KR20230148959A - 플라젤린 및 면역글로불린 Fc 융합 단백질을 포함하는 대장염 치료용 조성물 - Google Patents

플라젤린 및 면역글로불린 Fc 융합 단백질을 포함하는 대장염 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 플라젤린 및 면역글로불린 Fc 융합 단백질을 포함하는 대장염 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 플라젤린 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 대장염 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 고지방식이 투여에 의해 유도된 대장염 동물모델에서 야생형 플라젤린과 비교해 현저히 향상된 예방 및 치료 효과를 나타내므로, 대장염 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

플라젤린 및 면역글로불린 Fc 융합 단백질을 포함하는 대장염 치료용 조성물{Composition for treating colitis comprising fusion protein of flagellin and immunoglobulin Fc region}
본 발명은 플라젤린 및 면역글로불린 Fc 융합 단백질을 포함하는 대장염 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 플라젤린 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 대장염 치료용 조성물에 관한 것이다.
대장염은 대장에 염증이 발생하는 질환으로, 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease; IBD), 과민성 대장염 증후군((irritable bowel syndrome, IBS)등을 포함한다. 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease; IBD) 중 대표적인 질환인 궤양성 대장염(ulcerative colitis; UC)과 크론병(Crohn's disease; CD)은 아직 원인이 명확히 밝혀져 있지 않고 있으며, 복통과 더불어 심한 만성 설사와 혈성 설사를 일으킬 수 있으며, 완치가 힘들고 호전과 악화를 반복하는 특성이 있다. 궤양성 대장염은 대장의 점막에 진무름(미란)이나 궤양이 연속적으로 형성되는 질환으로, 혈변, 점혈변, 설사, 복통이 일어나고, 중증인 경우에는 발열, 체중감소, 빈혈 등의 전신성의 증상이 나타난다. 또한, 궤양성 대장염은 위장관 어느 부위에서도 발생할 수 있다. 크론병은 입에서 항문에 이르는 소화관의 임의의 부위에 궤양 등의 병변이 비연속적으로 발생하는 질환으로서, 복통, 설사, 혈변과 더불어, 중증의 경우에는 발열, 하혈, 체중감소, 전신권태감, 빈혈 등의 증상이 나타난다. 궤양성 대장염과 크론병은 병변과 염증 증상에 있어서 차이가 있지만 여러 면에서 유사한 양상을 보이기 때문에 두 질환의 구분이 서로 명확하지 않은 경우가 흔하다.
종래, 궤양성 대장염 및 크론병의 발생율은 서양인에게 높다고 알려져 있었지만, 최근, 식습관 등의 생활습관의 변화로 인해 우리나라 등 동양에서도 환자수가 급증하고 있다. 그렇지만, 원인이 불분명한 이유도 있어 근본적 치료법은 확립되어 있지 않다. 이 때문에 완전한 치료를 목표로 하는 것이 아니라, 증상을 완해시키고, 이러한 상태를 가능한 한 장기간 유지하는 약제가 사용되고 있는 실정이다. 이러한 대증요법을 위한 약제로서, 주로 아미노살리실산제제, 부신피질 스테로이드제, 면역억제제 등이 사용되지만, 다양한 부작용이 보고되고 있다. 예를 들어, 아미노살리실산제제로서 자주 사용되는 살라조설파피리딘은 구역질, 구토, 식욕부진, 발진, 두통, 간장해, 백혈구 감소, 이상 적혈구, 단백뇨, 설사 등의 부작용이 보고되고 있다. 또한 부신피질스테로이드제는 일반적으로는 프레드니솔론의 경구투여, 관장, 좌약, 정맥 주사 등으로 사용되지만, 위궤양이나 장기사용에 의한 대퇴골두 괴사 등 부작용이 강하다. 그러나 투약의 중단은 증상을 재발시키기 때문에, 이들 약제는 계속적으로 사용하지 않을 수 없다. 따라서, 효과가 우수하면서도, 안전하고 부작용을 일으키지 않는 궤양성 대장염, 크론병 등의 장질환 치료제의 개발이 요구되고 있다. 과민성 대장염 증후군((irritable bowel syndrome, IBS)도 마찬가지로 그 원인이 명확하지 않은 만성 복부 질환이다. 현재, IBS의 근본적인 치료제는 존재하지 않으며, 각 타입의 증상 경감을 목적으로 한 대증요법이 행해지고 있다. 예를 들어, 하리형 IBS에 대해서는 평활근의 수축을 억제하는 진경작용을 갖는 항콜린제가 사용되며, 변비형 IBS에는 염류 하제, 대체형 IBS에는 약제로 조절하기 곤란하고, 기본적으로 소화관 운동기능 개선제가 사용되고 있다.
이러한 대장염을 치료하기 위하여, 부작용이 적은 천연물로부터 대장염을 치료할 수 있는 조성물을 개발하기 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 예를 들어, 한국등록특허 제1466308호에는 지모 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장염 치료용 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 1526467호에는 산수유 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장염 치료용 조성물이 개시되어 있다.
그러나, 이러한 천연물 유래의 추출물들은 대장염의 예방 또는 치료효과가 만족할 만한 수준은 아니라는 점에서 한계가 있다.
한편, 플라젤린은 박테리아 편모의 채찍 줄기 모양의 필라멘트로 조립되는 구조 단백질로, 세포 표면에서 연장되어 박테리아가 움직일 수 있도록 기능한다. 플라젤린은 병원성 세균의 병원성 박테리아가 독성 인자로 작용하여 숙주 세포 내로 침투하고 침입하는 것을 촉진한다. 플라젤린은 박테리아에서 독점적으로 발견되며 편모성 박테리아(flagellated bacteria)에서 가장 풍부한 단백질 중 하나이기 때문에 플라젤린은 숙주 면역 감시의 주요 대상이 된다. 박테리아의 침입시, 플라젤린은 숙주에서 Toll-like receptor 5 (TLR5)와 NAIP5/NLRC4에 의해 검출되고 숙주에서 병원균의 즉각적인 제거에 기여하는 선천성 면역을 활성화시킨다.
플라젤린은 편모성-병원성 박테리아에 대한 첫 번째 방어선 역할을 하기 때문에 백신 담체 단백질 또는 백신 보조제 개발의 대상으로서 관심이 되어왔다.
하지만, 플라젤린과 면역글로불린 Fc 융합단백질의 대장염 치료 효과, 보다 구체적으로는 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 대장염 치료효과에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자는 플라젤린의 기능이 향상된 단백질을 개발하기 위해 연구를 거듭한 결과, 플라젤린과 면역글로불린 Fc가 융합된 새로운 형태의 융합단백질이 야생형(wild-type) 플라젤린, 공지된 플라젤린 단편 등과 비교하여 현저히 우수한 TLR5 활성화능을 나타낸다는 것을 발견하였다.
특히, 면역글로불린 Fc가 유발하는 항체 의존성 세포-매개 세포독성(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 또는 보체 의존성 세포 독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 회피하기 위해 사람 IgG4의 Fc를 이용하여 플라젤린 융합단백질을 제작할 경우, Fab 암(arm) 교환에 따라 1/2 형태의 항체 분자가 형성되어 플라젤린의 TLR5 활성화능이 현격히 저하되는 것을 확인하였고 인간 IgG4 Fc의 mutant를 이용하여 이와 같은 문제를 해결함과 동시에 야생형 플라젤린 대비 현저히 향상된 대장염 치료 효과를 나타내는 융합 단백질을 제공할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 대장염 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 대장염 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 플라젤린은 편모성 세균이 감염된 경우에 감염된 숙주 내에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 보다 구체적으로 인체의 세포막 표면에 존재하는 톨-유사수용체 5(TLR5; Toll like receptor 5)는 상기 플라젤린과 상호작용을 통하여 세포 내 신호 전달을 유발하고, 이를 통하여 전사인자인 NF-kB의 발현이 증가되어 선천성 면역신호 활성화를 유도할 뿐만 아니라, 획득 면역 반응을 조절할 수 있다.
플라젤린 단백질은 예를 들어, 미국 특허 제6,585,980호, 제6,130,082호; 5,888,810; 5,618,533; 4,886,748 및 미국 특허 공개 번호 US2003/0044429 A1; 및 Donnelly등 (2002) J. Biol. Chem. 43:4045 등을 통해서 잘 공지되어 있다. 대부분의 그람-음성 박테리아는 편모를 발현하는데, 이는 운동성을 제공하는 표면 구조이다. 편모는 기초 몸체, 필라멘트 및 이 둘을 연결하는 갈고리로 구성된다. 필라멘트는 단일 단백질인 플라젤린의 긴 중합체로 이루어지며 끝에 작은 캡 단백질이 형성되어 있다.
플라젤린의 중합은 N-및 C-말단에서 보존된 영역에 의해 매개되는 반면, 플라젤린 단백질의 중간에 위치한 초가변영역(hypervariable region)은 종간의 서열 및 길이가 매우 다양하다.
