JP2024520569A - ｓＰＤ－１及びＩＬ－１５を有する二重特異性Ｆｃ融合タンパク質 - Google Patents

ｓＰＤ－１及びＩＬ－１５を有する二重特異性Ｆｃ融合タンパク質 Download PDF

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Abstract

【目的】改善された特性を有する二重特異性Ｆｃ融合タンパク質、並びにそのような二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法、並びにがん、感染症、及び免疫関連疾患を有する患者の治療においてそれを使用する方法を提供する。【構成】本開示は、ＩＦ－１５ドメイン、インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＦ－１５Ｒα）スシドメイン、Ｆｃドメイン、及び可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）バリアントドメインを有する新規の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質、当該二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、それを作製及び使用する方法を対象とする。【選択図】 なし

Description

本発明は、生体分子（例えば、サイトカイン及び／又は免疫チェックポイント受容体）によって誘導又は刺激される生物学的応答の分野、より具体的には、ＩＬ－１５及び／又はＰＤ－１によって調節される生物学的応答の分野に関する。具体的には、本発明は、ＩＬ－１５ドメイン、インターロイキン－１５受容体アルファ（Interleukin-15 Receptor alpha、ＩＬ－１５Ｒα）スシドメイン、Ｆｃドメイン、及び可溶性ＰＤ－１（soluble PD-1、ｓＰＤ－１）バリアントドメインを含む、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法、並びに例えば、疾患（例えば、がん、感染症など）の予防及び／又は治療、免疫機能の調節、Ｔ細胞及び／又はナチュラルキラー（Natural Killer、ＮＫ）細胞に対する細胞傷害性の促進などにおいて二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を使用する方法に関する。
サイトカインであるインターロイキン－１５（interleukin-15、ＩＬ－１５）は、リンホカインの４つのアルファヘリックスバンドルファミリーのメンバーである。ＩＬ－１５は、自然免疫系及び獲得免疫系の両方の活性、例えば、侵入病原体に対するメモリーＴ細胞応答の維持、アポトーシスの阻害、樹状細胞の活性化、並びにＮＫ細胞増殖及び細胞傷害活性の誘導の調節において重要な役割を果たす（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第１０８９９８２１（Ｂ２）号）。
ＩＬ－１５受容体は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ、及びＩＬ－２Ｒαと相同である固有のリガンド特異的サブユニットであるＩＬ－１５Ｒαと会合するγｃサブユニットからなる。これらの受容体タンパク質は、「スシドメイン」と称されるタンパク質結合モチーフを含有する。ヒト及びマウスの両方では、これらの受容体及びそれらの同族リガンドは、ゲノムにおいて物理的に連結している（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２０１９，Ｃｈａｐｔｅｒ ９：Ｊ．Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｍａｓｓｉｍｏ Ｇａｄｉｎａ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｍ．Ｓｉｅｇｅｌ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊｏｈｎ ｐ．１２７－１５５）。
ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５Ｒαに結合し、細胞表面複合体を形成する。ＩＬ－１５は、受容体の細胞外ドメインのエクソン２の「スシドメイン」を介して高い親和性でＩＬ－１５Ｒαに特異的に結合する。トランスでのエンドソームリサイクリング及び細胞表面への移動の後、これらのＩＬ－１５複合体は、ＩＬ－１５Ｒβγ低親和性受容体複合体を発現するバイスタンダー細胞を活性化し、ＩＬ－１５媒介性シグナル伝達経路を誘導する特性を獲得する（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，２６５，３８２（Ｂ２）号）。ＩＬ－１５シグナル伝達は、正常な免疫系機能に必須である。それは、Ｔ細胞増殖を刺激し、ＩＬ－２によって媒介される活性化によって誘導される細胞死を阻害する。
ＰＤ－１（プログラム細胞死１）は、活性化されたＴ細胞及びＢ細胞によって発現される重要な免疫チェックポイント受容体である。それは、免疫抑制を媒介するように機能する。ＰＤ－１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞上で発現される。ＰＤ－１のリガンドは、プログラム細胞死１リガンド１（programmed cell death 1 ligand 1、ＰＤ－Ｌ１、あるいはＢ７－Ｈ１）及びプログラム細胞死１リガンド２（programmed cell death 1 ligand 2、ＰＤ－Ｌ２、あるいはＢ７－ＤＣ）であり、これらは、多くの腫瘍細胞、並びに単球、樹状細胞（dendritic cell、ＤＣ）、及びマクロファージなどの抗原提示細胞上で発現される（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，５８８，９３８（Ｂ２）号、米国特許出願第１６／５６９，１０５号、国際公開第２０２０／０５６０８５（Ａ１）号）。
ＰＤ－１は、Ｔ細胞において誘導されると、負の免疫応答シグナルを送達するように作用する。そのリガンドのうちの１つへの選択的結合を介するＰＤ－１の活性化は、Ｔ細胞増殖、並びに／又はＴ細胞応答の強度及び／若しくは持続時間を減少させる、阻害性免疫応答を活性化する。ＰＤ－１はまた、感染症又は腫瘍進行に応答して、末梢組織におけるエフェクターＴ細胞活性を調節する（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１２（４）：２５２－２６４）。
通常は免疫応答を終結させて付随的な組織損傷を軽減するＰＤ－１シグナル伝達経路などの内因性免疫チェックポイントは、腫瘍によって吸収されて免疫破壊を回避することができる。がんにおけるＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用は、腫瘍に浸潤する免疫細胞の数を減少させ、がん細胞に対する免疫応答を阻害し得る。ＰＤ－１への結合時のＴ細胞活性化及びサイトカイン分泌の下方制御が、いくつかのヒトがんにおいて観察されている（全て参照により全体が組み込まれる、Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２０００，１９２（７）：１０２７－３４、Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１，２（３）：２６１－８）。加えて、ＰＤ－１リガンドＰＤ－Ｌ１は、乳がん、結腸がん、食道がん、胃がん、神経膠腫、白血病、肺がん、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、膵臓がん、腎細胞がん、及び尿路上皮がんを含む多くのがんにおいて過剰発現される。また、がんを有する患者は、免疫細胞によるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の増加に起因して、獲得免疫応答が制限又は低減されていることも示されている。活性化されたＰＤ－１シグナル伝達のこの増加はまた、ウイルス感染症を有する患者においても見られている。例えば、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルスは、肝細胞上でＰＤ－１リガンドの過剰発現を誘導し、エフェクターＴ細胞におけるＰＤ－１シグナル伝達を活性化し得る。これは、ひいては、Ｔ細胞消耗及びウイルス感染症に対する免疫寛容に至る（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００７，８１：４２１５－４２２５、Ｇｏｌｄｅｎ－Ｍａｓｏｎｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００８，１８０：３６３７－３６４１）。
Ｔ細胞及び／若しくはＮＫ細胞に対する細胞傷害性を促進し、自然免疫系及び／若しくは獲得免疫系の活性を調節し、並びに／又はがん若しくは感染症を有する患者における獲得免疫の阻害を軽減若しくは逆転させるための、有効なタンパク質に基づく治療剤及び方法が、当技術分野で必要とされている。本発明は、この必要性及び他の必要性を満たす。
本開示は、改善された特性（例えば、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に対する結合親和性の増加、ＩＬ－１５のアゴニスト活性の向上、半減期の延長、並びにがん及び／又は感染症を治療するための相乗的効力）を有する、ｓＰＤ－１バリアント、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαスシドメインを含む、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質、並びにそのような二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法、並びにがん、感染症、及び免疫関連疾患を有する患者の治療においてそれを使用する方法に関する。
本開示は、とりわけ、ＩＬ－１５ドメイン、ＩＬ－１５Ｒαスシドメイン、Ｆｃドメイン、及びｓＰＤ－１バリアントドメインを含む、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法、並びに例えば、獲得免疫系が抑制されるか、又は免疫応答の大きさ若しくはレベルの増加が必要とされる疾患（例えば、がん、感染症など）の治療、免疫機能の調節、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に対する細胞傷害性の促進において二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を使用する方法を提供する。
一態様では、本開示は、
ａ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
ｂ）ＩＬ－１５ドメインと、
ｃ）Ｆｃドメインと、
ｄ）可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）バリアントドメインと、を含む、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質が、第１のドメインリンカーと、第２のドメインリンカーと、第３のドメインリンカーと、を更に含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、第１のドメインリンカー、第２のドメインリンカー、及び第３のドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎからなる群から選択され、ｎが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、第１のドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択される、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、第２のドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択される、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、第３のドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択される、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
ａ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）ＩＬ－１５ドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）Ｆｃドメインと、
ｆ）第３のドメインリンカーと、
ｇ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
ａ）ＩＬ－１５ドメインと、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）Ｆｃドメインと、
ｆ）第３のドメインリンカーと、
ｇ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
ａ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）Ｆｃドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）ＩＬ－１５ドメインと、
ｆ）第３のドメインリンカーと、
ｇ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
ａ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）Ｆｃドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
ｆ）第３のドメインリンカーと、
ｇ）ＩＬ－１５ドメインと、を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
ａ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）ＩＬ－１５ドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
ｆ）第３のドメインリンカーと、
ｇ）Ｆｃドメインと、を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
ａ）ＩＬ－１５ドメインと、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
ｆ）第３のドメインリンカーと、
ｇ）Ｆｃドメインと、を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
ａ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）ＩＬ－１５ドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
ｆ）第３のドメインリンカーと、
ｇ）Ｆｃドメインと、を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
ａ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）ＩＬ－１５ドメインと、
ｆ）第３のドメインリンカーと、
ｇ）Ｆｃドメインと、を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）ＩＬ－１５ドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
ｆ）第３のドメインリンカーと、
ｇ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）ＩＬ－１５ドメインと、
ｆ）第３のドメインリンカーと、
ｇ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）ＩＬ－１５ドメインと、
ｆ）第３のドメインリンカーと、
ｇ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
ｆ）第３のドメインリンカーと、
ｇ）ＩＬ－１５ドメインと、を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、
ＩＬ－１５ドメインとＩＬ－１５Ｒαスシドメインとを連結するドメインリンカーが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択され
他の２つのドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択される、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、
ＩＬ－１５ドメインとＩＬ－１５Ｒαスシドメインとを連結するドメインリンカーが、配列番号１５のアミノ酸配列を有し、
他の２つのドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択される、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、
ＩＬ－１５ドメインとＩＬ－１５Ｒαスシドメインとを連結するドメインリンカーが、配列番号１８のアミノ酸配列を有し、
他の２つのドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択される、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の３８、６３、６５、９２、１００、１０３、１０８、及び１１６位からなる群から選択される位置に対応する位置に、１つ以上のアミノ酸置換を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の３８位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の６３位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の６５位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の９２位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の１００位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の１０３位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の１０８位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の１１６位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、当該１つ以上のアミノ酸置換が、当該位置のうちの２つ、当該位置のうちの３つ、当該位置のうちの４つ、当該位置のうちの５つ、当該位置のうちの６つ、当該位置のうちの７つ、又は当該位置のうちの８つで生じる、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のＳ３８Ｇ、Ｓ６３Ｇ、Ｐ６５Ｌ、Ｎ９２Ｓ、Ｇ１００Ｓ、Ｓ１０３Ｖ、Ａ１０８Ｉ、及びＡ１１６Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｎ９２Ｓ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｓ３８Ｇ／Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｎ９２Ｓ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｓ３８Ｇ／Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｓ６３Ｇ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉのセットを含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、ＩＬ－１５ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン又はバリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ４のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、Ｆｃドメインが、バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、当該バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、配列番号２５に記載のＳ２２８Ｐに対応する置換を有するヒトＩｇＧ４のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号７０のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、配列番号７１のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
追加の態様では、本開示は、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は安定化剤と、を含む、薬学的組成物を提供する。
更なる態様では、本開示は、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
追加の態様では、本開示は、本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質をコードする核酸であって、核酸が、宿主生物のために、当該生物におけるＦｃ融合タンパク質の発現のためにコドン最適化されている。
更なる態様では、本開示は、本明細書に開示の核酸を含む発現ベクターを提供する。
追加の態様では、本開示は、ａ）当該Ｆｃ融合タンパク質が発現される条件下で、本明細書に開示の宿主細胞を培養することと、ｂ）当該Ｆｃ融合タンパク質を回収することと、を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、シグナルペプチドと本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質とを含むタンパク質前駆体をコードする、核酸を提供する。
追加の態様では、本開示は、シグナルペプチドと本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質とを含むタンパク質前駆体をコードする核酸であって、シグナルペプチドが、配列番号２２又は配列番号２３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、核酸を提供する。
更なる態様では、本開示は、シグナルペプチドと本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質とを含むタンパク質前駆体をコードする核酸であって、シグナルペプチドが、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、核酸を提供する。
追加の態様では、本開示は、シグナルペプチドと本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質とを含むタンパク質前駆体をコードする核酸であって、シグナルペプチドが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、核酸を提供する。
更なる態様では、本開示は、本明細書に開示のタンパク質前駆体をコードする核酸であって、タンパク質前駆体が、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、及び配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、核酸を提供する。
追加の態様では、本開示は、本明細書に開示の核酸を含む発現ベクターを提供する。
更なる態様では、本開示は、本明細書に開示の核酸又は本明細書に開示の発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
追加の態様では、本開示は、ａ）当該Ｆｃ融合タンパク質が発現される条件下で、本明細書に開示の宿主細胞を培養することと、ｂ）当該Ｆｃ融合タンパク質を回収することと、を含む、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、がんを有する対象における腫瘍の転移又は浸潤を治療、低減、又は予防する方法であって、方法が、治療有効用量の本明細書に開示の１つ以上の当該Ｆｃ融合タンパク質又は本明細書に開示の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
追加の態様では、本開示は、本明細書に開示のがんを有する対象において腫瘍の転移又は浸潤を治療、低減、又は予防する方法であって、腫瘍が、固形腫瘍である、方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、本明細書に開示のがんを有する対象において腫瘍の転移又は浸潤を治療、低減、又は予防する方法であって、がんが、結腸直腸がんである、方法を提供する。
追加の態様では、本開示は、本明細書に開示のがんを有する対象における腫瘍の転移又は浸潤を治療、低減、又は予防する方法であって、有効用量の１つ以上のＦｃ融合タンパク質又は薬学的組成物が、対象において、野生型ＰＤ－１によって媒介されるシグナル伝達を阻害、低減、又は調節する、方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、本明細書に開示のがんを有する対象における腫瘍の転移又は浸潤を治療、低減、又は予防する方法であって、有効用量の１つ以上のＦｃ融合タンパク質又は薬学的組成物が、対象においてＴ細胞応答を増加させる、方法を提供する。
追加の態様では、本開示は、対象における感染症を予防又は治療する方法であって、方法が、治療有効用量の本明細書に開示の１つ以上の当該Ｆｃ融合タンパク質又は本明細書に開示の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、本明細書に開示の対象における感染症を予防又は治療する方法であって、感染症が、真菌感染症、細菌感染症、及びウイルス感染症からなる群から選択される、方法を提供する。
追加の態様では、本開示は、本明細書に開示の対象における感染症を予防又は治療する方法であって、有効用量の１つ以上のＦｃ融合タンパク質又は薬学的組成物が、対象における野生型ＰＤ－１によって媒介されるシグナル伝達を阻害、低減、又は調節する、方法を提供する。
更なる態様では、本明細書に開示の対象における感染症を予防又は治療する方法であって、有効用量の１つ以上のＦｃ融合タンパク質又は薬学的組成物が、対象においてＴ細胞応答を増加させる、方法。
追加の態様では、本開示は、対象におけるＩＬ－１５媒介性疾患又は障害を予防又は治療する方法であって、方法が、治療有効用量の本明細書に開示の１つ以上の当該Ｆｃ融合タンパク質又は本明細書に開示の薬学的組成物を対象に投与することを含み、ＩＬ－１５媒介性疾患又は障害が、がん又は感染性疾患である、方法を提供する。
追加の態様では、本開示は、本明細書に開示の対象におけるＩＬ－１５媒介性疾患又は障害を予防又は治療する方法であって、がんが、結腸直腸がんである、方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、本明細書に開示の対象におけるＩＬ－１５媒介性疾患又は障害を予防又は治療する方法であって、感染性疾患が、ウイルス感染症である、方法を提供する。
追加の態様では、本開示は、対象における免疫不全又はリンパ球減少症を予防又は治療する方法であって、治療有効用量の本明細書に開示の１つ以上の当該Ｆｃ融合タンパク質又は本明細書に開示の当該薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、ＩＬ－１５媒介性免疫機能の向上を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効用量の本明細書に開示の１つ以上の当該Ｆｃ融合タンパク質又は本明細書に開示の当該薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
追加の態様では、本開示は、本明細書に開示のＩＬ－１５媒介性免疫機能の向上を必要とする対象においてそれを行う方法であって、向上されるＩＬ－１５媒介性免疫機能が、リンパ球の増殖、リンパ球のアポトーシスの阻害、抗体産生、抗原提示細胞及び／又は抗原提示の活性化を含む、方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、本明細書に開示のＩＬ－１５媒介性免疫機能の向上を必要とする対象においてそれを行う方法であって、向上されるＩＬ－１５媒介性免疫機能が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、メモリーＴ細胞、メモリーＢ細胞、樹状細胞、他の抗原提示細胞、マクロファージ、マスト細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（natural killer T cell、ＮＫＴ細胞）、腫瘍常在Ｔ細胞、ＣＤ１２２＋Ｔ細胞、及び／又はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化又は増殖を含む、方法を提供する。
追加の態様では、本開示は、Ｔ細胞に対する細胞傷害性又はＮＫ細胞に対する細胞傷害性の促進を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効用量の本明細書に開示の１つ以上の当該Ｆｃ融合タンパク質又は本明細書に開示の当該薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
