KR20160066553A - 섬유화 질환을 치료하기 위한 엔도글린 펩티드 - Google Patents
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Abstract
특정 측면에서, 본 개시내용은 엔도글린 (ENG) 폴리펩티드의 세포외 도메인의 말단절단된, 리간드 결합 부분을 포함하는 폴리펩티드가 섬유화 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다는 인식에 관한 것이다.
Description
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. §119 하에 2013년 10월 25일 출원된 미국 가출원 시리얼 번호 61/896,002 (발명의 명칭: Endoglin Peptides To Treat Fibrotic Diseases)의 출원일의 이익을 주장하고, 이 출원의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
섬유증은 기관 또는 조직 중의 과도한 섬유 결합 조직의 형성이다. 섬유증은 흉터 형성으로도 지칭되는 수복 또는 반응 과정의 일부로서 물리적 또는 화학적 손상에 대한 반응으로 일어날 수 있다. 섬유증은 또한 외부 손상 없이도 세포 또는 조직에서의 병적 이상으로부터 발생할 수 있다. 섬유증 결과, 결합 조직은 침착되고, 이는 조직의 항상성 및 외상 이후의 치유를 지원할 수 있다. 그러나, 과도한 섬유증은 구조를 제거할 수 있고, 기초 기관 또는 조직의 기능을 방해할 수 있으며, 이로 인해 섬유화 장애, 예컨대, 예를 들어, 간 섬유증, 폐 섬유증, 및 낭성 섬유증이 발생할 수 있다. 섬유화 조직은 전형적으로 각 기관의 특수화된 기능을 수행할 수 있고, 수복될 수 없다. 따라서, 섬유화 장애에 대한 치료 옵션은 조직 대체 접근법, 예컨대, 기관 이식, 및 완화 치료로 한정된다.
섬유증을 억제시키고, 치료하는 데 효과적인 조성물 및 방법을 개발하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 섬유화 장애와 관련된 과도한 섬유증을 억제시키고/거나, 역전시킬 수 있는 방법 및 조성물을 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 엔도글린 (ENG) 폴리펩티드, 및 섬유화 장애를 치료 또는 예방하기 위한 상기 엔도글린 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 본 개시내용의 일부 실시양태는 섬유화 장애 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 섬유화 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 상기 환자에게 유효량의, 본원에서 제공하는 엔도글린 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 사용되는 엔도글린 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 42-333과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 섬유화 장애는 간 섬유증, 혈관 섬유증, 폐 섬유증, 췌장 섬유증, 신장 섬유증, 근골격성 섬유증, 심장 섬유증, 피부 섬유증, 안구 섬유증, 진행성 전신 경화증 (PSS), 만성 이식편 대 숙주 질환, 페로니병, 방광경 검사 후의 요도 협착증, 복막뒤 섬유증, 종격 섬유증, 진행성 종괴성 섬유증, 증식성 섬유증, 신원성 전신 섬유증, 종양성 섬유증, 뒤퓌트랑병(Dupuytren's disease), 협착, 방사선 유발성 섬유증, 낭성 섬유증, 흉막 섬유증, 사르코이드증, 경피증, 척수 손상/섬유증, 골수 섬유증, 혈관 재협착, 죽상동맥경화증, (특히 아동에서의 근육내 주사의 합병증으로서 발생할 수 있는) 주사 섬유증, 또는 탄광부 진폐증의 합병증이다. 일부 실시양태에서, 섬유화 장애는 골수 섬유증이 아니다. 일부 실시양태에서, 간 섬유증은 간 경변증, 알콜 유발성 간 섬유증, 담즙관 손상, 원발성 담즙성 간경변증, 감염 유발성 간 섬유증, 선천성 간 섬유증 또는 자가면역 간염이다. 일부 실시양태에서, 감염 유발성 간 섬유증은 박테리아 유발성 또는 바이러스 유발성인 것이다. 일부 실시양태에서, 폐 섬유증은 특발성, 약리학상 유발성, 방사선 유발성, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 또는 만성 천식이다. 일부 실시양태에서, 심장 섬유증은 심내막심근 섬유증 또는 특발성 심근병증이다. 일부 실시양태에서, 피부 섬유증은 경피증, 외상 후, 수술 피부 흉터 형성, 켈로이드, 또는 피부 켈로이드 형성이다. 일부 실시양태에서, 안구 섬유증은 녹내장, 안구 경화증, 결막 흉터 형성, 각막 흉터 형성, 또는 익상편이다. 일부 실시양태에서, 복막뒤 섬유증은 특발성, 약리학상 유발성 또는 방사선 유발성인 것이다. 일부 실시양태에서, 낭성 섬유증은 췌장의 낭성 섬유증 또는 폐의 낭성 섬유증이다. 일부 실시양태에서, 주사 섬유증은 근육내 주사의 합병증으로서 발생한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같은, 섬유화 장애를 치료하는 데 사용되는 엔도글린 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 379-430으로 이루어진 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 서열 1의 위치 26-42 중 어느 위치에 상응하는 아미노산에서 시작하여, 서열 1의 위치 333-378 중 어느 위치에 상응하는 아미노산에서 종결되는 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 26-346, 서열 1의 아미노산 26-359, 또는 서열 1의 아미노산 26-378과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 26-346, 서열 1의 아미노산 26-359, 또는 서열 1의 아미노산 26-378과 95% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 제1 부분, 및 서열 1과 이종성인 제2 부분으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드의 제2 부분은 IgG의 Fc 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 379-586으로 이루어진 서열로부터의 50개 초과의 연속 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 2개 이상의 엔도글린 폴리펩티드를 포함하는, 이량체 또는 고차원 다량체이고, 임의적으로 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같은, 섬유화 장애를 치료하는 데 사용되는 엔도글린 폴리펩티드는 1 x 10-9 M 미만의 평형 해리 상수 (KD), 또는 1 x 10-3 s-1 미만의 해리 속도 상수 (kd)로 인간 BMP-9에 결합한다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 1 x 10-9 M 미만의 평형 해리 상수 (KD), 또는 5 x 10-4 s-1 미만의 해리 속도 상수 (kd)로 인간 BMP-9에 결합한다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 1 x 10-9 M 미만의 평형 해리 상수 (KD), 또는 5 x 10-3 s-1 미만의 해리 속도 상수 (kd)로 인간 BMP-10에 결합한다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 1 x 10-9 M 미만의 평형 해리 상수 (KD), 또는 2.5 x 10-3 s-1 미만의 해리 속도 상수 (kd)로 인간 BMP-10에 결합한다. 임의적으로, 상기 BMP-9 또는 BMP-10 결합 특성 중 임의의 것을 특징으로 하는 엔도글린 폴리펩티드는 이량체 또는 고차원 다량체이다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 인간 TGF-β1, 인간 TGF-β3, 인간 VEGF, 또는 인간 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2)에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 엔도글린 아미노산 서열을 포함하는 부분 이외에도, 생체내 안정성, 생체내 반감기, 흡수/투여, 조직 국재화 또는 분포, 단백질 복합체, 예컨대, 이량체 또는 다량체의 형성, 및/또는 정제 중 하나 이상의 것을 증진시키는 하나 이상의 폴리펩티드 부분을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 면역글로불린의 불변 도메인의 일부 및/또는 혈청 알부민의 일부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 도메인은 링커에 의해 ENG 폴리펩티드 부분에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열 31 (TGGG) 또는 GGG로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 이량체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 글리코실화된 아미노산, PEG화된 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 비오티닐화된 아미노산, 지질 모이어티에 접합된 아미노산, 및 유기 유도체화제에 접합된 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 정맥내로, 근육내로, 동맥내로, 피하로, 또는 경구적으로 투여된다.
부분적으로, 본 개시내용은 엔도글린 폴리펩티드, 및 BMP9 및/또는 BMP10에 대한 선택적 길항제로서의 상기 엔도글린 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 본원에 기술된 바와 같이, 엔도글린 세포외 도메인 (ECD)의 일부 또는 그 모두를 포함하는 폴리펩티드는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 다른 구성원에는 실질적인 결합을 보이지 않으면서, BMP9 및 BMP10에는 결합한다. 본 개시내용은 엔도글린 ECD의 일부 또는 그 모두를 포함하는 폴리펩티드가 BMP9 및 BMP10 신호전달의 효과적인 길항제이고, 이는 생체내에서 혈관신생 및 종양 성장을 억제시키는 작용을 한다는 것을 입증한다. 따라서, 특정 측면에서, 본 개시내용은 혈관신생 뿐만 아니라, 본원에 기술된 BMP9 또는 BMP10과 관련된 다른 장애를 억제시키는 데 사용하기 위한 BMP9 및/또는 BMP10의 길항제로서의 엔도글린 폴리펩티드를 제공한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 혈관신생을 억제시키는 데, 및 다른 BMP9 또는 BMP10-관련 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 엔도글린의 말단절단된 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 임의의 특정 작용 기전으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 상기 폴리펩티드는 BMP9 및/또는 BMP10에 결합하고, 수용체, 예컨대, ALK1, ALK2, ActRIIA, ActRIIB 및 BMPRII와 신호전달 복합체를 형성할 수 있는 상기 리간드의 능력을 억제시킴으로써 작용하는 것으로 예상된다. 특정 실시양태에서, 엔도글린 폴리펩티드는 서열 1의 인간 엔도글린 서열의 아미노산 42-333, 26-346, 26-359 또는 26-378의 서열과 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 본질적으로 그로 이루어진다. 엔도글린 폴리펩티드는 서열 1의 위치 26-42 중 어느 위치에서 시작하고, 서열 1의 인간 엔도글린 서열의 위치 333-378 중 어느 위치에서 종결되는 아미노산의 서열과 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 본질적으로 그로 이루어질 수 있다. 엔도글린 폴리펩티드는 덜 엄격한, 엄격한 또는 매우 엄격한 조건하에서 서열 2의 뉴클레오티드 537-1412, 서열 30의 뉴클레오티드 121-1035, 서열 26의 뉴클레오티드 121-1074, 서열 24의 뉴클레오티드 121-1131, 서열 30의 뉴클레오티드 73-1035, 서열 26의 뉴클레오티드 73-1074, 및 서열 24의 뉴클레오티드 73-1131로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 상보체에 하이브리드화하는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 본질적으로 그로 이루어질 수 있다. 상기 각각에서, 엔도글린 폴리펩티드는 전장의 엔도글린 ECD를 포함하지 않도록 선택될 수 있다 (예컨대, 엔도글린 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 379-430의 서열, 또는 그의 일부, 또는 서열 1의 독특한 서열의 임의의 추가 부분을 포함하지 않도록 선택될 수 있다). 엔도글린 폴리펩티드는 단량체 단백질로서, 또는 이량체화된 형태로 사용될 수 있다. 엔도글린 폴리펩티드는 또한 제2 폴리펩티드 부분에 융합되어 예컨대, 반감기 연장 또는 더욱 용이한 제조 또는 정제와 같은 개선된 특성을 제공할 수 있다. 융합은 직접적인 융합일 수 있거나, 또는 링커가 엔도글린 폴리펩티드 및 임의의 다른 부분 사이에 삽입될 수 있다. 링커는 구조화된, 또는 비구조화된 것일 수 있고, 임의적으로, 상대적으로는 2차 구조 없이, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 50개 또는 그 초과의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 링커는 글리신 및 프롤린 잔기가 풍부한 것일 수 있고, 예를 들어, 트레오닌/세린 및 글리신 (예컨대, TGGG (서열 31)) 또는 간단하게 하나 이상의 글리신 잔기 (예컨대, GGG (서열 32)로 이루어진 서열을 함유할 수 있다. 면역글로불린의 Fc 부분에의 융합, 또는 폴리옥시에틸렌 모이어티 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜)에의 결합은 특히 전신 투여 (예컨대, 정맥내, 동맥내 및 복강내 투여)에서 엔도글린 폴리펩티드의 혈청 반감기를 연장시키는 데 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 엔도글린-Fc 융합 단백질은 서열 1의 위치 26-42 중 어느 위치에서 시작하고, 서열 1의 인간 엔도글린 서열의 위치 333-378 중 어느 위치에서 종결되는 아미노산의 서열과 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 본질적으로 그로 이루어진 폴리펩티드를 포함하고, 임의적으로 전장의 엔도글린 ECD를 포함하지 않을 수 있고 (예컨대, 엔도글린 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 379-430의 서열, 또는 그의 일부를 포함하지 않도록, 또는 엔도글린의 임의 부분, 또는 서열 1의 아미노산 379 내지 581의 임의 부분의 임의의 5, 10, 20, 30, 40, 50, 52, 60, 70, 100, 150 또는 200개 또는 그 초과의 다른 아미노산을 포함하지 않도록 선택될 수 있다), 상기 폴리펩티드는 개재 링커를 이용하여, 또는 그러한 링커 없이 면역글로불린의 Fc 부분에 융합된 것이다. 엔도글린-Fc 융합 단백질을 비롯한, 엔도글린 폴리펩티드는 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 그 미만인 값보다 더 적은 KD로, 또는 10-3 s-1, 3x10-3 s-1, 5x10-3 s-1 또는 1x10-4 s-1 미만의 해리 상수 (kd)로 BMP9 및/또는 BMP10에 결합할 수 있다. 엔도글린 폴리펩티드는 BMP10에 대한 KD보다 더 작은, 임의적으로 5배, 10배, 20배, 30배, 40배 또는 그 초과만큼 더 작은 BMP9에 대한 KD를 가지도록 선택될 수 있다. 엔도글린 폴리펩티드는 TGF-β1, -β2 또는 -β3 중 임의의 것, 또는 그들 모두에 대하여 실질적으로 친화성을 가지지 않거나, 또는 전혀 가지지 않을 수 있고, TGF-β1, -β2 또는 -β3 중 임의의 것, 또는 그들 모두에 대하여 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M 또는 10-6 M보다 큰 KD를 가질 수 있다. 엔도글린 폴리펩티드는 이량체 또는 고차원 다량체일 수 있다.
Fc 부분은 유기체에 적합하도록 선택될 수 있다. 임의적으로, Fc 부분는 인간 IgG1의 Fc 부분이다. 임의적으로, 엔도글린-Fc 융합 단백질은 서열 33, 34, 35, 또는 36 중 임의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 임의적으로, 엔도글린-Fc 융합 단백질은 포유동물 세포주, 특히, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주에서 서열 17, 20, 22, 24, 26, 28 또는 30 중 임의 것의 핵산의 발현에 의해 제조된 단백질이다. 엔도글린 폴리펩티드는 실질적으로 발열성 물질을 함유하지 않는 제약 제제로서 제제화될 수 있다. 제약 제제는 전신 전달용 (예컨대, 정맥내, 근육내, 동맥내 또는 피하 전달용), 또는 국소 전달용 (예컨대, 안구로의 전달용)으로 제조될 수 있다.
본원에 개시된 엔도글린 폴리펩티드는 예를 들어, 항혈관신생제, VEGF 길항제, 항VEGF 항체, 항종양성 조성물, 세포독성제, 화학요법제, 항호르몬제, 및 성장 억제제를 비롯한, 하나 이상의 추가의 치료제와 함께, 또는 그와 순차적으로 사용될 수 있다. 상기 카테고리의 분자들 각각에 대한 추가 예는 본원에 제공되어 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 본원에 일반적으로 또는 구체적으로 기술된 엔도글린 폴리펩티드 중 임의의 것을 투여함으로써 포유동물에서 혈관신생을 억제시키는 방법을 제공한다. 엔도글린 폴리펩티드는 국소적으로 (예컨대, 안구에) 또는 전신으로 (예컨대, 정맥내로, 근육내로, 동맥내로 또는 피하로) 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 예컨대, 전신 투여에 의해 안구에서 먼 위치에서 포유동물에게 엔도글린 폴리펩티드를 투여함으로써 포유동물의 안구에서의 혈관신생을 억제시키는 방법을 제공한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 포유동물에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 종양을 앓는 포유동물에게 유효량의 엔도글린 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 예를 들어, 항혈관신생제, VEGF 길항제, 항VEGF 항체, 항종양성 조성물, 세포독성제, 화학요법제, 항호르몬제, 및 성장 억제제를 비롯한 하나 이상의 추가의 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 종양은 또한 다중의 혈관신생 유발 인자를 이용하는 것, 예컨대, 항VEGF 요법에 저항성인 종양일 수도 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 BMP9 또는 BMP10 관련 장애를 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 장애의 예는 본원에 제공되어 있으며, 이는 일반적으로 혈관구조 장애, 고혈압, 및 섬유화 장애를 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 안과용 제제를 제공한다. 상기 제제는 본원에 개시된 엔도글린 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 본 개시내용은 안구의 섬유화 질환, 또는 안구의 혈관신생 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효량의, 본원에 개시된 엔도글린 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제를 전신으로 또는 상기 안구에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
도 1은 인간 ENG, 이소형 1 (L-ENG)의 천연 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 리더 (잔기 1-25) 및 예측된 막횡단 도메인 (잔기 587-611)은 각각 밑줄로 표시되어 있다.
도 2는 인간 ENG, 이소형 1 (L-ENG)을 코딩하는 천연 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 리더 (뉴클레오티드 414-488)를 코딩하는 서열 및 예측된 막횡단 도메인 (뉴클레오티드 2172-2246)을 코딩하는 서열은 각각 밑줄로 표시되어 있다.
도 3은 인간 ENG, 이소형 2 (S-ENG)의 천연 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 리더 (잔기 1-25) 및 예측된 막횡단 도메인 (잔기 587-611)은 각각 밑줄로 표시되어 있다. 이소형 1과 비교하여 이소형 2는 더 짧고, 상이한 C-말단을 가지지만, 세포외 도메인의 서열 (도 9 참조)은 동일하다.
도 4는 인간 ENG, 이소형 2 (S-ENG)를 코딩하는 천연 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 리더 (뉴클레오티드 414-488)를 코딩하는 서열 및 예측된 막횡단 도메인 (뉴클레오티드 2172-2246)을 코딩하는 서열은 각각 밑줄로 표시되어 있다.
도 5는 뮤린 ENG, 이소형 1 (L-ENG)의 천연 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 리더 (잔기 1-26) 및 예측된 막횡단 도메인 (잔기 582-606)은 밑줄로 표시되어 있고, 성숙한 펩티드의 세포외 도메인을 괄호로 표시하고 있다 (도 10 참조). 뮤린 ENG의 이소형 3 (진뱅크(GenBank) 수탁 NM_001146348)은 오직 리더에서만 명시된 서열과 상이하며, 여기서, (강조 표시되어 있는) 23번 위치의 트레오닌은 결실되어 있고, (역시 강조 표시되어 있는) 24번 위치에는 글리신→세린으로의 치환이 존재한다.
도 6은 뮤린 ENG, 이소형 1 (L-ENG)을 코딩하는 천연 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 리더 (뉴클레오티드 364-441)를 코딩하는 서열 및 예측된 막횡단 도메인 (뉴클레오티드 2107-2181)을 코딩하는 서열은 밑줄로 표시되어 있다. 뮤린 ENG의 이소형 3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (진뱅크 수탁 NM_001146348)은 오직 리더에서만, 구체적으로 (강조 표시되어 있는) 430-433 위치에서 명시된 서열과 상이하다.
도 7은 뮤린 ENG, 이소형 2 (S-ENG) 천연 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 리더 (잔기 1-26) 및 예측된 막횡단 도메인 (잔기 582-606)은 밑줄로 표시되어 있다. 이소형 1과 비교하여 이소형 2는 더 짧고, 상이한 C-말단을 가지지만, 세포외 도메인의 서열 (도 10 참조)은 동일하다.
도 8은 뮤린 ENG, 이소형 2 (S-ENG)를 코딩하는 천연 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 리더 (뉴클레오티드 364-441)를 코딩하는 서열 및 예측된 막횡단 도메인 (뉴클레오티드 2107-2181)을 코딩하는 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
도 9는 인간 ENG의 세포외 도메인의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 두 인간 이소형의 세포외 도메인은 아미노산 및 뉴클레오티드 서열, 둘 모두가 동일하다.
도 10은 그의 인간 대응물과 69% 동일한, 뮤린 ENG의 세포외 도메인의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 두 뮤린 이소형의 세포외 도메인은 아미노산 및 뉴클레오티드 서열, 둘 모두가 동일하다.
도 11은 인간 IgG1 Fc 도메인의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 밑줄로 표시된 잔기는 텍스트에서 논의되는 임의적 돌연변이 부위이다.
도 12는 인간 IgG1 Fc 도메인의 N-말단이 말단절단된 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 밑줄로 표시된 잔기는 텍스트에서 논의되는 임의적 돌연변이 부위이다.
도 13은 hENG(26-586)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 14는 hENG(26-586)-hFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열을 코딩하는 것은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 15는 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-586)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 16은 mENG(27-581)-mFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 17은 mENG(27-581)-mFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열을 코딩하는 것은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 18은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기반 검정법으로 측정된 바와 같은, hENG(26-586)-hFc에의 BMP-9 결합의 특징 규명을 보여주는 것이다. 포획된 hENG(26-586)-hFc에의 BMP-9 결합을 0 내지 0.01-0.625 nM의 리간드 농도에서 (2배씩 증분시키면서, 0.3125 nM 배제) 평가하였고, 비선형 회귀를 사용하여 KD는 29 pM인 것으로 측정되었다.
도 19는 SPR 기반 검정법으로 측정된 바와 같은, hENG(26-586)-hFc에의 BMP-10 결합의 특징 규명을 보여주는 것이다. 포획된 hENG(26-586)-hFc에의 BMP-10 결합을 0 내지 0.01-1.25 nM의 리간드 농도에서 (2배씩 증분시키면서) 평가하였고, 비선형 회귀를 사용하여 KD는 400 pM인 것으로 측정되었다.
도 20은 가용성 인간 ENG 세포외 도메인, hENG(26-586)이 BMP-9의 ALK1에의 결합에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 0-50 nM 농도의 hENG(26-586)을 고정 농도의 BMP-9 (10 nM)와 미리 혼합하고, 포획된 ALK1에의 BMP-9 결합을 SPR 기반 검정법에 의해 측정하였다. 최상위 트레이스는 hENG(26-586) 비포함에 상응하는 반면, 최하의 트레이스는 5:1 비의 ENG:BMP-9에 상응한다. BMP-9의 ALK1에의 결합은 농도에 의존하는 방식으로 가용성 hENG(26-586)에 의해 억제되었고, IC50은 9.7 nM이었다.
도 21은 가용성 인간 ENG 세포외 도메인, hENG(26-586)이 BMP-10의 ALK1에의 결합에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 0-50 nM 농도의 hENG(26-586)을 고정 농도의 BMP-10 (10 nM)과 미리 혼합하고, 포획된 ALK1에의 BMP-10 결합을 SPR 기반 검정법에 의해 측정하였다. 최상위 트레이스는 hENG(26-586) 비포함에 상응하는 반면, 최하의 트레이스는 5:1 비의 ENG:BMP-10에 상응한다. BMP-10의 ALK1에의 결합은 농도에 의존하는 방식으로 가용성 hENG(26-586)에 의해 억제되었고, IC50은 6.3 nM이었다.
도 22는 mENG(27-581)-hFC가 배양물 중 인간 제정맥 내피 세포 (HUVEC)에 의한 제대 형성에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 데이터는 두 배양물의 평균 ± SD이다. 유도제인 내피 세포 성장 물질 (ECGS)은 비처리군과 비교하였을 때 제대의 평균 길이를 배가시켰고, mENG(27-581)-hFc는 상기 증가를 거의 60%만큼 감축시켰다. 자극 부재시 (비처리), mENG(27-581)-hFc 효과는 거의 없었다.
도 23은 닭 융모막요막 (CAM) 검정법에서 mENG(27-581)-hFc가 VEGF에 의해 자극받은 혈관신생에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이고; *, p < 0.05이다. VEGF 처리에 의해 유도된 추가의 혈관 개수는 공동 mENG(27-581)-hFc 처리로 65%만큼 감소되었다.
도 24는 마우스 혈관반응기(angioreactor) 검정법에서 11일 동안의 mENG(27-581)-mFc 처리가 성장 인자 (GF)인 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2)의 조합에 의해 자극받은 혈관신생에 대해 미치는 효과를 보여주는 것이다. 혈관신생 상대적 형광 단위 ± SEM; *, p < 0.05이다. mENG(27-581)-mFc는 본 생체내 검정법에서 GF에 의해 자극받은 혈관신생을 완전하게 차단시켰다.
도 25는 hENG-Fc 융합 구축물의 도메인 구조를 보여주는 것이다. 전장의 ENG 세포외 도메인 (상단의 구조에서 잔기 26-586)은 고아(orphan) 도메인, 및 N-말단 및 C-말단 투명대 (ZP) 도메인으로 이루어져 있다. 아래에는 선택된 말단절단된 변이체의 구조, 및 그가 SPR 기반 검정법에서 BMP-9 및 BMP-10에 대해 고-친화성 결합을 보이는지 여부 (+/-)가 제시되어 있다.
도 26은 hENG(26-437)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 27은 hENG(26-437)-hFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열을 코딩하는 것은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 28은 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-378)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 29는 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-378)-hFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 30은 hENG(26-359)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 31은 hENG(26-359)-hFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열을 코딩하는 것은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 32는 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-359)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 33은 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-359)-hFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열을 코딩하는 것은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 34는 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-346)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 35는 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-346)-hFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 36은 각각의 CHO-세포 유래의 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제한 이후의, hENG(26-586)-hFc (a), hENG(26-359)-hFc (b), 및 hENG(26-346)-hFc (c)에 대한 크기 배제 크로마토그램을 보여주는 것이다. 단량체 hENG(26-346)-hFc의 회수율(%)은 hENG(26-586)-hFc의 것과 동일하였다. 그에 반해, 단량체 hENG(26-359)-hFc의 회수는 추가의 고분자량 응집체의 존재로 인하여 감소되었고, 이로써, 다른 구축물의 것과 동일한 순도를 얻기 위해서는 추가의 방법을 필요로 하였다.
도 37은 SPR 기반 검정법에서 측정된 바와 같은, hENG(26-586)-hFc (a), hENG(26-359)-hFc (b), 및 hENG(26-346)-hFc (c)에의 BMP-9 결합에 관한 동적 특징 규명을 보여주는 것이다. 리간드 농도 0.0195-0.625 nM에서 2배씩 증분시키면서 포획된 CHO-세포 유래의 단백질에의 BMP-9 결합을 평가하였다. RU, 반응 단위. hENG(26-586)-hFc와 비교하여 말단절단된 변이체의 오프 속도는 더 느린 것에 주목한다.
도 38은 CAM 검정법에서 hENG(26-359)-hFc가 VEGF에 의해 자극받은 혈관신생에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이고; *, p < 0.05이다. 비록 hENG(26-359)-hFc는 VEGF에 결합하지 않더라도, VEGF 처리에 의해 유도된 추가의 혈관 개수는 공동 hENG(26-359)-hFc 처리로 75%만큼 감소되었다.
도 39는 마우스 혈관반응기 검정법에서 11일 동안의 hENG(26-346)-hFc 처리가 성장 인자 (GF)인 VEGF 및 FGF-2의 조합에 의해 자극받은 혈관신생에 대해 미치는 효과를 보여주는 것이다. a. 혈관신생 상대적 형광 단위 ± SEM; *, p < 0.05이다. b. 처리군에 의해 배열된 개별 혈관반응기 (마우스 1마리당 4개)에 관한 사진으로, 여기서, 혈관 형성은 음영 표시된 콘텐츠로 육안으로 보인다. 비록 VEGF 또는 FGF-2 그 자체에 결합하지는 못하지만, hENG(26-346)-hFc는 본 생체내 검정법에서 GF에 의해 자극받은 혈관신생을 완전하게 차단시켰다.