본 발명에서 상기 플라젤린은 임의의 적합한 박테리아로부터 유래된 플라젤린일 수 있다. 당업계에서는 다수의 플라젤린 유전자가 클로닝되고 서열화되어 있어 이들이 참고될 수도 있다. 본 발명에서 상기 플라젤린의 비제한적인 공급원으로는 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 세라티아(Serratia) 속, 시겔라(Shigella) 속, 트레포네마(Treponema) 속, 레기오넬라(Legionella) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 바르토넬라(Bartonella) 속, 프로튜스(Proteus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 여시니아(Yersinia) 속, 캄필로박터(Campylobacter) 속, 로세부리아(Roseburia) 속 또는 마리노박터(Marinobacter) 속 미생물을 들 수 있으며, 바람직하게는 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속 또는 비브리오(Vibrio) 속 미생물을 들 수 있다.
더 바람직하게는, 본 발명에서 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 세라티아 마세센스(Serratia marcesens), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 보렐리아 버그도페레이(Borrelia burgdorferei), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바르토넬라 클라리제이애(Bartonella clarridgeiae), 프로튜스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에스테리키아 콜라이(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 여시니아 페스티스(Yersinia pestis), 캄필로박터(Campylobacter spp), 로세부리아(Roseburia spp) 또는 마리노박터(Marinobacter spp) 유래의 플라젤린일 수 있으며,
보다 더 바람직하게는, 본 발명에서 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans) 유래의 플라젤린일 수 있으며,
가장 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 플라젤린일 수 있다.
플라젤린의 N-말단 및 C-말단 불변 영역은 당해 기술 분야에서 그 특징이 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Mimori-Kiyosue et al., (1997) J. Mol. 바이롤. 270: 222-237; Iino et al., (1977) Ann. Genet. 11: 161-182; 및 Schoenhals 등 (1993) J. Bacteriol. 175: 5395-5402을 참고할 수 있다. 당업자에 의해 잘 이해되는 바와 같이, 불변 영역의 크기는 플라젤린 단백질의 공급원에 따라 다소 변할 수 있다. 일반적으로, N-말단 불변 도메인은 단백질의 약 170 개 또는 180 개의 N-말단 아미노산을 포함하는 반면, C-말단 불변 도메인은 전형적으로 약 85 내지 100 개의 C-말단 아미노산을 포함한다. 중심의 초가변영역은 박테리아 사이의 크기와 순서에 따라 상당히 다양하며, 분자 질량의 차이 대부분이 상기 초가변영역에 의해서 설명될 수 있다. 다양한 박테리아로부터 유래된 플라젤린 단백질의 N- 및 C-말단 불변 영역은 공지되어 있고, 아직 공지되지 않은 박테리아 유래의 플라젤린 또한 통상의 기술자가 당업계에 공지된 테크닉을 이용하여 플라젤린 단량체의 결정 구조를 쉽게 규명할 수 있다.
본 발명에서 "플라젤린", "플라젤린 N-말단 불변 영역" 및 "플라젤린 C- 말단 불변 영역"이란 용어는 상기 예를 든 박테리아 중 임의의 것으로부터 유래한 플라젤린 활성 단편 및 변이체를 포함한다. 또한, 야생형(wild-type)의 플라젤린 또는 플라젤린의 일 부분은 안전성 및/또는 면역 반응을 증가시키기 위해 및/또는 클로닝 절차 또는 다른 실험실 조작의 결과로서 변형될 수 있으며 이러한 변형들(또는 변이체) 또한 본원발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서, 상기 플라젤린은 전장(full-length) 플레젤린을 포함하거나, 또는 이의 활성 단편(active fragment)을 포함할 수 있다. 또한, "플라젤린", "플라젤린 N-말단 불변 영역" 및 "플라젤린 C- 말단 불변 영역"등의 용어는 자연 발생 아미노산 서열을 포함하거나, 각각 자연적으로 발생하는 플라젤린, 플라젤린 N- 말단 불변 영역 또는 플라젤린 C- 말단 불변 영역의 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나 유사한 아미노산 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에서 플라젤린, 플라젤린 N-말단 불변 영역, 플라젤린 C-말단 불변 영역 또는 플라젤린의 다른 어떤 부분의 "활성 단편"은 적어도 약 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250 또는 300개 이상의 인접 아미노산 및/또는 인접한 아미노산의 약 300, 250, 200, 150, 125, 100 또는 75 개 미만의 아미노산을 포함하며, 하한이 상한보다 작은 한 이들의 조합도 포함할 수 있다. 상기 활성 단편은 숙주 내에서 TLR5 경로를 활성화시키는 작용을 나타낼 수 있는 단편을 의미할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 활성 단편은 전장 플라젤린의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 활성 단편은 TLR5 경로 활성능을 나타내는 플라젤린의 적어도 한 부분을 의미하는 것일 수 있다. 상기 “적어도 한 부분”이란 플라젤린의 도메인 0, 1, 2 및 3에서 TLR5 경로 활성능을 나타내는 부분을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 활성 단편이란 전장 플라젤린에서 초가변영역(hypervariable region)이 제거된 것일 수 있다. 상기 초가변영역이란 플라젤린의 유래가 되는 박테리아의 종류에 따라서 달라질 수 있으며, 특정 플라젤린의 전체 서열 중 초가변영역에 해당하는 서열은 통상의 기술자가 용이하게 파악하여 제거할 수 있다. 예를 들어, N-말단 도메인 0, 1, 2; 도메인 3; 및 C-말단 도메인 2, 1, 0을 포함하는 전장 플라젤린의 경우 도메인 3, 또는 도메인 2 및 3이 초가변영역일 수 있으며, N-말단 도메인 0, 1; 도메인 2; C-말단 도메인 1, 0을 포함하는 전장 플라젤린의 경우 도메인 2가 초가변영역일 수 있다. 또는, 초가변영역이 포함되지 않은 형태의 플라젤린의 경우(예를 들어, 많은 그람-양성균 유래의 플라젤린은 초가변영역이 포함되지 않을 수 있다.)에는 플라젤린 단백질의 접힘(folding)이 일어나는 힌지(hinge) 영역의 서열이 일부 제거된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “초가변영역”은 프로펠러(propeller) 도메인 또는 부위(region), 힌지(hinge), 초가변부위, 가변(variable) 도메인 또는 부위 등으로 표현될 수도 있다.
본 발명에서, 상기 초가변영역에 제거되었다는 것은 초가변영역에 해당되는 도메인 전체가 제거된 것일 수 있으며, 또는 초가변영역의 서열 중 일부가 제거된 것일 수도 있다.
본 발명에서, 상기 활성 단편이란 야생형 플라젤린의 초가변영역이 제거되고, 제거된 초가변영역에 인공의 서열(즉, 인공서열의 힌지 또는 링커)이 삽입된 형태의 플라젤린일 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 상기 플라젤린 단편은 야생형(wild type) 플라젤린의 C-말단 도메인 0, C-말단 도메인 1, C-말단 도메인 2, N-말단 도메인 2, N-말단 도메인 1, N-말단 도메인 0 및 상기 각 도메인들과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내는 부분(region)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하면서 TLR5 경로 활성능을 나타내는 단편을 의미할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 플라젤린의 활성 단편은 전장 플라젤린의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명은 또한 야생형 플라젤린의 전장 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에서 변이체란 야생형의 플라젤린 또는 이의 단편 단백질의 일부 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성(즉, TLR5 경로 활성화능)을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
경우에 따라서, 본 발명의 상기 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)된 전장 플라젤린 또는 이의 단편일 수도 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 플라젤린 또는 이의 단편의 변이체는 전장 플라젤린 또는 이의 단편의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 이의 단편과 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 이의 단편과 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 다른 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 플라젤린은 하나 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 상기 항원의 비제한적인 예시로는 S. pneumoniae PspA1 항원, S. pneumoniae PspA2 항원, S. pneumoniae PspA3 항원, S. pneumoniae PspA4 항원, S. pneumoniae PspA5 항원 및/또는 S. pneumoniae PspA6 항원을 들 수 있다. 또는, 예를 들어, 상기 플라젤린은 하나 이상의 면역 조절성 물질이 결합된 융합 단백질의 형태일 수 있다. 상기 면역 조절성 물질은 당업계에서 면역반응을 증가시키는 것으로 알려진 것이라면 제한없이 포함될 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로는 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터페론-ω, 인터페론-τ, 인터류킨-1α, 인터류킨-1β, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-4, 인터류킨-5, 인터류킨-6, 인터류킨-7, 인터류킨-8, 인터류킨-9, 인터류킨-10, 인터류킨-11, 인터류킨-12, 인터류킨-13, 인터류킨-14, 인터류킨-18, B세포 성장 인자, CD40 리간드, TNF- α, TNF- β, CCL25, CCL28 또는 이의 활성 단편 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “퍼센트(%) 서열 상동성”은 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 기준 폴리펩타이드 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의한다. 퍼센트 아미노산 상동성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법, 예를 들어 참고문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 외, eds., 1987)]에 기재된 방법, 및 블라스트(BLAST), 블라스트-2, 얼라인(ALIGN) 또는 메갈라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본 명세서에서의 목적을 위해, 주어진 아미노산 서열 B와 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 퍼센트(%) 아미노산 서열 상동성은 다음과 같이 계산된다: 분율(fraction) X/Y의 100 배, 여기서 X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일하게 일치하는 아미노산 잔기 점수의 수이며, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 퍼센트(%) 아미노산 서열 상동성은 B 대 A의 퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성과 같지 않음을 이해할 것이다.
