ES2575695T3 - Antagonistas de BMP-ALK3 y sus usos para estimular el crecimiento óseo - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que es al menos 95% pura con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

Description

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los ratones con operación simulada. En comparación con los controles OVX, mALK3 (24-152)-mFc aumentó el volumen del hueso significativamente a los 28 y 56 días de tratamiento.
La Figura 23 muestra el efecto del tratamiento con mALK3 (24-152)-mFc del espesor del hueso cortical en un modelo de ratón OVX de osteopenia. Las mediciones de hueso cortical fueron hechas por micro-CT. Los datos son medias (n = 7-8 por grupo) y las barras de error representan + 2 SEM. *, P <0,05 vs. OVX + vehículo. En comparación con los controles OVX, mALK3 (24-152)-mFc aumentó el espesor cortical significativamente a los 56 días de tratamiento.
La Figura 24 muestra el efecto del tratamiento con mALK3 (24-152)-mFc en la circunferencia endoósea en un modelo de ratón OVX de osteopenia. Las mediciones de la diáfisis tibial fueron hechas por micro-CT. Los datos son medias (n = 7-8 por grupo), y las barras de error representan + 2 SEM. *, P <0,05 vs. OVX + vehículo. En comparación con los controles OVX, el mALK3 (24-152)-niFc redujo la circunferencia endoósea significativamente a los 56 días de tratamiento, proporcionando así una evidencia adicional del crecimiento del hueso cortical.
La Figura 25 muestra el efecto del tratamiento con mALK3 (24-152)-mFc en todo el cuerpo de la densidad mineral ósea en un modelo de ratón OVX de osteopenia como se determina por DEXA. Los datos son medias (n = 7-8 por grupo) + SEM. *, P <0,05 vs. OVX + vehículo. En comparación con los controles OVX, mALK3 (24-152)-mFc aumentó en todo el cuerpo la densidad ósea de forma significativa a los 14, 28, 42 y 56 días de tratamiento.
La Figura 26 muestra el efecto del tratamiento con mALK3 (24-152)-mFc sobre la densidad mineral ósea vertebral en un modelo de ratón OVX de osteopenia. El análisis de la columna lumbar (vértebras L1-L6) se llevó a cabo mediante DEXA. Los datos son medias (n = 7-8 por grupo) + SEM. *, P <0,05 vs. OVX + vehículo. En comparación con los controles OVX, mALK3 (24-152)-mFc aumentó significativamente la densidad ósea vertebral a los 14, 28, 42, y 56 días de tratamiento.
La Figura 27 muestra el efecto del tratamiento con mALK3-mFc sobre la densidad mineral ósea de fémur-tibia en un modelo de ratón OVX de osteopenia como se determina por DEXA. El análisis de toda la tibia proximal y del fémur se llevó a cabo por DEXA. Los datos son medias (n = 7-8 por grupo) + SEM. *, P <0,05 vs. OVX + vehículo. En comparación con los controles OVX, mALK3 (24-152)-mFc aumentó la densidad ósea femorotibial significativamente a los 28, 42, y 56 días de tratamiento.
La Figura 28 muestra el efecto de mALK3 (24-152)-mFc durante 56 días en la microarquitectura ósea vertebral en un modelo de ratón OVX de osteopenia. Se generaron imágenes tridimensionales representativas del hueso trabecular en la vértebra lumbar (L5) ex vivo mediante micro-CT. Barra de escala = 300 micras.
La Figura 29 muestra el efecto de mALK3 (24-152)-mFc en el volumen de hueso en ratones hembra como se evaluó en el fémur distal por histomorfometría. Los datos son medias + SEM; n = 6 por grupo por punto de tiempo. **, P <0,01 frente al vehículo en los puntos de tiempo correspondientes. En comparación con el vehículo, mALK3 (24152)-mFc aumentó significativamente el volumen de hueso en todos los puntos de tiempo.
La Figura 30 muestra el efecto de mALK3 (24-152)-mFc en la tasa de formación de hueso en ratones hembra como se evaluó en el fémur distal por histomorfometría. Los datos son medias + SEM; n = 6 por grupo por punto de tiempo. ***, P <0,001 frente a vehículo en el punto de tiempo correspondiente. En comparación con el vehículo, mALK3 (24-152)-mFc aumentó la tasa de formación de hueso significativamente a los 28 días de tratamiento, proporcionando así la evidencia de la formación ósea anabólica.
La Figura 31 muestra el efecto de mALK3 (24-152)-mFc en la superficie de mineralización ósea en ratones hembra como se evaluó en el fémur distal por histomorfometría. Los datos son medias + SEM; n = 6 por grupo por punto de tiempo. **, P <0,01; *, P <0,05 frente a vehículo en los puntos de tiempo correspondientes. En comparación con el vehículo, mALK3 (24-152)-mFc aumentó la superficie de mineralización significativamente a los 14 y 28 días de tratamiento, lo que proporciona evidencia adicional de la formación ósea anabólica.
La Figura 32 muestra el efecto de mALK3 (24-152)-mFc en la superficie de los osteoclastos en ratones hembra como se evaluó en el fémur distal por histomorfometría. Los datos son medias + SEM; n = 6 por grupo por punto de tiempo. **, P <0,01 frente al vehículo en el punto de tiempo correspondiente. En comparación con el vehículo, mALK3 (24-152)-mFc reduce la superficie de los osteoclastos significativamente a los 28 días de tratamiento, proporcionando así la evidencia de la formación de hueso antirresortivo.
La Figura 33 muestra el efecto de mALK3 (24-152)-mFc en los niveles séricos de RANKL (activador del receptor para el ligando B del factor nuclear) en ratones hembra como se determina por el ensayo Luminex xMAP®. Los datos son medias + SEM; n = 6 por grupo por punto de tiempo. **, P <0,01; *, P <0,05 frente a vehículo en los puntos de tiempo correspondientes. En comparación con el vehículo, mALK3 (24-152)-mFc reduce los niveles circulantes de RANKL significativamente en todos los puntos de tiempo.
La Figura 34 muestra el efecto de mALK3 (24-152)-mFc en los niveles en suero de osteoprotegerina (OPG) en ratones hembra como se determina por el ensayo Luminex xMAP®. Los datos son medias + SEM; n = 6 por grupo por punto de tiempo. **, P <0,01; *, P <0,05 frente a vehículo en los puntos de tiempo correspondientes. En
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los antagonistas de BMP-ALK3 hacen aumentar la densidad ósea en ratones normales. Sorprendentemente, el hueso generado por el tratamiento con ALK3-Fc no muestra evidencia del tipo de la desorganización observada en los ratones con genes desactivados condicionales de ALK3. Cabe señalar que el hueso es un tejido dinámico, con un crecimiento o contracción y una densidad que aumenta o disminuye en función de un equilibrio de los factores que producen el hueso y estimulan la mineralización (principalmente los osteoblastos) y los factores que destruyen y desmineralizan el hueso (osteoclastos principalmente). El crecimiento óseo y la mineralización se pueden aumentar mediante el aumento de los factores productivos, por la disminución de los factores destructivos, o ambos. Las expresiones "promover el crecimiento del hueso" y "aumentar la mineralización de los huesos" se refieren a los cambios físicos observables en los huesos y se pretende que sean neutrales en cuanto al mecanismo por el cual los cambios en el hueso ocurren.
El modelo de ratón para el crecimiento óseo/densidad que se utilizó en los estudios descritos en el presente documento se considera que es altamente predictivo de la eficacia en seres humanos y, por lo tanto, los polipéptidos de ALK3 y otros antagonistas de BMP-ALK3 pueden usarse para promover el crecimiento óseo y el aumento de la densidad ósea en seres humanos. De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, los antagonistas de BMP-ALK3 para dicho uso incluyen ciertos polipéptidos de ALK3 solubles que se unen a BMP, anticuerpos que se unen a BMP e interrumpen la unión a ALK3 y anticuerpos que se unen a ALK3 e interrumpen la unión a BMP. También se describen para dicho uso proteínas no de anticuerpos seleccionadas para la unión de BMP o ALK3 (véanse, por ejemplo, los documentos WO/2002/088171, WO/2006/055689, WO/2002/032925, WO/2005/037989, los documentos de EE.UU. 2003/0133939 y 2005/0238646 para ejemplos de tales proteínas y métodos para el diseño y la selección de los mismos), péptidos aleatorizados seleccionados para la unión de BMP o ALK3, a menudo fijados a un dominio Fc. Dos proteínas diferentes (u otros restos) con actividad de unión a BMP o ALK3, especialmente aglutinantes de BMP que bloquean los sitios de unión del tipo I (por ejemplo, un receptor de activina tipo I soluble) y tipo II (por ejemplo, un receptor de activina tipo II soluble), respectivamente, pueden ser unidos entre sí para crear una molécula de unión bifuncional. También se contemplan aptámeros de ácidos nucleicos, moléculas pequeñas y otros agentes que inhiban el eje de señalización de BMP-ALK3. Adicionalmente, se pueden utilizar, como antagonistas de BMP-ALK3, ácidos nucleicos, tales como moléculas antisentido, siARN o ribozimas que inhiben BMP o, particularmente, la expresión de ALK3.
Los términos y las expresiones utilizados en esta memoria descriptiva tienen generalmente sus significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico donde se utiliza cada término. Ciertos términos se discuten a continuación o en otra parte en la memoria descriptiva, para proporcionar una guía adicional para el profesional en la descripción de las composiciones de la invención y de cómo prepararlos y usarlos. El alcance o el significado de cualquier uso de un término serán evidentes a partir del contexto específico en el que se utilice el término.