도 40은 마우스에서 mENG(27-581)-mFc가 4T1 유방 종양 이식편의 성장에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이다. 이식 후 24일째까지 종양 부피는 비히클과 비교하였을 때 mENG(27-581)-mFc로 처리된 마우스에서 45% 더 낮았다 (p < 0.05).
도 41은 마우스에서 mENG(27-581)-mFc가 콜론-26(Colon-26) 종양 이식편의 성장에 미치는 효과를 보여주는 것이다. mENG(27-581)-mFc 처리는 용량에 의존하는 방식으로 종양 성장을 억제시켰고, 여기서, 이식 후 58일째까지 고용량 군에서의 종양 부피는 비히클보다 거의 70% 더 낮았다.
도 42는 엔도글린 (mENG(27-581)-mFc) 처리된, 또는 그로 처리되지 않은, 간 섬유증의 마우스 CCl4 모델에서의 간 (체중(%))을 보여주는 것이다.
도 43은 모의 주사를 맞은 (PBS) 마우스에서의 간 조직의 H&E 염색을 보여주는 것이다.
도 44는 mENG(27-581)-mFc 주사를 맞은 마우스에서의 간 조직의 H&E 염색을 보여주는 것이다.
도 45는 CCl4 유도성 마우스에서의 간 조직의 마손 트리크롬(Masson's Trichrome) 염색을 보여주는 것이다.
도 46은 PBS 또는 mENG(27-581)-mFc 주사를 맞은 CCl4 유도성 마우스에서의 간 조직의 오일 레드 O(Oil Red O) 염색을 보여주는 것이다. mENG(27-581)-mFc 처리된 동물이 광범위한 양성 오일 레드 O 염색을 보이는 간 비율(%)이 가장 낮았다.
도 47은 mENG(27-581)-mFc 또는 PBS로 처리된 CCl4 유도성 및 모의 유도성 (올리브 오일) 마우스에서의 혈청 알칼리성 포스페이트 수준을 보여주는 것이다. 혈청 AP는 엔도글린 처리된 코호트에서 더 낮았다.
도 48은 메티오닌 및 콜린 식이 부족에 의해 유발된 간 섬유증의 모델인 MCDD 마우스에서의 ENG-Fc 처리가 간 지질 침착에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 비히클 (a, c)과 비교하여, 3주 동안의 mENG(27-581)-mFc 처리가 MCDD 마우스에서 간 지질 침착물을 현저히 감소시켰다 (b, d). 지질 침착물은 지질 가용성 디아조 염료인 오일 레드 O로 진하게 염색된 것에 의해 확인되었다. 확대 배율, 100x (a, b) 및 200x (c, d).
도 2는 인간 ENG, 이소형 1 (L-ENG)을 코딩하는 천연 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 리더 (뉴클레오티드 414-488)를 코딩하는 서열 및 예측된 막횡단 도메인 (뉴클레오티드 2172-2246)을 코딩하는 서열은 각각 밑줄로 표시되어 있다.
도 3은 인간 ENG, 이소형 2 (S-ENG)의 천연 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 리더 (잔기 1-25) 및 예측된 막횡단 도메인 (잔기 587-611)은 각각 밑줄로 표시되어 있다. 이소형 1과 비교하여 이소형 2는 더 짧고, 상이한 C-말단을 가지지만, 세포외 도메인의 서열 (도 9 참조)은 동일하다.
도 4는 인간 ENG, 이소형 2 (S-ENG)를 코딩하는 천연 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 리더 (뉴클레오티드 414-488)를 코딩하는 서열 및 예측된 막횡단 도메인 (뉴클레오티드 2172-2246)을 코딩하는 서열은 각각 밑줄로 표시되어 있다.
도 5는 뮤린 ENG, 이소형 1 (L-ENG)의 천연 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 리더 (잔기 1-26) 및 예측된 막횡단 도메인 (잔기 582-606)은 밑줄로 표시되어 있고, 성숙한 펩티드의 세포외 도메인을 괄호로 표시하고 있다 (도 10 참조). 뮤린 ENG의 이소형 3 (진뱅크(GenBank) 수탁 NM_001146348)은 오직 리더에서만 명시된 서열과 상이하며, 여기서, (강조 표시되어 있는) 23번 위치의 트레오닌은 결실되어 있고, (역시 강조 표시되어 있는) 24번 위치에는 글리신→세린으로의 치환이 존재한다.
도 6은 뮤린 ENG, 이소형 1 (L-ENG)을 코딩하는 천연 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 리더 (뉴클레오티드 364-441)를 코딩하는 서열 및 예측된 막횡단 도메인 (뉴클레오티드 2107-2181)을 코딩하는 서열은 밑줄로 표시되어 있다. 뮤린 ENG의 이소형 3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (진뱅크 수탁 NM_001146348)은 오직 리더에서만, 구체적으로 (강조 표시되어 있는) 430-433 위치에서 명시된 서열과 상이하다.
도 7은 뮤린 ENG, 이소형 2 (S-ENG) 천연 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 리더 (잔기 1-26) 및 예측된 막횡단 도메인 (잔기 582-606)은 밑줄로 표시되어 있다. 이소형 1과 비교하여 이소형 2는 더 짧고, 상이한 C-말단을 가지지만, 세포외 도메인의 서열 (도 10 참조)은 동일하다.
도 8은 뮤린 ENG, 이소형 2 (S-ENG)를 코딩하는 천연 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. 리더 (뉴클레오티드 364-441)를 코딩하는 서열 및 예측된 막횡단 도메인 (뉴클레오티드 2107-2181)을 코딩하는 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
도 9는 인간 ENG의 세포외 도메인의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 두 인간 이소형의 세포외 도메인은 아미노산 및 뉴클레오티드 서열, 둘 모두가 동일하다.
도 10은 그의 인간 대응물과 69% 동일한, 뮤린 ENG의 세포외 도메인의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 두 뮤린 이소형의 세포외 도메인은 아미노산 및 뉴클레오티드 서열, 둘 모두가 동일하다.
도 11은 인간 IgG1 Fc 도메인의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 밑줄로 표시된 잔기는 텍스트에서 논의되는 임의적 돌연변이 부위이다.
도 12는 인간 IgG1 Fc 도메인의 N-말단이 말단절단된 아미노산 서열을 보여주는 것이다. 밑줄로 표시된 잔기는 텍스트에서 논의되는 임의적 돌연변이 부위이다.
도 13은 hENG(26-586)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 14는 hENG(26-586)-hFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열을 코딩하는 것은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 15는 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-586)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 16은 mENG(27-581)-mFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 17은 mENG(27-581)-mFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열을 코딩하는 것은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 18은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기반 검정법으로 측정된 바와 같은, hENG(26-586)-hFc에의 BMP-9 결합의 특징 규명을 보여주는 것이다. 포획된 hENG(26-586)-hFc에의 BMP-9 결합을 0 내지 0.01-0.625 nM의 리간드 농도에서 (2배씩 증분시키면서, 0.3125 nM 배제) 평가하였고, 비선형 회귀를 사용하여 KD는 29 pM인 것으로 측정되었다.
도 19는 SPR 기반 검정법으로 측정된 바와 같은, hENG(26-586)-hFc에의 BMP-10 결합의 특징 규명을 보여주는 것이다. 포획된 hENG(26-586)-hFc에의 BMP-10 결합을 0 내지 0.01-1.25 nM의 리간드 농도에서 (2배씩 증분시키면서) 평가하였고, 비선형 회귀를 사용하여 KD는 400 pM인 것으로 측정되었다.
도 20은 가용성 인간 ENG 세포외 도메인, hENG(26-586)이 BMP-9의 ALK1에의 결합에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 0-50 nM 농도의 hENG(26-586)을 고정 농도의 BMP-9 (10 nM)와 미리 혼합하고, 포획된 ALK1에의 BMP-9 결합을 SPR 기반 검정법에 의해 측정하였다. 최상위 트레이스는 hENG(26-586) 비포함에 상응하는 반면, 최하의 트레이스는 5:1 비의 ENG:BMP-9에 상응한다. BMP-9의 ALK1에의 결합은 농도에 의존하는 방식으로 가용성 hENG(26-586)에 의해 억제되었고, IC50은 9.7 nM이었다.
도 21은 가용성 인간 ENG 세포외 도메인, hENG(26-586)이 BMP-10의 ALK1에의 결합에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 0-50 nM 농도의 hENG(26-586)을 고정 농도의 BMP-10 (10 nM)과 미리 혼합하고, 포획된 ALK1에의 BMP-10 결합을 SPR 기반 검정법에 의해 측정하였다. 최상위 트레이스는 hENG(26-586) 비포함에 상응하는 반면, 최하의 트레이스는 5:1 비의 ENG:BMP-10에 상응한다. BMP-10의 ALK1에의 결합은 농도에 의존하는 방식으로 가용성 hENG(26-586)에 의해 억제되었고, IC50은 6.3 nM이었다.
도 22는 mENG(27-581)-hFC가 배양물 중 인간 제정맥 내피 세포 (HUVEC)에 의한 제대 형성에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 데이터는 두 배양물의 평균 ± SD이다. 유도제인 내피 세포 성장 물질 (ECGS)은 비처리군과 비교하였을 때 제대의 평균 길이를 배가시켰고, mENG(27-581)-hFc는 상기 증가를 거의 60%만큼 감축시켰다. 자극 부재시 (비처리), mENG(27-581)-hFc 효과는 거의 없었다.
도 23은 닭 융모막요막 (CAM) 검정법에서 mENG(27-581)-hFc가 VEGF에 의해 자극받은 혈관신생에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이고; *, p < 0.05이다. VEGF 처리에 의해 유도된 추가의 혈관 개수는 공동 mENG(27-581)-hFc 처리로 65%만큼 감소되었다.
도 24는 마우스 혈관반응기(angioreactor) 검정법에서 11일 동안의 mENG(27-581)-mFc 처리가 성장 인자 (GF)인 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2)의 조합에 의해 자극받은 혈관신생에 대해 미치는 효과를 보여주는 것이다. 혈관신생 상대적 형광 단위 ± SEM; *, p < 0.05이다. mENG(27-581)-mFc는 본 생체내 검정법에서 GF에 의해 자극받은 혈관신생을 완전하게 차단시켰다.
도 25는 hENG-Fc 융합 구축물의 도메인 구조를 보여주는 것이다. 전장의 ENG 세포외 도메인 (상단의 구조에서 잔기 26-586)은 고아(orphan) 도메인, 및 N-말단 및 C-말단 투명대 (ZP) 도메인으로 이루어져 있다. 아래에는 선택된 말단절단된 변이체의 구조, 및 그가 SPR 기반 검정법에서 BMP-9 및 BMP-10에 대해 고-친화성 결합을 보이는지 여부 (+/-)가 제시되어 있다.
도 26은 hENG(26-437)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 27은 hENG(26-437)-hFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열을 코딩하는 것은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 28은 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-378)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 29는 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-378)-hFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 30은 hENG(26-359)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 31은 hENG(26-359)-hFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열을 코딩하는 것은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 32는 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-359)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 33은 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-359)-hFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열을 코딩하는 것은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 34는 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-346)-hFc의 아미노산 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인은 밑줄로 표시되어 있고, TPA 리더 서열은 이중 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 35는 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 hENG(26-346)-hFc를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 것이다. ENG 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되어 있고, 링커 서열을 코딩하는 것은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 36은 각각의 CHO-세포 유래의 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제한 이후의, hENG(26-586)-hFc (a), hENG(26-359)-hFc (b), 및 hENG(26-346)-hFc (c)에 대한 크기 배제 크로마토그램을 보여주는 것이다. 단량체 hENG(26-346)-hFc의 회수율(%)은 hENG(26-586)-hFc의 것과 동일하였다. 그에 반해, 단량체 hENG(26-359)-hFc의 회수는 추가의 고분자량 응집체의 존재로 인하여 감소되었고, 이로써, 다른 구축물의 것과 동일한 순도를 얻기 위해서는 추가의 방법을 필요로 하였다.
도 37은 SPR 기반 검정법에서 측정된 바와 같은, hENG(26-586)-hFc (a), hENG(26-359)-hFc (b), 및 hENG(26-346)-hFc (c)에의 BMP-9 결합에 관한 동적 특징 규명을 보여주는 것이다. 리간드 농도 0.0195-0.625 nM에서 2배씩 증분시키면서 포획된 CHO-세포 유래의 단백질에의 BMP-9 결합을 평가하였다. RU, 반응 단위. hENG(26-586)-hFc와 비교하여 말단절단된 변이체의 오프 속도는 더 느린 것에 주목한다.
도 38은 CAM 검정법에서 hENG(26-359)-hFc가 VEGF에 의해 자극받은 혈관신생에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이고; *, p < 0.05이다. 비록 hENG(26-359)-hFc는 VEGF에 결합하지 않더라도, VEGF 처리에 의해 유도된 추가의 혈관 개수는 공동 hENG(26-359)-hFc 처리로 75%만큼 감소되었다.
도 39는 마우스 혈관반응기 검정법에서 11일 동안의 hENG(26-346)-hFc 처리가 성장 인자 (GF)인 VEGF 및 FGF-2의 조합에 의해 자극받은 혈관신생에 대해 미치는 효과를 보여주는 것이다. a. 혈관신생 상대적 형광 단위 ± SEM; *, p < 0.05이다. b. 처리군에 의해 배열된 개별 혈관반응기 (마우스 1마리당 4개)에 관한 사진으로, 여기서, 혈관 형성은 음영 표시된 콘텐츠로 육안으로 보인다. 비록 VEGF 또는 FGF-2 그 자체에 결합하지는 못하지만, hENG(26-346)-hFc는 본 생체내 검정법에서 GF에 의해 자극받은 혈관신생을 완전하게 차단시켰다.
도 40은 마우스에서 mENG(27-581)-mFc가 4T1 유방 종양 이식편의 성장에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이다. 이식 후 24일째까지 종양 부피는 비히클과 비교하였을 때 mENG(27-581)-mFc로 처리된 마우스에서 45% 더 낮았다 (p < 0.05).
도 41은 마우스에서 mENG(27-581)-mFc가 콜론-26(Colon-26) 종양 이식편의 성장에 미치는 효과를 보여주는 것이다. mENG(27-581)-mFc 처리는 용량에 의존하는 방식으로 종양 성장을 억제시켰고, 여기서, 이식 후 58일째까지 고용량 군에서의 종양 부피는 비히클보다 거의 70% 더 낮았다.
도 42는 엔도글린 (mENG(27-581)-mFc) 처리된, 또는 그로 처리되지 않은, 간 섬유증의 마우스 CCl4 모델에서의 간 (체중(%))을 보여주는 것이다.
도 43은 모의 주사를 맞은 (PBS) 마우스에서의 간 조직의 H&E 염색을 보여주는 것이다.
도 44는 mENG(27-581)-mFc 주사를 맞은 마우스에서의 간 조직의 H&E 염색을 보여주는 것이다.
도 45는 CCl4 유도성 마우스에서의 간 조직의 마손 트리크롬(Masson's Trichrome) 염색을 보여주는 것이다.
도 46은 PBS 또는 mENG(27-581)-mFc 주사를 맞은 CCl4 유도성 마우스에서의 간 조직의 오일 레드 O(Oil Red O) 염색을 보여주는 것이다. mENG(27-581)-mFc 처리된 동물이 광범위한 양성 오일 레드 O 염색을 보이는 간 비율(%)이 가장 낮았다.
도 47은 mENG(27-581)-mFc 또는 PBS로 처리된 CCl4 유도성 및 모의 유도성 (올리브 오일) 마우스에서의 혈청 알칼리성 포스페이트 수준을 보여주는 것이다. 혈청 AP는 엔도글린 처리된 코호트에서 더 낮았다.
도 48은 메티오닌 및 콜린 식이 부족에 의해 유발된 간 섬유증의 모델인 MCDD 마우스에서의 ENG-Fc 처리가 간 지질 침착에 미치는 효과를 보여주는 것이다. 비히클 (a, c)과 비교하여, 3주 동안의 mENG(27-581)-mFc 처리가 MCDD 마우스에서 간 지질 침착물을 현저히 감소시켰다 (b, d). 지질 침착물은 지질 가용성 디아조 염료인 오일 레드 O로 진하게 염색된 것에 의해 확인되었다. 확대 배율, 100x (a, b) 및 200x (c, d).
1. 개요
특정 측면에서, 본 발명은 ENG 폴리펩티드에 관한 것이다. ENG (이는 또한 CD105로도 공지되어 있다)는 리간드인 형질전환 성장 인자-β (TGF-β) 슈퍼패밀리에 대한 공수용체로서 지칭되며, 이는 정상적 및 병적 섬유증 및 혈관신생에 연루되어 있다. ENG 발현은 휴지 혈관 내피에서는 낮지만, 치유 중인 상처, 발생 중인 배아, 염증 조직, 및 고형 종양의 내피 세포에서는 상향조절되어 있다 (Dallas et al., 2008, Clin Cancer Res 14:1931-1937). 널 ENG 대립유전자에 대하여 동형접합성인 마우스는 결손 혈관 발생에 기인하여 임신 상태에서 조기에 사망하는 반면 (Li et al., 1999, Science 284:1534-1537), 이형접합성인 널 ENG 마우스는 성체로서 혈관신생 이상을 보인다 (Jerkic et al., 2006, Cardiovasc Res 69:845-854). 인간에서, ENG 유전자 돌연변이는, 개재 모세관상 없이 동맥에서 정맥으로의 직접적인 유동 (소통)을 초래하는 동정맥 기형 (동정맥 션트)을 특징으로 하는, 상염색체 우성 형태의 혈관 형성 이상인 유전성 출혈성 모세혈관 확장증 (오슬러-랑뒤-웨버 증후군(Osler-Rendu-Weber syndrome)) 1형 (HHT-1)의 원인인 것으로 확인되었다 (McAllister et al., 1994, Nat Genet 8:345-351; Fernandez-L et al., 2006, Clin Med Res 4:66-78). HHT 환자의 전형적인 증상으로는 반복성 비출혈, 위장 출혈, 피부 및 점막피부 모세혈관 확장증, 및 폐, 뇌, 또는 간 혈관구조에서의 동정맥 기형을 포함한다.
비록 섬유증 및 혈관신생에서 ENG의 구체적인 역할은 여전히 확인되어야 하는 상태로 남아있기는 하지만, 본 과정에서 TGF-β 신호전달 시스템의 중요한 역할과 관련이 있을 가능성이 있다 (Cheifetz et al., 1992, J Biol Chem 267:19027-19030; Pardali et al., 2010, Trends Cell Biol 20:556-567). 중요하게는, ENG 발현은 종양 조직 내의 증식성 혈관 내피 세포에서 상향조절되어 있고 (Burrows et al., 1995, Clin Cancer Res 1:1623-1634; Miller et al., 1999, Int J Cancer 81:568-572), 종양내 ENG 발현 혈관의 개수는 광범위한 인간 종양에 대한 생존과 음의 상관관계를 가진다 (Fonsatti et al., 2010, Cardiovasc Res 86:12-19). 따라서, ENG는 일반적으로는 항혈관신생 요법을 위한, 및 특히 암을 위한 유망한 표적이다 (Dallas et al., 2008, Clin Cancer Res 14:1931-1937; Bernabeu et al., 2009, Biochim Biophys Acta 1792:954-973).
구조적으로, ENG는 동종이량체 세포 표면 당단백질이다. 이는 투명대(ZP) 패밀리의 단백질에 속하고, 단쇄인 C-말단 세포질 도메인, 단일 소수성 막횡단 도메인, 및 장쇄인 세포외 도메인 (ECD)으로 이루어진다 (Gougos et al., 1990, J Biol Chem 265:8361-8364). 전자 현미경법으로 측정되는 바, 단량체 ENG ECD는 2개의 ZP 영역 및 N-말단에 위치하는 고아 도메인으로 이루어진다 (Llorca et al., 2007, J Mol Biol 365:694-705). 인간에서, 1차 전사체의 선택적 스플라이싱 결과, 오직 그의 세포질 도메인에서만 차이가 나는 것인, 하나는 658개의 잔기로 이루어지고 (장쇄, L, 서열 1), 나머지 다른 하나는 625개의 잔기로 이루어진 (단쇄, S, 서열 3) 2개의 ENG 이소형이 생성된다 (Bellon et al., 1993, 23:2340-2345; ten Dijke et al., 2008, Angiogenesis 11:79-89). 뮤린 ENG는 3개의 이소형: L-ENG (서열 5), S-ENG (서열 7), 및 리더 서열 내의 두 위치에서의 변이를 제외하면, L-ENG와 동일한 것인, 기능상 유의성이 공지되지 않은 제3 변이체 (이소형 3)로 존재한다 (Perez-Gomez et al., 2005, Oncogene 24:4450-4461). 뮤린 ENG의 ECD는 인간 ENG의 것과 69%의 아미노산 동일성을 보이고, 여기에는 인간 단백질에서 관찰되는 Arg-Gly-Asp (RGD) 인테그린 상호작용 모티프는 없다. 최근의 증거는 L-ENG 및 S-ENG 이소형이 생체내에서 상이한 기능적 역할을 할 수 있다는 것을 제안한다 (Blanco et al., 2008, Circ Res 103:1383-1392; ten Dijke et al., 2008, Angiogenesis 11:79-89).
공수용체로서, ENG는 그 자체적으로 리간드 신호전달을 직접 매개하지 않고 TGF-β 패밀리 리간드에 대한 다른 수용체의 반응을 조정하는 것으로 사료된다. TGF-β 패밀리에서 리간드는 전형적으로는 동종이량체 II형 수용체에 결합함으로써 신호전달을 하고, 이로써, 동종이량체 I형 수용체를 동원하고, 그의 인산기 전달 반응을 일으켜 특이 유전자의 전사 활성화를 담당하는 Smad 단백질을 인산화시킨다 (Massague, 2000, Nat Rev Mol Cell Biol 1:169-178). 이소성 세포 발현 검정법에 기초하여, ENG는 단독으로 리간드에 결합하고, 그가 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A, 골 형태형성 단백질-2 (BMP-2), 및 BMP-7에 결합하기 위해서는 적절한 I형 및/또는 II형 수용체가 존재하여야 한다는 것으로 보고되었다 (Barbara et al., 1999, J Biol Chem 274:584-594). 그럼에도 불구하고, 섬유모세포 세포주에 의해 발현된 ENG는 TGF-β1에 결합할 수 있음을 증명하는 증거가 있으며 (St.-Jacques et al., 1994, Endocrinology 134:2645-2657), COS 세포에서의 최근 결과는 형질감염된 전장의 ENG가 형질감염된 I형 또는 II형 수용체의 부재하에서 BMP-9에 결합할 수 있다는 것을 시사한다 (Scharpfenecker et al., 2007, J Cell Sci 120:964-972).
상기 내용 이외에도, ENG는 전장의 막 결합 단백질의 단백질 분해 절단 이후에 특정 조건하에서 생체내에서 가용성 형태로 존재할 수 있다 (Hawinkels et al., 2010, Cancer Res 70:4141-4150). 암 및 자간전증을 앓는 환자의 순환에서 상승된 수준의 가용성 ENG가 관찰되었다 (Li et al., 2000, Int J Cancer 89:122-126; Calabro et al., 2003, J Cell Physiol 194:171-175; Venkatesha et al., 2006, Nat Med 12:642-649; Levine et al., 2006, N Engl J Med 355:992-1005). 내인성인 가용성 ENG의 역할에 관한 이해가 충분하지 못함에도 불구하고, ENG 전구체의 잔기 26-437에 상응하는 단백질 (서열 1의 아미노산 26-437)이 TGF-β 패밀리 리간드에 대한 스캐빈저 또는 트랩으로서의 역할을 하는 것으로 제안되었으며 (Venkatesha et al., 2006, Nat Med 12:642-649; WO-2007/143023), 그 중 TGF-β1 및 TGF-β3만이 특이적으로 연루되어 왔다.
본 개시내용은 BMP9 및/또는 BMP10에 선택적으로 결합하고, BMP9 및/또는 BMP10 길항제로서 작용할 수 있고, 전장의 세포외 도메인과 비교하여 유익한 특성을 제공하며, 섬유증을 억제시키는 데 사용될 수 있는, ENG의 세포외 도메인의 말단절단된 부분을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 부분적으로, 본 개시내용은 가용성 ENG 폴리펩티드에 대한 생리학적의 고친화성 리간드의 아이덴티티를 제공한다. 놀랍게도, 가용성 ENG 폴리펩티드는 본원에서 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3에 대해서는 어떤 중요한 결합도 보이지 않으면서, BMP-9 및 BMP-10에 대해서는 고도로 특이적인 고친화성 결합을 가지는 것으로 나타났고, 추가로, 가용성 ENG 폴리펩티드는 II형 수용체와의 BMP9 및 BMP10 상호작용을 억제시킴으로써 세포 신호 전달을 억제시키는 것으로 나타났다. 본 개시내용은 추가로 ENG 폴리펩티드가 섬유증을 억제시킨다는 것을 입증한다. 데이터는 또한 ENG 폴리펩티드가 TGF-β1, TGF-β3, VEGF, 또는 FGF-2에 대해서는 어떤 중요한 결합도 보이지 않는다는 관찰 결과에도 불구하고, ENG 폴리펩티드가 항혈관신생 효과를 발휘할 수 있다는 것을 입증한다.
따라서, 특정 측면에서, 본 개시내용은 일반적으로는 임의의 BMP-9 또는 BMP-10 장애를 억제시키는 데, 및 특히, VEGF 의존성 혈관신생 및 VEGF 비의존성 혈관신생, 둘 모두를 비롯한, 혈관신생 및/또는 섬유증을 억제시키는 데 사용하기 위한 BMP-9 또는 BMP-10의 길항제로서의 엔도글린 폴리펩티드를 제공한다. 그러나, ENG 그 자체에 대한 항체는 ENG 폴리펩티드와 상이한 효과를 가지는 것으로 예상된다는 점에 주목하여야 한다. ENG에 대한 범-중화 항체 (강력한 리간드 및 약한 리간드 모두의 결합을 억제시키는 것)는 ENG를 통해 상기 리간드의 신호전달을 억제시키는 것으로 예상되겠지만, 다른 수용체 (예컨대, BMP-9 또는 BMP-10의 경우, ALK-1, ALK-2, BMPRII, ActRIIA 또는 ActRIIB)를 통한 신호전달을 수행할 수 있는 상기 리간드의 능력을 억제시킨다고는 예상되지 않을 것이다. 본원에서 제시하는 데이터에 기초하여 가정컨대 천연 BMP-9/10 길항제로서의 역할을 하는 것으로 추정되는 천연, 순환 가용성 ENG 폴리펩티드가 존재한다고 볼 때, 중화 항ENG 항체가 주로 막 결합 형태의 ENG를 억제시키는지 (따라서, ENG/BMP-9/10 길항제로서 작용), 또는 가용성 형태의 ENG를 억제시키는지 (따라서, ENG/BMP-9/10 효능제로서 작용), 그에 관해서는 명확하지 않다는 점에 추가로 주목하여야 한다. 한편, 본 개시내용에 기초하여, ENG 폴리펩티드는 그가 밀착 결합하는 모든 리간드 (실시예에 제시된 것과 같은 구축물의 경우, BMP-9 또는 BMP-10 포함)를 억제시킬 것으로 예상되겠지만, 약하게 결합하는 리간드에는 영향을 미치지 않을 것이다. 따라서, ENG에 대한 범-중화 항체는 ENG를 통한 BMP-9 및 BMP-10 신호전달을 차단하지만, 또 다른 수용체를 통한 BMP-9 또는 BMP-10 신호전달은 차단하지 못할 것이다. 따라서, ENG 폴리펩티드는 모든 수용체 (ENG 이외의 수용체 포함)를 통한 BMP-9 신호전달은 억제시킬 수 있겠지만, 임의의 수용체, 심지어는 ENG를 통해 약하게 결합한 리간드 신호전달을 억제시킨다고는 예상되지 않을 것이다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에 기술된 단백질은 인간 형태의 것이다. 단백질에 대한 진뱅크(Genbank) 참조는 하기와 같다: 인간 ENG 이소형 1 (L-ENG), NM_001114753; 인간 ENG 이소형 2 (S-ENG), NM_000118; 뮤린 ENG 이소형 1 (L-ENG), NM_007932; 뮤린 ENG 이소형 2 (S-ENG), NM_001146350; 뮤린 ENG 이소형 3, NM_001146348. 인간 및 마우스로부터의 천연 ENG 단백질의 서열은 도 1-8에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 일반적으로 관련 기술분야에서, 본 개시내용의 맥락 내에서, 및 각 용어가 사용되는 구체적인 문맥에서 그의 일반적인 의미를 가진다. 본원에 개시된 조성물 및 방법, 및 그를 제조 및 사용하는 방법을 기술하는 데 있어 종사자에게 추가의 가이던스를 제공하기 위해 특정 용어는 본 명세서에서 논의된다. 용어의 임의 사용에 관한 범주 또는 의미는 그 용어가 사용되는 구체적인 문맥으로부터 자명해질 것이다.
