JP6994481B2 - 線維性疾患を処置するためのエンドグリンポリペプチド - Google Patents
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Description
本出願は、35U.S.C.§119の下で、2013年10月25日に出願された米国仮出願第61/896,002号、名称「線維性疾患を処置するためのペプチド」の出願日の利益を主張し、この全内容は、本明細書に参照により組み込まれる。
線維症は、器官または組織における過剰な線維性結合組織の形成である。線維症は、修復または反応プロセスとして物理的または化学的な損傷に応じて生じることがあり、瘢痕とも称される。線維症はまた、外部損傷のない細胞または組織における病理学的な異常からも発生することがある。線維症は、外傷後の組織の恒常性および治癒を支援し得る結合組織の沈着をもたらす。しかしながら、過度の線維症は、下にある器官または組織のアーキテクチャ(architecture)を消し去り得、および、その機能を邪魔し得ることで、例えば肝線維症、肺線維症および嚢胞性線維症などの線維性障害につながる。線維化組織は典型的には、それぞれの器官に特化した機能を実行し得ず、修復され得ない。それ故に、線維性障害のための処置の選択肢は、臓器移植などの組織置換アプローチ、および緩和療法に限定される。
本開示のいくつかの側面は、エンドグリン(ENG)ポリペプチドおよび線維性障害を処置または予防するためのかかるエンドグリンポリペプチドの使用を提供する。本開示のいくつかの態様は、それを必要とする患者において線維性障害を処置または予防する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、本明細書中に提供されるエンドグリンペプチドの有効量を患者へ投与することを含む。いくつかの態様において、使用されるエンドグリンポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸42~333に少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、エンドグリンポリペプチドは、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下または経口的に投与される。
ある側面において、本開示は、本明細書に一般的にまたは具体的に記載されたエンドグリンポリペプチドのいずれかを投与することにより、哺乳動物における血管新生を阻害する方法を提供する。エンドグリンポリペプチドは、局所的に(例えば眼に)または全身的に(例えば静脈内、筋肉内、動脈内または皮下)送達することができる。ある態様において、本開示は、エンドグリンポリペプチドを、哺乳動物に対して眼についての遠位的な位置に、例えば全身投与により投与することにより、哺乳動物の眼における血管新生を阻害する方法を提供する。
ある側面において、本開示は、BMP9またはBMP10に関連する障害を有する患者を処置するための方法を提供する。かかる障害の例は本明細書に提供されており、これには一般に、血管系の障害、高血圧および線維性障害を含むことができる。
ある側面において、本開示は、眼科用製剤を提供する。かかる製剤は、本明細書に開示されたエンドグリンポリペプチドを含んでよい。ある側面において、本開示は、眼の線維性疾患または血管新生関連疾患を処置するための方法を提供する。かかる方法は、全身的にまたはこの眼に対して、本明細書に開示されたエンドグリンポリペプチドの有効量を含む医薬製剤を投与することを含んでよい。
1.概略
ある側面において、本発明は、ENG(CD105としても知られている)ペプチドに関する。ENGは、リガンドのトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)スーパーファミリーに対するコレセプターと称され、正常および病的な線維症ならびに血管新生に関与している。ENGの発現は静止血管内皮では低いが、治癒傷、発生中の胚、炎症組織および固形腫瘍の内皮細胞においては上方制御される(Dallas et al, 2008, Clin Cancer Res 14:1931-1937)。ヌルENG対立遺伝子のホモ接合体マウスは、血管の発達の欠陥のために妊娠の早い段階で死ぬが(Li et al, 1999, Science 284:1534-1537)、一方ヘテロ接合ヌルENGマウスは、成体で血管新生の異常を示す(Jerkic et al, 2006, Cardiovasc Res 69:845-854)。
本明細書で使用される用語は、一般に、本開示の文脈内および各用語が使用される具体的な文脈において、当該技術分野における通常の意味を有する。一定の用語が本明細書で議論され、本明細書に開示された組成物および方法、およびいかにしてこれらを作製および使用するかについての説明において、実行者に対してさらなる指針を提供する。用語の任意の使用の範囲または意味は、その用語が使用される具体的な文脈から明らかになるであろう。
線維症および線維性障害
