KR20230148956A - 플라젤린 및 면역글로불린 Fc 융합 단백질을 포함하는 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물 - Google Patents

플라젤린 및 면역글로불린 Fc 융합 단백질을 포함하는 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 플라젤린 및 면역글로불린 Fc 융합 단백질을 포함하는 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 플라젤린 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 고지방식이 투여에 의해 유도된 대사증후군 및 비알코올성 지방간질환 동물모델에서 야생형 플라젤린과 비교해 현저히 향상된 예방 및 치료 효과를 나타내므로, 대사증후군 또는 간 질환 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

플라젤린 및 면역글로불린 Fc 융합 단백질을 포함하는 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물{Composition for treating liver disease or metabolic syndrome comprising fusion protein of flagellin and immunoglobulin Fc region}
본 발명은 플라젤린 및 면역글로불린 Fc 융합 단백질을 포함하는 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 플라젤린 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물에 관한 것이다.
대사증후군(Metabolic syndrome)은 생체 내에서의 물질대사 장애에 의해 발생하는 질환을 총칭한다. 일반적으로 당질, 지질, 단백질, 비타민, 전해질 및 수분 등의 불균형에 의해 발생하게 되는데, 그 예로는 대사증후군, 당뇨병, 고지혈증, 지방간, 동맥경화증, 고혈압 등이 있다. 이 중에서도 제2형 당뇨병의 경우에는 성인기에 주로 나타나는 당뇨병으로서 인슐린에 대한 저항성의 증가를 특징으로 한다. 인슐린 수용체 자체의 감소, 혹은 그 민감도가 떨어지거나 세포 내 글리코겐 합성을 일으키는 2차 전달자에 문제가 생기면 인슐린에 대한 민감도가 떨어지게 된다. 따라서, 제2형 당뇨병을 인슐린 비의존성 당뇨병이라 하며 당뇨의 85∼90%를 차지한다.
특히, 대사증후군은 외관상의 심미적 측면에서도 사회적 이슈가 되고 있지만, 사실 이로 인해 당뇨, 고혈압 등의 대사질환 합병증과 같은 건강상의 심각한 위험이 초래될 수 있다는 점이 대사증후군의 가장 심각한 문제점이다. 이와 같은 대사증후군의 병적인 상태와 관계있는 증상이 대사증후군 개체에게서 나타나는 전신성 만성염증(systemic chronic inflammation)이다. 염증반응은 체내에서 일어나는 면역 기작의 하나로서, 국소적으로 발생할 시 외부로부터의 병균이나 바이러스의 침입으로부터 몸을 방어하는 중요한 반응이다. 그러나 이와 같은 염증반응이 체내 면역반응의 균형 붕괴로 인하여 전신적, 만성적으로 과다하게 활성화되면 체내에서 일어나는 대사작용에 장애를 유발하게 된다. 대사증후군으로 인해 유발되는 만성염증 반응은 당뇨, 심혈관계 질환, 동맥경화 등 각종 대사증후군의 원인으로 밝혀지고 있으며 대사증후군을 질병으로 규정하는 가장 중요한 요소이기도 하다. 만성염증 반응으로 인한 이차적 대사증후군의 발병 없이는 대사증후군은 단순히 미용상의 문제이며, 최근 세계보건기구에서도 당뇨와 같이 삶의 질을 현저히 떨어뜨리는 이차적 대사증후군을 유발할 수 있는 만성 염증반응을 이유로 들어 대사증후군을 질병으로 규정한 바 있다.
한편, 지방간은 간세포 내에 비정상적으로 지방이 축적된 상태를 말하며, 의학적으로 중성지질 함량이 전체 간 무게의 5% 이상을 초과하는 병적 상태를 의미한다. 일반적으로 지방간은 지속적이고 과다한 음주에 의해 유발되는 알콜성 지방간 (Alcoholic fatty liver disease, ALD)과 알콜 섭취력은 거의 없지만 알콜성 지방간과 유사한 간 조직소견을 나타내는 비알콜성 지방간의 두 가지로 구분할 수 있다.
알콜성 지방간은 우리나라에 흔하며, 알콜 섭취로 인해 간에서 지방합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않음으로써 발병하며, 알콜 섭취 정도에 따라 간염이나 간경변으로 발전될 수 있다.
비알콜성 지방간은 음주와 관계없이 대사증후군, 당뇨병, 고지혈증, 약물 등의 원인에 의해 발병될 수 있으며, 진행 경과에 따라 염증 반응을 동반하지 않는 단순 지방간 (steatosis)와 간세포의 염증반응(hepatocellular inflammation)을 나타내는 비알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 진행 섬유화증 (advanced fibrosis) 및 간경변(cirrhosis)까지 포함하는 넓은 범위의 질환을 의미한다.
비알코올성 지방간질환(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 현대 사회의 고지방 및 고열량 식이 섭취에 따른 성인병의 증가로 선진국 기준 성인 인구의 20-30%가 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)을 나타내며 그 중 2-3%가 비알코올성 지방간염(NASH) 환자로 이행된다고 보고되고 있을 뿐 아니라, 특히, 조직학적으로 섬유화와 염증을 동반한 지방간염 소견을 보여 간경변, 간부전 및 간암으로 발전할 위험이 매우 높아지게 된다.
현재 지방간염이 대사증후군, 인슐린저항성, 2형 당뇨병 등과 밀접한 관계가 있다는 것은 밝혀졌으나, 명확한 발병기전은 현재 활발한 연구가 진행 중에 있으며, 최근 'two-hit' hypothesis가 제안되면서 지방간염은 간세포 안에 지방이 쌓이면서 시작되며 대사증후군, 당뇨병 등과 연관되어 나타나는 인슐린저항성이 주된 발병기전으로 여겨지고 있다. 또한 증가된 간세포 내 유리지방산(free fatty acid,FFA)이나 콜레스테롤에 의한 lipotoxicity와 증가된 염증성 사이토카인(cytokine) 및 이들 수용체가 지방간에서 지방간염으로 진행하는 과정에서 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다.
현재, 높은 에너지 부하를 갖는 식품 섭취의 꾸준한 증가 및 적은 운동과 연관된 사회적 변화들은 대사증후군 및 대사증후군으로 야기된 대사증후군의 발생을 증가시키고 있다. 저칼로리 다이어트와 운동에 기초한 전통적인 치료는 대사증후군 제어에 있어서 그다지 효과를 나타내지 못하고, 일시적인 체중 손실을 초래할 뿐이다. 체중 감소를 유도하는 안전하고 효과적인 약물의 개발이 수십 년 동안 진행되어 왔다. 그러나 현재까지, 효능을 보인 약물들은 심각한 부작용을 초래하거나 임상 실험에서 그다지 효능이 우수하지 못하였다. 따라서 대사증후군 및 대사증후군으로 야기된 대사증후군을 개선하고 이러한 병리상태를 예방할 수 있는 새로운 접근 방법이 요구되고 있다.
한편, 플라젤린은 박테리아 편모의 채찍 줄기 모양의 필라멘트로 조립되는 구조 단백질로, 세포 표면에서 연장되어 박테리아가 움직일 수 있도록 기능한다. 플라젤린은 병원성 세균의 병원성 박테리아가 독성 인자로 작용하여 숙주 세포 내로 침투하고 침입하는 것을 촉진한다. 플라젤린은 박테리아에서 독점적으로 발견되며 편모성 박테리아(flagellated bacteria)에서 가장 풍부한 단백질 중 하나이기 때문에 플라젤린은 숙주 면역 감시의 주요 대상이 된다. 박테리아의 침입시, 플라젤린은 숙주에서 Toll-like receptor 5 (TLR5)와 NAIP5/NLRC4에 의해 검출되고 숙주에서 병원균의 즉각적인 제거에 기여하는 선천성 면역을 활성화시킨다.
플라젤린은 편모성-병원성 박테리아에 대한 첫 번째 방어선 역할을 하기 때문에 백신 담체 단백질 또는 백신 보조제 개발의 대상으로서 관심이 되어왔다.
하지만, 플라젤린과 면역글로불린 Fc 융합단백질의 간 질환 및 대사증후군 치료 효과, 보다 구체적으로는 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 간 질환 및 대사증후군 치료효과에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자는 플라젤린의 기능이 향상된 단백질을 개발하기 위해 연구를 거듭한 결과, 플라젤린과 면역글로불린 Fc가 융합된 새로운 형태의 융합단백질이 야생형(wild-type) 플라젤린, 공지된 플라젤린 단편 등과 비교하여 현저히 우수한 TLR5 활성화능을 나타낸다는 것을 발견하였다.
특히, 면역글로불린 Fc가 유발하는 항체 의존성 세포-매개 세포독성(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 또는 보체 의존성 세포 독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 회피하기 위해 사람 IgG4의 Fc를 이용하여 플라젤린 융합단백질을 제작할 경우, Fab 암(arm) 교환에 따라 1/2 형태의 항체 분자가 형성되어 플라젤린의 TLR5 활성화능이 현격히 저하되는 것을 확인하였고 인간 IgG4 Fc의 mutant를 이용하여 이와 같은 문제를 해결함과 동시에 야생형 플라젤린 대비 현저히 향상된 간 질환 및 대사증후군 치료 효과를 나타내는 융합 단백질을 제공할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 플라젤린은 편모성 세균이 감염된 경우에 감염된 숙주 내에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 보다 구체적으로 인체의 세포막 표면에 존재하는 톨-유사수용체 5(TLR5; Toll like receptor 5)는 상기 플라젤린과 상호작용을 통하여 세포 내 신호 전달을 유발하고, 이를 통하여 전사인자인 NF-kB의 발현이 증가되어 선천성 면역신호 활성화를 유도할 뿐만 아니라, 획득 면역 반응을 조절할 수 있다.
플라젤린 단백질은 예를 들어, 미국 특허 제6,585,980호, 제6,130,082호; 5,888,810; 5,618,533; 4,886,748 및 미국 특허 공개 번호 US2003/0044429 A1; 및 Donnelly등 (2002) J. Biol. Chem. 43:4045 등을 통해서 잘 공지되어 있다. 대부분의 그람-음성 박테리아는 편모를 발현하는데, 이는 운동성을 제공하는 표면 구조이다. 편모는 기초 몸체, 필라멘트 및 이 둘을 연결하는 갈고리로 구성된다. 필라멘트는 단일 단백질인 플라젤린의 긴 중합체로 이루어지며 끝에 작은 캡 단백질이 형성되어 있다.
플라젤린의 중합은 N-및 C-말단에서 보존된 영역에 의해 매개되는 반면, 플라젤린 단백질의 중간에 위치한 초가변영역(hypervariable region)은 종간의 서열 및 길이가 매우 다양하다.
본 발명에서 상기 플라젤린은 임의의 적합한 박테리아로부터 유래된 플라젤린일 수 있다. 당업계에서는 다수의 플라젤린 유전자가 클로닝되고 서열화되어 있어 이들이 참고될 수도 있다. 본 발명에서 상기 플라젤린의 비제한적인 공급원으로는 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 세라티아(Serratia) 속, 시겔라(Shigella) 속, 트레포네마(Treponema) 속, 레기오넬라(Legionella) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 바르토넬라(Bartonella) 속, 프로튜스(Proteus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 여시니아(Yersinia) 속, 캄필로박터(Campylobacter) 속, 로세부리아(Roseburia) 속 또는 마리노박터(Marinobacter) 속 미생물을 들 수 있으며, 바람직하게는 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속 또는 비브리오(Vibrio) 속 미생물을 들 수 있다.