使用した培養培地及び選択薬物を含む、分子細胞株開発のフローチャート図を提供する。 使用した培養培地及び選択薬物を含む、各配列に対応するプールしたクローンの表を提供する。 配列１クローンＧ１～Ｇ４の細胞生存率回復の結果を示す。 配列２クローンＧ５～Ｇ８の細胞生存率回復の結果を示す。 配列１－１クローンＧ９～Ｇ１２の細胞生存率回復の結果を示す。 配列２－１クローンＧ１３～Ｇ１６の細胞生存率回復の結果を示す。 １１日間の流加培養によって回収したクローンプールの生産性及び細胞成長プロファイルを表にしたものを示す。 採取した細胞培養液（Harvested Cell Culture Fluid、ＨＣＣＦ）、クローンＧ１～Ｇ８を使用した１１日間の流加培養によって回収したプールのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。 採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）、クローンＧ９～Ｇ１６を使用した１１日間の流加培養によって回収したプールのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。 ＰｒｏＡ精製試料クローンＧ１～Ｇ８を使用した１１日間の流加培養によって回収したプールのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。 ＰｒｏＡ精製試料クローンＧ１～Ｇ８を使用した１１日間の流加培養によって回収したプールのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。 １２日間のバッチ培養における、第１回の単一細胞クローンの力価分布についての表を示す。 配列番号１－１の単一細胞クローンの細胞成長曲線を示す。 配列番号１－１の単一細胞クローンの細胞生存率曲線を示す。 配列番号２－１の単一細胞クローンの細胞成長曲線を示す。 配列番号２－１の単一細胞クローンの細胞生存率曲線を示す。 配列１－１及び２－１から選択した上位１０個のクローンの力価分布についての表を示す。 ＩＬ－１５受容体β結合ＥＬＩＳＡによって決定した、プールしたクローンのＩＬ－１５結合効力及びＥＣ５０の表にした要約を提供する。 ＩＬ－１５受容体β結合ＥＬＩＳＡによって決定した、ＩＬ－１５の相対効力についての結果を示す。 ＩＬ－１５受容体β結合ＥＬＩＳＡによって決定した、ＩＬ－１５のＥＣ５０についての結果を示す。 ＰＤ－Ｌ１結合ＥＬＩＳＡによって決定した、プールしたクローンのＰＤ－Ｌ１結合効力及びＥＣ５０の表にした要約を提供する。 ＰＤ－Ｌ１結合ＥＬＩＳＡによって決定した、ＰＤ－Ｌ１結合の相対効力についての結果を示す。 ＰＤ－Ｌ１結合ＥＬＩＳＡによって決定した、ＰＤ－Ｌ１のＥＣ５０についての結果を提供する。 ＰＤ－Ｌ２結合ＥＬＩＳＡによって決定した、プールしたクローンのＰＤ－Ｌ２結合効力及びＥＣ５０の表にした要約を提供する。 ＰＤ－Ｌ１結合ＥＬＩＳＡによって決定した、ＰＤ－Ｌ１結合の相対効力についての結果を示す。 ＰＤ－Ｌ１結合ＥＬＩＳＡによって決定した、ＰＤ－Ｌ１のＥＣ５０についての結果を示す。 １０ｍｇ／ｋｇでのｓＰＤ－１治療、２．５ｍｇ／ｋｇでの単一ＩＬ－１５治療、及びｓＰＤ－１とＩＬ－１５との併用治療で治療した腫瘍担持動物と比較した、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ１／ＩＬ－１５分子で治療したＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１結腸直腸腫瘍の最終腫瘍体積分析の結果を示す。挿入グラフは、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇでのｓＰＤ－１／ＩＬ－１５と比較した、ｓＰＤ－１とＩＬ－１５との併用治療の間の比較を示す。 Ｉｌ－１５アゴニストと組み合わせたＡＢ００２（配列番号９７）及び他のＰＤ－１免疫チェックポイント阻害因子の抗腫瘍活性を比較するインビボ研究において使用した、治療群、投与濃度、及び投与体積を要約する表である。 同じインビボ研究での投与スケジュールを示す。 図１９Ｃに説明したインビボ研究の終了時の異なる治療群における腫瘍体積の変化を示す。 図１９Ｃに説明したインビボ研究の終了時の異なる治療群における腫瘍体積の変化を示す。 同じインビボ研究における対象マウスの体重変化を示す。 ＡＢ００２（配列番号９７）又はマウスａＰＤ－１抗体による治療後のＭＣ３８腫瘍細胞における、標的遺伝子の遺伝子発現レベルの変化を示す。 Ｌｅｗｉｓ肺腫瘍細胞を注射したマウスに対するＡＢ００２（配列番号９７）及び抗ｍＰＤ１の効果を比較するインビボ研究において使用した、治療群、投与濃度、及び投与体積の要約を要約する表である。 図２２項目Ａに従って行ったインビボ研究におけるＡＢ００２（配列番号９７）又は抗ｍＰＤ－１による治療後の、腫瘍体積の阻害パーセントを示す。 異なる用量のＡＢ００２（配列番号９７）で静脈内又は皮下のいずれかで治療した場合の、ＭＣ３８腫瘍細胞を接種したマウスのインビボ研究からの腫瘍体積の変化を示す。加えて、ＡＢ００２（配列番号９７）の用量と同等の異なる用量のｓＰＤ－１を静脈内又は皮下投与した場合の腫瘍体積の変化。 異なる用量のＡＢ００２（配列番号９７）で静脈内又は皮下のいずれかで治療した場合の、ＭＣ３８腫瘍細胞を接種したマウスのインビボ研究からの腫瘍体積の変化を示す。加えて、ＡＢ００２（配列番号９７）の用量と同等の異なる用量のｓＰＤ－１を静脈内又は皮下投与した場合の腫瘍体積の変化。 ＡＢ００２（配列番号９７）単独又はａＰＤ－Ｌ１ Ａｂとの併用による腫瘍治療の有効性を示す。 ＡＢ００２（配列番号９７）単独又はａＰＤ－Ｌ１ Ａｂとの併用による腫瘍治療の有効性を示す。 最初の４つのアミノ酸を含まないヒトＰＤ－１の野生型ＥＣＤ（配列番号１）及び最初の４つのアミノ酸を含まないヒトＰＤ－１のバリアントＥＣＤ（配列番号２～配列番号９）のアミノ酸配列を示す。 ヒトＩＬ－１５ドメイン（配列番号１０）、ヒトＩＬ－１５Ｒアルファスシドメイン（配列番号１１）、リンカー（配列番号１２）、リンカーバリアント１（配列番号１３）、リンカーバリアント２（配列番号１４）、リンカーバリアント３（配列番号１５）、リンカーバリアント４（配列番号１６）、リンカーバリアント５（配列番号１７）、リンカーバリアント６（配列番号１８）、ＧＳリンカー（配列番号１９）、ＧＳリンカーＸ２（配列番号２０）、ＧＳリンカーＸ３（配列番号２１）、シグナルペプチド１（配列番号２２）、及びシグナルペプチド２（配列番号２３）のアミノ酸配列を示す。 ヒトＩｇＧ４（配列番号２４）及びバリアントヒトＩｇＧ４（配列番号２５）のアミノ酸配列を示す。 リンカーバリアント１及びＧＳリンカーＸ２を有する融合タンパク質１（配列番号２６）、並びにリンカーバリアント２及びＧＳリンカーＸ２を有する融合タンパク質２（配列番号２７）のアミノ酸配列を示す。 リンカーバリアント３及びＧＳリンカーＸ２を有する融合タンパク質３（配列番号２８）、並びにリンカーバリアント４及びＧＳリンカーＸ２を有する融合タンパク質４（配列番号２９）のアミノ酸配列を示す。 リンカーバリアント５及びＧＳリンカーＸ２を有する融合タンパク質５（配列番号３０）、並びにリンカーバリアント６及びＧＳリンカーＸ２を有する融合タンパク質６（配列番号３１）のアミノ酸配列を示す。 リンカーバリアント１及びＧＳリンカーＸ３を有する融合タンパク質７（配列番号３２）、並びにリンカーバリアント２及びＧＳリンカーＸ３を有する融合タンパク質８（配列番号３３）のアミノ酸配列を示す。 リンカーバリアント３及びＧＳリンカーＸ３を有する融合タンパク質９（配列番号３４）、並びにリンカーバリアント４及びＧＳリンカーＸ３を有する融合タンパク質１０（配列番号３５）のアミノ酸配列を示す。 リンカーバリアント５及びＧＳリンカーＸ３を有する融合タンパク質１１（配列番号３６）、並びにリンカーバリアント６及びＧＳリンカーＸ３を有する融合タンパク質１２（配列番号３７）のアミノ酸配列を示す。 シグナルペプチド１及び融合タンパク質１を含むタンパク質前駆体１（配列番号３８）、並びにシグナルペプチド１及び融合タンパク質２を含むタンパク質前駆体２（配列番号３９）のアミノ酸配列を示す。 シグナルペプチド１及び融合タンパク質３を含むタンパク質前駆体３（配列番号４０）、並びにシグナルペプチド１及び融合タンパク質４を含むタンパク質前駆体４（配列番号４１）のアミノ酸配列を示す。 シグナルペプチド１及び融合タンパク質５を含むタンパク質前駆体５（配列番号４２）、並びにシグナルペプチド１及び融合タンパク質６を含むタンパク質前駆体６（配列番号４３）のアミノ酸配列を示す。 シグナルペプチド１及び融合タンパク質７を含むタンパク質前駆体７（配列番号４４）、並びにシグナルペプチド１及び融合タンパク質８を含むタンパク質前駆体８（配列番号４５）のアミノ酸配列を示す。 シグナルペプチド１及び融合タンパク質９を含むタンパク質前駆体９（配列番号４６）、並びにシグナルペプチド１及び融合タンパク質１０を含むタンパク質前駆体１０（配列番号４７）のアミノ酸配列を示す。 シグナルペプチド１及び融合タンパク質１１を含むタンパク質前駆体１１（配列番号４８）、並びにシグナルペプチド１及び融合タンパク質１２を含むタンパク質前駆体１２（配列番号４９）のアミノ酸配列を示す。 シグナルペプチド２及び融合タンパク質１を含むタンパク質前駆体１３（配列番号５０）、並びにシグナルペプチド２及び融合タンパク質２を含むタンパク質前駆体１４（配列番号５１）のアミノ酸配列を示す。 シグナルペプチド２及び融合タンパク質３を含むタンパク質前駆体１５（配列番号５２）、並びにシグナルペプチド２及び融合タンパク質４を含むタンパク質前駆体１６（配列番号５３）のアミノ酸配列を示す。 シグナルペプチド２及び融合タンパク質５を含むタンパク質前駆体１７（配列番号５４）、並びにシグナルペプチド２及び融合タンパク質６を含むタンパク質前駆体１８（配列番号５５）のアミノ酸配列を示す。 シグナルペプチド２及び融合タンパク質７を含むタンパク質前駆体１９（配列番号５６）、並びにシグナルペプチド２及び融合タンパク質８を含むタンパク質前駆体２０（配列番号５７）のアミノ酸配列を示す。 シグナルペプチド２及び融合タンパク質９を含むタンパク質前駆体２１（配列番号５８）、並びにシグナルペプチド２及び融合タンパク質１０を含むタンパク質前駆体２２（配列番号５９）のアミノ酸配列を示す。 シグナルペプチド２及び融合タンパク質１１を含むタンパク質前駆体２３（配列番号６０）、並びにシグナルペプチド２及び融合タンパク質１２を含むタンパク質前駆体２４（配列番号６１）のアミノ酸配列を示す。 融合タンパク質６Ａ（配列番号６２）及び融合タンパク質６Ｂ（配列番号６３）のアミノ酸配列を示す。 融合タンパク質６Ｃ（配列番号６４）及び融合タンパク質６Ｄ（配列番号６５）のアミノ酸配列を示す。 融合タンパク質６Ｅ（配列番号６６）及び融合タンパク質６Ｆ（配列番号６７）のアミノ酸配列を示す。 融合タンパク質６Ｇ（配列番号６８）及び融合タンパク質６Ｈ（配列番号６９）のアミノ酸配列を示す。 融合タンパク質６１（配列番号７０）及び融合タンパク質６Ｊ（配列番号７１）のアミノ酸配列を示す。 融合タンパク質６Ｋ（配列番号７２）のアミノ酸配列を示す。 タンパク質前駆体１８Ａ（配列番号７３）及びタンパク質前駆体１８Ｂ（配列番号７４）のアミノ酸配列を示す。 タンパク質前駆体１８Ｃ（配列番号７５）及びタンパク質前駆体１８Ｄ（配列番号７６）のアミノ酸配列を示す。 タンパク質前駆体１８Ｅ（配列番号７７）及びタンパク質前駆体１８Ｆ（配列番号７８）のアミノ酸配列を示す。 タンパク質前駆体１８Ｇ（配列番号７９）及びタンパク質前駆体１８Ｇ（配列番号７９）のアミノ酸配列を示す。 タンパク質前駆体１８Ｉ（配列番号８１）及びタンパク質前駆体１８Ｊ（配列番号８２）のアミノ酸配列を示す。 タンパク質前駆体１８Ｋ（配列番号８３）のアミノ酸配列を示す。 タンパク質前駆体１をコードするＤＮＡ配列（配列番号８４）を示す。 タンパク質前駆体２をコードするＤＮＡ配列（配列番号８５）を示す。 タンパク質前駆体３をコードするＤＮＡ配列（配列番号８６）を示す。 タンパク質前駆体７をコードするＤＮＡ配列（配列番号８７）を示す。 タンパク質前駆体８をコードするＤＮＡ配列（配列番号８８）を示す。 タンパク質前駆体９をコードするＤＮＡ配列（配列番号８９）を示す。 タンパク質前駆体１３をコードするＤＮＡ配列（配列番号９０）を示す。 タンパク質前駆体１４をコードするＤＮＡ配列（配列番号９１）を示す。 タンパク質前駆体１５をコードするＤＮＡ配列（配列番号９２）を示す。 タンパク質前駆体１９をコードするＤＮＡ配列（配列番号９３）を示す。 タンパク質前駆体２０をコードするＤＮＡ配列（配列番号９４）を示す。 タンパク質前駆体２１をコードするＤＮＡ配列（配列番号９５）を示す。 ヒトＰＤ－１の野生型ＥＣＤ（配列番号９６）のアミノ酸配列を示す。 例示的なＡＢ００２配列を示す。
Ａ．序論
ＩＬ－１５は、約１２～１４ＫＤのサイトカインであり、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の発生、増殖、及び活性化において重要な役割を果たす。ＩＬ－１５は、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を刺激することによって自然免疫反応及び獲得免疫反応の両方を促進することができるが、Ｔ調節性（T-regulatory、Ｔｒｅｇ）細胞を活性化すること、又はエフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞の間で活性化関連死を誘導することには効果を示さない（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｑ．Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１８，８（７６７５）：１－１１）。
ＩＬ－１５は、α、β、及びγｃ鎖からなるインターロイキン－１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）に結合する。ＩＬ－１５Ｒβ（ＩＬ－２Ｒβ又はＣＤ１２２としても知られている）及びＩＬ－１５Ｒγｃ（ＣＤ１３２としても知られている）は、中程度の親和性でＩＬ－１５及びＩＬ－２の両方に結合することができる。ＩＬ－１５Ｒαは、広く発現され、高い親和性でＩＬ－１５にのみ結合する。ＩＬ－１５Ｒαは、スシドメイン（１～６５アミノ酸）を含有し、ＩＬ－１５との相互作用を担い、ＩＬ－１５の生物学的機能を媒介するのに必須である（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｑ．Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１８，８（７６７５）：１－１１）。
ＰＤ－１は、免疫及び寛容の間のＴ細胞機能の制御に関与する、阻害性細胞表面受容体である。ＰＤ－１は、そのリガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２に結合すると、Ｔ細胞エフェクター機能を阻害する。ＰＤ－１の構造は、シングルパス１型膜タンパク質のものである。ＰＤ－１は、プログラム細胞死１受容体遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１３３）によってコードされる。ヒトＰＤ－１ ｍＲＮＡ（コード）配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００５０１８に記載されている。ヒトＰＤ－１ポリペプチド配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ００５００９又はＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ１５１１６に記載されている。ＰＤ－１は、プログラム細胞死１、ＰＤＣＤ１、ＰＤ１、ＣＤ２７９、ＳＬＥＢ２、ｈＰＤ－１、及びｈＳＬＥ－１としても知られている。野生型ヒトＰＤ－１ポリペプチドは、２８８個のアミノ酸である。
当技術分野で既知であるように、ＰＤ－１に結合してＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２受容体のいずれかへのＰＤ－１の結合を遮断して、免疫抑制の低減を生じて免疫活性化をもたらす、いくつかの治療用抗体が存在する。これらの抗体としては、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）、並びに臨床で試験されているいくつかの他の抗体が挙げられる。同様に、ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）などの、同様の機序及び治療効果を生じることが承認されている抗ＰＤ－Ｌ１抗体が存在する。
本開示は、ＩＬ－１５のアゴニスト活性を向上するために、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαを使用することと組み合わせて、同様の生物学的機能及び治療効果をもたらす、バリアントを含むヒトＰＤ－１のＥＣＤを使用する新規の機序を対象とする。したがって、本開示は、二重特異性融合タンパク質を提供する。本明細書に記載の融合タンパク質は、４つの一般的な機能性成分を含む。第１の成分は、ヒトＰＤ－１の可溶性ＥＣＤのバリアント（以下、「ｓＰＤ－１バリアント」）を含む。ｓＰＤ－１バリアントは、ＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２に対する結合親和性、並びに／又はタンパク質安定性を増加させるように機能する。第２の成分は、ＩＬ－１５ドメインであり、第３のドメインは、ドメインリンカーを介してＩＬ－１５ドメインに連結されたＩＬ－１５Ｒαスシドメインである。ＩＬ－１５Ｒａスシドメインは、ＩＬ－１５に結合して、ＩＬ－１５の生物学的機能を媒介するであろう。第４のドメインは、融合タンパク質としてのｓＰＤ－１バリアント及びＩＬ－１５の半減期の有意な増加を付与する、ヒトＩｇＧタンパク質、例えばヒトＩｇＧ４のＬｃドメインである。これらの４つの成分又はドメインは、一般に、本明細書に概説されるグリシン－セリンリンカーなどのドメインリンカーを使用して連結されて、本開示の二重特異性Ｌｃ融合タンパク質を形成する。したがって、本開示は、がん又は感染症を有する患者において、Ｔ細胞及び／若しくはＮＫ細胞の発生、増殖、及び活性化を刺激すること、並びに／又はＴ細胞阻害シグナルを低減することなどの、ＰＤ－１及び／又はＩＬ－１５媒介性シグナル伝達経路を調節するための組成物及び方法を提供する。
Ｂ．定義
本明細書で使用されるとき、以下の用語は、特に指定がない限り、それらに帰する意味を有する。
本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」という用語は、１つのメンバーを有する態様を含むだけでなく、２つ以上のメンバーを有する態様も含む。例えば、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に文脈による明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「薬剤」への言及は、当業者に既知の１つ以上の薬剤への言及を含むなどである。
本明細書で使用される場合、本明細書における「タンパク質」は、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む。
本明細書における「Ｆｃ融合タンパク質」は、抗体の結晶化可能断片（Ｆｃ）ドメインを別の生物学的に活性なタンパク質ドメイン又はペプチドと接合させて、固有の構造－機能特性及び有意な治療潜在性を有する分子を生成する、生物工学的に作製されたタンパク質を意味する。
本明細書における「二重特異性タンパク質」、「二重特異性融合タンパク質」、「二機能性タンパク質」、「二機能性融合タンパク質」、又は「二機能性分子」という用語は、２つの別々の固有のリガンド又は受容体に同時に結合し、２つの異なるシグナル伝達経路を調節することができる、タンパク質を意味する。本明細書における「二重特異性Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、２つの別々の固有のリガンド若しくは受容体に同時に結合することができ、かつ／又は２つの異なるシグナル伝達経路を調節することができる、Ｆｃ融合タンパク質を意味する。例えば、ｓＰＤ－１バリアントドメイン、ＩＬ－１５ドメイン、及びＩＬ－１５Ｒαドメインを含む本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ｓＰＤ－１のリガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２）及びＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体の受容体（例えば、ＩＬ－１５Ｒβγ低親和性受容体複合体）に結合することができ、したがって、ＩＬ－１５媒介性及び／又はＰＤ－１媒介性シグナル伝達経路を誘導することが可能である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に記載の単一ペプチドを更に含み得る。
「単離された」という用語は、その自然環境を実質的に含まない分子を指す。例えば、単離されたタンパク質は、それが由来する細胞又は組織源からの細胞性材料又は他のタンパク質を実質的に含まない。「単離された」という用語はまた、単離されたタンパク質が、薬学的組成物として投与されるのに十分に純粋であるか、又は少なくとも約７０％～８０％、８０％～９０％、若しくは９０％～９５％（ｗ／ｗ）純粋であるか、又は少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％（ｗ／ｗ）純粋である、調製物を指す。
「リガンド」という用語は、生物学的目的を果たすために標的細胞の表面上に存在する受容体などの第２の生体分子に結合し、複合体を形成することが可能である、生体分子を指す。リガンドは、一般に、例えば、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用、双極子－双極子結合、又はファンデルワールス力などの分子間力によって、標的タンパク質上の部位に結合する、エフェクター分子である。本開示のｓＰＤ－１バリアントは、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２などのＰＤ－１リガンドに結合し、複合体を形成することができる。
「受容体」という用語は、リガンドなどの第２の生体分子に結合し、複合体を形成することが可能である、標的細胞の表面上に存在する、生体分子を指す。受容体は、一般に、特定のシグナル伝達経路を活性化する。例えば、ＩＬ－１５Ｒαは、ＩＬ－１５に結合する受容体である。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、ＰＤ－１に結合する細胞表面受容体の例である。
本明細書で使用される「位置」とは、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順番に番号付けされ得るか、又は確立されたフォーマット、例えば、ＥＵインデックスによって番号付けされ得る。本開示のいくつかの実施形態では、位置は、成熟タンパク質の第１のアミノ酸から開始して順番に番号付けされる。
本明細書における「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失を意味する。
本明細書における「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置で天然に存在しない（生物内で天然に存在しないか、又はいずれの生物中にも存在しないかのいずれか）アミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｓ２２８Ｐは、バリアントポリペプチドを指し、この場合は、２２８位のセリンがプロリンで置き換えられているヒトＩｇＧ４のＦｃバリアントを指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、開始アミノ酸を変化させないように操作されているタンパク質（例えば、宿主生物の発現レベルを増加させるためにＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（依然としてアルギニンをコードする）に交換すること）は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新しい遺伝子の作製にもかかわらず、タンパク質が、その特定の開始位置に同じアミノ酸を有する場合、アミノ酸置換ではない。
本明細書で使用される「アミノ酸挿入」又は「挿入」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸配列を付加することを意味する。例えば、－２３３Ｅ又は２３３Ｅは、２３３位の後及び２３４位の前のグルタミン酸の挿入を示す。加えて、－２３３ＡＤＥ又はＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後及び２３４位の前のＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を示す。
本明細書で使用される「アミノ酸欠失」又は「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置でアミノ酸配列を除去することを意味する。例えば、Ｅ２３３－又はＥ２３３＃、Ｅ２３３（）又はＥ２３３ｄｅｌは、２３３位のグルタミン酸の欠失を示す。加えて、ＥＤＡ２３３－又はＥＤＡ２３３＃は、２３３位で始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を示す。
本明細書で使用される「親ポリペプチド」とは、バリアントを生成するように後に修飾される出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、又は天然に存在するポリペプチドのバリアント若しくは操作されたバージョンであってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。したがって、本明細書で使用される「親免疫グロブリン」とは、バリアントを生成するように修飾されている非修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味する。これに関連して、「親Ｆｃドメイン」とは、列挙されたバリアントに関連するものであり、したがって、「バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン」は、ヒトＩｇＧの親Ｆｃドメインと比較され、例えば、「バリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン」は、ヒトＩｇＧ４の親Ｆｃドメインと比較されるなどである。
本明細書における「野生型」又は「ＷＴ」とは、対立遺伝子変異を含む、天然に見出されるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を意味する。野生型タンパク質（又はＷＴタンパク質）は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有する。
本明細書で使用される「バリアントタンパク質」又は「タンパク質バリアント」又は「バリアント」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。いくつかの実施形態では、親タンパク質は、ヒト野生型配列又はその断片である。いくつかの実施形態では、親タンパク質は、バリアントを含むヒト配列である。タンパク質バリアントは、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、又はそれをコードするアミノ配列を指し得る。好ましくは、タンパク質バリアントは、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して約１～約２０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１～約８つのアミノ酸修飾を有する。本明細書におけるタンパク質バリアント配列は、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性、好ましくは少なくとも約９０％の同一性、好ましくは少なくとも約９５％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し得る。本明細書におけるタンパク質バリアント配列は、親タンパク質配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％以下の同一性を有し得る。２つの同様の配列（例えば、ｓＰＤ－１可変ドメイン）間の配列同一性は、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｏｆ Ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，」Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，ＣＤ．（１９７０）「Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｏｆ Ｔｗｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ］，Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｗ．Ｒ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８８）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ Ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４［類似検索方法］、又はＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ，（１９９０）「Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，ｔｈｅ 「ＢＬＡＳＴ」 ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを参照されたい）などのアルゴリズムによって測定することができる。前述のアルゴリズムのいずれかを使用する場合、デフォルトパラメータ（ウィンドウの長さ、ギャップペナルティなど）が使用される。一実施形態では、配列同一性は、デフォルトパラメータを使用して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して行われる。
本明細書で使用される「ＩｇＧバリアント」又は「バリアントＩｇＧ」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、親ＩｇＧとは（やはり、多くの場合、ヒトＩｇＧ配列とは）異なる抗体を意味する。
本明細書で使用される「Ｆｃバリアント」又は「バリアントＦｃ」は、親Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、タンパク質を意味する。いくつかの実施形態では、親Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４からのＦｃ領域などの、ヒト野生型Ｆｃ配列である。したがって、「バリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン」は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインと比較して、アミノ酸修飾（一般に、アミノ酸置換）を含有するものである。例えば、Ｓ２４１Ｐ又はＳ２２８Ｐは、親ＩｇＧ４ヒンジポリペプチドと比較して２２８位に置換プロリンを有するヒンジバリアントであり、番号付けＳ２２８Ｐは、ＥＵインデックスに従い、Ｓ２４１Ｐは、Ｋａｂａｔ番号付けである。ＥＵインデックス、又はＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス、又はＥＵ番号付けスキームは、ＥＵ番号付けを指す（参照により全体が本明細書に組み込まれる、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１－３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたく、また、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８－８５も参照されたい）。いくつかの実施形態では、親Ｆｃドメインは、バリアントを含むヒトＦｃ配列である。ヒトＩｇＧのＦｃドメインに関する本開示で考察される全ての位置については、特に記載がない限り、アミノ酸位置の番号付けは、ＥＵインデックスに従う。修飾は、本明細書に概説される付加、欠失、置換、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。あるいは、バリアントＦｃドメインは、親Ｆｃドメインに対する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のアミノ酸修飾を有し得る。加えて、本明細書で考察されるように、本明細書におけるバリアントＦｃドメインは、非変性ゲル電気泳動などの本明細書に記載の既知の技術を使用して測定して、別のＦｃドメインとともに二量体を形成する能力、並びにＦｃＲｎ受容体に結合する能力を依然として保持する。
本明細書における「可溶性ＰＤ－１」又は「ｓＰＤ－１」という用語は、細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）又はその断片若しくは切断されたバージョンを含有するが、ＰＤ－１の膜貫通ドメイン又は細胞質（細胞内）ドメインを含有しない、プログラム細胞死１（programmed cell death 1、ＰＤ－１）ポリペプチドの可溶性部分を意味する。ヒト野生型ＰＤ－１のＥＣＤの配列は、配列番号９６と記載される。いくつかの実施形態では、切断された野生型ｓＰＤ－１が生物学的活性、例えば、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２への結合を保持する限り、親野生型ｓＰＤ－１ドメインは、Ｎ末端及び／又はＣ末端切断（例えば、切断された配列番号１に記載のヒトｓＰＤ－１）を有し得る。