本開示のいくつかの側面は、ENGポリペプチドが、線維性障害を抑制および/または処置するために使用することができるという驚くべき認識に基づいている。本開示は、ENGポリペプチドの有効量を投与するすることにより哺乳動物における線維性障害を抑制する方法を提供する。例えば、前記ENGポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸42~333に少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含むENGポリペプチドであり、ENG-Fc融合タンパク質または上記の核酸アンタゴニスト(例えばアンチセンスまたはsiRNA)を含む。これらのENGポリペプチド、ENG-Fc融合タンパク質および核酸アンタゴニストを以後まとめて「治療剤」とも称する。
新しい血管を形成するプロセスである血管新生は、正常および異常な多くの生理学的状態において重要である。正常な生理学的条件下では、ヒトおよび動物には特定の限定された状況において血管新生が生じる。例えば血管新生は通常、創傷治癒、胎児発達および胚発生ならびに黄体、子宮内膜および胎盤の形成において観察される。
望ましくない、または不適切に制御された血管新生は、異常な内皮増殖が病理学的プロセスを引き起こすかまたはこれに関与し得る、多くの障害において発生する。例えば血管新生は、多くの腫瘍の増殖に関与している。無秩序な血管新生は、例えば関節リウマチ、網膜症、血管腫および乾癬などの病理学的プロセスに関係する。無秩序な血管新生が存在する多様な病理学的疾患状態は、血管新生関連疾患として分類されている。
本開示によれば、本明細書中に記載の抗血管新生剤は、疾患の処置のための他の組成物および手順と組み合わせて使用することができる。例えば腫瘍は、従来の外科手術、放射線療法または化学療法にENGポリペプチドを組み合わせて処置することができ、次いでENGポリペプチドを患者に投与して、微小転移の休眠を延長し、任意の残存原発腫瘍を安定化することができる。
いくつかの態様において、ENGポリペプチドは、心血管障害またはBMP-9またはBMP-10に関連する状態を患っているが、必ずしも血管新生を伴わない患者を処置するために用いることができる。この種の例示の障害としては、限定はされないが以下を含む:心臓疾患(心筋疾患、心筋梗塞、狭心症および心臓弁膜症を含む);腎疾患(慢性糸球体炎症、糖尿病性腎不全および狼瘡に関連する腎炎症を含む);血圧の疾患(全身および肺のタイプを含む);アテローム性動脈硬化症または他の種類の動脈硬化症に関連する疾患(脳卒中、脳出血、くも膜下出血、狭心症および腎動脈硬化を含む);血栓性疾患(脳血栓、肺血栓症、血栓性腸管壊死を含む);糖尿病の合併症(糖尿病関連網膜疾患、白内障、糖尿病関連腎疾患、糖尿病関連の神経病理学、糖尿病関連の壊疽および糖尿病関連の慢性感染症を含む);血管の炎症性疾患(全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、関節の動脈の炎症、大細胞性動脈炎症(large-cell arterial inflammation)、川崎病、高安動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群およびヘノッホ・シェンライン紫班);および心疾患、例えば先天性心疾患、心筋症(例えば拡張、肥大、拘束性などの心筋症)およびうっ血性心不全。ENGポリペプチドは、対象に対して、単独で、または1以上の、BMP-9/10に関連する心血管障害および/または状態を処置するのに有用な薬剤もしくは治療様式、例えば治療剤と組み合わせて、投与することができる。一態様において、第2の薬剤または治療様式は、以下の1以上から選択される:血管形成術、ベータ遮断薬、抗高血圧薬、強心剤、抗血栓剤、血管拡張剤、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アンジオテンシン2型アンタゴニストおよび/またはサイトカイン遮断薬/阻害剤。
本明細書に記載の治療剤は、医薬組成物中に製剤化することができる。本開示に従って使用するための医薬組成物は、従来の方法で、1以上の生理学的に許容し得る担体または賦形剤を使用して製剤化することができる。かかる製剤は一般的に、ほとんどの規制要件に従って実質的にパイロジェンフリーである。
ある態様において、本開示の治療方法は、組成物を全身的に、または移植片もしくはデバイスとして局部的に投与することを含む。投与される場合、本開示において使用する治療用組成物は、パイロジェンフリーな生理学的に許容し得る形態である。また、任意に上述のように組成物中に含めることができる、ENGシグナル伝達アンタゴニスト以外の治療的に有用な薬剤は、本明細書に開示された方法において、対象化合物(例えばENGポリペプチド)と同時にまたは順番に投与してもよい。
組成物および製剤は、必要に応じて、活性成分を含む1以上の単位剤形を含むことができるパックまたはディスペンサーデバイスで提供することができる。パックは、例えばブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書を添付してもよい。
一定の条件下の場合を除き、天然に存在するENGタンパク質は膜貫通タンパク質であり、タンパク質の一部は細胞の外側(細胞外部分)に、およびタンパク質の一部は細胞の内側(細胞内部分)に配置されている。本開示の側面は、ENGの細胞外ドメイン(ECD)の一部を含むポリペプチドを包含する。
