WO2023204564A1 - 플라젤린 및 면역글로불린 fc 융합 단백질을 포함하는 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물 - Google Patents

플라젤린 및 면역글로불린 fc 융합 단백질을 포함하는 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a composition for treating liver disease or metabolic syndrome comprising flagellin and an immunoglobulin Fc fusion protein, and more specifically, to a fusion protein comprising flagellin and a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc
  • the variant relates to a composition for treating liver disease or metabolic syndrome that has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • Metabolic syndrome is a general term for diseases caused by metabolic disorders in the body. It is generally caused by an imbalance in carbohydrates, lipids, proteins, vitamins, electrolytes, and moisture. Examples include metabolic syndrome, diabetes, hyperlipidemia, fatty liver, arteriosclerosis, and high blood pressure. Among these, type 2 diabetes is a type of diabetes that mainly appears in adulthood and is characterized by increased resistance to insulin. Sensitivity to insulin decreases when the insulin receptor itself decreases, its sensitivity decreases, or there is a problem with the secondary messenger that causes intracellular glycogen synthesis. Therefore, type 2 diabetes is called non-insulin dependent diabetes and accounts for 85-90% of diabetes.
  • steatohepatitis is closely related to metabolic syndrome, insulin resistance, and type 2 diabetes, but active research is currently underway to determine the clear pathogenesis, and as the 'two-hit' hypothesis has recently been proposed, steatohepatitis is caused by fat in liver cells. It begins with the accumulation of insulin resistance, which is associated with metabolic syndrome and diabetes, and is considered the main pathogenesis. Additionally, it has been reported that lipotoxicity caused by increased free fatty acid (FFA) or cholesterol in hepatocytes and increased inflammatory cytokines and their receptors play an important role in the process of progressing from fatty liver to steatohepatitis.
  • FFA free fatty acid
  • flagellin is a structural protein that assembles into whip-like filaments of bacterial flagella, which extend from the cell surface and function to enable bacteria to move.
  • Flagellin acts as a virulence factor for pathogenic bacteria and promotes their entry and invasion into host cells.
  • Flagellin is found exclusively in bacteria and is one of the most abundant proteins in flagellated bacteria, making flagellin a major target of host immune surveillance.
  • flagellin is detected by Toll-like receptor 5 (TLR5) and NAIP5/NLRC4 in the host and activates innate immunity contributing to immediate elimination of the pathogen in the host.
  • TLR5 Toll-like receptor 5
  • NAIP5/NLRC4 activates innate immunity contributing to immediate elimination of the pathogen in the host.
  • Flagellin has been of interest as a target for the development of vaccine carrier proteins or vaccine adjuvants because it serves as the first line of defense against flagellated-pathogenic bacteria.
  • the present inventor conducted repeated research to develop a protein with improved flagellin function, and as a result, a new type of fusion protein in which flagellin and immunoglobulin Fc were fused was found to be wild-type flagellin, and known flagellin. It was found that it exhibits significantly superior TLR5 activation ability compared to fragments, etc.
  • the Fc of human IgG4 was used to When producing a fusion protein, it was confirmed that the TLR5 activation ability of flagellin was significantly reduced due to the formation of a half-shaped antibody molecule due to the exchange of the Fab arm. This problem was solved by using a human IgG4 Fc mutant. At the same time, the present invention was completed by discovering that it was possible to provide a fusion protein that showed significantly improved treatment effects for liver disease and metabolic syndrome compared to wild-type flagellin.
  • the object of the present invention is flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; and a fusion protein containing a variant of human IgG4 Fc as an active ingredient, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange, and is a pharmaceutical for preventing or treating liver disease or metabolic syndrome.
  • a composition is provided.
  • the object of the present invention is flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; and a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease or metabolic syndrome is provided. It is done.
  • the object of the present invention is flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; and a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease or metabolic syndrome. is to provide.
  • Another object of the present invention is flagellin, fragments thereof, or variants thereof; and a fusion protein containing a variant of human IgG4 Fc as an active ingredient, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • a food composition for preventing or improving liver disease or metabolic syndrome. is to provide.
  • another object of the present invention is flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; And a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • Providing a food composition for preventing or improving liver disease or metabolic syndrome. will be.
  • Another object of the present invention is flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; and a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • Another object of the present invention is to prepare a pharmaceutical composition for treating liver disease or metabolic syndrome, including flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; and a use of a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • Another object of the present invention is flagellin, fragments thereof, or variants thereof;
  • a method for treating liver disease or metabolic syndrome comprising administering to an individual in need an effective amount of a composition containing a fusion protein containing a variant of human IgG4 Fc as an active ingredient, wherein the human IgG4 Fc variant is a Fab arm ( arm) to provide a method of treating liver disease or metabolic syndrome that has a mutation that prevents exchange.
  • the present invention includes flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; and a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc as an active ingredient, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating colitis. .
  • the present invention relates to flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; and a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • the present invention relates to flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; and a fusion protein containing a variant of human IgG4 Fc as an active ingredient, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange, and is a pharmaceutical for preventing or treating liver disease or metabolic syndrome.
  • a composition is provided.
  • the present invention relates to flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; and a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease or metabolic syndrome is provided. do.
  • the present invention relates to flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; and a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease or metabolic syndrome. provides.
  • the present invention provides flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; and a fusion protein containing a variant of human IgG4 Fc as an active ingredient, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • a food composition for preventing or improving liver disease or metabolic syndrome. provides.
  • the present invention provides flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; and a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • the present invention provides a food composition for preventing or improving liver disease or metabolic syndrome. .
  • the present invention provides flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof; and a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • the present invention provides flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof for preparing a pharmaceutical composition for treating liver disease or metabolic syndrome; and a use of a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • the present invention provides flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof;
  • a method for treating liver disease or metabolic syndrome comprising administering to an individual in need an effective amount of a composition containing a fusion protein containing a variant of human IgG4 Fc as an active ingredient, wherein the human IgG4 Fc variant is a Fab arm ( arm)
  • a method of treating liver disease or metabolic syndrome which has a mutation that prevents exchange.
  • the present invention relates to flagellin, fragments thereof or variants thereof; and a fusion protein containing a variant of human IgG4 Fc as an active ingredient, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange, and is a pharmaceutical for preventing or treating liver disease or metabolic syndrome.
  • a composition is provided.
  • the flagellin can induce an immune response in the infected host when flagellated bacteria are infected. More specifically, Toll-like receptor 5 (TLR5; Toll like receptor 5), which exists on the surface of the human cell membrane, interacts with the flagellin to induce intracellular signal transmission, through which the expression of the transcription factor NF-kB This increase not only induces the activation of innate immune signals, but also regulates acquired immune responses.
  • TLR5 Toll-like receptor 5
  • NF-kB transcription factor NF-kB
  • Flagellin proteins are well known in the art. Most Gram-negative bacteria express flagella, which are surface structures that provide motility. The flagellum consists of a basal body, a filament, and a hook connecting the two. The filament is made up of a long polymer of a single protein, flagellin, with a small cap protein at the end.
  • the hypervariable region located in the middle of the flagellin protein is highly variable in sequence and length between species.
  • the flagellin may be flagellin derived from any suitable bacteria. Many flagellin genes have been cloned and sequenced in the art and may be referenced. In the present invention, non-limiting sources of flagellin include Bacillus genus , Salmonella genus , Helicobacter genus , Vibrio genus , Serratia genus , and Shigella genus.
  • Treponema genus , Legionella genus , Borrelia genus , Clostridium genus , Agrobacterium genus , Bartonella genus , Proteus (Proteus) genus , Pseudomonas genus , Escherichia genus , Listeria genus , Yersinia genus , Campylobacter genus , Roseburia genus or Examples include microorganisms of the genus Marinobacter , preferably the genus Bacillus and Salmonella . or Examples include microorganisms of the genus Vibrio .
  • the flagellin is Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella Dublin, Salmonella enterica, Helicobacter pylori. pylori), Vibrio cholera , Vibrio vulnificus, Vibrio fibrisolvens, Serratia marcesens, Shigella flexneri, Treponema Treponema pallidum , Borrelia burgdorferei, Clostridium difficile, Agrobacterium tumefaciens, Bartonella clarridgeiae, Pro Proteus mirabilis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus halodurans, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli coli, Listeria monocytogenes , Yersinia pestis, Campylobacter spp, Roseburia spp, or Marinobacter spp . ,
  • the flagellin is Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella Dublin, Salmonella enterica, Vibrio cholera ( Vibrio cholera), Vibrio vulnificus, Vibrio fibrisolvens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus or It may be flagellin from Bacillus halodurans ,
  • it may be flagellin derived from Bacillus subtilis .
  • N-terminal and C-terminal constant regions of flagellin are well characterized in the art.
  • the size of the constant region may vary somewhat depending on the source of the flagellin protein.
  • the N-terminal constant domain contains about 170 or 180 N-terminal amino acids of the protein, while the C-terminal constant domain typically contains about 85 to 100 C-terminal amino acids.
  • the central hypervariable region varies considerably in size and order among bacteria, and most of the differences in molecular mass can be explained by the hypervariable region.
  • flagellin proteins derived from various bacteria are known, and flagellins from as yet unknown bacteria can also be determined by a person skilled in the art to determine the flagellin monomer using techniques known in the art.
  • the structure can be easily identified.
  • flagellin As used herein, the terms “flagellin,” “flagellin N-terminal constant region,” and “flagellin C-terminal constant region” include flagellin active fragments and variants derived from any of the above-mentioned bacteria. do. Additionally, wild-type flagellin or portions of flagellin may be modified to increase safety and/or immune response and/or as a result of cloning procedures or other laboratory manipulations and such modifications (or variants) ) is also included in the scope of the present invention.
  • the flagellin may include full-length flagellin or an active fragment thereof. Additionally, terms such as “flagellin”, “flagellin N-terminal constant region”, and “flagellin C-terminal constant region” include naturally occurring amino acid sequences, or include naturally occurring flagellin, flagellin N-terminal constant region, respectively. It may also include an amino acid sequence that is substantially identical to or similar to the amino acid sequence of the terminal constant region or the flagellin C-terminal constant region.
  • an “active fragment” of flagellin, flagellin N-terminal constant region, flagellin C-terminal constant region or any other portion of flagellin is at least about 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250 or It may include at least 300 contiguous amino acids and/or less than about 300, 250, 200, 150, 125, 100 or 75 contiguous amino acids, or combinations thereof as long as the lower limit is less than the upper limit.