「ｓＰＤ－１バリアント」という用語は、野生型ｓＰＤ－１のバリアント又はその断片若しくは切断されたバージョンを指す。ｓＰＤ－１バリアントは、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２などのＰＤ－１リガンドへの特異的結合を保持するが、アミノ酸置換を有し、野生型ｓＰＤ－１と比較してＮ又はＣ末端切断を有さない場合がある。この場合の特異的結合は、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓａｐｉｄｙｎｅ ＫｉｎＥｘＡ、又はフローサイトメトリー結合分析などの標準的な結合アッセイによって決定されるものであり、これらのアッセイはまた、結合親和性を決定するために使用することができる。本明細書で考察されるように、ｓＰＤ－１バリアントは、場合によっては、野生型ｓＰＤ－１と比較して増加した結合親和性を有し得る。
「結合親和性」という用語は、タンパク質、例えば、受容体又はそのバリアントと配位結合を形成する、リガンド又はそのバリアントの能力を指す。リガンドとタンパク質との間の結合親和性は、平衡解離定数（equilibrium dissociation constant、ＫＤ）、リガンドとタンパク質（例えば、受容体又はそのバリアント）との間のｋｏｆｆ／ｋｏｎ比によって表すことができる。ＫＤ及び結合親和性は、反比例する。例えば、ＫＤ値は、ＰＤ－１リガンドに結合するのに必要なｓＰＤ－１バリアントの濃度に関連し、より低いＫＤ値（より低いＰＤ－１バリアント濃度）は、ＰＤ－１リガンドに対するより高い結合親和性に対応する。高い結合親和性は、リガンドとタンパク質との間のより高い分子間力に対応する。低い結合親和性は、リガンドとタンパク質との間のより低い分子間力に対応する。いくつかの場合では、リガンド結合親和性の増加は、例えば、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、又はそれ以上のオフレートの減少として表すことができる。
ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合するｓＰＤ－１バリアントの能力は、例えば、アッセイプレート上にコーティングされたＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合する推定的なリガンドの能力によって決定することができる。一実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に対するｓＰＤ－１バリアントの結合活性は、リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２又はｓＰＤ－１バリアントのいずれかを固定化することによってアッセイすることができる。例えば、アッセイは、Ｎｉ活性化ＮＴＡ樹脂ビーズ上のＨｉｓタグに融合されたＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２を固定化することを含み得る。薬剤を適切な緩衝液に添加し、ビーズを所与の温度で一定期間の間インキュベートしてもよい。洗浄して結合していない物質を除去した後、結合したタンパク質を、例えば、ＳＤＳ、高ｐＨの緩衝液などで放出させ、分析することができる。
あるいは、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に対するｓＰＤ－１バリアントの結合親和性は、微生物細胞表面、例えば、酵母細胞表面上にｓＰＤ－１バリアントを提示し、結合した複合体を、例えばフローサイトメトリーによって検出することによって決定することができる。ＰＤ－１リガンドに対するｓＰＤ－１の結合親和性は、限定されないが、実施例に記載の方法、放射性リガンド結合アッセイ、非放射性（蛍光）リガンド結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）、Ｏｃｔｅｔ（商標）などの表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance、ＳＰＲ）、プラズモン－導波路型共鳴（plasmon-waveguide resonance、ＰＷＲ）、熱力学的結合アッセイ、全細胞リガンド結合アッセイ、及び構造に基づくリガンド結合アッセイを含む、当技術分野で認識されている任意の既知の方法を使用して測定することができる。
特定のリガンド又はそのバリアントへの「特異的結合」、又は「～に特異的に結合する」、又は「～に特異的である」とは、測定可能なほどに非特異的相互作用とは異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を持たない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似する対照分子との競合によって決定することができる。いくつかの実施形態では、結合親和性は、標準的なＢｉａｃｏｒｅアッセイなどの、上に論じたような当技術分野のアッセイを使用して測定される。
特定のリガンド又はそのバリアントに対する特異的結合は、例えば、別のリガンドタンパク質に対して少なくとも約１０－４Ｍ、少なくとも約１０－５Ｍ、少なくとも約１０－６Ｍ、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、あるいは少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、少なくとも約１０－１２Ｍ、又はそれ以上のＫＤを有するタンパク質によって呈することができ、ＫＤが、特定のタンパク質－リガンド相互作用の解離速度を指す。典型的には、リガンドに特異的に結合するタンパク質は、そのタンパク質と比較して、対照分子に対して２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍以上高いＫＤを有するであろう。
本明細書で使用される「残基」とは、タンパク質における位置及びその関連するアミノ酸同一性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７又はＮ２９７とも称される）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の２９７位の残基である。
本明細書で使用される「インターロイキン－１５」、「ＩＬ－１５」、「ＩＬ１５」、又は「ＭＧＣ９７２１」は、哺乳動物インターロイキン１５（好ましくは、霊長類インターロイキン１５、より好ましくはヒトインターロイキン１５）又はその機能的／生物学的に活性な断片若しくはバリアントを指す。本明細書に開示の「機能的」又は「生物学的に活性」という用語は、ＩＬ－１５断片のポリペプチド又はそのバリアントが、以下に記載の少なくとも１つの機能アッセイにおいて、天然ＩＬ－１５タンパク質のものと同様（７５％以上）の機能を有することを指す。当該ＩＬ－１５ポリペプチドは、ヒトＩＬ－１５アミノ酸配列（配列番号１０）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し得る。いくつかの場合では、「ＩＬ－１５」は、そのようなＩＬ－１５ポリペプチド、又はその機能的／生物学的活性断片、又はそのバリアントをコードする、ヌクレオチドを指す。機能的に、ＩＬ－１５は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化及び増殖を調節するサイトカインである。ＩＬ－１５及びＩＬ－２は、ＣＤ１２２、ＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体サブユニットへの結合を含む、多くの生物学的活性を共有する。ＣＤ８＋メモリー細胞の数は、このＩＬ－１５とＩＬ－２とのバランスによって制御される。ＩＬ－１５は、ＪＡＫキナーゼの活性化、並びに転写活性化因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴＳ、及びＳＴＡＴ６のリン酸化及び活性化を誘導する。ＩＬ－１５はまた、アポトーシス阻害因子ＢＣＬ２Ｌｌ／ＢＣＬ－ｘ（Ｌ）の発現を増加させる。ＩＬ－１５ポリペプチドの例示的な機能アッセイとしては、Ｔ細胞の増殖（例えば、Ｍｏｎｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５）１４２：２９２を参照されたい）、ｋｉｔ２２５細胞株に対する増殖誘導（ＨＯＲＩ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．７０（４），ｐ：１０６９－７２，１９８７）、並びにＮＫ細胞、マクロファージ、及び好中球の活性化が挙げられる。特定の免疫細胞亜集団の単離、及び増殖（すなわち、３Ｈ－チミジン取り込み）の検出のための方法は、当該分野で周知である。細胞媒介性細胞に対する細胞傷害性アッセイは、ＮＫ細胞、マクロファージ、及び好中球活性化を測定するために使用することができる。同位体（５１Ｃｒ）、色素（例えば、テトラゾリウム、ニュートラルレッド）、又は酵素の放出を含む、市販のキットを用いる細胞媒介性細胞に対する細胞傷害性アッセイもまた、当該分野で周知である（Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｍ、Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）。ＩＬ－１５はまた、Ｆａｓ媒介性アポトーシスを阻害することが示されている（Ｄｅｍｉｒｃｉ ａｎｄ Ｌｉ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００４）１：１２３を参照されたい）。例えば、市販のキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）を用いる、ＴＵＮＥＬアッセイ及びアネキシンＶアッセイを含むアポトーシスアッセイは、当該分野で周知である。また、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１－２００６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第１０８９４８１６（Ｂ２）号）を参照されたい。
「インターロイキン－１５受容体アルファ」又は「ＩＬ－１５Ｒα」という用語は、天然哺乳動物ＩＬ－１５Ｒαアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するポリペプチド、又はそのような生物学的に活性なポリペプチドをコードするヌクレオチドを指し、そのようなポリペプチドが、少なくとも１つの機能アッセイにおいて、天然ＩＬ－１５Ｒαタンパク質のものと同様の（７５％以上の）機能を有することを意味する。ＩＬ－１５Ｒαは、高い親和性でＩＬ－１５に特異的に結合するサイトカイン受容体である。１つの機能アッセイは、天然ＩＬ－１５タンパク質への特異的結合である。
本明細書で使用される「ＩＬ－１５Ｒαスシドメイン」は、ＩＬ－１５Ｒαのスシドメインを指し、これは、一方の面が水素結合して三本鎖中央領域を形成する３つのβ鎖を含有し、反対の面が２つの別々のβ鎖によって形成される、βサンドイッチ構造に基づく。ＩＬ－１５Ｒαスシドメインは、ＩＬ－１５と相互作用し、ＩＬ－１５の生物学的機能を媒介するのに必須であり、例えば、ＩＬ－１５媒介性Ｔ細胞増殖の中和、並びにアポトーシス及び壊死の救済に重要である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインは、配列番号１１に記載のヒト野生型ＩＬ－１５ＲαスシポリペプチドのＥＣＤを指す。
本明細書において「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」又は「ヒンジドメイン」とは、抗体の第１の定常ドメインと第２の定常ドメインと間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインは、ＥＵ２１５位で終わり、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、残基ＥＵ２３１位で始まる。したがって、ＩｇＧでは、抗体ヒンジは、本明細書において、２１６位（ＩｇＧ１のＥ２１６）～２３０位（ＩｇＧ１のｐ２３０）を含むと定義され、番号付けが、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従う。いくつかの場合では、ヒンジドメインのＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方により少ないアミノ酸を含有する、「ヒンジ断片」が使用される。本明細書に概説されるように、いくつかの場合では、ヒンジを含むＦｃドメインが使用され、ヒンジは、一般に可動性リンカーとして使用される。（加えて、本明細書で更に記載されるように、ヒンジを有するか又は有さないかのいずれかの追加の可動性リンカー成分が使用され得る）。
本明細書で使用される「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」若しくは「Ｆｃドメイン」とは、ＩｇＧ分子のＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを意味し、いくつかの場合では、ヒンジを含む。ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けでは、ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、アミノ酸２３１～４４７を含み、ヒンジは、２１６～２３０である。したがって、「Ｆｃドメイン」の定義には、アミノ酸２３１～４４７（ＣＨ２－ＣＨ３）若しくは２１６～４４７（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）の両方、又はそれらの断片が含まれる。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、いくつかの場合では、これらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端を含む。ＩｇＡ及びＩｇＭでは、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧでは、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３を含み、いくつかの場合では、Ｃγ１とＣγ２との間に下部ヒンジ領域を含む。この文脈における「Ｆｃ断片」は、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか又は両方からのアミノ酸をあまり含有しない場合があるが、一般に、サイズに基づく標準的な方法（例えば、非変性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）を使用して検出することができる場合、別のＦｃドメイン又はＦｃ断片と二量体を形成する能力を依然として保持している。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、本開示において、特に有用なものであり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４からのＦｃドメインであり得る。一般に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４が、ＩｇＧ３よりも頻繁に使用される。いくつかの実施形態では、例えば、１つ以上のＦｃγＲ受容体若しくはＦｃＲｎ受容体への結合を変化させるために、及び／又はインビボでの半減期を増加させるために、Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾が行われる。
本明細書で使用される「ＩｇＧサブクラス修飾」又は「アイソタイプ修飾」とは、１つのＩｇＧアイソタイプの１個のアミノ酸を、異なる、整合したＩｇＧアイソタイプの対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＥＵ２９６位に、ＩｇＧ１はチロシンを含み、ＩｇＧ２はフェニルアラニンを含むため、ＩｇＧ２のＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス修飾であるとみなされる。同様に、２４１位に、ＩｇＧ１はプロリンを有し、ＩｇＧ４はセリンを有するため、Ｓ２４１Ｐを有するＩｇＧ４分子は、ＩｇＧサブクラス修飾であるとみなされる。サブクラス修飾は、本明細書のアミノ酸置換とみなされることに留意されたい。
本明細書で使用される「天然に存在しない修飾」とは、アイソタイプ性ではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧのうちのいずれも２９７位にアスパラギンを含まないため、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４（又はそれらのハイブリッド）におけるＮ２９７Ａ置換は、天然に存在しない修飾であると考えられる。
本明細書で使用される「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」とは、ＤＮＡ及びＲＮＡによってコードされている２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。
本明細書で使用される「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体又はリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能としては、限定されないが、抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cellular cytotoxicity、ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（antibody-dependent cellular phagocytosis、ＡＤＣＰ）、及び補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）が挙げられる。多くの場合、異なるＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ４）又はＦｃドメインにおけるアミノ酸置換のいずれかを使用して、ほとんどの又は全てのエフェクター機能を除去することが望ましいが、しかしながら、ＦｃＲｎ受容体への結合を保存することは、ヒト血清中での融合タンパク質の半減期に寄与するため、望ましい。
本明細書で使用される「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、又は「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、かつＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトでは、このファミリーとしては、限定されないが、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、及びＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ－１及びＦｃγＲＩＩｂ－２を含む）、及びＦｃγＲＩＩｃを含む、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；並びにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）、及びＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７－６５）、並びに任意の発見されていないヒトＦｃγＲ又はＦｃγＲアイソフォーム又はアロタイプが挙げられる。ＦｃγＲは、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを含む、任意の生物からのものであり得る。マウスＦｃγＲとしては、限定されないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃγＲＩＩＩ－２（ＣＤ１６－２）、並びに任意の発見されていないマウスＦｃγＲ又はＦｃγＲアイソフォーム又はアロタイプが挙げられる。
本明細書で使用される「ＦｃＲｎ」又は「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。
本明細書で使用される「リンカー」、「ドメインリンカー」、「リンカードメイン」、又は「リンカーペプチド」によって、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体配座であると仮定するような方式で、２つの分子を連結させるのに十分な長さを有する。リンカー又はリンカーペプチドは、主に、以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、又はＧｉｎを含み得る。一実施形態では、リンカーは、約１～５０アミノ酸長、好ましくは約１～２０アミノ酸長である。一実施形態では、１～２０アミノ酸長のリンカーが使用され得、いくつかの実施形態では、約８～約２０個のアミノ酸の使用が見出される。有用なリンカーとしては、例えば、ｎが、少なくとも１つの整数（一般に、３～４）である（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎを含む、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、並びに他の可動性リンカーが挙げられる。あるいは、限定されないが、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含む、多様な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとしての使用が見出され得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、「ドメインリンカー」であり、ｓＰＤ－１バリアントドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するか、又はＩＬ－１５ドメイン若しくはＩＬ－１５Ｒαスシドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するなど、本明細書に概説される任意の２つのドメインを一緒に連結するために使用される。任意の好適なリンカーが使用され得るが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１つの整数（かつ、一般に、３～４～５）である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン－セリンポリマー、並びに各ドメインがその生物学的機能を保持することを可能にするように十分な長さ及び可動性を有する２つのドメインの組換え結合を可能にする、任意のペプチド配列を利用する。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択される配列を有する。
本明細書で使用される「標的細胞」とは、標的ポリペプチド又はタンパク質を発現する細胞を意味する。
本明細書の開示によるｓＰＤ－１バリアントドメイン、ＩＬ－１５ドメイン、及びＩＬ－１５Ｒαドメインを含む二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を産生する文脈における「宿主細胞」とは、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質の成分をコードする外因性核酸を含有し、好適な条件下でそのような二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を発現することが可能である、細胞を意味する。好適な宿主細胞については、以下に記載する。
本明細書において「改善された活性」又は「改善された機能」とは、少なくとも１つの生化学的特性の望ましい変化を意味する。この文脈における改善された機能は、所望の特性の増加（例えば、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に対する結合親和性の増加、ＩＬ－１５のアゴニスト活性の向上、半減期の延長、並びにがん及び／又は感染症を治療するための相乗的効力など）を伴う、特定の活性の増加若しくは減少のパーセンテージとして、又は「倍数」変化として測定され得る。一般に、パーセンテージ変化は、１００％未満の生化学的活性の変化について記載するために使用され、倍率変化は、（親タンパク質と比較して）１００％超の生化学的活性の変化について記載するために使用される。本開示では、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、及び９９％の生化学的活性の変化パーセンテージ（通常は増加）を達成することができる。本開示では、「増加倍数」（又は減少倍数）は、親タンパク質と比較して測定される。多くの実施形態では、改善は、少なくとも１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍以上である。
Ｃ．二重特異性融合タンパク質
本明細書に記載されるように、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ－１５ドメイン、ＩＬ－１５Ｒαスシドメイン、Ｆｃドメイン、可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）バリアントドメイン、及び任意選択的に、必要な場合、これらのドメイン間を連結するドメインリンカーを含む。
本明細書に記載されるように、融合タンパク質の形式は、いくつかの構成をとる場合があり、成分ドメインが、タンパク質中で順序が切り替わる（Ｎ末端からＣ末端へと）。
一実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５ドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）Ｆｃドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む。
更なる実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ＩＬ－１５ドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）Ｆｃドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む。
追加の実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）Ｆｃドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５ドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、を含む。
更なる実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）Ｆｃドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ＩＬ－１５ドメインと、を含む。
追加の実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５ドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）Ｆｃドメインと、を含む。
更なる実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ＩＬ－１５ドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）Ｆｃドメインと、を含む。
追加の実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５ドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）Ｆｃドメインと、を含む。
更なる実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５ドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）Ｆｃドメインと、を含む。
追加の実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）Ｆｃドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５ドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む。
更なる実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）Ｆｃドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５ドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む。
追加の実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）Ｆｃドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５ドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、を含む。
更なる実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）Ｆｃドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ＩＬ－１５ドメインと、を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆｃドメインを他のドメインと連結する際に使用されない。いくつかの場合では、同じＦｃ融合タンパク質が、いくらか異なって標識され得ることに留意されたい。例えば、Ｆｃドメインがヒンジドメインを含む場合、ｓＰＤ－１バリアントドメイン－Ｆｃドメイン又はＩＬ－１５－Ｆｃドメイン又はＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃドメインを含む、Ｆｃ融合タンパク質は、ヒンジドメインの形態のリンカーを依然として含む。あるいは、この同じタンパク質は、Ｆｃドメインに含まれるヒンジドメインを有さない場合があり、その場合、融合タンパク質は、ｓＰＤ－１バリアントドメイン－ＣＨ２－ＣＨ３、ＩＬ－１５－ＣＨ２－ＣＨ３、又はＩＬ－１５Ｒα－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、Ｆｃドメインが、ヒンジドメインを含み、Ｆｃドメインが、他のドメイン（すなわち、ｓＰＤ－１バリアントドメイン、及び／又はＩＬ－１５ドメイン若しくはＩＬ－１５Ｒαスシドメイン）とヒンジドメインによって（Ｎ末端からＣ末端へと、又はＣ末端からＮ末端へと）：他のドメイン－ヒンジドメイン－ＣＨ２－ＣＨ３の形式で連結されている、本明細書に記載の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｆｃドメインが、ヒンジドメインを含み、Ｆｃドメインが、他のドメイン（すなわち、ｓＰＤ－１バリアントドメイン、及び／又はＩＬ－１５ドメイン若しくはＩＬ－１５Ｒαスシドメイン）と追加のリンカーによって（Ｎ末端からＣ末端へと、又はＣ末端からＮ末端へと）：他のドメイン－ドメインリンカー－ヒンジドメイン－ＣＨ２－ＣＨ３；他のドメイン－ドメインリンカー－ＣＨ２－ＣＨ３；他のドメイン－ドメインリンカー－ＣＨ２－ＣＨ３－ヒンジドメイン；又は他のドメイン－ドメインリンカー－ＣＨ２－ＣＨ３の形式で連結されている、上記の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｆｃドメインが、ヒンジドメインを含まず、Ｆｃドメインが、他のドメイン（すなわち、ｓＰＤ－１バリアントドメイン、及び／又はＩＬ－１５ドメイン若しくはＩＬ－１５Ｒαスシドメイン）と本明細書に記載のドメインリンカー（例えば、非ヒンジ）によって連結されている、上記の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