2つのアミノ酸配列間の最良の全体的アライメントを決定するための別の態様は、Brutlag et al(Comp. App. Biosci., 6:237-245 (1990))のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータプログラムを用いて決定することができる。配列アラインメントにおいて、クエリ(質問)と対象の配列は、共にアミノ酸配列である。前記グローバル配列アラインメントの結果は、同一性パーセントで表示される。一態様において、アミノ酸配列同一性は、Brutlag et al.(Comp. App. Biosci., 6:237-245 (1990))のアルゴリズムに基づきFASTDBコンピュータプログラムを用いて行われる。特定の態様において、アミノ酸アラインメントの同一性および類似性パーセントを算出するのに用いるパラメータは、以下を含む:マトリックス=PAM 150、k-タプル(touple)=2、ミスマッチペナルティ=1、連結ペナルティ(joining penalty)=20、ランダム化グループ長さ=0、カットオフスコア=1、ギャップペナルティ=5、および、ギャップサイズペナルティ=0.05。
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ETVHCD LQPVGPERDE VTYTTSQVSK GCVAQAPNAI LEVHVLFLEF PTGPSQLELT LQASKQNGTW PREVLLVLSV NSSVFLHLQA LGIPLHLAYN SSLVTFQEPP GVNTTELPSF PKTQILEWAA ERGPITSAAE LNDPQSILLR LGQAQGSLSF CMLEASQDMG RTLEWRPRTP ALVRGCHLEG VAGHKEAHIL RVLPGHSAGP RTVTVKVELS CAPGDLDAVL ILQGPPYVSW LIDANHNMQI WTTGEYSFKI FPEKNIRGFK LPDTPQGLLG EARMLNASIV ASFVELPLAS IVSLHASSCG GRLQTSPAPI QTTPPTGGGT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK (配列番号36)
ある態様において、本開示は、ENGポリペプチドの単離および/または精製形態であって、他のタンパク質および/または他のENGポリペプチド種から単離されたか、またはそれらを実質的に含まない(例えば、少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%含まない)ものを利用可能とする。ENGポリペプチドは、一般的に、組換え核酸からの発現によって産生される。
ある側面において、本開示は、本明細書に開示された、断片、機能性変異体および融合タンパク質を含むENGポリペプチドのいずれかをコードする、単離および/または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号2および4は、天然のヒトENG前駆体ポリペプチドのそれぞれ長いおよび短いアイソフォームをコードし、一方配列番号30は、IgG1 Fcドメインに融合したENG細胞外ドメインの1つの変異体をコードする。対象の核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよい。かかる核酸はDNAまたはRNA分子であってもよい。これらの核酸は、例えば、ENGポリペプチドを作製するための方法において、または直接治療剤として(例えばアンチセンス、RNAiまたは遺伝子治療アプローチで)、用いることができる。
ある態様において、本開示は、配列番号24、26、28または30に少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一な、単離されたまたは組み換え核酸配列を提供する。当業者は、配列番号24、26、28または30に相補的な核酸配列、および、配列番号24、26、28または30の変異体は、本開示の範囲内であることを認識する。さらなる態様において、本開示の核酸配列は、単離し、組み換え、および/または、異種ヌクレオチド配列またはDNAライブラリーに融合することができる。
本開示はまた、1以上の対象ENGポリペプチドのために、コード配列(例えば配列番号24、26、28または30)を含む組み換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞にも関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、本明細書に開示されるENGポリペプチドは、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞(例えばバキュロウイルス発現系を用いて)、酵母または哺乳動物細胞中で発現させることができる。他の適切な宿主細胞は、当業者によく知られている。
本出願はさらに、改変されたかまたは変異体Fc領域を有するENG-Fc融合タンパク質を提供する。かかる抗体およびFc融合タンパク質は、例えば抗原依存性細胞傷害(ADCC)および補体依存性細胞障害(CDC)などのエフェクター機能の調節において有用であり得る。さらに、修飾は、抗体およびFc融合タンパク質の安定性を向上することができる。抗体およびFc融合タンパク質のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化をDNAに導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。かかる変異体としては、例えば、本明細書に開示された抗体およびFc融合タンパク質のアミノ酸配列内の残基の欠失および/または挿入および/または置換を含む。欠失、挿入および置換の任意の組み合わせは、最終的なコンストラクトが所望の特性を有することを条件として、最終的なコンストラクトに到達するために行われる。アミノ酸変化はまた、抗体およびFc融合タンパク質の翻訳後プロセスを変化させてよく、例えばグリコシル化部位の数や位置を変更させてよい。