  • the active fragment may refer to a fragment capable of activating the TLR5 pathway in the host.
  • the active fragment is capable of activating the TLR5 pathway with at least about 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95% of full-length flagellin, or with full-length flagellin or a portion of flagellin. It may activate the TLR5 pathway to the same or essentially the same extent, or may activate the TLR5 pathway to a greater degree compared to full-length flagellin or flagellin regions.
  • the active fragment may refer to at least one part of flagellin that exhibits TLR5 pathway activation ability.
  • the term “at least one part” may refer to a part of flagellin domains 0, 1, 2, and 3 that exhibit TLR5 pathway activation. More specifically, the active fragment may be one in which the hypervariable region has been removed from full-length flagellin.
  • the hypervariable region may vary depending on the type of bacteria from which the flagellin is derived, and the sequence corresponding to the hypervariable region among the entire sequence of a specific flagellin can be easily identified and removed by a person skilled in the art.
  • N-terminal domains 0, 1, 2; domain 3; and C-terminal domains 2, 1, 0, domain 3, or domains 2 and 3 may be the hypervariable region, and N-terminal domains 0, 1; domain 2; In the case of full-length flagellin containing C-terminal domains 1 and 0, domain 2 may be a hypervariable region.
  • the folding of the flagellin protein may occur. Some of the sequences in the hinge region may have been removed.
  • hypervariable region used in the present invention may be expressed as a propeller domain or region, hinge, hypervariable region, variable domain or region, etc.
  • removal of the hypervariable region may mean removal of the entire domain corresponding to the hypervariable region, or may mean removal of part of the sequence of the hypervariable region.
  • the active fragment may be a form of flagellin in which the hypervariable region of wild-type flagellin is removed and an artificial sequence (i.e., a hinge or linker of the artificial sequence) is inserted into the removed hypervariable region.
  • an artificial sequence i.e., a hinge or linker of the artificial sequence
  • the flagellin fragment of the present invention is C-terminal domain 0, C-terminal domain 1, C-terminal domain 2, N-terminal domain 2, N-terminal domain 1, of wild type flagellin. It may refer to a fragment that exhibits TLR5 pathway activation ability and includes at least one selected from the group consisting of N-terminal domain 0 and regions showing more than 80% amino acid sequence homology with each of the above domains.
  • the active fragment of flagellin is capable of activating the TLR5 pathway at least about 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95% of full-length flagellin, or It may activate the TLR5 pathway to the same or essentially the same extent as the gelin moiety, or it may activate the TLR5 pathway to a higher degree compared to full-length flagellin or flagellin moiety.
  • the present invention also includes proteins having the full-length sequence of wild-type flagellin as well as amino acid sequence variants thereof.
  • a variant refers to a protein having a different sequence due to deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of some amino acid residues of wild-type flagellin or a fragment protein thereof, substitution of amino acid analogs, or a combination thereof.
  • Amino acid exchanges that do not overall alter the activity of the molecule (i.e., its ability to activate the TLR5 pathway) are known in the art.
  • the variant of the present invention is full-length flagellin modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, etc. Or it may be a fragment thereof.
  • the variant of flagellin or fragment thereof is capable of activating the TLR5 pathway at least about 50%, 75%, 80%, 85%, 90% or 95% of full-length flagellin or fragment thereof, or It may activate the TLR5 pathway to the same or essentially the same extent as full-length flagellin or a fragment thereof, or may activate the TLR5 pathway to a higher degree compared to full-length flagellin or a fragment thereof.
  • the flagellin, its fragment, or its variant may be in the form of a fusion protein containing another polypeptide.
  • the flagellin may be a fusion protein containing one or more antigens.
  • antigens include S. pneumoniae PspA1 antigen, S. pneumoniae PspA2 antigen, S. pneumoniae PspA3 antigen, S. pneumoniae PspA4 antigen, S. pneumoniae PspA5 antigen and/or S. pneumoniae PspA6 antigen.
  • the flagellin may be in the form of a fusion protein to which one or more immunomodulatory substances are bound.
  • the immune modulating substance may be included without limitation as long as it is known in the art to increase the immune response, and non-limiting examples include interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , Interleukin-1 ⁇ , interleukin-1 ⁇ , interleukin-2, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-5, interleukin-6, interleukin-7, interleukin-8, interleukin-9, interleukin-10, interleukin-11, interleukin- 12, interleukin-13, interleukin-14, interleukin-18, B cell growth factor, CD40 ligand, TNF- ⁇ , TNF- ⁇ , CCL25, CCL28 or active fragments thereof.
  • percent sequence homology means aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, without considering any conservative substitutions as part of the sequence identity to achieve maximum percent sequence identity. , defined as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to amino acid residues in the reference polypeptide. Alignment for the purpose of determining percent amino acid homology can be performed using a variety of methods within the skill of the art, for example, BLAST, BLAST-2, ALIGN, etc., using publicly available computer software programs. ) or can be achieved using Megalign (DNASTAR) software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms necessary to achieve maximal alignment over the entire length of the sequences being compared.
  • the percent amino acid sequence homology of a given amino acid sequence A with or to a given amino acid sequence B is calculated as follows: 100 times the fraction X/Y; where It will be understood that if the length of amino acid sequence A is not the same as the length of amino acid sequence B, the percent amino acid sequence identity of A to B will not equal the percent amino acid sequence identity of B to A.
  • the flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof may be composed of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 5, or an amino acid sequence exhibiting at least 80% sequence homology thereto.
  • the IgG4 Fc consists of heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) regions, excluding heavy chain constant region 1 (CH1) and light chain constant region 1 (CL1), and heavy chain and light chain variable regions of IgG4. It means that it may include a hinge part.
  • the IgG4 Fc excludes only the heavy and light chain variable regions of immunoglobulin, and includes part or all of the heavy chain constant region 1 (CH1) and/or light chain constant region 1 ( It may be an expanded IgG4 Fc including CL1). Additionally, it may be a region in which some fairly long amino acid sequences corresponding to CH2 and/or CH3 have been removed.
  • IgG4 Fc when producing a protein fusion using a native IgG Fc sequence, IgG4 Fc can be selected among efforts to minimize the effector function of Fc.
  • IgG4 is known to have a similar in vivo half-life as IgG1, but has a relatively small effector function due to differences in amino acid sequence.
  • IgG4 having a reduced effector function, it has been reported in the art that Fab arm exchange between IgG4 occurs in vivo due to the unique hinge sequence, resulting in great difficulty when using protein fusions for therapeutic purposes. .
  • IgG4 Fc when IgG4 Fc is used as a carrier for a protein fusion, the Fab arm is exchanged with the IgG4 that exists in the body, forming a hybrid with native IgG4 or existing as a monomer and changing the original structure, resulting in low therapeutic activity.
  • the problem of having a structure arises. This is a common problem whether the fusion of the IgG4 Fc fragment and the bioactive substance is produced using genetic engineering methods or in vitro .
  • the human IgG4 Fc variant included in the fusion protein of the present invention is characterized by containing a mutation that can prevent Fab arm exchange.
  • Mutations that can prevent exchange of the Fab arm of the IgG4 Fc may include deletion, insertion, or substitution of amino acids occurring in one or more of the Fc hinge, CH2, and CH3.
  • the mutation capable of preventing exchange of the Fab arm of the human IgG4 Fc may be characterized as a mutation that confers the formation of disulfide bonds between heavy chains of the human IgG4 Fc.
  • the 'disulfide bond' refers to a covalent bond formed between two sulfur atoms.
  • the mutation that confers the formation of a disulfide bond between the heavy chains of the human IgG4 Fc may be characterized as a mutation in the hinge.
  • the hinge of human IgG4 Fc consists of a total of 12 amino acids (ESKYGPPCPSCP) (SEQ ID NO: 64), and mutations in the hinge include deletion, insertion, or substitution of amino acids occurring in the hinge sequence.
  • the mutation in the hinge is a mutation in which the CPSC (SEQ ID NO: 80) sequence is replaced with CPPC (SEQ ID NO: 79) among the 12 amino acids constituting the hinge of the human IgG4 Fc and some amino acids are deleted or inserted, or a mutation in which another amino acid is substituted.
  • the human IgG4 Fc may be characterized as comprising a hinge consisting of 4 to 13 amino acids including the CPPC (SEQ ID NO: 79) sequence. More specifically, the human IgG4 Fc is ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 66), SKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 71), KYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 72), YGPPCPPCP (SEQ ID NO: 73), GPPCPPCP (SEQ ID NO: 74), and PPCPPCP (SEQ ID NO: 75) , PCPPCP (SEQ ID NO: 76), CPPCP (SEQ ID NO: 77), CPPCP (SEQ ID NO: 78), or CPPC (SEQ ID NO: 79).
  • ESKYGPPCPPCP SEQ ID NO: 66
  • SKYGPPCPPCP SEQ ID NO: 71
  • KYGPPCPPCP SEQ ID NO: 72
  • YGPPCPPCP SEQ ID NO: 73
  • the human IgG4 Fc may be mutated in the hinge region to ensure the formation of a disulfide bond between the two hinge regions.
  • the mutation in the human IgG4 Fc hinge region may include a serine (Ser) to proline (Pro) mutation (S228P) at position 228 (according to EU numbering).
  • the human IgG4 Fc may be characterized in that some amino acids are deleted from the hinge of wild-type IgG4 Fc, thereby preventing Fab arm exchange.
  • Specific examples in which Fab arm exchange is prevented by deleting some amino acids from the hinge of IgG4 Fc are known in the art.
  • the mutation capable of preventing exchange of the Fab arm of the IgG4 Fc may include S228P, R409K, or a combination thereof (according to EU numbering).
  • the variant of human IgG4 Fc is one in which Ser is substituted with Pro at position 220 of wild-type human IgG4 Fc (S220P), Gly is substituted with Thr at position 223 (G223T), and position 224. It may further include one or more amino acid mutations selected from the group consisting of Pro being substituted with His (P224H) and Pro being substituted with Thr at position 225 (P225T). Such amino acid mutations allow them to function as charge variants that affect the stability of the protein without affecting the activity of wild-type human IgG4 Fc.
  • the human IgG4 Fc variant capable of preventing Fab arm exchange is an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6 to 11 or an amino acid sequence having at least 80% sequence homology thereto. It can be characterized as being accomplished.