"Aproximadamente" significa generalmente un grado aceptable de error para la cantidad medida dada la naturaleza
o la precisión de las mediciones. Típicamente, los grados ilustrativos de error están dentro del 20 por ciento (%), preferiblemente dentro del 10% y más preferiblemente dentro del 5% de un valor dado o intervalo de valores.
Alternativamente y, particularmente en los sistemas biológicos, el término "aproximadamente" puede significar valores que están dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro de 5 veces y más preferiblemente dentro de 2 veces de un valor dado. Las cantidades numéricas dadas en este documento son aproximadas, a no ser que se indique lo contrario, lo que significa que el término "aproximadamente" se puede inferir cuando no se indique expresamente.
Las secuencias pueden ser comparadas entre sí, incluyendo la secuencia de tipo salvaje con respecto a uno o más mutantes (variantes de secuencia). Estas comparaciones comprenden típicamente alineamientos de secuencias de polímeros, por ejemplo, usando programas y/o algoritmos de alineación de secuencias que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, BLAST, FASTA y MEGALIGN, por nombrar unos pocos). El experto en la técnica puede apreciar fácilmente que, en tales alineaciones, donde una mutación contiene una inserción o eliminación de restos, la alineación de secuencias introducirá una "hueco" (normalmente representado por un guión, o "A") en la secuencia polimérica que no contiene el resto insertado o eliminado.
"Homólogo", en todas sus formas gramaticales y variaciones ortográficas, se refiere a la relación entre dos proteínas que poseen un "origen común evolutivo", incluyendo proteínas de superfamilias en la misma especie de organismo, así como proteínas homólogas de diferentes especies de organismo. Tales proteínas (y sus ácidos nucleicos que codifican) tienen homología de secuencia, como se refleja por su similitud de secuencia, ya sea en términos de porcentaje de identidad o por la presencia de restos o motivos específicos y posiciones conservadas.
La expresión "similitud de secuencia", en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos que pueden o no compartir un origen evolutivo común.
Sin embargo, en el uso común y en la presente solicitud, el término "homólogo", cuando se modifica con un adverbio tal como "altamente," puede referirse a la similitud de secuencia y puede o no estar relacionado con un origen evolutivo común.
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2. Polipéptidos de ALK3
Se describen en este documento polipéptidos de ALK3. Tal como se utiliza en este documento, el término "ALK3" se refiere a una familia de proteínas de quinasa-3 tipo receptor de activina (ALK3) [también conocido como receptor de la proteína morfogenética ósea, tipo IA (BMPR1A), o receptor de activina A, quinasa tipo II (ACVRLK)] de todas las especies y variantes derivadas de dichas proteínas ALK3 por mutagénesis u otra modificación. La referencia a ALK3 en el presente documento se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas actualmente identificadas. Los miembros de la familia ALK3 son generalmente proteínas transmembrana, compuestas de un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con la actividad serina/treonina quinasa predicha.
La expresión "polipéptido de ALK3" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ALK3, así como las variantes de los mismos (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que retienen una actividad útil. Por ejemplo, los polipéptidos de ALK3 incluyen los polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier ALK3 conocido que tiene una secuencia de al menos aproximadamente 80% idéntica respecto a la secuencia de un polipéptido de ALK3 y preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o mayor identidad. Por ejemplo, un polipéptido de ALK3 puede unirse e inhibir la función de una proteína ALK3 y/o BMP. Preferiblemente, un polipéptido de ALK3 promueve el crecimiento óseo y la mineralización ósea. Los ejemplos de polipéptidos de ALK3 incluyen el polipéptido precursor de ALK3 humano (SEQ ID NO: 1) y polipéptidos de ALK3 humanos solubles (por ejemplo, SEQ ID NOs: 3, 7, 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40 ó 41).
La secuencia de la proteína precursora ALK3 humana (SEQ ID NO: 1) se muestra en la Figura 1, y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína precursora ALK3 humana (SEQ ID NO: 2; nucleótidos 549-2144 de entrada de GenBank NM_004329) se muestra en la Figura 2. El ALK3 humana soluble (extracelular), secuencia de polipéptido procesada (SEQ ID NO: 3) se muestra en la Figura 3, y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el dominio extracelular de ALK3 humano (SEQ ID NO: 4; los nucleótidos 618-1004 de la entrada de Genbank NM_004329) se muestra en la Figura 4.
Se describen en este documento polipéptidos solubles de ALK3. Como se describe en el presente documento, la expresión "polipéptido de ALK3 soluble" generalmente se refiere a polipéptidos que comprenden un dominio extracelular de una proteína ALK3. La expresión "polipéptido de ALK3 soluble", como se usa en este documento, incluye cualquier dominio extracelular de origen natural de una proteína ALK3, así como cualesquiera variantes de los mismos (incluyendo mutantes, fragmentos y formas peptidomiméticas). Un polipéptido ALK3 que se une a BMP es uno que retiene la capacidad de unirse a los BMP, especialmente BMP2 y BMP4. Preferiblemente, un polipéptido ALK3 que se une a BMP se unirá a BMP con una constante de disociación de 1 nM o menos. La secuencia de aminoácidos de la proteína precursora ALK3 humana se proporciona en la Figura 1. El dominio extracelular de una proteína ALK3 se une a BMP y generalmente es soluble y, por lo tanto, puede ser denominado un polipéptido soluble ALK3 que se une a BMP. Los ejemplos de polipéptidos solubles ALK3 que se unen a BMP incluyen el polipéptido soluble ilustrado en las SEQ ID NOs: 3, 7, 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35 , 36, 38, 39, 40 ó 41. La SEQ ID NO: 7 es de acuerdo con el primer aspecto de la invención, se refiere como ALK3(24-152)hFc, y se describe adicionalmente en los Ejemplos. Otros ejemplos de polipéptidos solubles ALK3 que se unen a BMP comprenden una secuencia de señal, además del dominio extracelular de una proteína ALK3, por ejemplo, la secuencia líder ALK3 nativa (SEQ ID NO: 8), el líder del activador de plasminógeno tisular (TPA) (SEQ ID NO: 9) o el líder de melitina de la miel de abeja (SEQ ID NO: 10). El polipéptido de ALK3-hFc que se ilustra en la SEQ ID NO: 11 utiliza un líder TPA.
Los fragmentos funcionalmente activos de los polipéptidos de ALK3 se pueden obtener mediante el cribado de polipéptidos producidos de forma recombinante a partir del fragmento correspondiente del ácido nucleico que codifica un polipéptido de ALK3. Además, los fragmentos pueden sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas en la técnica tales como la química Merrifield en fase sólida convencional f-Moc o t-Boc. Los fragmentos pueden ser producidos (de forma recombinante o por síntesis química) y probados para identificar aquellos fragmentos de peptidilo que pueden funcionar como antagonistas (inhibidores) de la proteína ALK3 o de señalización mediada por los BMP.
Se pueden obtener variantes funcionalmente activas de polipéptidos de ALK3 mediante el cribado de bibliotecas de polipéptidos modificados producidos de forma recombinante a partir de los ácidos nucleicos mutagenizados correspondientes que codifican un polipéptido de ALK3. Las variantes pueden ser producidas y probadas para identificar a las que pueden funcionar como antagonistas (inhibidores) de la proteína ALK3 o la señalización mediada por los BMP. De acuerdo con el sexto aspecto de la invención, la variante funcional comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 95%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40 ó 41.
Las variantes funcionales pueden ser generadas mediante la modificación de la estructura de un polipéptido de ALK3 para fines tales como mejorar la eficacia terapéutica o la estabilidad (por ejemplo, semivida ex vivo y resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Tales polipéptidos de ALK3 modificados, cuando se seleccionan para retener la unión de BMP, se consideran equivalentes funcionales de los polipéptidos de ALK3 de origen natural.
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mecanismos característicos para tales actividades posteriores a la traducción y pueden ser elegidos para asegurar la correcta modificación y el procesamiento de los polipéptidos de ALK3.