本発明はここに一般的に記述されており、以下の例を参照することによってさらに容易に理解されるであろう;これらの例は、ある態様および本発明の態様の説明のみを目的としており、本発明を限定するものではない。
出願人らは、ヒトENGの完全長細胞外ドメイン(ECD)(図9、配列番号9)が、ヒトIgG1 Fcドメイン(図11、配列番号11)にこれらのドメイン間に最小リンカーを有して付着している、可溶性エンドグリン(ENG)融合タンパク質(hENG(26~586)-hFc)を構築した。hENG(26~586)-hFcは、HEK293細胞における一過性トランスフェクションによって発現させた。概要を述べると、HEK293細胞を、500mlのスピナー内に、250mlの用量のFreestyle培地(Invitrogen)中6×105細胞/mlにてセットし、一晩培養した。翌日これらの細胞を、DNA:PEI(1:1)複合体で0.5ug/mlの最終DNA濃度にて処理した。4時間後、250mlの培地を添加し、細胞を7日間増殖させた。馴化培地は、細胞をスピンダウンして濃縮することにより回収した。CHO細胞での発現のために、ENGポリペプチドコンストラクトをCHO DUKX B11細胞株にトランスフェクトした。クローンは、典型的には5nMまたは10nMの初期濃度のメトトレキサート(MTX)で選択し、ついで任意に、50nMのMTX中の増幅により発現を増加させた。高発現クローンを希釈クローニングによって同定し、無血清懸濁増殖に適合させて、精製のための馴化培地を生成することができる。任意に、遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE)をベクターに含めて、発現を促進することができる。例えばCytotechnology. 2002 Jan; 38 (1-3):43 -6を参照のこと。
(i)ミツバチメリチン(HBML):MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(配列番号13)
(ii)組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA):MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(配列番号14)
(iii)天然のヒトENG:MDRGTLPLAVALLLASCSLSPTSLA(配列番号15)
出願人らは、マウスENGの完全長細胞外ドメイン(図10、配列番号10)が、マウスIgG2a Fcドメインにこれらのドメイン間に最小リンカーを有して融合されている、可溶性マウスENG融合タンパク質(mENG(27~581)-mFc)を構築した。mENG(27~581)-mFcは、HEK293細胞における一過性トランスフェクションによって発現させた。
mENG(27~581)-mFcの選択形態は、TPAリーダーを使用し、図16(配列番号19)に示す未処理のアミノ酸配列を有し、図17(配列番号20)に示すヌクレオチド配列によりコードされる。精製は、トランスフェクトされたHEK293細胞からの馴化培地のろ過と、続くプロテインAクロマトグラフィーにより行った。試料の純度は、分析用サイズ排除クロマトグラフィー、SDS-PAGE、銀染色およびウェスタンブロット分析により評価した。
コレセプターを考えると、ENGは、TGF-β1および-3のIおよびII型受容体の多タンパク質複合体への結合を促進することにより機能すると、広く考えられている。単離されたENGによる直接のリガンド結合の可能性を調べるために、出願人らは、表面プラズモン共鳴(SPR)方法論(Biocore(商標)器具)を用いて、ENGの完全長細胞外ドメインを含む捕捉されたタンパク質の、種々の可溶性ヒトTGF-βファミリーリガンドへの結合について、スクリーニングした。
BMP-9およびBMP-10は、I型受容体ALK1(アクチビン受容体様キナーゼ1)における高親和性リガンドである。SPRベースのアッセイを用いて、可溶性hENG(26~586)(R&D Systems, catalog #1097-EN)の、BMP-9およびBMP-10のALK1への結合に対する効果を決定した。ALK1-hFcを捕捉し、次いで、種々の比率でBMP-9と予備混合された可溶性hENG(26~586)を含有する溶液に曝した。図20に示すように、可溶性hENG(26~586)は、BMP-9のALK1-Fcへの結合を、10nM未満のIC50で濃度依存的に阻害した。同様の結果はBMP-10についても得られた(図21)。別の実験により、可溶性hENG(26~586)がALK1に結合せず、したがってこのメカニズムによってリガンドのALK1への結合を阻害しないことが実証された。確かに、SPRに基づく追加実験は、可溶性hENG(26~586)がI型受容体ALK2~ALK7にも、アクチビン受容体IIA、アクチビン受容体IIB、骨形成タンパク質受容体II、およびTGF-β受容体IIなどのII型受容体にも結合しないことを示す。これらの結果は、ENGがBMP-9およびBMP-10のALK1への結合を、主にこれらのリガンドとの直接相互作用を介して阻害するというさらなる証拠を提供する。