특정 실시양태에서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 IgG4 Fc는 IgG4의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역 1(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에서 상기 IgG4 Fc는 야생형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함한 확장된 IgG4 Fc일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
한편, 천연형 IgG Fc 서열을 이용한 단백질 융합체를 생산시 Fc에 의한 이펙터 기능을 최소화하기 위한 노력 중 선택될 수 있는 것은 IgG4 Fc이다. IgG4는 IgG1과 유사한 생체내 반감기를 보이면서 아미노산 서열의 차이로 인해 이펙터 기능이 상대적으로 작은 것으로 알려져 있다. 그러나 IgG4는 감소된 이펙터 기능이 있다는 장점에도 불구하고, 독특한 힌지 서열에 의해 생체내에서 IgG4 간의 Fab 암(arm) 교환이 일어나 단백질 융합체를 치료용 목적으로 사용시 큰 어려움이 있는 것으로 보고되었다 (van der Neut Kolfschoten, et at., Science, 317:1554-1557. 2007). 즉, IgG4 Fc를 단백질 융합체의 캐리어로 사용시 생체내에 존재하는 IgG4와 Fab 암(arm) 교환이 일어나 천연형 IgG4와 하이브리드를 형성하거나 단량체로 존재하여 원래의 구조를 변경시켜 치료학적으로 낮은 활성을 갖는 구조를 갖게 되는 문제가 발생한다. 이는 IgG4 Fc 단편과 생리활성 물질 융합체를 유전공학 방법으로 생산하든, in vitro에서 생산하든 공통의 문제점으로 작용한다.
따라서, 본 발명의 상기 융합 단백질에 포함되는 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 IgG4 Fc의 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이는 Fc의 힌지, CH2 및 CH3로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에서 발생한 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 인간 IgG4 Fc의 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이는 인간 IgG4 Fc의 중쇄 간 이황화 결합 형성을 부여하는 돌연변이인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 '이황화 결합'은 2개의 황 원자 사이에 형성되는 공유 결합을 의미한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc의 중쇄 간 이황화 결합 형성을 부여하는 돌연변이는 힌지에서의 돌연변이인 것을 특징으로 할 수 있다. 인간 IgG4 Fc의 힌지는 총 12개의 아미노산(ESKYGPPCPSCP)으로 이루어져 있으며, 상기 힌지에서의 돌연변이란 상기 힌지 서열에서 발생한 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 바람직하게는, 상기 힌지에서의 돌연변이는 상기 인간 IgG4 Fc의 힌지를 구성하는 12개의 아미노산 중 CPSC 서열이 CPPC로 치환되고 일부 아미노산이 결실되거나 삽입된 돌연변이, 또는 또 다른 아미노산이 치환된 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc는 CPPC 서열을 포함하는 4개 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 힌지를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 인간 IgG4 Fc는 ESKYGPPCPPCP, SKYGPPCPPCP, KYGPPCPPCP, YGPPCPPCP, GPPCPPCP, PPCPPCP, PCPPCP, CPPCP, CPPCP, 또는 CPPC의 서열로 이루어진 힌지를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc는 힌지 영역에서 돌연변이되어, 2개의 힌지 영역 사이에 이황화 결합 형성을 보장하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 인간 IgG4 Fc 힌지 영역에서의 돌연변이는 위치 228(EU 넘버링에 따름)에서 세린(Ser)이 프롤린(Pro)으로 돌연변이(S228P) 된 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc는 야생형의 IgG4 Fc의 힌지에서 일부 아미노산이 결실되어 Fab 암(arm) 교환이 방지되는 것을 특징으로 할 수 있다. IgG4 Fc의 힌지에서 일부 아미노산이 결실되어 Fab 암(arm) 교환이 방지되는 구체적인 예시는 KR20130063029호 등에 개시되어 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 IgG4 Fc의 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이는 S228P, R409K 또는 이의 조합(EU 넘버링에 따름)을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 위치 220에서 Ser이 Pro로 치환된 것(S220P), 위치 223에서 Gly이 Thr으로 치환된 것(G223T), 위치 224에서 Pro이 His으로 치환된 것(P224H) 및 위치 225에서 Pro이 Thr으로 치환된 것(P225T)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 아미노산 변이는 야생형 인간 IgG4 Fc의 활성에는 영향을 주지 않으면서 단백질의 안정성 등에 영향을 주는 전하 변이체(charge variants)로서 기능할 수 있도록 한다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 인간 IgG4 Fc 변이체는 서열번호 6 내지 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이로서, IgG4 Fc 변이체의 유도체(mutein)도 포함한다. 본 발명에 있어서 IgG4 Fc 변이체의 유도체란 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 또한, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 인간 IgG4 Fc 변이체의 유도체는 인간 IgG4 Fc 변이체와 동일한 생물학적 활성을 나타내나 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
본 발명의 일 실시예에서는, 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 3번째 아미노산이 Leu에서 Pro으로 치환된 유도체(힌지 영역에서 Fab 암 교환을 방지하는 아미노산 변이도 포함)와 플라젤린의 융합단백질을 제작하여 그 효과를 평가한 결과, 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 서열을 그대로 포함하는 플라젤린의 융합단백질과 TLR5 agonist activity에 차이가 없는 것으로 확인되었다.
즉, 본 발명에서 상기 인간 IgG4 Fc 변이체의 유도체는 융합단백질의 활성에는 영향을 주지 않으면서, 단백질의 안정성을 향상시키는 변이가 추가로 포함된 것일 수 있으며, 구체적으로는 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 3번째 아미노산이 Leu에서 Pro으로 치환된 유도체인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 인간 IgG4 Fc 변이체는 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, 당쇄가 제거된 인간 IgG4 Fc 변이체는 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 인간 IgG4 Fc 변이체라 할 것이다.
본 발명에서 당쇄의 제거(Deglycosylation)는 효소로 당을 제거한 인간 IgG4 Fc 변이체를 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 융합단백질은 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단 또는 C-말단이 상기 인간 IgG4 Fc 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합된 것일 수 있다. 구체적으로 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단이 인간 IgG4 Fc 변이체의 C-말단에 결합된 것이거나, 또는 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 C-말단이 인간 IgG4 Fc 변이체의 N-말단에 결합된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 C-말단이 인간 IgG4 Fc 변이체의 N-말단에 결합된 것일 수 있다.
한편, 본 발명에서 융합 단백질을 구성하는 각 구성요소, 즉 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체, 및 인간 IgG4 Fc 변이체는 서로 직접 연결되거나 링커를 통해 연결될 수 있다. 일반적으로, 용어 “링커”는 하나 이상의 분자, 예를 들면, 하나 이상의 성분 도메인 사이에 삽입될 수 있는 핵산, 아미노산 또는 비-펩타이드 잔기를 의미한다. 예를 들어, 링커는 조작을 용이하게 하기 위해 성분간에 관심있는 바람직한 부위를 제공하는데 사용될 수 있다. 링커는 또한 형질전환체로부터 융합 단백질의 발현을 증진시키고, 성분이 이의 최적의 3차 구조를 취하고/취하거나 표적 분자와 적절하게 상호 작용할 수 있도록 입체 장애를 감소시키기 위해 제공될 수 있다. 링커 서열은, 수용체 성분에 자연적으로 연결된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 융합 단백질의 발현을 증진시키기 위해, 특이적으로 관심있는 바람직한 부위를 제공하기 위해, 성분 도메인이 최적의 3 차 구조를 형성할 수 있도록 하기 위해, 및/또는 성분과 이의 표적 분자와의 상호 작용을 증진시키기 위해 사용되는 첨가된 서열일 수 있다.
바람직하게는, 상기 링커는 융합 단백질 내의 각각의 구성요소의 구조를 간섭하지 않고 융합 단백질의 유연성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 잔기는 2 내지 100 개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드 링커이다. 예시적인 링커는 Gly-Gly, Gly-Ala-Gly, Gly-Pro-Ala, Gly (G)n 및 Gly-Ser (GS) 링커와 같은 적어도 2 개의 아미노산 잔기를 갖는 선형 펩타이드를 포함한다. 본 명세서에 기재된 GS 링커는 (GS)n, (GSGSG)n, (G2S)n,G2S2G, (G2SG)n, (G3S)n, (G4S)n, (GGSGG)nGn, GSG4SG4SG 및 (GGGGS)n을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 n은 1 이상이다. (G)n 링커의 하나의 예는 G9 링커를 포함하며, (GGGGS)n 링커의 예시는 GGGGS 또는 (GGGGS)3 링커를 포함한다. 적합한 선형 펩타이드는 알라닐 및/또는 세리닐 및/또는 프롤리닐 및/또는 글리실 아미노산 잔기로 구성된 폴리글리신, 폴리세린, 폴리프롤린, 폴리알라닌 및 올리고펩타이드를 포함한다. 링커 잔기는 본 발명에 개시된 융합 단백질의 구성성분을 연결시키는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 링커는 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 기재된 융합 단백질은 숙주 세포로부터 융합 단백질을 분비하기 위해 기능하는 신호 펩타이드를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 신호 펩타이드를 포함하지 않는다.