En ciertos aspectos, las variantes funcionales o las formas modificadas de los polipéptidos de ALK3 incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una porción de los polipéptidos de ALK3 y uno o más dominios de fusión. Ejemplos bien conocidos de tales dominios de fusión incluyen, pero no se limitan a, polihistidina, Glu-Glu, glutatión S transferasa (GST), tiorredoxina, proteína A, proteína G, una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Fc), proteína de unión a maltosa (MBP) o albúmina de suero humano. Un dominio de fusión puede seleccionarse a fin de conferir una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusión son particularmente útiles para el aislamiento de las proteínas de fusión mediante cromatografía de afinidad. Para el propósito de la purificación por afinidad, se utilizan matrices relevantes para la cromatografía de afinidad, tales como resinas de conjugados de glutatión, amilasa y de níquel o cobalto. Muchos de tales matrices están disponibles en forma de "kit", tales como el sistema de purificación de Pharmacia GST y el sistema QIAexpress™ (Qiagen) útil con parejas de fusión (HIS6). Como otro ejemplo, puede seleccionarse un dominio de fusión a fin de facilitar la detección de los polipéptidos de ALK3. Ejemplos de tales dominios de detección incluyen las diversas proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP), así como "marcadores de epítopo", que son generalmente secuencias de péptidos cortos para las que un anticuerpo específico está disponible. Los marcadores de epítopo bien conocidos por los que los anticuerpos monoclonales específicos están fácilmente disponibles incluyen FLAG, hemaglutinina del virus influenza (HA) y marcadores de cmyc. En algunos casos, los dominios de fusión tienen un sitio de escisión de proteasa, tales como para el Factor Xa
o la trombina, lo que permite que la proteasa relevante digiera parcialmente las proteínas de fusión y de ese modo liberar las proteínas recombinantes de los mismos. Las proteínas liberadas se pueden aislar entonces a partir del dominio de fusión de la separación cromatográfica subsiguiente. En ciertas realizaciones preferidas, un polipéptido de ALK3 se fusiona con un dominio que estabiliza el polipéptido de ALK3 in vivo (un dominio "estabilizador"). Por "estabilizar" se entiende cualquier cosa que aumenta la semivida en suero, independientemente de si esto es debido a la menor destrucción, la disminución del aclaramiento por el riñón u otro efecto farmacocinético. Son conocidas fusiones con la porción Fc de una inmunoglobulina para conferir propiedades farmacocinéticas deseables en una amplia gama de proteínas. Del mismo modo, las fusiones a albúmina de suero humano pueden conferir propiedades deseables. Otros tipos de dominios de fusión que pueden ser seleccionadas incluyen la multimerización de dominios (por ejemplo, la dimerización, la tetramerización) y dominios funcionales (que confieren una función biológica adicional, tal como una mayor estimulación del crecimiento del hueso o del crecimiento muscular, según se desee).
Como un ejemplo específico, una proteína de fusión que comprende un dominio extracelular soluble de ALK3 fusionado a un dominio Fc (por ejemplo, SEQ ID NO: 5 en la Figura 5). Ejemplos de dominios Fc se muestran a continuación:
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Opcionalmente, el dominio Fc tiene una o más mutaciones en los restos, tales como Asp-265, lisina 322 y Asn-434. En ciertos casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de estas mutaciones (por ejemplo, la mutación Asp265) tiene reducida la capacidad de unión al receptor de Fc con respecto a un dominio Fc de tipo salvaje. En otros casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de estas mutaciones (por ejemplo, la mutación Asn-434) tiene incrementada la capacidad de unirse al receptor de Fc relacionado con el CMH clase I (FcRn) a un dominio Fc de tipo salvaje.
Se entiende que los diferentes elementos de las proteínas de fusión se pueden disponer en cualquier forma que sea consistente con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, puede colocarse C-terminal un polipéptido de ALK3 a un dominio heterólogo, o, alternativamente, puede ser colocado C-terminal un dominio heterólogo a un polipéptido de ALK3. El dominio del polipéptido de ALK3 y el dominio heterólogo no tienen que ser adyacentes en una proteína de fusión y se pueden incluir extremos C-o N-terminal a dominios adicionales o secuencias de aminoácidos a cualquiera del dominio o entre los dominios.
Los polipéptidos de ALK3 de la presente invención pueden contener una o más modificaciones que sean capaces de estabilizar los polipéptidos de ALK3. Por ejemplo, tales modificaciones aumentan la semivida in vitro de los polipéptidos de ALK3, mejoran la semivida circulatoria de los polipéptidos de ALK3 o reducen la degradación proteolítica de los polipéptidos de ALK3. Tales modificaciones estabilizadoras incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión (incluyendo, por ejemplo, las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de ALK3 y un dominio estabilizador), modificaciones de un sitio de glicosilación (incluyendo, por ejemplo, la adición de un sitio de glicosilación a un polipéptido de ALK3) y modificaciones del resto de carbohidrato (incluyendo, por ejemplo, la eliminación de restos de carbohidratos a partir de un polipéptido de ALK3). En el caso de proteínas de fusión, un polipéptido de ALK3 está fusionado a un dominio de estabilizador tal como una molécula de IgG (por ejemplo, un
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inicio de la transcripción y terminación, secuencias de inicio y terminación de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. Los promotores constitutivos o inducibles como se conocen en la técnica se contemplan por la invención. Los promotores pueden ser tanto promotores de origen natural, o promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Una construcción de expresión puede estar presente en una célula en un episoma, tal como un plásmido, o la construcción de expresión puede ser insertada en un cromosoma. En una realización preferida, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable que permite la selección de células huésped transformadas. Los genes marcadores seleccionables son bien conocidos en la técnica y variarán con la célula huésped usada.
En ciertos aspectos de la invención, el ácido nucleico objeto se proporciona en un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de ALK3 y que se une operativamente a al menos una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras son reconocidas en la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión del polipéptido de ALK3. En consecuencia, la expresión “secuencia reguladora” incluye promotores, potenciadores y otros elementos del control de la expresión. Secuencias reguladoras ilustrativas se describen en Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de la expresión que controlan la expresión de una secuencia de ADN cuando se unen operativamente a ella puede usarse en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifican un polipéptido de ALK3. Tales secuencias de control de la expresión útiles, incluyen, por ejemplo, los promotores temprano y tardío de SV40, el promotor tet, el promotor temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus, los promotores de RSV, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el promotor T7, cuya expresión está dirigida por la T7 ARN polimerasa, las principales regiones operadora y promotora del fago lambda, las regiones de control para la proteína de la cubierta fd, el promotor para la 3fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de α-apareamiento de levadura, el promotor poliédrico del sistema de baculovirus y otras secuencias conocidas por controlar la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus, y varias combinaciones de los mismos. Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar y/o el tipo de proteína que se desee expresar. Por otra parte, el número de copias del vector, la capacidad de controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tales como marcadores de antibióticos, también deben ser considerados.
Un ácido nucleico recombinante de la invención puede producirse mediante la ligación del gen clonado, o una porción del mismo, en un vector adecuado para la expresión en células procariotas, células eucariotas (levadura, aviar, insecto o mamífero), o ambos. Los vehículos de expresión para la producción de un polipéptido recombinante ALK3 incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procariotas, tales como E. coli.
Algunos vectores de expresión de mamíferos contienen tanto secuencias procarióticas para facilitar la propagación del vector en bacterias, y una o más unidades de transcripción eucariotas que se expresan en células eucariotas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamíferos adecuados para la transfección de células eucariotas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y la selección de la resistencia a fármacos en células tanto procariotas como eucariotas. Alternativamente, pueden usarse derivados de virus tales como el virus del papiloma bovino (BPV-1), o virus de Epstein-Barr (pHEBo, pREP-derivado y p205) para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. Ejemplos de otros sistemas de expresión virales (incluyendo retrovirales) se pueden encontrar a continuación en la descripción de sistemas de administración de terapia génica. Los diversos métodos empleados en la preparación de los plásmidos y en la transformación de organismos huésped son bien conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas, así como procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3ª Ed., Ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). En algunos casos, puede ser deseable expresar los polipéptidos recombinantes mediante el uso de un sistema de expresión de baculovirus. Ejemplos de tales sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUWl) y vectores derivados de pBlueBac (tales como el pBlueBac III que contiene β-gal).
En una realización preferida, se diseñó un vector para la producción de los polipéptidos objeto de ALK3 en células CHO, tal como un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), vectores de pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y vectores pCI-Neo (Promega, Madison, Wise). Como será evidente, pueden usarse los constructos de genes objeto para causar la expresión de los polipéptidos objeto de ALK3 en células propagadas en cultivo, por ejemplo, para producir proteínas, incluyendo proteínas de fusión o proteínas variantes, para la purificación.
Esta invención también se refiere a una célula huésped transfectada con un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 12, 15, 21, 24, 27, 32 ó 37). La célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipéptido de ALK3 de la invención puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (por ejemplo, utilizando un sistema de expresión de baculovirus), levadura o células de mamífero. Otras células huésped adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica.
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De acuerdo con ello, se describen en este documento métodos de producción de los polipéptidos objeto de ALK3. Por ejemplo, una célula huésped transfectada con un vector de expresión que codifica un polipéptido de ALK3 puede cultivarse en condiciones apropiadas para permitir que se produzca la expresión del polipéptido de ALK3. El polipéptido de ALK3 puede ser secretado y aislado a partir de una mezcla de células y medio que contiene el polipéptido de ALK3. Alternativamente, el polipéptido de ALK3 puede ser retenido citoplásmicamente o en una fracción de membrana y las células recogidas, ser lisadas y aisladas de la proteína. Un cultivo celular incluye células huésped, medios y otros subproductos. Los medios adecuados para el cultivo celular son bien conocidos en la técnica. Los polipéptidos objeto de ALK3 pueden aislarse a partir del medio del cultivo celular, células huésped, o ambos, usando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis, purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para epítopos particulares de los polipéptidos de ALK3 y la purificación por afinidad con un agente que se une a un dominio fusionado al polipéptido de ALK3 (por ejemplo, una columna de proteína A se puede utilizar para purificar una fusión ALK3-Fc). En una realización preferida, el polipéptido de ALK3 es una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación. La purificación se puede conseguir mediante una serie de etapas de cromatografía de columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio de cationes. La purificación se pudo completar con la filtración vírica y el intercambio de tampón. Como se ha demostrado en el presente documento, la proteína ALK3-hFc se purificó a una pureza de >98%, determinada por cromatografía de exclusión por tamaño y > 95% según se determinó mediante SDS PAGE. Este nivel de pureza fue suficiente para lograr efectos deseables en el hueso en ratones y un perfil de seguridad aceptable en ratones, ratas y primates no humanos.