  • the human IgG4 Fc variant is a mutation that prevents Fab arm exchange, and also includes a derivative (mutein) of the IgG4 Fc variant.
  • a derivative of an IgG4 Fc variant means that one or more amino acid residues in the amino acid sequence have a different sequence due to deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • various types of derivatives are possible, such as in which several amino acids at the N-terminus of native Fc are removed or a methionine residue is added to the N-terminus of native Fc.
  • the complement binding site for example, the C1q binding site, may be removed, and the ADCC site may be removed. Techniques for preparing sequence derivatives of such Fc regions are known in the art.
  • Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not overall alter the activity of the molecule are known in the art.
  • the most common exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/ It is an exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, and Asp/Gly.
  • the human IgG4 Fc variant may undergo phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, or amylation ( It can also be modified with amidation, etc.
  • the derivative of the human IgG4 Fc variant described above exhibits the same biological activity as the human IgG4 Fc variant, but has increased structural stability against heat, pH, etc.
  • a fusion protein of a derivative in which the third C-terminal amino acid of wild-type human IgG4 Fc is substituted from Leu to Pro (including an amino acid mutation that prevents Fab arm exchange in the hinge region) and flagellin is produced.
  • the derivative of the human IgG4 Fc variant may additionally contain a mutation that improves the stability of the protein without affecting the activity of the fusion protein, and specifically, the C- of the wild-type human IgG4 Fc. It can be characterized as a derivative in which the third terminal amino acid is substituted from Leu to Pro.
  • the human IgG4 Fc variant may have a native sugar chain, an increased sugar chain compared to the native type, a decreased sugar chain compared to the native type, or a form in which the sugar chain has been removed.
  • Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms can be used to increase or decrease sugar chains.
  • the human IgG4 Fc variant from which the sugar chain has been removed significantly reduces the binding ability of complement (c1q) and reduces or eliminates antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity, so it does not induce unnecessary immune responses in vivo.
  • a form more suitable for its original purpose as a drug carrier would be a human IgG4 Fc variant in which the sugar chain has been removed or non-glycosylated.
  • “Deglycosylation” refers to a human IgG4 Fc variant in which the sugar has been removed with an enzyme
  • “Aglycosylation” refers to a variant produced in a prokaryotic animal, preferably Escherichia coli, and not glycosylated.
  • the fusion protein may be one in which the N-terminus or C-terminus of the flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof is bound to the N-terminus or C-terminus of the human IgG4 Fc variant.
  • the N-terminus of the flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof is bound to the C-terminus of a human IgG4 Fc variant, or the C-terminus of the flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof is bound to the C-terminus of a human IgG4 Fc variant. It may be bound to the N-terminus.
  • the C-terminus of the flagellin, fragment thereof, or variant thereof may be bound to the N-terminus of the human IgG4 Fc variant.
  • each component constituting the fusion protein may be directly connected to each other or may be connected through a linker.
  • linker refers to a nucleic acid, amino acid, or non-peptide residue that can be inserted between one or more molecules, for example, one or more component domains.
  • linkers can be used to provide desirable sites of interest between components to facilitate manipulation.
  • Linkers may also be provided to enhance expression of the fusion protein from a transformant and to reduce steric hindrance so that the component can assume its optimal tertiary structure and/or interact appropriately with the target molecule.
  • the linker sequence may include one or more amino acids naturally linked to the receptor component, or may be configured to provide an optimal tertiary structure for the component domain to specifically provide a desired site of interest to enhance expression of the fusion protein. It may be an added sequence used to enable the component to form and/or enhance the interaction of the component with its target molecule.
  • the linker can increase the flexibility of the fusion protein without interfering with the structure of each component within the fusion protein.
  • the linker moiety is a peptide linker having a length of 2 to 100 amino acids.
  • Exemplary linkers include linear peptides with at least two amino acid residues, such as Gly-Gly, Gly-Ala-Gly, Gly-Pro-Ala, Gly (G)n, and Gly-Ser (GS) linkers.
  • the GS linkers described herein include (GS)n, (GSGSG)n (SEQ ID NO: 81), (G2S)n, G2S2G (SEQ ID NO: 82), (G2SG)n (SEQ ID NO: 83), (G3S)n (SEQ ID NO: Number 84), (G4S)n (SEQ ID NO: 12), (GGSGG)nGn (SEQ ID NO: 85), GSG4SG4SG (SEQ ID NO: 86), and (GGGGS)n (SEQ ID NO: 12), where n is 1 or more.
  • a (G)n linker includes the G9 linker, and an example of a (GGGGS)n (SEQ ID NO: 12) linker includes the GGGGS (SEQ ID NO: 12) or (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 13) linker.
  • Suitable linear peptides include polyglycine, polyserine, polyproline, polyalanine and oligopeptides composed of alanyl and/or serinyl and/or prolinyl and/or glycyl amino acid residues.
  • Linker moieties can be used to link components of the fusion proteins disclosed herein.
  • the linker may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13.
  • the fusion proteins described herein may or may not include a signal peptide that functions to secrete the fusion protein from the host cell.
  • a nucleic acid sequence encoding a signal peptide can be operably linked to a nucleic acid sequence encoding a protein of interest.
  • the fusion protein includes a signal peptide. In some embodiments, the fusion protein does not include a signal peptide.
  • the fusion proteins described herein may include modified forms of protein binding peptides.
  • the fusion protein component may have post-translational modifications, including, for example, glycosylation, sialylation, acetylation, and phosphorylation on any of the protein binding peptides.
  • the fusion proteins of the invention are administered as polypeptides (or nucleic acids encoding polypeptides) that are not per se part of a live, killed, or recombinant bacterial or viral vectored vaccine. Additionally, unless otherwise specified, the fusion proteins of the invention are isolated fusion proteins, for example, not incorporated into the flagellum.
  • fusion refers to the integration of two molecules with different or the same function or structure, and may be fusion by any physical, chemical, or biological method in which peptides can bind.
  • the fusion protein or the polypeptide constituting the fusion protein may be prepared by a chemical peptide synthesis method known in the art, or the gene encoding the fusion protein may be amplified by PCR (polymerase chain reaction) or synthesized by a known method. It can be manufactured by cloning into an expression vector and expressing it.
  • the fusion protein may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, or SEQ ID NO: 63. there is.
  • the composition according to the present invention has a weight reduction effect, an effect of suppressing neutral fat accumulation in liver tissue, and an improvement in oral glucose tolerance in animal models of metabolic syndrome and non-alcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet administration. It was confirmed to have an effect of improving non-alcoholic fatty liver disease and steatohepatitis index (NAS score), suppressing differentiation of adipocytes, and suppressing liver fibrosis.
  • NAS score non-alcoholic fatty liver disease and steatohepatitis index
  • the liver disease may be selected from the group consisting of non-alcoholic fatty liver disease, non-alcoholic steatohepatitis, alcoholic fatty liver disease, hepatitis, liver fibrosis, liver cirrhosis, liver failure, and liver cancer, and is preferably selected from the group consisting of non-alcoholic fatty liver disease and non-alcoholic fatty liver disease. It may be liver fibrosis, liver cirrhosis, or liver failure caused by hepatitis or non-alcoholic fatty liver disease.
  • the metabolic syndrome may also be expressed as metabolic disease, metabolic disease, etc., and may be selected from the group consisting of diabetes, obesity, insulin resistance, fatty liver, hyperlipidemia, and high blood pressure.
  • the metabolic syndrome may be selected from the group consisting of diabetes, obesity, insulin resistance, and fatty liver.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated in various ways depending on the route of administration by methods known in the art along with a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the fusion protein.
  • “Pharmaceutically acceptable” refers to a non-toxic substance that is physiologically acceptable and does not inhibit the action of the active ingredient when administered to humans and does not usually cause gastrointestinal upset, allergic reactions such as dizziness, or similar reactions.
  • the carrier includes all types of solvents, dispersion media, oil-in-water or water-in-oil emulsions, aqueous compositions, liposomes, microbeads and microsomes.
  • the route of administration may be oral or parenteral.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intranasal, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual or rectal. It could be my dosage.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is administered orally, the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated into powder, granules, tablets, pills, sugar-coated tablets, capsules, liquid, or gel according to methods known in the art along with a suitable carrier for oral administration. , can be formulated in the form of syrup, suspension, wafer, etc.
  • suitable carriers include sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol, starches including corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, cellulose, Fillers such as cellulose, including methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose, and hydroxypropylmethylcellulose, gelatin, polyvinylpyrrolidone, etc. may be included. Additionally, in some cases, cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid, or sodium alginate may be added as a disintegrant. Furthermore, the pharmaceutical composition may further include anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, and preservatives.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated with a suitable parenteral carrier in the form of injections, transdermal administration, and nasal inhalation according to methods known in the art.
  • a suitable parenteral carrier in the form of injections, transdermal administration, and nasal inhalation according to methods known in the art.
  • suitable carriers include, but are not limited to, solvents or dispersion media including water, ethanol, polyols (e.g., glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, etc.), mixtures thereof, and/or vegetable oils. You can.
  • suitable carriers include Hanks' solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanol amine, or isotonic solutions such as sterile water for injection, 10% ethanol, 40% propylene glycol, and 5% dextrose. etc. can be used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • isotonic solutions such as sterile water for injection, 10% ethanol, 40% propylene glycol, and 5% dextrose. etc. can be used.
  • it may additionally contain various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, etc.
  • the injection may additionally contain an isotonic agent such as sugar or sodium chloride.
  • transdermal administration means administering a pharmaceutical composition topically to the skin so that an effective amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition is delivered into the skin.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in an injectable formulation and administered by lightly pricking the skin with a 30-gauge thin injection needle or applying it directly to the skin.
  • the compounds used according to the invention may be packaged in pressurized packs or using a suitable propellant, for example dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas. It can be conveniently delivered in the form of an aerosol spray from a nebulizer.
  • the dosage unit can be determined by providing a valve that delivers a metered amount.
  • gelatin capsules and cartridges for use in inhalers or insufflators can be formulated to contain a powder mixture of the compound and a suitable powder base such as lactose or starch.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain one or more buffers (e.g. saline or PBS), carbohydrates (e.g. glucose, mannose, sucrose or dextran), antioxidants, bacteriostatic agents, chelating agents. (e.g. EDTA or glutathione), adjuvants (e.g. aluminum hydroxide), suspending agents, thickening agents and/or preservatives.