더 바람직하게는, 본 발명에서 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 세라티아 마세센스(Serratia marcesens), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 보렐리아 버그도페레이(Borrelia burgdorferei), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바르토넬라 클라리제이애(Bartonella clarridgeiae), 프로튜스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에스테리키아 콜라이(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 여시니아 페스티스(Yersinia pestis), 캄필로박터(Campylobacter spp), 로세부리아(Roseburia spp) 또는 마리노박터(Marinobacter spp) 유래의 플라젤린일 수 있으며,
보다 더 바람직하게는, 본 발명에서 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans) 유래의 플라젤린일 수 있으며,
가장 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 플라젤린일 수 있다.
플라젤린의 N-말단 및 C-말단 불변 영역은 당해 기술 분야에서 그 특징이 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Mimori-Kiyosue et al., (1997) J. Mol. 바이롤. 270: 222-237; Iino et al., (1977) Ann. Genet. 11: 161-182; 및 Schoenhals 등 (1993) J. Bacteriol. 175: 5395-5402을 참고할 수 있다. 당업자에 의해 잘 이해되는 바와 같이, 불변 영역의 크기는 플라젤린 단백질의 공급원에 따라 다소 변할 수 있다. 일반적으로, N-말단 불변 도메인은 단백질의 약 170 개 또는 180 개의 N-말단 아미노산을 포함하는 반면, C-말단 불변 도메인은 전형적으로 약 85 내지 100 개의 C-말단 아미노산을 포함한다. 중심의 초가변영역은 박테리아 사이의 크기와 순서에 따라 상당히 다양하며, 분자 질량의 차이 대부분이 상기 초가변영역에 의해서 설명될 수 있다. 다양한 박테리아로부터 유래된 플라젤린 단백질의 N- 및 C-말단 불변 영역은 공지되어 있고, 아직 공지되지 않은 박테리아 유래의 플라젤린 또한 통상의 기술자가 당업계에 공지된 테크닉을 이용하여 플라젤린 단량체의 결정 구조를 쉽게 규명할 수 있다.
본 발명에서 "플라젤린", "플라젤린 N-말단 불변 영역" 및 "플라젤린 C- 말단 불변 영역"이란 용어는 상기 예를 든 박테리아 중 임의의 것으로부터 유래한 플라젤린 활성 단편 및 변이체를 포함한다. 또한, 야생형(wild-type)의 플라젤린 또는 플라젤린의 일 부분은 안전성 및/또는 면역 반응을 증가시키기 위해 및/또는 클로닝 절차 또는 다른 실험실 조작의 결과로서 변형될 수 있으며 이러한 변형들(또는 변이체) 또한 본원발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서, 상기 플라젤린은 전장(full-length) 플레젤린을 포함하거나, 또는 이의 활성 단편(active fragment)을 포함할 수 있다. 또한, "플라젤린", "플라젤린 N-말단 불변 영역" 및 "플라젤린 C- 말단 불변 영역"등의 용어는 자연 발생 아미노산 서열을 포함하거나, 각각 자연적으로 발생하는 플라젤린, 플라젤린 N- 말단 불변 영역 또는 플라젤린 C- 말단 불변 영역의 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나 유사한 아미노산 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에서 플라젤린, 플라젤린 N-말단 불변 영역, 플라젤린 C-말단 불변 영역 또는 플라젤린의 다른 어떤 부분의 "활성 단편"은 적어도 약 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250 또는 300개 이상의 인접 아미노산 및/또는 인접한 아미노산의 약 300, 250, 200, 150, 125, 100 또는 75 개 미만의 아미노산을 포함하며, 하한이 상한보다 작은 한 이들의 조합도 포함할 수 있다. 상기 활성 단편은 숙주 내에서 TLR5 경로를 활성화시키는 작용을 나타낼 수 있는 단편을 의미할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 활성 단편은 전장 플라젤린의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 활성 단편은 TLR5 경로 활성능을 나타내는 플라젤린의 적어도 한 부분을 의미하는 것일 수 있다. 상기 “적어도 한 부분”이란 플라젤린의 도메인 0, 1, 2 및 3에서 TLR5 경로 활성능을 나타내는 부분을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 활성 단편이란 전장 플라젤린에서 초가변영역(hypervariable region)이 제거된 것일 수 있다. 상기 초가변영역이란 플라젤린의 유래가 되는 박테리아의 종류에 따라서 달라질 수 있으며, 특정 플라젤린의 전체 서열 중 초가변영역에 해당하는 서열은 통상의 기술자가 용이하게 파악하여 제거할 수 있다. 예를 들어, N-말단 도메인 0, 1, 2; 도메인 3; 및 C-말단 도메인 2, 1, 0을 포함하는 전장 플라젤린의 경우 도메인 3, 또는 도메인 2 및 3이 초가변영역일 수 있으며, N-말단 도메인 0, 1; 도메인 2; C-말단 도메인 1, 0을 포함하는 전장 플라젤린의 경우 도메인 2가 초가변영역일 수 있다. 또는, 초가변영역이 포함되지 않은 형태의 플라젤린의 경우(예를 들어, 많은 그람-양성균 유래의 플라젤린은 초가변영역이 포함되지 않을 수 있다.)에는 플라젤린 단백질의 접힘(folding)이 일어나는 힌지(hinge) 영역의 서열이 일부 제거된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “초가변영역”은 프로펠러(propeller) 도메인 또는 부위(region), 힌지(hinge), 초가변부위, 가변(variable) 도메인 또는 부위 등으로 표현될 수도 있다.
본 발명에서, 상기 초가변영역에 제거되었다는 것은 초가변영역에 해당되는 도메인 전체가 제거된 것일 수 있으며, 또는 초가변영역의 서열 중 일부가 제거된 것일 수도 있다.
본 발명에서, 상기 활성 단편이란 야생형 플라젤린의 초가변영역이 제거되고, 제거된 초가변영역에 인공의 서열(즉, 인공서열의 힌지 또는 링커)이 삽입된 형태의 플라젤린일 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 상기 플라젤린 단편은 야생형(wild type) 플라젤린의 C-말단 도메인 0, C-말단 도메인 1, C-말단 도메인 2, N-말단 도메인 2, N-말단 도메인 1, N-말단 도메인 0 및 상기 각 도메인들과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내는 부분(region)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하면서 TLR5 경로 활성능을 나타내는 단편을 의미할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 플라젤린의 활성 단편은 전장 플라젤린의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명은 또한 야생형 플라젤린의 전장 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에서 변이체란 야생형의 플라젤린 또는 이의 단편 단백질의 일부 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성(즉, TLR5 경로 활성화능)을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
경우에 따라서, 본 발명의 상기 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)된 전장 플라젤린 또는 이의 단편일 수도 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 플라젤린 또는 이의 단편의 변이체는 전장 플라젤린 또는 이의 단편의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 이의 단편과 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 이의 단편과 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 다른 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 플라젤린은 하나 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 상기 항원의 비제한적인 예시로는 S. pneumoniae PspA1 항원, S. pneumoniae PspA2 항원, S. pneumoniae PspA3 항원, S. pneumoniae PspA4 항원, S. pneumoniae PspA5 항원 및/또는 S. pneumoniae PspA6 항원을 들 수 있다. 또는, 예를 들어, 상기 플라젤린은 하나 이상의 면역 조절성 물질이 결합된 융합 단백질의 형태일 수 있다. 상기 면역 조절성 물질은 당업계에서 면역반응을 증가시키는 것으로 알려진 것이라면 제한없이 포함될 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로는 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터페론-ω, 인터페론-τ, 인터류킨-1α, 인터류킨-1β, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-4, 인터류킨-5, 인터류킨-6, 인터류킨-7, 인터류킨-8, 인터류킨-9, 인터류킨-10, 인터류킨-11, 인터류킨-12, 인터류킨-13, 인터류킨-14, 인터류킨-18, B세포 성장 인자, CD40 리간드, TNF- α, TNF- β, CCL25, CCL28 또는 이의 활성 단편 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “퍼센트(%) 서열 상동성”은 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 기준 폴리펩타이드 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의한다. 퍼센트 아미노산 상동성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법, 예를 들어 참고문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 외, eds., 1987)]에 기재된 방법, 및 블라스트(BLAST), 블라스트-2, 얼라인(ALIGN) 또는 메갈라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본 명세서에서의 목적을 위해, 주어진 아미노산 서열 B와 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 퍼센트(%) 아미노산 서열 상동성은 다음과 같이 계산된다: 분율(fraction) X/Y의 100 배, 여기서 X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일하게 일치하는 아미노산 잔기 점수의 수이며, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 퍼센트(%) 아미노산 서열 상동성은 B 대 A의 퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성과 같지 않음을 이해할 것이다.
특정 실시양태에서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 IgG4 Fc는 IgG4의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역 1(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에서 상기 IgG4 Fc는 야생형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함한 확장된 IgG4 Fc일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
한편, 천연형 IgG Fc 서열을 이용한 단백질 융합체를 생산시 Fc에 의한 이펙터 기능을 최소화하기 위한 노력 중 선택될 수 있는 것은 IgG4 Fc이다. IgG4는 IgG1과 유사한 생체내 반감기를 보이면서 아미노산 서열의 차이로 인해 이펙터 기능이 상대적으로 작은 것으로 알려져 있다. 그러나 IgG4는 감소된 이펙터 기능이 있다는 장점에도 불구하고, 독특한 힌지 서열에 의해 생체내에서 IgG4 간의 Fab 암(arm) 교환이 일어나 단백질 융합체를 치료용 목적으로 사용시 큰 어려움이 있는 것으로 보고되었다 (van der Neut Kolfschoten, et at., Science, 317:1554-1557. 2007). 즉, IgG4 Fc를 단백질 융합체의 캐리어로 사용시 생체내에 존재하는 IgG4와 Fab 암(arm) 교환이 일어나 천연형 IgG4와 하이브리드를 형성하거나 단량체로 존재하여 원래의 구조를 변경시켜 치료학적으로 낮은 활성을 갖는 구조를 갖게 되는 문제가 발생한다. 이는 IgG4 Fc 단편과 생리활성 물질 융합체를 유전공학 방법으로 생산하든, in vitro에서 생산하든 공통의 문제점으로 작용한다.