또한, 본 발명에서 기술된 융합 단백질은 단백질 결합 펩타이드의 변형된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질 성분은 예를 들어 임의의 단백질 결합 펩타이드에 대한 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화 및 인산화를 포함하는 번역 후 변형을 가질 수 있다.
다른 언급이 없는 한, 본 발명의 융합 단백질은 그 자체로 생균, 사멸 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스 벡터화 백신의 일부가 아닌 폴리펩타이드 (또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)로서 투여된다. 또한, 달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 융합 단백질은 분리된 융합 단백질로서, 예를 들어, 편모에 혼입되지 않는다.
본 발명에 있어서 “융합”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 구성하는 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서 상기 융합 단백질은 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61 또는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 염증성 대장 질환 동물 모델에서 염증성 소견, 임상증상, 장조직 손상 및 궤양증상을 완화하는 효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다.
본 발명에서 상기 대장염은 염증성 대장 질환 또는 과민성 대장염일 수 있으며, 상기 염증성 대장 질환은 궤양성 대장염 또는 크론병일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 융합 단백질 외에 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 물질을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 비강내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 “경피 투여”는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 대장염 예방 또는 치료하는 효과가 있는 공지의 물질과 병용하여 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 대장염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물 내 각 구성에 대한 설명은 전술한 바가 참고될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함하는 것으로서, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 대장염 개선 또는 치료 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
예를 들면, 건강기능식품으로는 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 대장염의 예방, 개선 또는 치료 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부당 0.01~0.3 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100mL당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 조성물은 고지방식이 투여에 의해 유도된 대장염 동물모델에서 야생형 플라젤린과 비교해 현저히 향상된 예방 및 치료 효과를 나타내므로, 대장염 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 제조된 1번 및 4번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 제조된 1번 및 2번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 제조된 4번 내지 7번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 제조된 6번, 8번 내지 11번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 융합단백질의 zTLR5와의 단백질-단백질 상호작용을 융합단백질-TLR5 결합에 대한 biolayer interferometry법으로, 그리고 융합단백질과 TLR5의 복합체 형성을 gel-filtration chromatography법으로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 농도별로 평가하고, 이의 EC50 값을 산출한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 및 12번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 농도별로 평가한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에서 제조된 서열번호 63번 융합단백질과 야생형 바실러스 서브틸리스의 플라젤린(BsFlagellin)의 비강 내 투여 후 시간의 경과에 따른 약물 흡수정도를 형광 이미징으로 분석한 결과이다(A: 서열번호 63번 융합단백질, B: 야생형 바실러스 서브틸리스의 플라젤린).
도 10은 DSS 음수에 의한 Inflammatory Bowel Disease(IBD) 유도 및 약물처리에 대한 모식도이다.
도 11은 DSS 음수에 의한 IBD 유도 모델에서 시험약물 처리 후 임상증상 개선을 나타내는 결과이다.
도 12는 DSS 음수에 의한 IBD 유도 모델에서 시험약물 처리 후 장조직손상 개선을 나타내는 결과이다.
도 13은 DSS 음수에 의한 IBD 유도 모델에서 시험약물 처리 후 혈청 내 염증조절인자 발현을 나타내는 결과이다.
도 14는 DSS 음수에 의한 IBD 유도 모델에서 MSP306과 flagellin을 각각 투여한 장조직을 조직학적 방법을 통해 관찰한 결과이다.
도 15는 DSS 음수에 의한 IBD 유도 모델에서 시험물질 처리 후 장조직 내 염증성 대식세포 발현양상을 관찰한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
1. 실험방법
본 발명에서는 Fab 암(arm) 교환이 방지된 인간 IgG4 Fc 변이체-플라젤린 융합단백질을 제작하고, 이의 효과를 다른 형태의 Fc-플라젤린 융합단백질과 비교하고자 다양한 형태의 융합단백질을 제작하였다. 융합단백질 제작에 사용된 플라젤린은 Bacillus subtilis 플라젤린(BsFlagellin)이다.
(1) DNA 클로닝
하기 12가지 종류의 플라스미드를 제작하였다.
1. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP303)
2. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304)
3. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge-NL
4. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305)
5. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC-NL
6. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306)
7. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-NL
8. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-S220P
9. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-G223T
10. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P224H
11. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P225T
12. pFUSE-hIgG4-Fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-LGK
상기 1 내지 12번의 각 플라스미드가 암호화하는 인간 IgG4 Fc 변이체-플라젤린 융합단백질의 구성을 아래 표 1에 나타내었다:
(인간 IgG4 Fc의 힌지 영역은 총 12개의 아미노산(ESKYGPPCPSCP)으로 이루어져 있다. 상기 1 내지 3번의 융합단백질에 포함된 인간 IgG4 Fc는 상용 플라스미드에 포함된 서열로서 인간 IgG4 Fc 힌지를 구성하는 아미노산 중 일부가 결실된 형태(PPCPSCP)의 힌지가 포함된 인간 IgG4 Fc이며, 상기 5번 내지 12번은 12개의 아미노산이 모두 포함된 full length의 야생형 힌지 서열 또는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 full length의 힌지 서열을 포함하고 있다.
상기 1 내지 12의 DNA 제작에 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다:
번호 Used Primer
1.pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP303) Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 14)
Reverse 5'- GAC CAT GGC AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3'
(서열번호 15)
2. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304) Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC -3'
(서열번호 16)
Reverse 5'- GAC CAT GGC AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3'
(서열번호 17)
3. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge-NL Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 18)
Reverse 5'- TCA GAT CTA ACC ATG GCA CGT AAT AAT TGA AG -3'
(서열번호 19)
4. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305) Forward 5'- TAT ATC CAT GGT TAG ATC TGA ATC CAA ATA CGG TCC CCC ATG CCC ATC -3'
(서열번호 20)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 21)
5. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC-NL Forward 5' - C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 22)
Reverse 5'- TCA GAT CTA ACC ATG GCA CGT AAT AAT TGA AG -3'
(서열번호 23)
6. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306) Forward 5' - TAT ATC CAT GGT TAG ATC TGA ATC CAA ATA CGG TCC CCC ATG CCC ACC TTG CCC AGC ACC TGA - 3'
(서열번호 24)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 25)
7. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-NL Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 26)
Reverse 5'- TCA GAT CTA ACC ATG GCA CGT AAT AAT TGA AG -3'
(서열번호 27)
8. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-S220P Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA CCC AAA TAC GGT CCC CCA TGC CCA CCT TGC -3'
(서열번호 28)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 29)
9. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-G223T Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA TCC AAA TAC ACT CCC CCA TGC CCA CCT TGC - 3'
(서열번호 30)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3' (서열번호 31)
10. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P224H Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA TCC AAA TAC GGT CAC CCA TGC CCA CCT TGC -3'
(서열번호 32)
Reverse TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 33)
11. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P225T Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA TCC AAA TAC GGT CCC ACA TGC CCA CCT TGC - 3'
(서열번호 34)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 35)
12. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L) Forward 5'- GAC AAG GAT ATC GAT GAG AAT TAA CCA CAA TAT TGC AGC ACT TAA CAC - 3'
(서열번호 36)
Reverse 5'- GAC GCT AGC TCA TTT ACC CAG AGA CAG GGA GAG GC - 3'
(서열번호 37)
다음과 같은 단계에 따라 클로닝을 수행하였다:
[PCR]
1) Solgent PCR Kit (STD16-R500)을 사용하여 제작한 ORF를 맞춘 상기 프라이머를 사용하여 pFUSE-hIgG4-Fc2-BS1을 Template DNA로 하여 CPSC와 CPPC PCR product를 제작하기 위해 클로닝을 진행했다.
2) PCR fragment DNA에 10X DNA dye 4.4㎕ 첨가하고, 겔 전기영동을 통해 PCR 결과물의 크기와 band의 유무를 확인하여 MEGAquick-spin Plus (17290)를 통해 Gel Extraction을 수행했다.
[Enzyme Restriction]
3) 2)를 수행한 PCR fragment 와 Template DNA에 제한효소(Enzyme restriction)를 처리하고, 각각의 플라스미드의 enzyme cutting 완료 후, 10X DNA dye 4.4㎕ 첨가하고, 겔 전기 영동을 통해 PCR fragment 와 Template DNA 결과물의 크기와 band의 유무를 확인하여 MEGAquick-spin Plus (17290)를 통해 Gel Extraction을 수행했다.