  • buffers e.g. saline or PBS
  • carbohydrates e.g. glucose, mannose, sucrose or dextran
  • antioxidants e.g. glucose, mannose, sucrose or dextran
  • bacteriostatic agents e.g. EDTA or glutathione
  • adjuvants e.g. aluminum hydroxide
  • suspending agents e.g. aluminum hydroxide
  • compositions of the present invention can be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • composition of the present invention can be administered in combination with known substances that are effective in preventing or treating metabolic syndrome or liver disease.
  • the present invention also relates to flagellin, fragments thereof or variants thereof; and a fusion protein containing a variant of human IgG4 Fc as an active ingredient, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • a food composition for preventing or improving liver disease or metabolic syndrome. provides.
  • the food composition of the present invention includes all foods in the conventional sense, and includes all forms of functional foods, nutritional supplements, health foods, and food additives. Includes. Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • the food composition of the present invention may include health functional foods.
  • health functional food used in the present invention refers to food manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, and pills using raw materials or ingredients with functional properties useful to the human body.
  • functionality means controlling nutrients for the structure and function of the human body or obtaining useful effects for health purposes, such as physiological effects.
  • the health functional food of the present invention can be manufactured by a method commonly used in the art, and can be manufactured by adding raw materials and components commonly added in the art.
  • the formulation of the health functional food can also be manufactured without limitation as long as it is a formulation recognized as a health functional food.
  • the food composition of the present invention can be manufactured in various types of formulations, and unlike general drugs, it is made from food as a raw material and has the advantage of not having side effects that may occur when taking the drug for a long period of time, and is excellent in portability, so the present invention Health functional foods can be consumed as supplements to improve liver disease or metabolic syndrome or enhance treatment effects.
  • health functional foods can be consumed in the form of tea, juice, and drinks, or can be granulated, encapsulated, and powdered. Additionally, it can be prepared in the form of a composition by mixing it with known substances or active ingredients known to have effects in preventing, improving, or treating liver disease or metabolic syndrome.
  • the food composition of the present invention contains various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, and alcohol.
  • These ingredients can be used independently or in combination.
  • the ratio of these additives is not very important, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.3 parts by weight per 100 parts by weight of the food composition of the present invention, but is not limited thereto.
  • the food composition of the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients, like conventional beverages.
  • the carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • a sweetener natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the ratio of the natural carbohydrate may generally be about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g, per 100 mL of the composition of the present invention, but is not limited thereto.
  • the present invention provides flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof for preparing a pharmaceutical composition for treating liver disease or metabolic syndrome; and a use of a fusion protein comprising a variant of human IgG4 Fc, wherein the human IgG4 Fc variant has a mutation that prevents Fab arm exchange.
  • the present invention provides flagellin, a fragment thereof, or a variant thereof;
  • a method for treating liver disease or metabolic syndrome comprising administering to an individual in need an effective amount of a composition containing a fusion protein containing a variant of human IgG4 Fc as an active ingredient, wherein the human IgG4 Fc variant is a Fab arm ( arm)
  • a method of treating liver disease or metabolic syndrome which has a mutation that prevents exchange.
  • the 'effective amount' of the present invention refers to an amount that has the effect of improving, treating, detecting, diagnosing, or suppressing or reducing liver disease or metabolic syndrome or the above diseases when administered to an individual, and the 'individual' is an animal. , Preferably, it may be an animal, including mammals, especially humans, and may also be cells, tissues, organs, etc. derived from animals. The subject may be a patient in need of the effect.
  • the 'treatment' of the present invention comprehensively refers to liver disease or metabolic syndrome or improving symptoms caused by the disease, which may include curing, substantially preventing, or improving the condition of the disease, , including, but not limited to, alleviating, curing, or preventing one or most of the symptoms resulting from the disease.
  • the term “comprising” is used in the same sense as “including” or “characterized by,” and specifically refers to the composition or method according to the present invention. It does not exclude additional components or method steps that have not been used. Additionally, the term “consisting of” means excluding additional elements, steps, or ingredients that are not separately stated.
  • the term “essentially consisting of” means that, in the scope of a composition or method, it may include substances or steps that do not substantially affect its basic characteristics in addition to the described substances or steps.
  • composition according to the present invention exhibits significantly improved preventive and therapeutic effects compared to wild-type flagellin in animal models of metabolic syndrome and non-alcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet administration, and is therefore very useful in the development of therapeutic agents for metabolic syndrome or liver disease. It can be utilized.
  • Figure 1 shows the results of evaluating the TLR5 activation ability of fusion proteins No. 1 and No. 4 prepared in an example of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of evaluating the TLR5 activation ability of fusion proteins No. 1 and No. 2 prepared in an example of the present invention.
  • Figure 3 shows the results of evaluating the TLR5 activation ability of fusion proteins Nos. 4 to 7 prepared in Examples of the present invention.
  • Figure 4 shows the results of evaluating the TLR5 activation ability of fusion proteins No. 6, No. 8 to No. 11 prepared in an example of the present invention.
  • Figure 5 shows the results of evaluating the TLR5 activation ability of fusion protein No. 6 prepared in an example of the present invention.
  • Figure 6 shows the protein-protein interaction with zTLR5 of fusion protein No. 6 prepared in an example of the present invention using biolayer interferometry for fusion protein-TLR5 binding, and the formation of a complex between the fusion protein and TLR5 using gel-filtration chromatography. This is the result of analysis.
  • Figure 7 shows the results of evaluating the TLR5 activation ability of fusion protein No. 6 prepared in an example of the present invention at each concentration and calculating its EC50 value.
  • Figure 8 shows the results of evaluating the TLR5 activation ability of fusion proteins No. 6 and No. 12 prepared in an example of the present invention by concentration.
  • Figures 9a and b show the degree of drug absorption over time after intranasal administration of the fusion protein of SEQ ID NO: 63 prepared in an example of the present invention and the wild-type Bacillus subtilis flagellin (BsFlagellin), analyzed by fluorescence imaging. This is the result ( Figure 9a: fusion protein of SEQ ID NO: 63, Figure 9b: flagellin of wild-type Bacillus subtilis).
  • Figure 10 shows a schematic diagram of NASH induction and test drug treatment model by AMLN diet.
  • Figure 11 shows the results showing liver weight, liver weight, and intrahepatic accumulation of triglyceride (TG) during test drug treatment in the AMLN model.
  • Figure 12 is a result showing the effect of improving body fat mass by the experimental drug in the AMLN model.
  • Figure 13 shows the results showing the effect of improving oral glucose tolerance by the experimental drug in the AMLN model.
  • Figure 14 shows the results showing the improvement effect in fatty liver disease index (NAS score), adipocyte size, and histological analysis by experimental drugs in the AMLN model.
  • NAS score fatty liver disease index
  • Figure 15 shows a schematic diagram of NASH induction and test drug treatment model by MCD diet.
  • Figure 16 shows the results of body weight and dietary intake after treatment with test drugs in the MCD model.
  • Figure 18 is a result showing the effect of improving metabolic factor levels in the blood after treatment with the experimental drug in the MCD model.
  • Figure 19 is a result showing the effect of improving the NAS score after treatment with the experimental drug in the MCD model.
  • Figure 20 shows results showing the effect of improving liver fibrosis levels after treatment with the experimental drug in the MCD model.
  • a human IgG4 Fc variant-flagellin fusion protein in which Fab arm exchange was prevented was produced, and various types of fusion proteins were produced to compare its effect with other types of Fc-flagellin fusion proteins.
  • the flagellin used to produce the fusion protein is Bacillus subtilis flagellin (BsFlagellin).
  • composition of the human IgG4 Fc variant-flagellin fusion protein encoded by each of the plasmids Nos. 1 to 12 is shown in Table 1 below:
  • the hinge region of human IgG4 Fc consists of a total of 12 amino acids (ESKYGPPCPSCP) (SEQ ID NO: 64).
  • the human IgG4 Fc contained in the fusion proteins Nos. 1 to 3 is a sequence contained in a commercial plasmid and contains the human IgG4 Fc hinge. It is a human IgG4 Fc containing a hinge in a form in which some of the constituting amino acids have been deleted (PPCPSCP) (SEQ ID NO: 65), and numbers 5 to 12 are the full-length wild-type hinge sequence containing all 12 amino acids or one or more amino acids. Contains full length hinge sequence including mutations.
  • the primers used to prepare the DNA of 1 to 12 are shown in Table 2 below:
  • MSP303 Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3' (SEQ ID NO: 14) Reverse 5'- GAC CAT GGC AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3' (SEQ ID NO: 15) 2.
  • pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304) Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC -3' (SEQ ID NO: 16) Reverse 5'- GAC CAT GGC AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3' (SEQ ID NO: 17) 3.
  • pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305) Forward 5'- TAT ATC CAT GGT TAG ATC TGA ATC CAA ATA CGG TCC CCC ATG CCC ATC -3' (SEQ ID NO: 20) Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3' (SEQ ID NO: 21) 5.
  • pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306) Forward 5' - TAT ATC CAT GGT TAG ATC TGA ATC CAA ATA CGG TCC CCC ATG CCC ACC TTG CCC AGC ACC TGA - 3' (SEQ ID NO: 24) Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3' (SEQ ID NO: 25) 7.
  • CPSC SEQ ID NO: 80
  • CPPC SEQ ID NO: 79
  • HEK-Blue cells were cultured in a 75T-Flask using media containing DMEM (4.5 g/L glucose, 2mM L-glutamine), 10% FBS, 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, and 100ug/ml Normocin. .
  • TLR5avitag is diluted to a concentration of 5 ⁇ g/ml, and the ligand proteins (CPPC, entolimod, flagellin) are diluted to a concentration of 81, 27, 9, and 3 nM.
  • sample is injected into the sample loop using a syringe.
  • AMLN Amylin Liver NASH
  • AMLN Amylin Liver NASH
  • D09100310 RESEARCH DIETS Inc., New Brunswick, U.S.A.
  • Body weight and body fat mass were measured for animals fed the AMLN diet for 18 weeks, and groups were separated so that the averages between each group were similar for both measurements.
  • Amylin Liver NASH diet (AMLN diet, D09100310)
  • AMLN diet was provided to all animals except the normal animal group.
  • Drug administration was conducted the next day after group separation.
  • the control substance (Obeticholic acid, OCA) was administered orally once a day for 12 weeks.
  • the test substance was administered twice a week for 12 weeks for the intranasal group, and intravenously. Administration was conducted once a week for 12 weeks.