まとめると、これらのデータは、可溶性ENG-Fcキメラタンパク質ならびに非キメラ水溶性ENGが、ALK1を含む複数のシグナル伝達経路を介して、BMP-9およびBMP-10シグナル伝達のアンタゴニストとして用いることができることを示す。
出願人らは、HUVECベースの培養系における、mENG(27~581)-hFcの血管新生作用を検討した。HUVECを重合マトリゲル基質上で培養し、試験物質の、内皮細胞の管(臍帯(cord))形成に対する効果を、12時間暴露した後の位相差顕微鏡により評価した。単一の細胞の幅と少なくとも3つの枝を有する臍帯が視覚的に同定され、コンピュータ支援画像分析を用いてかかる臍帯の全長を決定した。平均値は、実験条件ごとにデュプリケートの培養ウェルに基づき、各ウェルは3つの観察視野の平均を取った。基底条件(無処理)と比較して、強力な誘導剤である内皮細胞増殖物質(ECGS、0.2μg/ml)は、平均の臍帯の長さを倍増させた(図22)。mENG(27~581)-hFc(R&D Systems, catalog #1320-EN、10μg/ml)は、この増加を60%近く低減し、これは刺激された条件に特異的な効果であり、なぜならば、同様の濃度のmENG(27~581)-hFcは、ECGSの不在においてはほとんど効果を示さなかったからである(図22)。これらの結果は、ENG-Fc融合タンパク質が、血管新生の細胞培養モデルにおいてそれ以外は刺激された条件下で、内皮細胞の凝集を抑制可能であることを実証する。
ニワトリ漿尿膜(CAM)アッセイ系を用いて、ENG-Fc融合タンパク質の血管新生に対する効果を調べた。簡単に述べると、9日齢の受精ニワトリ胚を、制御された温度(37℃)および湿度(60%)で卵のインキュベーターに維持した。卵殻をアルコールで軟化し、卵殻膜とCAMとの間に「ブリスター」を作るための小さな穴を穿刺して卵殻を取り除き、顕著な血管を覆うウィンドウを作成した。小さなフィルターディスクを、0.01MのHEPES、0.5MのNaCl、3mMのEDETA、0.005%v/vの界面活性剤P20、および0.5mg/mlのウシ血清アルブミンを含むバッファー(pH7.4)に溶解したmENG(27~581)-hFcタンパク質(R&D Systems, catalog #1320-EN;毎日14μg)の存在または不在において、VEGF(毎日50ng)で処理した。試験物質を含んだフィルターディスクを次に開口部を通して挿入し、CAMに並置した。卵(群あたりn=8)を新鮮な試験物質で3日間毎日処理し、4日目にフィルターディスクに関連付けられた血管の数を、卵ランプの支援により目視検査によって決定した。
ENG-Fc融合タンパク質の血管新生に対する効果を、指向性in vivo血管新生アッセイ(DIVAA(商標); Guedez et al., 2003, Am J Pathol 162:1431-1439)としても知られているマウスアンジオリアクターアッセイにおいてさらに検討した;これは、製造業者(Trevigen(登録商標))の指示に従って実施した。簡単に述べると、移植グレードのシリコンで作られ一端を閉じた中空円筒内に、塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF-2、1.8g)とVEGF(600ng)の組み合わせ有りまたは無しと予め混合した基底膜抽出物(BME)を充填した。BMEがゲル化した後、アンジオリアクターを無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した(マウスあたり4つ)。マウスは、mENG(27~581)-mFc(10mg/kg,s.c.)またはビヒクル(Tris緩衝生理食塩水)で11日間毎日処理し、その後マウスに、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)標識デキストラン(20mg/kg,i.v.)を注射し、20分後に安楽死させた。アンジオリアクターを取り出し、それぞれに含まれるFITC-デキストランの量を、血管形成の指標として、485nm励起/520nm発光の蛍光プレートリーダー(Infinite(登録商標)M200, Tecan)を用いて定量した。図24に示すように、FGF-2およびVEGFのBMEへの添加は、試験完了時においてアンジオリアクター内の血管新生の大幅な増加をもたらしたが、一方mENG(27~581)-mFcの同時投与は、この増加を完全に阻止した。哺乳動物系で得られたこれらの結果は、上述したCAMアッセイで得られたものを補完し、完全長ENG細胞外ドメインを組み込んだENG-Fc融合タンパク質の、in vivo抗血管新生活性を実証する。
出願人らは、ヒトENG ECDの切断変異体が最小限のリンカーでヒトIgG1のFcドメインに融合されている、可溶性ENG融合タンパク質を生成した。これらの変異体を以下に記載し、選択された変異体の構造は図25に概略的に示す。