따라서, 본 발명의 상기 융합 단백질에 포함되는 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 IgG4 Fc의 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이는 Fc의 힌지, CH2 및 CH3로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에서 발생한 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 인간 IgG4 Fc의 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이는 인간 IgG4 Fc의 중쇄 간 이황화 결합 형성을 부여하는 돌연변이인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 '이황화 결합'은 2개의 황 원자 사이에 형성되는 공유 결합을 의미한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc의 중쇄 간 이황화 결합 형성을 부여하는 돌연변이는 힌지에서의 돌연변이인 것을 특징으로 할 수 있다. 인간 IgG4 Fc의 힌지는 총 12개의 아미노산(ESKYGPPCPSCP)으로 이루어져 있으며, 상기 힌지에서의 돌연변이란 상기 힌지 서열에서 발생한 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 바람직하게는, 상기 힌지에서의 돌연변이는 상기 인간 IgG4 Fc의 힌지를 구성하는 12개의 아미노산 중 CPSC 서열이 CPPC로 치환되고 일부 아미노산이 결실되거나 삽입된 돌연변이, 또는 또 다른 아미노산이 치환된 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc는 CPPC 서열을 포함하는 4개 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 힌지를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 인간 IgG4 Fc는 ESKYGPPCPPCP, SKYGPPCPPCP, KYGPPCPPCP, YGPPCPPCP, GPPCPPCP, PPCPPCP, PCPPCP, CPPCP, CPPCP, 또는 CPPC의 서열로 이루어진 힌지를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc는 힌지 영역에서 돌연변이되어, 2개의 힌지 영역 사이에 이황화 결합 형성을 보장하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 인간 IgG4 Fc 힌지 영역에서의 돌연변이는 위치 228(EU 넘버링에 따름)에서 세린(Ser)이 프롤린(Pro)으로 돌연변이(S228P) 된 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc는 야생형의 IgG4 Fc의 힌지에서 일부 아미노산이 결실되어 Fab 암(arm) 교환이 방지되는 것을 특징으로 할 수 있다. IgG4 Fc의 힌지에서 일부 아미노산이 결실되어 Fab 암(arm) 교환이 방지되는 구체적인 예시는 KR20130063029호 등에 개시되어 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 IgG4 Fc의 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이는 S228P, R409K 또는 이의 조합(EU 넘버링에 따름)을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 위치 220에서 Ser이 Pro로 치환된 것(S220P), 위치 223에서 Gly이 Thr으로 치환된 것(G223T), 위치 224에서 Pro이 His으로 치환된 것(P224H) 및 위치 225에서 Pro이 Thr으로 치환된 것(P225T)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 아미노산 변이는 야생형 인간 IgG4 Fc의 활성에는 영향을 주지 않으면서 단백질의 안정성 등에 영향을 주는 전하 변이체(charge variants)로서 기능할 수 있도록 한다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 인간 IgG4 Fc 변이체는 서열번호 6 내지 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이로서, IgG4 Fc 변이체의 유도체(mutein)도 포함한다. 본 발명에 있어서 IgG4 Fc 변이체의 유도체란 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 또한, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 인간 IgG4 Fc 변이체의 유도체는 인간 IgG4 Fc 변이체와 동일한 생물학적 활성을 나타내나 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
본 발명의 일 실시예에서는, 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 3번째 아미노산이 Leu에서 Pro으로 치환된 유도체(힌지 영역에서 Fab 암 교환을 방지하는 아미노산 변이도 포함)와 플라젤린의 융합단백질을 제작하여 그 효과를 평가한 결과, 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 서열을 그대로 포함하는 플라젤린의 융합단백질과 TLR5 agonist activity에 차이가 없는 것으로 확인되었다.
즉, 본 발명에서 상기 인간 IgG4 Fc 변이체의 유도체는 융합단백질의 활성에는 영향을 주지 않으면서, 단백질의 안정성을 향상시키는 변이가 추가로 포함된 것일 수 있으며, 구체적으로는 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 3번째 아미노산이 Leu에서 Pro으로 치환된 유도체인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 인간 IgG4 Fc 변이체는 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, 당쇄가 제거된 인간 IgG4 Fc 변이체는 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 인간 IgG4 Fc 변이체라 할 것이다.
본 발명에서 당쇄의 제거(Deglycosylation)는 효소로 당을 제거한 인간 IgG4 Fc 변이체를 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 융합단백질은 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단 또는 C-말단이 상기 인간 IgG4 Fc 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합된 것일 수 있다. 구체적으로 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단이 인간 IgG4 Fc 변이체의 C-말단에 결합된 것이거나, 또는 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 C-말단이 인간 IgG4 Fc 변이체의 N-말단에 결합된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 C-말단이 인간 IgG4 Fc 변이체의 N-말단에 결합된 것일 수 있다.
한편, 본 발명에서 융합 단백질을 구성하는 각 구성요소, 즉 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체, 및 인간 IgG4 Fc 변이체는 서로 직접 연결되거나 링커를 통해 연결될 수 있다. 일반적으로, 용어 “링커”는 하나 이상의 분자, 예를 들면, 하나 이상의 성분 도메인 사이에 삽입될 수 있는 핵산, 아미노산 또는 비-펩타이드 잔기를 의미한다. 예를 들어, 링커는 조작을 용이하게 하기 위해 성분간에 관심있는 바람직한 부위를 제공하는데 사용될 수 있다. 링커는 또한 형질전환체로부터 융합 단백질의 발현을 증진시키고, 성분이 이의 최적의 3차 구조를 취하고/취하거나 표적 분자와 적절하게 상호 작용할 수 있도록 입체 장애를 감소시키기 위해 제공될 수 있다. 링커 서열은, 수용체 성분에 자연적으로 연결된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 융합 단백질의 발현을 증진시키기 위해, 특이적으로 관심있는 바람직한 부위를 제공하기 위해, 성분 도메인이 최적의 3 차 구조를 형성할 수 있도록 하기 위해, 및/또는 성분과 이의 표적 분자와의 상호 작용을 증진시키기 위해 사용되는 첨가된 서열일 수 있다.
바람직하게는, 상기 링커는 융합 단백질 내의 각각의 구성요소의 구조를 간섭하지 않고 융합 단백질의 유연성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 잔기는 2 내지 100 개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드 링커이다. 예시적인 링커는 Gly-Gly, Gly-Ala-Gly, Gly-Pro-Ala, Gly (G)n 및 Gly-Ser (GS) 링커와 같은 적어도 2 개의 아미노산 잔기를 갖는 선형 펩타이드를 포함한다. 본 명세서에 기재된 GS 링커는 (GS)n, (GSGSG)n, (G2S)n,G2S2G, (G2SG)n, (G3S)n, (G4S)n, (GGSGG)nGn, GSG4SG4SG 및 (GGGGS)n을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 n은 1 이상이다. (G)n 링커의 하나의 예는 G9 링커를 포함하며, (GGGGS)n 링커의 예시는 GGGGS 또는 (GGGGS)3 링커를 포함한다. 적합한 선형 펩타이드는 알라닐 및/또는 세리닐 및/또는 프롤리닐 및/또는 글리실 아미노산 잔기로 구성된 폴리글리신, 폴리세린, 폴리프롤린, 폴리알라닌 및 올리고펩타이드를 포함한다. 링커 잔기는 본 발명에 개시된 융합 단백질의 구성성분을 연결시키는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 링커는 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 기재된 융합 단백질은 숙주 세포로부터 융합 단백질을 분비하기 위해 기능하는 신호 펩타이드를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 신호 펩타이드를 포함하지 않는다.
또한, 본 발명에서 기술된 융합 단백질은 단백질 결합 펩타이드의 변형된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질 성분은 예를 들어 임의의 단백질 결합 펩타이드에 대한 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화 및 인산화를 포함하는 번역 후 변형을 가질 수 있다.
다른 언급이 없는 한, 본 발명의 융합 단백질은 그 자체로 생균, 사멸 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스 벡터화 백신의 일부가 아닌 폴리펩타이드 (또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)로서 투여된다. 또한, 달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 융합 단백질은 분리된 융합 단백질로서, 예를 들어, 편모에 혼입되지 않는다.
본 발명에 있어서 “융합”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 구성하는 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서 상기 융합 단백질은 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61 또는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 고지방식이 투여에 의해 유도된 대사증후군 및 비알코올성 지방간 질환 동물모델에서 체중 감소효과, 간 조직 내 중성지방 축적 억제 효과, 경구 당부하 개선 효과, 비알코올성 지방간질환 및 지방간염 지표(NAS score) 개선 효과, 지방세포의 분화 억제 효과 및 간 섬유화 억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명에서 상기 간 질환은 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염, 알코올성 지방간, 간염, 간 섬유화, 간 경변, 간 부전 및 간암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염 또는 비알코올성 지방간에 의해 발생되는 간 섬유화, 간 경변, 간 부전일 수 있다.
본 발명에서 상기 대사증후군은 대사성 질환, 대사질환 등으로도 표현될 수 있으며, 당뇨, 비만, 인슐린 저항성, 지방간, 고지혈증 및 고혈압으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 대사증후군은 당뇨, 비만, 인슐린 저항성, 및 지방간으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 융합 단백질 외에 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 물질을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 비강내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 “경피 투여”는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 대사증후군 또는 간 질환 예방 또는 치료하는 효과가 있는 공지의 물질과 병용하여 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물 내 각 구성에 대한 설명은 전술한 바가 참고될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함하는 것으로서, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 간 질환 또는 대사증후군 개선 또는 치료 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
예를 들면, 건강기능식품으로는 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 간 질환 또는 대사증후군의 예방, 개선 또는 치료 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부당 0.01~0.3 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100mL당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 조성물은 고지방식이 투여에 의해 유도된 대사증후군 및 비알코올성 지방간질환 동물모델에서 야생형 플라젤린과 비교해 현저히 향상된 예방 및 치료 효과를 나타내므로, 대사증후군 또는 간 질환 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 제조된 1번 및 4번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 제조된 1번 및 2번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 제조된 4번 내지 7번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 제조된 6번, 8번 내지 11번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 융합단백질의 zTLR5와의 단백질-단백질 상호작용을 융합단백질-TLR5 결합에 대한 biolayer interferometry법으로, 그리고 융합단백질과 TLR5의 복합체 형성을 gel-filtration chromatography법으로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 농도별로 평가하고, 이의 EC50 값을 산출한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 및 12번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 농도별로 평가한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에서 제조된 서열번호 63번 융합단백질과 야생형 바실러스 서브틸리스의 플라젤린(BsFlagellin)의 비강 내 투여 후 시간의 경과에 따른 약물 흡수정도를 형광 이미징으로 분석한 결과이다(A: 서열번호 63번 융합단백질, B: 야생형 바실러스 서브틸리스의 플라젤린).
도 10은 AMLN 식이에 의한 NASH 유도 및 시험약물 처리 모델 모식도를 나타낸 것이다.
도 11은 AMLN 모델에서 시험약물 처리시 간의 체중, 간의 무게 및 간내 Triglyceride(TG)의 간내 축적을 나타내는 결과이다.
도 12는 AMLN 모델에서 실험약물에 의한 체지방량 개선효과를 나타내는 결과이다.
도 13은 AMLN 모델에서 실험약물에 의한 경구 당부하 개선효과를 나타내는 결과이다.
도 14는 AMLN 모델에서 실험약물에 의한 지방간질환 지표(NAS score), 지방세포 크기 및 조직학적 분석에서 개선효과를 나타내는 결과이다.
도 15는 MCD 식이에 의한 NASH 유도 및 시험약물 처리 모델 모식도를 나타낸 것이다.
도 16은 MCD 모델에서 시험약물 처리 후 체중과 식이 섭취량에 대한 결과이다.
도 18은 MCD 모델에서 실험약물 처리 후 혈액 내 대사인자 수치 개선효과를 나타내는 결과이다.
도 19는 MCD 모델에서 실험약물 처리 후 NAS score 개선효과를 나타내는 결과이다.
도 20은 MCD 모델에서 실험약물 처리 후 간섬유화 수치 개선효과를 나타내는 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
1. 실험방법
본 발명에서는 Fab 암(arm) 교환이 방지된 인간 IgG4 Fc 변이체-플라젤린 융합단백질을 제작하고, 이의 효과를 다른 형태의 Fc-플라젤린 융합단백질과 비교하고자 다양한 형태의 융합단백질을 제작하였다. 융합단백질 제작에 사용된 플라젤린은 Bacillus subtilis 플라젤린(BsFlagellin)이다.
(1) DNA 클로닝
하기 12가지 종류의 플라스미드를 제작하였다.
1. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP303)
2. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304)
3. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge-NL
4. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305)
5. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC-NL
6. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306)
7. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-NL
8. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-S220P
9. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-G223T
10. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P224H
11. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P225T
12. pFUSE-hIgG4-Fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-LGK
상기 1 내지 12번의 각 플라스미드가 암호화하는 인간 IgG4 Fc 변이체-플라젤린 융합단백질의 구성을 아래 표 1에 나타내었다:
(인간 IgG4 Fc의 힌지 영역은 총 12개의 아미노산(ESKYGPPCPSCP)으로 이루어져 있다. 상기 1 내지 3번의 융합단백질에 포함된 인간 IgG4 Fc는 상용 플라스미드에 포함된 서열로서 인간 IgG4 Fc 힌지를 구성하는 아미노산 중 일부가 결실된 형태(PPCPSCP)의 힌지가 포함된 인간 IgG4 Fc이며, 상기 5번 내지 12번은 12개의 아미노산이 모두 포함된 full length의 야생형 힌지 서열 또는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 full length의 힌지 서열을 포함하고 있다.