[Ligation]
4) Molar Ratio를 기준으로 Vector (Template DNA): Insert (PCR fragment) = 1:5의 비율로 Ligation을 진행했다. Ligation 과정은 Takara T4 DNA Ligase Kit (2011A) 매뉴얼 대로 진행했다.
[Transformation]
5) DH5a competent cell을 얼음에서 1분동안 녹인 후에 Zeocin(+) TB plate를 37도씨 incubator에 방치한다.
6) 녹은 DH5a competent cell의 10% volume으로 Ligation Product를 넣어주고 20분동안 얼음에서 방치한다.
7) 42℃에서 30초 동안 열 충격을 준다.
8) Heat Shock 후에 얼음에서 5분 동안 방치한다.
9) 이후에 Zeocin(+) TB Plate에 Transformation 된 E-coli를 도말한다.
10) Overnight로 Colony를 키우고 colony를 picking한다.
11) Picking된 colony를 Zeocin (+) LB media의 3㎖ Inoculation을 18hr 동안 진행한 후에 Mini Prep을 한다.
12) 클로닝이 완료된 플라스미드의 염기서열을 확인하기 위해 각각의 DNA Sequencing을 진행한다.
상기 1 내지 12번 융합단백질의 DNA 염기서열 및 단백질 아미노산 서열을 하기 표 3에 나타내었다.
번호 서열정보
1.pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP303) DNA 서열번호 38
단백질 서열번호 39
2. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304) DNA 서열번호 40
단백질 서열번호 41
3. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge-NL DNA 서열번호 42
단백질 서열번호 43
4. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305) DNA 서열번호 44
단백질 서열번호 45
5. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC-NL DNA 서열번호 46
단백질 서열번호 47
6. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306) DNA 서열번호 48
단백질 서열번호 49
7. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-NL DNA 서열번호 50
단백질 서열번호 51
8. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-S220P DNA 서열번호 52
단백질 서열번호 53
9. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-G223T DNA 서열번호 54
단백질 서열번호 55
10. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P224H DNA 서열번호 56
단백질 서열번호 57
11. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P225T DNA 서열번호 58
단백질 서열번호 59
12. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L) DNA 서열번호 60
단백질 서열번호 61
(2) 제작한 플라스미드의 동물 세포에서의 발현 및 단백질 정제
1) 12well plate에 well 당 poly-L-lysine 500ul 사용하여 5분간 RT에서 coating한 후 serum free DMEM으로 1회, 10% FBS DMEM으로 1회 wash 한다. Transfection 당일 cell confluency가 약 60%가 되게끔 HEK293T를 seeding한다
2) 실험 당일 serum free DEME 100ul에 DNA을 각각 1ug과 TurboFect Transfection Reagent (Thermo Scientific) 2ul을 섞은 후 20분간 RT incubation한 후 transfection 한다. Transfection volume은 1ml으로 한다.
3) 24hr 후 transfection efficiency 확인 후 0.5% FBS DMEM으로 media change 한다.
4) 24hr 후 media 400ul을 harvest 한 후 debris 제거를 위해 12300g에서 1분간 원심 분리하여 상층액을 사용한다.
5) 또한, flask 배양 방식으로 CHO S cell line에서 6 X 106 cells/ml 을 200ml 배지에 DNA를 1mg/L의 농도로 일시발현한다.
6) 배양 후 원심분리와 필터링 후 친화 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피 정제 과정을 거쳐 각 단백질을 수득했다.
(3) TLR5 아고니스트 어세이
상기 방법에 따라 제조한 (i) 내지 (vi) 단백질의 TLR5 활성화능을 다음 단계에 따라 확인하였다:
1) 단백질은 정량하여 준비한다.
2) HEK-Blue cell은 75T-Flask에서 DMEM (4.5 g/L glucose, 2mM L-glutamine), 10% FBS, 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 100ug/ml Normocin이 들어간 media를 사용하여 culture.
3) Cell은 thawing하고 3회 정도 Normocin (100ug/ml)이 들어간 media에서 키우다가 본 실험 전에 2회 이상 Normocin (100ug/ml), Blasticidin (15ug/ml), Zeocin (100ug/ml)을 넣은 media에서 subculture 후에 사용한다.
4) Cell은 Flask의 70~80%가 차면 media만 넣고 tapping으로 cell을 분리 centrifuge (1000rpm/5min) 후에 1:6으로 subculture.
5) 흔들어서 잘 녹여주고 foil로 감싸서 37℃에서 30min 반응 후 4℃냉장고에 보관, 사용시에는 37℃로 warming up 후에 사용한다.
6) 반응시킬 protein이나 물질들을 20ul를 기준으로 필요한 농도에 맞춰서 준비해준다. 96well plate에 물질을 넣어주고 ice올려둔다. Blank는 PBS를 20ul 넣어준다.
7) 140,000 cell/ml을 기준으로 cell을 counting 후 HEK-Blue detection solution과 잘 섞어준 다음 180ul씩 각 well에 넣어준다.
8) Cell은 소량의 PBS를 사용하여 counting해주고 96well-triplicate 기준으로 총 수량을 정한다.
9) 37℃, CO2 incubator에서 16h 후에 620nm에서 읽어준다.
(4) Biolayer interferometry 분석
[TLR5avitag의 biotinylation]
1) Sample preparation: BirA500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit를 이용하여 진행하였다.
2) TLR5avitag (~1 mg/ml) 300 ul + BiomixA 50 ul + BiomixB 50 ul + BirA 10 ul + buffer (20 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl) = final volume 500 ul의 조건으로 sample을 섞어주었다.
3) 18℃에서 5시간동안 incubation을 실시하였다.
4) 1L Buffer (20 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl)에 dialysis 3회 반복하여 남아있는 잔여물을 모두 제거한다.
5) SDS-PAGE gel loading하고 PVDF membrane transfer 후 streptavidin-HRP 이용하여 biotinylation을 확인하였다.
[BLI experiment]
6) SA biosensors를 200 μl baseline buffer에 5분이상 hydration한다.
7) Baseline buffer 로 각 sample 단백질을 희석한다. TLR5avitag은 5 μg/ml, 리간드 단백질(CPPC, entolimod, flagellin)은 81, 27, 9, 3 nM의 농도로 희석한다.
[palate 측정]
8) Octet Data Acquisition 프로그램에서 process를 설정한다.
9) late Definition: 측정할 plate well type(plate 구성 참고)을 입력한다
10) Assay Definition: 1-9 lane 순서대로 sensor가 이동하게끔 Well과 각 step을 세팅하여(위 plate 구성 및 각 step별 설정 참고) 실험을 진행시킨다.
11-1) 1~3 lane에 걸쳐 sensor wash를 진행
11-2) 4 lane에서 TLR5avitag을 sensor상에 고정
11-3) 5~7 lane에 걸쳐 sensor wash를 진행
11-4) 8 lane에서 TLR5와 ligand의 association을 확인
11-5) 9 lane에서 TLR5와 ligand의 dissociation을 확인
12) 측정이 시작되면 각 5개 sensor의 baseline이 잘 잡히는지 확인한다.
13) 측정된 결과는 Octet Data Analysis 프로그램을 이용하여 분석한다 (Association and dissociation, 1:1 binding model 설정으로 fitting).
(5) Gel filtration 실험
[Buffer & Column conditions]
1) Buffer & Column conditions
- Gel-filtration buffer: 20mM HEPES (Biobasic, HB0264) pH 7.4 150mM NaCl (Biobasic, DB0483)
- 모든 단백질은 gel-filtration buffer 조건에 있으며, 단백질간 binding 또한 gel-filtration buffer 조건 하에 진행되었음. Column 내 환경 또한 gel-filtration buffer로 하여 실험을 진행하였음.)
- Column: Superdex 200 10/300 GL
- FPLC: AKTA FPLC (GE-healthcare)
2) 각각 단독으로 단백질을 column에 inject하며 각 물질의 분자량 및 elution 위치를 파악하였다.
[Sample mixing & chromatography running]
3) Protein들의 농도를 계산해서 TLR5와 리간드 protein을 각각 1:0, 1:1, 1:2, 0:1 비율로 혼합한다. total volume은 gel-filtration buffer를 이용하여 300 μl 로 맞춰준다.
4) Column에 3 column volume (75ml) 이상의 gel-filtration buffer를 흘려주어 equilibration을 진행한다.
5) 0.5 ml/min의 속도로 1 ml equilibration 진행한다.
6) 18℃ 에서 30분간 incubation한 뒤 sample을 centrifuge(12000 rpm, 4 ℃ 10 min)하여 침전물을 가라앉힌 후 상층액을 모아 FPLC에 injection한다. (Sample은 syringe를 이용해 sample loop에 injection한다.)