2.
ENG 폴리펩티드의 치료학적 방법 및 용도
섬유증 및 섬유화 장애
본 개시내용의 일부 측면은 ENG 폴리펩티드가 섬유화 장애를 억제 및/또는 치료하는 데 사용될 수 있다는 놀라운 인지에 기초한다. 본 개시내용은 유효량의 ENG 폴리펩티드, 예컨대, 서열 1의 아미노산 42-333과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ENG 폴리펩티드 (상기의 ENG-Fc 융합 단백질 또는 핵산 길항제 (예컨대, 안티센스 또는 siRNA) 포함)를 대상체에게 투여함으로써 포유동물에서 섬유증을 억제시키는 방법을 제공한다. ENG 폴리펩티드, ENG-Fc 융합 단백질, 및 핵산 길항제는 이하 총칭하여 "치료제"로서 지칭된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 섬유증의 치료, 억제, 또는 예방에서 유용한 ENG 폴리펩티드 및 상기 ENG 폴리펩티드 사용 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바, "섬유증"이라는 용어는 기관 또는 조직 중의 세포에 의한 과도한 섬유 결합 조직의 비정상적인 형성 또는 발생을 의미한다. 섬유증과 관련된 과정이 정상적인 조직 형성 또는 수복의 일부로서도 발생할 수 있지만, 이러한 과정의 조절이상은 변경된 세포 조성 및 과도한 결합 조직 침착을 유도할 수 있으며, 이는 계속해서 조직 또는 기관 기능을 손상시키게 된다. 섬유 조직의 형성은 수복성 또는 반응성 과정으로부터 초래될 수 있다.
본원에서 제공하는 바와 같은 ENG 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 사용하는 치료 방법으로 치료될 수 있는 섬유화 장애 또는 병태로는 (예컨대, 문헌 [Wynn, 2004, Nat Rev 4:583-594] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이) 혈관 질환, 예컨대, 심장 질환, 뇌 질환, 및 말초 혈관 질환 뿐만 아니라, 심장, 피부, 신장, 폐, 복막, 소화관, 및 간을 비롯한 조직계 및 기관계와 관련된 섬유증식성 장애를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 치료될 수 있는 예시적인 장애로는 손상/섬유증과 관련된 신장병증, 예컨대, 당뇨병과 관련된 만성 신장병증 (예컨대, 당뇨성 신장병증), 루푸스, 경피증, 사구체 신염, 초점성 분절성 사구체 경화증, 및 IgA 신장병증을 비롯한, 신장 섬유증; 폐 또는 폐성 섬유증, 예컨대, 특발성 폐 섬유증, 방사선 유발성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 경피증, 및 만성 천식; 소화관 섬유증, 예컨대, 경피증, 및 방사선 유발성 소화관 섬유증; 간 섬유증, 예컨대, 경변증, 알콜 유발성 간 섬유증, 담즙관 손상, 원발성 담즙성 간경변증, 감염 또는 바이러스 유도성 간 섬유증, 선천성 간 섬유증 및 자가면역 간염; 및 다른 섬유화 병태, 예컨대, 낭성 섬유증, 심내막심근 섬유증, 종격 섬유증, 흉막 섬유증, 사르코이드증, 경피증, 척수 손상/섬유증, 골수 섬유증, 혈관 재협착, 죽상동맥경화증, 췌장 및 폐의 낭성 섬유증, (특히 아동에서의 근육내 주사의 합병증으로서 발생할 수 있는) 주사 섬유증, 심내막심근 섬유증, 폐의 특발성 폐 섬유증, 종격 섬유증, 골수 섬유증, 복막뒤 섬유증, 진행성 종괴성 섬유증, 탄광부 진폐증의 합병증, 및 신원성 전신 섬유증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "섬유화 장애," "섬유화 병태," 및 "섬유화 질환"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 이는 섬유증을 특징으로 하는 장애, 병태 또는 질환을 의미한다. 섬유화 장애의 예로는 혈관 섬유증, 폐 섬유증 (예컨대, 특발성 폐 섬유증), 췌장 섬유증, 간 섬유증 (예컨대, 경변증), 신장 섬유증, 근골격성 섬유증, 심장 섬유증 (예컨대, 심내막심근 섬유증, 특발성 심근병증), 피부 섬유증 (예컨대, 경피증, 외상 후, 수술 피부 흉터 형성, 켈로이드 및 피부 켈로이드 형성), 안구 섬유증 (예컨대, 녹내장, 안구 경화증, 결막 및 각막 흉터 형성, 및 익상편), 진행성 전신 경화증 (PSS), 만성 이식편 대 숙주 질환, 페로니병, 방광경 검사 후의 요도 협착증, 특발성 및 약리학상 유발성 복막뒤 섬유증, 종격 섬유증, 진행성 종괴성 섬유증, 증식성 섬유증, 및 종양성 섬유증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "세포"라는 용어는 섬유화 반응을 쉽게 나타내는 임의의 세포를 의미하며, 이는 개별 세포, 조직, 및 조직 및 기관 내의 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용되는 바, 세포라는 용어는 세포 그 자체 뿐만 아니라, 세포 주변의 세포외 기질 (ECM)을 포함한다. 예를 들어, 세포의 섬유화 반응의 억제는 폐 (또는 폐 조직) 내의 하나 이상의 세포; 간 (또는 간 조직) 내의 하나 이상의 세포; 신장 (또는 신장 조직) 내의 하나 이상의 세포; 근육 조직 내의 하나 이상의 세포; 심장 (또는 심장 조직) 내의 하나 이상의 세포; 췌장 내의 하나 이상의 세포; 피부 내의 하나 이상의 세포; 골 내의 하나 이상의 세포, 혈관구조 내의 하나 이상의 세포, 하나 이상의 줄기 세포, 또는 안구 내의 하나 이상의 세포의 섬유화 반응의 억제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법 및 조성물은 섬유화 장애를 치료 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 섬유화 장애의 예시적인 유형으로는 혈관 섬유증, 폐 섬유증 (예컨대, 특발성 폐 섬유증), 췌장 섬유증, 간 섬유증 (예컨대, 경변증), 신장 섬유증, 근골격성 섬유증, 심장 섬유증 (예컨대, 심내막심근 섬유증, 특발성 심근병증), 피부 섬유증 (예컨대, 경피증, 외상 후, 수술 피부 흉터 형성, 켈로이드 및 피부 켈로이드 형성), 안구 섬유증 (예컨대, 녹내장, 안구 경화증, 결막 및 각막 흉터 형성, 및 익상편), 진행성 전신 경화증 (PSS), 만성 이식편 대 숙주 질환, 페로니병, 방광경 검사 후의 요도 협착증, 특발성 및 약리학상 유발성 복막뒤 섬유증, 종격 섬유증, 진행성 종괴성 섬유증, 증식성 섬유증, 종양성 섬유증, 뒤퓌트랑병, 협착, 및 방사선 유발성 섬유증를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 섬유화 장애는 골수 섬유증이 아니다.
본 발명의 방법 및 조성물은 비알콜성 지방 간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH) 및 장기간의 과도한 알콜 섭취로부터 유발될 수 있는 후천성 섬유화 장애, 담즙정체, 자가면역 간 질환, 철 또는 구리 과부하 및 만성 바이러스성 간염을 비롯한, 간 섬유증으로서의 소견을 보이거나, 또는 그를 초래하는 간 장애를 치료 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다. NAFLD는 비만 및 2형 당뇨벙의 대사 병태로부터 유발된다. NAFLD 환자는 단독으로 지방증 (지방 간)에서부터 괴사염증 (이는 대개 NASH로 명명된다)까지 다양한 병리조직학적 소견을 나타낼 수 있다. NAFLD 및 NASH 환자에서는 진행성 섬유증 및 경변증을 비롯한, 더욱 진행된 상태의 섬유증으로 진행될 수 있다. NASH 환자 중 25%-50%에서는 4 내지 6년 간에 걸쳐 진행성 섬유증이 발생하고, NASH를 앓는 개체 중 15% 내지 25%에서는 계속 진행하여 경변증이 발생할 수 있다. NASH 경변증은 미국에서 간 이식의 중요한 원인이 되며, 이는 간세포 암종의 위험 증가 및 간 이식을 기다리고 있는 환자의 사망과 관련이 있다. 알콜 중독 및 바이러스 감염 또한 간 손상을 유발할 수 있으며, 이는 간 섬유증 및 경변증으로 진행된다. 간 건강 상태 및 섬유화 질환의 진행을 평가하는 데 다양한 도구가 사용될 수 있다. 간 생검을 통해서 조직 중 콜라겐 수준 뿐만 아니라, 지방 간 질환인 경우에는 지질 수준에 대한 염색 및 정량화 비롯한, 간 조직의 조직학적 특징을 평가할 수 있다. NAFLD 활동성 점수 (NAS: NAFLD Activity Score)는 수치 점수를 제공하고, 이는 지방증 (0-3), 간세포 팽대 (0-2) 및 소엽 염증 (0-3)에 대한 개별 점수의 총합이며, NASH 환자 대다수는 NAS 점수가 ≥ 5이다. 문헌 [Kleiner et al., Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 41(6), 1313-1321 (2005)]를 참조할 수 있다. 혈청 마커는 간 기능 마커, ALT 및 AST, 및 세포외 기질 형성의 마커, 섬유용해 과정의 마커, 세포외 기질 분해의 마커, 및 특정 시토카인을 포함한다.
본 발명은 하나 이상의 다른 치료 방식과 함께 조합된 ENG 폴리펩티드의 사용을 고려한다. 따라서, ENG 폴리펩티드 사용 이외에도, 대상체에게 섬유화 장애 치료를 위한 하나 이상의 "표준" 요법 또한 투여할 수 있다. 예를 들어, ENG 폴리펩티드는 세포독소, 면역억제제, 방사성 독성제, 및/또는 치료학적 항체와 함께 조합하여 (즉, 그와 함께) 투여될 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 특정의 공동 치료제로는 스테로이드 (예컨대, 코르티코스테로이드, 예컨대, 프리드니손), 면역억제제 및/또는 항염증제 (예컨대, 감마-인터페론, 시클로포스파미드, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 페니실라민, 시클로스포린, 콜히친, 항흉선세포 글로불린, 마이코페놀레이트 모페틸, 및 히드록시클로로퀸), 세포독성 약물, 칼슘 채널 차단제 (예컨대, 니페디핀), 안지오텐신 전환 효소 억제제 (ACE) 억제제, 파라-아미노벤조산 (PABA), 디메틸 술폭시드, 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-β) 억제제, 인터류킨-5 (IL-5) 억제제, 및 범 카스파제(pan caspase) 억제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
ENG 폴리펩티드와 함께 조합되어 사용될 수 있는 추가의 항섬유화 작용제로는 예를 들어, 미국 특허 번호 7,026,283 (상기 특허의 전체 내용이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같은) 렉틴 뿐만 아니라, 문헌 [Wynn et al (2007, J Clin Invest 117:524-529] (상기 문헌의 전체 내용이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 항섬유화 작용제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 추가의 항섬유화 작용제 및 요법으로는 다양한 항염증성/면역억제성/세포독성 약물 (콜히친, 아자티오프린, 시클로포스파미드, 프리드니손, 탈리도미드, 펜톡시필린 및 테오필린 포함), TGF-β 신호전달 조절제 (펜톡시필린 및 CTGF 억제제 포함), 시토카인 및 시토카인 수용체 길항제 (IL-1β, IL-5, IL-6, IL-13, IL-21, IL-4R, IL-13Rα1, GM-CSF, TNF-α, 온코스타틴 M, WISP-I, 및 PDGF의 억제제), 시토카인 및 케모카인 (IFN-γ, IFN-α/β, IL-12, IL-10, HGF, CXCL10, 및 CXCL11), 케모카인 길항제 (CXCL1, CXCL2, CXCL12, CCL2, CCL3, CCL6, CCL17, 및 CCL18의 억제제), 케모카인 수용체 길항제 (CCR2, CCR3, CCR5, CCR7, CXCR2, 및 CXCR4의 억제제), TLR 길항제 (TLR3, TLR4, 및 TLR9의 억제제), 혈관신생 길항제 (VEGF-특이 항체 및 아데노신 데아미나제 대체 요법), 항고혈압 약물 (베타 차단제, 및 ANG 11, ACE, 및 알도스테론의 억제제), 혈관활성 물질 (ET-1 수용체 길항제 및 보세탄), 콜라겐을 합성하고, 프로세스하는 효소의 억제제 (프롤릴 히드록실라제의 억제제), B 세포 길항제 (리툭시맙), 인테그린/부착 분자 길항제 (α1β1 및 αvβ6 인테그린을 차단하는 분자 뿐만 아니라, 인테그린 연관 키나제의 억제제, 및 ICAM-I 및 VCAM-I에 특이적인 항체), 근섬유모세포를 표적화하는 아포프토시스 유발성 약물, MMP 억제제 (MMP2, MMP9, 및 MMP12의 억제제), 및 TIMP 억제제 (TIMP-1에 대해 특이적인 항체)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
ENG 폴리펩티드 및 공동 치료제 또는 공동 요법은 동일 제제로 또는 별개로 투여될 수 있다. 별개로 투여되는 경우, ENG 폴리펩티드는 공동 치료제 또는 공동 요법 이전에, 그 이후에, 또는 그와 공동으로 투여될 수 있다. 한 작용제는 수분 내지 수주 범위의 간격을 두고 다른 작용제 투여에 선행되거나, 또는 그 이후에 진행될 수 있다. 2개 이상의 상이한 종류의 치료제를 별개로 대상체에게 적용하는 실시양태에서, 일반적으로 각 전달 사이에 상당 기간으로 기한이 만료되지 않았고, 따라서, 이들 상이한 종류의 작용제는 표적 조직 또는 세포에 대해 이로운 조합 효과를 여전히 발휘할 수 있을 것이라는 것을 보장할 것이다.
혈관신생
새로운 혈관이 형성되는 과정인 혈관신생은 정상 및 비정상적인 다수의 생리학적 상태에서 중요한 것이다. 정상적인 생리학적 상태에서, 인간 및 동물에서는 특이적인 및 한정적인 상황하에서 혈관신생이 이루어진다. 예를 들어, 혈관신생은 보통 상처 치유, 태아 및 배아 발생 및 황체, 자궁내막 및 태반 형성에서 관찰된다.
바람직하지 못한 또는 부적절하게 조절된 혈관신생은, 비정상적인 내피 성장이 병적 과정을 유발하거나, 그에 참여할 수 있는 것인 많은 장애에서 발생한다. 예를 들어, 혈관신생은 많은 종양의 성장에 참여한다. 탈조절된 혈관신생은 병적 과정, 예컨대, 류마티스성 관절염, 망막증, 혈관종, 및 건선에 연루되어 왔다. 비조절된 혈관신생이 존재하는 다양한 병적 질환 상태는 혈관신생 관련 질환으로 분류되어 왔다.
조절된, 및 비조절된 혈관신생, 둘 모두 유사한 방식으로 진행되는 것으로 간주된다. 모세혈관은 주로, 기저막으로 감싸여진 혈관주위 세포 및 내피 세포로 이루어진다. 혈관신생은 내피 세포에 의해 방출된 효소 및 백혈구에 의한 기저막의 미란으로 시작된다. 혈관 내강 안에서 막을 형성하는 내피 세포는 이어서 돌출되어 기저막을 통과하게 된다. 혈관신생 인자는 내피 세포가 미란성 기저막을 통해 이동하도록 유도한다. 이동 세포는 모체 혈관으로부터 돌출되는 "발아"를 형성하고, 여기서, 내피 세포의 체세포 분열 및 증식이 이루어진다. 내피 발아는 서로 합병되어 새로운 혈관을 생성하게 된다.
혈관신생을 억제하는 작용제가 다양한 장애를 치료하는 데 효과적인 것으로 입증되었다. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 결합하는 모노클로날 항체인 아바스틴(Avastin)™ (베바시주맙(Bevacizumab))은 다양한 암을 치료하는 데 사용된다. VEGF에 결합하는 압타머인 마큐젠(Macugen)™은 신생혈관 (습식) 연령 관련 황반 변성 치료에 효과적인 것으로 입증되었다. SDF/CXCR4 신호전달 신호전달의 길항제는 종양 신생혈관을 억제시키고, 마우스 모델에서의 암에 대해 효과적이다 (Guleng et al. Cancer Res. 2005 Jul 1;65(13):5864-71). 반데타닙, 수니티닙, 악시티닙, 소라페닙, 바탈라닙, 및 파조파닙을 비롯한, 각종의 소위 다중표적 티로신 키나제 억제제라 하는 것은 다양한 종양 유형의 치료에서 항혈관신생제로서 사용된다. 탈리도미드 및 관련된 화합물 (포말리도미드 및 레날리도미드 포함)은 암 치료에서 유익한 효과가 있는 것으로 밝혀졌고, 비록 분자적 작용 기전은 불명확하지만, 혈관신생 억제가 항종양 효과의 중요 성분이 되는 것으로 보인다 (예컨대, 문헌 [Dredge et al. Microvasc Res. 2005 Jan;69(1-2):56-63] 참조). 비록 다수의 항혈관신생제가 이환된 조직에 상관 없이 혈관신생에 대해 효과를 발휘하기는 하지만, 다른 혈관신생제는 조직 특이적인 효과를 발휘하는 경향이 있을 수 있다.
본 개시내용은 종양성 및 비-종양성 장애, 둘 모두를 비롯한, 혈관신생 조절 이상의 병태를 치료 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특정 심혈관 장애를 치료 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물 또한 제공한다. 추가로, 본 개시내용은 BMP9 및/또는 BMP10 활성과 관련된 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 유효량의, 이하 총칭하여 "치료제"로서 지칭되는, ENG 폴리펩티드 (상기의 ENG-Fc 융합 단백질 또는 핵산 길항제 (예컨대, 안티센스 또는 siRNA) 포함)를 투여함으로써 포유동물에서 혈관신생을 억제시키는 방법을 제공한다. 제시된 데이터는 구체적으로 본원에 개시된 항혈관신생 치료제가 종양 관련된 혈관신생을 억제시키는 데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 이들 치료제는 또한 안구에서의 혈관신생을 억제시키는 데에도 또한 유용할 것으로 예상된다.
혈관신생 관련된 질환으로는 혈관신생 의존성 암 (예를 들어, 고형 종양, 혈액 매개 종양 예컨대, 백혈병, 및 종양 전이 포함); 양성 종양, 예를 들어, 혈관종, 청각 신경종, 신경섬유종, 트라코마, 및 화농성 육아종; 류마티스성 관절염; 건선; 피부홍조; 오슬러-웨버 증후군; 심근 혈관신생; 플라크 신생혈관; 모세혈관 확장증; 혈우병성 관절; 및 혈관섬유종을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특히, 본 개시내용의 폴리펩티드 치료제는 암 (종양), 및 특히 성장을 지지하는 혈관신생 과정에 의존하는 것으로 알려져 있는 것과 같은 암을 치료 또는 예방하는 데 유용하다. 대부분의 항혈관신생제와 달리, ENG 폴리펩티드는 다중 인자에 의해 유도된 혈관신생에 영향을 준다. 이는 암이 빈번하게 종양 혈관신생을 지지하는 다중 인자를 획득하게 되는 것인 암에서 매우 높은 관련성을 가진다. 따라서, 본원에 개시된 치료제는 특히 단일 혈관신생 인자를 표적하는 약물 (예컨대, VEGF를 표적하는 베바시주맙)을 이용하는 치료에 저항성인 종양을 치료하는 데 효과적일 것이며, 이는 또한 특히, 다른 기전에 의해 작용하는 다른 항혈관신생 화합물과 조합되었을 때 효과적일 수 있다.
혈관신생의 조절이상이 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 많은 장애를 유도할 수 있다. 이러한 장애로는 종양성 및 비-종양성 병태, 둘 모두를 포함한다. "암" 및 "암성"이라는 용어는 전형적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는, 포유동물의 생리학적 병태를 의미하거나, 또는 기술한다. 암, 또는 종양성 장애의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 암에 관한 더욱 특정의 예로는 편평세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐 샘암종, 폐 편평세포 암종, 복막암, 간세포 암, 위장암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암(liver cancer), 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 암종 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 전립샘암, 음문암, 갑상샘암, 간 암종, 위암, 흑색종, 및 다양한 유형의 두부경부암 (편평세포 두부경부암)을 포함한다. 종양성 장애 및 관련 병태의 다른 예로는 식도 암종, 난포막종, 남성배세포종, 자궁내막 증식증, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막암종, 코인두 암종, 후두 암종, 간모세포종, 카포시 육종, 피부 암종, 혈관종, 해면 혈관종, 혈관모세포종, 망막모세포종, 성상세포종, 아교모세포종, 슈반세포종, 희소돌기아교세포종, 속질모세포종, 신경모세포종, 횡문근육종, 골육종, 평활근육종, 요로 암종, 윌름즈 종양, 신장 세포 암종, 전립샘 암종, 모반증과 관련된 비정상적인 혈관 증식, 및 메이그 증후군을 포함한다. 특히, 본원에 기술된 치료제를 이용하는 치료에 따라 잘 치료될 수 있는 암은 하기 중 하나 이상의 것을 특징으로 할 수 있다: 암은 혈관신생 활성을 가지거나, 종양 또는 혈청 중에서 검출가능한 ENG 수준이 상승되어 있거나, BMP-9 또는 BMP-10 발현 수준 또는 생물학적 활성이 증가되어 있거나, 전이성이거나, 전이될 위험이 있거나, 또는 그의 임의의 조합을 가진다.
본 발명에서 유용한 ENG 폴리펩티드를 이용하는 치료에 따라 잘 치료될 수 있는, 혈관신생 조절 이상을 동반하는 비-종양성 장애로는 원치않거나, 또는 비정상적인 비대증, 관절염, 류마티스성 관절염, 건선, 건선성 플라크, 사르코이드증, 죽상동맥경화증, 동맥경화성 플라크, 당뇨병성 및 다른 증식성 망막증 (미숙 망막병증 포함), 수정체후 섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 각막 신생혈관, 각막 이식편 신생혈관, 각막 이식편 거부, 망막/맥락막 신생혈관, 전방각 신생혈관 (피부홍조), 안구 신생혈관 질환, 혈관 재협착, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상샘 과다형성 (그레이브스병 포함), 각막 및 다른 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 원발성 폐 고혈압, 악성 폐 삼출, 뇌 부종 (예컨대, 급성 뇌졸중/폐쇄성 뇌 손상/외상과 관련된 것), 윤활 염증, RA에서의 파누스 형성, 골화 근육염, 비후성 골 형성, 골관절염, 난치성 복수, 다낭성 난소 질환, 자궁내막증, 체액성 질환 (췌장염, 구획 증후군, 화장, 장 질환)의 제3 스페이싱, 자궁 섬유양, 조산, 만성 염증, 예컨대, IBD (크론병 및 궤양성 결장염), 신장 동종 이식 거부, 염증성 장 질환, 신장 증후군, 원치않거나, 또는 비정상적인 조직 종괴 성장 (비-암), 혈우병성 관절, 비후성 반흔, 모발 성장 억제, 오슬러웨버 증후군, 화농성 육아종 수정체후부 섬유증식증, 경피증, 트라코마, 혈관 부착, 활막염, 피부염, 자간전증, 복수, 심낭 삼출 (예컨대, 심장막염과 관련된 것), 및 흉막 삼출을 포함한다. 상기 장애의 추가 예로는 상피 또는 심장 장애를 포함한다.
상기 방법의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 폴리펩티드 치료제는 함께 (동시에) 또는 다른 시점에서 (순차적으로) 투여될 수 있다. 추가로, 폴리펩티드 치료제는 암을 치료하기 위한, 또는 혈관신생을 억제시키기 위한 또 다른 유형의 화합물과 함께 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 대상 방법은 단독으로 사용될 수 있다. 별법으로, 대상 방법은 증식성 장애 (예컨대, 종양) 치료 또는 예방을 겨냥하는 다른 종래 항암 치료 접근법과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 예방적 암 예방, 암 재발 예방 및 수술 이후의 전이에서, 및 다른 종래 암 요법의 애주번트로서 사용될 수 있다. 본 개시내용은 종래 암 요법 (예컨대, 화학요법, 방사선 요법, 광선요법, 면역요법, 및 수술)의 효능이 대상 폴리펩티드 치료제의 사용을 통해 증진될 수 있다는 것을 인지한다.
매우 다양한 종래 화합물이 항종양성 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 이들 화합물은 고형 종양을 위축시키거나, 전이 및 추가 성장을 예방하거나, 또는 백혈병 또는 골수 악성 종양에서 악성 세포의 개수를 감소시키는 화학요법에서 제약 작용제로서 사용될 수 있다. 비록 화학요법이 다양한 유형의 악성 종양을 치료하는 데 효과적이기는 하지만, 다수의 항종양성 화합물은 바람직하지 못한 부작용을 유도한다. 2종 이상의 상이한 치료법이 조합되었을 때, 치료법은 상승적으로 작용할 수 있고, 각 치료법의 투여량을 감소시킴으로써 더 높은 투여량의 각 화합물에 의해 나타나는 유해한 부작용을 감소시키는 것으로 나타났다. 다른 경우에서, 치료법에 난치성인 악성 종양은 2종 이상의 상이한 치료법으로 이루어진 조합 요법에 대해 반응할 수 있다.
본원에 개시된 치료제가 또 다른 종랭 항종양제와 함께 조합되어 공동으로 또는 순차적으로 투여될 때, 상기 치료제는 항종양제의 치료학적 효과를 증진시킬 수 있거나, 상기 항종양제에 대한 세포의 저항성을 극복할 수 있다. 이를 통해 종양제의 투여량을 감소시킬 수 있고, 이로써, 바람직하지 못한 부작용을 감소시킬 수 있거나, 저항성 세포에서 항종양제의 효능을 회복시킬 수 있다.