상기 1 내지 12의 DNA 제작에 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다:
번호 Used Primer
1.pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP303) Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 14)
Reverse 5'- GAC CAT GGC AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3'
(서열번호 15)
2. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304) Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC -3'
(서열번호 16)
Reverse 5'- GAC CAT GGC AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3'
(서열번호 17)
3. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge-NL Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 18)
Reverse 5'- TCA GAT CTA ACC ATG GCA CGT AAT AAT TGA AG -3'
(서열번호 19)
4. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305) Forward 5'- TAT ATC CAT GGT TAG ATC TGA ATC CAA ATA CGG TCC CCC ATG CCC ATC -3'
(서열번호 20)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 21)
5. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC-NL Forward 5' - C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 22)
Reverse 5'- TCA GAT CTA ACC ATG GCA CGT AAT AAT TGA AG -3'
(서열번호 23)
6. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306) Forward 5' - TAT ATC CAT GGT TAG ATC TGA ATC CAA ATA CGG TCC CCC ATG CCC ACC TTG CCC AGC ACC TGA - 3'
(서열번호 24)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 25)
7. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-NL Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 26)
Reverse 5'- TCA GAT CTA ACC ATG GCA CGT AAT AAT TGA AG -3'
(서열번호 27)
8. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-S220P Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA CCC AAA TAC GGT CCC CCA TGC CCA CCT TGC -3'
(서열번호 28)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 29)
9. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-G223T Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA TCC AAA TAC ACT CCC CCA TGC CCA CCT TGC - 3'
(서열번호 30)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3' (서열번호 31)
10. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P224H Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA TCC AAA TAC GGT CAC CCA TGC CCA CCT TGC -3'
(서열번호 32)
Reverse TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 33)
11. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P225T Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA TCC AAA TAC GGT CCC ACA TGC CCA CCT TGC - 3'
(서열번호 34)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 35)
12. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L) Forward 5'- GAC AAG GAT ATC GAT GAG AAT TAA CCA CAA TAT TGC AGC ACT TAA CAC - 3'
(서열번호 36)
Reverse 5'- GAC GCT AGC TCA TTT ACC CAG AGA CAG GGA GAG GC - 3'
(서열번호 37)
다음과 같은 단계에 따라 클로닝을 수행하였다:
[PCR]
1) Solgent PCR Kit (STD16-R500)을 사용하여 제작한 ORF를 맞춘 상기 프라이머를 사용하여 pFUSE-hIgG4-Fc2-BS1을 Template DNA로 하여 CPSC와 CPPC PCR product를 제작하기 위해 클로닝을 진행했다.
2) PCR fragment DNA에 10X DNA dye 4.4㎕ 첨가하고, 겔 전기영동을 통해 PCR 결과물의 크기와 band의 유무를 확인하여 MEGAquick-spin Plus (17290)를 통해 Gel Extraction을 수행했다.
[Enzyme Restriction]
3) 2)를 수행한 PCR fragment 와 Template DNA에 제한효소(Enzyme restriction)를 처리하고, 각각의 플라스미드의 enzyme cutting 완료 후, 10X DNA dye 4.4㎕ 첨가하고, 겔 전기 영동을 통해 PCR fragment 와 Template DNA 결과물의 크기와 band의 유무를 확인하여 MEGAquick-spin Plus (17290)를 통해 Gel Extraction을 수행했다.
[Ligation]
4) Molar Ratio를 기준으로 Vector (Template DNA): Insert (PCR fragment) = 1:5의 비율로 Ligation을 진행했다. Ligation 과정은 Takara T4 DNA Ligase Kit (2011A) 매뉴얼 대로 진행했다.
[Transformation]
5) DH5a competent cell을 얼음에서 1분동안 녹인 후에 Zeocin(+) TB plate를 37도씨 incubator에 방치한다.
6) 녹은 DH5a competent cell의 10% volume으로 Ligation Product를 넣어주고 20분동안 얼음에서 방치한다.
7) 42℃에서 30초 동안 열 충격을 준다.
8) Heat Shock 후에 얼음에서 5분 동안 방치한다.
9) 이후에 Zeocin(+) TB Plate에 Transformation 된 E-coli를 도말한다.
10) Overnight로 Colony를 키우고 colony를 picking한다.
11) Picking된 colony를 Zeocin (+) LB media의 3㎖ Inoculation을 18hr 동안 진행한 후에 Mini Prep을 한다.
12) 클로닝이 완료된 플라스미드의 염기서열을 확인하기 위해 각각의 DNA Sequencing을 진행한다.
상기 1 내지 12번 융합단백질의 DNA 염기서열 및 단백질 아미노산 서열을 하기 표 3에 나타내었다.
번호 서열정보
1.pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP303) DNA 서열번호 38
단백질 서열번호 39
2. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304) DNA 서열번호 40
단백질 서열번호 41
3. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge-NL DNA 서열번호 42
단백질 서열번호 43
4. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305) DNA 서열번호 44
단백질 서열번호 45
5. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC-NL DNA 서열번호 46
단백질 서열번호 47
6. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306) DNA 서열번호 48
단백질 서열번호 49
7. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-NL DNA 서열번호 50
단백질 서열번호 51
8. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-S220P DNA 서열번호 52
단백질 서열번호 53
9. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-G223T DNA 서열번호 54
단백질 서열번호 55
10. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P224H DNA 서열번호 56
단백질 서열번호 57
11. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P225T DNA 서열번호 58
단백질 서열번호 59
12. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L) DNA 서열번호 60
단백질 서열번호 61
(2) 제작한 플라스미드의 동물 세포에서의 발현 및 단백질 정제
1) 12well plate에 well 당 poly-L-lysine 500ul 사용하여 5분간 RT에서 coating한 후 serum free DMEM으로 1회, 10% FBS DMEM으로 1회 wash 한다. Transfection 당일 cell confluency가 약 60%가 되게끔 HEK293T를 seeding한다
2) 실험 당일 serum free DEME 100ul에 DNA을 각각 1ug과 TurboFect Transfection Reagent (Thermo Scientific) 2ul을 섞은 후 20분간 RT incubation한 후 transfection 한다. Transfection volume은 1ml으로 한다.
3) 24hr 후 transfection efficiency 확인 후 0.5% FBS DMEM으로 media change 한다.
4) 24hr 후 media 400ul을 harvest 한 후 debris 제거를 위해 12300g에서 1분간 원심 분리하여 상층액을 사용한다.
5) 또한, flask 배양 방식으로 CHO S cell line에서 6 X 106 cells/ml 을 200ml 배지에 DNA를 1mg/L의 농도로 일시발현한다.
6) 배양 후 원심분리와 필터링 후 친화 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피 정제 과정을 거쳐 각 단백질을 수득했다.
(3) TLR5 아고니스트 어세이
상기 방법에 따라 제조한 (i) 내지 (vi) 단백질의 TLR5 활성화능을 다음 단계에 따라 확인하였다:
1) 단백질은 정량하여 준비한다.
2) HEK-Blue cell은 75T-Flask에서 DMEM (4.5 g/L glucose, 2mM L-glutamine), 10% FBS, 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 100ug/ml Normocin이 들어간 media를 사용하여 culture.
3) Cell은 thawing하고 3회 정도 Normocin (100ug/ml)이 들어간 media에서 키우다가 본 실험 전에 2회 이상 Normocin (100ug/ml), Blasticidin (15ug/ml), Zeocin (100ug/ml)을 넣은 media에서 subculture 후에 사용한다.
4) Cell은 Flask의 70~80%가 차면 media만 넣고 tapping으로 cell을 분리 centrifuge (1000rpm/5min) 후에 1:6으로 subculture.
5) 흔들어서 잘 녹여주고 foil로 감싸서 37℃에서 30min 반응 후 4℃냉장고에 보관, 사용시에는 37℃로 warming up 후에 사용한다.
6) 반응시킬 protein이나 물질들을 20ul를 기준으로 필요한 농도에 맞춰서 준비해준다. 96well plate에 물질을 넣어주고 ice올려둔다. Blank는 PBS를 20ul 넣어준다.
7) 140,000 cell/ml을 기준으로 cell을 counting 후 HEK-Blue detection solution과 잘 섞어준 다음 180ul씩 각 well에 넣어준다.
8) Cell은 소량의 PBS를 사용하여 counting해주고 96well-triplicate 기준으로 총 수량을 정한다.
9) 37℃, CO2 incubator에서 16h 후에 620nm에서 읽어준다.
(4) Biolayer interferometry 분석
[TLR5avitag의 biotinylation]
1) Sample preparation: BirA500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit를 이용하여 진행하였다.
2) TLR5avitag (~1 mg/ml) 300 ul + BiomixA 50 ul + BiomixB 50 ul + BirA 10 ul + buffer (20 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl) = final volume 500 ul의 조건으로 sample을 섞어주었다.
3) 18℃에서 5시간동안 incubation을 실시하였다.
4) 1L Buffer (20 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl)에 dialysis 3회 반복하여 남아있는 잔여물을 모두 제거한다.
5) SDS-PAGE gel loading하고 PVDF membrane transfer 후 streptavidin-HRP 이용하여 biotinylation을 확인하였다.
[BLI experiment]
6) SA biosensors를 200 μl baseline buffer에 5분이상 hydration한다.
7) Baseline buffer 로 각 sample 단백질을 희석한다. TLR5avitag은 5 μg/ml, 리간드 단백질(CPPC, entolimod, flagellin)은 81, 27, 9, 3 nM의 농도로 희석한다.
[palate 측정]
8) Octet Data Acquisition 프로그램에서 process를 설정한다.
9) late Definition: 측정할 plate well type(plate 구성 참고)을 입력한다
10) Assay Definition: 1-9 lane 순서대로 sensor가 이동하게끔 Well과 각 step을 세팅하여(위 plate 구성 및 각 step별 설정 참고) 실험을 진행시킨다.
11-1) 1~3 lane에 걸쳐 sensor wash를 진행
11-2) 4 lane에서 TLR5avitag을 sensor상에 고정
11-3) 5~7 lane에 걸쳐 sensor wash를 진행
11-4) 8 lane에서 TLR5와 ligand의 association을 확인
11-5) 9 lane에서 TLR5와 ligand의 dissociation을 확인
12) 측정이 시작되면 각 5개 sensor의 baseline이 잘 잡히는지 확인한다.
13) 측정된 결과는 Octet Data Analysis 프로그램을 이용하여 분석한다 (Association and dissociation, 1:1 binding model 설정으로 fitting).
(5) Gel filtration 실험
[Buffer & Column conditions]
1) Buffer & Column conditions
- Gel-filtration buffer: 20mM HEPES (Biobasic, HB0264) pH 7.4 150mM NaCl (Biobasic, DB0483)
- 모든 단백질은 gel-filtration buffer 조건에 있으며, 단백질간 binding 또한 gel-filtration buffer 조건 하에 진행되었음. Column 내 환경 또한 gel-filtration buffer로 하여 실험을 진행하였음.)
- Column: Superdex 200 10/300 GL
- FPLC: AKTA FPLC (GE-healthcare)
2) 각각 단독으로 단백질을 column에 inject하며 각 물질의 분자량 및 elution 위치를 파악하였다.