以下の表１は、本開示のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列、並びにそれらに割り当てられた配列番号を示す。
Figure 2024520569000001
Figure 2024520569000002
 （上記表の続き）
１．ｓＰＤ－１バリアントドメイン
本開示のｓＰＤ－１バリアントドメインは、バリアントを含むヒトＰＤ－１の可溶性ＥＣＤを含む。ｓＰＤ－１バリアントは、野生型ＰＤ－１と比較して、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に対する結合親和性及び／又は特異性を増加させるように機能し、結合親和性及び／又は特異性は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイなどの当技術分野の結合親和性アッセイによって、又は実施例２に開示の社内開発されたＥＬＩＳＡに基づくバイオアッセイによって決定される。
いくつかの実施形態では、本開示のｓＰＤ－１バリアントは、ＰＤ－１リガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２）に結合し、それを遮断し、それによって、リガンドのその受容体ＰＤ－１への結合を干渉又は阻害する、アンタゴニストである。アンタゴニストは、ＰＤ－１受容体に結合するのに利用可能なリガンドの量を低減することを介して、ＰＤ－１によって媒介されるシグナル伝達経路を阻害することによって、免疫応答を向上することができる。したがって、より強固な免疫応答が対象によって生成され得る。
いくつかの場合では、有用なｓＰＤ－１バリアントドメインは、標的細胞上、例えばがん細胞上のＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に特異的に結合し、それによって、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１（例えば、免疫細胞上、例えばＴ細胞上の野生型ＰＤ－１）との間の相互作用を低減する（例えば、遮断する、防止するなど）。したがって、本明細書で提供されるｓＰＤ－１バリアントは、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に対する操作されたデコイ受容体として作用することができる。ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２と野生型ＰＤ－１との間の相互作用を低減することによって、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、ＰＤ－Ｌ／ＰＤ－１相互作用によって産生される免疫阻害シグナルを減少させることができ、したがって、（例えば、Ｔ細胞活性化を増加させることによって）免疫応答を増加させることができる。好適なｓＰＤ－１バリアントドメインは、通常、シグナル配列と膜貫通ドメインとの間に位置する、ＰＤ－１リガンドに認識可能な親和性、例えば、高い親和性で結合するのに十分であるＰＤ－１の部分、又は結合活性を保持するその断片を含み得る。
いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントは、野生型ＰＤ－１と比較して、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２のいずれか又は両方に対するその結合活性を増加又は向上する、配列番号９６に記載のＷＴ ＰＤ－１ドメインに対するアミノ酸置換、欠失、若しくは挿入、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントは、野生型ＰＤ－１と比較して、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２のいずれか又は両方に対するその結合活性を増加又は向上する、配列番号１に記載のＷＴ ＰＤ－１断片に対するアミノ酸置換、欠失、若しくは挿入、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
本開示は、成熟領域から始まる番号付けを使用して、配列番号１のヒト野生型親ＰＤ－１断片と比較して位置３８、６３、６５、９２、１００、１０３、１０８、及び１１６に対応する１つ以上（例えば、いくつか）の位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントは、親ＰＤ－１ドメインに対して少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％であるが、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、又は９０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、親ＰＤ－１ドメインは、配列番号１である。好ましい実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、切断されたバリアントｓＰＤ－１が、生物学的活性（例えば、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２への結合）を保持する限り、配列番号９６に記載の野生型ｓＰＤ－１と比較してＮ末端及び／又はＣ末端切断を有し得る。明確にするために、本開示のｓＰＤ－１バリアントは、天然に存在せず、野生型ｓＰＤ－１と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、したがって、配列番号１又は配列番号９６を有さない。
本開示は、配列番号１の３８、６３、６５、９２、１００、１０３、１０８、及び１１６位からなる群から選択される位置に対応する１つ以上（例えば、いくつか）の位置に、１つ以上のアミノ酸置換を含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の３８位に対応する位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の６３位に対応する位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の６５位に対応する位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の９２位に対応する位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の１００位に対応する位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の１０３位に対応する位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の１０８位に対応する位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の１１６位に対応する位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓＰＤ－１バリアントドメインは、当該位置のうちの１つ、当該位置のうちの２つ、当該位置のうちの３つ、当該位置のうちの４つ、当該位置のうちの５つ、当該位置のうちの６つ、当該位置のうちの７つ、又は当該位置のうちの８つに、アミノ酸置換を有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と比較してＳ３８Ｇ、Ｓ６３Ｇ、Ｐ６５Ｌ、Ｎ９２Ｓ、Ｇ１００Ｓ、Ｓ１０３Ｖ、Ａ１０８Ｉ、及びＡ１１６Ｖからなる群から選択されるアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と比較して、Ｎ９２Ｓ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖ、Ｓ３８Ｇ／Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｎ９２Ｓ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖ、Ｓ３８Ｇ／Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖ、Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８１／Ａ１１６Ｖ、Ｓ６３Ｇ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖ、Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖ、Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖ、及びＧ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と比較して、アミノ酸置換Ｎ９２Ｓ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と比較して、アミノ酸置換Ｓ３８Ｇ／Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｎ９２Ｓ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と比較して、アミノ酸置換Ｓ３８Ｇ／Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と比較して、アミノ酸置換Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と比較して、アミノ酸置換Ｓ６３Ｇ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と比較して、アミノ酸置換Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と比較して、アミノ酸置換Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と比較して、アミノ酸置換Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉのセットを含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４のアミノ酸配列を含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号５のアミノ酸配列を含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６のアミノ酸配列を含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８のアミノ酸配列を含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号９のアミノ酸配列を含む、ｓＰＤ－１バリアントドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の３８位に対応する位置に、セリンのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、置換は、１９個の天然に存在するアミノ酸、スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びチロシンのうちの任意の他のものによるものであり、いくつかの実施形態では、システイン（ジスルフィド形成の可能性に起因する）又はプロリン（立体効果に起因する）を利用しない。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３８Ｇである。
いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の６３位に対応する位置に、セリンのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、置換は、１９個の天然に存在するアミノ酸、スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びチロシンのうちの任意の他のものによるものであり、いくつかの実施形態では、システイン（ジスルフィド形成の可能性に起因する）又はプロリン（立体効果に起因する）を利用しない。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ６３Ｇである。
いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の６５位に対応する位置に、プロリンのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、置換は、１９個の天然に存在するアミノ酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びチロシンのうちの任意の他のものによるものであり、いくつかの実施形態では、システイン（ジスルフィド形成の可能性に起因する）を利用しない。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ６５Ｌである。
いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の９２位に対応する位置に、アスパラギンのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、置換は、１９個の天然に存在するアミノ酸、セリン、スレオニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びチロシンのうちの任意の他のものによるものであり、いくつかの実施形態では、システイン（ジスルフィド形成の可能性に起因する）又はプロリン（立体効果に起因する）を利用しない。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｎ９２Ｓである。
いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の１００位に対応する位置に、グリシンのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、置換は、１９個の天然に存在するアミノ酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びチロシンのうちの任意の他のものによるものであり、いくつかの実施形態では、システイン（ジスルフィド形成の可能性に起因する）又はプロリン（立体効果に起因する）を利用しない。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｇ１００Ｓである。
いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の１０３位に対応する位置に、セリンのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、置換は、１９個の天然に存在するアミノ酸、スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びチロシンのうちの任意の他のものによるものであり、いくつかの実施形態では、システイン（ジスルフィド形成の可能性に起因する）又はプロリン（立体効果に起因する）を利用しない。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ１０３Ｖである。
いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の１０８位に対応する位置に、アラニンのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、置換は、１９個の天然に存在するアミノ酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びチロシンのうちの任意の他のものによるものであり、いくつかの実施形態では、システイン（ジスルフィド形成の可能性に起因する）又はプロリン（立体効果に起因する）を利用しない。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ａ１０８Ｉである。
いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の１１６位に対応する位置に、アラニンのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、置換は、１９個の天然に存在するアミノ酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びチロシンのうちの任意の他のものによるものであり、いくつかの実施形態では、システイン（ジスルフィド形成の可能性に起因する）又はプロリン（立体効果に起因する）を利用しない。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ａ１１６Ｖである。
いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントタンパク質は、ＰＤ－１の全長ＥＣＤよりも短い。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントは、切断され形態が、本明細書に概説される結合アッセイのうちの１つによって測定して、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合する能力を保持する限り、ＥＣＤの切断されたバージョンを含み得る。当技術分野で既知であるように、例えば、配列番号９６のおよそ残基１、５、１０、１５、２０、２５、３０からおよそ残基３３、３５、４０、４５、又は５０まで、Ｎ及びＣ末端の両方の切断が可能である。いくつかの場合では、活性が保持される限り、数個のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、又は６つ）のみが、Ｎ及びＣ末端のいずれか又は両方から除去される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓＰＤ－１バリアントは、野生型ＰＤ－１ポリペプチド／ドメインよりも良好である、ＰＤ－１リガンド（すなわち、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２）に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、Ｓｐｄ－１バリアントは、野生型ＰＤ－１のものよりも少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍以上である、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、Ｓｐｄ－１バリアントは、野生型ＰＤ－１のものよりも少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍以上である、ＰＤ－Ｌ１に対する結合親和性を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｓｐｄ－１バリアントは、野生型ＰＤ－１のものよりも少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍以上である、ＰＤ－Ｌ２に対する結合親和性を有し得る。
ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、又はその両方に対するＳｐｄ－１バリアントの結合親和性は、野生型ＰＤ－１のものと比較して少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上増加する。他の実施形態では、本開示のＳｐｄ－１バリアントは、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に対して約１×１０－８Ｍ、１×１０－９Ｍ、１×１０－１０Ｍ、又は１×１０－１２Ｍ未満の結合親和性を有する。本開示のＳｐｄ－１バリアントは、ＰＤ－Ｌ１に対して約１×１０－８Ｍ、１×１０－９Ｍ、１×１０－１０Ｍ、又は１×１０－１２Ｍ未満の結合親和性を有し得る。本開示のｓＰＤ－１バリアントは、ＰＤ－Ｌ２に対して約１×１０－８Ｍ、１×１０－９Ｍ、１×１０－１０Ｍ、又は１×１０－１２Ｍ未満の結合親和性を有し得る。更に他の実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントは、インビボ、インビトロのいずれか又は両方でのＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２への野生型ＰＤ－１の結合を阻害するか又はそれらに競合する。
いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントは、野生型ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１に対する解離半減期よりも２倍以上（例えば、５倍以上、１０倍以上、１００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上、５０００倍以上、１００００倍以上など）長い、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に対する解離半減期を有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示のｓＰＤ－１バリアントドメインのうちのいずれか１つを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示のｓＰＤ－１バリアントドメインのうちのいずれか１つと、本明細書に開示のＦｃドメインのうちのいずれか１つと、を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示のｓＰＤ－１バリアントドメインのうちのいずれか１つと、本明細書に開示のＦｃドメインのうちのいずれか１つと、本明細書に開示のドメインリンカーのうちのいずれか１つと、を含む、組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示のｓＰＤ－１バリアントドメインと、ＩＬ－１５ドメインと、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、Ｆｃドメインと、本明細書に開示の任意選択的なドメインリンカーと、を含む、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を含む、組成物を提供する。
２．Ｆｃドメイン
本明細書で考察されるように、上記のｓＰＤ－１バリアントドメインに加えて、本開示の融合タンパク質はまた、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むいくつかのサブクラスを有するＩｇＧクラスに一般に基づく抗体のＦｃドメインを含む。本明細書に記載されるように、Ｆｃドメインは、任意選択的に、ＩｇＧ抗体のヒンジドメインを含む。
ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、本開示において特に有用なものであり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４からのＦｃドメインであり得る。一般に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４が、ＩｇＧ３よりも頻繁に使用される。
本開示の融合タンパク質に含まれるヒトＩｇＧタンパク質のＦｃドメインは、融合タンパク質の半減期の有意な増加を付与し、Ｉｇ分子との追加の結合又は相互作用を提供する。いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃドメインを含まない対応する融合タンパク質と比較して、他の分子の精製、多量体化、結合、及び中和を促進し得る。
本開示での用途が見出されるＦｃドメインはまた、必要に応じて、機能を変化させるためにＦｃバリアントを含有し得る。しかしながら、任意のＦｃバリアントは、一般に、二量体を形成する能力、並びにＦｃＲｎに結合する能力の両方を保持する必要がある。したがって、本明細書における実施形態のうちの多くは、エフェクター機能を回避するためにヒトＩｇＧ４ドメインの使用に依存するが、他のＩｇＧドメインにおける機能を強化又は排除するＦｃバリアントが作製され得る。したがって、例えば、当業者によって理解されるであろうように、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２におけるエフェクター機能を低減若しくは排除する除去バリアントが使用され得、かつ／又はＦｃＲｎへのより強固な結合を付与するＦｃバリアントが使用され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン又はバリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、本開示のＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、本開示のＦｃドメインは、バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである。
ａ．ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン
ＩｇＧ４サブクラスは、Ｃ１ｑタンパク質複合体へのごくわずかな結合しか呈さず、古典的な相補的経路を活性化することが不可能であるため、他のＩｇＧサブクラスと区別される（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ａ．Ｎｉｒｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ２３：１１９－１２４）。結果として、ＩｇＧ４は、有意なエフェクター機能を有さないため本開示での使用が見出され、したがって、細胞枯渇を伴わずに受容体－リガンド結合を遮断するために使用される。
別の実施形態では、本開示のＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。
いくつかの実施形態では、本開示のＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジＣＨ２－ＣＨ３を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ４のＣＨ２－ＣＨ３を含む。
別の実施形態では、本開示のＦｃドメインは、バリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。しかしながら、本明細書のバリアントＦｃドメインは、既知のものを使用して測定して、別のＦｃドメインと二量体を形成する能力、並びにＦｃＲｎに結合する能力を依然として保持しているため、これは、本明細書の融合タンパク質の血清半減期の増加に有意に寄与する。
バリアントＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、親ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインと比較して、付加、欠失、置換、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のバリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、（上に考察される同一性アルゴリズムを使用し、一実施形態では、デフォルトパラメータを使用して、当技術分野で既知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを利用して）対応する親ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインに対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であるが、１００％未満の同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、本開示のバリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、配列番号２４に記載の親ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸修飾を有し得る。
いくつかの実施形態では、バリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、ＥＵ番号付けインデックスに従って２２８位のセリンのプロリンへのアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＦｃドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＦｃドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
ｂ．他のＩｇＧ Ｆｃドメイン
いくつかの実施形態では、本開示のＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３などの、ＩｇＧ４以外の他のＩｇＧからのＦｃドメインであり得る。一般に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が、ＩｇＧ３よりも頻繁に使用される。
いくつかの実施形態では、本開示のＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。
いくつかの実施形態では、本開示のＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメインである。
いくつかの実施形態では、本開示のＦｃドメインは、バリアントヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
いくつかの実施形態では、本開示のＦｃドメインは、バリアントヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインである。
いくつかの実施形態では、本開示のバリアントヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、（上に考察される同一性アルゴリズムを使用し、一実施形態では、デフォルトパラメータを使用して、当技術分野で既知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを利用して）対応する親ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であるが、１００％未満の同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、本開示のバリアントヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、（上に考察される同一性アルゴリズムを使用し、一実施形態では、デフォルトパラメータを使用して、当技術分野で既知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを利用して）対応する親ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインに対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であるが、１００％未満の同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、本開示のバリアントヒトＩｇＧ３ Ｆｃドメインは、（上に考察される同一性アルゴリズムを使用し、一実施形態では、デフォルトパラメータを使用して、当技術分野で既知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを利用して）対応する親ヒトＩｇＧ３ Ｆｃドメインに対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であるが、１００％未満の同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、本開示のバリアントヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、親ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸修飾を有し得る。