Un gen de fusión que codifica una secuencia líder de purificación, tal como un secuencia del sitio de escisión de poli(His)/enteroquinasa en el extremo N-terminal de la porción deseada del polipéptido de ALK3 recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada por cromatografía de afinidad usando una resina de metal Ni2+. La secuencia líder de purificación después puede retirarse posteriormente por tratamiento con enteroquinasa para proporcionar el polipéptido de ALK3 purificado (por ejemplo, véase Hochuli et al., (1987) J. Chromatography
411: 177; y Janknecht et al, PNAS USA 88: 8972).
Las técnicas para preparar genes de fusión son bien conocidas. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptidos se lleva a cabo de acuerdo con técnicas convencionales, empleando extremos romos o escalonados de composición para la ligación, la digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable y la ligación enzimática. El gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos de genes puede llevarse a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden hibridarse posteriormente para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons: 1992).
4. Antagonistas de BMP y ALK3 alternativos
Los datos presentados en el presente documento demuestran que los antagonistas de la señalización de BMP-ALK3 se pueden utilizar para promover el crecimiento óseo y la mineralización ósea. Aunque los polipéptidos de ALK3 solubles y, en particular ALK3-Fc, son antagonistas preferidos, y aunque tales antagonistas pueden afectar el hueso a través de un mecanismo distinto del antagonismo de BMP (por ejemplo, la inhibición de BMP puede ser un indicador de la tendencia de un agente para inhibir las actividades de un espectro de moléculas, incluyendo, quizás, otros miembros de la superfamilia de TGF-beta, y tal inhibición colectiva puede dar lugar al efecto deseado sobre el hueso), se esperan que otros tipos de antagonistas de BMP-ALK3 sean útiles, incluyendo anticuerpos anti-BMP (por ejemplo, BMP2 o BMP4), anticuerpos anti-ALK3, antisentido, ARNi o ácidos nucleicos de ribozima que inhiben la producción de ALK3, BMP2 o BMP4 y otros inhibidores de BMP o ALK3, particularmente aquellos que interrumpen la unión de BMP-ALK3.
Un anticuerpo que es específicamente reactivo con un polipéptido de ALK3 (por ejemplo, un polipéptido soluble de ALK3), y que o bien se une competitivamente a ligando con el polipéptido de ALK3 o de otro modo inhibe la señalización mediada por ALK3, puede ser usado como un antagonista de las actividades de polipéptidos de ALK3. Del mismo modo, se puede utilizar un anticuerpo que sea específicamente reactivo con un polipéptido BMP y que interrumpa la unión del polipéptido de ALK3, como un antagonista.
Mediante el uso de inmunógenos derivados de un polipéptido de ALK3 o un polipéptido de BMP, antisueros antiproteína/anti-péptido o anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante protocolos estándar (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, ed. por Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Un mamífero, tal como un ratón, un hámster o un conejo puede ser inmunizado con una forma inmunogénica del polipéptido de ALK3, un fragmento antigénico que es capaz de provocar una respuesta de anticuerpos, o una proteína de fusión. Las técnicas para conferir inmunogenicidad a una proteína o péptido incluyen conjugación con vehículos u otras técnicas bien conocidas en la técnica. Una porción inmunogénica de un polipéptido BMP o ALK3 puede ser administrada en presencia de adyuvante. El progreso de la inmunización puede controlarse por detección de títulos
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de anticuerpos en plasma o suero. El ELISA estándar u otros inmunoensayos pueden usarse con el inmunógeno como antígeno para evaluar los niveles de anticuerpos.
Después de la inmunización de un animal con una preparación antigénica de un polipéptido de ALK3, se pueden obtener los antisueros y, si se desea, los anticuerpos policlonales pueden ser aislados a partir del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, se pueden cultivar células productoras de anticuerpos (los linfocitos) a partir de un animal inmunizado y fusionarlas por procedimientos de fusión de células somáticas estándar con células de inmortalización tales como células de mieloma para producir células de hibridoma. Tales técnicas son bien conocidas en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la técnica del hibridoma (desarrollada originalmente por Kohler y Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbar et al, (1983) Immunology Today, 4: 72), y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al, (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96). Las células de hibridoma se pueden seleccionar inmunoquímicamente para la producción de anticuerpos específicamente reactivos con un polipéptido de ALK3 y los anticuerpos monoclonales aislarse a partir de un cultivo que comprenda tales células de hibridoma.
El término "anticuerpo", como se usa en este documento, pretende incluir fragmentos del mismo que también sean específicamente reactivos con un polipéptido objeto. Los anticuerpos pueden fragmentarse usando técnicas convencionales y los fragmentos ser seleccionados para la utilidad de la misma manera que la descrita anteriormente para los anticuerpos completos. Por ejemplo, se pueden generar fragmento F(ab)2 tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)2 resultante puede tratarse para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab. El anticuerpo útil en la presente invención se pretende que incluya además moléculas biespecíficas y humanizadas y completamente humanas quiméricas de una sola cadena que tienen afinidad por un polipéptido BMP o ALK3 conferida por al menos una región CDR del anticuerpo. Un anticuerpo puede comprender además un marcador fijado al mismo y capaz de ser detectado (por ejemplo, el marcador puede ser un radioisótopo, compuesto fluorescente, enzima o co-factor de enzima).
El anticuerpo puede ser un anticuerpo recombinante, término que abarca cualquier anticuerpo generado en parte por técnicas de biología molecular, incluyendo los anticuerpos injertados con CDR o quiméricos, anticuerpos humanos o de otros ensamblados a partir de dominios de anticuerpos seleccionados de la biblioteca, anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos de dominio simple (por ejemplo, proteínas VH humanas o proteínas de camélidos VHH). En ciertas realizaciones, un anticuerpo útil de la invención es un anticuerpo monoclonal. Se describen en este documento métodos para la generación de nuevos anticuerpos. Por ejemplo, un método para generar un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido de ALK3 o polipéptido de BMP puede comprender administrar a un ratón una cantidad de una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de antígeno eficaz para estimular una respuesta inmune detectable, obteniendo células productoras de anticuerpos (por ejemplo, células de bazo) del ratón y fusiondo de las células productoras de anticuerpos con células de mieloma para obtener hibridomas productores de anticuerpos, y probando los hibridomas productores de anticuerpos para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monocolonal que se une específicamente al antígeno. Una vez obtenido, un hibridoma puede ser propagado en un cultivo de células, opcionalmente en condiciones de cultivo donde las células derivadas de hibridoma producen el anticuerpo monoclonal que se une específicamente al antígeno. El anticuerpo monoclonal puede purificarse a partir del cultivo celular.
El adjetivo "específicamente reactivo con", tal como se utiliza en referencia a un anticuerpo, se entiende que significa, como se entiende generalmente en la técnica, que el anticuerpo es suficientemente selectivo entre el antígeno de interés (por ejemplo, un polipéptido de ALK3) y otros antígenos que no son de interés que el anticuerpo sea útil para, como mínimo, detectar la presencia del antígeno de interés en un tipo particular de muestra biológica. En ciertos métodos que emplean el anticuerpo, tales como aplicaciones terapéuticas, puede ser deseable un mayor grado de especificidad en la unión. Los anticuerpos monoclonales generalmente tienen una mayor tendencia (en comparación con los anticuerpos policlonales) para discriminar eficazmente entre los antígenos deseados y polipéptidos que reaccionan cruzados. Una característica que influye en la especificidad de una interacción anticuerpo:antígeno es la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Aunque la especificidad deseada se puede alcanzar con una gama de diferentes afinidades, los anticuerpos generalmente preferidos tendrán una afinidad (una constante de disociación) de aproximadamente 10-6 , 10-7 , 10-8 , 10-9 o menos. Teniendo en cuenta la unión extraordinariamente estrecha entre los BMP y ALK3, se espera que una neutralización del anticuerpo anti-BMP o anti-ALK3 tendría generalmente una constante de disociación de 10-9 o menos.
Además, las técnicas utilizadas para detectar anticuerpos con el fin de identificar un anticuerpo deseable puede influir en las propiedades del anticuerpo obtenido. Por ejemplo, si un anticuerpo se va a utilizar para la unión de un antígeno en solución, puede ser deseable analizar la solución de unión. Una variedad de técnicas diferentes están disponibles para el ensayo de la interacción entre los anticuerpos y los antígenos para identificar anticuerpos particularmente deseables. Tales técnicas incluyen ELISA, ensayos de unión de resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, el ensayo de unión de Biacore™, Biacore AB, Uppsala, Suecia), ensayos de sándwich (por ejemplo, el sistema de perlas paramagnéticas de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), transferencias Western, ensayos de inmunoprecipitación e inmunohistoquímica.
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unión se pueden realizar con la diana fijada a un pocillo, perla o chip o capturada por un anticuerpo inmovilizado o resueltos por electroforesis capilar. Los compuestos unidos pueden detectarse generalmente mediante métodos colorimétricos o fluorescencia o resonancia de plasmón de superficie.
Se describen en este documento métodos y agentes para modular (estimular o inhibir) la formación de hueso y aumentar la masa ósea. Por lo tanto, puede ser probado cualquier compuesto identificado en células completas o tejidos, in vitro o in vivo, para confirmar su capacidad para modular el crecimiento del hueso o la mineralización. Diversos métodos conocidos en la técnica pueden ser utilizados para este propósito.
