 서열번호 22
hIgG4-Fc-Ecflagellin 폴리뉴클레오티드 서열: 서열번호 23
본 발명이 제공하는 융합 단백질은 야생형 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체와 비교하여 톨-유사 수용체 5(TLR5) 경로 활성화능이 현저히 우수하여, TLR5 경로 활성화를 통해 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 질환의 치료제 개발 및/또는 백신 보조제 개발에 매우 유용하게 활용이 될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Flagellin fusion protein and uses thereof <130> NP19-0045P <150> KR 10-2019-0046866 <151> 2019-04-22 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 278 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus subtilis(Bs) flagellin <400> 1 Met Arg Ile Asn His Asn Ile Ala Ala Leu Asn Thr Leu Asn Arg Leu 1 5 10 15 Gly Ser Asn Asn Gly Ala Ala Gln Lys Asn Met Glu Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Leu Arg Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Arg Gly Gln Ile Arg Gly Leu Glu Met Ala Ser Lys 50 55 60 Asn Ser Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Thr Glu Thr His Ala Ile Leu Gln Arg Met Arg Glu Leu Thr Val Gln 85 90 95 Ala Gly Asn Thr Gly Thr Gln Gln Ala Glu Asp Leu Gly Ala Ile Lys 100 105 110 Asp Glu Met Asp Ala Leu Ile Glu Glu Ile Asp Gly Ile Ser Asn Arg 115 120 125 Thr Glu Phe Asn Gly Lys Lys Leu Leu Asp Gly Thr Asn Ser Thr Asp 130 135 140 Gly Phe Thr Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Gly Gln Gln Leu Asn Val 145 150 155 160 Lys Ile Asp Ser Met Ser Ser Thr Ala Leu Gly Val Asn Ala Leu Asp 165 170 175 Val Thr Asp Phe Ala Ala Thr Ala Phe Asp Asp Gln Leu Lys Ser Ile 180 185 190 Asp Thr Ala Ile Asn Thr Val Ser Thr Gln Arg Ala Lys Leu Gly Ala 195 200 205 Val Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ala Ser Gly 210 215 220 Glu Asn Leu Thr Ala Ala Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala 225 230 235 240 Lys Glu Met Ser Glu Phe Thr Lys Asn Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ser 245 250 255 Gln Ala Met Leu Ala Gln Ala Asn Gln Gln Pro Gln Asn Val Leu Gln 260 265 270 Leu Leu Arg Pro Gly Lys 275 <210> 2 <211> 505 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Salmonella dublin(Sd) flagellin <400> 2 Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn 1 5 10 15 Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ile Glu Arg Leu 20 25 30 Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln 35 40 45 Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala 50 55 60 Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly 65 70 75 80 Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ser 85 90 95 Val Gln Ala Thr Asn Gly Thr Asn Ser Asp Ser Asp Leu Lys Ser Ile 100 105 110 Gln Asp Glu Ile Gln Gln Arg Leu Glu Glu Ile Asp Arg Val Ser Asn 115 120 125 Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ser Gln Asp Asn Gln Met 130 135 140 Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asp Leu 145 150 155 160 Gln Lys Ile Asp Val Lys Ser Leu Gly Leu Asp Gly Phe Asn Val Asn 165 170 175 Gly Pro Lys Glu Ala Thr Val Gly Asp Leu Lys Ser Ser Phe Lys Asn 180 185 190 Val Thr Gly Tyr Asp Thr Tyr Ala Ala Gly Ala Asp Lys Tyr Arg Val 195 200 205 Asp Ile Asn Ser Gly Ala Val Val Thr Asp Ala Val Ala Pro Asp Lys 210 215 220 Val Tyr Val Asn Ala Ala Asn Gly Gln Leu Thr Thr Asp Asp Ala Glu 225 230 235 240 Asn Asn Thr Ala Val Asp Leu Phe Lys Thr Thr Lys Ser Thr Ala Gly 245 250 255 Thr Ala Glu Ala Lys Ala Ile Ala Gly Ala Ile Lys Gly Gly Lys Glu 260 265 270 Gly Asp Thr Phe Asp Tyr Lys Gly Val Thr Phe Thr Ile Asp Thr Lys 275 280 285 Thr Gly Asp Asp Gly Asn Gly Lys Val Ser Thr Thr Ile Asn Gly Glu 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr Val Ala Asp Ile Ala Ile Gly Ala Ala Asp Val 305 310 315 320 Asn Ala Ala Thr Leu Gln Ser Ser Lys Asn Val Tyr Thr Ser Val Val 325 330 335 Asn Gly Gln Phe Thr Phe Asp Asp Lys Thr Lys Asn Glu Ser Ala Lys 340 345 350 Leu Ser Asp Leu Glu Ala Asn Asn Ala Val Lys Gly Glu Ser Lys Ile 355 360 365 Thr Val Asn Gly Ala Glu Tyr Thr Ala Asn Ala Thr Gly Asp Lys Ile 370 375 380 Thr Leu Ala Gly Lys Thr Met Phe Ile Asp Lys Thr Ala Ser Gly Val 385 390 395 400 Ser Thr Leu Ile Asn Glu Asp Ala Ala Ala Ala Lys Lys Ser Thr Ala 405 410 415 Asn Pro Leu Ala Ser Ile Asp Ser Ala Leu Ser Lys Val Asp Ala Val 420 425 430 