7) 1 column volume(25 ml) gel-filtration buffer를 흘려주어 sample의 elution peak를 UV 280 nm로 결과를 확인한다.
(6) DSS(Dextran sodium sulphate)에 의한 염증성장질환 동물 모델 유도 실험
1) 염증성 장 질환 유발
Dextran sodium sulphate(DSS) salt, colitis grade(36,000 - 50,000)를 식수에 2% 농도로 희석하여 급수하였고, 시험물질 투여 개시일(Day 0) 부터 Day 5까지 자유롭게 섭취하도록 하여 장 질환을 유발시켰다.
2) 군 분리
순화기간 중 시험동물들의 체중을 측정하였고 체중에 따라 각 군의 평균체중이 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하였다.
3) 투여방법 및 횟수
약물 투여는 질환유도 물질(DSS) 급수날부터 실시하였고, 군 구성은 총 5개의 군 및 조직학적 평가를 위한 추가 1군 등 총 6군으로 아래의 표 4와 같이 나누어 진행하였다. 대조물질 Mesalazine 은 15일 간 1일 1회 경구 투여하였으며, 추가적인 조직학적평가를 위한 대조물질인 야생형 바실러스 서브틸리스 플라젤린(Bs.flagellin) 은 부검 전까지 1주 2회씩 총 4회 비강 내 투여 하였으며, 시험물질은 비강 내 투여하였으며 부검 전까지 1주 2회씩 총 4회 투여하였다.
4) 관찰 및 검사
1. 일반 증상 관찰 및 육안평가
투여 및 관찰기간 동안 사망을 포함한 일반증상의 종류, 발현일 및 증상의 정도를 1 일 1 회 관찰하고 개체별로 기록하며, 아래 제시된 기준 (disease activity index, DAI)에 따라 종합하여 scoring을 실시하였다 (Lifu Wang et al., 2020).
Body weight loss (%): 0 (<2%), 1 (≥2-<5%), 2 (≥5-<10%), 3 (≥10-<15%), 4 (≥15%)
Stool type: 0 (Normal), 1 (softer stool), 2 (moderate diarrhea), 3 (diarrhea)
Bleeding: 0 (no rectal bleeding). 1 (weak hemoccult), 2 (blood in stool), 3 (fresh rectal bleeding)
5) 부검
부검일 (Day 15)에 해당 동물을 안락사 시킨 뒤, 후대정맥에서 주사기를 이용하여 채혈한 후, 비장 및 대장[결장 (colon)부터 직장 (rectum)]을 적출한 다음 Swiss roll 방법을 이용하여 10% 중성완충포르말린에 고정하였다.
6) 조직병리학적 검사
부검 후 고정된 조직은 삭정, 탈수, 파라핀 포매, 박절 등 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 조직병리학적 검사를 위한 검체를 제작한 뒤, Hematoxylin & Eosin (H&E), Immunohistochemistry stain을 실시하였고, 광학 현미경 (Olympus BX53, Japan)을 이용하여 조직병리학적 변화를 관찰하였다. 조직병리학적 평가는 대장에 대해 병변이 가장 심한 부위를 선정하여 움세포 (Crypt cell) 손상 (0 - 4 점), 궤양 (0 - 3 점)에 대해 각각 점수를 부과하여 평가하였다(Stillie et al, 2009).
7) Real-time PCR analysis
부검일에 채취한 혈액을 원심분리하여 얻은 혈청으로 혈중 전염증성사이토카인 농도를 분석하였다.
2. 실험결과
(1) TLR5 아고니스트 어세이
상기 실험방법에 따라 제조한 1 내지 11번 각각의 단백질의 TLR5 활성화능을 평가하고, 이에 대한 결과를 도 1 내지 도 5에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, hIgG4 Fc의 힌지 일부 서열이 융합된 단백질(1번)과 힌지 전체서열이 융합된 단백질(4) 모두 TLR5 활성화능을 나타냈으며, 그 정도는 힌지 전체서열이 융합된 단백질에서 높게 나타났다.
도 2에 나타낸 바와 같이, Bsflagellin과 hIgG4 Fc를 연결하는 링커(GGGGS)가 1개인 융합단백질(1번)과 3개인 융합단백질(2번) 모두 TLR5 활성화능을 나타냈으며, 그 정도는 링커가 3개인 융합단백질에서 높게 나타났다.
도 3에 나타낸 바와 같이, Bsflagellin과 hIgG4 Fc를 연결하는 링커(GGGGS)가 1개인 융합단백질(1번)과 링커가 없는 융합단백질(3번) 모두 TLR5 활성화능을 나타냈으며, 그 정도는 비슷한 것으로 확인되었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 야생형의 hIgG4 Fc에 융합된 단백질(4번)과 비교해 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이(S228P)를 포함하고 있는 hIgG4 Fc에 융합된 단백질(6번)의 TLR5 활성화능이 현저히 높은 것으로 확인되었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이(S228P)를 포함하고 있는 hIgG4 Fc에 융합된 단백질(6번)과 추가적인 변이를 포함하는 전하 변이체들 모두 TLR5 활성화능이 나타난 것으로 확인되었다.
(2) 융합단백질과 TLR5와의 결합력 분석
상기 제조한 융합단백질 중에서 6번 융합단백질(MSP306)과 zTLR5와의 단백질-단백질 상호작용을 융합단백질-TLR5 결합에 대한 biolayer interferometry법으로, 그리고 융합단백질과 TLR5의 복합체 형성을 gel-filtration chromatography법으로 분석하였다.
이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이 6번 융합단백질은 결합력이 pM 수준으로 매우 뛰어난 것으로 확인되었다.
또한, 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능의 EC50 값을 산출해 본 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능의 EC50는 21.44nM로서 매우 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 효과가 가장 우수한 6번 융합단백질과, hIgG4 Fc의 C-말단 3번째 서열만 6번과 상이한 12번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 비교해 본 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 6번 및 12번 융합단백질의 활성이 거의 동일한 것으로 확인되었다.
3. 곤충세포에서의 단백질 발현 및 비강 흡수 실험
(1) 곤충세포에서의 단백질 발현
[Original Baculovirus의 제작]
1) 6 well plate에 각 well 당 100 x 104개의 Sf9 cell을 seeding 한다.
2) 항생제가 포함되지 않는 배양액을 2ml까지 채운 후 28℃에서 30분 동안 방치한다. 방치하는 동안 그 다음 단계를 진행한다.
3) CellfectinII solution(gibco) 8μl와 항생제가 포함되지 않는 배양액 100μl을 섞은 후 실온에서 30분 동안 방치한다.
4) 별도의 용기에 midi-prep DNA (서열번호 62, 1μg/μl concentration) 1.5μl와 linearized baculovirus DNA 1.5μl을 넣고 조심스럽게 섞은 후 실온에서 5분 동안 방치한 후 항생제가 포함되지 않는 배양액 100μl을 첨가한 후 섞어준다.
5) 단계 3)의 혼합액과 단계 4)의 혼합액을 섞은 후 실온에서 30분간 방치한다.
6) 단계 2)의 plate를 꺼내 기존의 배양액을 제거한 후 각 well에 새로운 배양액 1ml를 넣어준다.
7) 각 well에 단계 5)의 혼합액을 첨가하여 plate를 밀봉한 후 low T incubator에서 4시간동안 방치한다.
8) 배양액으로 씻어낸 후 항생제가 없는 배양액으로 바꿔준다.
9) plate를 밀봉한 후 28℃ incubator에서 5일동안 방치한다.
10) Original baculovirus를 이용하여 Primary Baculovirus를 바로 제작하지 않고 보관하는 경우, 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다. 바로 제작하는 경우 다음 과정을 따른다.
[Primary Baculovirus의 제작]
1) 실험 전 Sf9 cell을 Log phage 상태가 되도록 배양한다.
2) 75T 플라스크에 1000 x 104cells개의 Sf9 cell을 seeding 한 후 28℃에서 30분동안 방치한다.
3) Sf cell이 플라스크 바닥에 부착했는지 확인한 후 배양액을 모두 제거한다.
4) 새로운 배양액 1ml 넣어준 후 original baculovirus 500ul를 한 방울씩 파이펫으로 떨어뜨려 준다. original baculovirus가 잘 퍼지도록 부드럽게 흔들어준 후 28℃에서 1시간동안 방치한다.
5) 새로운 배양액 10ml를 첨가한 후 28℃에서 3일동안 방치한다.
6) Primary Baculovirus를 이용하여 Secondary Baculovirus를 바로 제작하지 않고 보관하는 경우, 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다. 바로 제작하는 경우 다음 과정을 따른다.
[Secondary Baculovirus의 제작]
1) 실험 전 Sf9 cell을 Log phage 상태가 되도록 배양한다.
2) 175T 플라스크에 2000 x 104개의 Sf9 cell을 seeding 한 후 28℃에서 30분동안 방치한다.
3) Sf cell이 플라스크 바닥에 부착했는지 확인한 후 배양액을 모두 제거한다.