Por ejemplo, el efecto de los polipéptidos de ALK3 o BMP o los compuestos de ensayo sobre el hueso o el crecimiento de cartílago puede ser determinado mediante la medición de la inducción de Msx2 o la diferenciación de células osteoprogenitoras en osteoblastos en ensayos basados en células (véase, por ejemplo, Daluiski et al., Nat Genet., 2001, 27 (1): 84-8; Hino et al, Front Biosci. 2004, 9: 1520-9). Otro ejemplo de ensayos basados en células incluye el análisis de la actividad osteogénica de los polipéptidos de ALK3 o BMP objeto y compuestos de ensayo en células progenitoras mesenquimales y osteoblásticas. Para ilustrarlo, se pueden construir adenovirus recombinantes que expresan un polipéptido de BMP o ALK3 para infectar células C3H10T1/2 pluripotentes progenitoras mesenquimales, células C2C12 preosteoblásticas y células osteoblásticas TE-85. La actividad osteogénica se determina a continuación mediante la medición de la inducción de la fosfatasa alcalina, la osteocalcina y la mineralización de la matriz (véase, por ejemplo, Cheng et al, J Bone Joint Surg Am 2003, 85-A (8): 1544-1552).
Pueden usarse ensayos in vivo para medir el crecimiento de hueso o cartílago. Por ejemplo, Namkung-Matthai et al, Bone, 28: 80-86 (2001) describen un modelo de rata osteoporótica en el que se estudia la reparación ósea durante el período inicial después de la fractura. Kubo et al, Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68: 197-202 (1999) describen también un modelo de rata osteoporótica en el que se estudia la reparación ósea durante el último período después de la fractura. Andersson et al., J. Endocrinol. 170: 529-537 describen un modelo de osteoporosis en ratón en el que los ratones son ovarioectomizadas, lo que hace que los ratones pierdan el contenido mineral óseo sustancial y la densidad mineral ósea, perdiendo el hueso trabecular más o menos el 50% de la densidad mineral ósea. La densidad ósea se podría aumentar en los ratones ovarioectomizados mediante la administración de factores tales como la hormona paratiroidea. Pueden usarse ensayos de curación de fracturas que son conocidos en la técnica. Estos ensayos incluyen la técnica de fractura, el análisis histológico y el análisis biomecánico, que se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. No. 6.521.750, que describe protocolos experimentales para causar fracturas así como la medición de la extensión de las fracturas y su proceso de reparación.
6. Usos terapéuticos ejemplares
En el cuarto aspecto de la invención, se pueden usar ciertos antagonistas de BMP-ALK3 (por ejemplo, polipéptidos de ALK3) para tratar o prevenir una enfermedad o afección que está asociada con el daño óseo, ya sea, por ejemplo, a través de la rotura, la pérdida o la desmineralización. El daño en el hueso puede tratarse o prevenirse en un individuo en necesidad del mismo a través de la administración al individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de BMP-ALK3, particularmente un polipéptido de ALK3. Dado el potencial para un efecto dual sobre la resorción ósea y la formación, tales compuestos pueden ser útiles en una amplia gama de enfermedades que se tratan actualmente con anabólicos (por ejemplo, la hormona paratiroidea y derivados de los mismos) o agentes anti-resorción (por ejemplo, bisfosfonatos). Se describen en este documento métodos para promover el crecimiento óseo o la mineralización en un individuo en necesidad del mismo a través de la administración al individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de BMP-ALK3, particularmente un polipéptido de ALK3. Estos métodos están dirigidos opcionalmente a tratamientos terapéuticos y profilácticos de animales y, más preferiblemente, de seres humanos. La descripción proporciona el uso de antagonistas de BMP-ALK3 (polipéptidos de ALK3 particularmente solubles y anticuerpos neutralizantes dirigidos a los BMP o ALK3) para el tratamiento de trastornos asociados con baja densidad ósea o la disminución de la resistencia ósea.
Como se usa en este documento, un agente terapéutico que "previene" un trastorno o afección se refiere a un compuesto que, en una muestra estadística, reduce la aparición de la enfermedad o condición en la muestra tratada con respecto a una muestra de control sin tratar, o retrasa la aparición o reduce la gravedad de uno o más síntomas del trastorno o condición en relación con la muestra de control sin tratar. El término "tratar", como se usa en este documento, incluye la profilaxis de la dolencia nombrada o la mejora o la eliminación una vez que se ha establecido. En cualquier caso, pueden distinguirse la prevención o el tratamiento en el diagnóstico proporcionado por un médico y el resultado deseado de la administración del agente terapéutico.
La descripción proporciona métodos de la inducción de la formación de hueso y/o cartílago, evitando la pérdida de hueso, el aumento de la mineralización ósea o la prevención de la desmineralización del hueso. Por ejemplo, los antagonistas de BMP-ALK3 objeto tienen aplicación en el tratamiento de los trastornos de pérdida ósea, tales como osteoporosis y la curación de fracturas óseas y defectos del cartílago u otros defectos de los huesos, lesiones y trastornos en seres humanos y otros animales. Los polipéptidos de ALK3 o BMP pueden ser útiles en pacientes que se diagnostican con una baja densidad ósea subclínica, como medida de protección contra el desarrollo de la osteoporosis.
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anticoagulante; y colestiramina (Questran) y colestipol (Colestid), que se utiliza para tratar el colesterol alto. La pérdida ósea resultante de la terapia del cáncer es ampliamente reconocida y se denomina pérdida ósea inducida por terapia del cáncer (CTIBL). Las metástasis óseas pueden crear cavidades en el hueso que pueden ser corregidas por el tratamiento con antagonistas de BMP-ALK3.
Opcionalmente, los antagonistas de BMP-ALK3, particularmente un ALK3 soluble, descrito en este documento, pueden usarse en pacientes con cáncer. Los pacientes que tienen ciertos tumores (por ejemplo, de próstata, de mama, mieloma múltiple o cualquier tumor que cause hiperparatiroidismo) están en alto riesgo de pérdida ósea debido a la pérdida ósea inducida por los tumores, así como las metástasis óseas y agentes terapéuticos. Estos pacientes pueden ser tratados con antagonistas de BMP-ALK3 incluso en ausencia de evidencias de pérdida de hueso o metástasis óseas. Los pacientes también pueden ser monitorizados para detectar evidencias de pérdida de hueso o metástasis óseas, y pueden ser tratados con antagonistas de BMP-ALK3 en el caso de que los indicadores sugieran un aumento del riesgo. En general, se emplean las exploraciones DEXA para evaluar los cambios en la densidad ósea, mientras que se pueden usar indicadores de la remodelación ósea para evaluar la probabilidad de metástasis óseas. Los marcadores séricos pueden ser monitoreados. La fosfatasa alcalina específica de hueso (BSAP) es una enzima que está presente en los osteoblastos. Los niveles sanguíneos de BSAP se incrementan en pacientes con metástasis en los huesos y otras condiciones que resultan en un aumento de la remodelación ósea. La osteocalcina y los péptidos de procolágeno también están asociados con la formación de hueso y las metástasis óseas. Se han detectado aumentos en BSAP en pacientes con metástasis ósea causada por cáncer de próstata y, en menor grado, en las metástasis óseas del cáncer de mama. Los niveles de proteína morfogenética ósea-7 (BMP7) son elevados en el cáncer de próstata que ha hecho metástasis al hueso, pero no en las metástasis de hueso debidas al cáncer de vejiga, piel, hígado o pulmón. El telopéptido carboxi-terminal tipo I (CIFT) es un agente de reticulación que se encuentra en el colágeno y que se forma durante la resorción del hueso. Dado que el hueso está siendo constantemente descompuesto y reformado, el ICTP se encuentra en todo el cuerpo. Sin embargo, en el sitio de la metástasis ósea, el nivel será significativamente mayor que en un área de hueso normal. El ICTP se ha encontrado en niveles altos en la metástasis ósea debida al cáncer de próstata, de pulmón y mama. Otro agente de reticulación del colágeno, el telopéptido N-terminal Tipo I (NTx), se produce junto con el ICTP durante el recambio óseo. La cantidad de NTx se incrementa en la metástasis ósea causada por muchos tipos diferentes de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón, de próstata y de mama. Además, los niveles de NTx aumentan con la progresión de la metástasis ósea. Por lo tanto, este marcador se puede usar para detectar tanto la metástasis, como para medir la extensión de la enfermedad. Otros marcadores de resorción incluyen piridinolina y desoxipiridolina. Cualquier aumento en los marcadores de resorción o marcadores de metástasis en los huesos indican la necesidad de una terapia con antagonistas de BMP-ALK3 en un paciente.