[Sample mixing & chromatography running]
3) Protein들의 농도를 계산해서 TLR5와 리간드 protein을 각각 1:0, 1:1, 1:2, 0:1 비율로 혼합한다. total volume은 gel-filtration buffer를 이용하여 300 μl 로 맞춰준다.
4) Column에 3 column volume (75ml) 이상의 gel-filtration buffer를 흘려주어 equilibration을 진행한다.
5) 0.5 ml/min의 속도로 1 ml equilibration 진행한다.
6) 18℃ 에서 30분간 incubation한 뒤 sample을 centrifuge(12000 rpm, 4 ℃ 10 min)하여 침전물을 가라앉힌 후 상층액을 모아 FPLC에 injection한다. (Sample은 syringe를 이용해 sample loop에 injection한다.)
7) 1 column volume(25 ml) gel-filtration buffer를 흘려주어 sample의 elution peak를 UV 280 nm로 결과를 확인한다.
(6) AMLN diet에 의한 NASH 동물 모델 유도 실험
1) AMLN(Amylin Liver NASH) diet 급이
정상 식이 그룹인 12수의 동물을 제외하고 나머지 88수의 동물을 대상으로 AMLN (Amylin Liver NASH) diet (D09100310, RESEARCH DIETS Inc., New Brunswick, U.S.A.)를 18주간 급이하여 비알코올 지방간을 유도하였다.
2) 군 분리
18주간 AMLN diet를 급이한 동물을 대상으로 체중과 body fat mass를 측정하고, 두 가지 측정값에 대해 각 그룹간 평균이 유사하도록 군 분리를 실시하였다
3) 사료
1. 실험동물용 일반 고형 사료
순화 기간 동안 모든 동물에 제공하였으며, 질환 유도 기간 및 군 분리 후 정상 동물군에 제공하였다. (TEKLAD CERTIFIED GLOBAL 18% PROTEIN RODENT DIET 2018)
2. Amylin Liver NASH diet (AMLN diet, D09100310)
순화기간 종료 후 정상 동물군을 제외한 모든 동물에 AMLN diet를 제공하였다.
4) 투여
약물 투여는 군 분리한 후 다음날부터 실시하였고, 대조물질(Obeticholic acid, OCA)은 12주간 1일 1회 경구 투여하였으며, 시험물질은 비강 내 투여 그룹의 경우 12주간 1주 2회 투여하였으며, 정맥투여는 12주간 1주 1회 실시하였다.
5) 투여 방법 및 횟수
1. 군 분리 후 다음날부터 대조물질을 12주간 1일 1회 경구투여 하였으며, 시험물질은 12주간 1주 2회 비강 내 투여 또는 1주 1회 정맥 투여를 실시하였다.
2. 대조물질의 경구 투여는 경구 투여용 존데를 부착한 일회용 주사기를 이용하여 위 내로 강제 투여하였고, 시험물질의 정맥 투여는 0.3 mL insulin syringe를 이용하여 마우스의 꼬리 정맥을 통해 정맥투여 하였으며, 비강내 투여는 흡입 마취 하에 micro pipette을 이용하여 비강 내 투여하였다.
6) 군 구성 및 투여 용량
군 구성은 총 6개의 군으로 아래의 표 4와 같이 나누어 진행하였다.
7) 관찰 및 검사
1. 검사일 설정
관찰, 측정 및 검사일은 투여 개시일을 Day 1일로 하였고, 투여 개시일부터 7일간을 투여 1주로 계산하였다.
2. 임상증상 관찰
모든 동물에 대하여 1일 1회 일반증상을 관찰하였고, 1일 2회 빈사 및 사망동물의 유무를 확인하였으며 관찰은 투여 1일부터 투여 종료시까지 실시하였다.
8) 체중측정
군 분리를 위해 시험물질 투여 전일에 전자 저울로 체중을 측정하였고, 투여 개시 후 주 1회 체중을 측정하였으며 이를 기준으로 시험물질 투여액량을 결정하였다. 시험물질 투여가 최종 종료되면 16시간 절식 후 체중을 측정한 후 부검을 실시하였다.
9) 사료 섭취량 측정
사료 섭취량은 군 분리 후 주 1회 사육상자별 사료 섭취량을 측정하였고, 체중 측정 전일 사료 급이량을 측정한 후 체중 측정 당일 잔량을 측정하여 사료 섭취량을 계산하였다.
10) Body fat mass 측정
군 분리를 위해 body fat mass를 측정하였고, 시험물질 투여 후 12주에 body fat mass를 추가로 측정하였다. 측정 이세는 동물을 isoflurane으로 흡압 마취한 후 dual energy X-ray absorptiometry (InAlyzer, Medikors)를 이용하여 fat mass를 측정하였다.
11) 경구 당부하 검사
경구 당부하 검사는 질 투여 후 85일에 측정하였다. 모든 동물을 경구 당부하 시험 전날부터 16시간 절식시키고 혈당을 측정한 후, 2 g/kg의 glucose (D-(+)-Glucose, sigma, U.S.A)를 10 mL/kg 용적으로 강제 경구 투여한 후, 15분, 30분, 60분과 120분에 혈당을 측정하였다.
혈당의 측정은 혈당 측정기인 Accu-CHEK*?*을 이용하여 동물의 꼬리 미부 끝 부분을 scissor로 미세하게 절개하여 자연스럽게 흘러나오는 whole blood로 측정하였다. 시간대 별 혈당 측정치를 이용하여 경시적 변화를 기록하고, 그래프의 밑면적(Area Under the Curve, AUC)를 SigmaPlot (version 10.0 Systat Software Inc., U.S.A.)을 사용하여 산출하여 각 그룹 간 내당능을 비교하였다. 모든 혈당 측정이 종료되고 난 후 각 그룹별 시험물질을 투여하였다.
12) 부검
부검은 투여를 종료한 후 각 그룹별 음수 제공 하에 16시간 절식을 시키고 부검은 개체 순서에 따라 진행하였다.
1. 복대정맥을 통해 혈액 채취 후 복부 장기에 대해 육안검사를 실시하였다.
2. 내부 장기의 이상 유무를 확인한 후 간 조직과 부고환 지방 조직을 적출하였고, 적출된 간 조직 개체 별 사진 촬영을 실시하였다.
3. 간 조직과 부고환 지방 조직을 생리식염수로 세척하고 여과지로 수분을 제거한 후 전자저울로 절대 중량을 측정하여 부검 전 절식된 체중에 대한 각각의 상대 중량을 아래와 같이 산출하였다.
산식 : 상대 장기 중량 = 장기 무게(g)/부검 전 절식 체중(g)
4. 적출하여 무게를 측정한 간 조직 일부는 2 set로 소분하여 1 set는 간 조직 내 TG 분석을 위하여 액체질소로 급속 냉동 후 -70℃이하의 deep freezer (Model 706, Thermo Fisher Scientific Inc., U.S.A.)에 보관하였고, 나머지 1 set는 조직학적 검사를 위해 10% 중성 완충 포르말린에 고정 및 남은 간 조직 -70
Figure pat00003
이하의 deep freezer에 보관하였다.
5. 복대정맥에서 채취한 혈액은 EDTA-2K tube (Microtainer, BD, U.S.A.)와 0.6 mL SST tube (Microtainer, BD, U.S.A.)에 각각 소분하였고, 0.6 mL SST tube에 담은 혈액은 완전히 굳힌 다음 EDTA-2K tube와 4℃에서 5,000 rpm으로 15분간 원심분리한 후 혈청 및 혈장을 취하여 각각 1.5 mL tube에 담아 -70℃이하의 deep freezer에 보관하였다.
13) 간 조직 내 Triglyceride(TG) 분석
부검시 적출한 간 조직을 200 mg 칭량하고 정상 생리식염수로 적출한 간 조직을 세척하였다. 간 조직 200 mg당 1% Triton X-100 in PBS를 1 mL씩 넣은 후 homogenization하였다. 간 균질액을 4
Figure pat00004
에서 10,000 xg로 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 분리한 후 TG quantification kit (STZ-396, Cell Biolabs)를 이용하여 microplate reader (SpectraMax M2, Molecular Devices, U.S.A.)로 간 조직 내 TG 함량을 측정하였다.
14) 혈청학적 검사
부검시 복대정맥에서 채취하여 냉동 보관 중인 혈청을 이용하여 혈청 생화학 분석기(Blood chemistry analyzer, AU480, Beckman Coulter, Germany)로 간 염증 혈액 마커(AST, ALT, ALP, GGT) 및 혈중 지질 profile(T-chol, TG, H이-C, LDL-c) 등을 측정하였다. 분석 후 남은 검체(혈청)는 deep freezer에 보관하였다.
15) 조직학적 검사
1. 조직 슬라이드 제작
조직병리학적 검사를 위해 간과 부고환 지방조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였고, 고정된 조직을 삭정, 탈수 및 파라핀 포매 등의 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 블록을 제작하고 박절하였다. 박절한 간 조직 절편에 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 실시하여 NAFLD activity score (NAS)를 평가하였다. 또한 박절한 부고환 지방 절편에 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 실시하여 부고환 지방 조직 내 adipocyte size를 분석하였다.
2. Non-alcoholic fatty liver disease activity score(NAS) 평가
H&E 염색 슬라이드에서의 NAS 평가는 아래의 표 5를 참고하여 진행하였다.
3. H&E 염색을 통한 부고환 지방 조직 분석
부고환 지방 조직 내 adipocyte의 size를 측정하기 위하여 현미경을 통해 조직 슬라이드의 영상을 확보한 후 image J program을 이용하여 adipocyte의 size를 측정하여 분석하였다.
16) 자료의 통계처리
실험에서 얻어진 모든 실험 결과는 평균치 ± 표준편차로 표시하였고 SPSS (version 20, IBM SPSS Statistics, U.S.A.)를 사용하여 검정하였다. 모든 자료들에 대해 분산의 동질성을 비교하기 위한 Levene's test를 실시하였으며, 분산이 동질성을 갖는 경우 One-way analysis of variance (ANOVA)를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과의 유의차가 있는 시험군을 알아내기 위하여 Dunnett's test를 실시하였다. (유의수준: 양측 5%, 1% 및 0.1%)
(7) MCD diet에 의한 NASH 동물 모델 유도 실험
1) MCD(Methionine-Choline Deficient) diet 급이
정상 식이 그룹인 12수의 동물을 제외하고 나머지 80수의 동물을 대상으로 MCD (Methionine-Choline Deficient) diet (A02082002B, RESEARCH DIETS Inc., New Brunswick, U.S.A.)를 4주간 급이하여 비알코올 지방간을 유도하였다.
2) 군 분리
4주간 MCD diet를 급이한 동물을 대상으로 체중을 측정하였고, 그룹간 체중 측정값의 평균이 유사도록 군분리를 실시하였다.
3) 사료
1. 실험동물용 일반 고형 사료
순화 기간 동안 모든 동물에 제공하였으며, 질환 유도 기간 및 군 분리 후 정상 동물군에 제공하였다. (TEKLAD CERTIFIED GLOBAL 18% PROTEIN RODENT DIET 2018)
2. Methionine-Choline Deficient (MCD diet, A02082002B)
순화기간 종료 후 정상 동물군을 제외한 모든 동물에 MCD diet를 제공하였다.
4) 투여
약물 투여는 군 분리한 후 다음날부터 실시하였고, 대조물질은 8주간 1일 1회 경구 투여하였으며, 시험물질은 비강 내 투여 그룹의 경우 8주간 1주 2회 투여하였다. 정맥 투여 그룹은 투여 개시 후 2주간 1주 1회 투여하였고 투여 후 3주부터는 1주 2회 정맥 투여를 실시하였다.