본 개시내용에 따라, 본원에 기술된 항혈관신생제는 질환 치료를 위한 다른 조성물 및 방법과 함께 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양은 ENG 폴리펩티드와 함께 조합되어 종래대로 수술, 방사선 또는 화학요법으로 치료될 수 있고, 이어서, ENG 폴리펩티드는 이어서, 미세전이를 오랫 동안 휴지 상태로 유지되는 시간을 연장시키고, 임의의 잔류 원발성 종양을 안정화시키기 위해 환자에게 투여될 수 있다.
본원에 열거된 것, 및 예컨대, 문헌 [Carmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)]; [Ferrara et al., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)]; 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol, 8:200-206 (2003)]에 열거된 것을 비롯한, 다수의 항혈관신생제가 확인되었고, 관련 기술분야에 공지되어 있다. 또한 미국 특허 출원 US20030055006을 참조할 수 있다. 한 실시양태에서, ENG 폴리펩티드는 항VEGF 중화 항체 (또는 단편) 및/또는 또 다른 VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제 (제한하는 것은 아니지만, 예를 들어, 가용성 VEGF 수용체 (예컨대, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, 뉴로필린 (예컨대, NRP1, NRP2)) 단편 포함), VEGF 또는 VEGFR을 차단할 수 있는 압타머, 중화 항VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제 (RTK)의 저분자량 억제제, VEGF에 대한 안티센스 전략법, VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 리보자임, VEGF의 길항제 변이체; 및 그의 임의 조합과 함께 조합되어 사용된다. 별법으로, 또는 추가로, VEGF 길항제 및 다른 작용제 이외에도 2종 이상의 혈관신생 억제제가 임의적으로 환자에게 공동 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대, 항암제는 ENG 폴리펩티드, VEGF 길항제, 및 항혈관신생제와 함께 조합되어 투여될 수 있다.
"VEGF" 및 "VEGF-A"라는 용어는 문헌 [Leung et al. Science, 246:1306 (1989)], [Houck et al. Mol Endocrinol, 5:1806 (1991)], 및 [Robinson & Stringer, J Cell Sci, 144(5):853-865 (2001)]에 기술된 바와 같이, 상호교환적으로 사용되며, 이는 165-아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련 121-, 145-, 183-, 189-, 및 206- 아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자, 및 그의 자연적으로 발생된 대립유전자 형태 및 프로세싱된 형태를 함께 의미한다.
"VEGF 길항제"란, 하나 이상의 VEGF 수용체에의 그의 결합을 비롯한, VEGF 활성을 중화, 차단, 억제, 폐기, 감소, 또는 간섭할 수 있는 분자를 의미한다. VEGF 길항제로는 항VEGF 항체 및 그의 항원 결합 단편, VEGF에 특이적으로 결합하여 그의 하나 이상의 수용체에의 결합을 격리시키는 수용체 분자 및 유도체, 항VEGF 수용체 항체 및 VEGF 수용체 길항제, 예컨대, VEGFR 티로신 키나제의 소분자 억제제, 및 융합 단백질, 예컨대, VEGF-트랩(Trap) (리제네론(Regeneron)), VEGF121-겔로닌 (페레그린(Peregrine))을 포함한다. VEGF 길항제는 또한 VEGF의 길항제 변이체, VEGF에 대한 안티센스 분자, RNA 압타머, 및 VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 리보자임을 포함한다.
"항VEGF 항체"는 충분한 친화성 및 특이성으로 VEGF에 결합하는 항체이다. 항VEGF 항체는 VEGF 활성이 관여하는 질환 또는 병태를 표적화하고, 그를 간섭하는 치료제로서 사용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 6,582,959, 6,703,020; WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202, WO2005/044853; EP 0666868B1; 미국 특허 출원 20030206899, 20030190317, 20030203409, 20050112126, 20050186208, 및 20050112126; 문헌 [Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)]; 및 WO2005012359를 참조할 수 있다. 항VEGF 항체는 보통 다른 VEGF 동족체, 예컨대, VEGF-B 또는 VEGF-C에도, 다른 성장 인자, 예컨대, PlGF, PDGF 또는 bFGF에도 결합하지 않을 것이다. "rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴®"로도 알려져 있는, 항VEGF 항체인 "베바시주맙 (BV)"은 문헌 [Presta et al. Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에 따라 생성된 재조합 인간화된 항VEGF 모노클로날 항체이다. 이는 돌연변이된 인간 IgG1 프레임워크 영역, 및 인간 VEGF의 그의 수용체에의 결합을 차단하는, 뮤린 항hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원 결합 상보성 결정 영역을 포함한다. 대부분의 프레임워크 영역을 포함하는, 베바시주맙의 아미노산 서열 중 대략 93%는 인간 IgG1로부터 유래된 것이고, 서열 중 약 7%는 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유래된 것이다. 베바시주맙의 분자 질량은 약 149,000 달톤이고, 이는 글리코실화된 것이다. 베바시주맙, 및 항VEGF 항체 단편을 비롯한, 다른 인간화된 항VEGF 항체로서, "루센티스(Lucentis)®"로도 알려져 있는 "라니비주맙"은 추가로 2005년 2월 26일 발행된 미국 특허 번호 6,884,879에 기술되어 있다.
"항종양성 조성물"이라는 용어는 1종 이상의 활성 치료제, 예컨대, "항암제"를 포함하는, 암을 치료하는 데 유용한 조성물을 의미한다. 치료제 (항암제, 이는 또한 본원에서 "항종양제"로도 언급된다)의 예로는 예컨대, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용되는 작용제, 항혈관신생제, 아포프토시스 작용제, 항튜불린제, 독소, 및 암을 치료하는 다른 작용제, 예컨대, 항VEGF 중화 항체, VEGF 길항제, 항HER-2, 항CD20, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예컨대, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제, 에를로티닙, COX-2 억제제 (예컨대, 세레콕시브), 인터페론, 시토카인, ErbB2, ErbB3, ErbB4, 또는 VEGF 수용체(들) 중 하나 이상의 것에 결합하는 길항제 (예컨대, 중화 항체), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 및/또는 줄기 세포 인자 (SCF)에 대한 수용체 티로신 키나제에 대한 억제제 (예컨대, 아파티닙 메실레이트 (글리벡® 노파르티스(Gleevec® Novartis)), TRAIL/Apo2L, 및 다른 생체활성 작용제 및 유기 화학 작용제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"혈관신생 인자 또는 작용제"는 혈관 발생을 자극하는, 예컨대, 혈관신생, 내피 세포 성장, 혈관의 안정성, 및/또는 맥관 형성 등을 촉진시키는 성장 인자이다. 예를 들어, 혈관신생 인자로는 예컨대, VEGF 및 VEGF 패밀리의 구성원, PlGF, PDGF 패밀리, 섬유모세포 성장 인자 패밀리 (FGF), TIE 리간드 (안지오포이에틴), 에프린, ANGPTL3, ALK-1 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상처 치유를 가속화시키는 인자, 예컨대, 성장 호르몬, 인슐린 유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 그의 패밀리의 구성원, 및 TGF-α 및 TGF-β또한 포함할 것이다. 예컨대, 문헌 [Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991)]; [Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)]; [Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)]; [Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (예컨대, 혈관신생 인자가 열거되어 있는 표 1)]; 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)]을 참조할 수 있다.
"항혈관신생제" 또는 "혈관신생 억제제"란 혈관신생, 맥관 형성, 또는 바람직하지 못한 혈관 투과성을 직접적으로 또는 간접적으로 억제시키는 소분자량 물질, 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 억제성 RNA (RNAi 또는 siRNA) 포함), 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 그의 접합체 또는 융합 단백질을 의미한다. 예를 들어, 항혈관신생제는 상기 정의된 바와 같은 혈관신생제에 대한 항체 또는 다른 길항제, 예컨대, VEGF에 대한 항체, VEGF 수용체에 대한 항체, VEGF 수용체 신호전달을 차단하는 소분자 (예컨대, PTK787/ZK2284, SU6668, 수텐트(SUTENT)®/SU 11248 (수니티닙 말레이트), AMG706, 또는 예컨대, 국제 특허 출원 WO 2004/113304에 기술되어 있는 것)이다. 항혈관신생제는 또한 천연 혈관신생 억제제, 예컨대, 안지오스타틴, 엔도스타틴 등을 포함한다. 예컨대, 문헌 [Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991)]; [Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (예컨대, 악성 흑색종에서의 항혈관신생 요법이 열거되어 있는 표 3)]; [Ferrara & Alitalo, Nat Med 5(12): 1359-1364 (1999)]; [Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (예컨대, 항혈관신생 인자가 열거되어 있는 표 2)]; 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol, 8:200-206 (2003) (예컨대, 임상 시험에 사용된 항혈관신생제가 열거되어 있는 표 1)]을 참조할 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, ENG 폴리펩티드와의 조합 종양 요법에 유용한 다른 치료제로는 다른 암 요법: 예컨대, 수술, 세포독성제, 방사선 조사 또는 방사성 물질 투여를 포함하는 방사선 치료, 화학요법제, 항호르몬제, 성장 억제제, 항종양성 조성물, 및 본원에 열거되어 있고, 관련 기술분야에 공지되어 있는 항암제를 이용한 치료법, 또는 그의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "세포독성제"라는 용어는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/거나, 세포의 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예컨대, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예컨대, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제, 효소 및 그의 단편, 예컨대, 뉴클레오티드 분해 효소, 항생제, 및 독소, 예컨대, 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 하기 개시되는 각종 항종양제 및 항암제를 포함하는 것으로 한다. 다른 세포독성제는 하기에 기술되어 있다. 종양 파괴제는 종양 세포의 파괴를 유발한다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예컨대, 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)® 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대, 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히, 불라탁신 및 불라탁시논); 아세토게닌 (특히, 불라탁신 및 불라탁시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (히캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)® 포함), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대, 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대, 에네디인 항생제 (예컨대, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I, 및 칼리케아미신 오메가I1 (예컨대, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네미신 (다이네미신 A 포함); 에스페라미신; 뿐만 아니라, 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스유리딘; 안드로겐, 예컨대, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항부신호르몬제, 예컨대, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토크산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS 내추럴 프로덕츠(JHS Natural Products: 미국 오레곤주 유진)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예컨대, 탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology: 미국 뉴저지주 프린스턴)), 아브락산(ABRAXANE)™ (크레모포르-무함유), 파클릭탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너즈(American Pharmaceutical Partners: 미국 일리노이주 샤움버그)), 및 탁소테레(TAXOTERE)® 도세탁셀 (롱-프랑 로라(Rhoene-Poulenc Rorer: 프랑스 앙토니)); 클로란부실; 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®); 옥살리플라틴; 류코보린; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대, 레티노산; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®); 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체; 뿐만 아니라, 상기 중 2종 이상의 것의 조합, 예컨대, CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합된 요법에 대한 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 엘록사틴(ELOXATIN)™)을 이용하는 치료 요법에 대한 약어)를 포함한다.
암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제시키는 작용을 하고, 대개는 전체, 또는 전신 치료 형태의 것인 항호르몬제 또한 본 정의에 포함된다. 이는 호르몬 그 자체의 것일 수 있다. 예로는 항에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자 (SERM) (예를 들어, 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 에비스타(EVISTA)® 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 파레스톤(FARESTON)® 토레미핀 포함); 항프로게스테론제; 에스트로겐 수용체 하향조절제 (ERD); 난소를 억제시키거나, 정지시키는 작용을 하는 작용제, 예를 들어, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예컨대, 루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)® 류프롤라이드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립토렐린; 다른 항안드로겐제, 예컨대, 플루타미드, 닐루타미드, 및 비칼루타미드; 및 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비조르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸을 포함한다. 추가로, 화학요법제의 상기 정의는 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스타크(OSTAC)®), 디드로칼(DIDROCAL)® 에티드로네이트, NE-58095, 조메타(ZOMETA)® 졸레드론산/졸레드로네이트, 포사맥스(FOSAMAX)® 알렌드로네이트, 아레디아(AREDIA)® 파미드로네이트, 스켈리드(SKELID)® 틸루드로네이트, 또는 악토넬(ACTONEL)® 리세드로네이트; 뿐만 아니라, 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히, 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로 중의 유전자, 예컨대, 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R)의 발현을 억제시키는 것; 백신, 예컨대, 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 박시드(VAXID)® 백신; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 라파티닙 디톡실레이트 (ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제, 이는 또한 GW572016으로도 공지되어 있다); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산, 또는 유도체를 포함한다.
본원에서 사용될 때 "성장 억제제"란 시험관내 또는 생체내에서 세포의 성장을 억제시키는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 S 기에 있는 세포의 비율을 현저히 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예로는 (S 기 이외의 다른 단계에서) 세포 주기 진행을 차단하는 작용제, 예컨대, G1 정지 및 M 기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 고전적 M 기 차단제로는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 및 블레오마이신을 포함한다. 예를 들어, DNA 알킬화제, 예컨대, 타목시펜, 프리드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 ara-C와 같은 G1을 정지시키는 작용제는 또한 S 기 정지로 넘어가게 된다. 추가 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)], 특히, 13페이지에서 살펴볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 모두 주목 나무로부터 유래된 항암 약물이다. 서양 주목(European yew)으로부터 유래된, 도세탁셀 (탁소테레®, 롱-프랑 로라)은 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스큅)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세관의 조립을 촉진시키고, 해중합을 방지함으로써 미세관을 안정화시켜, 세포에서의 체세포 분열을 억제시킨다.
혈관신생-억제제는 또한 새로운 암 또는 재발 암이 발생할 위험이 높은 것으로 알려져 있는 개체에게 예방적으로 제공될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 한 측면은 대상체에게 유효량의, 본 개시내용의 ENG 폴리펩티드 및/또는 그의 유도체, 또는 또 다른 혈관신생-억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 예방적으로 방지하는 방법을 포함한다.
예를 들어, 배란, 월경, 및 태반 형성과 같은 특정의 정상적인 생리학적 과정 또한 혈관신생과 관련이 있다. 본 개시내용의 혈관신생 억제 단백질은 내피 세포의 과도한 또는 비정상적인 자극으로 된 질환을 치료하는 데 유용하다. 이러한 질환으로는 장 유착, 죽상동맥경화증, 경피증, 및 비후 흉터, 즉, 켈로이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이는 또한 병적 결과로서 혈관신생을 보이는 질환, 고양이 할큄병 (로셀 미날리아 퀸토사(Rochele minalia quintosa)) 및 궤양 (헬리코박터 파이로리 (Helicobacter pylori))을 치료하는 데 유용하다.
일반적 혈관신생 억제 단백질은 배아 착상에 요구되는 자궁 혈관 생성을 감소 또는 방지함으로써 피임제로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 배아 착상을 방지하는 데 충분한 양의 억제 단백질을 여성에게 투여할 때 효과적인 피임 방법을 제공한다. 피임 방법의 한 측면에서, 성교 및 수정이 일어나기 전 또는 후에 배아 착상을 차단하기에 충분한 양의 억제 단백질을 투여하여 효과적인 피임 방법, 가능하게는 "사후 (morning after)" 방법을 제공한다. 본 진술에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 자궁 내막의 혈관 생성의 억제는 포배(blastocyst)의 착상을 저해하는 것으로 생각된다. 자궁관의 점막의 혈관 생성의 유사한 억제는 포배의 착상을 저해하여, 자궁관 임신의 발생을 방지한다. 투여 방법은 환제, 주사 (정맥내, 피하, 근육내), 좌제, 질 스폰지, 질 탐폰 및 자궁내 장치를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 개시내용의 혈관신생 억제제의 투여는 태반의 정상적인 증진된 혈관 생성, 및 또한 성공적으로 착상된 포배 및 발생 중인 배아 및 태아 내에서 혈관의 발생을 저해할 것으로도 생각된다.
눈에서, 혈관신생은 예를 들어, 당뇨 망막병증, 미숙아 망막병증, 황반 변성, 각막 이식편 거부, 신생혈관 녹내장, 및 수정체후 섬유증식증과 관련된다. 본원에 개시된 치료제는 안구내로 또는 안구로의 다른 국소 투여에 의해 투여될 수 있다. 안구에서의 혈관신생과 관련된 다른 질환으로는 유행성 각막결막염, 비타민 A 결핍증, 콘택트 렌즈 과도 착용, 아토피성 각막염, 상윤 부각 각막염, 건성 익상편 각막염, 쇼그렌, 주사성 여드름, 필렉테눌로시스(phylectenulosis), 매독, 미코박테리아 감염, 지질 변성증, 화학 화상, 박테리아성 궤양, 진균성 궤양, 단순 헤르페스 감염, 대상 포진 감염, 원충 감염, 카포시 육종, 무렌각막 궤양, 테리엔 변연 각막 변성(Terrien's marginal degeneration), 변연 각질용해증, 류마티스성 관절염, 전신성 루푸스, 다발동맥염, 외상, 베게너 사르코이드증, 공막염, 스티븐스 존슨(Steven's Johnson) 질환, 유사천포창 방사상 각막절개술, 각막 이식편 거부, 겸상 적혈구 빈혈, 사르코이드증, 탄력섬유 가성 황색종, 파제트병, 정맥 폐쇄증, 동맥 폐쇄증, 경동맥 폐쇄성 질환, 만성 포도막염/유리체염, 마이코박테리아 감염, 라임 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 미숙아 망막병증, 일스병, 베체트 질환, 망막염 또는 맥락막염을 유발하는 감염, 추정 안구 히스토플라스마증, 베스트병, 근시, 시와, 스타르가르트 질환, 주변 포도막염, 만성 망막 박리, 과다점성 증후군, 톡소플라스마증, 외상 및 레이저 조사 후의 합병증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 질환으로는 피부홍조와 관련된 질환 (전방각 혈관신생) 및 모든 형태의 증식성 유리체 망막병증을 비롯한, 섬유혈관 또는 섬유 조직의 비정상적인 증식에 의해 유발된 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
눈의 병태는 예컨대, 치료제의 전신, 국부, 안구내 주사에 의해, 또는 치료제를 방출하는 지속 방출 장치의 삽입에 의해 치료 또는 예방될 수 있다. 치료제는 제약상 허용되는 안과용 비히클 중에서 전달될 수 있으며, 이로써, 화합물이 각막, 및 예컨대, 전방, 후방, 유리체, 방수, 유리체액, 각막, 홍채/섬모체, 수정체, 맥락막/망막 및 공막과 같은 안구의 내부 영역을 관통할 수 있도록 하는 충분한 시간 동안 화합물은 안구 표면과 접촉 상태로 유지된다. 제약상 허용되는 안과용 비히클은 예를 들어, 연고, 식물성 오일 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 별법으로, 본 개시내용의 치료제는 유리체 및 방수 내로 직접 주사될 수 있다. 추가의 대안으로, 화합물은 안구 치료를 위해 전신으로, 예컨대, 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여될 수 있다.
하나 이상의 치료제가 투여될 수 있다. 본 개시내용의 방법은 또한 안구의 병태를 치료하는 데 사용되는 다른 의약과 함께 공동 투여하는 것을 포함한다. 1종 초과의 작용제, 또는 작용제와 의약의 조합을 투여할 때, 투여는 시간상 동시에 또는 순차적으로 일어날 수 있다. 치료제 및/또는 의약은 상이한 투여 경로로 또는 동일한 투여 경로로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 치료제 및 의약은 안과용 제약 제제로 함께 투여된다.
한 실시양태에서, 치료제는 약리학적 기전에 의해 혈관신생을 차단하는 작용을 하는 다른 의약과의 공동 투여에 의해 안구에서 혈관신생과 관련된 질환을 치료하는 데 사용된다. 본 개시내용의 치료제와 함께 공동으로 투여될 수 있는 의약으로는 페갑타닙 (마큐젠™), 라니비주맙 (루센티스™), 스쿠알라민 락테이트 (에비존(Evizon)™), 헤파리나제, 및 글루코코르티코이드 (예컨대, 트리암시놀론)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 1종 이상의 치료제 및 하기 의약: 페갑타닙 (마큐젠™), 라니비주맙 (루센티스™), 스쿠알라민 락테이트 (에비존™), 헤파리나제, 및 글루코코르티코이드 (예컨대, 트리암시놀론) 중 적어도 하나를 함유하는 안과용 제약 제제를 투여함으로써 혈관신생과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 질환 또는 장애
일부 실시양태에서, ENG 폴리펩티드는 심혈관 장애, 또는 BMP-9 또는 BMP-10과 관련되지만, 반드시 혈관신생을 동반하지는 않는 것인 병태를 앓는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 종류의 장애에 관한 예로는 심장 질환 (심근 질환, 심근경색, 협심증, 및 심장 판막 질환 포함); 신장 질환 (만성 사구체 염증, 당뇨성 신부전증, 및 루푸스-관련 신장 염증 포함); 혈압 장애 (전신 및 폐 유형); 죽상동맥경화증 또는 다른 유형의 동맥경화증과 관련된 장애 (뇌졸중, 뇌 출혈, 지주막하 출혈, 협심증, 및 신장 동맥경화증 포함); 혈전 장애 (뇌 혈전증, 폐 혈전증, 혈전 장 괴사); 당뇨병의 합병증 (당뇨병 관련 망막 질환, 백내장, 당뇨병 관련 신장 질환, 당뇨병 관련 신경병, 당뇨병 관련 괴저, 및 당뇨병 관련 만성 감염 포함); 혈관 염증성 장애 (전신성 홍반성 루푸스, 관절 류머티즘, 관절 동맥 염증, 대세포 동맥 염증, 가와사키병, 타카야수 동맥염, 초그-스토라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 및 헤노호-쉐라인 자반증(Henoch-Schoenlein pupura)); 및 심장 장애, 예컨대, 선천성 심장 질환, 심근병증 (예컨대, 확장성, 비대성, 제한성 심근병증), 및 울혈성 심부전증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. ENG 폴리펩티드는 대상체에게 단독으로, 또는 BMP-9/10 관련 심혈관 장애 및/또는 병태를 치료하는 데 유용한 하나 이상의 작용제 또는 치료학적 방식, 예컨대, 치료제와 함께 조합하여 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 제2 작용제 또는 치료 방식은 혈관성형술, 베타 차단제, 항고혈압제, 강심제, 항혈전제, 혈관확장제, 호르몬 길항제, 엔도텔린 길항제, 칼슘 채널 차단제, 포스포디에스터라제 억제제, 안지오텐신 2형 길항제 및/또는 시토카인 차단제/억제제 중 하나 이상의 것으로부터 선택된다.
추가의 다른 실시양태에서, ENG 폴리펩티드는 BMP9와 관련이 있을 수 있지만, 앞에서 이미 언급되지는 않았던 염증성 장애 또는 병태 치료에서 유용할 수 있다. 예시적인 장애로는 간 질환 (급성 간염, 만성 간염, 및 경변증 포함); 흉부 또는 복부 부종; 만성 췌장 질환; 알레르기 (비알레르기, 천식, 기관지염, 및 아토피 피부염); 알츠하이머병; 레이노우드 증후군; 및 미만성 경화증을 포함한다.
3. 제제 및 유효량
본원에 기술된 치료제는 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은 하나 이상의 생리학상 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 종래 방식으로 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 일반적으로 대부분의 규제 요건에 따라 실질적으로 발열물질을 함유하지 않을 것이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 방법은 조성물을 전신으로, 또는 임플란트 또는 장치로서 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 치료 조성물은 투여시, 발열물질을 함유하지 않는, 생리학상 허용되는 형태로 존재한다. ENG 신호전달 길항제 이외의, 상기 기술된 바와 같은 조성물 내에 또한 임의적으로 포함될 수 있는 치료학상 유용한 작용제는 본원에 개시된 방법에서 대상 화합물 (예컨대, ENG 폴리펩티드)과 동시에 또는 그와 순차적으로 투여될 수 있다.
전형적으로, 본원에 개시된 단백질 치료제는 비경구적으로로, 특히, 정맥내 또는 피하로 투여될 것이다. 비경구 투여에 적합한 제약 조성물은 하나 이상의 ENG 폴리펩티드를 하나 이상의 제약상 허용되는 멸균 등장성 수용액 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전에 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 함께 조합하여 포함할 수 있고, 이는 항산화제, 완충제, 정균제, 제제를 의도된 수혜자의 혈액과 등장성이 되게 만드는 용질, 또는 현탁화제 또는 증점제를 함유할 수 있다. 본 개시내용의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대, 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레에이트를 포함한다. 적합한 유동성은 예를 들어, 코팅 물질, 예컨대, 레시틴의 사용에 의해, 분산액인 경우, 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 ENG 폴리펩티드는 안과용 제약 제제로 투여된다. 일부 실시양태에서, 안과용 제약 제제는 멸균 수용액, 바람직하게는, 주사하기에 적합한 농도의 것, 또는 고약(salve) 또는 연고이다. 이러한 고약 또는 연고는 전형적으로 멸균의 제약상 허용되는 고약 또는 연고 베이스, 예컨대, 광유-백색 바셀린 베이스 중에 용해되거나, 현탁된 본원에 개시된 하나 이상의 ENG 폴리펩티드를 포함한다. 고약 또는 연고 조성물에서, 무수 라놀린 또한 제제에 포함될 수 있다. 바람직하게는 티메로살 또는 클로로부탄올 또한 항미생물제로서 상기 연고 조성물에 첨가된다. 한 실시양태에서, 멸균 수용액은 미국 특허 번호 6,071,958에 기술되어 있는 바와 같다.
본 개시내용은 pH를 조정하기 위해 산 및 염기; 및 pH를 좁은 범위 내로 유지시키기 위해 완충제를 포함하도록 변경될 수 있는 제제를 제공한다. 추가의 의약이 제제에 첨가될 수 있다. 상기 의약으로는 페갑타닙, 헤파리나제, 라니비주맙 또는 글루코코르티코이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 개시내용에 따른 안과용 제약 제제는 무균 처리에 의해 제조되거나, 적합한 제제 단계에서 멸균이 수행된다.
조성물 및 제제는 원하는 경우, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예컨대, 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대, 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여 설명서가 동봉될 수 있다.
4. 가용성 ENG 폴리펩티드
특정 조건하인 경우를 제외하면, 자연적으로 발생된 ENG 단백질은, 단백질 중 일부는 세포 밖에 위치하고 (세포외 부분), 단백질 중 일부는 세포 내부에 위치하는 것 (세포내 부분)인 막횡단 단백질이다. 본 개시내용의 측면은 ENG의 세포외 도메인 (ECD) 부분을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 ENG 폴리펩티드를 제공한다. ENG 폴리펩티드는, 그의 C-말단은 서열 1의 아미노산 333-378 중 어느 위치에 존재하고, 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 379-430로 이루어진 서열은 포함하지 않는 것인 자연적으로 발생된 ENG 폴리펩티드의 말단절단된 ECD 도메인과 90% 이상 동일하고, 임의적으로, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 그를 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 임의적으로, ENG 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 379-586으로 이루어진 서열로부터, 또는 서열 1의 아미노산 379-581로 이루어진 서열로부터 5개 초과의 연속 아미노산, 또는 10, 20, 30, 40, 50, 52, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개 또는 그 초과만큼의 것보다 더 많은 연속 아미노산을 포함하지 않는다. 프로세싱되지 않은 ENG 폴리펩티드는 임의의 신호 서열 뿐만 아니라, 상기 신호 서열에 대해 N-말단에 있는 임의의 서열을 포함하거나, 또는 배제할 수 있다. 본원에서 상술된 바와 같이, 성숙한 (프로세싱된) ENG 폴리펩티드의 N-말단은 서열 1의 아미노산 26-42 중 임의의 위치에 존재할 수 있다. 성숙한 ENG 폴리펩티드의 예로는 서열 23의 아미노산 25-377, 서열 25의 아미노산 25-358, 및 서열 29의 아미노산 25-345를 포함한다. 유사하게, ENG 폴리펩티드는 서열 24의 뉴클레오티드 73-1131, 서열 26의 뉴클레오티드 73-1074, 또는 서열 30의 뉴클레오티드 73-1035, 또는 그의 침묵 변이체, 또는 엄격한 하이브리드화 조건 (일반적으로, 상기 조건은 관련 기술분야에 공지되어 있지만, 예를 들어, 50% v/v 포름아미드, 5x SSC, 2% w/v 차단제, 0.1% N-라우로일사르코신, 0.3% SDS 중에서 65℃에서 밤새도록 하이브리드화하고, 예를 들어, 5x SSC 중에서 약 65℃ 에서 세척할 수 있다)하에 그의 상보체에 하이브리드화하는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 따라서, "ENG 폴리펩티드"라는 용어는 ENG 폴리펩티드의 단리된 세포외 부분, 그의 변이체 (예를 들어, 서열 1의 아미노산 26-378에 상응하는 서열에서 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 35개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 포함), 그의 단편 및 상기 중 임의의 것을 포함하는 융합 단백질을 포함하지만, 각각의 경우에 바람직하게는 상기 ENG 폴리펩티드 중 임의의 것은 BMP-9 및/또는 BMP-10에 대한 실질적인 친화성은 유지할 것이다. 일반적으로, ENG 폴리펩티드는 생물학상 관련 온도, pH 수준 및 삼투압에서 수용액 중에서 가용성인 것이 되도록 디자인될 것이다 .