4) 새로운 배양액 2ml 넣어준 후 primary baculovirus 500ul를 한 방울씩 파이펫으로 떨어뜨려 준다. primary baculovirus가 잘 퍼지도록 부드럽게 흔들어준 후 28℃에서 1시간동안 방치한다.
5) 새로운 배양액 20ml를 첨가한 후 28℃에서 3일동안 방치한다.
6) Secondary Baculovirus를 이용하여 Tertiary Baculovirus를 바로 제작하지 않고 보관하는 경우, 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다. 바로 제작하는 경우 다음 과정을 따른다.
[Tertiary Baculovirus의 제작]
단백질 발현이 확인되면 Tertiary Baculovirus을 제작한다. 이후의 과정은 진탕배양기를 사용한다.
1) 실험 전 Sf9 cell을 Log phage 상태가 되도록 배양한다.
2) 플라스크에 180-200 x 104개의 Sf9 cell을 seeding 한 후 적정양의 Secondary Baculovirus를 첨가한 후 28℃의 진탕배양기에서 90rpm 속도로 3일동안 배양한다.
3) 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다.
[단백질 획득]
1) 60-80 x 104cells/ml의 밀도로 Hi5 cell을 seeding 한다.
2) 180-200 x 104cells/ml의 밀도까지 Hi5 cell을 배양한 후 적정양의 Tertiary Baculovirus를 첨가한 후 28℃의 진탕배양기에서 90rpm 속도로 3일동안 배양한다.
3) 3일 배양 후 Hi5 cell을 튜브에 모은 후 4℃, 8000rpm의 조건으로 10분동안 원심 분리한다.
4) 단계 3)이 진행되는 동안 Roche Ni resin 5ml을 column에 넣은 후, [20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 30mM Imidazole] 용액 10ml를 흘려보낸다.
5) 단계 3)의 원심분리가 종료되면 상층액을 회수한 후 단계 4)에서 준비한 resin에 흘려보내준다.
6) [20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 30mM Imidazole] 용액 150ml를 흘려보낸다.
7) resin에 protein이 확인되면 다음 세 종류의 용액을 각각 15ml씩 흘려보낸다.
- 용액 1 : 20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 100mM Imidazole
- 용액 2 : 20 HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 300mM Imidazole
- 용액 3 : 20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 500mM Imidazole
8) SDS-PAGE를 통해 단백질을 확인한 후 농축한다.
9) 20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl 용액 9ml을 넣어 Imidazole을 1/10 희석한 후 다시 농축한다.
10) FPLC를 통해 SEC를 진행한 뒤 peak, SDS-PAGE를 확인하여 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 정제된 단백질을 수득했다 (20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl).
(2) 비강투여된 물질의 생체 내 이미징
시간에 따른 Bsflagellin 및 상기 곤충세포에서 발현한 서열번호 63의 융합단백질의 생체 내 이미징을 다음 단계에 따라 확인하였다:
[실험의 준비]
1) 8주령의 수컷 SKH1 mouse을 구입하여 순화 후 실험에 사용하였다.
2) 서열번호 63 융합단백질의 비교 대상인 BsFlagellin은 Invivogen에서 구입하여 사용하였다.
[물질의 표지]
물질의 생체 내 추적을 위한 물질의 표지는 다음 단계에 따라 진행하였다
1) Flamma 774 NHS ester (pws1603,bioacts)을 1mg으로 희석하였다.
2) BsFlagellin 혹은 서열번호 63의 융합단백질을 Flamma 774 NHS ester와 혼합한다.
3) 혼합된 물질을 4℃에서 3일동안 반응시킨다.
4) 반응 종료 후 Amicon Ultra centrifugal filter unit을 통해 표지되지 않은 물질을 분리하였다.
5) 분리된 물질은 BCA 정량법을 이용하여 농도를 결정하였다.
[생체 내 이미징 분석]
1) 이전 단계에서 준비한 물질을 SKH1 마우스(n=2)에 10ug/head로 비강으로 주입하였다.
2) SKH1 마우스(n=1)에 PBS를 같은 용량으로 주입하였다.
3) 생체 내 이미징 분석을 위해 마우스를 호흡 마취한다.
4) 마취 한 마우스를 비강 주입 후 3, 6, 24 시간 후에 IVIS™ imaging system(Perkin Elmer)을 이용하여 마우스의 목 부분까지 형광 검출 영상을 얻었다.
이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, BsFlagellin(도 9B) 혹은 서열번호 63의 융합단백질(도 9A)을 비강투여한 결과, 모든 마우스의 olfactory epithelium 및 lymph node(Depp cervical, mandibular)에서 두 물질에 표지된 형광이 검출되었다.
물질 주입 24시간 후의 형광 검출 영상에서 BsFlagellin(B)보다 서열번호 63의 융합단백질이 체내 흡수가 빠르게 진행됨을 확인할 수 있었다.
4. DSS 음수에 의한 염증성장질환 동물모델에서의 약리활성 평가
상기 실험방법에 따라 IBD 유도 모델의 군을 분리하고, 시험약물 처리를 나타내는 모식도를 도 10에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, IBD 유도 모델에서 출혈, 분변 양상, 체중 감소 양상을 종합적으로 평가한 임상증상 평가(Disease activity index) 결과, 시험물질 투여개시 후 부검 전인 13 일째에 G5 DSS MSP306 high IN 고용량 비강투여군의 합산 점수 수준은 G2 DSS vehicle control 그룹에 비하여 유의하게 낮게 나타났다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 장내 조직병리학적 검사 결과 G5 DSS MSP high dose IN 고용량 비강투여군의 선와세포(Crypt cell) 손상 및 궤양(Ulceration) 수준은 G2 DSS vehicle control 그룹에 비하여 유의하게 낮게 나타났다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 부검시 채취한 혈액을 원심분리하여 얻은 혈청을 이용하여 염증조절인자 검사 결과 전염증성사이토카인인 IL-6의 발현이 G5 DSS MSP306 high IN 고용량 비강투여그룹의 mRNA 수치가 G2 DSS vehicle control 그룹에 비해 유의하게 감소하였다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 부검시 적출한 장 조직을 고정하고 H&E 염색을 실시 후 장 조직의 조직학적 형태를 관찰한 결과 DSS MSP306 투여 그룹이 DSS vehicle control 그룹, DSS 야생형 바실러스 플라젤린(Bs.flagellin) 그룹에 비하여 장내 조직의 형태가 개선되었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 부검시 적출한 장 조직을 고정하고 면역조직학적 발현 염색을 실시 후 장 조직의 염증성 대식세포 발현양상을 관찰한 결과 DSS MSP306 투여 그룹이 DSS vehicle control 그룹에 비하여 염증성 대식세포의 발현이 감소되었다.