5) 투여 방법 및 횟수
1. 군 분리 후 다음날부터 대조물질을 12주간 1일 1회 경구투여 하였으며, 시험물질은 12주간 1주 2회 비강 내 투여 및 1주 1회 정맥 투여를 실시하였다.
2. 대조물질의 경구 투여는 경구 투여용 존데를 부착한 일회용 주사기를 이용하여 위 내로 강제 투여하였고, 시험물질의 정맥 투여는 0.3 mL insulin syringe를 이용하여 마우스의 꼬리 정맥을 통해 정맥투여 하였으며, 비강내 투여는 흡입 마취 하에 micro pipette을 이용하여 비강 내 투여하였다.
6) 군 구성 및 투여 용량
군 구성은 총 6개의 군으로 아래의 표 6과 같이 나누어 진행하였다.
7) 관찰 및 검사
1. 검사일 설정
관찰, 측정 및 검사일은 투여 개시일을 Day 1일로 하였고, 투여 개시일부터 7일간을 투여 1주로 계산하였다.
2. 임상증상 관찰
모든 동물에 대하여 1일 1회 일반증상을 관찰하였고, 1일 2회 빈사 및 사망동물의 유무를 확인하였으며 관찰은 투여 1일부터 투여 종료시까지 실시하였다.
8) 체중측정
군 분리를 위해 시험물질 투여 전일에 전자 저울로 체중을 측정하였고, 투여 개시 후 주 1회 체중을 측정하였으며 이를 기준으로 시험물질 투여액량을 결정하였다. 시험물질 투여가 최종 종료되면 16시간 절식 후 체중을 측정한 후 부검을 실시하였다.
9) 사료 섭취량 측정
사료 섭취량은 군 분리 후 주 1회 사육상자별 사료 섭취량을 측정하였고, 체중 측정 전일 사료 급이량을 측정한 후 체중 측정 당일 잔량을 측정하여 사료 섭취량을 계산하였다.
10) 부검
부검은 투여를 종료한 후 각 그룹별 음수 제공 하에 16시간 절식을 시키고 부검은 개체 순서에 따라 진행하였다.
1. 복대정맥을 통해 혈액 채취 후 복부 장기에 대해 육안검사를 실시하였다.
2. 내부 장기의 이상 유무를 확인한 후 간 조직과 부고환 지방 조직을 적출하였고, 적출된 간 조직 개체 별 사진 촬영을 실시하였다.
3. 간 조직과 부고환 지방 조직을 생리식염수로 세척하고 여과지로 수분을 제거한 후 전자저울로 절대 중량을 측정하여 부검 전 절식된 체중에 대한 각각의 상대 중량을 아래와 같이 산출하였다.
산식 : 상대 장기 중량 = 장기 무게(g)/부검 전 절식 체중(g)
4. 적출하여 무게를 측정한 간 조직 일부는 2 set로 소분하여 1 set는 간 조직 내 hydroxyproline 분석을 위하여 액체질소로 급속 냉동 후 -70
Figure pat00007
이하의 deep freezer (Model 706, Thermo Fisher Scientific Inc., U.S.A.)에 보관하였고, 나머지 1 set는 조직학적 검사를 위해 10% 중성 완충 포르말린에 고정 및 남은 간 조직 -70
Figure pat00008
이하의 deep freezer에 보관하였다.
5. 복대정맥에서 채취한 혈액은 EDTA-2K tube (Microtainer, BD, U.S.A.)와 0.6 mL SST tube (Microtainer, BD, U.S.A.)에 각각 소분하였고, 0.6 mL SST tube에 담은 혈액은 완전히 굳힌 다음 EDTA-2K tube와 4
Figure pat00009
에서 5,000 rpm으로 15분간 원심분리한 후 혈청 및 혈장을 취하여 각각 1.5 mL tube에 담아 -70
Figure pat00010
이하의 deep freezer에 보관하였다.
11) 간 조직 내 hydroxyproline 분석
간 조직을 10 mg당 100 uL dH2O에 넣고 homogenization하였다. 간 균질액에 HCl (~12N) 100 μL를 넣고 Teflon cap으로 꽉 닫아서 120
Figure pat00011
에 3시간 가수분해하였다. 가수분해 된 sample을 vortex하고, 10,000 xg로 3분간 원심분리한 후, 가수분해 된 sample을 96 well plate에 10 μL를 옮기고 증발시킨 후 Hydroxyproline Colorimetric Assay Kit (K555-100, BioVision)을 이용하여 간 조직 내 hydroxyproline 농도를 microplate reader (SpectraMax M2, Molecular Devices, U.S.A.)로 560 nm에서 측정하였다.
12) 혈청학적 검사
부검시 복대정맥에서 채취하여 냉동 보관 중인 혈청을 이용하여 혈청 생화학 분석기(Blood chemistry analyzer, AU480, Beckman Coulter, Germany)로 간 염증 혈액 마커(AST, ALT, ALP, GGT) 및 혈중 지질 profile(T-chol, TG, H이-C, LDL-c) 등을 측정하였다. 분석 후 남은 검체(혈청)는 deep freezer에 보관하였다.
13) 절식 혈중 인슐린 분석
절식 혈중 인슐린 분석은 부검 시 EDTA-2K tube에 담아 채취한 혈액을 통해 얻은 혈장으로 Rat/Mouse Insulin ELISA Kit (#EZRMI-13K, Millipore)을 이용하여 ELISA reader (SpectraMax M2, Molecular Devices, U.S.A.)로 측정하였다.
14) 조직학적 검사
1. 조직 슬라이드 제작
조직병리학적 검사를 위해 간 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였고, 고정된 조직을 삭정, 탈수 및 파라핀 포매 등의 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 블록으로 제작하고 박절하였다. 박절한 조직 절편에 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 실시하여 NAFLD activity score (NAS)를 평가하였고, Sirius-red 염색을 실시하여 fibrosis score 및 area를 평가하였다.
2. Non-alcoholic fatty liver disease activity score(NAS) 평가
H&E 염색 슬라이드에서의 NAS 평가는 상기 표 5를 참고하여 진행하였다.
3. Fibrosis score 평가
Sirius-red 염색 슬라이드에서의 fibrosis score 평가는 아래의 표 6을 참고하여 진행하였다.
4. Fibrosis area 분석
Cellsens 소프트웨어를 이용하여 Sirius-red 염색 슬라이드를 200배 배율로 촬영한 뒤, Image J 소프트웨어를 이용하여 염색된 부분의 면적을 측정하였다. 이후 염색된 부분을 관심 영역(region of interest, ROI)의 총 면적으로 나누고, 이 비율을 기준으로 군간 평균을 비교하였다. 배경 염색 혹은 아티팩트 등 위양성으로 관찰될 수 있는 경우, threshold를 조절하여 측정하였다.
15) 자료의 통계처리
실험에서 얻어진 모든 실험 결과는 평균치 ± 표준편차로 표시하였고 SPSS (version 20, IBM SPSS Statistics, U.S.A.)를 사용하여 검정하였다. 모든 자료들에 대해 분산의 동질성을 비교하기 위한 Levene's test를 실시하였으며, 분산이 동질성을 갖는 경우 One-way analysis of variance (ANOVA)를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과의 유의차가 있는 시험군을 알아내기 위하여 Dunnett's test를 실시하였다. (유의수준: 양측 5%, 1% 및 0.1%)
2. 실험결과
(1) TLR5 아고니스트 어세이
상기 실험방법에 따라 제조한 1 내지 11번 각각의 단백질의 TLR5 활성화능을 평가하고, 이에 대한 결과를 도 1 내지 도 5에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, hIgG4 Fc의 힌지 일부 서열이 융합된 단백질(1번)과 힌지 전체서열이 융합된 단백질(4) 모두 TLR5 활성화능을 나타냈으며, 그 정도는 힌지 전체서열이 융합된 단백질에서 높게 나타났다.
도 2에 나타낸 바와 같이, Bsflagellin과 hIgG4 Fc를 연결하는 링커(GGGGS)가 1개인 융합단백질(1번)과 3개인 융합단백질(2번) 모두 TLR5 활성화능을 나타냈으며, 그 정도는 링커가 3개인 융합단백질에서 높게 나타났다.
도 3에 나타낸 바와 같이, Bsflagellin과 hIgG4 Fc를 연결하는 링커(GGGGS)가 1개인 융합단백질(1번)과 링커가 없는 융합단백질(3번) 모두 TLR5 활성화능을 나타냈으며, 그 정도는 비슷한 것으로 확인되었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 야생형의 hIgG4 Fc에 융합된 단백질(4번)과 비교해 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이(S228P)를 포함하고 있는 hIgG4 Fc에 융합된 단백질(6번)의 TLR5 활성화능이 현저히 높은 것으로 확인되었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이(S228P)를 포함하고 있는 hIgG4 Fc에 융합된 단백질(6번)과 추가적인 변이를 포함하는 전하 변이체들 모두 TLR5 활성화능이 나타난 것으로 확인되었다.
(2) 융합단백질과 TLR5와의 결합력 분석
상기 제조한 융합단백질 중에서 6번 융합단백질(MSP306)과 zTLR5와의 단백질-단백질 상호작용을 융합단백질-TLR5 결합에 대한 biolayer interferometry법으로, 그리고 융합단백질과 TLR5의 복합체 형성을 gel-filtration chromatography법으로 분석하였다.
이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이 6번 융합단백질은 결합력이 pM 수준으로 매우 뛰어난 것으로 확인되었다.
또한, 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능의 EC50 값을 산출해 본 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능의 EC50는 21.44nM로서 매우 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 효과가 가장 우수한 6번 융합단백질과, hIgG4 Fc의 C-말단 3번째 서열만 6번과 상이한 12번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 비교해 본 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 6번 및 12번 융합단백질의 활성이 거의 동일한 것으로 확인되었다.
3. 곤충세포에서의 단백질 발현 및 비강 흡수 실험
(1) 곤충세포에서의 단백질 발현
[Original Baculovirus의 제작]
1) 6 well plate에 각 well 당 100 x 104개의 Sf9 cell을 seeding 한다.
2) 항생제가 포함되지 않는 배양액을 2ml까지 채운 후 28℃에서 30분 동안 방치한다. 방치하는 동안 그 다음 단계를 진행한다.
3) CellfectinII solution(gibco) 8μl와 항생제가 포함되지 않는 배양액 100μl을 섞은 후 실온에서 30분 동안 방치한다.
4) 별도의 용기에 midi-prep DNA (서열번호 62, 1μg/μl concentration) 1.5μl와 linearized baculovirus DNA 1.5μl을 넣고 조심스럽게 섞은 후 실온에서 5분 동안 방치한 후 항생제가 포함되지 않는 배양액 100μl을 첨가한 후 섞어준다.
5) 단계 3)의 혼합액과 단계 4)의 혼합액을 섞은 후 실온에서 30분간 방치한다.
6) 단계 2)의 plate를 꺼내 기존의 배양액을 제거한 후 각 well에 새로운 배양액 1ml를 넣어준다.
7) 각 well에 단계 5)의 혼합액을 첨가하여 plate를 밀봉한 후 low T incubator에서 4시간동안 방치한다.
8) 배양액으로 씻어낸 후 항생제가 없는 배양액으로 바꿔준다.
9) plate를 밀봉한 후 28℃ incubator에서 5일동안 방치한다.
10) Original baculovirus를 이용하여 Primary Baculovirus를 바로 제작하지 않고 보관하는 경우, 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다. 바로 제작하는 경우 다음 과정을 따른다.