Se pueden utilizar antagonistas de BMP-ALK3 en pacientes con un trastorno mineral y óseo asociado a la enfermedad renal (CKD-MBD), un amplio síndrome de trastornos metabólicos esquelético, cardiovascular y minerales interrelacionados derivados de la enfermedad renal. El CKD-MBD abarca diversas patologías esqueléticas a menudo y se refiere como osteodistrofia renal (ROD), que es preferida para el tratamiento con antagonistas de BMP-ALK3. En función de la contribución relativa de los diferentes factores patógenos, la ROD se manifiesta como diversos patrones patológicos de remodelado óseo (Hruska et al., 2008, Chronic kidney disease mineral bone disorder (CKD-MBD); en Rosen et al (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism, 7a ed. American Society for Bone and Mineral Research, Washington D.C., pp. 343-349). En un extremo del espectro se encuentra ROD con osteodistrofia urémica y bajo recambio óseo, que se caracteriza por un bajo número de sitios activos de remodelación, una formación de hueso profundamente reprimida y una resorción ósea baja. En el otro extremo se encuentra ROD con hiperparatiroidismo, alto recambio óseo y osteítis fibrosa. Dado que los antagonistas de BMP-ALK3 ejercen tanto efectos anabólicos como antirresortivos, estos agentes pueden ser útiles en pacientes en todo el espectro de la patología ROD.
Se pueden administrar antagonistas de BMP-ALK3 conjuntamente con otros agentes farmacéuticos. La administración conjunta puede llevarse a cabo mediante la administración de una única co-formulación, mediante la administración simultánea o por administración en momentos separados. Los antagonistas de BMP-ALK3 pueden ser particularmente ventajosos si se administran con otros agentes activos para los huesos. Un paciente puede beneficiarse de recibir conjuntamente el antagonista de BMP-ALK3 y tomando suplementos de calcio, vitamina D, ejercicio apropiado y/o, en algunos casos, otra medicación. Los ejemplos de otros medicamentos incluyen bifosfonatos (alendronato, ibandronato y risedronato), calcitonina, estrógenos, hormona paratiroidea y raloxifeno. Los bisfosfonatos (alendronato, ibandronato y risedronato), calcitonina, estrógenos y raloxifeno afectan al ciclo de remodelación ósea y se clasifican como medicamentos anti-resorción. El remodelado óseo consiste en dos etapas distintas: la resorción ósea y la formación ósea. Los medicamentos antirresortivos ralentizan o detienen la porción de resorción ósea del ciclo de remodelación ósea pero no retardan la porción de formación de hueso del ciclo. Como resultado, la nueva formación continúa a una velocidad mayor que la resorción ósea y la densidad ósea puede aumentar con el tiempo. La teriparatida, una forma de la hormona paratiroidea, aumenta la tasa de formación del hueso en el ciclo de remodelación ósea. El alendronato está aprobado tanto para la prevención (5 mg por día o 35 mg una vez a la semana) y el tratamiento (10 mg por día o 70 mg una vez a la semana) de la osteoporosis postmenopáusica. El alendronato reduce la pérdida de masa ósea, aumenta la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas de columna vertebral, muñeca y cadera. El alendronato también está aprobado para el tratamiento de la osteoporosis inducida por glucocorticoides en hombres y mujeres, como resultado de un uso a largo plazo de estos
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medicamentos (es decir, prednisona y cortisona) y para el tratamiento de la osteoporosis en los hombres. El alendronato y la vitamina D están aprobados para el tratamiento de la osteoporosis en mujeres posmenopáusicas (70 mg una vez a la semana más vitamina D), y para el tratamiento para mejorar la masa ósea en hombres con osteoporosis. El Ibandronato está aprobado para la prevención y tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Tomado como una pastilla una vez al mes (150 mg), el ibandronato se debe tomar en el mismo día cada mes. El Ibandronato reduce la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas de columna. El Risedronato está aprobado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Tomado diariamente (5 mg de dosis) o semanal (dosis de 35 mg o 35 mg de dosis con calcio), el risedronato reduce la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas de columna vertebral y no vertebrales. El Risedronato también está aprobado para su uso por hombres y mujeres para prevenir y/o tratar la osteoporosis inducida por glucocorticoides que resulta del uso a largo plazo de estos medicamentos (es decir, la prednisona o la cortisona). La calcitonina es una hormona natural implicada en la regulación del calcio y el metabolismo óseo. En las mujeres que llevan más de 5 años después de la menopausia, la calcitonina reduce la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea de la columna, y puede aliviar el dolor asociado con las fracturas óseas. La calcitonina reduce el riesgo de fracturas de la columna. La calcitonina está disponible en forma de inyección (50-100 UI al día) o aerosol nasal (200 UI al día). La terapia con estrógeno (TE)/terapia hormonal (TH) está aprobada para la prevención de la osteoporosis. La TE se ha demostrado que reduce la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea en la columna y la cadera, y reduce el riesgo de fracturas de cadera y vertebrales en mujeres posmenopáusicas. La TE se administra más comúnmente en la forma de una píldora o un parche cutáneo que proporciona una dosis baja de aproximadamente 0,3 mg al día o una dosis estándar de aproximadamente 0,625 mg al día y es eficaz incluso cuando se inicia después de los 70 años de edad. Cuando los estrógenos se toman solos, se puede aumentar el riesgo en las mujeres de desarrollar cáncer del revestimiento uterino (cáncer de endometrio). Para eliminar este riesgo, los profesionales médicos prescriben la hormona progestina en combinación con estrógenos (terapia de reemplazo hormonal o TH) para aquellas mujeres que tienen un útero intacto. La TE/TH alivia los síntomas de la menopausia y se ha demostrado que tiene un efecto beneficioso sobre la salud de los huesos. Los efectos secundarios pueden incluir sangrado vaginal, sensibilidad en los senos, cambios de humor y enfermedad de la vesícula biliar. El raloxifeno, 60 mg al día, está aprobado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Es a partir de una clase de medicamentos llamados moduladores selectivos del receptor estrogénico (SERM) que se han desarrollado para proporcionar efectos beneficiosos de los estrógenos sin sus desventajas potenciales. El raloxifeno aumenta la masa ósea y reduce el riesgo de fracturas de columna. No hay datos todavía disponibles para demostrar que el raloxifeno puede reducir el riesgo de fracturas de cadera y otras no vertebrales. La teriparatida, una forma de hormona paratiroidea, está aprobada para el tratamiento de la osteoporosis en mujeres posmenopáusicas y hombres que están en alto riesgo de sufrir una fractura. Este medicamento estimula la formación de hueso nuevo y aumenta significativamente la densidad mineral ósea. En las mujeres posmenopáusicas, se observó reducción de las fracturas en la columna vertebral, la cadera, los pies, las costillas y la muñeca. En los hombres, se observó reducción de las fracturas en la columna vertebral, pero no había datos suficientes para evaluar la reducción de fracturas en otros sitios. La teriparatida se administra como una autoinyección diaria durante un máximo de 24 meses.
7. Composiciones farmacéuticas
Los antagonistas de BMP-ALK3 (por ejemplo, polipéptidos de ALK3) pueden formularse con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, se puede administrar un polipéptido de ALK3 solo o como un componente de una formulación farmacéutica (composición terapéutica). Los compuestos objeto se pueden formular para su administración de cualquier manera conveniente para su uso en medicina humana o veterinaria.
La composición puede administrarse sistémicamente o localmente, como un implante o dispositivo. Cuando se administra, la composición terapéutica para uso en esta invención está, por supuesto, en una forma libre de pirógenos y fisiológicamente aceptable. Los agentes terapéuticamente útiles distintos de los antagonistas de ALK3 que pueden también opcionalmente estar incluidos en la composición como se describe anteriormente, pueden administrarse simultáneamente o secuencialmente con los compuestos en cuestión (por ejemplo, los polipéptidos de ALK3) en los métodos de la invención.
Típicamente, los antagonistas de ALK3 serán administrados parenteralmente. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden comprender uno o más polipéptidos de ALK3 en combinación con una o más soluciones acuosas o no acuosas isotónicas y estériles farmacéuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de usar, que pueden contener antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos, solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor deseado o agentes de suspensión o espesantes. Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden ser empleados en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como el oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de materiales de revestimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
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Además, la composición puede encapsularse o inyectarse en una forma para la entrega a un sitio de tejido diana (por ejemplo, el hueso). En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención pueden incluir una matriz capaz de administrar uno o más compuestos terapéuticos (por ejemplo, los polipéptidos de ALK3) a un sitio de tejido diana (por ejemplo, el hueso), proporcionando una estructura para el desarrollo del tejido y óptimamente capaz de ser reabsorbido en el cuerpo. Por ejemplo, la matriz puede proporcionar la liberación lenta de los polipéptidos de ALK3. Tales matrices pueden estar formadas por materiales actualmente en uso para otras aplicaciones médicas implantadas.
La elección del material de la matriz se basa en la biocompatibilidad, la biodegradabilidad, las propiedades mecánicas, los aspectos cosméticos y las propiedades de la interfaz. La aplicación particular de las composiciones en cuestión definirán la formulación apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser biodegradables y químicamente definidas por sulfato cálcico, fosfato tricálcico, hidroxiapatito, ácido poliláctico y polianhídridos. Otros materiales potenciales son biodegradables y biológicamente bien definidos, tales como el colágeno óseo o dérmico. Otras matrices están compuestas de proteínas puras o componentes de matriz extracelular. Otras matrices potenciales son no biodegradables y químicamente definidas, tales como hidroxiapatito sinterizado, biovidrio, aluminatos u otras cerámicas. Las matrices pueden estar compuestas de combinaciones de cualquiera de los tipos antes mencionados de material, tales como ácido poliláctico e hidroxiapatito o colágeno y fosfato tricálcico. Los materiales biocerámicos pueden alterarse en su composición, tal como en calcio-aluminatofosfato y el procesamiento para alterar el tamaño de poro, el tamaño de partícula, la forma de la partícula y la biodegradabilidad.