본 발명에 따른 조성물은 고지방식이 투여에 의해 유도된 대장염 동물모델에서 야생형 플라젤린과 비교해 현저히 향상된 예방 및 치료 효과를 나타내므로, 대장염 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY MEDISPAN CO.,Ltd <120> Composition for treating colitis comprising fusion protein of flagellin and immunoglobulin Fc region <130> NP21-0116 <160> 63 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus subtilis flagellin protein <400> 1 Met Arg Ile Asn His Asn Ile Ala Ala Leu Asn Thr Leu Asn Arg Leu 1 5 10 15 Gly Ser Asn Asn Gly Ala Ala Gln Lys Asn Met Glu Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Leu Arg Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Arg Gly Gln Ile Arg Gly Leu Glu Met Ala Ser Lys 50 55 60 Asn Ser Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Thr Glu Thr His Ala Ile Leu Gln Arg Met Arg Glu Leu Thr Val Gln 85 90 95 Ala Gly Asn Thr Gly Thr Gln Gln Ala Glu Asp Leu Gly Ala Ile Lys 100 105 110 Asp Glu Met Asp Ala Leu Ile Glu Glu Ile Asp Gly Ile Ser Asn Arg 115 120 125 Thr Glu Phe Asn Gly Lys Lys Leu Leu Asp Gly Thr Asn Ser Thr Asp 130 135 140 Gly Phe Thr Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Gly Gln Gln Leu Asn Val 145 150 155 160 Lys Ile Asp Ser Met Ser Ser Thr Ala Leu Gly Val Asn Ala Leu Asp 165 170 175 Val Thr Asp Phe Ala Ala Thr Ala Phe Asp Asp Gln Leu Lys Ser Ile 180 185 190 Asp Thr Ala Ile Asn Thr Val Ser Thr Gln Arg Ala Lys Leu Gly Ala 195 200 205 Val Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ala Ser Gly 210 215 220 Glu Asn Leu Thr Ala Ala Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala 225 230 235 240 Lys Glu Met Ser Glu Phe Thr Lys Asn Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ser 245 250 255 Gln Ala Met Leu Ala Gln Ala Asn Gln Gln Pro Gln Asn Val Leu Gln 260 265 270 Leu Leu Arg 275 <210> 2 <211> 505 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Salmonella dublin flagellin protein <400> 2 Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn 1 5 10 15 Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ile Glu Arg Leu 20 25 30 Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln 35 40 45 Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr 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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 305 310 315 320 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 325 330 335 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 340 345 350 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 355 360 365 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 370 375 380 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 385 390 395 400 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 405 410 415 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 420 425 430 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 435 440 445 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 450 455 460 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 465 470 475 480 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 485 490 495 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 500 505 510 Gly Lys <210> 60 <211> 1545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L) DNA <400> 60 atgagaatta accacaatat tgcagcactt aacacattga atcgtttggg ttcaaacaac 60 ggagcagcac aaaagaatat ggagaagctt tcttcaggtc ttcgtatcaa ccgtgcggga 120 gatgacgcag caggtctagc gatctctgaa aaaatgagag gacaaatcag aggtcttgaa 180 atggcttcta aaaactctca agatggaatc tctcttatcc aaacagctga gggtgcatta 240 actgaaactc atgcaattct tcaacgtatg cgtgaactta ctgttcaagc aggaaacaca 300 ggtacacaac aagctgaaga tcttggtgca attaaagatg aaatggatgc gcttatcgag 360 gaaattgatg gcatttcaaa ccgtactgaa tttaacggta aaaagttgct agacggaact 420 aattctactg atggtttcac attccaaatt ggtgcgaatg ctggccaaca actaaatgta 480 aaaattgaca gcatgtcatc aactgcttta ggagtaaacg cacttgatgt aacagatttc 540 gctgctactg cttttgatga tcaacttaaa agtattgata ctgccatcaa tactgtatca 600 actcaacgtg ctaaattagg tgcggtacaa aaccgtctag agcatacaat caacaactta 660 ggcgcttctg gtgaaaacct gacagctgct gagtctcgta tccgtgacgt tgacatggct 720 aaagaaatga gcgagttcac taagaacaac attctttctc aagcttctca agctatgctt 780 gctcaagcta accaacagcc tcaaaacgta cttcaattat tacgtggtgg cggagggtct 840 gccatggtta gatctgaatc caaatacggt cccccatgcc caccttgccc agcacctgag 900 ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc 960 tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc 1020 cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1080 gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1140 ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag 1200 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca 1260 tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac 1320 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1380 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac 1440 aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1500 aaccactaca cacagaagag cctctccctg tctctgggta aatga 1545 <210> 61 <211> 514 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Asn Thr Val Ser Thr Gln Arg Ala Lys Leu Gly Ala 195 200 205 Val Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ala Ser Gly 210 215 220 Glu Asn Leu Thr Ala Ala Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala 225 230 235 240 Lys Glu Met Ser Glu Phe Thr Lys Asn Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ser 245 250 255 Gln Ala Met Leu Ala Gln Ala Asn Gln Gln Pro Gln Asn Val Leu Gln 260 265 270 Leu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ala Met Val Arg Ser Glu Ser Lys 275 280 285 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 290 295 300 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 305 310 315 320 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 325 330 335 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 340 345 350 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 355 360 365 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 370 375 380 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 385 390 395 400 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 405 410 415 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 420 425 430 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 435 440 445 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 450 455 460 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 465 470 475 480 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 485 490 495 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 500 505 510 Gly Lys <210> 62 <211> 1590 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAcGP67-A-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L-Insect) DNA <400> 62 atgagaatta accacaatat tgcagcactt aacacattga atcgtttggg ttcaaacaac 60 ggagcagcac aaaagaatat ggagaagctt tcttcaggtc ttcgtatcaa ccgtgcggga 120 gatgacgcag caggtctagc gatctctgaa aaaatgagag gacaaatcag aggtcttgaa 180 atggcttcta aaaactctca agatggaatc tctcttatcc aaacagctga gggtgcatta 240 actgaaactc atgcaattct tcaacgtatg cgtgaactta ctgttcaagc 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ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag 1200 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca 1260 tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac 1320 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1380 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac 1440 aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1500 aaccactaca cacagaagag cctctccctg tctctgggta aatgcggccg cctggttccg 1560 cgtggttcgc atcatcatca tcatcactga 1590 <210> 63 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAcGP67-A-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L-Insect) Protein <400> 63 Met Arg Ile Asn His Asn Ile Ala Ala Leu Asn Thr Leu Asn Arg Leu 1 5 10 15 Gly Ser Asn Asn Gly Ala Ala Gln Lys Asn Met Glu Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Leu Arg Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Arg Gly Gln Ile Arg Gly Leu Glu Met Ala Ser Lys 50 55 60 Asn Ser Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Thr Glu Thr His Ala Ile Leu Gln Arg Met Arg Glu Leu Thr Val Gln 85 90 95 Ala Gly Asn Thr Gly Thr Gln Gln Ala Glu Asp Leu Gly Ala Ile Lys 100 105 110 Asp Glu Met Asp Ala Leu Ile Glu Glu Ile Asp Gly Ile Ser Asn Arg 115 120 125 Thr Glu Phe Asn Gly Lys Lys Leu Leu Asp Gly Thr Asn Ser Thr Asp 130 135 140 Gly Phe Thr Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Gly Gln Gln Leu Asn Val 145 150 155 160 Lys Ile Asp Ser Met Ser Ser Thr Ala Leu Gly Val Asn Ala Leu Asp 165 170 175 Val Thr Asp Phe Ala Ala Thr Ala Phe Asp Asp Gln Leu Lys Ser Ile 180 185 190 Asp Thr Ala Ile Asn Thr Val Ser Thr Gln Arg Ala Lys Leu Gly Ala 195 200 205 Val Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ala Ser Gly 210 215 220 Glu Asn Leu Thr Ala Ala Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala 225 230 235 240 Lys Glu Met Ser Glu Phe Thr Lys Asn Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ser 245 250 255 Gln Ala Met Leu Ala Gln Ala Asn Gln Gln Pro Gln Asn Val Leu Gln 260 265 270 Leu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ala Met Val Arg Ser Glu Ser Lys 275 280 285 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 290 295 300 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 305 310 315 320 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 325 330 335 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 340 345 350 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 355 360 365 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 370 375 380 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 385 390 395 400 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 405 410 415 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 420 425 430 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 435 440 445 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 450 455 460 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 465 470 475 480 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 485 490 495 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 500 505 510 Gly Lys Cys Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Ser His His His His His 515 520 525 His

Claims (22)

  1. 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 세라티아(Serratia) 속, 시겔라(Shigella) 속, 트레포네마(Treponema) 속, 레기오넬라(Legionella) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 바르토넬라(Bartonella) 속, 프로튜스(Proteus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 여시니아(Yersinia) 속, 캄필로박터(Campylobacter) 속, 로세부리아(Roseburia) 속 및 마리노박터(Marinobacter) 속으로 이루어진 군에서 선택된 미생물 유래의 플라젤린인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 세라티아 마세센스(Serratia marcesens), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 보렐리아 버그도페레이(Borrelia burgdorferei), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바르토넬라 클라리제이애(Bartonella clarridgeiae), 프로튜스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에스테리키아 콜라이(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 여시니아 페스티스(Yersinia pestis), 캄필로박터(Campylobacter spp), 로세부리아(Roseburia spp) 및 마리노박터(Marinobacter spp)로 이루어진 군에서 선택된 미생물 유래의 플라젤린인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 TLR5 (toll-like receptor 5)에 의해 인식되는 보존된 서열(conserved sequence)을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단편은 야생형(wild-type) 플라젤린에서 초가변 영역(hypervariable region)이 제거된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단편은 야생형(wild type) 플라젤린의 C-말단 도메인 0, C-말단 도메인 1, C-말단 도메인 2, N-말단 도메인 2, N-말단 도메인 1, N-말단 도메인 0 및 상기 각 도메인들과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내는 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린의 변이체는 야생형(wild-type) 플라젤린과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내며 톨-유사 수용체 5(Toll-like receptor 5, TLR5) 자극 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 힌지(hinge)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 힌지는 CPPC 서열을 포함하는 4 내지 12개의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이는 상기 IgG4 Fc의 중쇄 간 이황화 결합 형성을 부여하는 돌연변이인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 위치 228에서 Ser이 Pro로 치환된 것(S228P), 위치 409에서 Arg이 Lys으로 치환된 것(R409K), 또는 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 위치 220에서 Ser이 Pro로 치환된 것(S220P), 위치 223에서 Gly이 Thr으로 치환된 것(G223T), 위치 224에서 Pro이 His으로 치환된 것(P224H) 및 위치 225에서 Pro이 Thr으로 치환된 것(P225T)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 3번째 아미노산이 Leu에서 Pro으로 치환된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단 또는 C-말단이 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 직접 연결되거나 또는 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 서열번호 6 내지 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 링커는 상기 링커는 (GGGGS)n (n은 1 내지 5)의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61 또는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 상기 대장염은 염증성 대장 질환 또는 과민성 대장염인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 염증성 대장 질환은 궤양성 대장염 또는 크론병(Crohn's disease)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  22. 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 대장염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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