[Primary Baculovirus의 제작]
1) 실험 전 Sf9 cell을 Log phage 상태가 되도록 배양한다.
2) 75T 플라스크에 1000 x 104cells개의 Sf9 cell을 seeding 한 후 28℃에서 30분동안 방치한다.
3) Sf cell이 플라스크 바닥에 부착했는지 확인한 후 배양액을 모두 제거한다.
4) 새로운 배양액 1ml 넣어준 후 original baculovirus 500ul를 한 방울씩 파이펫으로 떨어뜨려 준다. original baculovirus가 잘 퍼지도록 부드럽게 흔들어준 후 28℃에서 1시간동안 방치한다.
5) 새로운 배양액 10ml를 첨가한 후 28℃에서 3일동안 방치한다.
6) Primary Baculovirus를 이용하여 Secondary Baculovirus를 바로 제작하지 않고 보관하는 경우, 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다. 바로 제작하는 경우 다음 과정을 따른다.
[Secondary Baculovirus의 제작]
1) 실험 전 Sf9 cell을 Log phage 상태가 되도록 배양한다.
2) 175T 플라스크에 2000 x 104개의 Sf9 cell을 seeding 한 후 28℃에서 30분동안 방치한다.
3) Sf cell이 플라스크 바닥에 부착했는지 확인한 후 배양액을 모두 제거한다.
4) 새로운 배양액 2ml 넣어준 후 primary baculovirus 500ul를 한 방울씩 파이펫으로 떨어뜨려 준다. primary baculovirus가 잘 퍼지도록 부드럽게 흔들어준 후 28℃에서 1시간동안 방치한다.
5) 새로운 배양액 20ml를 첨가한 후 28℃에서 3일동안 방치한다.
6) Secondary Baculovirus를 이용하여 Tertiary Baculovirus를 바로 제작하지 않고 보관하는 경우, 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다. 바로 제작하는 경우 다음 과정을 따른다.
[Tertiary Baculovirus의 제작]
단백질 발현이 확인되면 Tertiary Baculovirus을 제작한다. 이후의 과정은 진탕배양기를 사용한다.
1) 실험 전 Sf9 cell을 Log phage 상태가 되도록 배양한다.
2) 플라스크에 180-200 x 104개의 Sf9 cell을 seeding 한 후 적정양의 Secondary Baculovirus를 첨가한 후 28℃의 진탕배양기에서 90rpm 속도로 3일동안 배양한다.
3) 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다.
[단백질 획득]
1) 60-80 x 104cells/ml의 밀도로 Hi5 cell을 seeding 한다.
2) 180-200 x 104cells/ml의 밀도까지 Hi5 cell을 배양한 후 적정양의 Tertiary Baculovirus를 첨가한 후 28℃의 진탕배양기에서 90rpm 속도로 3일동안 배양한다.
3) 3일 배양 후 Hi5 cell을 튜브에 모은 후 4℃, 8000rpm의 조건으로 10분동안 원심 분리한다.
4) 단계 3)이 진행되는 동안 Roche Ni resin 5ml을 column에 넣은 후, [20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 30mM Imidazole] 용액 10ml를 흘려보낸다.
5) 단계 3)의 원심분리가 종료되면 상층액을 회수한 후 단계 4)에서 준비한 resin에 흘려보내준다.
6) [20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 30mM Imidazole] 용액 150ml를 흘려보낸다.
7) resin에 protein이 확인되면 다음 세 종류의 용액을 각각 15ml씩 흘려보낸다.
- 용액 1 : 20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 100mM Imidazole
- 용액 2 : 20 HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 300mM Imidazole
- 용액 3 : 20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 500mM Imidazole
8) SDS-PAGE를 통해 단백질을 확인한 후 농축한다.
9) 20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl 용액 9ml을 넣어 Imidazole을 1/10 희석한 후 다시 농축한다.
10) FPLC를 통해 SEC를 진행한 뒤 peak, SDS-PAGE를 확인하여 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 정제된 단백질을 수득했다 (20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl).
(2) 비강투여된 물질의 생체 내 이미징
시간에 따른 Bsflagellin 및 상기 곤충세포에서 발현한 서열번호 63의 융합단백질의 생체 내 이미징을 다음 단계에 따라 확인하였다:
[실험의 준비]
1) 8주령의 수컷 SKH1 mouse을 구입하여 순화 후 실험에 사용하였다.
2) 서열번호 63 융합단백질의 비교 대상인 BsFlagellin은 Invivogen에서 구입하여 사용하였다.
[물질의 표지]
물질의 생체 내 추적을 위한 물질의 표지는 다음 단계에 따라 진행하였다
1) Flamma 774 NHS ester (pws1603,bioacts)을 1mg으로 희석하였다.
2) BsFlagellin 혹은 서열번호 63의 융합단백질을 Flamma 774 NHS ester와 혼합한다.
3) 혼합된 물질을 4℃에서 3일동안 반응시킨다.
4) 반응 종료 후 Amicon Ultra centrifugal filter unit을 통해 표지되지 않은 물질을 분리하였다.
5) 분리된 물질은 BCA 정량법을 이용하여 농도를 결정하였다.
[생체 내 이미징 분석]
1) 이전 단계에서 준비한 물질을 SKH1 마우스(n=2)에 10ug/head로 비강으로 주입하였다.
2) SKH1 마우스(n=1)에 PBS를 같은 용량으로 주입하였다.
3) 생체 내 이미징 분석을 위해 마우스를 호흡 마취한다.
4) 마취 한 마우스를 비강 주입 후 3, 6, 24 시간 후에 IVIS™ imaging system(Perkin Elmer)을 이용하여 마우스의 목 부분까지 형광 검출 영상을 얻었다.
이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, BsFlagellin(도 9B) 혹은 서열번호 63의 융합단백질(도 9A)을 비강투여한 결과, 모든 마우스의 olfactory epithelium 및 lymph node(Depp cervical, mandibular)에서 두 물질에 표지된 형광이 검출되었다.
물질 주입 24시간 후의 형광 검출 영상에서 BsFlagellin(B)보다 서열번호 63의 융합단백질이 체내 흡수가 빠르게 진행됨을 확인할 수 있었다.
4. AMLN 식이에 의한 비알코올성 지방간질환 동물모델에서의 약리활성 평가
상기 실험방법에 따라 NASH 유도 모델의 군을 분리하고, 시험약물 처리를 나타내는 모식도를 도 10에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이 실험물질 투여 실시 후 AMLN diet를 급이한 모든 개체에서 G1 Normal diet control 그룹 대비 체중이 증가하였으며 실험물질인 MSP306 투여 그룹에서 물질투여 1주차 후 체중이 감소하였다.
실험물질 투여 후 주 1회 사료 섭취량을 측정한 결과 투여 기간 동안 G6 AMLN diet MSP306 high dose IV 고용량 정맥투여 그룹은 투여 시작일과 투여 후 1주에 G2 AMLN vehicle control 그룹 대비 유의한 수준으로 사료 섭취량이 감소하였다.
부검 시 적출한 간 조직의 상대 중량 결과에서 고용량의 MSP306 투여 그룹에서 유의하게 간 상대 중량이 감소하였고, 간 조직 내 TG Triglyceride(TG) 수치를 측정한 결과, 실험물질 MSP306 투여 그룹에서 용량의존적으로 간 조직 내 TG 수치가 감소하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 실험물질 투여 실시 후 12주에 측정한 Body Fat mass 결과에서 MSP306 투여 그룹에서 수치가 감소하는 경향을 보였으며, G6 AMLN diet MSP306 high dose IV 고용량 정맥투여 그룹에서 G2 AMLN diet vehicle control 그룹 대비 유의한 수준으로 fat mass 수치가 감소하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 경구 당부하 검사를 위해 부검 하루 전 하룻밤 동안 절식 후 2 g/kg의 glucose를 경구 투여하였고, 실험물질 투여 전 측정한 혈당 결과에서 실험물질 투여그룹이 G2 AMLN diet vehicle control 그룹과 비교하여 혈당이 유의하게 감소하였으며, 특히 G6 AMLN diet MSP306 IV 고용량 정맥투여 그룹에서 투여 후 120분까지 유의한 차이로 혈당 감소가 지속되었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 부검 시 적출한 간 조직을 고정하고 H&E 염색을 실시하여 간 조직의 NAFLD Activity Score(NAS)를 평가한 결과 실험물질 G5 AMLN diet high dose IN 고용량 비강투여군 및 G6 AMLN diet high dose IV 정맥투여 군에서 G2 AMLN diet vehicle control 그룹 대비 NAS 결과가 유의한 수준으로 감소하였으며, 부고환 지방 조직 내 adipocyte size 가 유의한 수준으로 감소하였다.
5. MCD 식이에 의한 비알코올성 지방간질환 동물모델에서의 약리활성 평가
상기 실험방법에 따라 NASH 유도 모델의 군을 분리하고, 시험약물 처리를 나타내는 모식도를 도 15에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이 실험물질 투여 실시 후 주 1회 체중을 관찰하였고, MCD diet를 급이한 모든 개체에서 G1 Normal diet control 그룹 대비 체중 감소하였고, 시험 종료 시까지 지속적으로 체중이 감소하였다.
실험물질 투여 첫날과 그 이후 매주 사료 섭취량을 측정하였고, 투여 첫날 실험물질 G6 MCD diet MSP306 IV 고용량 정맥투여 그룹은 G2 MCD diet vehicle control 그룹과 비교 시 유의한 수준으로 사료 섭취량이 감소하였지만 그 이후에는 유의한 사료 섭취량의 감소는 관찰되지 않았다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 부검 후 채취한 혈청을 이용하여 혈청학적 검사 결과를 실시하였고, 혈중 AST 결과에서 G6 MCD diet MSP306 IV 고용량 정맥 투여 그룹은 G2 MCD diet vehicle control 그룹과 비교하여 유의한 수준으로 혈중 AST, ALT, TG 수치가 감소하였다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 간 조직학적 검사에서 간 조직의 NAFLD activity score (NAS)를 평가한 결과, G4 MCD diet MSP306 low dose IN 저용량 비강 투여 그룹과 G5 MCD diet MSP306 high dose IN 고용량 비강 투여 그룹이 유의한 수준으로 NAFLD activity score 가 감소하였다
도 19에 나타낸 바와 같이, 간 조직의 섬유화 정도를 평가한 결과 G4 MCD diet MSP306 low dose IN 저용량 비강 투여 그룹, G5 MCD diet MSP306 high dose IN 고용량 비강 투여 그룹, G6 MCD diet MSP306 high dose IV 고용량 정맥 투여 그룹이 유의하게 fibrosis score와 fibrosis area가 감소하였다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 간 조직의 주요 섬유화 및 염증 조절인자들의 발현을 확인한 결과 MCD vehicle 그룹에 비하여 MCD MSP306 투여그룹에서 섬유화 및 염증 조절인자들의 발현이 유의하게 감소하였다.
항염증 및 조직재생관련 인자들의 발현양상에서는 MCD vehicle 그룹에 비하여 MCD MSP306 투여그룹에서 항염증 및 조직재생 관련 인자들의 발현이 상승하였다.