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se pueden administrar por vía oral, por ejemplo, en forma de cápsulas, sellos, píldoras, comprimidos, pastillas (usando una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto), polvos, gránulos, o como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia) y/o como lavados bucales y similares, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada de un agente como el ingrediente activo. El agente también se puede administrar como un bolo, electuario o pasta.
En las formas de dosificación sólidas para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), uno o más compuestos terapéuticos de la presente invención se pueden mezclar con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato dicálcico, y/o cualquiera de los siguientes: (1) cargas o extendedores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico;
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aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o acacia; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio; (5) solución de agentes retardantes, tales como parafina; (6) aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario;
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agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio, y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes tamponantes. Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Las formas de dosificación líquidas para la administración oral incluyen emulsiones farmacéuticamente aceptables, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, y elixires. Además del ingrediente activo, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica, tales como agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurilo, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y agentes conservantes.
Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados, sorbitol de polioxietileno y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto y mezclas de los mismos.
Las composiciones de la invención también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos se puede asegurar mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser provocada por la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
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Se entiende que el régimen de dosificación será determinado por el médico asistente considerando diversos factores que modifican la acción de los compuestos objeto de la invención (por ejemplo, los polipéptidos de ALK3). Los diversos factores incluyen, pero no se limitan a, la cantidad de peso del hueso que se desea formar, el grado de la pérdida de densidad ósea, el sitio del daño del hueso, el estado del hueso dañado, la edad del paciente, el sexo y la dieta, la gravedad de cualquier enfermedad que pueda estar contribuyendo a la pérdida ósea, el tiempo de administración y otros factores clínicos. Opcionalmente, la dosificación puede variar con el tipo de matriz usada en la reconstitución y los tipos de compuestos en la composición. La adición de otros factores de crecimiento conocidos a la composición final, también puede afectar a la dosificación. El progreso puede monitorizarse mediante la evaluación periódica del crecimiento y/o la reparación del hueso, por ejemplo, los rayos X (incluyendo DEXA), determinaciones histomorfométricas y el marcaje de tetraciclina.
Puede usarse terapia génica para la producción in vivo de los polipéptidos de ALK3. Dicha terapia lograría su efecto terapéutico mediante la introducción de las secuencias de los polinucleótidos de ALK3 en células o tejidos que tienen los trastornos enumerados anteriormente. La administración de las secuencias de los polinucleótidos de ALK3 se puede lograr utilizando un vector de expresión recombinante, tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. Se prefiere, para la administración terapéutica de las secuencias de polinucleótidos de ALK3, el uso de liposomas dirigidos.
Varios vectores víricos que pueden utilizarse para la terapia génica como se enseña en este documento incluyen adenovirus, virus del herpes, vaccinia, o, preferiblemente, un virus de ARN tal como un retrovirus. Preferiblemente, el vector retroviral es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Los ejemplos de vectores retrovirales en los que un solo gen ajeno se puede insertar incluyen, pero no están limitados a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV) y el virus del sarcoma de Rous (RSV). Una serie de vectores retrovirales adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de modo que las células transducidas puedan ser identificadas y generadas. Los vectores retrovirales pueden hacerse dirigidos específicamente uniendo, por ejemplo, un azúcar, un glicolípido o una proteína. La diana preferida se logra usando un anticuerpo. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden insertar secuencias de polinucleótidos específicas en el genoma retroviral o unirse a una envuelta viral para permitir la administración específica de la diana del vector retroviral que contiene el polinucleótido de ALK3. El vector está dirigido al hueso o al cartílago.
Alternativamente, pueden ser directamente transfectadas células de cultivo de tejidos con plásmidos que codifican los genes estructurales retrovirales gag, pol y env, mediante transfección con fosfato de calcio convencional. Estas células se transfectaron entonces con el plásmido vector que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retroviral en el medio de cultivo.
Otro sistema de administración dirigida para polinucleótidos de ALK3 es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal preferido de esta invención es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de suministro in vitro e in vivo. Pueden encapsularse ARN, ADN y viriones intactos dentro del interior acuoso y administrarse a las células en una forma biológicamente activa (véase, por ejemplo, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Los métodos para la transferencia de genes eficiente usando un vehículo de liposoma, son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Mannino, et al, Biotechniques, 6: 682, 1988. La composición del liposoma es normalmente una combinación de fosfolípidos, normalmente en combinación con esteroides, especialmente el colesterol. También se pueden utilizar otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la resistencia iónica y la presencia de cationes divalentes.
Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina. El reconocimiento de liposomas también es posible en base a, por ejemplo, la especificidad del órgano, la especificidad de la célula y la especificidad del orgánulo y se conoce en la técnica.
Ejemplificación
La invención se describe ahora en general; se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen meramente para fines de ilustración de ciertas realizaciones de la presente invención y no pretenden limitar la invención.
Ejemplo 1. Generación de proteínas de fusión de ALK3-Fc
La secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos correspondiente para el ALK3 humano nativo se muestran en las figuras 1 y 2. Los solicitantes diseñaron una proteína de fusión de ALK3-hFc en la que el dominio extracelular (restos 24-152) del ALK3 humano (Figuras 3 y 4) se fusionan a través del extremo C-terminal con un dominio Fc humano (Figuras 5 y 6) a través de un enlazador mínimo (compuesto de los restos de aminoácidos TGGG) para producir la proteína que se muestra en la Figura 7. Se consideraron las siguientes tres secuencias líder:
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Nativa: MPQLYIYIRLLGAYLFIISRVQG (SEQ ID NO: 8)
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Activador de plasminógeno tisular (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 9)
(iii) Melitina de miel de abeja (HBML): MKFLVNVALVFMWYISYIYA (SEQ ID NO: 10)
La forma seleccionada de hALK3(24-152)-hFc (SEQ ID NO: 11) emplea el líder TPA y tiene la secuencia de aminoácidos sin procesar que se muestra en la Figura 8. Una secuencia de nucleótidos sentido que codifica esta proteína de fusión y la secuencia antisentido correspondiente se indican en la Figura 9. A continuación se muestra una secuencia de nucleótidos sentido alternativa que codifica hALK3(24-152)-hFc, que incorpora una sustitución C → T en la posición 1137 (subrayado) que no altera la secuencia de aminoácidos.
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Una variante de hALK3(24-152)-Fc con el líder TPA y con Fc murina sustituida para Fc humana se muestra en la Figura 10. Una secuencia de nucleótidos sentido que codifica esta variante y su secuencia antisentido correspondiente se indican en la Figura 11. Los solicitantes construyeron una forma de hALK3(24-152)-mFc que tiene una asparagina en la posición 71 (posición 70 en la secuencia nativa ALK3 ECD). La proteína se expresó en 15 líneas de células CHO y la secuencia N-terminal reveló una especie primaria con un bloque N-terminal, lo que indica un comienzo en el resto de la glutamina (Q) nativa, en consonancia con la proteína de SEQ ID NO: 7, y una única
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Como puede observarse, los truncamientos C-terminales que se evaluaron muestran una afinidad de unión similar o mayor por BMP2/BMP4 en comparación con ALK3 ECD de cadena completa, con una reducción general de la unión a BMP6/BMP-7, aunque ALK3CΔ12 conserva la unión a BMP-7 a una afinidad similar a los ALK3 ECD de cadena completa. Por el contrario, los truncamientos N-terminales tienden a reducir la unión a BMP2, abolir la unión a BMP4 y muestran varía efectos sobre la unión a BMP6/BMP7. Curiosamente, las variantes de ALK3NΔ6CΔ6 doblemente truncadas muestran mayor afinidad por BMP2/BMP4 en comparación con los ALK3 ECD de longitud completa, en combinación con la unión indetectable a BMP6/BMP7. Las moléculas con mayor selectividad para los objetivos deseados, BMP2 y BMP4, son útiles porque tendrán menos efectos "fuera del objetivo" en los pacientes. La secuenciación del extremo N-terminal mostró que el ácido nucleico que codifica un truncamiento de seis aminoácidos en el extremo N-terminal, cuando se expresa en un cultivo celular, daba lugar a una población de polipéptidos que tienen el truncamiento de seis aminoácidos y una población de polipéptidos que tienen un truncamiento de siete aminoácidos. Tomados en conjunto, estos demuestran que los polipéptidos de hALK3-HFC que contienen hasta un truncamiento de siete aminoácidos en el extremo N-terminal y hasta un truncamiento de doce aminoácidos en el extremo C-terminal conservan una actividad útil y demuestran la reducción deseable y sorprendente en la unión a ligandos fuera de la diana. Por lo tanto, se puede usar un polipéptido de ALK3 que comprende al menos los aminoácidos de 8 a 117 de SEQ ID NO: 3 para los fines descritos en el presente documento.