いくつかの実施形態では、本開示のバリアントヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、親ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸修飾を有し得る。
いくつかの実施形態では、本開示のバリアントヒトＩｇＧ３ Ｆｃドメインは、親ヒトＩｇＧ３ Ｆｃドメインと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸修飾を有し得る。
３．ＩＬ－１５ドメイン
本開示のＩＬ－１５ドメインは、哺乳動物ＩＬ－１５、又はその生物学的に活性な断片若しくはバリアントを含む。好ましい実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは、霊長類ＩＬ－１５、又はその生物学的に活性な断片若しくはバリアントである。より好ましい実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは、ヒトＩＬ－１５である。本明細書に開示のＩＬ－１５の「生物学的に活性な断片又はそのバリアント」という用語は、野生型ＩＬ－１５に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有するポリペプチドを指し、ポリペプチドが、本明細書に記載の少なくとも１つの機能アッセイにおいて、野生型ＩＬ－１５のものと同様（７５％以上）の機能を有する。したがって、本明細書に開示の「ヒトＩＬ－１５の生物学的に活性な断片又はそのバリアント」という用語は、配列番号１０に記載のヒトＩＬ－１５に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有するポリペプチドを指し、ポリペプチドが、本明細書に記載の少なくとも１つの機能アッセイにおいて、ヒトＩＬ－１５タンパク質のものと同様（７５％以上）の機能を有する。
ＩＬ－１５ドメインは、ＮＫ、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）、及びＣＤ８＋Ｔ細胞、特にメモリー表現型ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び活性化を刺激するように機能し、細胞傷害性、並びにＩＦＮ－γ及びＩＦＮ－αの産生の増加をもたらす。加えて、ＩＬ－１５ドメインは、抗アポトーシスタンパク質の発現を増加させ、アポトーシス促進性タンパク質の産生を減少させることによって、免疫細胞のアポトーシスを阻害する。ＩＬ－１５ポリペプチドの例示的な機能アッセイとしては、Ｔ細胞の増殖（例えば、Ｍｏｎｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５）１４２：２９２を参照されたい）、ｋｉｔ２２５細胞株に対する増殖誘導（ＨＯＲＩ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．７０（４），ｐ：１０６９－７２，１９８７）、並びにＮＫ細胞、マクロファージ、及び好中球の活性化が挙げられる。細胞媒介性細胞に対する細胞傷害性アッセイは、ＮＫ細胞、マクロファージ、及び好中球活性化を測定するために使用することができる。同位体（５１Ｃｒ）、色素（例えば、テトラゾリウム、ニュートラルレッド）、又は酵素の放出を含む、市販のキットを用いる細胞媒介性細胞に対する細胞傷害性アッセイもまた、当該分野で周知である（Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｍ、Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）。ＩＬ－１５はまた、Ｆａｓ媒介性アポトーシスを阻害することが示されている（Ｄｅｍｉｒｃｉ ａｎｄ Ｌｉ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００４）１：１２３を参照されたい）。例えば、市販のキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）を用いる、ＴＵＮＥＬアッセイ及びアネキシンＶアッセイを含むアポトーシスアッセイは、当該分野で周知である。また、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１－２００６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第１０８９４８１６（Ｂ２）号）を参照されたい。ほとんどの実施形態では、本開示のＩＬ－１５結合活性は、実施例２に開示の社内開発されたＥＬＩＳＡに基づくバイオアッセイを使用して分析した。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは、ヒトＩＬ－１５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは、ヒトＩＬ－１５の生物学的に活性な断片又はバリアントであり、ヒトＩＬ－１５アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは、ヒトＩＬ－１５の生物学的に活性な断片又はバリアントであり、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
４．ＩＬ－１５Ｒαスシドメイン
本開示のＩＬ－１５Ｒαスシドメインは、哺乳動物ＩＬ－１５Ｒαのスシドメイン、又はその生物学的に活性な断片若しくはバリアントを含む。好ましい実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインは、霊長類ＩＬ－１５Ｒαのスシドメイン、又はその生物学的に活性な断片若しくはバリアントである。より好ましい実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインは、ヒトＩＬ－１５Ｒαのスシドメイン、又はその生物学的に活性な断片若しくはバリアントである。本明細書に開示のＩＬ－１５Ｒαの「生物学的に活性な断片又はそのバリアント」という用語は、野生型ＩＬ－１５Ｒαに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するポリペプチドを指し、ポリペプチドが、本明細書に記載の少なくとも１つの機能アッセイにおいて、野生型ＩＬ－１５Ｒαのものと同様（７５％以上）の機能を有する。したがって、本明細書に開示の「ヒトＩＬ－１５Ｒαの生物学的に活性な断片又はそのバリアント」という用語は、配列番号１１に記載のヒトＩＬ－１５ＲαのＥＣＤに対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有するポリペプチドを指し、ポリペプチドが、本明細書に記載の少なくとも１つの機能アッセイにおいて、ヒトＩＬ－１５Ｒαのものと同様（７５％以上）の機能を有する。
ＩＬ－１５Ｒαは、高い親和性でＩＬ－１５に特異的に結合するサイトカイン受容体である。ＩＬ－１５Ｒαのスシドメインは、ＩＬ－１５と相互作用し、ＩＬ－１５の生物学的機能を媒介するのに必須であり、例えば、ＩＬ－１５媒介性Ｔ細胞増殖の中和、並びにアポトーシス及び壊死の救済に重要である。その結合活性は、当該分野で既知の機能アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して、天然ＩＬ－１５タンパク質への特異的結合について測定することができる。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインは、ヒトＩＬ－１５Ｒαのスシドメインのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインは、配列番号１１に記載のヒトＩＬ－１５ＲαスシドメインのＥＣＤのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインは、ヒトＩＬ－１５Ｒαのスシドメインの生物学的に活性な断片又はバリアントであり、ヒトＩＬ－１５Ｒαのスシドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインは、配列番号１１に記載のヒトＩＬ－１５ＲαスシドメインのＥＣＤの生物学的に活性な断片又はバリアントであり、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
５．ドメインリンカー
上記の４つのドメイン（すなわち、ｓＰＤ－１バリアントドメイン、ＩＬ－１５ドメイン、ＩＬ－１５Ｒαスシドメイン、及びＦｃドメイン）は、一般に、本明細書に記載のドメインリンカーを使用して連結される。本開示の文脈において、重要なことは、ｓＰＤ－１バリアントドメイン及びＩＬ－１５ドメイン／ＩＬ－１５Ｒαスシドメインが、３つのドメイン－ｓＰＤ－１バリアント、ＩＬ－１５（ＩＬ－１５Ｒαスシドメインを含む）、及びＦｃドメインが独立して作用することができるような方式で、可動性リンカーを使用してＦｃドメインに結合されることである。これは、従来のリンカー及び／又はヒンジリンカーを使用して、多様な方式で達成することができる。
任意の好適なリンカーが使用され得るが、ドメインリンカーは、主に、以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、又はＧｌｎを含む。有用なリンカーとしては、例えば、ｎが、少なくとも１つの整数（一般に、３～５）である（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎを含む、グリシン－セリンポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態、リンカーとしては、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び各ドメインがその生物学的機能を保持することを可能にするのに十分な長さ及び柔軟性を有する、２つのドメインの組換え結合を可能にする他の可動性リンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含む、多様な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとしての使用が見出され得る。
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）のヒンジドメインが使用される。いくつかの場合では、ヒンジドメインは、アミノ酸置換も同様に含有し得る。例えば、図２１の配列番号２５に示されるように、Ｓ２２８Ｐバリアントを含むＩｇＧ４からのヒンジドメインが使用される。
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、同様に、ＩｇＧ４ヒンジとＳ２２８ＰとＧＧＳＧＧＧＧＳリンカーとの組み合わせなどの、ヒンジドメインと可動性リンカーとの組み合わせである。
一実施形態では、リンカーは、約１～５０アミノ酸長、好ましくは約５～２０アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために、ドメインリンカーが使用される。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために、ドメインリンカーが使用される。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために、ドメインリンカーが使用される。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために、ドメインリンカーが使用される。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ｓＰＤ－１バリアントドメインをＩＬ－１５ドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ｓＰＤ－１バリアントドメインをＩＬ－１５Ｒαドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ドメインリンカーは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ｓＰＤ－１バリアントドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するため使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１５又は配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のドメインリンカーは、ｓＰＤ－１バリアントドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用され、当該第１のドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、第２のドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメイン又はＩＬ－１５Ｒαスシドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用され、当該第２のドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、第３のドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用され、当該第３のドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のドメインリンカーは、ｓＰＤ－１バリアントドメインを（バリアント）ドメインと連結するために使用され、当該第１のドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、第２のドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメイン又はＩＬ－１５Ｒαスシドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用され、当該第２のドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、第３のドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用され、当該第３のドメインリンカーが、配列番号１５又は配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
Ｄ．開示の例示的な実施形態
本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、４つのドメイン：ａ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｂ）ＩＬ－１５ドメインと、ｃ）Ｆｃドメインと、ｄ）可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）バリアントドメインと、を含み、任意選択的に、ドメインリンカーを更に含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、１つのドメインリンカーを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、２つのドメインリンカーを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、第１のドメインリンカー、第２のドメインリンカー、及び第３のドメインリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１のドメインリンカーは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎからなる群から選択され、ｎが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第２のドメインリンカーは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎからなる群から選択され、ｎが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第３のドメインリンカーは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎからなる群から選択され、ｎが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ｓＰＤ－１バリアントドメインを（バリアント）ドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５バリアントドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５バリアントドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５バリアントドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するため使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒａスシドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ｓＰＤ－１バリアントドメインをＩＬ－１５ドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインをＩＬ－１５ドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインをＩＬ－１５ドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインをＩＬ－１５ドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、ｓＰＤ－１バリアントドメインをＩＬ－１５Ｒαドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインをＩＬ－１５Ｒαドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインをＩＬ－１５Ｒαドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインをＩＬ－１５Ｒαドメインと連結するために使用されるドメインリンカーは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つのドメインリンカーは、ｓＰＤ－１バリアントドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、追加のドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメイン又はＩＬ－１５Ｒαスシドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用され、当該追加のドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、更なるドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用され、当該更なるドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つのドメインリンカーは、ｓＰＤ－１バリアントドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、追加のドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメイン又はＩＬ－１５Ｒαスシドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用され、当該追加のドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、更なるドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用され、当該更なるドメインリンカーが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つのドメインリンカーは、ｓＰＤ－１バリアントドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用され、当該ドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、追加のドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメイン又はＩＬ－１５Ｒαスシドメインを（バリアント）Ｆｃドメインと連結するために使用され、当該追加のドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、更なるドメインリンカーは、ＩＬ－１５ドメインをＩＬ－１５Ｒαスシドメインと連結するために使用され、当該更なるドメインリンカーが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ａ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｂ）ＩＬ－１５ドメインと、ｃ）Ｆｃドメインと、ｄ）可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）バリアントドメインと、第１のドメインリンカー、第２のドメインリンカー、及び第３のドメインリンカーと、を含む。
一実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５ドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）Ｆｃドメインと、１）第３のドメインリンカーと、ｇ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む。
更なる実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ＩＬ－１５ドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）Ｆｃドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む。
追加の実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）Ｆｃドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５ドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、を含む。
更なる実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）Ｆｃドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ＩＬ－１５ドメインと、を含む。
追加の実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５ドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）Ｆｃドメインと、を含む。
更なる実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ＩＬ－１５ドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）Ｆｃドメインと、を含む。
追加の実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５ドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）Ｆｃドメインと、を含む。
更なる実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５ドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）Ｆｃドメインと、を含む。
追加の実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）Ｆｃドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５ドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む。
更なる実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）Ｆｃドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５ドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む。
追加の実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）Ｆｃドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５ドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、を含む。
更なる実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ａ）Ｆｃドメインと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ｓＰＤ－１バリアントドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、ｆ）第３のドメインリンカーと、ｇ）ＩＬ－１５ドメインと、を含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に開示のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、及びｇ）ドメインを含み、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の３８、６３、６５、９２、１００、１０３、１０８、及び１１６位からなる群から選択される位置に対応する位置に、１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の３８位に対応する位置に、アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の６３位に対応する位置に、アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の６５位に対応する位置に、アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の９２位に対応する位置に、アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の１００位に対応する位置に、アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の１０３位に対応する位置に、アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の１０８位に対応する位置に、アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１の１１６位に対応する位置に、アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態は、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、当該位置のうちの２つで生じるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、当該位置のうちの３つで生じるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、当該位置のうちの４つで生じるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、当該位置のうちの５つで生じるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、当該位置のうちの６つで生じるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、当該位置のうちの７つで生じるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、当該位置のうちの８つで生じるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１に対して少なくとも９６％の配列番号１の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１に対して少なくとも９７％の配列番号１の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列番号１の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１に対して少なくとも９９％の配列番号１の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に開示のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、及びｇ）ドメインを含み、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のＳ３８Ｇ、Ｓ６３Ｇ、Ｐ６５Ｌ、Ｎ９２Ｓ、Ｇ１００Ｓ、Ｓ１０３Ｖ、Ａ１０８Ｉ、及びＡ１１６Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号１のアミノ酸置換Ｎ９２Ｓ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、アミノ酸置換Ｓ３８Ｇ／Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｎ９２Ｓ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、アミノ酸置換Ｓ３８Ｇ／Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、アミノ酸置換Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、アミノ酸置換Ｓ６３Ｇ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、アミノ酸置換Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、アミノ酸置換Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、アミノ酸置換Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉのセットを含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に開示のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、及びｇ）ドメインを含み、ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓＰＤ－１バリアントドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に開示のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、及びｇ）ドメインを含み、ＩＬ－１５ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に開示のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、及びｇ）ドメインを含み、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に開示のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、及びｇ）ドメインを含み、ＩＬ－１５ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に開示のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、及びｇ）ドメインを含み、Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン又はバリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号２５に記載のＳ２２８Ｐに対応する置換を有するヒトＩｇＧ４のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む、バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである。
いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に開示のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、及びｇ）ドメインを含み、ＩＬ－１５ドメインが、グリコシル化されていない。
いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に開示のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、及びｇ）ドメインを含み、ＩＬ－１５Ｒαドメインが、グリコシル化されていない。
いくつかの実施形態では、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に開示のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、及びｇ）ドメインを含み、Ｆｃドメインが、グリコシル化されていない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、１つのみのＩＬ－１５ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、１つのみのＩＬ－１５Ｒαドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、１つのみのｓＰＤ－１バリアントドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、１つのみのＦｃドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、１つのみのＩＬ－１５ドメインと、１つのみのＩＬ－１５Ｒαドメインと、１つのみのｓＰＤ－１バリアントドメインと、１つのみのＦｃドメインと、を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号３３のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号３５のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号３６のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号３７のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号６２のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号６３のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号６４のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号６５のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号６７のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号６８のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号６９のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号７０のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号７１のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、配列番号７２のアミノ酸配列を含む、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は安定化剤と、を含む、薬学的組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ－１２、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ－１２ＲβのＥＣＤ、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ－１２ＲγのＥＣＤ、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＧＦβ結合ペプチド、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＧＦβ Ｒ２、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＧＦβ Ｒ３、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、可溶性ＴＧＦβ調節ペプチド、その変異体、若しくはその断片、又は可溶性ＴＧＦ－β調節ペプチドを形成することが可能な前駆体を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、可溶性Ｇａｌ９結合ペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｔｉｍ３の細胞外ドメイン、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＤ８０、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＤ８又はＣＤ２８の膜貫通領域を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＯＤ３ζシグナル伝達領域と４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）シグナル伝達領域との融合によって得られるポリペプチド、又はＯＤ３ζシグナル伝達領域とＣＤ２８シグナル伝達領域との融合によって得られるポリペプチドである、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ４、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ４Ｒ、αその変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ－１２、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ－７受容体のアルファ鎖、又はそのバリアント、又はその断片からの膜貫通ドメインを含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ２、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ２Ｒα、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ１０、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＤ１６、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＤ３２、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＤ６４、その変異体、又はその断片を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、抗ＣＤ１９－ｓｃＦｖ、抗ＭＨＣ／ＧＰ１００－ＶＨＨ、抗ＭＨＣ／ＷＴ１－ＶＨ、抗ＣＤ２０－ｓｃＦｖ、及び抗ＣＤ２２－ｓｃＦｖのうちのいずれか１つ又はそれらの組み合わせを含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、グリオーマ関連抗原、がん胎児性抗原（carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α－フェトプロテイン（α-Fetoprotein、ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスタターゼ（prostatase）、前立腺特異抗原（prostate-specific antigen、ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロスタイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原－１（Prostate-Cancer Tumor Antigen-1、ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（Insulin Growth Factor、ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、又は中皮ベジタリアン（Mesothelium Vegetarian）に結合する、抗原結合ドメインを含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、内因性ポリペプチドからの膜貫通ドメイン又はその一部分を含まず、内因性ポリペプチドが、Ｔ細胞受容体のα鎖、Ｔ細胞受容体のβ鎖、Ｔ細胞受容体のζ鎖、ＣＤ２８（Ｔｐ４４としても知られている）、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３３、ＣＤ３７（ＧＰ５２－４０又はＴＳＰＡＮ２６としても知られている）、ＣＤ６４（ＦＣＧＲ１Ａとしても知られている）、ＣＤ８０（Ｂ７、Ｂ７－１、Ｂ７．１、ＢＢ１、ＣＤ２８ＬＧ、ＣＤ２８ＬＧ１、及びＬＡＢ７としても知られている）、ＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ、Ｂ２２０、ＣＤ４５Ｒ、ＧＰ１８０、Ｌ－ＣＡ、ＬＣＡ、ＬＹ５、Ｔ２００、及びタンパク質チロシンホスファターゼ、Ｃ型受容体としても知られている）、ＣＤ４、ＣＤ５（ＬＥＵ１及びＴｌとしても知られている）、ＣＤ８ａ（Ｌｅｕ２、ＭＡＬ、及びｐ３２としても知られている）、ＣＤ９（ＢＴＣＣ－１、ＤＲＡＰ－２７、ＭＩＣ３、ＭＲＰ－１、ＴＳＰ ＡＮ－２９、及びＴＳＰＡＮ２９としても知られている）、ＣＤ１６（ＦＣＧＲ３及びＦＣＧ３としても知られている）、ＣＤ２２（ＳＩＧＬＥＣ－２及びＳＩＧＬＥＣ２としても知られている）、ＣＤ８６（Ｂ７－２、Ｂ７．２、Ｂ７０、ＣＤ２８ＬＧ２、及びＬＡＢ７２としても知られている）、ＣＤ１３４（ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５、ＲＰ５－９０２Ｐ８．３、ＩＭＤ１６、ＯＸ４０、ＴＸＧＰ１Ｌ、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４としても知られている）、ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９、４－ＩＢＢ、ＣＤｗｌ３７、ＩＬＡ、及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９としても知られている）、ＣＤ２７（５１５２、Ｓ１５２．ＬＰＦＳ２、Ｔ１４、ＴＮＦＲＳＦ７、及びＴｐ５５としても知られている）、及びＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４、ＡＬＰＳ５、ＣＥＬＩＡＣ３、ＣＴＬＡ－４、ＧＲＤ４、ＧＳＥ、ＩＤＤＭ１２、及び細胞傷害性Ｔ－リンパ球関連タンパク質４としても知られている）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、いずれのキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）ポリペプチドも含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、単鎖可変断片（single-chain variable fragment、ｓｃＦｖ）を含むドメインを含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、麻疹ウイルスヘマグルチニン（measles virus hemagglutinin、ＭＶＨ）ポリペプチド、麻疹ウイルス融合（measles virus fusion、ＭＶＦ）ポリペプチド、又は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（vesicular stomatitis virus glycoprotein、ＶＳＶＧ）ポリペプチドを含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）ポリペプチド、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、又は顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor、ＧＭ－ＣＳＦ）ポリペプチドを含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ａｄ株Ａｄ６のカプシドヘキソンポリペプチド、又はＡｄ株Ａｄ５７からのカプシドヘキソン超可変領域（capsid hexon hypervaribale region、ＨＶＲ）ポリペプチドを含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、Ｘ因子単鎖抗体ポリペプチドのビタミンＫ依存性ガンマ－カルボキシグルタミン酸ドメインを含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＰＥＧ分子、アルブミン、アルブミン断片、又は抗体（バリアント）若しくはその抗原結合断片である、担体部分を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＤ４７、及びＴＩＧＩＴから選択される１つ以上の抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含まない。
Ｅ．核酸
本開示はまた、ＩＬ－１５ドメインと、ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、Ｆｃドメインと、ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む本明細書に開示の二重特異性融合タンパク質をコードする核酸を含む、組成物を提供する。そのような核酸は、本出願に列挙される二重特異性Ｆｃ融合タンパク質のうちのいずれかをコードすることができる。
本開示の核酸は、実質的な純度で単離及び得ることができる。通常、他の天然に生じる核酸配列を実質的に含まない、一般に、少なくとも約５０％であり、通常は、少なくとも約９０％純粋である、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかとしての核酸が得られ、典型的には、例えば、天然に生じる染色体上では通常関連付けられない１つ以上のヌクレオチドが隣接している「組換え体」である。
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２６の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２７の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２７の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２９の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号３０の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号３１の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号３２の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号３３の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号３４の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号３５の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号３６の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号３７の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６２の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６３の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６４の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６５の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６６の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６７の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６８の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号６９の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号７０の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号７１の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号７２の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。
いくつかの実施形態では、核酸は、シグナル配列又はシグナルペプチドを含む二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする。当該分野で既知であるように、シグナル配列は、発現産生物を細胞の外部に送るために使用される。当業者によって理解されるであろうように、本開示の融合タンパク質の発現のための好適なシグナル配列又はシグナルペプチドは、発現のために使用される宿主細胞に「適合」され得る。すなわち、本開示の融合タンパク質がＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞において発現される場合、例えば、ＣＨＯ細胞からのシグナル配列が使用され得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、シグナルペプチドと本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質とを含むタンパク質前駆体をコードする、核酸を提供する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２２又は配列番号２３に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、シグナルペプチドと本明細書に開示のＦｃ融合タンパク質とを含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供し、タンパク質前駆体が、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、及び配列番号８３からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４５のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４６のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４７のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号５２のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号５３のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号５４のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号５６のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号５７のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号５９のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６０のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６１のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号７３のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号７４のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号７５のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号７６のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号７７のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号７８のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号７９のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８０のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８１のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８２のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８３のアミノ酸配列を含むタンパク質前駆体をコードする核酸を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４及び配列番号９５からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、核酸を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８４の配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８５の配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８６の配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８７の配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８８の配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８９の配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号９０の配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号９１の配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号９２の配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号９３の配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号９４の配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号９５の配列を含む核酸を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸は、コドン最適化バージョン又はバリアントを含む。
この文脈における「コドン最適化」は、特定の宿主生物及びその一般に好ましいアミノ酸コドンに関して行われる、すなわち、宿主産生生物、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種は、酵母産生生物と比較して、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ優先コドンを使用してより高い翻訳及び／又は分泌をもたらし得る。
コドン最適化は、用いられる宿主細胞における発現を最適化するために、本開示の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質のうちのいずれかに用いられ得る。
ＩＬ－１５ドメイン、ＩＬ－１５Ｒαスシドメイン、Ｆｃドメイン、及びｓＰＤ－１バリアントドメインを含む二重特異性Ｆｃ融合タンパク質（「ｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二重特異性Ｆｃ融合タンパク質」の略）は、一般に、親遺伝子の部位特異的変異誘発及び合成遺伝子構築を含む周知の技術を使用して、融合タンパク質配列をコードする遺伝子を構築することによって調製することができる。
本開示の核酸の発現は、それ自体又は当該分野で既知の他の調節配列によって調節することができる。
本開示はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞においてコード配列の発現を指示する１つ以上の制御配列に操作可能に連結された、本開示のｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸構築物に関する。制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のために、プロモータである、宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドを含み得る。プロモータは、Ｆｃ融合タンパク質の発現を媒介する転写制御配列を含有する。変異体プロモータ、切断されたプロモータ、ハイブリッドプロモータを含むプロモータは、宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであり得、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかの細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
いくつかの実施形態では、制御配列はまた、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端に連結されたシグナルペプチドをコードし、発現される融合タンパク質を細胞の分泌経路に向けるシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’終端は、翻訳リーディングフレームにおいて天然に連結されたシグナルペプチドコード配列とともに、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードするコード配列のセグメントを本質的に含有し得る。あるいは、コード配列の５’終端は、コード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード配列を含有し得る。外来性シグナルペプチドコード配列は、コード配列がシグナルペプチドコード配列を天然に含有しない場合に必要とされ得る。あるいは、外来性シグナルペプチドコード配列は、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質の分泌を向上するために、天然シグナルペプチドコード配列を単に置き換えてもよい。しかしながら、発現された融合タンパク質を宿主細胞の分泌経路に向ける任意のシグナルペプチドコード配列が使用され得る。
Ｆ．発現ベクター
また本明細書で提供されるのは、本開示の１つ以上のｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を、構成的に又は１つ以上の調節エレメントの下のいずれかで、インビトロ又はインビボで発現させるための発現ベクターである。本開示は、本明細書に開示の核酸のうちのいずれかを含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、プロモータと、転写及び翻訳停止シグナルと、を含む、発現ベクターに関する。様々なヌクレオチド配列及び制御配列を一緒に接合させて、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入又は置換を可能にする１つ以上の好都合な制限部位をそのような部位に含み得る、組換え発現ベクターを産生することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって発現され得る。発現ベクターの作製において、コード配列が発現のための適切な制御配列と操作可能に連結されるように、コード配列はベクターに位置する。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順を都合よく施すことができ、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことができる、任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存するであろう。ベクターは、線状又は閉環状プラスミドであり得る。
ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製に依存しないベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有し得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。更に、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡ又はトランスポゾンを一緒に含有する単一のベクター若しくはプラスミド又は２つ以上のベクター若しくはプラスミドが使用され得る。本開示の方法で使用するために企図されるベクターとしては、組込みベクター及び非組込みベクターの両方が挙げられる。
Ｇ．宿主細胞及び産生株