  • control material was administered orally once a day for 12 weeks, and the test material was administered intranasally twice a week or intravenously once a week for 12 weeks.
  • Oral administration of the control substance was forcefully administered into the stomach using a disposable syringe attached to a sonde for oral administration, and intravenous administration of the test substance was administered intravenously through the tail vein of mice using a 0.3 mL insulin syringe, and intranasally. It was administered intranasally using a micro pipette under inhalation anesthesia.
  • the group composition was divided into a total of 6 groups as shown in Table 4 below.
  • the date of observation, measurement, and testing was set as the start date of administration as Day 1, and the 7 days from the start of administration were calculated as 1 week of administration.
  • body weight was measured using an electronic scale the day before administration of the test substance, and once a week after the start of administration, the amount of test substance administered was determined based on this.
  • the test substance administration was finally completed, the subjects fasted for 16 hours, their body weight was measured, and an autopsy was performed.
  • Feed intake was measured for each breeding box once a week after group separation, and the feed intake was calculated by measuring the amount of feed fed the day before the weight measurement and measuring the remaining amount on the day of the weight measurement.
  • Body fat mass was measured for group separation, and body fat mass was additionally measured 12 weeks after test substance administration. Measurement After anesthetizing the animals with isoflurane, fat mass was measured using dual energy X-ray absorptiometry (InAlyzer, Medikors).
  • Oral glucose tolerance test was measured 85 days after vaginal administration. All animals were fasted for 16 hours from the day before the oral glucose tolerance test, blood sugar was measured, and 2 g/kg of glucose (D-(+)-Glucose, sigma, U.S.A.) was forcibly orally administered at a volume of 10 mL/kg. , blood sugar levels were measured at 15, 30, 60, and 120 minutes.
  • glucose D-(+)-Glucose, sigma, U.S.A.
  • Blood sugar was measured using Accu-CHEK®, a blood glucose meter, by making a fine incision at the tail end of the animal with a scissor and measuring the whole blood flowing out naturally. Changes over time were recorded using blood sugar measurements for each time period, and the area under the curve (AUC) of the graph was calculated using SigmaPlot (version 10.0 Systat Software Inc., U.S.A.) to compare glucose tolerance between each group. After all blood sugar measurements were completed, test substances were administered to each group.
  • each group was fasted for 16 hours with drinking water provided, and the autopsy was performed according to the order of the subjects.
  • liver tissue and epididymal fat tissue were extracted, and photographs were taken for each extracted liver tissue.
  • the liver tissue and epididymal fat tissue were washed with saline solution, moisture was removed with filter paper, and absolute weight was measured using an electronic scale.
  • the relative weight of each relative to the fasted body weight before autopsy was calculated as follows.
  • liver tissue Part of the liver tissue that was extracted and weighed was divided into 2 sets, and 1 set was rapidly frozen in liquid nitrogen for TG analysis in the liver tissue, and then deep frozen below -70°C (Model 706, Thermo Fisher Scientific Inc., U.S.A.), and the remaining 1 set was fixed in 10% neutral buffered formalin and the remaining liver tissue was stored in a deep freezer below -70°C for histological examination.
  • liver tissue extracted during autopsy was weighed and washed with normal saline solution. 1 mL of 1% Triton The liver homogenate was centrifuged at 10,000 My TG content was measured.
  • liver inflammation blood markers AST, ALT, ALP, GGT
  • blood lipid profile T- chol, TG, H-C, LDL-c
  • liver and epididymal adipose tissue was fixed in 10% neutral buffered formalin, and the fixed tissue went through general tissue processing procedures such as trimming, dehydration, and paraffin embedding to prepare a paraffin block and section.
  • Hematoxylin & Eosin (H&E) staining was performed on thinly cut liver tissue sections to evaluate NAFLD activity score (NAS).
  • NAS NAFLD activity score
  • Hematoxylin & Eosin staining was performed on thinly cut epididymal fat sections to analyze adipocyte size in epididymal fat tissue.
  • MCD Methionine-Choline Deficient
  • the body weight of animals fed the MCD diet for 4 weeks was measured, and group separation was performed to ensure that the average weight measurements between groups were similar.
  • MCD diet was provided to all animals except the normal animal group.
  • Drug administration was conducted the next day after group separation, control substances were administered orally once a day for 8 weeks, and test substances were administered twice a week for 8 weeks in the intranasal administration group.
  • the intravenous administration group was administered once a week for 2 weeks after the start of administration, and administered intravenously twice a week from 3 weeks after administration.
  • control material was administered orally once a day for 12 weeks, and the test material was administered intranasally twice a week and intravenously once a week for 12 weeks.
  • Oral administration of the control substance was forcefully administered into the stomach using a disposable syringe attached to a sonde for oral administration, and intravenous administration of the test substance was administered intravenously through the tail vein of mice using a 0.3 mL insulin syringe, and intranasally. It was administered intranasally using a micro pipette under inhalation anesthesia.
  • the group composition was divided into a total of 6 groups as shown in Table 6 below.
  • the date of observation, measurement, and testing was set as the start date of administration as Day 1, and the 7 days from the start of administration were calculated as 1 week of administration.
  • body weight was measured using an electronic scale the day before administration of the test substance, and once a week after the start of administration, the amount of test substance administered was determined based on this.
  • the test substance administration was finally completed, the subjects fasted for 16 hours, their body weight was measured, and an autopsy was performed.
  • Feed intake was measured for each breeding box once a week after group separation, and the feed intake was calculated by measuring the amount of feed fed the day before the weight measurement and measuring the remaining amount on the day of the weight measurement.
  • each group was fasted for 16 hours with drinking water provided, and the autopsy was performed according to the order of the subjects.
  • liver tissue and epididymal fat tissue were extracted, and photographs were taken for each extracted liver tissue.
  • the liver tissue and epididymal fat tissue were washed with saline solution, moisture was removed with filter paper, and absolute weight was measured using an electronic scale.
  • the relative weight of each relative to the fasted body weight before autopsy was calculated as follows.
  • liver tissue Part of the liver tissue that was extracted and weighed was divided into 2 sets, and 1 set was rapidly frozen in liquid nitrogen for analysis of hydroxyproline in the liver tissue, and then deep frozen below -70°C (Model 706, Thermo Fisher Scientific Inc., U.S.A.), and the remaining 1 set was fixed in 10% neutral buffered formalin and the remaining liver tissue was stored in a deep freezer below -70°C for histological examination.
  • Liver tissue was homogenized in 100 uL dH 2 O per 10 mg. 100 ⁇ L of HCl ( ⁇ 12N) was added to the liver homogenate, tightly closed with a Teflon cap, and hydrolyzed at 120°C for 3 hours. After vortexing the hydrolyzed sample and centrifuging at 10,000 The hydroxyproline concentration was measured at 560 nm using a microplate reader (SpectraMax M2, Molecular Devices, USA).
  • liver inflammation blood markers AST, ALT, ALP, GGT
  • blood lipid profile T- chol, TG, H-C, LDL-c
  • liver tissue was fixed in 10% neutral buffered formalin, and the fixed tissue was made into a paraffin block and sectioned through general tissue processing procedures such as trimming, dehydration, and paraffin embedding.
  • Hematoxylin & Eosin (H&E) staining was performed on thin tissue sections to evaluate NAFLD activity score (NAS), and Sirius-red staining was performed to evaluate fibrosis score and area.
  • NAS NAFLD activity score
  • Sirius-red staining was performed to evaluate fibrosis score and area.
  • the fibrosis score evaluation on the Sirius-red stained slide was performed with reference to Table 6 below.
  • Sirius-red stained slides were photographed at 200x magnification using Cellsens software, and the area of the stained area was measured using Image J software. Afterwards, the stained area was divided by the total area of the region of interest (ROI), and the average between groups was compared based on this ratio. In cases where false positives such as background staining or artifacts could be observed, the threshold was adjusted and measured.
  • ROI region of interest
  • both the fusion protein (No. 1) with one linker (GGGGS) (SEQ ID NO. 12) connecting Bsflagellin and hIgG4 Fc and the fusion protein (No. 2) with three linkers (No. 2) showed TLR5 activation ability. The degree was high in fusion proteins with three linkers.
  • both the fusion protein (No. 1) with one linker (GGGGS) (SEQ ID NO. 12) connecting Bsflagellin and hIgG4 Fc and the fusion protein without linker (No. 3) showed TLR5 activation ability; The degree was confirmed to be similar.
  • fusion protein No. 6 was confirmed to have excellent binding affinity at the pM level.
  • step 6 Take out the plate from step 2), remove the existing culture medium, and add 1ml of new culture medium to each well.
  • step 7) Add the mixture from step 5) to each well, seal the plate, and leave in a low T incubator for 4 hours.
  • Hi5 cells are collected in a tube and centrifuged for 10 minutes at 4°C and 8000rpm.
  • step 3 add 5ml of Roche Ni resin to the column and then flow 10ml of [20mM HEPES (pH 7.0) + 200mM NaCl + 30mM Imidazole] solution.
  • step 5 When centrifugation in step 3) is completed, the supernatant is recovered and transferred to the resin prepared in step 4).
  • BsFlagellin the object of comparison for the SEQ ID NO: 63 fusion protein, was purchased from Invivogen and used.
  • Labeling of substances for in vivo tracking was carried out according to the following steps.
  • Fluorescence detection images were obtained up to the neck of the mouse using the IVISTM imaging system (Perkin Elmer) 3, 6, and 24 hours after nasal injection of the anesthetized mouse.
  • the relative weight of the liver tissue extracted at autopsy showed that the relative weight of the liver was significantly decreased in the high-dose MSP306 administration group, and as a result of measuring the TG Triglyceride (TG) level in the liver tissue, the liver was dose-dependently decreased in the experimental substance MSP306 administration group. TG levels in tissues decreased.
  • the body fat mass measured 12 weeks after administration of the test substance showed a tendency for the value to decrease in the MSP306 administration group, and in the G6 AMLN diet MSP306 high dose IV high dose intravenous administration group, the G2 AMLN diet Fat mass levels decreased to a significant level compared to the vehicle control group.
  • test substance administration group was G2 AMLN diet vehicle control.
  • blood sugar levels decreased significantly, and in particular, in the G6 AMLN diet MSP306 IV high-dose intravenous administration group, blood sugar levels continued to decrease significantly until 120 minutes after administration.