본원에서 제시하는 데이터는 ENG(26-437)-Fc 또는 전장의 ENG ECD를 포함하는 Fc 융합 단백질과 비교하였을 때, 더 짧은, ENG 폴리펩티드의 C-말단이 말단절단된 변이체를 포함하는 Fc 융합 단백질은 TGF-β1 및 TGF-β3에 대해서는 주목할 만한 어떤 결합도 보이지 않지만, 대신 BMP-9에 대해서는 현저히 더 느린 해리 속도로, 더 높은 친화성 결합을 보인다는 것을 나타낸다. 구체적으로, 서열 1의 아미노산 378, 359, 및 346에서 종료된 C-말단이 말단절단된 변이체 모두 ENG(26-437) 또는 ENG(26-586)과 비교하였을 때, 실질적으로 더 높은 친화도로 BMP-9에 결합 (및 감소되지 않은 친화도로 BMP-10에 결합)하는 것으로 나타났다. 그러나, 아미노산 332, 329, 또는 257까지의 더욱 광범위한 C-말단 말단절단물에 의해서는 BMP-9 및 BMP-10에의 결합이 완전히 파괴되었다. 따라서, 아미노산 333 내지 아미노산 378에서 종결되는 ENG 폴리펩티드는 모두 활성을 띨 것으로 예상되지만, 아미노산 346 및 359에서, 또는 그 사이에서 종료되는 구축물은 가장 큰 활성을 띨 수 있다. 아미노산 360 및 378에서, 또는 그 사이에서 종료되는 형태는 ENG(26-378)이 보이는 중간 정도의 리간드 결합 친화성을 나타내는 경향을 띨 것으로 예측된다. 전장의 ENG ECD를 포함하는 융합 단백질과 비교하였을 때, ENG(26-346)-Fc의 경우에 관찰되는 단백질 발현 및 제거 반감기의 개선에 기초하면 (실시예 참조), 아미노산 333 및 378에서, 또는 그 사이에서 종료되는 특정 구축물의 경우, 다른 중요한 파라미터가 개선될 것으로 예상된다. 상기 말단절단된 변이체 중 임의의 것은 임상적 또는 실험 환경에 따라 사용하는 데 바람직할 수 있다.
N-말단에서, 서열 1의 아미노산 26 (맨 처음 글루타메이트), 또는 그 앞에서 시작되는 ENG 폴리펩티드는 리간드 결합 활성을 유지할 것으로 예상된다. 본원에서 개시된 바와 같이, 서열 1의 아미노산 61까지의 N-말단 말단절단물은 더욱 광범위한 N-말단 말단절단물과 같이, 리간드 결합을 제거한다. 그러나, 이 또한 본원에서 개시된 바와 같이, ENG 1차 서열의 컨센서스 모델링은 서열 1의 아미노산 26-60에 의해 정의되는 영역 내의 정돈된 2차 구조는 높은 신뢰도로 예측되는 서열 1의 42-45번 위치의 4-잔기 베타 가닥, 및 매우 낮은 신뢰도로 예측되는 서열 1의 28-29번 위치의 2-잔기 베타 가닥으로 한정된다는 것을 나타낸다. 따라서, 활성 ENG 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 26에서 (또는 그 앞에서), 우선적으로는 또한 서열 1의 아미노산 27-42 중 어느 위치에서 시작될 것이다.
종합해 보면, ENG 폴리펩티드의 활성 부분은 서열 1의 아미노산 서열 26-333, 26-334, 26-335, 26-336, 26-337, 26-338, 26-339, 26-340, 26-341, 26-342, 26-343, 26-344, 26-345, 또는 26-346 뿐만 아니라, 서열 1의 아미노산 27-42 중 임의의 위치에서 시작되는 상기 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예시적인 ENG 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 서열 26-346, 26-359, 및 26-378을 포함한다. 상기 범위 내에 포함되는 변이체, 특히, 서열 1의 상응하는 부분과 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상의 동일성을 가지는 것 또한 고려된다. ENG 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 379-430으로 이루어진 서열은 포함하지 않을 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 개시내용은 자연적으로 발생된 ENG 폴리펩티드와 명시된 정도의 서열 동일성 또는 유사성을 공유하는 ENG 폴리펩티드를 제공한다. 두 아미노산 서열의 동일성(%)을 측정하기 위해, 최적의 비교 목적으로 정렬을 정렬한다 (예컨대, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 그 둘 모두에 갭을 도입할 수 있고, 비교 목적을 위해 비-상동성 서열은 무시할 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 잔기를 비교한다. 제1 서열 내의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기에 의해 점유되었을 때, 분자는 그 위치에서 동일한 것이다 (본원에서 사용되는 바, 아미노산 "동일성" 은 아미노산 "상동성"과 등가이다). 두 서열 사이의 동일성(%)은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 개수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일 위치의 개수의 함수이다.
두 서열 사이의 서열의 비교 및 동일성(%) 및 유사성(%) 측정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. ([Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987]; 및 [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]).
한 실시양태에서, 두 아미노산 서열 사이의 동일성(%)은 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능) 내로 포함된 문헌 [Needleman and Wunsch (J Mol. Biol. (48):444-453 (1970))]의 알고리즘을 이용하여 측정된다. 구체적인 실시양태에서, GAP 프로그램에서는 하기 파라미터가 사용된다: Blosum 62 행렬 또는 PAM250 행렬, 및 갭 가중치 = 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 = 1, 2, 3, 4, 5 또는 6. 추가의 또 다른 실시양태에서, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성(%)은 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램을 사용하여 측정된다. (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Res. 12(1):387 (1984)) (http://www.gcg.com에서 이용가능). 예시적인 파라미터로는 NWSgapdna.CMP 행렬 및 갭 가중치 = 40, 50, 60, 70 또는 80 및 길이 가중치 = 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하는 것을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 두 아미노산 서열 사이의 동일성(%)은 Blosum 62 행렬, 갭 가중치 = 10 및 길이 가중치 = 3을 사용하는 GAP 프로그램을 이용하여 측정되어야 하고, 상기 알고리즘이 원하는 동일성(%)을 계산할 수 없다면, 본원에 개시된 적합한 대안을 선택하여야 한다.
또 다른 실시양태에서, 두 아미노산 서열 사이의 동일성(%)은 PAM 120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 = 12 및 갭 패널티 = 4를 사용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 포함된 문헌 [E. Myers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))]의 알고리즘을 이용하여 측정된다.
두 아미노산 서열 사이의 최선의 전체 정렬을 결정하기 위한 또 다른 실시양태는 문헌 [Brutlag et al. (Comp. App . Biosci ., 6:237-245 (1990))]의 알고리즘에 기반한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 서열 정렬에서, 질의 및 대상 서열은 모두 아미노산 서열이다. 상기 전체적인 서열 정렬의 결과는 동일성(%)으로 제시된다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열 동일성은 문헌 [Brutlag et al. (Comp. App . Biosci ., 6:237-245 (1990))]의 알고리즘에 기반한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행된다. 구체적인 실시양태에서, 아미노산 정렬의 동일성(%) 및 유사성(%)을 계산하기 위해 사용된 파라미터는 행렬 = PAM 150, k-터플(tuple) = 2, 미스매치 페널티 = 1, 연결 페널티 = 20, 랜덤화 그룹 길이 = 0, 컷오프 스코어 = 1, 갭 페널티 = 5 및 갭 크기 페널티 = 0.05를 포함한다.
특정 실시양태에서, ENG 폴리펩티드는 BMP-9 및 BMP-10에 결합하고, ENG 폴리펩티드는 TGF-β1 또는 TGF-β3에 대해서는 실질적인 결합은 보이지 않는다. 결합은 용액 중 정제된 단백질을 사용하여, 또는 표면 플라스몬 공명 시스템, 예컨대, 비아코어(Biacore)™ 시스템에서 평가될 수 있다. ENG 폴리펩티드는 항혈관신생 활성을 보이는 것이 선택될 수 있다. 혈관신생 억제 활성에 대한 생체검정법으로는 닭 융모막요막 (CAM) 검정법, 마우스 혈관반응기 검정법, 및 단리된 또는 합성된 단백질 투여가 이식된 종양에 미치는 효과를 측정하는 검정법을 포함한다. CAM 검정법, 마우스 혈관반응기 검정법, 및 다른 검정법은 본 실시예에 기술되어 있다.
ENG 폴리펩티드는 N-말단에 다양한 리더 서열 중 임의의 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 서열을 통해서 펩티드는 진핵 시스템에서 발현될 수 있고, 분비 경로로 표적화될 수 있다. 예컨대, 에른스트(Ernst) 등의 미국 특허 번호 5,082,783 (1992)을 참조할 수 있다. 별법으로, 천연 ENG 신호 서열은 세포로부터의 추출을 수행하는 데 사용될 수 있다. 가능한 리더 서열로는 꿀벌 멜리틴, TPA, 및 천연 리더 (각각 서열 13-15)를 포함한다. TPA 리더 서열을 도입한 ENG-Fc 융합 단백질의 예로는 서열 23, 25, 27, 및 29를 포함한다. 신호 펩티드의 프로세싱은 다른 변수 중에서 선택된 리더 서열, 사용된 세포 유형 및 배양 조건에 따라 달라질 수 있고, 따라서, 성숙한 ENG 폴리펩티드에 대한 실제 N-말단 개시 부위는 N-말단 또는 C-말단 방향으로 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산만큼 이동할 수 있다. 성숙한 ENG-Fc 융합 단백질의 예로는 하기 제시된 바와 같은 서열 33-36 (여기서, ENG 폴리펩티드 부분은 밑줄로 표시)을 포함한다.
인간 ENG(26-378)-hFc (말단절단된 Fc)
인간 ENG(26-359)-hFc
인간 ENG(26-359)-hFc (말단절단된 Fc)
인간 ENG(26-346)-hFc (말단절단된 Fc)
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 폴리펩티드의 글리코실화를 변경시키기 위해 ENG 폴리펩티드의 특정 돌연변이를 고려한다. 상기 돌연변이는 하나 이상의 글리코실화 부위, 예컨대, O-연결된 또는 N-연결된 글리코실화 부위를 도입하거나, 제거하도록 선택될 수 있다. 아스파라긴-연결된 글리코실화 인식 부위는 일반적으로 적절한 세포성 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌 (또는 아스파라긴-X-세린) (여기서, "X"는 임의의 아미노산이다)을 포함한다. 변경은 또한 야생형 ENG 폴리펩티드의 서열 (O-연결된 글리코실화 부위에 대해)에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 그에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다. 글리코실화 인식 부위의 첫번째 또는 세번째 아미노산 위치 중 하나 또는 그 둘 모두에서 다양한 아미노산 치환 또는 결실 (및/또는 제2 위치에서의 아미노산 결실)은 변형된 트리펩티드 서열에서 비-글리코실화를 일으킨다. ENG 폴리펩티드 상에서 탄수화물 모이어티의 개수를 증가시키는 또 다른 수단은 ENG 폴리펩티드에의 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링에 의한 것이다. 사용된 커플링 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 유리 카르복실 기; (c) 유리 술프히드릴 기, 예컨대, 시스테인의 것; (d) 유리 히드록실 기, 예컨대, 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 것; (e) 방향족 잔기, 예컨대, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것; 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 WO 87/05330 (1987년 9월 11일 공개) 및 문헌 [Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306] (상기는 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. ENG 폴리펩티드 상에 존재하는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 및/또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 예를 들어, ENG 폴리펩티드를 화합물 트리플루오로메탄술폰산 또는 등가 화합물에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 처리 결과, 아미노산 서열은 무손상 상태로 유지되면서, 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 당 또는 모든 당은 절단된다. 화학적 탈글리코실화는 문헌 [Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52] 및 [Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131]에 추가로 기술되어 있다. ENG 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350]에 기술된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성될 수 있다. ENG 폴리펩티드의 서열은 적절할 경우, 사용된 발현 시스템의 유형에 따라 조정될 수 있는데, 이는 포유동물, 효모, 곤충 및 식물 세포 모두가 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 상이한 글리코실화 패턴을 도입할 수 있기 때문이다. 비록 다른 포유동물 발현 세포주, 조작된 글리코실화 효소를 갖는 효모 세포주 및 곤충 세포도 또한 유용한 것으로 예상되기는 하지만, 일반적으로는 인간에서 사용하기 위한 ENG 폴리펩티드는 적절한 글리코실화를 제공하는 포유동물 세포주, 예컨대, HEK293 또는 CHO 세포주에서 발현될 것이다.
본 개시내용은 돌연변이체, 특히, ENG 폴리펩티드의 조합 돌연변이체의 세트뿐만 아니라, 말단절단 돌연변이체를 생성하는 방법을 추가로 고려하고; 조합 돌연변이체의 풀은 기능적 변이체 서열을 확인하는 데 특히 유용하다. 상기 조합 라이브러리를 스크리닝하는 목적은 예를 들어, 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있거나, 별법으로, 신규한 활성을 모두 갖는 ENG 폴리펩티드 변이체를 생성하기 위한 것일 수 있다. 다양한 스크리닝 검정법을 하기에서 제공하며, 이러한 검정법은 변이체를 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, ENG 리간드에 결합하거나, ENG 리간드의 ENG 폴리펩티드에의 결합을 방해하거나, 또는 ENG 리간드에 의해 유발된 신호전달을 간섭할 수 있는 능력에 대해 ENG 폴리펩티드 변이체를 스크리닝할 수 있다. ENG 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 활성은 또한 세포 기반 또는 생체내 검정법, 특히, 실시예에 개시된 임의의 검정법으로 시험될 수 있다.
자연적으로 발생된 ENG 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 ENG 폴리펩티드에 비해 선택적인 또는 일반적으로 증가된 효능을 가지는, 조합 방식으로 유도된 변이체가 생성될 수 있다. 유사하게, 돌연변이 유발은 혈청 반감기가 상응하는 야생형 ENG 폴리펩티드와 크게 상이한 변이체를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 변경된 단백질은 단백분해에 의한 분해, 또는 천연 ENG 폴리펩티드의 파괴, 또는 다르게는 제거 또는 불활성화를 일으키는 다른 과정에 대해 더 안정하거나, 덜 안정하게 될 수 있다. 상기 변이체 및 그를 코딩하는 유전자는 ENG 폴리펩티드의 반감기를 조정함으로써 ENG 폴리펩티드 수준을 변경시키는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 더 짧은 반감기는 더욱 일시적인 생물학적 효과를 일으킬 수 있고, 환자 내에서 재조합 ENG 폴리펩티드 수준을 더욱 엄격하게 제어할 수 있도록 허용할 수 있다. Fc 융합 단백질에서, 단백질의 반감기를 변경하기 위해 링커 (존재하는 경우) 및/또는 Fc 부분에서 돌연변이가 이루어질 수 있다.
조합 라이브러리는, 각각의 것이 잠재적 ENG 폴리펩티드 서열의 적어도 일부를 포함하는 것인 폴리펩티드의 라이브러리를 코딩하는 유전자의 축퇴성 라이브러리에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 잠재적 ENG 폴리펩티드 뉴클레오티드 서열의 축퇴성 세트가 개별 폴리펩티드로서, 또는 별법으로 보다 큰 융합 단백질의 세트로서 (예컨대, 파지 디스플레이의 경우) 발현가능하도록 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 효소 작용에 의해 유전자 서열 내로 결찰시킬 수 있다.
축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적 ENG 폴리펩티드 변이체의 라이브러리를 생성할 수 있는 방법은 다수 존재한다. 축퇴성 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있고, 이어서, 합성 유전자를 발현을 위해 적절한 벡터 내로 결찰시킬 수 있다. 축퇴성 올리고뉴클레오티드의 합성은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3]; [Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289]; [Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323]; [Itakura et al., (1984) Science 198:1056]; [Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477] 참조). 상기 기술은 다른 단백질의 유도 진화에 사용되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Scott et al., (1990) Science 249:386-390]; [Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433]; [Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406]; [Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382]; 뿐만 아니라, 미국 특허 번호 5,223,409, 5,198,346, 및 5,096,815 참조).
별법으로, 조합 라이브러리를 생성하기 위해 다른 형태의 돌연변이 유발을 이용할 수 있다. 예를 들어, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 등을 사용하는 스크리닝함으로써 ([Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572]; [Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099]; [Balint et al., (1993) Gene 137:109-118]; [Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601]; [Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892]; [Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838]; 및 [Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085]), 링커 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 ([Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660]; [Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652]; [McKnight et al., (1982) Science 232:316]); 포화 돌연변이 유발에 의해 (Meyers et al., (1986) Science 232:613); PCR 돌연변이 유발에 의해 (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); 또는 화학적 돌연변이 유발을 포함한 무작위 돌연변이 유발 등에 의해 ([Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY]; 및 [Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]) ENG 폴리펩티드 변이체를 생성하고, 라이브러리로부터 단리시킬 수 있다. 링커 스캐닝 돌연변이 유발은 특히 조합 환경에서 말단절단된 (생체활성) 형태의 ENG 폴리펩티드를 확인하는 데 있어 매력적인 방법이다.
점 돌연변이 및 말단절단에 의해 제조된 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하기 위한, 및 실제로 특정 특성을 갖는 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 매우 다양한 기술이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 기술은 일반적으로 ENG 폴리펩티드의 조합 돌연변이 유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝을 위해 조정가능할 것이다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 데 가장 광범위하게 사용되는 기술은 전형적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 적절한 세포를 벡터의 생성되는 라이브러리로 형질전환시키고, 조합 유전자를 원하는 활성의 검출이 그의 생성물이 검출된 유전자를 코딩하는 벡터의 비교적 용이한 단리를 가능하게 하는 조건하에 발현시키는 것을 포함한다. 바람직한 검정법으로는 ENG 리간드 결합 검정법 및 리간드-매개 세포 신호전달 검정법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 ENG 폴리펩티드는 ENG 폴리펩티드 내에 자연적으로 존재하는 것 외에 번역 후 변형을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 변형은 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화, PEG화 (폴리에틸렌 글리콜) 및 아실화를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그 결과, 변형된 ENG 폴리펩티드는 비-아미노산 요소, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 다당류 또는 단당류 및 포스페이트를 함유할 수 있다. ENG 폴리펩티드의 기능성에 대해 상기 비-아미노산 요소가 미치는 효과를 다른 ENG 폴리펩티드 변이체에 대해 본원에 기술된 바와 같이 시험할 수 있다. ENG 폴리펩티드가 신생 형태의 ENG 폴리펩티드를 절단함으로써 세포 내에서 생산될 때, 단백질의 정확한 폴딩 및/또는 기능을 위해서는 번역 후 처리 또한 중요할 수 있다. 상이한 세포 (예컨대, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 또는 HEK293)는 이러한 번역 후 활성을 위한 특수한 세포 기구 및 특징적인 기전을 갖고, ENG 폴리펩티드의 정확한 변형 및 처리가 확실하게 이루어질 수 있도록 선택될 수 있다.
특정 측면에서, ENG 폴리펩티드의 기능적 변이체 또는 변형된 형태는 ENG 폴리펩티드의 적어도 일부 및 하나 이상의 융합 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 융합 도메인의 널리 공지된 예는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 (Fc), 말토스 결합 단백질 (MBP), 또는 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 융합 도메인은 원하는 특성을 부여하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화성 정제의 목적으로, 친화성 크로마토그래피를 위한 관련 매트릭스, 예컨대, 글루타티온-, 아밀라제-및 니켈- 또는 코발트-접합된 수지가 사용된 다. 상기와 같은 매트릭스 다수는 "키트" 형태로, 예컨대, (HIS6) 융합 파트너와 유용한 파마시아(Pharmacia) GST 정제 시스템 및 퀴아익스프레스(QIAexpress)™ 시스템(퀴아젠(Qiagen))으로 이용가능하다. 또 다른 예로서, 융합 도메인은 ENG 폴리펩티드의 검출을 용이하게 하도록 선택될 수 있다. 이러한 검출 도메인의 예는 다양한 형광 단백질 (예컨대, GFP) 뿐만 아니라, 그에 대한 특이적인 항체가 이용가능한, 대체로 짧은 펩티드 서열인 "에피토프 태그"를 포함한다. 그에 대한 특이적인 모노클로날 항체가 쉽게 이용가능한, 널리 공지된 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에서, 융합 도메인은 예컨대, 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 것과 같은 프로테아제 절단 부위를 가지며, 이는 관련 프로테아제가 융합 단백질을 부분적으로 분해하여 그로부터 재조합 단백질을 유리시키도록 한다. 이어서, 유리된 단백질은 후속된 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 단리될 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, ENG 폴리펩티드는 생체 내에서 ENG 폴리펩티드를 안정화시키는 도메인 ("안정화제" 도메인)과 융합된다. "안정화시키는"이라는 것은 파괴 감소, 신장에 의한 제거 감소 또는 다른 약동학적 효과 때문인지 그 여부와는 상관없이, 혈청 반감기를 증가시키는 임의의 것을 의미한다. 면역글로불린의 Fc 부분과의 융합은 매우 다양한 단백질에 대해 바람직한 약동학적 특성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 인간 혈청 알부민에의 융합은 바람직한 특성을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 다른 유형의 융합 도메인은 다량체화 (예를 들어, 이량체화, 사량체화) 도메인 및 기능성 도메인을 포함한다.
특정 예로서, 본 개시내용은 두 Fc 도메인 서열 (예컨대, 서열 11, 12)에 융합된 ENG 폴리펩티드의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 임의적으로, Fc 도메인은 예컨대, (상응하는 전장의 IgG에 따라 넘버링된) Asp-265, Lys-322, 및 Asn-434와 같이 잔기에 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 특정 경우에, 상기 돌연변이 (예를 들어, Asp-265 돌연변이) 중 하나 이상의 것을 가지는 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 Fcγ 수용체에 결합할 수 있는 능력이 감소되어 있다. 다른 경우에, 상기 돌연변이 (예컨대, Asn-434 돌연변이) 중 하나 이상의 것을 가지는 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 MHC 부류 I-관련 Fc-수용체 (FcRN)에 결합할 수 있는 능력이 증가되어 있다.
융합 단백질의 상이한 요소들은 원하는 기능성과 일관되는 임의의 방식으로 배열될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, ENG 폴리펩티드는 이종성 도메인에 대해 C-말단에 배치될 수 있거나, 또는 별법으로, 이종성 도메인은 ENG 폴리펩티드에 대해 C-말단에 배치될 수 있다. ENG 폴리펩티드 도메인 및 이종성 도메인은 융합 단백질 내에서 인접해 있을 필요는 없으며, 추가의 도메인 또는 아미노산 서열은 두 도메인에 대해 C- 또는 N-말단에, 또는 상기 도메인들 사이에 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "면역글로불린 Fc 도메인" 또는 간단히 "Fc"라는 용어는 면역글로불린 쇄 불변 영역, 바람직하게, 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 또는 그의 일부의 카르복실-말단 부분을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 또는 5) 2개 이상의 도메인 및 면역글로불린 힌지 영역의 조합을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 적어도 면역글로불린 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 바람직하게는 CH1 도메인은 결핍되어 있다.
한 실시양태에서, 중쇄 불변 영역 유래의 기점이 되는 면역글로불린의 부류는 IgG (Igγ) (γ 서브부류 1, 2, 3 또는 4)이다. 다른 부류의 면역글로불린, IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε) 및 IgM (Igμ)이 사용될 수 있다. 적절한 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 선택은 미국 특허 번호 5,541,087 및 5,726,044에서 상세히 논의된 바 있다. 특정 결과를 달성하기 위해 특정 면역글로불린 부류 및 서브부류로부터 특정 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 선택하는 것은 관련 기술분야의 기술 수준 내에 포함되어 있는 것으로 간주된다. 면역글로불린 Fc 영역을 코딩하는 DNA 구축물의 부분은 바람직하게는 힌지 도메인의 적어도 일부 및 바람직하게는 Fc 감마의 CH3 도메인의 적어도 일부, 또는 IgA, IgD, IgE 또는 IgM 중 임의의 중의 상동성 도메인을 포함한다.
추가로, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 실시에서 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 아미노산의 치환 또는 결실이 유용할 수 있는 것으로 고려된다. 한 예는 상부 CH2 영역 중에 아미노산 치환을 도입하여 Fc 수용체에 대한 친화성이 감소된 Fc 변이체를 생성하는 것이 될 것이다 (Cole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613).
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 다른 단백질 및/또는 다른 ENG 폴리펩티드 종으로부터 단리되거나, 또는 다르게는 그가 실질적으로 없는 (예를 들어, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 없는) 이용가능한 단리된 및/또는 정제된 형태의 ENG 폴리펩티드를 제조한다. ENG 폴리펩티드는 일반적으로 재조합 핵산으로부터 발현에 의해 제조될 것이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 ENG 단백질의 세포외 부분에 대한 코딩 서열을 포함하는 가용성 ENG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩티드는 박테리아 세포, 예컨대, E. 콜라이(E. coli), 곤충 세포 (예컨대, 바큘로바이러스 발현 시스템을 이용), 효모, 또는 포유동물 세포 내에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 따라서, 본 개시내용의 일부 실시양태는 추가로 ENG 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 서열 25 및 29에 기재되어 있고, CHO 세포 내에서 발현된 ENG-Fc 융합 단백질은 강력한 항혈관신생 활성을 갖는다는 것이 확립되었다.
5. ENG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산
특정 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 단편, 기능성 변이체 및 융합 단백질를 비롯한, ENG 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 단리된 및/또는 재조합 핵산을 제공한다. 예를 들어, 서열 2 및 4는 각각 천연 인간 ENG 전구체 폴리펩티드의 장쇄 및 단쇄 이소형을 코딩하는 반면, 서열 30은 IgG1 Fc 도메인에 융합된 ENG 세포외 도메인의 한 변이체를 코딩한다. 대상 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이러한 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 상기 핵산은 예를 들어, ENG 폴리펩티드를 제조하는 방법에서, 또는 직접적인 치료제로서 (예를 들어, 안티센스, RNAi 또는 유전자 요법 접근법에서) 사용될 수 있다.