Arg Ser Ser Leu Gly Ala Ile Gln Asn Arg Phe Asp Ser Ala Ile Thr 435 440 445 Asn Leu Gly Asn Thr Val Thr Asn Leu Asn Ser Ala Arg Ser Arg Ile 450 455 460 Glu Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln 465 470 475 480 Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val 485 490 495 Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg 500 505 <210> 3 <211> 387 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudomonas aeruginosa (Pa) flagellin <400> 3 Met Ala Leu Thr Val Asn Thr Asn Ile Ala Ser Leu Asn Thr Gln Arg 1 5 10 15 Asn Gln Asn Asn Ser Ser Ala Ser Leu Asn Thr Ser Leu Gln Arg Leu 20 25 30 Ser Thr Gly Ser Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu 35 40 45 Gln Ile Ala Asn Arg Leu Thr Ser Gln Val Asn Gly Leu Asn Val Ala 50 55 60 Thr Lys Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Leu Ala Gln Thr Ala Glu Gly 65 70 75 80 Ala Leu Gln Gln Ser Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser 85 90 95 Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Asp Ser Glu Arg Thr Ala Leu 100 105 110 Asn Gly Glu Val Lys Gln Leu Gln Lys Glu Leu Asp Arg Ile Ser Asn 115 120 125 Thr Thr Thr Phe Gly Gly Arg Lys Leu Leu Asp Gly Ser Phe Gly Val 130 135 140 Ala Ser Phe Gln Val Gly Ser Ala Ala Asn Glu Ile Ile Ser Val Gly 145 150 155 160 Ile Asp Glu Met Ser Ala Glu Ser Leu Asn Gly Thr Tyr Phe Lys Ala 165 170 175 Asp Gly Gly Gly Ala Val Thr Ala Ala Thr Ala Ser Gly Thr Val Asp 180 185 190 Ile Ala Ile Asp Ile Thr Gly Gly Ser Ala Val Asn Val Lys Val Asp 195 200 205 Met Lys Gly Asn Glu Thr Ala Glu Gln Ala Ala Ala Lys Ile Ala Ala 210 215 220 Ala Val Asn Asp Ala Asn Val Gly Ile Gly Ala Phe Thr Asp Gly Ala 225 230 235 240 Gln Ile Ser Tyr Val Ser Lys Ala Ser Ala Asp Gly Thr Thr Ser Ala 245 250 255 Val Ser Gly Val Ala Ile Thr Asp Thr Gly Ser Thr Gly Ala Gly Thr 260 265 270 Ala Ala Gly Thr Thr Thr Phe Thr Glu Ala Asn Asp Thr Val Ala Lys 275 280 285 Ile Asp Ile Ser Thr Ala Lys Gly Ala Gln Ser Ala Val Leu Val Ile 290 295 300 Asp Glu Ala Ile Lys Gln Ile Asp Ala Gln Arg Ala Asp Leu Gly Ala 305 310 315 320 Val Gln Asn Arg Phe Asp Asn Thr Ile Asn Asn Leu Lys Asn Ile Gly 325 330 335 Glu Asn Val Ser Ala Ala Arg Gly Arg Ile Glu Asp Thr Asp Phe Ala 340 345 350 Ala Glu Thr Ala Asn Leu Thr Lys Asn Gln Val Leu Gln Gln Ala Gly 355 360 365 Thr Ala Ile Leu Ala Gln Ala Asn Gln Leu Pro Gln Ser Val Leu Ser 370 375 380 Leu Leu Arg 385 <210> 4 <211> 550 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shigella flexneri (Sf) flagellin <400> 4 Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn 1 5 10 15 Asn Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu 20 25 30 Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln 35 40 45 Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala 50 55 60 Ala Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly 65 70 75 80 Ala Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Ile Arg Glu Leu Thr 85 90 95 Val Gln Ala Ser Thr Gly Thr Asn Ser Asp Ser Asp Leu Asp Ser Ile 100 105 110 Gln Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly 115 120 125 Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asp Gly Ser Met 130 135 140 Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu 145 150 155 160 Lys Lys Ile Asp Ser Asp Thr Leu Gly Leu Asn Gly Phe Asn Val Asn 165 170 175 Gly Gly Gly Ala Val Ala Asn Thr Ala Ala Ser Lys Ala Asp Leu Val 180 185 190 Ala Ala Asn Ala Thr Val Val Gly Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ala Gly 195 200 205 Tyr Asp Ala Ala Lys Ala Ser Asp Leu Leu Ala Gly Val Ser Asp Gly 210 215 220 Asp Thr Val Gln Ala Thr Ile Asn Asn Gly Phe Gly Thr Ala Ala Ser 225 230 235 240 Ala Thr Asn Tyr Lys Tyr Asp Ser Ala Ser Lys Ser Tyr Ser Phe Asp 245 250 255 Thr Thr Thr Ala Ser Ala Ala Asp Val Gln Lys Tyr Leu Thr Pro Gly 260 265 270 Val Gly Asp Thr Ala Lys Gly Thr Ile Thr Ile Asp Gly Ser Ala Gln 275 280 285 Asp Val Gln Ile Ser Ser Asp Gly Lys Ile Thr Ala Ser Asn Gly Asp 290 295 300 Lys Leu Tyr Ile Asp Thr Thr Gly Arg Leu Thr Lys Asn Gly Ser Gly 305 310 315 320 Ala Ser Leu Thr Glu Ala Ser Leu Ser Thr Leu Ala Ala Asn Asn Thr 325 330 335 Lys Ala Thr Thr Ile Asp Ile Gly Gly Thr