  • the liver tissue extracted at the time of autopsy was fixed and H&E stained to evaluate the NAFLD Activity Score (NAS) of the liver tissue.
  • NAS NAFLD Activity Score
  • the experimental substances G5 AMLN diet high dose IN high dose nasal administration group and G6 AMLN diet high were evaluated.
  • NAS results were significantly reduced compared to the G2 AMLN diet vehicle control group, and adipocyte size in epididymal fat tissue was significantly reduced.
  • body weight was observed once a week after administration of the test substance, and all subjects fed the MCD diet lost weight compared to the G1 Normal diet control group, and continued to lose weight until the end of the test.
  • Feed intake was measured on the first day of administration of the test substance and every week thereafter.
  • the feed intake of the G6 MCD diet MSP306 IV high-dose IV administration group on the first day of administration decreased significantly compared to the G2 MCD diet vehicle control group, but was significant thereafter. No reduction in food intake was observed.
  • the G4 MCD diet MSP306 low dose IN low-dose nasal administration group and the G5 MCD diet MSP306 high dose IN high-dose nasal administration group were NAFLD activity score decreased to a significant level.
  • the expression of anti-inflammatory and tissue regeneration-related factors increased in the MCD MSP306 administration group compared to the MCD vehicle group.
  • composition according to the present invention exhibits significantly improved preventive and therapeutic effects compared to wild-type flagellin in animal models of metabolic syndrome and non-alcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet administration, and is therefore very useful in the development of therapeutic agents for metabolic syndrome or liver disease. It can be utilized.

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Abstract

본 발명은 플라젤린 및 면역글로불린 Fc 융합 단백질을 포함하는 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 플라젤린 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

플라젤린 및 면역글로불린 FC 융합 단백질을 포함하는 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물
본 출원은 2022년 04월 19일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2022-0047976호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 플라젤린 및 면역글로불린 Fc 융합 단백질을 포함하는 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 플라젤린 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 간 질환 또는 대사증후군 치료용 조성물에 관한 것이다.
대사증후군(Metabolic syndrome)은 생체 내에서의 물질대사 장애에 의해 발생하는 질환을 총칭한다. 일반적으로 당질, 지질, 단백질, 비타민, 전해질 및 수분 등의 불균형에 의해 발생하게 되는데, 그 예로는 대사증후군, 당뇨병, 고지혈증, 지방간, 동맥경화증, 고혈압 등이 있다. 이 중에서도 제2형 당뇨병의 경우에는 성인기에 주로 나타나는 당뇨병으로서 인슐린에 대한 저항성의 증가를 특징으로 한다. 인슐린 수용체 자체의 감소, 혹은 그 민감도가 떨어지거나 세포 내 글리코겐 합성을 일으키는 2차 전달자에 문제가 생기면 인슐린에 대한 민감도가 떨어지게 된다. 따라서, 제2형 당뇨병을 인슐린 비의존성 당뇨병이라 하며 당뇨의 85～90%를 차지한다.
현재 지방간염이 대사증후군, 인슐린저항성, 2형 당뇨병 등과 밀접한 관계가 있다는 것은 밝혀졌으나, 명확한 발병기전은 현재 활발한 연구가 진행 중에 있으며, 최근 'two-hit' hypothesis가 제안되면서 지방간염은 간세포 안에 지방이 쌓이면서 시작되며 대사증후군, 당뇨병 등과 연관되어 나타나는 인슐린저항성이 주된 발병기전으로 여겨지고 있다. 또한 증가된 간세포 내 유리지방산(free fatty acid,FFA)이나 콜레스테롤에 의한 lipotoxicity와 증가된 염증성 사이토카인(cytokine) 및 이들 수용체가 지방간에서 지방간염으로 진행하는 과정에서 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다.
현재, 높은 에너지 부하를 갖는 식품 섭취의 꾸준한 증가 및 적은 운동과 연관된 사회적 변화들은 대사증후군 및 대사증후군으로 야기된 대사증후군의 발생을 증가시키고 있다. 저칼로리 다이어트와 운동에 기초한 전통적인 치료는 대사증후군 제어에 있어서 그다지 효과를 나타내지 못하고, 일시적인 체중 손실을 초래할 뿐이다. 체중 감소를 유도하는 안전하고 효과적인 약물의 개발이 수십 년 동안 진행되어 왔다. 그러나 현재까지, 효능을 보인 약물들은 심각한 부작용을 초래하거나 임상 실험에서 그다지 효능이 우수하지 못하였다. 따라서 대사증후군 및 대사증후군으로 야기된 대사증후군을 개선하고 이러한 병리상태를 예방할 수 있는 새로운 접근 방법이 요구되고 있다.
한편, 플라젤린은 박테리아 편모의 채찍 줄기 모양의 필라멘트로 조립되는 구조 단백질로, 세포 표면에서 연장되어 박테리아가 움직일 수 있도록 기능한다. 플라젤린은 병원성 세균의 병원성 박테리아가 독성 인자로 작용하여 숙주 세포 내로 침투하고 침입하는 것을 촉진한다. 플라젤린은 박테리아에서 독점적으로 발견되며 편모성 박테리아(flagellated bacteria)에서 가장 풍부한 단백질 중 하나이기 때문에 플라젤린은 숙주 면역 감시의 주요 대상이 된다. 박테리아의 침입시, 플라젤린은 숙주에서 Toll-like receptor 5 (TLR5)와 NAIP5/NLRC4에 의해 검출되고 숙주에서 병원균의 즉각적인 제거에 기여하는 선천성 면역을 활성화시킨다.
플라젤린은 편모성-병원성 박테리아에 대한 첫 번째 방어선 역할을 하기 때문에 백신 담체 단백질 또는 백신 보조제 개발의 대상으로서 관심이 되어왔다.
하지만, 플라젤린과 면역글로불린 Fc 융합단백질의 간 질환 및 대사증후군 치료 효과, 보다 구체적으로는 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 간 질환 및 대사증후군 치료효과에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자는 플라젤린의 기능이 향상된 단백질을 개발하기 위해 연구를 거듭한 결과, 플라젤린과 면역글로불린 Fc가 융합된 새로운 형태의 융합단백질이 야생형(wild-type) 플라젤린, 공지된 플라젤린 단편 등과 비교하여 현저히 우수한 TLR5 활성화능을 나타낸다는 것을 발견하였다.
특히, 면역글로불린 Fc가 유발하는 항체 의존성 세포-매개 세포독성(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 또는 보체 의존성 세포 독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 회피하기 위해 사람 IgG4의 Fc를 이용하여 플라젤린 융합단백질을 제작할 경우, Fab 암(arm) 교환에 따라 1/2 형태의 항체 분자가 형성되어 플라젤린의 TLR5 활성화능이 현격히 저하되는 것을 확인하였고 인간 IgG4 Fc의 mutant를 이용하여 이와 같은 문제를 해결함과 동시에 야생형 플라젤린 대비 현저히 향상된 간 질환 및 대사증후군 치료 효과를 나타내는 융합 단백질을 제공할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로 이루어지며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로 필수적으로 이루어지며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로 이루어지며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로 필수적으로 이루어지며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 간 질환 또는 대사증후군 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질의 용도로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 융합 단백질의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 간 질환 또는 대사증후군 치료 방법으로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 간질환 또는 대사증후군 치료 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로 이루어지며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 대장염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 목적을 달성하기 전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로 이루어지며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로 필수적으로 이루어지며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로 이루어지며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질로 필수적으로 이루어지며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 간 질환 또는 대사증후군 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질의 용도로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 융합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 간 질환 또는 대사증후군 치료 방법으로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 간질환 또는 대사증후군 치료 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 플라젤린은 편모성 세균이 감염된 경우에 감염된 숙주 내에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 보다 구체적으로 인체의 세포막 표면에 존재하는 톨-유사수용체 5(TLR5; Toll like receptor 5)는 상기 플라젤린과 상호작용을 통하여 세포 내 신호 전달을 유발하고, 이를 통하여 전사인자인 NF-kB의 발현이 증가되어 선천성 면역신호 활성화를 유도할 뿐만 아니라, 획득 면역 반응을 조절할 수 있다.
플라젤린 단백질은 당업계에 잘 공지되어 있다. 대부분의 그람-음성 박테리아는 편모를 발현하는데, 이는 운동성을 제공하는 표면 구조이다. 편모는 기초 몸체, 필라멘트 및 이 둘을 연결하는 갈고리로 구성된다. 필라멘트는 단일 단백질인 플라젤린의 긴 중합체로 이루어지며 끝에 작은 캡 단백질이 형성되어 있다.
플라젤린의 중합은 N-및 C-말단에서 보존된 영역에 의해 매개되는 반면, 플라젤린 단백질의 중간에 위치한 초가변영역(hypervariable region)은 종간의 서열 및 길이가 매우 다양하다.
본 발명에서 상기 플라젤린은 임의의 적합한 박테리아로부터 유래된 플라젤린일 수 있다. 당업계에서는 다수의 플라젤린 유전자가 클로닝되고 서열화되어 있어 이들이 참고될 수도 있다. 본 발명에서 상기 플라젤린의 비제한적인 공급원으로는 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 세라티아(Serratia) 속, 시겔라(Shigella) 속, 트레포네마(Treponema) 속, 레기오넬라(Legionella) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 바르토넬라(Bartonella) 속, 프로튜스(Proteus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 여시니아(Yersinia) 속, 캄필로박터(Campylobacter) 속, 로세부리아(Roseburia) 속 또는 마리노박터(Marinobacter) 속 미생물을 들 수 있으며, 바람직하게는 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속 또는 비브리오(Vibrio) 속 미생물을 들 수 있다.
더 바람직하게는, 본 발명에서 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 세라티아 마세센스(Serratia marcesens), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 보렐리아 버그도페레이(Borrelia burgdorferei), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바르토넬라 클라리제이애(Bartonella clarridgeiae), 프로튜스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에스테리키아 콜라이(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 여시니아 페스티스(Yersinia pestis), 캄필로박터(Campylobacter spp), 로세부리아(Roseburia spp) 또는 마리노박터(Marinobacter spp) 유래의 플라젤린일 수 있으며,
보다 더 바람직하게는, 본 발명에서 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans) 유래의 플라젤린일 수 있으며,
가장 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 플라젤린일 수 있다.