본 발명에 따른 조성물은 고지방식이 투여에 의해 유도된 대사증후군 및 비알코올성 지방간질환 동물모델에서 야생형 플라젤린과 비교해 현저히 향상된 예방 및 치료 효과를 나타내므로, 대사증후군 또는 간 질환 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY MEDISPAN CO.,Ltd <120> Composition for treating liver disease or metabolic syndrome comprising fusion protein of flagellin and immunoglobulin Fc region <130> NP21-0115 <160> 63 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus subtilis flagellin protein <400> 1 Met Arg Ile Asn His Asn Ile Ala Ala Leu Asn Thr Leu Asn Arg Leu 1 5 10 15 Gly Ser Asn Asn Gly Ala Ala Gln Lys Asn Met Glu Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Leu Arg Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Arg Gly Gln Ile Arg Gly Leu Glu Met Ala Ser Lys 50 55 60 Asn Ser Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Thr Glu Thr His Ala Ile Leu Gln Arg Met Arg Glu Leu Thr Val Gln 85 90 95 Ala Gly Asn Thr Gly Thr Gln Gln Ala Glu Asp Leu Gly Ala Ile Lys 100 105 110 Asp Glu Met Asp Ala Leu Ile Glu Glu Ile Asp Gly Ile Ser Asn Arg 115 120 125 Thr Glu Phe Asn Gly Lys Lys Leu Leu Asp Gly Thr Asn Ser Thr Asp 130 135 140 Gly Phe Thr Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Gly Gln Gln Leu Asn Val 145 150 155 160 Lys Ile Asp Ser Met Ser Ser Thr Ala Leu Gly Val Asn Ala Leu Asp 165 170 175 Val Thr Asp Phe Ala Ala Thr Ala Phe Asp Asp Gln Leu Lys Ser Ile 180 185 190 Asp Thr Ala Ile Asn Thr Val Ser Thr Gln Arg Ala Lys Leu Gly Ala 195 200 205 Val Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ala Ser Gly 210 215 220 Glu Asn Leu Thr Ala Ala Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala 225 230 235 240 Lys Glu Met Ser Glu Phe Thr Lys Asn Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ser 245 250 255 Gln Ala Met Leu Ala Gln Ala Asn Gln Gln Pro Gln Asn Val Leu Gln 260 265 270 Leu Leu Arg 275 <210> 2 <211> 505 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Salmonella dublin flagellin protein <400> 2 Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn 1 5 10 15 Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ile Glu Arg Leu 20 25 30 Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln 35 40 45 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attctttctc aagcttctca agctatgctt 780 gctcaagcta accaacagcc tcaaaacgta cttcaattat tacgtggtgg cggagggtct 840 gccatggtta gatctgaatc caaatacggt cccccatgcc caccttgccc agcacctgag 900 ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc 960 tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc 1020 cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1080 gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1140 ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag 1200 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca 1260 tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac 1320 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1380 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac 1440 aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1500 aaccactaca cacagaagag cctctccctg tctctgggta aatga 1545 <210> 61 <211> 514 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L) Protein <400> 61 Met Arg Ile Asn His Asn Ile Ala Ala Leu Asn Thr Leu Asn Arg Leu 1 5 10 15 Gly Ser Asn Asn Gly Ala Ala Gln Lys Asn Met Glu Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Leu Arg Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Arg Gly Gln Ile Arg Gly Leu Glu Met Ala Ser Lys 50 55 60 Asn Ser Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Thr Glu Thr His Ala Ile Leu Gln Arg Met Arg Glu Leu Thr Val Gln 85 90 95 Ala Gly Asn Thr Gly Thr Gln Gln Ala Glu Asp Leu Gly Ala Ile Lys 100 105 110 Asp Glu Met Asp Ala Leu Ile Glu Glu Ile Asp Gly Ile Ser Asn Arg 115 120 125 Thr Glu Phe Asn Gly Lys Lys Leu Leu Asp Gly Thr Asn Ser Thr Asp 130 135 140 Gly Phe Thr Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Gly Gln Gln Leu Asn Val 145 150 155 160 Lys Ile Asp Ser Met Ser Ser Thr Ala Leu Gly Val Asn Ala Leu Asp 165 170 175 Val Thr Asp Phe Ala Ala Thr Ala Phe Asp Asp Gln Leu Lys Ser Ile 180 185 190 Asp Thr Ala Ile Asn Thr Val Ser Thr Gln Arg Ala Lys Leu Gly Ala 195 200 205 Val Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ala Ser Gly 210 215 220 Glu Asn Leu Thr Ala Ala Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala 225 230 235 240 Lys Glu Met Ser Glu Phe Thr Lys Asn Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ser 245 250 255 Gln Ala Met Leu Ala Gln Ala Asn Gln Gln Pro Gln Asn Val Leu Gln 260 265 270 Leu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ala Met Val Arg Ser Glu Ser Lys 275 280 285 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 290 295 300 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 305 310 315 320 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 325 330 335 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 340 345 350 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 355 360 365 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 370 375 380 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 385 390 395 400 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 405 410 415 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 420 425 430 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 435 440 445 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 450 455 460 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 465 470 475 480 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 485 490 495 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 500 505 510 Gly Lys <210> 62 <211> 1590 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAcGP67-A-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L-Insect) DNA <400> 62 atgagaatta accacaatat tgcagcactt aacacattga atcgtttggg ttcaaacaac 60 ggagcagcac aaaagaatat ggagaagctt tcttcaggtc ttcgtatcaa ccgtgcggga 120 gatgacgcag caggtctagc gatctctgaa aaaatgagag gacaaatcag aggtcttgaa 180 atggcttcta aaaactctca agatggaatc tctcttatcc aaacagctga gggtgcatta 240 actgaaactc atgcaattct tcaacgtatg cgtgaactta ctgttcaagc aggaaacaca 300 ggtacacaac aagctgaaga tcttggtgca attaaagatg aaatggatgc gcttatcgag 360 gaaattgatg gcatttcaaa ccgtactgaa tttaacggta aaaagttgct agacggaact 420 aattctactg atggtttcac attccaaatt ggtgcgaatg ctggccaaca actaaatgta 480 aaaattgaca gcatgtcatc aactgcttta ggagtaaacg cacttgatgt aacagatttc 540 gctgctactg cttttgatga tcaacttaaa agtattgata ctgccatcaa tactgtatca 600 actcaacgtg ctaaattagg tgcggtacaa aaccgtctag agcatacaat caacaactta 660 ggcgcttctg gtgaaaacct gacagctgct gagtctcgta tccgtgacgt tgacatggct 720 aaagaaatga gcgagttcac taagaacaac attctttctc aagcttctca agctatgctt 780 gctcaagcta accaacagcc tcaaaacgta cttcaattat tacgtggtgg cggagggtct 840 gccatggtta gatctgaatc caaatacggt cccccatgcc caccttgccc agcacctgag 900 ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc 960 tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc 1020 cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1080 gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1140 ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag 1200 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagagccac aggtgtacac cctgccccca 1260 tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac 1320 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1380 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac 1440 aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1500 aaccactaca cacagaagag cctctccctg tctctgggta aatgcggccg cctggttccg 1560 cgtggttcgc atcatcatca tcatcactga 1590 <210> 63 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pAcGP67-A-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L-Insect) Protein <400> 63 Met Arg Ile Asn His Asn Ile Ala Ala Leu Asn Thr Leu Asn Arg Leu 1 5 10 15 Gly Ser Asn Asn Gly Ala Ala Gln Lys Asn Met Glu Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Leu Arg Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Arg Gly Gln Ile Arg Gly Leu Glu Met Ala Ser Lys 50 55 60 Asn Ser Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Thr Glu Thr His Ala Ile Leu Gln Arg Met Arg Glu Leu Thr Val Gln 85 90 95 Ala Gly Asn Thr Gly Thr Gln Gln Ala Glu Asp Leu Gly Ala Ile Lys 100 105 110 Asp Glu Met Asp Ala Leu Ile Glu Glu Ile Asp Gly Ile Ser Asn Arg 115 120 125 Thr Glu Phe Asn Gly Lys Lys Leu Leu Asp Gly Thr Asn Ser Thr Asp 130 135 140 Gly Phe Thr Phe Gln Ile Gly Ala Asn Ala Gly Gln Gln Leu Asn Val 145 150 155 160 Lys Ile Asp Ser Met Ser Ser Thr Ala Leu Gly Val Asn Ala Leu Asp 165 170 175 Val Thr Asp Phe Ala Ala Thr Ala Phe Asp Asp Gln Leu Lys Ser Ile 180 185 190 Asp Thr Ala Ile Asn Thr Val Ser Thr Gln Arg Ala Lys Leu Gly Ala 195 200 205 Val Gln Asn Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ala Ser Gly 210 215 220 Glu Asn Leu Thr Ala Ala Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala 225 230 235 240 Lys Glu Met Ser Glu Phe Thr Lys Asn Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ser 245 250 255 Gln Ala Met Leu Ala Gln Ala Asn Gln Gln Pro Gln Asn Val Leu Gln 260 265 270 Leu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Ala Met Val Arg Ser Glu Ser Lys 275 280 285 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 290 295 300 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 305 310 315 320 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 325 330 335 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 340 345 350 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 355 360 365 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 370 375 380 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 385 390 395 400 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 405 410 415 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 420 425 430 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 435 440 445 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 450 455 460 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 465 470 475 480 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 485 490 495 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 500 505 510 Gly Lys Cys Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Ser His His His His His 515 520 525 His

Claims (22)

  1. 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 세라티아(Serratia) 속, 시겔라(Shigella) 속, 트레포네마(Treponema) 속, 레기오넬라(Legionella) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 바르토넬라(Bartonella) 속, 프로튜스(Proteus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 여시니아(Yersinia) 속, 캄필로박터(Campylobacter) 속, 로세부리아(Roseburia) 속 및 마리노박터(Marinobacter) 속으로 이루어진 군에서 선택된 미생물 유래의 플라젤린인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 세라티아 마세센스(Serratia marcesens), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 보렐리아 버그도페레이(Borrelia burgdorferei), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바르토넬라 클라리제이애(Bartonella clarridgeiae), 프로튜스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에스테리키아 콜라이(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 여시니아 페스티스(Yersinia pestis), 캄필로박터(Campylobacter spp), 로세부리아(Roseburia spp) 및 마리노박터(Marinobacter spp)로 이루어진 군에서 선택된 미생물 유래의 플라젤린인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 TLR5 (toll-like receptor 5)에 의해 인식되는 보존된 서열(conserved sequence)을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단편은 야생형(wild-type) 플라젤린에서 초가변 영역(hypervariable region)이 제거된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단편은 야생형(wild type) 플라젤린의 C-말단 도메인 0, C-말단 도메인 1, C-말단 도메인 2, N-말단 도메인 2, N-말단 도메인 1, N-말단 도메인 0 및 상기 각 도메인들과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내는 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린의 변이체는 야생형(wild-type) 플라젤린과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내며 톨-유사 수용체 5(Toll-like receptor 5, TLR5) 자극 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 힌지(hinge)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 힌지는 CPPC 서열을 포함하는 4 내지 12개의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이는 상기 IgG4 Fc의 중쇄 간 이황화 결합 형성을 부여하는 돌연변이인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 위치 228에서 Ser이 Pro로 치환된 것(S228P), 위치 409에서 Arg이 Lys으로 치환된 것(R409K), 또는 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 위치 220에서 Ser이 Pro로 치환된 것(S220P), 위치 223에서 Gly이 Thr으로 치환된 것(G223T), 위치 224에서 Pro이 His으로 치환된 것(P224H) 및 위치 225에서 Pro이 Thr으로 치환된 것(P225T)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 3번째 아미노산이 Leu에서 Pro으로 치환된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단 또는 C-말단이 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 직접 연결되거나 또는 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 서열번호 6 내지 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 링커는 상기 링커는 (GGGGS)n (n은 1 내지 5)의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61 또는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 상기 간 질환은 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염, 알코올성 지방간, 간염, 간 섬유화, 간 경변, 간 부전 및 간암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징을 하는 약학적 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 대사증후군은 당뇨, 대사증후군, 인슐린 저항성, 고지혈증 및 고혈압으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  22. 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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