Ser Ile Ser Phe Thr Gly 340 345 350 Asn Ser Thr Thr Pro Asp Thr Ile Thr Tyr Ser Val Thr Gly Ala Lys 355 360 365 Val Asp Gln Ala Ala Phe Asp Lys Ala Val Ser Thr Ser Gly Asn Asn 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agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 2160 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 2220 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 2280 ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 2340 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 2400 tccctgtctc tgggtaaata a 2421 <210> 23 <211> 2265 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding hIgG4-Fc-Ecflagellin (with linker 1) <400> 23 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60 atatcgatgg cacaagtcat taataccaac agcctctcgc tgatcactca aaataatatc 120 aacaagaacc agtctgcgct gtcgagttct atcgagcgtc tgtcttctgg cttgcgtatt 180 aacagcgcga aggatgacgc agcgggtcag gcgattgcta accgtttcac ctctaacatt 240 aaaggcctga ctcaggcggc ccgtaacgcc aacgacggta tctccgttgc gcagaccacc 300 gaaggcgcgc tgtccgaaat caacaacaac ttacagcgtg tgcgtgaact gacggtacag 360 gccactaccg gtactaactc tgagtctgat ctgtcttcta tccaggacga aattaaatcc 420 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ttgcaaatgg taaaaccacg gatccgctga aagcgctgga cgatgctatc 1320 gcatctgtag acaaattccg ttcttccctc ggtgcggtgc aaaaccgtct ggattccgcg 1380 gttaccaacc tgaacaacac cactaccaac ctgtctgaag cgcagtcccg tattcaggac 1440 gccgactatg cgaccgaagt gtccaatatg tcgaaagcgc agatcatcca gcaggccggt 1500 aactccgtgt tggcaaaagc taaccaggta ccgcagcagg ttctgtctct gctgcagggt 1560 ggtggcggag ggtctgccat ggttagatct cccccatgcc catcatgccc agcacctgag 1620 ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc 1680 tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc 1740 cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1800 gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1860 ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag 1920 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca 1980 tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac 2040 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 2100 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac 2160 aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 2220 aaccactaca cacagaagag cctctccctg tctctgggta aataa 2265

Claims (26)

  1. 야생형의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 플라젤린(Flagellin) 및 천연형 아미노산 서열의 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 플라젤린의 C-말단에 상기 Fc 영역의 N-말단이 결합된 융합 단백질.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 TLR5 (toll-like receptor 5)에 의해 인식되는 보존된 서열(conserved sequence)을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 동물 면역글로불린 IgG, IgM, IgD, IgA 또는 IgE의 Fc로부터 유도된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 동물 면역글로불린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc로부터 유도된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지(hinge) 영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린 및 상기 면역글로불린 Fc 영역은 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  14. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  15. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 6 또는 7의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  16. 제13항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 8 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  17. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 10 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  18. 제1항, 제4항 ,제8항, 제9항, 제11항 및 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  20. 제19항의 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체.
  21. 제1항, 제4항, 제8항, 제9항, 제11항 및 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 톨-유사 수용체 5(TLR5) 자극 활성에 의한, 방사선 노출에 의한 손상 예방 또는 치료용; 재관류 손상 예방 또는 치료용; 염증성 장 질환 예방 또는 치료용; 자가면역질환 예방 또는 치료용; 바이러스 감염 예방 또는 치료용; 면역기능 증강용; 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 제21항에 있어서, 상기 방사선 노출에 의한 손상은 위장 증후군 또는 조혈 증후군인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  25. 삭제
  26. 제1항, 제4항, 제8항, 제9항, 제11항 및 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 보조제.
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