플라젤린의 N-말단 및 C-말단 불변 영역은 당해 기술 분야에서 그 특징이 잘 공지되어 있다. 당업자에 의해 잘 이해되는 바와 같이, 불변 영역의 크기는 플라젤린 단백질의 공급원에 따라 다소 변할 수 있다. 일반적으로, N-말단 불변 도메인은 단백질의 약 170 개 또는 180 개의 N-말단 아미노산을 포함하는 반면, C-말단 불변 도메인은 전형적으로 약 85 내지 100 개의 C-말단 아미노산을 포함한다. 중심의 초가변영역은 박테리아 사이의 크기와 순서에 따라 상당히 다양하며, 분자 질량의 차이 대부분이 상기 초가변영역에 의해서 설명될 수 있다. 다양한 박테리아로부터 유래된 플라젤린 단백질의 N- 및 C-말단 불변 영역은 공지되어 있고, 아직 공지되지 않은 박테리아 유래의 플라젤린 또한 통상의 기술자가 당업계에 공지된 테크닉을 이용하여 플라젤린 단량체의 결정 구조를 쉽게 규명할 수 있다.
본 발명에서 "플라젤린", "플라젤린 N-말단 불변 영역" 및 "플라젤린 C- 말단 불변 영역"이란 용어는 상기 예를 든 박테리아 중 임의의 것으로부터 유래한 플라젤린 활성 단편 및 변이체를 포함한다. 또한, 야생형(wild-type)의 플라젤린 또는 플라젤린의 일 부분은 안전성 및/또는 면역 반응을 증가시키기 위해 및/또는 클로닝 절차 또는 다른 실험실 조작의 결과로서 변형될 수 있으며 이러한 변형들(또는 변이체) 또한 본원발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서, 상기 플라젤린은 전장(full-length) 플레젤린을 포함하거나, 또는 이의 활성 단편(active fragment)을 포함할 수 있다. 또한, "플라젤린", "플라젤린 N-말단 불변 영역" 및 "플라젤린 C- 말단 불변 영역"등의 용어는 자연 발생 아미노산 서열을 포함하거나, 각각 자연적으로 발생하는 플라젤린, 플라젤린 N- 말단 불변 영역 또는 플라젤린 C- 말단 불변 영역의 아미노산 서열과 실질적으로 동일하거나 유사한 아미노산 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에서 플라젤린, 플라젤린 N-말단 불변 영역, 플라젤린 C-말단 불변 영역 또는 플라젤린의 다른 어떤 부분의 "활성 단편"은 적어도 약 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250 또는 300개 이상의 인접 아미노산 및/또는 인접한 아미노산의 약 300, 250, 200, 150, 125, 100 또는 75 개 미만의 아미노산을 포함하며, 하한이 상한보다 작은 한 이들의 조합도 포함할 수 있다. 상기 활성 단편은 숙주 내에서 TLR5 경로를 활성화시키는 작용을 나타낼 수 있는 단편을 의미할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 활성 단편은 전장 플라젤린의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 활성 단편은 TLR5 경로 활성능을 나타내는 플라젤린의 적어도 한 부분을 의미하는 것일 수 있다. 상기 “적어도 한 부분”이란 플라젤린의 도메인 0, 1, 2 및 3에서 TLR5 경로 활성능을 나타내는 부분을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 활성 단편이란 전장 플라젤린에서 초가변영역(hypervariable region)이 제거된 것일 수 있다. 상기 초가변영역이란 플라젤린의 유래가 되는 박테리아의 종류에 따라서 달라질 수 있으며, 특정 플라젤린의 전체 서열 중 초가변영역에 해당하는 서열은 통상의 기술자가 용이하게 파악하여 제거할 수 있다. 예를 들어, N-말단 도메인 0, 1, 2; 도메인 3; 및 C-말단 도메인 2, 1, 0을 포함하는 전장 플라젤린의 경우 도메인 3, 또는 도메인 2 및 3이 초가변영역일 수 있으며, N-말단 도메인 0, 1; 도메인 2; C-말단 도메인 1, 0을 포함하는 전장 플라젤린의 경우 도메인 2가 초가변영역일 수 있다. 또는, 초가변영역이 포함되지 않은 형태의 플라젤린의 경우(예를 들어, 많은 그람-양성균 유래의 플라젤린은 초가변영역이 포함되지 않을 수 있다.)에는 플라젤린 단백질의 접힘(folding)이 일어나는 힌지(hinge) 영역의 서열이 일부 제거된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “초가변영역”은 프로펠러(propeller) 도메인 또는 부위(region), 힌지(hinge), 초가변부위, 가변(variable) 도메인 또는 부위 등으로 표현될 수도 있다.
본 발명에서, 상기 초가변영역에 제거되었다는 것은 초가변영역에 해당되는 도메인 전체가 제거된 것일 수 있으며, 또는 초가변영역의 서열 중 일부가 제거된 것일 수도 있다.
본 발명에서, 상기 활성 단편이란 야생형 플라젤린의 초가변영역이 제거되고, 제거된 초가변영역에 인공의 서열(즉, 인공서열의 힌지 또는 링커)이 삽입된 형태의 플라젤린일 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 상기 플라젤린 단편은 야생형(wild type) 플라젤린의 C-말단 도메인 0, C-말단 도메인 1, C-말단 도메인 2, N-말단 도메인 2, N-말단 도메인 1, N-말단 도메인 0 및 상기 각 도메인들과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내는 부분(region)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하면서 TLR5 경로 활성능을 나타내는 단편을 의미할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 플라젤린의 활성 단편은 전장 플라젤린의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 플라젤린 부위와 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명은 또한 야생형 플라젤린의 전장 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에서 변이체란 야생형의 플라젤린 또는 이의 단편 단백질의 일부 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성(즉, TLR5 경로 활성화능)을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다.
경우에 따라서, 본 발명의 상기 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)된 전장 플라젤린 또는 이의 단편일 수도 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 플라젤린 또는 이의 단편의 변이체는 전장 플라젤린 또는 이의 단편의 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상으로 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있으며, 또는 전장 플라젤린 또는 이의 단편과 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 정도로 TLR5 경로를 활성화시키거나, 또는 전장 플라젤린 또는 이의 단편과 비교하여 더 높게 TLR5 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 다른 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 플라젤린은 하나 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 상기 항원의 비제한적인 예시로는 S. pneumoniae PspA1 항원, S. pneumoniae PspA2 항원, S. pneumoniae PspA3 항원, S. pneumoniae PspA4 항원, S. pneumoniae PspA5 항원 및/또는 S. pneumoniae PspA6 항원을 들 수 있다. 또는, 예를 들어, 상기 플라젤린은 하나 이상의 면역 조절성 물질이 결합된 융합 단백질의 형태일 수 있다. 상기 면역 조절성 물질은 당업계에서 면역반응을 증가시키는 것으로 알려진 것이라면 제한없이 포함될 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로는 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터페론-ω, 인터페론-τ, 인터류킨-1α, 인터류킨-1β, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-4, 인터류킨-5, 인터류킨-6, 인터류킨-7, 인터류킨-8, 인터류킨-9, 인터류킨-10, 인터류킨-11, 인터류킨-12, 인터류킨-13, 인터류킨-14, 인터류킨-18, B세포 성장 인자, CD40 리간드, TNF- α, TNF- β, CCL25, CCL28 또는 이의 활성 단편 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “퍼센트(%) 서열 상동성”은 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 기준 폴리펩타이드 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의한다. 퍼센트 아미노산 상동성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법 및 블라스트(BLAST), 블라스트-2, 얼라인(ALIGN) 또는 메갈라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본 명세서에서의 목적을 위해, 주어진 아미노산 서열 B와 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 퍼센트(%) 아미노산 서열 상동성은 다음과 같이 계산된다: 분율(fraction) X/Y의 100 배, 여기서 X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일하게 일치하는 아미노산 잔기 점수의 수이며, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 퍼센트(%) 아미노산 서열 상동성은 B 대 A의 퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성과 같지 않음을 이해할 것이다.
특정 실시양태에서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 IgG4 Fc는 IgG4의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역 1(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에서 상기 IgG4 Fc는 야생형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함한 확장된 IgG4 Fc일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
한편, 천연형 IgG Fc 서열을 이용한 단백질 융합체를 생산시 Fc에 의한 이펙터 기능을 최소화하기 위한 노력 중 선택될 수 있는 것은 IgG4 Fc이다. IgG4는 IgG1과 유사한 생체내 반감기를 보이면서 아미노산 서열의 차이로 인해 이펙터 기능이 상대적으로 작은 것으로 알려져 있다. 그러나 IgG4는 감소된 이펙터 기능이 있다는 장점에도 불구하고, 독특한 힌지 서열에 의해 생체내에서 IgG4 간의 Fab 암(arm) 교환이 일어나 단백질 융합체를 치료용 목적으로 사용시 큰 어려움이 있는 것으로 당업계에 보고되었다. 즉, IgG4 Fc를 단백질 융합체의 캐리어로 사용시 생체내에 존재하는 IgG4와 Fab 암(arm) 교환이 일어나 천연형 IgG4와 하이브리드를 형성하거나 단량체로 존재하여 원래의 구조를 변경시켜 치료학적으로 낮은 활성을 갖는 구조를 갖게 되는 문제가 발생한다. 이는 IgG4 Fc 단편과 생리활성 물질 융합체를 유전공학 방법으로 생산하든, in vitro에서 생산하든 공통의 문제점으로 작용한다.