특정 측면에서, ENG 폴리펩티드를 코딩하는 대상 핵산은 서열 24, 26, 28, 또는 30의 변이체인 핵산을 포함하는 것으로 추가로 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실에 의해 상이한 서열, 예를 들어, 대립유전자 변이체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 24, 26, 28, 또는 30과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 단리된 또는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 통상의 기술자는 서열 24, 26, 28, 또는 30에 상보성인 핵산 서열, 및 서열 24, 26, 28, 또는 30의 변이체 또한 본 개시내용의 범주 안에 포함된다는 것을 이해할 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 서열은 단리되고/되거나, 재조합되고/되거나, 이종성 뉴클레오티드 서열과 융합되거나, DNA 라이브러리 내에 존재할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산은 또한 고도로 엄격한 조건하에서 서열 24, 26, 28, 또는 30에 명시된 뉴클레오티드 서열, 서열 24, 26, 28, 또는 30의 상보체 서열, 또는 그의 단편에 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 통상의 기술자는 DNA 하이브리드화를 촉진하는 적절한 엄격도 조건이 변할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 6.0 x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)에서 약 45℃에서 하이브리드화를 수행한 후, 2.0 x SSC로 50℃에서 세척할 수 있다. 예를 들어, 세척 단계의 염 농도는 50℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격도로부터 50℃에서 약 0.2 x SSC의 높은 엄격도까지 선택될 수 있다. 추가로, 세척 단계의 온도는 실온, 약 22℃에서의 낮은 엄격도 조건으로부터 약 65℃에서 높은 엄격도 조건까지 증가될 수 있다. 온도 및 염 모두 변할 수 있거나, 다른 변수는 변화시키는 동안, 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄격도 조건하에 하이브리드화한 후, 실온에서 2 x SSC로 세척한 핵산을 제공한다.
유전자 코드의 축퇴성에 기인하여 서열 24, 26, 28, 또는 30에 제시된 핵산과 상이한 단리된 핵산 또한 본 개시내용의 범주 안에 포함된다. 예를 들어, 다수의 아미노산은 1 초과의 삼중체에 의해 지정될 수 있다. 동일한 아미노산을 지정하는 코돈, 또는 동의 코돈 (예를 들어, CAU 및 CAC는 히스티딘에 대한 동의 코돈이다)은 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 "침묵" 돌연변이를 생성할 수 있다. 그러나, 대상 단백질의 아미노산 서열의 변화를 일으키지 않는 DNA 서열 다형성이 포유동물 세포 사이에 존재할 것으로 예상된다. 통상의 기술자는 특정 단백질을 코딩하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드 (뉴클레오티드의 최대 약 3-5%까지)에서 이들 변이가 자연적 대립유전자 변이로 인해 주어진 종의 개체들 사이에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 임의의 및 모든 이러한 뉴클레오티드 변이 및 생성된 아미노산 다형성은 본 개시내용의 범주 안에 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 핵산은 발현 구축물 내에서 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 발현을 위해 사용된 숙주 세포에 적절할 것이다. 다양한 숙주 세포에 대한 많은 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 상기 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성인자 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 관련 기술분야에 공지되어 있는 구성적 또는 유도성 프로모터가 본 개시내용에 의해 고려된다. 프로모터는 자연적으로 발생된 프로모터, 또는 1 초과의 프로모터의 요소들을 조합한 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 구축물은 세포 내에 에피좀, 예컨대, 플라스미드 상에 존재할 수 있거나, 발현 구축물은 염색체 내에 삽입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선별을 허용하는 선별가능한 마커 유전자를 함유한다. 선별가능한 마커 유전자는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 사용된 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.
본원에 개시된 특정 측면에서, 대상 핵산은 ENG 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 1개 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 발현 벡터 내에 제공된다. 조절 서열은 관련 기술분야에서 인정받은 것이고, ENG 폴리펩티드의 발현을 지시하도록 선택된다. 따라서, 조절 서열이라는 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소를 포함한다. 예시적인 조절 서열은 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기술되어 있다. 예를 들어, DNA 서열에 작동가능하게 연결될 때 그의 발현을 제어하는 임의의 매우 다양한 발현 조절 서열이 이들 벡터 내에서 ENG 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 제어 서열로는 예를 들어, SV40의 조기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 최조기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T7 프로모터 (그의 발현은 T7 RNA 폴리머라제에 의해 지시된다), 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질에 대한 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소에 대한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 예컨대, Pho5, 효모 α-메이팅 인자의 프로모터, 바큘로바이러스 시스템의 폴리헤드론 프로모터 및 원핵 또는 진핵세포 또는 그들의 바이러스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 다른 서열, 및 그의 다양한 조합을 포함한다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택 및/또는 발현시키고자 하는 단백질의 유형과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 벡터의 카피수, 벡터에 의해 코딩된 임의의 다른 단백질의 카피수 및 발현을 제어하는 능력, 예컨대, 항생제 마커 또한 고려되어야 한다.
본 개시내용에 포함되는 재조합 핵산은 클로닝된 유전자 또는 그의 일부를 원핵 세포, 진핵 세포 (효모, 조류, 곤충 또는 포유동물), 또는 둘 모두에서의 발현에 적합한 벡터 내로 결찰시킴으로써 제조될 수 있다. 재조합 ENG 폴리펩티드의 제조를 위한 발현 비히클은 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들어, 적합한 벡터는 E. 콜라이와 같은 원핵 세포에서의 발현을 위한 pBR322-유도된 플라스미드, pEMBL-유도된 플라스미드, pEX-유도된 플라스미드, pBTac-유도된 플라스미드 및 pUC-유도된 플라스미드 유형의 플라스미드를 포함한다.
일부 포유동물 발현 벡터는 박테리아에서 벡터의 전파를 용이하게 하는 원핵 세포 서열, 및 진핵 세포 내에서 발현되는 하나 이상의 진핵성 전사 단위, 둘 모두 함유한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유도된 벡터는 진핵 세포의 형질감염에 적합한 포유동물 발현 벡터의 예이다. 이들 벡터 중 일부는 원핵 및 진핵 세포, 둘 모두에서 복제 및 약물 저항성 선별을 용이하게 하도록 박테리아 플라스미드, 예컨대, pBR322로부터의 서열로 변형된다. 별법으로, 진핵 세포 내에서 단백질의 일시적인 발현을 위해 바이러스의 유도체, 예컨대, 소 유두종 바이러스 (BPV-1), 또는 엡스타인-바 바이러스 (pHEBo, pREP-유도된 및 p205)가 사용될 수 있다. 다른 바이러스 (레트로바이러스 포함) 발현 시스템의 예는 하기의 유전자 요법 전달 시스템의 설명에서 살펴볼 수 있다. 플라스미드 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 사용되는 다양한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 원핵 및 진핵 세포, 둘 모두에 대한 다른 적합한 발현 시스템 및 일반적인 재조합 방법에 대해서는 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)]을 참조한다. 일부 경우에서, 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용함으로써 재조합 폴리펩티드를 발현하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 바큘로바이러스 발현 시스템의 예로는 pVL-유도된 벡터 (예컨대, pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유도된 벡터 (예컨대, pAcUW1), 및 pBlueBac-유도된 벡터 (예컨대, β-gal 함유 pBlueBac III)를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 예컨대, Pcmv-Script 벡터 (스트라타진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 라호야)), pcDNA4 벡터 (인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)) 및 pCI-neo 벡터 (프로메가(Promega: 미국 위스콘신주 매디슨))와 같은 벡터는 CHO 세포 내에서 대상 ENG 폴리펩티드의 제조를 위해 디자인될 것이다. 자명하게 되는 바와 같이, 대상 유전자 구축물은 정제를 위해, 예컨대, 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 비롯한 단백질을 제조하도록 배양물 내에 전파되는 세포 내에서 ENG 폴리펩티드의 발현을 일으키기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 또한 대상 ENG 폴리펩티드 중 하나 이상의 것에 대한 코딩 서열 (예컨대, 서열 24, 26, 28, 또는 30)을 포함하는 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 ENG 폴리펩티드는 박테리아 세포, 예컨대, E. 콜라이, 곤충 세포 (예컨대, 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용), 효모, 또는 포유동물 세포 내에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
따라서, 본 개시내용은 추가로 대상 ENG 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, ENG 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 ENG 폴리펩티드의 발현이 일어나도록 하는 데 적절한 조건하에서 배양할 수 있다. ENG 폴리펩티드는 분비될 수 있고, ENG 폴리펩티드를 함유하는 세포 및 배지의 혼합물로부터 단리될 수 있다. 별법으로, ENG 폴리펩티드는 세포질 내에 또는 막 분획 내에 유지될 수 있고, 세포를 수거하고, 용해시키고 단백질을 단리할 수 있다. 세포 배양물은 숙주 세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 세포 배양을 위해 적합한 배지는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 대상 ENG 폴리펩티드는 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동, ENG 폴리펩티드의 특정 에피토프에 특이적인 항체를 사용한 면역친화도 정제 및 ENG 폴리펩티드에 융합된 도메인과 결합하는 작용제를 사용한 친화도 정제 (예컨대, ENG-Fc 융합체를 정제하기 위해 단백질 A 칼럼이 사용될 수 있다)를 비롯한, 단백질을 정제하기 위한 관련 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 세포 배양 배지, 숙주 세포 또는 그 둘 모두로부터 단리될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, ENG 폴리펩티드는 그의 정제를 용이하게 하는 도메인을 함유하는 융합 단백질이다. 한 예로서, 정제는 예를 들어, 하기 중 3개 이상의 것을 임의의 순서로 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로스 크로마토그래피, 페닐세파로스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 완충제 교환으로 완료될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 ENG 폴리펩티드의 원하는 부분의 N-말단에서 예컨대, 폴리-(His)/엔테로키나제 절단 부위 서열과 같은 정제 리더 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni2 + 금속 수지를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의한 발현된 융합 단백질의 정제를 허용할 수 있다. 이어서, 정제 리더 서열은 엔테로키나제로 처리하여 후속적으로 제거되어 정제된 ENG 폴리펩티드를 제공할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177]; 및 [Janknecht et al., PNAS USA 88:8972] 참조).
융합 유전자를 제조하기 위한 기술은 널리 공지되어 있다. 본질적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편의 연결은 결찰을 위한 블런트-단부(blunt-ended) 또는 스태거-단부(stagger-ended) 말단, 적절한 말단을 제공하기 위해 제한 효소 분해, 적절한 경우에 점착 단부의 충전, 바람직하지 않은 연결을 피하기 위해 알칼리성 포스파타제 처리, 및 효소적 결찰을 이용하는 종래 기술에 따라 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 유전자는 자동 DNA 합성기를 포함하는 종래 기술에 의해 합성할 수 있다. 별법으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 2개의 연속 유전자 단편 사이에 상보적인 오버행을 일으키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있고, 이어서, 이는 어닐링되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992] 참조).
ENG, BMP-9, 또는 BMP-10의 길항제인 핵산 화합물의 카테고리의 예는 안티센스 핵산, RNAi 구축물 및 촉매성 핵산 구축물을 포함한다. 핵산 화합물은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥 화합물은 또한 오버행 또는 비-상보성의 영역을 포함할 수 있고, 여기서, 가닥 중 하나 또는 다른 나머지 하나는 단일 가닥이다. 단일 가닥 화합물은 자기-상보성인 영역을 포함할 수 있고, 이는 화합물이 이중 나선 구조의 영역과 소위 "헤어핀" 또는 "스템-루프" 구조라고 하는 것을 형성한다는 것을 의미한다. 핵산 화합물은 전장의 ENG 핵산 서열 또는 리간드 핵산 서열의 1,000개 이하, 500개 이하, 250개 이하, 100개 이하 또는 50, 35, 30, 25, 22, 20 또는 18개 이하의 뉴클레오티드로 이루어진 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상보성인 영역은 바람직하게는 8개 이상의 뉴클레오티드, 임의적으로, 10개 이상 또는 15개 이상의 뉴클레오티드, 및 임의적으로, 15 내지 25개의 뉴클레오티드일 것이다. 상보성인 영역은 표적 전사체, 예컨대, 코딩 서열 부분의 인트론, 코딩 서열 또는 비코딩 서열에 포함될 수 있다. 일반적으로, 핵산 화합물의 길이는 약 8 내지 약 500개의 뉴클레오티드 또는 염기쌍 길이일 것이고, 임의적으로 길이는 약 14 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이일 것이다. 핵산은 DNA (특히 안티센스로서 사용하기 위한 것), RNA 또는 RNA:DNA 하이브리드일 수 있다. 임의의 한 가닥은 DNA 및 RNA의 혼합물 뿐만 아니라, DNA 또는 RNA로서 쉽게 분류될 수 없는 변형된 형태를 포함할 수 있다. 유사하게, 이중 가닥 화합물은 DNA:DNA, DNA:RNA 또는 RNA:RNA일 수 있고, 임의의 한 가닥은 또한 DNA 및 RNA의 혼합물 뿐만 아니라, DNA 또는 RNA로서 쉽게 분류될 수 없는 변형된 형태를 포함할 수 있다. 핵산 화합물은 골격 (뉴클레오티드간 연결을 포함하는 천연 핵산 중 당-포스페이트 부분) 또는 염기 부분 (천연 핵산의 퓨린 또는 피리미딘 부분)에 대한 하나 이상의 변형을 비롯한, 다양한 변형 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 안티센스 핵산 화합물은 바람직하게는 길이가 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이일 것이며, 종종 혈청 내에서, 세포 내에서, 또는 화합물이 전달될 가능성이 있는 위치에서, 예컨대, 경구적으로 전달된 화합물인 경우, 위, 및 흡입된 화합물인 경우, 폐에서 안정성과 같은 특징을 개선하기 위해 하나 이상의 변형을 포함할 것이다. RNAi 구축물의 경우에, 표적 전사체에 상보성인 가닥은 일반적으로 RNA 또는 그의 변형일 것이다. 나머지 다른 가닥은 RNA, DNA 또는 임의의 다른 변이일 수 있다. 이중 가닥 또는 단일 가닥의 "헤어핀" RNAi 구축물의 이중체 부분은 다이서 (Dicer) 기질로서의 역할을 하는 한, 바람직하게는 길이가 18 내지 40개의 뉴클레오티드 길이 및 임의적으로는 약 21 내지 23개의 뉴클레오티드 길이일 것이다. 촉매성 또는 효소적 핵산은 리보자임 또는 DNA 효소일 수 있고, 이는 또한 변형된 형태를 함유할 수 있다. 핵산 화합물은 생리학적 조건하에서 및 넌센스 또는 센스 제어가 영향을 거의 또는 전혀 미치지 않는 농도에서 세포와 접촉될 때 표적의 발현을 약 50%, 75%, 90% 또는 그 초과만큼 억제시킬 수 있다. 핵산 화합물의 효과를 시험하는 데 바람직한 농도는 1, 5 및 10 마이크로몰이다. 핵산 화합물은 또한 예를 들어, 혈관신생에 미치는 효과에 대하여 시험될 수 있다.
6.
Fc
-융합 단백질에서의 변경
본 출원은 조작된 또는 변이체 Fc 영역을 포함하는 ENG-Fc 융합 단백질을 추가로 제공한다. 상기 항체 및 Fc 융합 단백질은 이펙터 기능, 예컨대, 항원 의존성 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 조절하는 데 유용할 수 있다. 추가로, 변형은 항체 및 Fc 융합 단백질의 안정성을 개선시킬 수 있다. 항체 및 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변이를 DNA에 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 상기 변이체는 예를 들어, 본원에 개시된 항체 및 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 그 내로의 삽입 및/또는 그의 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특징을 갖는다면, 결실, 삽입, 및 치환의 임의 조합을 통해 최종 구축물에 도달하게 된다. 아미노산 변이는 또한 예컨대, 글리코실화 부위의 개수 또는 위치 변이와 같이, 항체 및 Fc 융합 단백질의 번역 후 프로세스를 변경시킬 수 있다.
이펙터 기능이 감소된 항체 및 Fc 융합 단백질은 블루스톤(Bluestone) 등에 의해 기술된 Ala-Ala 돌연변이를 포함하나, 이에 한정되지 않는 변이를 아미노산 서열에 도입함으로써 제조될 수 있다 (WO 94/28027 및 WO 98/47531 참조; 또한, 문헌 [Xu et al. 2000 Cell Immunol 200; 16-26] 참조). 따라서, 특정 실시양태에서, 불변 영역 내에 Ala-Ala 돌연변이를 비롯한 돌연변이를 포함하는 본 개시내용의 항체 및 Fc 융합 단백질은 이펙터 기능을 감소시키거나, 또는 그를 폐기하는 데 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에 따라, 항체 및 Fc 융합 단백질은 234번 위치에서 알라닌으로의 돌연변이, 또는 235번 위치에서 알라닌으로의 돌연변이, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 또는 Fc 융합 단백질은 IgG4 프레임워크를 포함하며, 여기서, Ala-Ala 돌연변이는 234번 위치에서의 페닐알라닌으로부터 알라닌으로의 돌연변이, 및/또는 235번 위치에서의 류신으로부터 알라닌으로의 돌연변이를 기술할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 Fc 융합 단백질은 IgG1 프레임워크를 포함하며, 여기서, Ala-Ala 돌연변이는 234번 위치에서의 류신으로부터 알라닌으로의 돌연변이, 및/또는 235번 위치에서의 류신으로부터 알라닌으로의 돌연변이를 기술할 것이다. 항체 또는 Fc 융합 단백질은 별법으로 또는 추가로 CH2 도메인 중의 점 돌연변이 K322A를 비롯한 다른 돌연변이를 보유할 수 있다 (Hezareh et al. 2001 J Virol. 75: 12161-8).
특정 실시양태에서, 항체 또는 Fc 융합 단백질은 보체 의존성 세포독성 (CDC)를 증진 또는 억제시키기 위해 변형될 수 있다. 조정된 CDC 활성은 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 도입함으로써 달성될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 6,194,551 참조). 별법으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)는 Fc 영역에 도입될 수 있으며, 이로써 상기 영역 중에서의 쇄간 이황화 결합이 형성될 수 있다. 상기와 같이 생성된 동종이량체 항체는 개선된, 또는 감소된 내재화 능력 및/또는 증가된 또는 감소된 보체 매개 세포 사멸을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)], WO99/51642, [Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO94/29351을 참조할 수 있다.
실시예
이제 일반적으로 기술되었던 본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 더욱 쉽게 이해될 것이며, 이 실시예는 단지 본 발명의 특정 실시양태 및 실시양태를 예시하기 위한 목적으로 포함되는 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
1: 인간 ENG의 전장의
세포외
도메인을 포함하는 융합 단백질의 발현
출원인들은, 인간 ENG의 전장의 세포외 도메인 (ECD) (도 9, 서열 9)가 인간 IgG1 Fc 도메인 (도 11, 서열 11)에, 상기 도메인 사이의 최소의 링커를 이용하여 부착되어 있는, 가용성 엔도글린 (ENG) 융합 단백질 (hENG(26-586)-hFc)을 구축하였다. HEK 293 세포에서의 일시적인 형질감염에 의해 hENG(26-586)-hFc를 발현하였다. 간략하면, HEK 293 세포를 250 ml 부피의 프리스타일(Freestyle) 배지 (인비트로겐) 중 6x105개의 세포/ml로 500 ml 스피너에 셋업하고, 밤새도록 성장시켰다. 다음날, 상기 세포를 0.5 ug/ml 최종 DNA 농도의 DNA:PEI (1:1) 복합체로 처리하였다. 4 hr 후, 250 ml 배지를 첨가하고, 세포를 7일 동안 성장시켰다. 세포를 스핀 다운하여 조절 배지를 수거하고, 농축시켰다. CHO 세포에서 발현시키기 위해, ENG 폴리펩티드 구축물을 CHO DUKX B11 세포주에 형질감염시켰다. 전형적으로는 초기 농도를 5 nM 또는 10 nM으로 하여 메토트렉세이트 (MTX)에서 클론을 선별한 후, 임의적으로, 50 nM MTX 중에서 증폭시켜 발현을 증가시켰다. 희석 클로닝에 의해 고발현 클론을 확인할 수 있고, 무혈청 현탁 성장에 적응시켜 정제를 위한 조절된 배지를 생성할 수 있다. 임의적으로, 발현 촉진을 위해 벡터 중에 도처에 있는 염색질 개방 요소 (UCOE)를 포함시킬 수 있다. 예컨대, 문헌 [Cytotechnology. 2002 Jan;38(1-3):43-6]을 참조할 수 있다.
3개의 상이한 리더 서열이 사용될 수 있다:
(i) 꿀벌 멜리틴 (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열 13)
(ii) 조직 플라스미노겐 활성인자 (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (서열 14)
(iii) 천연 인간 ENG: MDRGTLPLAVALLLASCSLSPTSLA (서열 15).
선택된 형태의 hENG(26-586)-hFc는 TPA 리더를 사용하고, 도 13 (서열 16)에 제시된 프로세싱되지 않은 아미노산 서열을 가지며, 도 14 (서열 17)에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 출원인들은 또한 TGGG 링커에 의해 hENG(26-586)에 부착된 N-말단이 말단절단된 hFc 도메인 (도 12, 서열 12)을 포함하는, TPA 리더 를 포함하는 대체 hENG(26-586)-hFc 서열 (도 15, 서열 18)도 구상한다. 조절 배지 여과, 이어서, 단백질 A 크로마토그래피, 낮은 pH (3.0) 글리신 완충제를 이용한 용리, 샘플 중화, 및 PBS에 대한 투석을 비롯한, 다양한 기술을 사용하여 정제를 달성하였다. 분석적 크기 배제 크로마토그래피, SDS-PAGE, 은 염색, 및 웨스턴 블롯에 의해 샘플의 순도를 평가하였다. 성숙한 단백질 분석을 통해 예상된 N-말단 서열을 확인하였다.
실시예
2: 뮤린
ENG의 전장의
세포외
도메인을 포함하는 융합 단백질의 발현
출원인들은 뮤린 ENG의 전장의 세포외 도메인 (도 10, 서열 10)이 뮤린 IgG2a Fc 도메인에 상기 도메인 사이의 최소 링커를 이용하여 융합되어 있는, 가용성 뮤린 ENG 융합 단백질 (mENG(27-581)-mFc)를 구축하였다. HEK 293 세포에서의 일시적인 형질감염에 의해 mENG(27-581)-mFc를 발현하였다.
선택된 형태의 mENG(27-581)-mFc는 TPA 리더를 사용하고, 도 16 (서열 19)에 제시된 프로세싱되지 않은 아미노산 서열을 가지며, 도 17 (서열 20)에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 형질감염된 HEK 293 세포로부터의 조절 배지 여과, 이어서, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제를 달성하였다. 분석적 크기 배제 크로마토그래피, SDS-PAGE, 은 염색, 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 샘플의 순도를 평가하였다.
실시예
3: 전장의
세포외
ENG 도메인을 포함하는 단백질에의 BMP-9/BMP-10의 선택적 결합
공수용체를 고려할 때, ENG는 I형 및 II형 수용체의 다중단백질 복합체에의 TGF-β1 및 -3의 결합을 촉진시킴으로써 작용하는 것으로 널리 생각되고 있다. 단리된 ENG에 의한 직접적인 리간드 결합의 가능성을 조사하기 위해, 출원인들은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 방법론 (비아코어(Biacore)™ 인스트루먼트)을 사용하여 ENG의 전장의 세포외 도메인을 포함하는 포획된 단백질의 다양한 가용성 인간 TGF-β 패밀리 리간드에의 결합에 대하여 스크리닝하였다.
본 표에 제시된 바와 같이, 저농도의 리간드에서 평가되었을 때, hBMP-9 및 hBMP-10의 경우, hENG(26-586)-hFc에 대한 결합 친화도는 높았다 (++++, KD < 1 nM). 심지어 40배 더 높은 농도에서 조차도 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 액티빈 A, BMP-2, 및 BMP-7의 hENG(26-586)-hFc에의 결합은 검출불가능하였다 (-). 후자의 리간드 군의 경우, I형 및 II형 수용체의 다중단백질 복합체는 ENG 부재하에서보다는 그의 존재하에서 더욱 잘 그들 대부분에 결합하는 것으로 나타났는 바, 단리된 ENG 융합 단백질에의 직접적인 결합 부족은 주목할 만하다. 또한 상기 표에서 제시된 바와 같이, 리간드를, Fc 도메인이 없는 인간 변이체인 고정화된 hENG(26-586) (R&D 시스템즈(R&D Systems), 카탈로그 #1097-EN)에 결합할 수 있는 그의 능력에 대하여, 또는 6개의 잔기 링커 서열 (IEGRMD)를 통해 인간 IgG1의 Fc 도메인에 부착된 뮤린 ENG (잔기 27-581)의 세포외 도메인으로 이루어진 포획된 mENG(27-581)-hFc (R&D 시스템즈, 카탈로그 #1320-EN)에 결합할 수 있는 그의 능력에 대하여 스크리닝하였을 때, 유사한 결과를 얻었다. SPR에 의해 특징 규명한 결과 (도 18, 19), 포획된 hENG(26-586)-hFc는 KD = 29 pM으로 가용성 BMP-9에 결합하고, KD = 400 pM으로 가용성 BMP-10에 결합한다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, BMP-9 및 BMP-10의 선택적인 고친화성 결합은 종 간에 일반화될 수 있는, ENG 세포외 도메인의 앞서 인식되지 못했던 특성이다.
실시예
4:
hENG의
가용성
세포외
도메인은 BMP-9/BMP-10의
ALK1
및 다른 동족 수용체에의 결합을
억제시킨다
BMP-9 및 BMP-10은 I형 수용체 ALK1 (액티빈 수용체-유사 키나제 1)에서의 고친화성 리간드이다. SPR 기반 검정법을 사용하여 가용성 hENG(26-586) (R&D 시스템즈, 카탈로그 #1097-EN)이 BMP-9 및 BMP-10의 ALK1에의 결합에 미치는 효과에 대해 측정하였다. ALK1-hFc를 포획하고, 다양한 비율로 BMP-9와 함께 미리 혼합된, 가용성 hENG(26-586)를 함유하는 용액에 노출시켰다. 도 20에 제시된 바와 같이, 가용성 hENG(26-586)은 농도에 의존하는 방식으로 BMP-9의 ALK1-Fc에의 결합을 억제시켰고, 여기서, IC50은 10 nM 미만이었다. BMP-10에 대해서도 유사한 결과를 얻었다 (도 21). 별도의 실험을 통해 가용성 hENG(26-586)는 ALK1에 결합하지 않으며, 따라서, ALK1에의 리간드 결합을 상기 기전에 의해 억제시키는 것은 아니라는 것이 입증되었다. 실제로, 추가의 SPR 기반 실험 결과, 가용성 hENG(26-586)은 I형 수용체 ALK2-ALK7에도 결합하지 않고, II형 수용체, 예컨대, 액티빈 수용체 IIA, 액티빈 수용체 IIB, 골 형태형성 단백질 수용체 II, 및 TGF-β 수용체 II에도 결합하지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 ENG가 주로 상기 리간드와의 직접적인 상호작용을 통해 BMP-9 및 BMP-10의 ALK1로의 결합을 억제시킨다는 것을 추가로 입증한다.