hENG(26~437)-hFcの選択された形態はTPAリーダーを使用し、図26(配列番号21)に示す未処理のアミノ酸配列を有し、図27(配列番号22)に示すヌクレオチド配列でコードされる。hENG(26~378)-hFcの選択された形態もTPAリーダーを使用し、図28(配列番号23)に示す未処理のアミノ酸配列を有し、図29(配列番号24)に示すヌクレオチド配列でコードされる。hENG(26~359)-hFcの選択された形態もTPAリーダーを使用し、図30(配列番号25)に示す未処理のアミノ酸配列を有し、図31(配列番号26)に示すヌクレオチド配列でコードされる。出願人らはまた、hENG(26~359)にTGGGリンカーにより付着したN末端切断hFcドメイン(図12、配列番号12)を含む、TPAリーダー(図32、配列番号27)を有する代替的なhENG(26~359)-hFc配列も想定する。この代替的なhENG(26~359)-hFcタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、図33(配列番号28)に示す。hENG(26~346)-hFcの選択された形態はTPAリーダーを使用し、N末端切断hFcドメインを含む図34(配列番号29)に示す未処理のアミノ酸配列を有し、図35(配列番号30)に示すヌクレオチド配列によりコードされる。
出願人らはSPR法を用いて、以下のhENG-hFcタンパク質変異体を、ヒトBMP-9およびBMP-10への高親和性結合についてスクリーニングした。これらの実験において、捕捉されたhENG-hFcタンパク質は、100nMの可溶性ヒトBMP-9またはBMP-10にそれぞれ暴露した。
上で開示されたように、36アミノ酸という短いN末端切断型(hENG(61~346)-hFc)は、ENGポリペプチドへのリガンド結合を消失させることが見出された。さらに短いN末端切断型のリガンド結合に対する効果を予測するために、ヒトエンドグリンの孤児ドメインの二次構造を、修正版Psipred version 3(Jones, 1999, J Mol Biol 292:195-202)を用いてコンピュータにより予測した。分析は、配列番号1のアミノ酸26~60によって規定されるENGポリペプチド領域内の規則二次構造(ordered secondary structure)が、配列番号1の42~45位に高い信頼性で予想される4残基のβ鎖および配列番号1の28~29位に非常に低い信頼性で予想される2残基のβ鎖に限定されることを示す。したがって、アミノ酸27または28で開始するENGポリペプチド変異体、および任意に、配列番号1のアミノ酸29~42で開始するものは、重要な構造要素およびリガンド結合を保持する可能性がある。
A204細胞におけるレポーター遺伝子アッセイを用いて、hENG-hFc融合タンパク質が、BMP-9およびBMP-10によるシグナル伝達を阻害する効力を決定した。このアッセイは、pGL3 BREルシフェラーゼレポータープラスミド(Korchynskyi et al, 2002, J Biol Chem 277: 4883-4891)ならびにトランスフェクション効率を制御するためのRenillaレポータープラスミド(pRLCMV-BREルシフェラーゼ)によってトランスフェクトされた、ヒト横紋筋肉腫細胞株に基づく。BREモチーフはBMP応答性遺伝子(Id1プロモーターを含む)に存在するため、このベクターは、Smad1および/またはSmad5を介してシグナル伝達する因子に対して一般的に用いられる。ENG-Fc融合タンパク質の不在のもとで、BMP-9およびBMP-10は用量依存的にA204細胞におけるシグナル伝達を刺激する。
出願人らは、切断変異体hENG(26~359)-hFcの血管新生への効果を、VEGFを用いて血管新生を誘導する例6に記載されたものと同じCAMアッセイ系で検討した。VEGF処理(毎日50ng)によって誘発される追加の血管数は、hENG(26~359)-hFc処理(配列番号25;毎日20μg)の併用によって75%減少した(図38)。SPRに基づく試験により、VEGFがhENG(26~359)-hFcに結合しないことが示されており、したがって本CAM実験におけるこの変異体の血管新生に対する効果は、融合タンパク質とVEGFの直接の相互作用によるものではない。hENG(26~359)-hFcについて、10μgの用量は、各コンストラクトの理論分子量に基づくと、例6で試験したより長いENG-Fcコンストラクトについて用いた14μgに対応することに注意すべきである。したがって、切断変異体hENG(26~359)-hFcは、VEGF誘導性の血管新生を阻害することについて、同じアッセイ系において完全長ECDを有するENGコンストラクト(図23)と比較して、これより高くはないとしても、同等の有効性を示した。
切断変異体hENG(26~346)-hFcを、例7に記載したものと同じマウスアンジオリアクターアッセイで試験した。アンジオリアクターを無胸腺ヌードマウスの皮下に移植し(マウスあたり4つ)、マウスを、hENG(26~346)-hFc(10mg/kg,s.c.)またはビヒクル(Trisバッファー生理食塩水)で11日間毎日処理し、その後マウスに、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)標識デキストラン(20mg/kg,i.v.)を注射し、20分後に安楽死させた。各アンジオリアクターに含まれるFITC-デキストランの量を、次に血管形成の指標として測定した。図39に示すように、増殖因子(GF)FGF-2およびVEGFのアンジオリアクターへの添加は、血管新生の大幅な増加をもたらしたが、一方hENG(26~346)-hFcの同時投与は、この増加を完全に阻止した。SPRに基づく試験により、hENG(26~346)-hFcは、FGF-2にもVEGFにも結合しないことが確認され、これにより、本実験におけるhENG(26~346)-hFcの誘導性血管新生への効果が、融合タンパク質とFGF-2またはVEGFどちらかへの直接的相互作用によるという可能性が除外された。この哺乳動物のアッセイ系での本結果は、CAMアッセイでの切断変異体hENG(26~359)-hFcについて得られた結果を補完する(図12)。これらを一緒にすると、ENG細胞外ドメインの好ましい切断を組み込んだENG-Fc融合タンパク質の、in vivo抗血管新生活性を実証する。