Las propiedades de unión a ligandos se utilizaron para comparar la calidad de la proteína hALK3(24-152)-hFc derivada de células CHO con las derivadas de células HEK 293. Según lo determinado por la metodología Biacore™, la afinidad (Kd) de BMP2 para hALK3(24-152)-hFc no difirió dependiendo de la fuente de la proteína de fusión; sin embargo, el porcentaje de proteína activa generada por las células CHO fue más alta que la de las células HEK 293 en función de sus respectivos valores Rmax. Rmax es una medida de la calidad de la proteína igual a (PMA/PML) X RL X SM, donde PMA es el peso molecular del analito, PML es el peso molecular del ligando, RL en el nivel de inmovilización en unidades de respuesta, y SM es la estequiometría molar. El análisis correspondiente de la unión de BMP4 reveló que la proteína derivada de células CHO exhibía una mayor afinidad por BMP4 que la que exhibía de las células HEK 293 (KD de 314 pM vs. 1020 pM, respectivamente) y el valor de Rmax para la proteína generada por las células CHO fue tres veces la de la proteína a partir de células HEK 293, lo que indica de nuevo un porcentaje más alto de proteína activa. Por lo tanto, los beneficios inesperados de las células CHO como la fuente de la proteína hALK3(24-152)-hFc incluyen una mayor afinidad de unión de la proteína a BMP4 y una mayor biodisponibilidad predicha para dar como resultado una calidad más alta de la proteína (valor Rmax).
Ejemplo 3. hALK3-mFC mejora el estado óseo en ratones
Los solicitantes investigaron la capacidad de una versión de ALK3-MFC para mejorar el estado de los huesos en ratones. Fueron tratados ratones hembra C57BL/6 de doce semanas de edad (n = 8 por grupo) con hALK3(24-152)mFc, 10 mg/kg, o vehículo (solución salina tamponada con Tris) por inyección intraperitoneal dos veces por semana para un total de seis semanas. En comparación con el vehículo, hALK3(24-152)-mFc aumentó significativamente la densidad ósea de todo el cuerpo, según lo determinado por absorciometría de energía dual de rayos X (DEXA), el día 31 y se mantuvo este efecto a través de la finalización del estudio en el día 42 (Figura 12). Un efecto similar del tratamiento de hALK3(24-152)-mFc en la densidad ósea se observó para el análisis localizado de vértebras lumbares por DEXA en estos mismos puntos de tiempo (Figura 13). Además, las mediciones de alta resolución de la diáfisis tibial y la tibia proximal se llevaron a cabo mediante tomografía micro-computerizada (micro-CT) para determinar el efecto de hALK3(24-152)-mFc sobre el hueso cortical y el hueso trabecular, respectivamente. En comparación con el vehículo, el tratamiento de hALK3(24-152)-mFc aumentó significativamente: i) el espesor del
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El hueso fue preparado para la histomorfometría como sigue. En la necropsia, el fémur derecho se separó, y la cuarta parte distal del fémur se sometió a una preparación histológica que consistía en la deshidratación, la infiltración de metacrilato de metilo, y la incrustación en metacrilato de metilo. Un micrótomo rotatorio se utilizó para obtener conjuntos de secciones frontales en espesores de 4 y 8 micras. Las secciones más finas se tiñeron con tricrómico de Goldner y se utilizaron para el análisis de parámetros estáticos, mientras que las secciones más gruesas se montaron sin teñir y se utilizaron para el análisis de los parámetros dinámicos. La histomorfometría se realizó en tratamiento ciego con un microscopio de luz/epifluorescencia Eclipse E4000 de Nikon conectado a un subsistema de vídeo corriente con software de análisis de imágenes OsteoMeasure.
El análisis histomorfométrico del fémur distal reveló tanto efectos anabólicos como antirresortivos de ALK3-Fc. En comparación con el vehículo, mALK3(24-152)-mFc aumentó significativamente el volumen de hueso en los tres puntos de tiempo hasta en un 90% (Figura 29). Es importante destacar que mALK3(24-152)-mFc aumentó la tasa de formación del hueso en tanto como un 120% (Figura 30) y la superficie de mineralización ósea en tanto como un 115% (Figura 31). Estos últimos parámetros son considerados indicativos del crecimiento óseo anabólico, aunque marcadores adicionales de efectos anabólicos – la superficie de los osteoblastos y la superficie de los osteoides mostraron aumentos más modestos o insignificantes. El análisis histomorfométrico también proporcionó una evidencia de los efectos antirresortivos temporales, como que el mALK3(24-152)-mFc redujo la superficie de los osteoclastos significativamente el día 28 solamente (Figura 32) y se observó un efecto similar sobre la superficie erosionada.
También se investigaron los efectos del tratamiento con mALK3(24-152)-mFc sobre los biomarcadores séricos del estado de los huesos. El RANKL (activador del receptor del ligando del factor-B nuclear) es producido por los osteoblastos y es un activador clave de la diferenciación de los osteoclastos, mientras que la osteoprotegerina (OPG) es un inhibidor endógeno de la señalización de RANKL. Por lo tanto, la relación RANKL/OPG es un determinante importante de la actividad osteoclástica, la masa ósea y la calidad ósea (Boyce et al, 2008, Arch Biochem Biophys 473: 139-146). En el presente experimento, los niveles séricos de RANKL y OPG se midieron con los productos de Millipore (MBN2A-41K y 41K-MBN-1OPG) que incorporan la tecnología Luminex xMAP®. El tratamiento con mALK3(24-152)-mFc redujo significativamente los niveles de RANKL en suero en los tres puntos de tiempo (Figura 33) y aumentó significativamente los niveles de OPG en suero a los 28 y 42 días (Figura 34) en comparación con el vehículo. Estos resultados indican que el tratamiento con mALK3(24-152)-mFc estimula la formación de hueso, en parte, a través de una acción antirresortiva.
Ejemplo 7. Efectos de mALK3-mFC en la expresión génica de esclerostina en ratones
La proteína esclerostina es un regulador negativo clave en la formación del hueso y la interferencia con la señalización de esclerostina se ha publicado que ejerce efectos anabólicos sobre el hueso in vivo (Li et al, 2009, J Bone Miner Res. 24: 578-588). Por lo tanto, los solicitantes investigaron si el tratamiento con mALK3(24-152)-mFc in vivo alteraba la expresión de los genes de esclerostina en el hueso y, por lo tanto, si una reducción en los niveles de esclerostina podría mediar potencialmente algunos de los efectos reconstructivos óseos de ALK3-Fc. Fueron tratados ratones hembra C57BL/6 de doce semanas de edad con mALK3(24-152)-mFc o vehículo (PBS) mediante inyección intraperitoneal dos veces por semana. A las cohortes de ratones se les practicó la autopsia después de 2, 7, 14, y 28 días de tratamiento lo que permitió la recogida bilateral de los fémures y de las tibias, que se separaron y se limpiaron de cualquier tejido de músculo residual o conectivo.
La expresión de genes de esclerostina se analizó como sigue. Los huesos fueron recortados para dejar al descubierto el eje de la médula interior, y las células de la médula se lavaron con solución salina estéril usando una aguja del calibre 21 unida a una jeringa de 3 ml. Los fémures y las tibias de cada ratón fueron pulverizados juntos, y se extrajo el ARN a partir del polvo resultante con un kit RiboPure (Ambion) según las instrucciones del fabricante. La integridad del ARN en las muestras de hueso se confirmó con nanochips de ARN (Agilent Technologies) pasados en un Bioanalizador 2100 de Agilent Technologies de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se transcribió inversamente usando reactivos TaqMan RT (Applied Biosystems) y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) con la sonda de esclerostina/cebadores y control endógeno de ARNr 18S eucariota (ambos de Applied Biosystems). Las amplificaciones se realizaron con un sistema 7300 de Applied Biosystems, y los resultados fueron analizados utilizando el método 2-ΔΔCt .
En comparación con el vehículo, el tratamiento con mALK3(24-152)-mFc redujo los niveles óseos del ARNm de esclerostina significativamente en tres de los cuatro puntos de tiempo investigados (Figura 35). Este hallazgo indica que la reducción de la expresión de esclerostina puede contribuir a los efectos anabólicos y/o antirresortivos de mALK3(24-152)-mFc sobre el hueso.
Ejemplo 8. Efecto de hALK3-hFC en el estado óseo en ratones
Los solicitantes investigaron los efectos de la construcción humana hALK3(24-152)-hFc en el estado óseo en ratones. Fueron tratados ratones hembra C57BL/6 de doce semanas de edad (n = 6 por grupo) con hALK3(24-152)hFc, 10 mg/kg, o vehículo (solución salina tamponada con Tris) por inyección intraperitoneal dos veces por semana durante una total de 6 semanas. En el transcurso del experimento, el volumen de hueso trabecular disminuyó casi un 20% en los controles tratados con vehículo, pero aumentó en más del 80% con el tratamiento de hALK3(24-152)
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Se aislaron las siguientes especies de proteína:
(1)
La hALK3(24-146)-hFc se muestra a continuación (SEQ ID NO: 22), comenzando con una glutamina (que tiende a ser bloqueada para la secuenciación N-terminal por degradación de Edman).
(2)
La secuencia de hALK3(GA,24-146)-hFc mostrada a continuación (SEQ ID NO: 23), que retiene una glicinaalanina inicial de la secuencia líder.
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E. Un ácido nucleico que codifica hALK3(30-146)-hFc, mostrada a continuación (SEQ ID NO: 32), se expresó en células CHO:
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Las siguientes especies de proteínas se pueden aislar:
(1) La hALK3(GA,30-140)-hFc, mostrada a continuación (SEQ ID NO: 38), que retiene una glicina-alanina inicial de la secuencia líder.
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Aunque se han discutido realizaciones específicas de la materia objeto, la anterior memoria descriptiva es ilustrativa y no restrictiva. Muchas variaciones serán evidentes para los expertos en la técnica tras la revisión de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones siguientes. El alcance completo de la invención debe ser determinado por referencia a las reivindicaciones y a la memoria descriptiva.

Claims (1)

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