当業者によって理解されるであろうように、本開示のｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二重特異性Ｆｃ融合タンパク質の組換え産生のための多種多様な産生宿主生物が存在し、限定されないが、細菌細胞、哺乳動物細胞、及び酵母を含む真菌細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示の核酸のうちのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示の発現ベクターのうちのいずれかを含む。
本開示の核酸は、トランスフェリンポリカチオン媒介性ＤＮＡ移入、裸の核酸又はカプセル化された核酸でのトランスフェクション、リポソーム媒介性ＤＮＡ移入、ＤＮＡでコーティングされたラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔、遺伝子ガン、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションなどの当該分野で利用可能な多様な技術を使用して、好適な宿主細胞に導入され得る。
Ｈ．融合タンパク質を作製する方法
本開示はまた、ｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法であって、（ａ）ｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二重特異性Ｆｃ融合タンパク質の発現に好適な条件下で本開示の宿主細胞を培養することと、（ｂ）任意選択的に、ｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を回収することと、を含む、方法に関する。
Ｉ．治療方法
１．治療に適合する対象
様々な実施形態は、治療方法を対象とし、その多くは、治療有効量の本明細書に記載の１つ以上の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を、治療を必要とする対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態は、がんを有する対象における腫瘍の転移又は浸潤を治療、低減、又は予防する方法であって、方法が、治療有効用量の本明細書に開示の１つ以上の当該二重特異性Ｆｃ融合タンパク質又は当該薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を対象とする。いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。
いくつかの実施形態は、対象における感染症を予防又は治療する方法であって、方法が、治療有効用量の本明細書に開示の１つ以上の当該二重特異性Ｆｃ融合タンパク質又は当該薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を対象とする。いくつかの実施形態では、感染症は、真菌感染症、細菌感染症、及びウイルス感染症からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法で使用される有効用量の１つ以上の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質又は薬学的組成物は、対象において、野生型ＰＤ－１によって媒介されるシグナル伝達を阻害、低減、又は調節する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法で使用される有効用量の１つ以上の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質又は薬学的組成物は、対象においてＴ細胞応答を増加させる。
いくつかの実施形態は、対象におけるＩＬ－１５媒介性疾患又は障害を予防又は治療する方法であって、方法が、治療有効用量の本明細書に開示の当該二重特異性Ｆｃ融合タンパク質又は当該薬学的組成物を対象に投与することを含み、ＩＬ－１５媒介性疾患又は障害が、がん又は感染性疾患である、方法を対象とする。いくつかの実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。いくつかの実施形態では、感染性疾患は、ウイルス感染症である。
いくつかの実施形態は、対象における免疫不全又はリンパ球減少症を予防又は治療する方法であって、治療有効用量の本明細書に開示の１つ以上の当該二重特異性Ｆｃ融合タンパク質又は当該薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を対象とする。
いくつかの実施形態は、ＩＬ－１５媒介性免疫機能の向上を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効用量の本明細書に開示の１つ以上の当該二重特異性Ｆｃ融合タンパク質又は当該薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を対象とする。いくつかの実施形態では、向上されるＩＬ－１５媒介性免疫機能は、リンパ球の増殖、リンパ球のアポトーシスの阻害、抗体産生、抗原提示細胞及び／又は抗原提示の活性化を含む。いくつかの実施形態では、向上されるＩＬ－１５媒介性免疫機能は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、メモリーＴ細胞、メモリーＢ細胞、樹状細胞、他の抗原提示細胞、マクロファージ、マスト細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、腫瘍常在Ｔ細胞、ＣＤ１２２＋Ｔ細胞、及び／又はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化又は増殖を含む。
いくつかの実施形態は、Ｔ細胞に対する細胞傷害性又はＮＫ細胞に対する細胞傷害性の促進を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効用量の本明細書に開示の１つ以上の当該二重特異性Ｆｃ融合タンパク質又は当該薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を対象とする。
２．治療的投与
ある特定の実施形態では、本開示の１つ以上の二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を含む治療的に有効な組成物又は製剤は、それを必要とする個体に全身投与され得るか、又は当技術分野で既知の任意の他の投与経路を介して投与され得る。
３．投与
いくつかの実施形態では、例えば、がん又は感染症の治療のための本開示の有効用量の治療実体は、投与手段、標的部位、患者がヒト又は動物である患者の生理学的状態、投与される他の医薬品、及び治療が予防的であるか治療的であるかを含む、多くの異なる要因に応じて変動する。治療投薬量は、安全性及び効力を最適化するために滴定され得る。
Ａ．実施例１：細胞株開発及びクローン選択
ＨｙＣｅｌｌ ＴｒａｎＦｘ－Ｃ培地を用いて、ＣＨＯ－Ｋ１－Ｃ６－４Ｇ５宿主細胞を対数期に３継代の間維持した。トランスフェクション当日に、２５ｍＬの細胞培養物（１２５ｍＬの振盪フラスコ）中で生存細胞密度１Ｅ＋０６細胞／ｍＬまで細胞を調整した。以下のトランスフェクション混合物の調製：５０μＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸを１．５ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭで希釈し、室温で３～５分間インキュベートした。５０μｇの線状化発現プラスミドｐＪＨＬ－Ａｌｄｏａ－ＰｕｒｏＲｓ－ＪＨＬ９９３２及びｐＪＨＬ－Ａｌｄｏａ－ＤＨＦＲｓ－ＪＨＬ９９３２を１．５ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭで希釈した。次いで、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ溶液をＤＮＡ溶液と混合し、室温で１５分間放置した。インキュベーション後、ＣＨＯ－Ｋ１－Ｃ６－４Ｇ５培養物（１２５ｍＬの振盪フラスコ内で２５ｍＬ）に、溶液を添加した。トランスフェクトした細胞を、１３０ｒｐｍ、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータ内でインキュベートした。トランスフェクションの２４時間後に、トランスフェクトした細胞の一部分を安定なプール生成のために使用した。トランスフェクションの４８時間後に、トランスフェクトした細胞に薬物選択を施した。選択薬物（１５又は２０□ｇ／ｍｌのピューロマイシン及び８００又は１２００ｎＭのＭＴＸ）を含む１５０Ｔフラスコ内で、１５～２０ｍＬの培地中４～５Ｅ＋０５細胞／ｍＬの密度で細胞を播種した。フローチャートに示されるように、２つの培地を適用した。１つは、４ｍＭのＬ－グルタミン及び０．１％のＦ－６８を含有するＨｙＣｅｌｌ ＴｒａｎｓＦｘ－Ｃであり、別のものは、４ｍＭのＬ－グルタミンを含有するＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ Ｇｒｏｗｔｈ Ａである（図１）。細胞生存率が５０％超に達したら、プール回収のために、５０ｍＦのスピンチューブ内で１０ｍＬの培養物まで細胞を増殖させる（図２）。更に５～１０日で、各プールは、約９０％の生存率まで回復するであろう。生存率データは、１６プール全てが９０％まで首尾よく回復したことを示した（図３Ａ～図３Ｄ）。１２５ｍＬの振盪フラスコ内で２５ｍＦの培養物まで細胞を増殖させ、１３０ｒｐｍ、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータ内でインキュベートした。各プールがその後の継代培養によって９０％の生存率に達したら、プール当たり３つのバイアルで凍結保存を実施した。
細胞培養液を１１日目に採取し、続いて３０００ｇ、１５分、２２℃で遠心分離を行った。培養上清を０．２２μｍフィルターに通し、（ＰｒｏＡ－ＨＰＬＣ）を使用して力価を決定する。具体的には、ＨｙＣｅｌｌ ＴｒａｎｓＦｘ－Ｃ培地で培養されたプールは、ＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ培地で培養されたプールよりも良好な力価を生じた。Ｇ９、Ｇ１０、Ｇ１３、及びＧ１４は、最も高い力価を生じた（図４）。濾過した上清の一部分をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ Ｓｐｉｎ Ｔｒａｐによって精製し、社内ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、並びに社内で開発したバイオアッセイＰＤ－Ｌ１、ＰＤＬ－２、及びＩＬ１５Ｒ－ベータ結合（ＥＬＩＳＡ）を施した。ＰＤ－Ｌ１、ＰＤＬ－２、及びＩＬ１５Ｒ－ベータの相対結合効力アッセイ結果は、１００％に設定される参照標準としてのプールＧ９に対して１００％超を得た。
１１日間の流加培養によって回収したＩ相プールに、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）（図５Ａ、図５Ｂ）及びＰｒｏＡ精製試料（図６Ａ、図６Ｂ）の両方に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を施した。４ｕｌのＨＣＣＦ及び２ｕｇのＰｒｏＡ精製試料を、４～１５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動した。標的の主要バンドは、およそ１５０ｋＤａ及び２００ｋＤａである。全てのクローンは、約１５０ｋＤａ及び２００ｋＤａの目に見える主要バンドを有した。
Ｂ．実施例２：ＥＬＩＳＡ効力アッセイ
プールした材料のＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、及びＩＬ－１５Ｒ－ベータ結合効力を、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、及びＩＬ１５Ｒ－ベータ結合についての社内開発したＥＬＩＳＡに基づくバイオアッセイを使用して分析した。プールＧ９を、参照標準（Reference Standard、ＲＳ）及びシステム適合性試験（System Suitability Test、ＳＳＴ）として使用し、１００％に設定した。ＩＬ－１５に結合しているプールしたクローンの表にした要約を図１１に示し、ＩＬ－１５効力を実証する結果を図１２及び図１３に示す。具体的には、プールＧ１、Ｇ２、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ１０、Ｇ１３、及びＧ１４は全て、ＩＬ－１５ ＥＬＩＳＡ結合研究においてＧ９参照標準よりも高い効力及び低いＥＣ５０を示した。ＰＤ－Ｌ１に結合しているプールしたクローンの表にした要約を図１４に示し、ＰＤ－Ｌ１効力を実証する結果を図１５Ａに示し、ＥＣ５０を図１５Ｂに示す。プールＧ１、Ｇ２、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ１０、Ｇ１３、及びＧ１４は全て、ＰＤ－Ｌ１ ＥＬＩＳＡ結合研究においてＧ９参照標準よりも高い効力及び低いＥＣ５０を示し、プールＧ５は最も高い効力及びＥＣ５０を示した。ＰＤ－Ｌ２に結合しているプールしたクローンの表にした要約を図１６に示し、ＰＤ－Ｌ２効力を実証する結果を図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。プールＧ５、Ｇ１０、Ｇ１３、及びＧ１４は、ＰＤ－Ｌ２結合に対して高い効力及び低いＥＣ５０を有する。
プールしたクローンＧ１０及びＧ１４をＩＩ相プール選択のために選択し、単一細胞クローニングを実施した。９６ウェルプレートから１１２個のクローンを選択し、選択薬剤含有培地（６０μｇ／ｍＬのピューロマイシン＋３０００ｎＭのＭＴＸ）で増殖させた。いくつかのクローンは、スケールアッププロセスの間に１００％まで徐々に増加させた選択薬物下で生存することが可能ではない。最終的に、６ウェルプレートから５０ｍＬのスピンチューブ内の５～６ｍＬの培養物にクローンを移し、１８０ｒｐｍ、３７℃、５％のＣＯ２インキュベータ内でインキュベートした。５０ｍＬのスピンチューブ内で成長することが可能であり、最終的に９０％以上の生存率及び１Ｅ＋０６細胞／ｍＬ以上の生存細胞密度を達成したクローンを、凍結保存した（図８Ａ、図８Ｂ、及び図９Ａ、図９Ｂ）。３１個のクローンを凍結保存し、クローン評価のために流加培養に進んだ（図７）。最後に、力価、生存率、及び単クローン性に基づいて上位１０個の単一細胞クローン、プールＧ１０から５つのクローン、及びプールＧ１４から５つのクローンを選択した（図１０）。
Ｃ．実施例３：インビボ検証
ｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二重特異性（又は二機能性）Ｆｃ融合タンパク質（配列番号９７）の抗腫瘍活性を分析し、ｓＰＤ－１バリアント及びＩＬ－１５分子の単独又は組み合わせの抗腫瘍活性と比較した。１つの群のマウスには、ビヒクル対照群として生理食塩水を与え、６つの群のマウスには、それぞれ腹腔内（intraperitoneal、ＩＰ）注射を介して以下の治療を与えた。
群１は、１０ｍｇ／ｋｇでのｓＰＤ－１バリアント及びｈＩｇＧ４ Ｆｃドメインで構成されるｓＰＤ－１バリアント単一治療である。
群２は、２．５ｍｇ／ｋｇでのＩＬ－１５、ＩＬ－１５スシドメイン、及びｈＩｇＧ４で構成されるＩＬ－１５単一治療である。
群３は、０．１ｍｇ／ｋｇでのｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二機能性Ｆｃ融合タンパク質治療（「二機能性治療」の略）である。
群４は、１０ｍｇ／ｋｇでのｓＰＤ－１バリアント単一分子と、２．５ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５、ＩＬ－１５スシドメイン、及びｈＩｇＧ４で構成されるＩＬ－１５単一治療で構成されるｓＰＤ－１バリアント＋ＩＬ－１５併用治療（「併用治療」の略）である。
群５は、１ｍｇ／ｋｇでの二機能性治療である。
群６は、１０ｍｇ／ｋｇでの二機能性治療である。
ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１結腸直腸腫瘍の最終腫瘍体積を、ビヒクル対照、群１、群２、群３、群４、群５、及び群６の治療を受けた後の腫瘍間で比較した。（図１８）。図１８の挿入グラフは、併用治療（群４）、並びに１ｍｇ／ｋｇ（群５）及び１０ｍｇ／ｋｇ（群６）での二機能性治療を受けた後の腫瘍の体積についての結果を示す。ｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二機能性Ｆｃ融合タンパク質（１０ｍｇ／ｋｇ）による治療（群６）は、ｓＰＤ－１バリアント＋ＩＬ－１５併用治療（群４）と比較すると、腫瘍体積の減少に対して有意かつ相乗的な効果を示した。詳細な計算を以下に示す：
ｓＰＤ－１／ＩＬ－１５二機能性Ｆｃ融合タンパク質治療、又は「二機能性治療」）：
二価全分子サイズ：６７．３６×２＝１３４．７２ｋＤａ（翻訳後修飾を除く）
ＩＬ－１５ドメイン分子サイズ＝４７．８ｋＤａ（総分子の３５．４％である）。１ｍｇ／ｋｇの二機能性治療ごとに、０．３５４ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５をマウスに注射した。
ｓＰＤ－１バリアントドメイン分子サイズ＝３２．７ｋＤａ（分子の２４％である）。１ｍｇ／ｋｇの二機能性治療ごとに、０．２４ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアントをマウスに注射した。
ＩＬ－１５単一治療は、２．５ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５、ＩＬ－１５スシドメイン、及びｈＩｇＧ４で構成した：
二価分子サイズ：１００．２ｋＤａ（翻訳後修飾を除く）
ＩＬ－１５＝４７．８ｋＤａ（分子の４７．７％である）。１ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５単一治療ごとに、０．４７７ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５をマウスに注射した。
ｓＰＤ－１バリアント単一治療：
二価全分子サイズ：９０．３４ｋＤａ（翻訳後修飾を除く）
ｓＰＤ－１バリアント＝３８．４６ｋＤａ（分子の４２．５％である）。例えば、１ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアント単一治療ごとに、０．４２５ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアントをマウスに注射した。
要約：
１０ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアント単一治療（群１）を投与する場合、４．２５ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアントをマウスに注射した。
２．５ｍｇのＩＬ－１５（群２）を投与する場合、１．１９ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５をマウスに注射した。
０．１ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二機能性Ｆｃ融合タンパク質治療（群３）を投与する場合、０．０３５４ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５及び０．０２４ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアントをマウスに注射した。
上に開示のｓＰＤ－１バリアント＋ＩＬ－１５併用治療（群４）を投与する場合、４．２５ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアント及び１．１９ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５をマウスに注射した。
１ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二機能性Ｆｃ融合タンパク質治療（群５）を投与する場合、０．３５４ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５及び０．２４ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアントをマウスに注射した。
１０ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二機能性Ｆｃ融合タンパク質治療（群６）を投与する場合、３．５４ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５及び２．４ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアントをマウスに注射した。
上の計算は、群５（１ｍｇ／ｋｇでの二機能性治療）及び群４（併用治療）が、同等ではなくとも同様の治療後腫瘍体積を実証しているが、しかしながら、群５（０．３５４ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５及び０．２４ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアント）では、群４（１．１９ｍｇ／ｋｇのＩＬ－１５及び４．２５ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１バリアント）ものよりも、動物の体内に注射したｓＰＤ－１バリアント及びＩＬ－１５がはるかに少ないことを示している。したがって、群４（併用治療）及び群５（配列番号９７を用いた１ｍｇ／ｋｇでの二機能性治療）が同様の治療後腫瘍体積を示すと仮定すると、群５は、群４よりも３．４倍少ないＩＬ－１５及びほぼ１７．７倍少ないｓＰＤ－１バリアントを使用しており、ｓＰＤ－１バリアント／ＩＬ－１５二機能性Ｆｃ融合タンパク質（配列番号９７）治療が、ｓＰＤ－１バリアント＋ＩＬ－１５併用治療よりも有意に高い抗腫瘍効力を有することを明らかにしている。
Ｄ．実施例４：ＩＬ－１５アゴニストと組み合わせたＡＢ００２及び様々なＰＤ－１免疫チェックポイント阻害因子の抗腫瘍活性を比較するインビボ研究
ＡＢ００２、ｓＰＤ－１／ＩＬ－１５二機能性Ｆｃ融合タンパク質（配列番号９７）の抗腫瘍活性を分析し、ａＰＤ－１、ａＰＤ－Ｌ１、及びＩＬ－１５分子単独又は組み合わせの抗腫瘍活性と比較した。
腫瘍接種及び治療プロトコル
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、イソフルラン吸入麻酔下で３×１０６個のＭＣ３８腫瘍細胞を皮下注射した。注射後最大２４時間まで、苦痛の徴候についてマウスを監視した。１つの群のマウスには、ビヒクル対照群として生理食塩水を与え、６つの群のマウスには、腹腔内（ＩＰ）注射を介して１５日間治療を与えた。治療に使用した治療群、投与濃度、及び投与体積を図１９Ａに列挙する。投与スケジュールを図１９Ｂに列挙する。
腫瘍成長監視
各治療群について、腫瘍が５日目に触知可能になったときに治療を開始した。デジタルキャリパーを使用して腫瘍の幅、長さ、及び高さを測定することによって、研究全体を通じて腫瘍成長を監視した。腫瘍体積（ｍｍ３）を、以下の等式を使用して計算した。
腫瘍体積＝π／６＊幅＊長さ＊高さ
研究の最後に腫瘍成長曲線を生成した。図２０Ａは、最終腫瘍体積を示す。図２０Ｂは、治療した動物における全体的な腫瘍成長を示す。ＡＢ００２で治療した動物は、腫瘍成長に有意な低減を示し、ＡＢ００２治療は、１１匹の治療した動物のうちの１０匹において完全な治癒を生じた。図１９Ｃに示されるように、ａＰＤ－１及びａＰＤ－Ｌ１をＩＬ－１５と組み合わせて使用すると、単独で使用したａＰＤ－１、ａＰＤ－Ｌ１、及びＩＬ－１５と比較して、組み合わせの群は、抗腫瘍活性の向上を一貫して示した。
動物毒性
動物の体重を、研究期間全体を通じて記録した。ＡＢ００２、ａＰＤ－１ Ａｂ／ＩＬ－１５、ａＰＤ－Ｌ１ Ａｂ／ＩＬ－１５、及びＩＬ－１５治療群において、総体重に低減が観察された。ＡＢ００２治療マウスは、図２０Ｃに示されるように、体重の初期低減を示したが、治療後に体重の大部分を回復することが可能であった。これは、以前に報告されたＩＬ－１５に関連する体重低減と一致した。
結論
ＡＢ００２は、インビボでＭＣ３８結腸直腸がんを治療するための独立型薬剤として使用されると、有意な抗腫瘍活性を示した。ＡＢ００２が使用される場合、単独で又はＩＬ－１５と組み合わせて使用した他のＰＤ－１免疫チェックポイント阻害因子との直接比較において、優れた抗腫瘍活性を実証している。
Ｅ．実施例５：ＡＢ００２対ａＰＤ－１抗体で治療したＭＣ３８腫瘍を比較する、ＲＮＡ配列決定プロファイリング
免疫腫瘍学パネルに焦点を当てたＲＮＡ配列決定分析のために、ＡＢ００２（２．５ｍｇ／ｋｇ；配列番号５２）（Ｎ＝６）又はマウスａＰＤ－１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）（Ｎ＝６）で治療したＭＣ３８腫瘍を採取した。図２１の火山プロットは、４６個の遺伝子が、標的遺伝子として同定されたことを示し、それらの発現において有意な変化を示している（｜倍数変化｜＞２、ｐ値＜０．０５）。赤色の点は、上方制御された１５個の遺伝子（Ｃｘ３ｃｒｌ、Ｌｉｌｒａ５、Ｒｔｎｌ、Ｎｐｌ、Ｐ２ｒｙｌ３、Ｃｏｌ４ａ５、Ｓｎｃａ、Ｓｅｌｅｎｏｐ、Ｈｂｂ－ｂｓ、Ｈｂｂ－ｂｔ、Ｃｏｌ５ａｌ、Ｈｂａ－ａｌ、Ｈｂａ－ａ２、Ｓｐｉｂ、及びＦｃｒｌｓ）を表し、青色の点は、下方制御された他の３１個の遺伝子を表す。
結論
ａＰＤ－１ Ａｂ治療と比較して、配列番号５２で治療したＭＣ３８腫瘍は、腫瘍促進性ＣＣＲ５＋ＭＤＳＣ浸潤を促進するためのＣＣＲ５のケモカインリガンドである、Ｃｃｌ３及びＣｃｌ４ｍＲＮＡ転写物を独自に下方制御することができる。加えて、ＡＢ００２（配列番号５２）治療はまた、ＮＫ及びＴ細胞疲弊マーカーＣｄ２７４（Ｐｄ－Ｌ１）及びＴｉｇｉｔの減少をもたらし、ＡＢ００２治療が、ＭＤＳＣ浸潤を逆転させ、ＮＫ及びＴ細胞疲弊表現型を阻害し得ることを示唆している。
Ｆ．実施例６：ＡＢ００２は、免疫療法耐性ルイス肺腫瘍モデルにおいて、ａＰＤ－１抗体と比較して優れた腫瘍阻害を実証した
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、イソフルラン吸入麻酔下で３×１０５個のルイス肺がん腫瘍細胞を皮下注射した。注射後最大２４時間まで、苦痛の徴候についてマウスを監視した。治療群、投与濃度、及び投与スケジュールを図２２項目Ａに列挙する。治療群の無作為化は、平均腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ３に達したときに開始した。５０匹のマウスを研究に登録した。全ての動物を、各群に１０匹のマウスを含む５つの研究群に無作為に割り当てた。無作為化は、「一致分布（Matched distribution）」法／「層別化」法（ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒＴＭソフトウェア、バージョン３．１．３９９．１９）／乱塊法に基づいて実施した。無作為化の日を０日目として示した。
腫瘍細胞接種後、動物を罹患率及び死亡率について毎日チェックした。日常的な監視の間、腫瘍成長に対する任意の効果、並びに運動性、食物及び水の消費、体重変化（無作為化後、体重を週当たり３回測定した）、眼／毛の艶のなさ、並びに任意の他の異常などの挙動に対する治療について、動物をチェックした。死亡率及び観察された臨床徴候を、個々の動物について詳細に記録した。
ＡＢ００２（配列番号５２）による治療を、研究デザイン当たりの無作為化と同じ日（０日目）に開始した。無作為化後に週３回、キャリパーを使用して２次元で腫瘍体積を測定し、体積を、Ｖが、腫瘍体積であり、Ｌが、腫瘍長さ（最長腫瘍寸法）であり、Ｗが、腫瘍幅（Ｌに対して垂直な最長腫瘍寸法）である、「式：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２を使用してｍｍ３で表した。ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒＴＭソフトウェア（バージョン３．１．３９９．１９）を使用することによって、体重及び腫瘍体積を測定した。治療後の腫瘍体積の阻害パーセントを図２２項目Ｂに提示する。投与、並びに腫瘍及び体重測定は、クリーンベンチ内で行った。図２２項目Ｂに示される１４日目の結果は、２．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２（配列番号５２）、続いて１０ｍＬ／ｋｇでの抗ｍＰＤ－１による最高レベルの腫瘍阻害を示している。
要約すると、ルイス肺腫瘍モデルにおいて、単一薬剤としてのＰＤ－１免疫チェックポイント阻害因子との直接比較で使用したＡＢ００２は、優れた抗腫瘍活性を実証した。
Ｇ．実施例７：ＭＣ３８腫瘍担持マウスにおけるＡＢ００２の治療用量と治療効力との間の関係性
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、イソフルラン吸入麻酔下で、５０％のマトリゲルに懸濁させた５×１０６個のＭＣ３８腫瘍細胞を皮下注射した。注射後最大２４時間まで、苦痛の徴候についてマウスを監視した。腫瘍接種後１０日目頃に腫瘍がおよそ２００ｍｍ３に達したら、マウスを治療群へと無作為化した。ＡＢ００２（配列番号９７）を用いるか又は用いない１５個の治療群：１）ビヒクル対照、２）０．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２の静脈内投与（intravenous administration、「ＩＶ」）、３）ＩＶ １ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２、４）ＩＶ ２．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２、５）ＩＶ ５ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２、６）０．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２の皮下投与（Subcutaneous administration、「ＳＱ」）、７）ＳＱ １ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２、８）ＳＱ ２．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２、９）ＳＱ ５ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２、１０）ＩＶ ０．６７ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１、１ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２と等価、１１）ＩＶ １．６７５ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１、２．５ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２と等価、１２）ＩＶ ３．３５ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１、５ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２と等価、１３）１ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２＋５ｍｇ／ｋｇのｓＰＤ－１、１４）１ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２＋５ｍｇ／ｋｇのａＰＤ－１ Ａｂ（ペンブロリズマブ）、１５）１ｍｇ／ｋｇのＡＢ００２＋５ｍｇ／ｋｇのａＰＤ－Ｌ１ Ａｂ（アテゾリズマブ）の各々ごとに、５匹の雌マウスを割り当てた。全ての治療を週１回与えた。動物を罹患率及び死亡率について毎日チェックした。日常的な監視の間、腫瘍成長に対する任意の効果、並びに運動性、食物及び水の消費、体重変化（無作為化後、体重を週当たり３回測定した）、眼／毛の艶のなさ、並びに任意の他の異常などの挙動に対する治療について、動物をチェックした。死亡率及び観察された臨床徴候を、個々の動物について詳細に記録した。デジタルキャリパーを使用して腫瘍の幅、長さ、及び高さを測定することによって、研究全体を通じて腫瘍成長を監視した。腫瘍体積（ｍｍ３）を、以下の等式を使用して計算した。