出願人らは、修正薬物動態試験を実施して、hENG(26~346)-hFcの全身消失半減期を決定し、これを完全長タンパク質mENG(27~581)-mFcのそれと比較した。hENG(26~346)-hFcタンパク質は、SAIVI(商標)(小動物のin vivo画像化) Rapid Antibody Labeling kitを製造業者(Invitrogen(商標))の指示書に従って用いて、Alexa Fluor(登録商標)750染料で標識した。標識されたタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーにより遊離標識から分離した。無胸腺ヌードマウス(n=3、17~20g)に、標識したhENG(26~346)-hFc(2mg/kg、s.c.)を注射し、全身撮像をIVIS画像化システム(Xenogen(登録商標)/Caliper Life Sciences)を用いて実施し、注射後2、4、6、8、24、32、48および72時間における融合タンパク質レベルを決定した。hENG(26~346)-hFcの平均消失半減期は26.5時間であり、これは同様の試験で決定したmENG(27~581)-mFcの半減期の22時間よりも長かった。
ENG-Fcタンパク質を2つの異なるマウス異種移植モデルにおいて試験して、これらのタンパク質が腫瘍増殖を阻害できるかどうかを決定した。最初の実験では、無胸腺ヌードマウスに、106個の4T1乳癌細胞(ATCC(登録商標)番号:CRL-2539(商標);寄託者:BA Pulaski)を6週齢で皮下注射した。マウス(群あたりn=10)には、mENG(27~581)-mFc(10mg/kg)またはビヒクル(Trisバッファー生理食塩水)を毎日皮下投与した。腫瘍を、デジタルキャリパーを使用して手動で測定し、腫瘍体積は、式:容積=0.5(長さ)(幅2)に従って計算した。図40に示すように、mENG(27~581)-mFcの処理は、ビヒクルに比べ、移植後24日までに腫瘍体積を45%減少させた。
線維症の処置におけるENG-Fcタンパク質の有効性は、肝線維症のマウスCCL4(四塩化炭素)モデルで評価した。本研究において50匹のマウスを使用した。実験の開始(0日)に約14週齢の雄および雌のA/Jマウスを、少なくとも48時間実験室で馴化させた。動物を、実験の過程の間中、毎日モニターして、病的状態、死亡およびテスト品目の毒性の兆候が観察された場合、殺処分した。
動物に、肝線維症を誘導するため、週2回、経口胃管栄養法を介してオリーブオイル中50%CCL4を1ml/kgの用量で与えた。下記の表に記載のとおり、動物に13週間mENG(27~581)-mFcを投与した。
ENG-Fcタンパク質の有効性をまた、メチオニンおよびコリンの食餌性欠乏(MCDD)によって引き起こされる非アルコール性脂肪肝炎(NASH)のマウスモデルでも評価した。野生型C57BL/6マウスに、標準的な固形飼料、または、高スクロース(40%)および脂肪(10%)を含有するが、肝臓のβ酸化および超低密度リポタンパク質の合成に不可欠である(Takahashi et al., 2012, World J Gastroenterol 18:2300-2308)メチオニンおよびコリンを欠く食餌のいずれかを与えた。その結果、MCDDマウスは、肝臓損傷および線維沈着の前兆と考えられる脂質沈着を呈した(Corbin et al., 2012, Curr Opin Gastroenterol 28:159-165)。12週齢でマウスを、それらそれぞれの食餌のもとに飼育し、3週間週2回のmENG(27~581)-mFc(10mg/kg)またはビヒクル(n=10/グループ)のいずれかによる腹腔内処置を開始した。投薬の終わりにマウスを死なせ、肝臓切片を、脂質沈着の程度を査定するために脂溶性ジアゾ染料オイルOレッドにより染色した。
本明細書で言及された全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が具体的かつ個別に参照によって組み込まれるかのようにして、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書の任意の定義を含む本出願が優先される。
本発明の特定の態様が本明細書に明示的に開示されているが、上記明細書は例示であって限定するものではない。当業者には本発明の多くの変形が、本明細書および以下の特許請求の範囲の検討により明らかになるであろう。本発明の完全な範囲は、特許請求の範囲およびその均等物の全範囲および明細書とかかる変形を参照することにより、決定されるべきである。
Claims (22)