종합해 보면, 상기 데이터는 가용성 ENG-Fc 키메라 단백질 뿐만 아니라, 비-키메라 가용성 ENG가 ALK1을 포함하는, 다중의 신호전달 경로를 통한 BMP-9 및 BMP-10 신호전달의 길항제로서 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예
5:
mENG
(27-581)-hFc가 배양물 중 인간 제대 정맥
내피 세포
(
HUVEC
)에 미치는 효과
출원인들은 HUVEC 기반 배양 시스템에서 mENG(27-581)-hFc의 혈관신생 효과를 조사하였다. HUVEC를 중합화된 마트리겔(Matrigel) 기판 상에서 배양하고, 12 h 노출 후 위상차 현미경 검사에 의해 시험 물품이 내피 세포 관 (제대) 형성에 미치는 효과를 평가하였다. 단일 세포 너비 및 3개 이상의 분지를 가지는 제대를 시각적으로 확인하였고, 컴퓨터 지원 영상 분석을 사용하여 상기 제대의 총 길이를 측정하였다. 평균 값은 실험 조건당 2개의 배양 웰에 기초한 것으로, 각 웰은 3개의 관찰 시야의 평균을 특징으로 하였다. 기본 조건 (비처리)과 비교하여, 강력한 유도제인 내피 세포 성장 물질 (ECGS, 0.2 ㎍/ml)은 제대의 평균 길이를 배가시켰다 (도 22). mENG(27-581)-hFc (R&D 시스템즈, 카탈로그 #1320-EN; 10 ㎍/ml)는 상기 증가를 거의 60%만큼 감축시켰는데, 이는 같은 농도의 mENG(27-581)-hFc가 ECGS의 부재하에서는 효과가 거의 없었기 때문에, 자극받은 조건에 대해 특이적 효과이다 (도 22). 이러한 결과는 ENG-Fc 융합 단백질이 혈관신생의 세포 배양물 모델에서 다르게 자극받은 조건하의 내피 세포 응집을 억제시킬 수 있다는 것을 입증한다.
실시예
6: ENG
-
Fc는
닭
융모막요막
(CAM) 검정법에서
VEGF
유도성 혈관신생을 억제시킨다.
닭 융모막요막 (CAM) 검정 시스템을 사용하여 ENG-Fc 융합 단백질이 혈관신생에 미치는 효과를 조사하였다. 간략하면, 9일된, 수정된 닭 배아를 온도 (37℃) 미 습도 (60%)가 제어되는 부란기에서 유지시켰다. 난각을 알콜로 연화시키고, 펀칭하여 작은 구멍을 만들어 난각막과 CAM 사이에 "블리스터"를 생성하고, 돌출 혈관 위에 가로 놓인 창을 생성하였다. 0.01 M HEPES, 0.5 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20, 및 0.5 mg/ml 우혈청 알부민을 함유하는 완충제 (pH 7.4) 중에 용해된 mENG(27-581)-hFc 단백질 (R&D 시스템즈, 카탈로그 #1320-EN; 14 ㎍ 매일)의 존재 또는 부재하에서 VEGF (50 ng 매일)로 작은 필터 디스크를 처리하였다. 이어서, 시험 물품을 함유하는 필터 디스크를 개구부를 통해 삽입하여, CAM에 병치시켰다. 난 (각 군당 n = 8)을 3일 동안 매일 신선한 시험 물품으로 처리하고, 4일째에는 난 램프의 도움으로 시각적으로 검사함으로써 필터 디스크와 결합된 혈관 개수를 측정하였다.
예상대로, CAM 검정 시스템에서 VEGF 처리는 비히클의 것과 비교하였을 때, 혈관 개수를 현저히 증가시켰다. VEGF 처리에 의해 유도된 추가 혈관 개수는 mENG(27-581)-hFc 공동 처리로 65%만큼 감소되었다 (도 23). SPR 기반 연구 결과, VEGF는 mENG(27-581)-mFc에는 결합하지 않고, 따라서, 본 CAM 실험에서 mENG(27-581)-hFc가 혈관신생에 미치는 효과는 융합 단백질과 VEGF 사이의 직접적인 상호작용에 기인하는 것인 아닌 것으로 나타났다. 상기 결과는 ENG-Fc가 생체내 모델에서 VEGF 그 자체에 접촉하지 않고, VEGF의 잘 확립된 혈관신생 효과를 유의적으로 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예
7: 마우스
혈관반응기
검정법에서
mENG
(27-581)-mFc가 혈관신생에 미치는 효과
직접적인 생체내 혈관신생 검정법 (DIVAA™; Guedez et al., 2003, Am J Pathol 162:1431-1439)으로도 또한 공지되어 있는 마우스 혈관반응기 검정법으로 ENG-Fc 융합 단백질이 혈관신생에 미치는 효과를 추가로 조사하였으며, 이는 제조사 (트레비겐(Trevigen)®)의 설명서에 따라 수행하였다. 간략하면, 임플란트 등급의 실리콘으로 제조되고, 한쪽 끝이 폐쇄되어 있는 공동 실린더를, 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2, 1.8 g) ? VEGF (600 ng)의 조합과 미리 혼합된, 또는 그렇지 않은 20 ㎕의 기저막 추출물 (BME)로 충전시켰다. BME가 겔화된 후, 혈관반응기를 무흉선 누드 마우스에 피하로 삽입하였다 (마우스 1마리당 4개씩). 11일 동안 매일 마우스를 mENG(27-581)-mFc (10 mg/kg, s.c.) 또는 비히클 (트리스-완충처리된 염수)로 처리하였으며, 이때, 마우스에 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-표지된 덱스트란 (20 mg/kg, i.v.)을 주입하고, 20 min 후에 안락사시켰다. 혈관반응기를 제거하고, 485 nm 여기/520 nm 방출에서 형광 플레이트 판독기 (인피니트(Infinite)® M200, 테칸(Tecan))를 이용하여 혈관 형성의 지표로서 각각에 함유되어 있는 FITC-덱스트란의 양을 정량하였다. 도 24에 제시되어 있는 바와 같이, FGF-2 및 VEGF를 BME에 첨가한 결과, 연구 종료시 혈관반응기 내에서 혈관은 유의적으로 증가한 반면, mENG(27-581)-mFc를 공동으로 투여하였을 때에는 상기 증가는 완전히 억제되었다. 포유동물 시스템에서 수득된 이러한 결과는 상기 기술된 CAM 검정법으로 수득된 결과를 보충해주고, 전장의 ENG 세포외 도메인을 도입한 ENG-Fc 융합 단백질의 생체내 항혈관신생 활성을 입증한다.
실시예
8: hENG
세포외
도메인이 말단절단
된
변이체의
발현
출원인들은 인간 ENG ECD의 말단절단된 변이체가 최소 링커를 이용하여 인간 IgG1 Fc 도메인에 융합되어 있는 것인 가용성 ENG 융합 단백질을 생성하였다. 이들 변이체는 하기에 열거되어 있고, 선택된 변이체의 구조는 도 25에 개략적으로 제시되어 있다.
이들 변이체는 명시된 바와 같이, HEK 293 세포 또는 COS 세포에서 일시적인 형질감염에 의해 발현되었다.
선택된 형태의 hENG(26-437)-hFc는 TPA 리더를 이용하고, 도 26에 제시된 프로세싱되지 않은 아미노산 서열 (서열 21)을 가지며, 도 27에 제시된 뉴클레오티드 서열 (서열 22)에 의해 코딩된다. 선택된 형태의 hENG(26-378)-hFc는 또한 TPA 리더를 이용하고, 도 28에 제시된 프로세싱되지 않은 아미노산 서열 (서열 23)을 가지며, 도 29에 제시된 뉴클레오티드 서열 (서열 24)에 의해 코딩된다. 선택된 형태의 hENG(26-359)-hFc는 또한 TPA 리더를 이용하고, 도 30에 제시된 프로세싱되지 않은 아미노산 서열 (서열 25)을 가지며, 도 31에 제시된 뉴클레오티드 서열 (서열 26)에 의해 코딩된다. 출원인들은 또한 TGGG 링커에 의해 hENG(26-359)에 부착된 N-말단이 말단절단된 hFc 도메인 (도 12, 서열 12)을 포함하는, TPA 리더를 포함하는 대체 hENG(26-359)-hFc 서열 (도 32, 서열 27)을 구상한다. 상기 대체 hENG(26-359)-hFc 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 도 33 (서열 28)에 제시되어 있다. 선택된 형태의 hENG(26-346)-hFc는 TPA 리더를 이용하고, N-말단이 말단절단된 hFc 도메인을 포함하는, 도 34에 제시된 프로세싱되지 않은 아미노산 서열 (서열 29)을 가지며, 도 35에 제시된 뉴클레오티드 서열 (서열 30)에 의해 코딩된다.
각각 N-말단이 말단절단된 Fc 도메인 (서열 12)을 포함하는 것인, 선택된 hENG-hFc 변이체를 (상기 기술된 방법을 사용하여) CHO 세포에서 안정하게 발현시키고, 여과 및 단백질 A 크로마토그래피에 의해 조절 배지로부터 정제하였다. CHO 세포에서 발현된 성숙한 단백질을 분석함으로써 hENG(26-359)-hFc 및 hENG(26-346)-hFc의 N-말단이 서열이 예상 그대로인 것을 확인할 수 있었다. (이론상의 분자량 차이에 대하여 보정되지 않은) 단백질 수율에 기초하였을 때, hENG(26-346)-hFc (90 mg/리터)가 hENG(26-359)-hFc (9 mg/리터) 및 전장의 hENG(26-586)-hFc (31 mg/리터), 둘보다 우수하였다. 도 36에 제시된 바와 같이, 크기 배제 크로마토그래피에 의한 상기 정제된 샘플 분석 결과, hENG(26-346)-hFc 단백질 (96% 단량체)의 정성이 hENG(26-359)-hFc 단백질 (84% 단량체)의 것보다 우수하고, hENG(26-586)-hFc 단백질 (96% 단량체)의 것과는 등가인 것으로 나타났다. 따라서, hENG(26-346)-hFc와 비교하여 hENG(26-359)-hFc의 경우, 더 큰 수준의 고분자량 응집체를 위해서는 추가의 정제 단계를 사용하여야 한다.
실시예
9: BMP-9/BMP-10의 말단절단
된
hENG
-hFc
변이체에의
고친화성
결합
출원인들은 인간 BMP-9 및 BMP-10에의 고친화성 결합에 대하여 하기의 hENG-hFc 단백질 변이체를 스크리닝하기 위해 SPR 방법을 사용하였다. 본 실험에서, 포획된 hENG-hFc 단백질을 각각 100 nM씩인 가용성 BMP-9 또는 BMP-10에 노출시켰다.
상기 표에 제시되어 있는 바와 같이, BMP-9 및 BMP-10에의 고친화성 결합은 오직 전장의 구축물의 경우에만, 및 hENG(26-346)-hFc만큼 짧은 C-말단이 말단절단된 변이체의 경우에만 관찰되었다. BMP-9 및 BMP-10에의 고친화성 결합은 시험된, 61개 초과의 아미노산으로 이루어진 모든 N-말단 말단절단물에 대해 상실되었다.
C-말단 말단절단된 변이체 hENG(26-346)-hFc, hENG(26-359)-hFc, 및 hENG(26-437)-hFc에의 잠재적 결합에 대하여 리간드 패널을 스크리닝하였다. 상기 3종의 단백질의 BMP-9 및 BMP-10에 대한 고친화성 결합은 선택적이었다. hENG(26-346)-hFc, hENG(26-359)-hFc, 및 hENG(26-437)-hFc 어느 것도, 심지어 높은 리간드 농도에서조차 BMP-2, BMP-7, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 또는 액티빈 A에 대해 검출가능한 결합을 나타내지 않았다.
출원인들은 SPR 방법을 이용하여 5개의 구축물: hENG(26-586)-hFc, hENG(26-437)-hFc, hENG(26-378)-hFc, hENG(26-359)-hFc, 및 hENG(26-346)-hFc에 의한 BMP-9 결합의 동적 성질을 비교하였다. 도 37은 여러 구축물에 대한 결합 곡선을 보여주는 것이고, 하기 표에는 평형 해리 상수 및 해리 속도 상수 (kd)에 대하여 계산된 값이 열거되어 있다. hENG(26-359)-hFc 또는 hENG(26-346)-hFc에 대한 인간 BMP-9의 친화도 (KD는 낮은 피코몰 범위)는 전장의 구축물에 대한 것보다 거의 10배수만큼 더 강력하였다. 리간드 트랩, 예컨대, ENG-Fc가 상대적으로 느린 리간드 해리 속도를 보이는 것이 매우 바람직하고, 따라서, 전장의 구축물과 비교하여 hENG(26-346)-hFc에 대한 BMP-9 해리 속도의 10배 개선 (감소)이 특히 주목할 만하다.
하기 제시하는 바와 같이, 각 말단절단된 변이체들은 또한 전장의 구축물에 비하여 더 높은 친화성, 및 더 우수한 동적 성질을 가지고 BMP-10에 결합하였다. 그렇다고 해도, 말단절단된 변이체는 (KD 비에 기초하였을 때) BMP-10보다는 BMP-9에 대한 그의 선호도에 있어 차이를 보였고, hENG(26-346)-hFc는 가장 큰 차이를 보였고, hENG(26-437)-hFC가 가장 작았다. 말단절단된 변이체 중에서의 리간드 선호도에 있어 상기와 같은 차이는 잠재적으로는 생체내 그의 활성의 중요한 차이로 해석될 수 있다.
상기 결과는 hENG ECD의 특정 C-말단이 말단절단된 변이체를 포함하는 융합 단백질이, TGF-β1 및 TGF-β3을 비롯한 다양한 다른 TGF-β 패밀리 리간드가 아닌, BMP-9 및 BMP-10에 고친화성 결합을 보인다는 것을 나타낸다. 특히, 말단절단된 변이체 hENG(26-359)-hFc, hENG(26-346)-hFc, 및 hENG(26-378)-hFc는 전장의 구축물 hENG(26-586)-hFc 및 말단절단된 변이체 hENG(26-437)-hFc, 둘 모두와 비교하여, 평형 상태일 때 더 높은 결합 친화성을 보이고, BMP-9에 대하여 개선된 동적 특성을 보인다.
실시예
10: ENG
N-말단 영역에 대한 2차 구조 예측
상기 개시된 바와 같이, 36개의 아미노산만큼 짧은 N-말단 말단절단물 (hENG(61-346)-hFc)은 ENG 폴리펩티드에의 리간드 결합을 폐기하는 것으로 밝혀졌다. 더욱더 짧은 N-말단 말단절단물이 리간드 결합에 대해 미치는 효과를 예상해 보기 위해, 변형된 사이프레드(Psipred) 버전 3을 이용하여 인간 엔도글린 고아 도메인에 대한 2차 구조를 컴퓨팅으로 예측하였다 (Jones, 1999, J Mol Biol 292:195-202). 분석 결과, 서열 1의 아미노산 26-60에 의해 정의되는 ENG 폴리펩티드 영역 내의 정돈된 2차 구조는 높은 신뢰도로 예측되는 서열 1의 42-45번 위치의 4-잔기 베타 가닥, 및 매우 낮은 신뢰도로 예측되는 서열 1의 28-29번 위치의 2-잔기 베타 가닥으로 한정되는 것으로 나타났다. 따라서, 아미노산 27 또는 28에서 시작되는 ENG 폴리펩티드 변이체, 및 임의적으로 서열 1의 아미노산 29-42 중 어느 것에 시작되는 것은 중요한 구조 요소 및 리간드 결합을 보유할 가능성을 가지고 있다.
실시예
11: 세포 기반 검정법에서 ENG-
Fc
변이체의
효능
A204 세포에서 리포터 유전자 검정법을 사용하여 hENG-hFc 융합 단백질이 BMP-9 및 BMP-10에 의한 신호전달을 억제시키는 효능을 측정하였다. 상기 검정법은 pGL3 BRE-루시페라제 리포터 플라스미드 (Korchynskyi et al., 2002, J Biol Chem 277: 4883-4891)로 뿐만 아니라, 형질감염률 제어를 위해 레닐라(Renilla) 리포터 플라스미드 (pRLCMV-루시페라제)로 형질감염된 인간 횡문근육종 세포주에 기초한 것이다. BRE 모티프는 (Id1 프로모터를 함유하는) BMP 반응성 유전자에 존재하며, 이에, 상기 벡터가 Smad1 및/또는 Smad5를 통해 신호전달하는 인자에 대하여 일반적으로 사용된다. ENG-Fc 융합 단백질의 부재하에서, BMP-9 및 BMP-10은 A204 세포에서 용량에 의존하는 방식으로 신호전달을 자극시킨다.
검정 첫날, A204 세포 (ATCC® 번호: HTB-82™; 기탁자: DJ 지아르(DJ Giard))를 웰당 105개의 세포로 48 웰 플레이트에 분포시켰다. 다음날, 12 ㎍ pGL3 BRE-루시페라제, 0.1 ㎍ pRLCMV-루시페라제, 30 ㎕ 퓨젠(Fugene) 6 (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics)), 및 970 ㎕ 옵티MEM(OptiMEM) (인비트로겐)을 함유하는 용액을, 24 ml의 검정용 완충제 (0.1% BSA로 보충된 맥코이(McCoy's) 배지)에 첨가하기 전 30 min 동안 실온에서 미리 인큐베이션시켰다. 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시키기 위해 플레이팅된 세포 (500 ㎕/웰)에 상기 혼합물을 적용시켰다. 3일째, 배지를 제거하고, 검정용 완충제 중에 희석된 시험 물질 (250 ㎕/웰)로 대체하였다. 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 세포를 세정하고, 수동 용해 완충제 (프로메가(Promega) E1941))로 용해시키고, -70℃에서 냉동시켰다. 검정하기 전, 플레이트를 완만하게 진탕시키면서, 실온으로 가온시켰다. 세포 용해물을 이중으로 화학발광 플레이트 (96 웰)로 옮겨 놓고, 듀얼-루시페라제 리포터 어세이(Dual-Luciferase Reporter Assay) 시스템 (프로메가 E1980)으로부터의 시약을 이용하여 광도계에서 분석하여 정규화된 루시페라제 활성을 측정하였다.
본 결과, hENG-hFc 단백질은 BMP-9 및 BMP-10에 의해 매개되는 세포 신호전달의 강력한 억제제인 것으로 나타났다. 하기 표에 제시된 바와 같이, 전장의 구축물 hENG(26-586)-hFc는 각각 나노몰 미만(sub-nanomolar) 및 낮은 나노몰 범위의 IC50 값으로 BMP-9 및 BMP-10에 의한 신호전달을 억제시킨다. 또한, 말단절단된 변이체 hENG(26-359)-hFc 및 hENG(26-346)-hFc, 둘 모두 hENG(26-586)-hFc보다 더 강력한 효능을 가졌다.
실시예
12: 말단절단된
변이체
hENG
(26-359)-hFc는 CAM 검정법에서
VEGF
유도성 혈관신생을
억제시킨다
.
출원인들은, 혈관신생을 유도하는 데 VEGF가 사용된 실시예 6에 기술된 것과 동일한 CAM 검정 시스템에서 말단절단된 변이체 hENG(26-359)-hFc가 혈관신생에 미치는 효과를 조사하였다. VEGF 처리 (50 ng 매일)에 의해 유도된 추가 혈관 개수는 공동 hENG(26-359)-hFc (서열 25; 20 ㎍ 매일)로 75%만큼 감소되었다 (도 38). SPR 기반 연구 결과, VEGF는 hENG(26-359)-hFc에는 결합하지 않고, 따라서, 본 CAM 실험에서 본 변이체가 혈관신생에 미치는 효과는 융합 단백질과 VEGF 사이의 직접적인 상호작용에 기인하는 것인 아닌 것으로 확인되었다. 각 구축물의 이론상의 분자량에 기초하면, hENG(26-359)-hFc의 경우, 10 ㎍인 용량은 실시예 6에서 시험된 더욱 긴 장쇄의 ENG-Fc 구축물에 대해 사용된 14 ㎍인 용량에 상응한다는 점에 주의한다. 따라서, 말단절단된 변이체 hENG(26-359)-hFc는 상기 동일한 검정 시스템에서 전장의 ECD를 포함하는 ENG 구축물과 비교하였을 때, VEGF 유도성 혈관신생을 억제시킴에 있어서, 등가인, 그렇지 않다면, 더 큰 효능을 보였다 (도 23).
실시예
13: 말단절단된
변이체
hENG
(26-346)-hFc는 마우스
혈관반응기
검정법에서 혈관신생을 억제시킨다.
말단절단된 변이체 hENG(26-346)-hFc를 실시예 7에 기술된 것과 동일한 마우스 혈관반응기 검정법으로 시험하였다. 혈관반응기를 무흉선 누드 마우스에 피하로 삽입하고 (마우스 1마리당 4개씩), 11일 동안 매일 마우스를 hENG(26-346)-hFc (10 mg/kg, s.c.) 또는 비히클 (트리스-완충처리된 염수)로 처리하였으며, 이때, 마우스에 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-표지된 덱스트란 (20 mg/kg, i.v.)을 주입하고, 20 min 후에 안락사시켰다. 이어서, 혈관 형성의 지표로서 각 혈관반응기에 함유되어 있는 FITC-덱스트란의 양을 측정하였다. 도 39에 제시되어 있는 바와 같이, 성장 인자 (GF) FGF-2 및 VEGF를 혈관반응기에 첨가한 결과, 혈관은 유의적으로 증가한 반면, hENG(26-346)-hFc를 공동으로 투여하였을 때에는 상기 증가는 완전히 억제되었다. SPR 기반 연구를 통해 hENG(26-346)-hFc는 FGF-2에도, 및 VEGF에도 결합하지 않으며, 본 실험에서 hENG(26-346)-hFc가 유도성 혈관신생에 미치는 효과는 융합 단백질과 FGF-2 또는 VEGF 사이의 직접적인 상호작용에 기인하는 것일 수 있다는 가능성을 배제된다는 것을 확인할 수 있었다. 본 포유동물 검정 시스템에서 얻은 본 결과는 CAM 검정법에서 말단절단된 변이체 hENG(26-359)-hFc에 대해 수득된 결과 (실시예 12)를 보충해준다. 종합해 보면, 이는 ENG 세포외 도메인의 바람직한 말단절단물을 도입한 ENG-Fc 융합 단백질의 생체내 항혈관신생 활성을 입증한다.
실시예
14: 말단절단된
변이체
hENG
(26-346)-hFc의 더욱 긴 장기간의
생체내
반감기
출원인들은 hENG(26-346)-hFc의 전신 제거 반감기를 측정하기 위해 변형된 약동학적 연구를 수행하였고, 그를 전장의 단백질 mENG(27-581)-mFc의 것과 비교하였다. SAIVI™ (소형 동물 생체내 영상화) 라피드 안티바디 라벨링(Rapid Antibody Labeling) 키트를 사용하여 제조사 (인비트로겐™)의 설명서에 따라 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 750 염료로 hENG(26-346)-hFc 단백질을 형광 표지하였다. 크기 배제 크로마토그래피에 의해 표지된 단백질을 유리 표지로부터 분리시켰다. 무흉선 누드 마우스 (n = 3, 17-20 g)에 표지된 hENG(26-346)-hFc (2 mg/kg, s.c.)를 주입하고, IVIS 영상화 시스템 (제노겐(Xenogen)®/캘리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences))을 이용하여 전신 영상화를 수행하여 주사 후 2, 4, 6, 8, 24, 32, 48, 및 72 h 시점에 융합 단백질 수준을 측정하였다. hENG(26-346)-hFc의 평균 제거 반감기는 26.5 h였으며, 이는 유사 연구에서 측정된 mENG(27-581)-mFc의 반감기가 22 h인 것보다 20% 더 길다.
실시예
15: 마우스
이종이식편
모델에서 ENG-
Fc
단백질이 종양 성장에 미치는 효과
2개의 상이한 마우스 이종이식편 모델에서 ENG-Fc 단백질을 시험하여 상기 단백질이 종양 성장을 억제시킬 수 있는지 여부에 대하여 측정하였다. 제1 실험에서는, 106 4T1 유방 암종 세포 (ATCC® 번호: CRL-2539™; 기탁자: BA 플라스키 (BA Pulaski))를 무흉선 누드 마우스에 6주령째에 피하로 주사하였다. 마우스 (군당 n = 10)에 mENG(27-581)-mFc (10 mg/kg) 또는 비히클 (트리스-완충처리된 염수)을 매일 (s.c.) 투약하였다. 디지털 캘리퍼로 종양을 수동으로 측정하고, 공식: 부피 = 0.5(길이)(너비2)에 따라 종양 부피를 계산하였다. 도 40에 제시된 바와 같이, 비히클과 비교하였을 때 mENG(27-581)-mFc 처리는 이식 후 24일째까지 종양 부피를 45%만큼 축소시켰다.
ENG-Fc 융합 단백질을 또한 콜론-26 암종 이종이식편 모델에서 시험하였다. 1.5 x 106 콜론-26 암종 세포 (ATCC® 번호: CRL-2638™; 기탁자: N 레스티포(N Restifo))를 BALB/c 마우스에 7주령째에 피하로 주사하였다. 마우스 (군당 n = 10)에 mENG(27-581)-mFc (1, 10, 또는 30 mg/kg) 또는 비히클 (트리스-완충처리된 염수)을 매일 (s.c.) 투약하였다. 상기 기술된 바와 같이 종양 부피를 측정하였다. 도 41에 제시된 바와 같이, mENG(27-581)-mFc 처리는 종양 부피를 용량에 의존하는 방식으로 축소시켰으며, 비히클과 비교하였을 때 10 mg/kg 및 30 mg/kg의 용량은 각각 이식 후 58일째까지 55% 및 거의 70%만큼 축소시켰다. 따라서, mENG(27-581)-mFc는 마우스 이종이식편 모델 2종의 상이한 종양 유형의 성장을 현저히 저속화시켰으며, 이는 전장의 뮤린 ENG 세포외 도메인을 도입한 융합 단백질의 상기 언급된 항혈관신생 활성 (실시예 5-7)과 일관되는 것이다. 예비 실험에서, 말단절단된 변이체 hENG(26-346)은 또한 콜론-26 이종이식편 모델에서 비히클과 비교하여 종양 성장을 저속화시켰으며, 이는 마우스 혈관반응기 검정법에서의 상기 변이체의 항혈관신생 활성 (실시예 13)과 일관되는 것이다.
종합해 보면, 상기 언급된 결과는 전장의 ENG ECD, 및 그의 특정의 말단절단된 변이체를 포함하는 융합 단백질이 TGF-β1 및 TGF-β3을 비롯한 다양한 다른 TGF-β 패밀리 리간드가 아닌, BMP-9 및 BMP-10에 고친화성 결합을 보인다는 것을 입증한다. 이러한 ENG 폴리펩티드는 모델 시스템에서 혈관신생 및 종양 성장을 억제시킬 수 있으며, 따라서, 암 환자를 비롯한, 원치않는 혈관신생을 앓는 환자를 치료할 수 있는 잠재능을 가질 수 있다. 전장의 ENG ECD를 포함하는 구축물과 비교하였을 때, 말단절단된 ENG 폴리펩티드 hENG(26-346)-hFc 및/또는 hENG(26-359)-hFc는 더 높은 효능을 보였고, 여러 다른 중요한 파라미터에 대한 성능을 개선시켰다 (하기 요약 표를 참조).
변이체 hENG(26-346)-hFc는 특히 전장의 ENG ECD 구축물보다 더 높은 효능, 강력한 결합 친화도, 더 느린 해리 속도, 더 긴 제거 반감기, 및 더 우수한 단백질 제조와 같은 속성의 우수한 조합을 가졌다. 리간드 트랩으로서 말단절단된 ENG 폴리펩티드는 바람직하게는 느린 리간드 해리 속도를 보여야 하며, 따라서, 전장의 구축물과 비교하였을 때, hENG(26-346)-hFc의 경우, BMP-9 해리 속도가 10배 감소된 것이 매우 바람직할 수 있다. 한편으로, 변이체 hENG(26-378)-hFc는 hENG(26-346)-hFc와 hENG(26-359)-hFc 사이의 중간 정도인 BMP-9 결합 특성 (친화성 및 해리 속도)을 보였고, 다른 한편으로는 hENG(26-378)을 포함하는 hENG(26-437)-hFc는 더 짧은 구축물과 훨씬 더 유사하였다.