腫瘍体積＝π／６＊幅＊長さ＊高さ
この研究は、１）静脈内（ＩＶ）投与から皮下（ＳＱ）投与への投与経路の変化が、ＡＢ００２の治療効力を変化させるかどうか、２）ＡＢ００２におけるｓＰＤ－１ドメインの包含が、ＡＢ００２で観察される抗腫瘍活性の向上に寄与するかどうか、及び３）ＡＢ００２の治療効力が、ｓＰＤ－１、ａＰＤ－１ Ａｂ（ペンブロリズマブ）、又はａＰＤ－Ｌ１ Ａｂ（アテゾリズマブ）の形態のＰＤ－１阻害因子と比較した場合に更に向上され得るかどうか、を調査するために設計されている。ＩＶ又はＳＱを通じてＡＢ００２で治療したマウスＭＣ３８腫瘍の腫瘍成長曲線及び最終腫瘍体積、並びに対応するＡＢ００２投与と等価な分子量比に基づいて計算した、単剤療法として与えたｓＰＤ－１で治療したＭＣ３８腫瘍の腫瘍成長曲線及び最終腫瘍体積を、図２３項目Ａ及び図２３項目Ｂに示すに示す。ｓＰＤ－１、ａＰＤ－１ Ａｂ（ペンブロリズマブ）、又はＡＢ００２＋ａＰＤ－Ｌ１ Ａｂ（アテゾリズマブ）と組み合わせたＡＢ００２で治療したＭＣ３８腫瘍の腫瘍成長曲線及び最終腫瘍体積を、図２３項目Ｃ及び図２３項目Ｄに示す。
結論
１）ＡＢ００２の静脈内及び皮下投与の両方は、様々な濃度で有意な抗腫瘍活性を呈する。２）２．５ｍｇ／ｋｇ以上のＡＢ００２投与濃度と等価な分子量比で投与したｓＰＤ－１は、有意なシグナル薬剤活性を示し、ＡＢ００２の抗腫瘍効力に相加的様式で寄与することを示唆している。３）ｓＰＤ－１、ａＰＤ－１ Ａｂ（ペンブロリズマブ）、又はＡＢ００２＋ａＰＤ－Ｌ１ Ａｂ（アテゾリズマブ）の追加は、ＡＢ００２の治療効力を更に向上せず、ＡＢ００２治療単独が、他の免疫チェックポイント阻害因子と組み合わせなくても最適な抗腫瘍活性を達成するのに十分であることを示唆している。

Claims (101)

  1. ａ）ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
    ｂ）ＩＬ－１５ドメインと、
    ｃ）Ｆｃドメインと、
    ｄ）可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）バリアントドメインと、を含む、二重特異性Ｆｃ融合タンパク質。
  2. 第１のドメインリンカーと、第２のドメインリンカーと、第３のドメインリンカーと、を更に含む、請求項１に記載のＦｃ融合タンパク質。
  3. 前記第１のドメインリンカー、前記第２のドメインリンカー、及び前記第３のドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎからなる群から選択され、ｎが、１、２、３、４、及び５からなる群から選択される、請求項２に記載のＦｃ融合タンパク質。
  4. 前記第１のドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択される、請求項２又は３に記載のＦｃ融合タンパク質。
  5. 前記第２のドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択される、請求項２～４のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  6. 前記第３のドメインリンカーが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択される、請求項２～５のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  7. Ｎ末端からＣ末端へと、
    ａ）前記ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
    ｂ）前記第１のドメインリンカーと、
    ｃ）前記ＩＬ－１５ドメインと、
    ｄ）前記第２のドメインリンカーと、
    ｅ）前記Ｆｃドメインと、
    ｆ）前記第３のドメインリンカーと、
    ｇ）前記ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  8. Ｎ末端からＣ末端へと、
    ａ）前記ＩＬ－１５ドメインと、
    ｂ）前記第１のドメインリンカーと、
    ｃ）前記ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
    ｄ）前記第２のドメインリンカーと、
    ｅ）前記Ｆｃドメインと、
    ｆ）前記第３のドメインリンカーと、
    ｇ）前記ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  9. Ｎ末端からＣ末端へと、
    ａ）前記ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
    ｂ）前記第１のドメインリンカーと、
    ｃ）前記Ｆｃドメインと、
    ｄ）前記第２のドメインリンカーと、
    ｅ）前記ＩＬ－１５ドメインと、
    ｆ）前記第３のドメインリンカーと、
    ｇ）前記ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  10. Ｎ末端からＣ末端へと、
    ａ）前記ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
    ｂ）前記第１のドメインリンカーと、
    ｃ）前記Ｆｃドメインと、
    ｄ）前記第２のドメインリンカーと、
    ｅ）前記ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
    ｆ）前記第３のドメインリンカーと、
    ｇ）前記ＩＬ－１５ドメインと、を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  11. Ｎ末端からＣ末端へと、
    ａ）前記ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
    ｂ）前記第１のドメインリンカーと、
    ｃ）前記ＩＬ－１５ドメインと、
    ｄ）前記第２のドメインリンカーと、
    ｅ）前記ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
    ｆ）前記第３のドメインリンカーと、
    ｇ）前記Ｆｃドメインと、を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  12. Ｎ末端からＣ末端へと、
    ａ）前記ＩＬ－１５ドメインと、
    ｂ）前記第１のドメインリンカーと、
    ｃ）前記ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
    ｄ）前記第２のドメインリンカーと、
    ｅ）前記ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
    ｆ）前記第３のドメインリンカーと、
    ｇ）前記Ｆｃドメインと、を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  13. Ｎ末端からＣ末端へと、
    ａ）前記ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
    ｂ）前記第１のドメインリンカーと、
    ｃ）前記ＩＬ－１５ドメインと、
    ｄ）前記第２のドメインリンカーと、
    ｅ）前記ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
    ｆ）前記第３のドメインリンカーと、
    ｇ）前記Ｆｃドメインと、を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  14. Ｎ末端からＣ末端へと、
    ａ）前記ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
    ｂ）前記第１のドメインリンカーと、
    ｃ）前記ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
    ｄ）前記第２のドメインリンカーと、
    ｅ）前記ＩＬ－１５ドメインと、
    ｆ）前記第３のドメインリンカーと、
    ｇ）前記Ｆｃドメインと、を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  15. Ｎ末端からＣ末端へと、
    ａ）前記Ｆｃドメインと、
    ｂ）前記第１のドメインリンカーと、
    ｃ）前記ＩＬ－１５ドメインと、
    ｄ）前記第２のドメインリンカーと、
    ｅ）前記ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
    ｆ）前記第３のドメインリンカーと、
    ｇ）前記ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  16. Ｎ末端からＣ末端へと、
    ａ）前記Ｆｃドメインと、
    ｂ）前記第１のドメインリンカーと、
    ｃ）前記ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
    ｄ）前記第２のドメインリンカーと、
    ｅ）前記ＩＬ－１５ドメインと、
    ｆ）前記第３のドメインリンカーと、
    ｇ）前記ｓＰＤ－１バリアントドメインと、を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  17. Ｎ末端からＣ末端へと、
    ａ）前記Ｆｃドメインと、
    ｂ）前記第１のドメインリンカーと、
    ｃ）前記ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
    ｄ）前記第２のドメインリンカーと、
    ｅ）前記ＩＬ－１５ドメインと、
    ｆ）前記第３のドメインリンカーと、
    ｇ）前記ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  18. Ｎ末端からＣ末端へと、
    ａ）前記Ｆｃドメインと、
    ｂ）前記第１のドメインリンカーと、
    ｃ）前記ｓＰＤ－１バリアントドメインと、
    ｄ）前記第２のドメインリンカーと、
    ｅ）前記ＩＬ－１５Ｒαスシドメインと、
    ｆ）前記第３のドメインリンカーと、
    ｇ）前記ＩＬ－１５ドメインと、を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  19. 前記第１のドメインリンカーが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択され、
    前記第２のドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択され、
    前記第３のドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択される、請求項７、８、１１、及び１２のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  20. 前記第１のドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択され、
    前記第２のドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択され、
    前記第３のドメインリンカーが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択される、請求項９、１０、１７、及び１８のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  21. 前記第１のドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択され、
    前記第２のドメインリンカーが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群から選択され、
    前記第３のドメインリンカーが、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１からなる群から選択される、請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  22. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の３８、６３、６５、９２、１００、１０３、１０８、及び１１６位からなる群から選択される位置に対応する位置に、１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  23. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の３８位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２２に記載のＦｃ融合タンパク質。
  24. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の６３位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２２又は２３に記載のＦｃ融合タンパク質。
  25. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の６５位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  26. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の９２位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  27. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の１００位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２２～２６のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  28. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の１０３位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  29. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の１０８位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２２～２８のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  30. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１の１１６位に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２２～２９のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  31. 前記１つ以上のアミノ酸置換が、前記位置のうちの２つ、前記位置のうちの３つ、前記位置のうちの４つ、前記位置のうちの５つ、前記位置のうちの６つ、前記位置のうちの７つ、又は前記位置のうちの８つで生じる、請求項２２～３０のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  32. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２～３１のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  33. 前記１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１のＳ３８Ｇ、Ｓ６３Ｇ、Ｐ６５Ｌ、Ｎ９２Ｓ、Ｇ１００Ｓ、Ｓ１０３Ｖ、Ａ１０８Ｉ、及びＡ１１６Ｖからなる群から選択される、請求項２２～３１のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  34. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｎ９２Ｓ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、請求項３３に記載のＦｃ融合タンパク質。
  35. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｓ３８Ｇ／Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｎ９２Ｓ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、請求項３３に記載のＦｃ融合タンパク質。
  36. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｓ３８Ｇ／Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、請求項３３に記載のＦｃ融合タンパク質。
  37. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、請求項３３に記載のＦｃ融合タンパク質。
  38. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｓ６３Ｇ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、請求項３３に記載のＦｃ融合タンパク質。
  39. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｓ６３Ｇ／Ｐ６５Ｌ／Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、請求項３３に記載のＦｃ融合タンパク質。
  40. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉ／Ａ１１６Ｖのセットを含む、請求項３３に記載のＦｃ融合タンパク質。
  41. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号１のアミノ酸置換Ｇ１００Ｓ／Ｓ１０３Ｖ／Ａ１０８Ｉのセットを含む、請求項３３に記載のＦｃ融合タンパク質。
  42. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のＦｃ融合タンパク質。
  43. 前記ｓＰＤ－１バリアントドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のＦｃ融合タンパク質。
  44. 前記ＩＬ－１５ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  45. 前記ＩＬ－１５Ｒαスシドメインが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  46. 前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン又はバリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項１～４５のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質。
  47. 前記ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ４のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む、請求項４６に記載のＦｃ融合タンパク質。
  48. 前記Ｆｃドメインが、バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項４６に記載のＦｃ融合タンパク質。
  49. 前記バリアントヒトＩｇＧ Ｆｃドメインが、配列番号２５に記載のＳ２２８Ｐに対応する置換を有するヒトＩｇＧ４のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む、請求項４８に記載のＦｃ融合タンパク質。
  50. 配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
  51. 配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
  52. 配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
  53. 配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
  54. 配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
  55. 配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
  56. 配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
  57. 配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
  58. 配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
  59. 配列番号３５のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
  60. 配列番号３６のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
  61. 配列番号３７のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
  62. 配列番号６２のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＦｃ融合タンパク質。
  63. 配列番号６３のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＦｃ融合タンパク質。
  64. 配列番号６４のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のＦｃ融合タンパク質。
  65. 配列番号６５のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のＦｃ融合タンパク質。
  66. 配列番号６６のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＦｃ融合タンパク質。
  67. 配列番号６７のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のＦｃ融合タンパク質。
  68. 配列番号６８のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のＦｃ融合タンパク質。
  69. 配列番号６９のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のＦｃ融合タンパク質。
  70. 配列番号７０のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のＦｃ融合タンパク質。
  71. 配列番号７１のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＦｃ融合タンパク質。
  72. 配列番号７２のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のＦｃ融合タンパク質。
  73. 請求項１～７２のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は安定化剤と、を含む、薬学的組成物。
  74. 請求項１～７２のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質をコードする、核酸。
  75. 前記核酸が、宿主生物のために、前記生物における前記Ｆｃ融合タンパク質の発現のためにコドン最適化されている、請求項７４に記載の核酸。
  76. 請求項７４又は７５に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  77. 請求項７４若しくは７５に記載の核酸、又は請求項７６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  78. 二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法であって、ａ）前記Ｆｃ融合タンパク質が発現される条件下で請求項７７に記載の宿主細胞を培養することと、ｂ）前記Ｆｃ融合タンパク質を回収することと、を含む、方法。
  79. シグナルペプチドと請求項１～７２のいずれか一項に記載のＦｃ融合タンパク質とを含むタンパク質前駆体をコードする、核酸。
  80. 前記シグナルペプチドが、配列番号２２又は配列番号２３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７９に記載の核酸。
  81. 前記シグナルペプチドが、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載の核酸。
  82. 前記シグナルペプチドが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載の核酸。
  83. 前記タンパク質前駆体が、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、及び配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載の核酸。
  84. 請求項７９～８３のいずれか一項に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  85. 請求項７９～８３のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項８４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  86. 二重特異性Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法であって、ａ）前記Ｆｃ融合タンパク質が発現される条件下で請求項８５に記載の宿主細胞を培養することと、ｂ）前記Ｆｃ融合タンパク質を回収することと、を含む、方法。
  87. がんを有する対象における腫瘍の転移又は浸潤を治療、低減、又は予防する方法であって、前記方法が、治療有効用量の請求項１～７２のいずれか一項に記載の１つ以上のＦｃ融合タンパク質、請求項７３に記載の薬学的組成物、又は請求項７９～８３のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるタンパク質前駆体を前記対象に投与することを含む、方法。
  88. 前記腫瘍が、固形腫瘍である、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記がんが、結腸直腸がんである、請求項８７又は８８に記載の方法。
  90. 対象における感染症を予防又は治療する方法であって、前記方法が、治療有効用量の請求項１～７２のいずれか一項に記載の１つ以上のＦｃ融合タンパク質、請求項７３に記載の薬学的組成物、又は請求項７９～８３のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるタンパク質前駆体を前記対象に投与することを含む、方法。
  91. 前記感染症が、真菌感染症、細菌感染症、及びウイルス感染症からなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記有効用量の前記１つ以上のＦｃ融合タンパク質又は前記薬学的組成物が、前記対象において、野生型ＰＤ－１によって媒介されるシグナル伝達を阻害、低減、又は調節する、請求項８７～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記有効用量の前記１つ以上のＦｃ融合タンパク質又は前記薬学的組成物が、前記対象において、Ｔ細胞応答を増加させる、請求項８７～９１のいずれか一項に記載の方法。
  94. 対象におけるＩＬ－１５媒介性疾患又は障害を予防又は治療する方法であって、前記方法が、治療有効用量の請求項１～７２のいずれか一項に記載の１つ以上のＦｃ融合タンパク質、請求項７３に記載の薬学的組成物、又は請求項７９～８３のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるタンパク質前駆体を前記対象に投与することを含み、前記ＩＬ－１５媒介性疾患又は障害が、がん又は感染性疾患である、方法。
  95. 前記がんが、結腸直腸がんである、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記感染性疾患が、ウイルス感染症である、請求項９４に記載の方法。
  97. 対象における免疫不全又はリンパ球減少症を予防又は治療する方法であって、治療有効用量の請求項１～７２のいずれか一項に記載の１つ以上のＦｃ融合タンパク質、請求項７３に記載の薬学的組成物、又は請求項７９～８３のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるタンパク質前駆体を前記対象に投与することを含む、方法。
  98. ＩＬ－１５媒介性免疫機能の向上を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効用量の請求項１～７２のいずれか一項に記載の１つ以上のＦｃ融合タンパク質、請求項７３に記載の薬学的組成物、又は請求項７９～８３のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるタンパク質前駆体を前記対象に投与することを含む、方法。
  99. 前記向上されるＩＬ－１５媒介性免疫機能が、リンパ球の増殖、リンパ球のアポトーシスの阻害、抗体産生、抗原提示細胞及び／又は抗原提示の活性化を含む、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記向上されるＩＬ－１５媒介性免疫機能が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、メモリーＴ細胞、メモリーＢ細胞、樹状細胞、他の抗原提示細胞、マクロファージ、マスト細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、腫瘍常在Ｔ細胞、ＣＤ１２２＋Ｔ細胞、及び／又はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化又は増殖を含む、請求項９８又は９９に記載の方法。
  101. Ｔ細胞に対する細胞傷害性又はＮＫ細胞に対する細胞傷害性の促進を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効用量の請求項１～７２のいずれか一項に記載の１つ以上のＦｃ融合タンパク質、請求項７３に記載の薬学的組成物、又は請求項７９～８３のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるタンパク質前駆体を前記対象に投与することを含む、方法。
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