- それを必要とする対象における非アルコール性脂肪肝炎(NASH)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、または細菌性もしくはウイルス性肝線維症を処置または予防する、医薬組成物であって、配列番号1のアミノ酸26~346に少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含むエンドグリンポリペプチドの有効量を含み、ここで該エンドグリンポリペプチドはヒトBMP-9および/またはヒトBMP-10に結合する、前記医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸379~430からなる配列を含まない、請求項1に記載の医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドが、配列番号1の26~346に少なくとも95%同一なアミノ酸配列からなる第1部分、および配列番号1に非相同な第2部分を含む、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 第2部分が、in vivo安定性、in vivo半減期、取込み/投与、組織の局在化または分散、タンパク質複合体の形成および/または精製の1以上を強化するポリペプチドを含む、請求項3に記載の医薬組成物。
- 第2部分が、イムノグロブリンの定常領域および血清アルブミンからなる群から選択される、請求項3または4に記載の医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドが、イムノグロブリンFcドメインを含む、請求項3~5のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドの第2部分が、IgGのFc部分を含む、請求項6に記載の医薬組成物。
- イムノグロブリンFcドメインが、ENGポリペプチド部分に、リンカーによって連結されている、請求項6または7に記載の医薬組成物。
- リンカーが、配列番号31(TGGG)またはGGGからなるアミノ酸配列からなる、請求項8に記載の医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドが、配列番号36のアミノ酸配列を含む、請求項7~9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドが、配列番号29のアミノ酸配列を含む、請求項7~9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドが、ダイマーである、請求項1~11のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドが、ホモダイマーである、請求項1~12のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸379~586からなる配列からの連続した50を超えるアミノ酸を含まない、請求項1~13のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドが、ヒトBMP-9に、1×10-9M未満の平衡解離定数(KD)または1×10-3s-1未満の解離速度定数(kd)で結合する、請求項1~14のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドが、ヒトBMP-9に、1×10-9M未満の平衡解離定数(KD)または5×10-4s-1未満の解離速度定数(kd)で結合する、請求項1~15のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドが、ヒトBMP-10に、1×10-9M未満の平衡解離定数(KD)または5×10-3s-1未満の解離速度定数(kd)で結合する、請求項1~16のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドが、ヒトBMP-10に、1×10-9M未満の平衡解離定数(KD)または2.5×10-3s-1未満の解離速度定数(kd)で結合する、請求項1~17のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- エンドグリンポリペプチドが、ヒトTGF-β1にも、ヒトTGF-β3にも、ヒトVEGFにも、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF-2)にも結合しない、請求項1~18のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- エンドグリンペプチドが、以下:糖化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ファネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸、および、有機誘導体化剤に結合したアミノ酸、から選択される1個以上の改変アミノ酸残基を含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- エンドグリンペプチドが、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下または経口的に投与される、請求項1~20のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 配列番号36のアミノ酸配列を含む、エンドグリン融合タンパク質の有効量を含む、それを必要とする対象における非アルコール性脂肪肝炎(NASH)または非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、または細菌性もしくはウイルス性肝線維症を処置または予防する、医薬組成物。
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