실시예
16: ENG-
Fc
단백질을 이용한 간 섬유증을 앓는 마우스 모델의 치료
간 섬유증을 앓는 마우스 CCL4 (사염화탄소) 모델에서 섬유증 치료에서의 ENG-Fc 단백질의 효과를 평가하였다. 본 연구에서는 50마리의 마우스를 사용하였다. 실험 출발일 (0일째) 시점에 대략 14주령된 것인 수컷 및 암컷 A/J 마우스를 48시간 이상 실험실에서 순응시켰다. 실험을 진행하는 동안 매일 동물을 모니터링하고, 이환, 사망, 및 시험 물품의 독성에 관한 임의의 징후가 관찰되었을 때에는 희생시켰다.
간 섬유증을 유도하기 위해 주 2회에 걸쳐 경구 급식을 통해 올리브 오일 중 50% CCl4을 1 ml/kg의 용량으로 동물에게 제공하였다. 하기 표에 기술된 바와 같이 13주 동안 mENG(27-581)-mFc를 동물에게 투약하였다.
체중 (BW), 간 중량, 간 성능, 및 조직학적 성질의 변화에 대해 동물을 분석하였다. 0일째, 28일째, 56일째, 및 90일째, 동물을 NMR 스캐닝하였다. 45일째 또는 90일째, CO2를 이용하여 동물을 안락시켰다. 혈청 분석을 위해, 동물을 희생 및 혈청 샘플링 전 12 hr 동안 금식시켰다. 간 기능 분석을 위해 전혈을 수집하고, 각 동물로부터 간을 수집하고, 그 중량을 측정하였다. 간의 절반부는 10% 포르말린 중의 카트리지에 놓고, 간엽은 액체 질소 중에서 급냉시켰다.
mENG(27-581)-mFc 처리는 13주 동안의 기간에 걸쳐 (체중에 대한 비율로서 측정된) 간 중량에 어떤 영향도 미치지 않았다 (도 42). 13주 간의 투약 기간 후, 동물을 희생시키고, 간 절편을 H&E 및 마손 트리크롬 염색법으로 염색하였다 (도 43-45). 비처리 동물에 비하여 처리 동물에서는 섬유증이 현저히 감소된 것으로 나타났다 (도 45). 추가로, 오일 레드 O를 이용한 염색법 결과, mENG(27-581)-mFc 처리는, 대개는 간 손상 및 섬유화 침착의 전구체인 것인 간 조직 중 지방 침착물 축적을 감소시킨 것으로 나타났다 (도 46). 추가로, mENG(27-581)-mFc 처리는, 아포프토시스와 관련이 있고, 간 염증과 관련하여 관찰되는 것인, 간세포의 팽대 변성을 감소시키는 것으로 보였다. 비처리 코호트와 비교하였을 때, 엔도글린으로 처리된 코호트에서 혈청 알칼리성 포스파타제 수준은 더 낮았다 (도 47). 전체적으로 보면, 상기 데이터는 mENG(27-581)-mFc 처리가 상기의 간 섬유증을 앓는 마우스 모델에서 간 손상을 감소시킬 수 있으며, 따라서, ENG-Fc 단백질은 경변증 및 최종적으로는 간세포 암종을 비롯한, 간의 섬유화 장애를 치료하는 데 있어 유용할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예
17: 간 섬유증을 앓는 식이성 마우스 모델에서의 ENG-
Fc
단백질의 효과
메티오닌 및 콜린 식이 부족 (MCDD)에 의해 유발된 비알콜성 지방간염 (NASH)을 앓는 마우스 모델에서 ENG-Fc 단백질의 효과 또한 평가하였다. 야생형 C57BL/6 마우스에 표준 사료 식단, 또는 높은 수크로스 (40%) 및 지방 (10%)은 함유하되, 간 β-산화, 및 초저밀도 지질단백질의 생산에 필수적인 메티오닌 및 콜린은 결핍된 식단을 식단을 먹이로 제공하였다 (Takahashi et al., 2012, World J Gastroenterol 18:2300-2308). 그 결과, MCDD 마우스는 간 손상 및 섬유화 침착의 전구체인 것으로 간주되는 지방 침착물을 보였다 (Corbin et al., 2012, Curr Opin Gastroenterol 28:159-165). 12주령째에 마우스를 그의 각 식단을 유지하도록 배치하고, 3주 동안 매주 2회에 걸쳐 mENG(27-581)-mFc (10 mg/kg) 또는 비히클 (군당 n = 10)을 이용한 복강내 처리를 시작하였다. 투약 종료시, 마우스를 죽이고, 간 절편을 지질 가용성 디아조 염료인 오일 레드 O로 염색하여 지질 침착 정도를 평가하였다.
예상대로, 사료 식단을 먹이로 제공받은 마우스는 간 조직에 오직 작은 지질 침착물을 보인 반면 (데이터는 나타내지 않음), MCDD 마우스는, 전체적으로 전체 조직 면적의 상당 부분을 점유하는 다수의 큰 지질 침착물을 보였다 (도 48a,c). MCDD 마우스에서, 비히클과 비교하였을 때, mENG(27-581)-mFc 처리는 간 지질 침착물을 현저히 감소시켰다 (도 48). 비록 내인성 TGFβ가 간 질환의 진행에 있어 크게 연루되어 있기는 하지만 (Dooley et al., 2012, Cell Tissue Res 347:245-256), TGFβ 수용체 II형을 포함하고, 고친화성으로 TGFβ에 결합하는 Fc 융합 단백질은 간 지질 침착물의 축적에는 영향을 거의 미치지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 실시예 3에 개시된 바와 같이, mENG(27-581)-mFc 및 다른 ENG-Fc 단백질은 TGFβ1, TGFβ2에도, TGFβ3에도 결합하지 않으며, 따라서, MCDD 마우스에서의 mENG(27-581)-mFc의 생체활성은 상기 리간드에 의한 신호전달의 억제에 기인하는 것은 아니다. 종합해 보면, 상기 결과는 mENG(27-581)-mFc가, 식이 부족이 최종적으로는 섬유증 및 비알콜성 지방간염을 유도하게 되는 것인 마우스 모델에서 지질의 침착을 현저히 감소시킬 수 있다는 것을 나타내며, 이는 ENG-Fc 단백질이 간 섬유증을 치료하는 데 있어 유용할 수 있다는 것을 추가로 입증한다.
참고 문헌 포함
본원에서 언급된 모든 공개 문헌 및 특허는 각각의 개별 공개 문헌 또는 특허가 마치 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같이, 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 본원의 임의의 정의를 비롯한 본 출원이 우선할 것이다.
등가물
본원에서 대상 발명의 구체적인 실시양태가 명백하게 개시되었지만, 상기 명세서는 예시적이고, 제한적인 것이다. 본 발명의 많은 변형은 본 명세서 및 하기 청구범위 리뷰시에 통상의 기술자에게 자명해질 것이다. 본 발명의 완전한 범주는 청구범위와, 등가물에 관한 그의 완전한 범주와 함께, 및 명세서와, 상기 변형과 함께 그를 참조로 하여 결정되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Acceleron Pharma, Inc.
<120> ENDOGLIN PEPTIDES TO TREAT FIBROTIC DISEASES
<130> A0904.70009WO00
<140> PCT/US2014/062147
<141> 2014-10-24
<150> US 61/896,002
<151> 2013-10-25
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gtgccgacga cgccatgacc ctggtactaa agaaagagct tgttgcgcat ttgaagtgca 1200
ccatcacggg cctgaccttc tgggacccca gctgtgaggc agaggacagg ggtgacaagt 1260
ttgtcttgcg cagtgcttac tccagctgtg gcatgcaggt gtcagcaagt atgatcagca 1320
atgaggcggt ggtcaatatc ctgtcgagct catcaccaca gcggaaaaag gtgcactgcc 1380
tcaacatgga cagcctctct ttccagctgg gcctctacct cagcccacac ttcctccagg 1440
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tctccgagtt cctgctccag ttagacagct gccacctgga cttggggcct gagggaggca 1560
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gggccctgct cactgctgca ctctggtaca tctactcgca cacgcgtgag taccccaggc 1920
ccccacagtg a 1931
<210> 5
<211> 653
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
Met Asp Arg Gly Val Leu Pro Leu Pro Ile Thr Leu Leu Phe Val Ile
1 5 10 15
Tyr Ser Phe Val Pro Thr Thr Gly Leu Ala Glu Arg Val Gly Cys Asp
20 25 30
Leu Gln Pro Val Asp Pro Thr Arg Gly Glu Val Thr Phe Thr Thr Ser
35 40 45
Gln Val Ser Glu Gly Cys Val Ala Gln Ala Ala Asn Ala Val Arg Glu
50 55 60
Val His Val Leu Phe Leu Asp Phe Pro Gly Met Leu Ser His Leu Glu
65 70 75 80
Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Glu Thr Gln Glu Val
85 90 95
Phe Leu Val Leu Val Ser Asn Lys Asn Val Phe Val Lys Phe Gln Ala
100 105 110
Pro Glu Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asp Ser Ser Leu Val Ile Phe
115 120 125
Gln Gly Gln Pro Arg Val Asn Ile Thr Val Leu Pro Ser Leu Thr Ser
130 135 140
Arg Lys Gln Ile Leu Asp Trp Ala Ala Thr Lys Gly Ala Ile Thr Ser
145 150 155 160
Ile Ala Ala Leu Asp Asp Pro Gln Ser Ile Val Leu Gln Leu Gly Gln
165 170 175
Asp Pro Lys Ala Pro Phe Leu Cys Leu Pro Glu Ala His Lys Asp Met
180 185 190
Gly Ala Thr Leu Glu Trp Gln Pro Arg Ala Gln Thr Pro Val Gln Ser
195 200 205
Cys Arg Leu Glu Gly Val Ser Gly His Lys Glu Ala Tyr Ile Leu Arg
210 215 220
Ile Leu Pro Gly Ser Glu Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Met Met
225 230 235 240
Glu Leu Ser Cys Thr Ser Gly Asp Ala Ile Leu Ile Leu His Gly Pro
245 250 255
Pro Tyr Val Ser Trp Phe Ile Asp Ile Asn His Ser Met Gln Ile Leu
260 265 270
Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Val Lys Ile Phe Pro Gly Ser Lys Val Lys
275 280 285
Gly Val Glu Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Ile Ala Glu Ala Arg
290 295 300
Lys Leu Asn Ala Ser Ile Val Thr Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Val
305 310 315 320
Ser Asn Val Ser Leu Arg Ala Ser Ser Cys Gly Gly Val Phe Gln Thr
325 330 335
Thr Pro Ala Pro Val Val Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro
340 345 350
Val Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Pro Lys Cys Gly Asn Gln Val Met
355 360 365
Thr Leu Ala Leu Asn Lys Lys His Val Gln Thr Leu Gln Cys Thr Ile
370 375 380
Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Ser Ser Cys Gln Ala Glu Asp Thr Asp
385 390 395 400
Asp His Leu Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Lys Val
405 410 415
Thr Ala His Val Val Ser Asn Glu Val Ile Ile Ser Phe Pro Ser Gly
420 425 430
Ser Pro Pro Leu Arg Lys Lys Val Gln Cys Ile Asp Met Asp Ser Leu
435 440 445
Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His Phe Leu Gln Ala Ser
450 455 460
Asn Thr Ile Glu Leu Gly Gln Gln Ala Phe Val Gln Val Ser Val Ser
465 470 475 480
Pro Leu Thr Ser Glu Val Thr Val Gln Leu Asp Ser Cys His Leu Asp
485 490 495
Leu Gly Pro Glu Gly Asp Met Val Glu Leu Ile Gln Ser Arg Thr Ala
500 505 510
Lys Gly Ser Cys Val Thr Leu Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro
515 520 525
Arg Phe Ser Phe Leu Leu Arg Val Tyr Met Val Pro Thr Pro Thr Ala
530 535 540
Gly Thr Leu Ser Cys Asn Leu Ala Leu Arg Pro Ser Thr Leu Ser Gln
545 550 555 560
Glu Val Tyr Lys Thr Val Ser Met Arg Leu Asn Ile Val Ser Pro Asp
565 570 575
Leu Ser Gly Lys Gly Leu Val Leu Pro Ser Val Leu Gly Ile Thr Phe
580 585 590
Gly Ala Phe Leu Ile Gly Ala Leu Leu Thr Ala Ala Leu Trp Tyr Ile
595 600 605
Tyr Ser His Thr Arg Gly Pro Ser Lys Arg Glu Pro Val Val Ala Val
610 615 620
Ala Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ser Ser Ser Thr Asn His Ser Ile Gly
625 630 635 640
Ser Thr Gln Ser Thr Pro Cys Ser Thr Ser Ser Met Ala
645 650
<210> 6
<211> 1965
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 6
agcatggacc gtggcgtgct ccctctgccc attaccctgc tgtttgtcat ctatagcttt 60
gtacccacaa caggtctcgc agaaagagtc ggctgtgatc tacagcctgt ggaccccaca 120
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ctcgtttcga acaaaaatgt cttcgtgaag ttccaggccc cggaaatccc attgcacttg 360
gcctacgact ccagcctggt catcttccaa ggacagccaa gagtcaacat cacagtgcta 420
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gcaccattct tgtgcttgcc agaagctcac aaggacatgg gcgccacact tgaatggcaa 600
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gcctacatcc tgaggatcct gccaggttct gaggccgggc cccggacggt gaccgtaatg 720
atggaactga gttgcacatc tggggacgcc attctcatcc tgcatggtcc tccatatgtc 780
tcctggttca tcgacatcaa ccacagcatg cagatcttga ccacaggtga atactccgtc 840
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caggaagtct acaagacagt ctccatgcgc ctgaacatcg tcagccctga cctgtctggt 1740
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Met Asp Arg Gly Val Leu Pro Leu Pro Ile Thr Leu Leu Phe Val Ile
1 5 10 15
Tyr Ser Phe Val Pro Thr Thr Gly Leu Ala Glu Arg Val Gly Cys Asp
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Leu Gln Pro Val Asp Pro Thr Arg Gly Glu Val Thr Phe Thr Thr Ser
35 40 45
Gln Val Ser Glu Gly Cys Val Ala Gln Ala Ala Asn Ala Val Arg Glu
50 55 60
Val His Val Leu Phe Leu Asp Phe Pro Gly Met Leu Ser His Leu Glu
65 70 75 80
Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Glu Thr Gln Glu Val
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115 120 125
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130 135 140
Arg Lys Gln Ile Leu Asp Trp Ala Ala Thr Lys Gly Ala Ile Thr Ser
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Ile Ala Ala Leu Asp Asp Pro Gln Ser Ile Val Leu Gln Leu Gly Gln
165 170 175
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180 185 190
Gly Ala Thr Leu Glu Trp Gln Pro Arg Ala Gln Thr Pro Val Gln Ser
195 200 205
Cys Arg Leu Glu Gly Val Ser Gly His Lys Glu Ala Tyr Ile Leu Arg
210 215 220
Ile Leu Pro Gly Ser Glu Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Met Met
225 230 235 240
Glu Leu Ser Cys Thr Ser Gly Asp Ala Ile Leu Ile Leu His Gly Pro
245 250 255
Pro Tyr Val Ser Trp Phe Ile Asp Ile Asn His Ser Met Gln Ile Leu
260 265 270
Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Val Lys Ile Phe Pro Gly Ser Lys Val Lys
275 280 285
Gly Val Glu Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Ile Ala Glu Ala Arg
290 295 300
Lys Leu Asn Ala Ser Ile Val Thr Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Val
305 310 315 320
Ser Asn Val Ser Leu Arg Ala Ser Ser Cys Gly Gly Val Phe Gln Thr
325 330 335
Thr Pro Ala Pro Val Val Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro
340 345 350
Val Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Pro Lys Cys Gly Asn Gln Val Met
355 360 365
Thr Leu Ala Leu Asn Lys Lys His Val Gln Thr Leu Gln Cys Thr Ile
370 375 380
Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Ser Ser Cys Gln Ala Glu Asp Thr Asp
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Asp His Leu Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Lys Val
405 410 415
Thr Ala His Val Val Ser Asn Glu Val Ile Ile Ser Phe Pro Ser Gly
420 425 430
Ser Pro Pro Leu Arg Lys Lys Val Gln Cys Ile Asp Met Asp Ser Leu
435 440 445
Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His Phe Leu Gln Ala Ser
450 455 460
Asn Thr Ile Glu Leu Gly Gln Gln Ala Phe Val Gln Val Ser Val Ser
465 470 475 480
Pro Leu Thr Ser Glu Val Thr Val Gln Leu Asp Ser Cys His Leu Asp
485 490 495
Leu Gly Pro Glu Gly Asp Met Val Glu Leu Ile Gln Ser Arg Thr Ala
500 505 510
Lys Gly Ser Cys Val Thr Leu Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro
515 520 525
Arg Phe Ser Phe Leu Leu Arg Val Tyr Met Val Pro Thr Pro Thr Ala
530 535 540
Gly Thr Leu Ser Cys Asn Leu Ala Leu Arg Pro Ser Thr Leu Ser Gln
545 550 555 560
Glu Val Tyr Lys Thr Val Ser Met Arg Leu Asn Ile Val Ser Pro Asp
565 570 575
Leu Ser Gly Lys Gly Leu Val Leu Pro Ser Val Leu Gly Ile Thr Phe
580 585 590
Gly Ala Phe Leu Ile Gly Ala Leu Leu Thr Ala Ala Leu Trp Tyr Ile
595 600 605
Tyr Ser His Thr Arg Glu Tyr Pro Lys Pro Pro Pro His Ser His Ser
610 615 620
Lys Arg Ser Gly Pro Val His Thr Thr Pro Gly His Thr Gln Trp Ser
625 630 635 640
Leu
<210> 8
<211> 1929
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 8
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gtacagtgca tcgacatgga cagcctctcc ttccagctgg gcctctacct cagcccgcac 1380
ttcctccagg catccaacac catcgaacta ggccagcagg ccttcgtaca ggtgagcgtg 1440
tctccattga cctctgaggt cacagtccag ctagatagct gccatctgga cttggggccc 1500
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caggaagtct acaagacagt ctccatgcgc ctgaacatcg tcagccctga cctgtctggt 1740
aaaggccttg tcctgccctc tgtactgggt atcacctttg gtgccttcct gattggggcc 1800
ctgctcacag ctgcactctg gtacatctat tctcacacac gtgagtatcc caagcctcca 1860
ccccattccc acagcaagcg ctcagggccc gtccacacca ccccggggca cacccagtgg 1920
agcctctga 1929
<210> 9
<211> 561
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu
1 5 10 15
Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala
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Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr
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Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly
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Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg
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Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu
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Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu
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Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu
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Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr
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Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala
210 215 220
Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala
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Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser
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Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr
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Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val
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Val Val Asn Ile Leu Ser Ser Ser Ser Pro Gln Arg Lys Lys Val His
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Leu Ile Gln Gly Arg Ala Ala Lys Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Ser
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Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro Arg Phe Ser Phe Leu Leu His Phe Tyr
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Arg Pro Lys Thr Gly Ser Gln Asp Gln Glu Val His Arg Thr Val Phe
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Gly
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<213> Mus musculus
<400> 10
Glu Arg Val Gly Cys Asp Leu Gln Pro Val Asp Pro Thr Arg Gly Glu
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Leu Pro Ser Leu Thr Ser Arg Lys Gln Ile Leu Asp Trp Ala Ala Thr
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Lys Gly Ala Ile Thr Ser Ile Ala Ala Leu Asp Asp Pro Gln Ser Ile
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Val Leu Gln Leu Gly Gln Asp Pro Lys Ala Pro Phe Leu Cys Leu Pro
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Glu Ala His Lys Asp Met Gly Ala Thr Leu Glu Trp Gln Pro Arg Ala
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Gln Thr Pro Val Gln Ser Cys Arg Leu Glu Gly Val Ser Gly His Lys
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Glu Ala Tyr Ile Leu Arg Ile Leu Pro Gly Ser Glu Ala Gly Pro Arg
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275 280 285
Val Glu Leu Pro Leu Val Ser Asn Val Ser Leu Arg Ala Ser Ser Cys
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305 310 315 320
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355 360 365
Gln Ala Glu Asp Thr Asp Asp His Leu Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ser
370 375 380
Ser Cys Gly Met Lys Val Thr Ala His Val Val Ser Asn Glu Val Ile
385 390 395 400
Ile Ser Phe Pro Ser Gly Ser Pro Pro Leu Arg Lys Lys Val Gln Cys
405 410 415
Ile Asp Met Asp Ser Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro
420 425 430
His Phe Leu Gln Ala Ser Asn Thr Ile Glu Leu Gly Gln Gln Ala Phe
435 440 445
Val Gln Val Ser Val Ser Pro Leu Thr Ser Glu Val Thr Val Gln Leu
450 455 460
Asp Ser Cys His Leu Asp Leu Gly Pro Glu Gly Asp Met Val Glu Leu
465 470 475 480
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545 550 555
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<211> 233
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Gly Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
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20 25 30
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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
165 170 175
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
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Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
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115 120 125
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<213> Apis mellifera
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
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ctccaggcat ccaagcaaaa tggcacctgg ccccgagagg tgcttctggt cctcagtgta 300
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tccagcctgg tcaccttcca agagcccccg ggggtcaaca ccacagagct gccatccttc 420
cccaagaccc agatccttga gtgggcagct gagaggggcc ccatcacctc tgctgctgag 480
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tccgtctccg agttcctgct ccagttagac agctgccacc tggacttggg gcctgaggga 1500
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ccaagccccg agggtgaccc gcgcttcagc ttcctcctcc acttctacac agtacccata 1620
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tgcacaagca aaggcaccgg tggtggaccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca 1800
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cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1980
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gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 2100
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ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 2280
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctat 2340
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tga 2463
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
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gtctccctga gggcctccag ctgcggtggt gtgttccaga ccacccctgc acccgttgtg 1020
accacacctc ccaaggacac atgcagcccc gtgctactca tgtccctgat ccagccaaag 1080
tgtggcaatc aggtcatgac tctggcactc aataaaaaac acgtgcagac tctccagtgc 1140
accatcacag gcctgacttt ctgggactcc agctgccagg ctgaagacac tgacgaccat 1200
cttgtcctga gtagcgccta ctccagctgc ggcatgaaag tgacagccca tgtggtcagc 1260
aatgaggtga tcatcagttt cccgtcaggc tcaccaccac ttcggaaaaa ggtacagtgc 1320
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gcatccaaca ccatcgaact aggccagcag gccttcgtac aggtgagcgt gtctccattg 1440
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aaatga 2466
<210> 21
<211> 671
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln
20 25 30
Pro Val Gly Pro Glu Arg Asp Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val
35 40 45
Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His
50 55 60
Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu
85 90 95
Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu Gly
100 105 110
Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln Glu
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly
165 170 175
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180 185 190
Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu
195 200 205
Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro
210 215 220
Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser
225 230 235 240
Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro
245 250 255
Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr
260 265 270
Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly
275 280 285
Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met
290 295 300
Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser
305 310 315 320
Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser
325 330 335
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Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met Thr
355 360 365
Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile Thr
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Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val Ser
405 410 415
Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser Ser
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435 440 445
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<210> 22
<211> 2016
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
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<210> 23
<211> 606
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln
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Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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595 600 605
<210> 24
<211> 1821
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 24
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Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu
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Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
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Lys
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln
20 25 30
Pro Val Gly Pro Glu Arg Asp Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val
35 40 45
Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His
50 55 60
Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu
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195 200 205
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Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser
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260 265 270
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Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser
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<212> DNA
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<400> 28
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ctctccctgt ccccgggtaa atga 1764
<210> 29
<211> 574
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 32
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1
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
485 490 495
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
500 505 510
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
515 520 525
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
530 535 540
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
545 550 555 560
Pro Gly Lys
<210> 36
<211> 550
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Asp Glu
1 5 10 15
Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala
20 25 30
Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr
35 40 45
Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly
50 55 60
Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val
65 70 75 80
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180 185 190
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Claims (24)
- 섬유화 장애 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 유효량의, 서열 1의 아미노산 42-333과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 엔도글린 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 섬유화 장애 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 섬유화 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
- 제1항에 있어서, 섬유화 장애가 간 섬유증인 방법.
- 제2항에 있어서, 간 섬유증이 간 경변증, 알콜 유발성 간 섬유증, 담즙관 손상, 원발성 담즙성 간경변증, 감염 유발성 간 섬유증, 선천성 간 섬유증 또는 자가면역 간염인 방법.
- 제4항에 있어서, 감염 유발성 간 섬유증이 박테리아 유발성 또는 바이러스 유발성인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 서열 1의 아미노산 379-430으로 이루어진 서열을 포함하지 않는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 서열 1의 위치 26-42 중 어느 위치에 상응하는 아미노산에서 시작하고, 서열 1의 위치 333-378 중 어느 위치에 상응하는 아미노산에서 종결되는 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가
a. 서열 1의 아미노산 26-346,
b. 서열 1의 아미노산 26-359, 및
c. 서열 1의 아미노산 26-378로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가
a. 서열 1의 아미노산 26-346,
b. 서열 1의 아미노산 26-359, 및
c. 서열 1의 아미노산 26-378로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 제1 부분, 및
서열 1과 이종성인 제2 부분으로 이루어진 것인 방법. - 제8항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드의 제2 부분이 IgG의 Fc 부분 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 이량체인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 동종이량체인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 서열 1의 아미노산 379-586으로 이루어진 서열로부터의 50개 초과의 연속 아미노산을 포함하지 않는 것인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 1 x 10-9 M 미만의 평형 해리 상수 (KD), 또는 1 x 10-3 s-1 미만의 해리 속도 상수 (kd)로 인간 BMP-9에 결합하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 1 x 10-9 M 미만의 평형 해리 상수 (KD), 또는 5 x 10-4 s-1 미만의 해리 속도 상수 (kd)로 인간 BMP-9에 결합하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 1 x 10-9 M 미만의 평형 해리 상수 (KD), 또는 5 x 10-3 s-1 미만의 해리 속도 상수 (kd)로 인간 BMP-10에 결합하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 1 x 10-9 M 미만의 평형 해리 상수 (KD), 또는 2.5 x 10-3 s-1 미만의 해리 속도 상수 (kd)로 인간 BMP-10에 결합하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 인간 TGF-β1, 인간 TGF-β3, 인간 VEGF, 또는 인간 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2)에 결합하지 않는 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 엔도글린 아미노산 서열을 포함하는 부분 이외에도, 생체내 안정성, 생체내 반감기, 흡수/투여, 조직 국재화 또는 분포, 단백질 복합체의 형성, 및/또는 정제 중 하나 이상의 것을 증진시키는 하나 이상의 폴리펩티드 부분을 포함하는 융합 단백질인 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 면역글로불린의 불변 도메인 및 혈청 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제20항에 있어서, 면역글로불린 Fc 도메인이 링커에 의해 ENG 폴리펩티드 부분에 연결되어 있는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 링커가 서열 31 (TGGG) 또는 GGG로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 것인 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 글리코실화된 아미노산, PEG화된 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 비오티닐화된 아미노산, 지질 모이어티에 접합된 아미노산, 및 유기 유도체화제에 접합된 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도글린 폴리펩티드가 정맥내로, 근육내로, 동맥내로, 피하로, 또는 경구적으로 투여되는 것인 방법.
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