따라서, 본 발명의 상기 융합 단백질에 포함되는 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 IgG4 Fc의 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이는 Fc의 힌지, CH2 및 CH3로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에서 발생한 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 인간 IgG4 Fc의 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이는 인간 IgG4 Fc의 중쇄 간 이황화 결합 형성을 부여하는 돌연변이인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 '이황화 결합'은 2개의 황 원자 사이에 형성되는 공유 결합을 의미한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc의 중쇄 간 이황화 결합 형성을 부여하는 돌연변이는 힌지에서의 돌연변이인 것을 특징으로 할 수 있다. 인간 IgG4 Fc의 힌지는 총 12개의 아미노산(ESKYGPPCPSCP)(서열번호 64)으로 이루어져 있으며, 상기 힌지에서의 돌연변이란 상기 힌지 서열에서 발생한 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 바람직하게는, 상기 힌지에서의 돌연변이는 상기 인간 IgG4 Fc의 힌지를 구성하는 12개의 아미노산 중 중 CPSC(서열번호 80) 서열이 CPPC(서열번호 79)로 치환되고 일부 아미노산이 결실되거나 삽입된 돌연변이, 또는 또 다른 아미노산이 치환된 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc는 CPPC (서열번호 79)서열을 포함하는 4개 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 힌지를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 인간 IgG4 Fc는 ESKYGPPCPPCP(서열번호 66), SKYGPPCPPCP(서열번호 71), KYGPPCPPCP(서열번호 72), YGPPCPPCP(서열번호 73), GPPCPPCP(서열번호 74), PPCPPCP(서열번호 75), PCPPCP(서열번호 76), CPPCP(서열번호 77), CPPCP(서열번호 78), 또는 CPPC(서열번호 79)의 서열로 이루어진 힌지를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc는 힌지 영역에서 돌연변이되어, 2개의 힌지 영역 사이에 이황화 결합 형성을 보장하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 인간 IgG4 Fc 힌지 영역에서의 돌연변이는 위치 228(EU 넘버링에 따름)에서 세린(Ser)이 프롤린(Pro)으로 돌연변이(S228P) 된 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc는 야생형의 IgG4 Fc의 힌지에서 일부 아미노산이 결실되어 Fab 암(arm) 교환이 방지되는 것을 특징으로 할 수 있다. IgG4 Fc의 힌지에서 일부 아미노산이 결실되어 Fab 암(arm) 교환이 방지되는 구체적인 예시는 당업계에 알려져 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 IgG4 Fc의 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 돌연변이는 S228P, R409K 또는 이의 조합(EU 넘버링에 따름)을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 위치 220에서 Ser이 Pro로 치환된 것(S220P), 위치 223에서 Gly이 Thr으로 치환된 것(G223T), 위치 224에서 Pro이 His으로 치환된 것(P224H) 및 위치 225에서 Pro이 Thr으로 치환된 것(P225T)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 아미노산 변이는 야생형 인간 IgG4 Fc의 활성에는 영향을 주지 않으면서 단백질의 안정성 등에 영향을 주는 전하 변이체(charge variants)로서 기능할 수 있도록 한다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 Fab 암(arm) 교환을 방지할 수 있는 인간 IgG4 Fc 변이체는 서열번호 6 내지 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이로서, IgG4 Fc 변이체의 유도체(mutein)도 포함한다. 본 발명에 있어서 IgG4 Fc 변이체의 유도체란 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 또한, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 당업계에 알려져 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 인간 IgG4 Fc 변이체의 유도체는 인간 IgG4 Fc 변이체와 동일한 생물학적 활성을 나타내나 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
본 발명의 일 실시예에서는, 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 3번째 아미노산이 Leu에서 Pro으로 치환된 유도체(힌지 영역에서 Fab 암 교환을 방지하는 아미노산 변이도 포함)와 플라젤린의 융합단백질을 제작하여 그 효과를 평가한 결과, 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 서열을 그대로 포함하는 플라젤린의 융합단백질과 TLR5 agonist activity에 차이가 없는 것으로 확인되었다.
즉, 본 발명에서 상기 인간 IgG4 Fc 변이체의 유도체는 융합단백질의 활성에는 영향을 주지 않으면서, 단백질의 안정성을 향상시키는 변이가 추가로 포함된 것일 수 있으며, 구체적으로는 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 3번째 아미노산이 Leu에서 Pro으로 치환된 유도체인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 인간 IgG4 Fc 변이체는 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, 당쇄가 제거된 인간 IgG4 Fc 변이체는 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 인간 IgG4 Fc 변이체라 할 것이다.
본 발명에서 당쇄의 제거(Deglycosylation)는 효소로 당을 제거한 인간 IgG4 Fc 변이체를 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 융합단백질은 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단 또는 C-말단이 상기 인간 IgG4 Fc 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합된 것일 수 있다. 구체적으로 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단이 인간 IgG4 Fc 변이체의 C-말단에 결합된 것이거나, 또는 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 C-말단이 인간 IgG4 Fc 변이체의 N-말단에 결합된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 C-말단이 인간 IgG4 Fc 변이체의 N-말단에 결합된 것일 수 있다.
한편, 본 발명에서 융합 단백질을 구성하는 각 구성요소, 즉 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체, 및 인간 IgG4 Fc 변이체는 서로 직접 연결되거나 링커를 통해 연결될 수 있다. 일반적으로, 용어 “링커”는 하나 이상의 분자, 예를 들면, 하나 이상의 성분 도메인 사이에 삽입될 수 있는 핵산, 아미노산 또는 비-펩타이드 잔기를 의미한다. 예를 들어, 링커는 조작을 용이하게 하기 위해 성분간에 관심있는 바람직한 부위를 제공하는데 사용될 수 있다. 링커는 또한 형질전환체로부터 융합 단백질의 발현을 증진시키고, 성분이 이의 최적의 3차 구조를 취하고/취하거나 표적 분자와 적절하게 상호 작용할 수 있도록 입체 장애를 감소시키기 위해 제공될 수 있다. 링커 서열은, 수용체 성분에 자연적으로 연결된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 융합 단백질의 발현을 증진시키기 위해, 특이적으로 관심있는 바람직한 부위를 제공하기 위해, 성분 도메인이 최적의 3 차 구조를 형성할 수 있도록 하기 위해, 및/또는 성분과 이의 표적 분자와의 상호 작용을 증진시키기 위해 사용되는 첨가된 서열일 수 있다.
바람직하게는, 상기 링커는 융합 단백질 내의 각각의 구성요소의 구조를 간섭하지 않고 융합 단백질의 유연성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 잔기는 2 내지 100 개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드 링커이다. 예시적인 링커는 Gly-Gly, Gly-Ala-Gly, Gly-Pro-Ala, Gly (G)n 및 Gly-Ser (GS) 링커와 같은 적어도 2 개의 아미노산 잔기를 갖는 선형 펩타이드를 포함한다. 본 명세서에 기재된 GS 링커는 (GS)n, (GSGSG)n(서열번호 81), (G2S)n, G2S2G(서열번호 82), (G2SG)n(서열번호 83), (G3S)n(서열번호 84), (G4S)n(서열번호 12), (GGSGG)nGn(서열번호 85), GSG4SG4SG(서열번호 86), 및 (GGGGS)n(서열번호 12)을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 n은 1 이상이다. (G)n 링커의 하나의 예는 G9 링커를 포함하며, (GGGGS)n (서열번호 12) 링커의 예시는 GGGGS(서열번호 12) 또는 (GGGGS)3 (서열번호 13) 링커를 포함한다. 적합한 선형 펩타이드는 알라닐 및/또는 세리닐 및/또는 프롤리닐 및/또는 글리실 아미노산 잔기로 구성된 폴리글리신, 폴리세린, 폴리프롤린, 폴리알라닌 및 올리고펩타이드를 포함한다. 링커 잔기는 본 발명에 개시된 융합 단백질의 구성성분을 연결시키는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 링커는 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 기재된 융합 단백질은 숙주 세포로부터 융합 단백질을 분비하기 위해 기능하는 신호 펩타이드를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 신호 펩타이드를 포함하지 않는다.
또한, 본 발명에서 기술된 융합 단백질은 단백질 결합 펩타이드의 변형된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질 성분은 예를 들어 임의의 단백질 결합 펩타이드에 대한 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화 및 인산화를 포함하는 번역 후 변형을 가질 수 있다.
다른 언급이 없는 한, 본 발명의 융합 단백질은 그 자체로 생균, 사멸 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스 벡터화 백신의 일부가 아닌 폴리펩타이드 (또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)로서 투여된다. 또한, 달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 융합 단백질은 분리된 융합 단백질로서, 예를 들어, 편모에 혼입되지 않는다.
본 발명에 있어서 “융합”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 구성하는 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서 상기 융합 단백질은 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61 또는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 고지방식이 투여에 의해 유도된 대사증후군 및 비알코올성 지방간 질환 동물모델에서 체중 감소효과, 간 조직 내 중성지방 축적 억제 효과, 경구 당부하 개선 효과, 비알코올성 지방간질환 및 지방간염 지표(NAS score) 개선 효과, 지방세포의 분화 억제 효과 및 간 섬유화 억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명에서 상기 간 질환은 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염, 알코올성 지방간, 간염, 간 섬유화, 간 경변, 간 부전 및 간암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염 또는 비알코올성 지방간에 의해 발생되는 간 섬유화, 간 경변, 간 부전일 수 있다.
본 발명에서 상기 대사증후군은 대사성 질환, 대사질환 등으로도 표현될 수 있으며, 당뇨, 비만, 인슐린 저항성, 지방간, 고지혈증 및 고혈압으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 대사증후군은 당뇨, 비만, 인슐린 저항성, 및 지방간으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 융합 단백질 외에 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 물질을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 비강내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 “경피 투여”는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 문헌에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 당업계에 알려진 것을 참고로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 대사증후군 또는 간 질환 예방 또는 치료하는 효과가 있는 공지의 물질과 병용하여 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물 내 각 구성에 대한 설명은 전술한 바가 참고될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함하는 것으로서, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 간 질환 또는 대사증후군 개선 또는 치료 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
예를 들면, 건강기능식품으로는 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 간 질환 또는 대사증후군의 예방, 개선 또는 치료 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부당 0.01~0.3 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100mL당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 간질환 또는 대사증후군 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질의 용도로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 융합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 간질환 또는 대사증후군 치료 방법으로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 간질환 또는 대사증후군 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 '유효량'이란 개체에게 투여하였을 때, 간질환 또는 대사증후군 또는 상기 질환의 개선, 치료, 검출, 진단 또는 상기 질환의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 상기 '치료'는 간질환 또는 대사증후군 또는 상기 질환으로 인한 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “을 포함하는(comprising)”이란 “함유하는(including)”또는 “특징으로 하는(characterized by)”과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 “로 이루어지는(consisting of)”이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 “필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)”이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 조성물은 고지방식이 투여에 의해 유도된 대사증후군 및 비알코올성 지방간질환 동물모델에서 야생형 플라젤린과 비교해 현저히 향상된 예방 및 치료 효과를 나타내므로, 대사증후군 또는 간 질환 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 제조된 1번 및 4번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 제조된 1번 및 2번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 제조된 4번 내지 7번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 제조된 6번, 8번 내지 11번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 융합단백질의 zTLR5와의 단백질-단백질 상호작용을 융합단백질-TLR5 결합에 대한 biolayer interferometry법으로, 그리고 융합단백질과 TLR5의 복합체 형성을 gel-filtration chromatography법으로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 농도별로 평가하고, 이의 EC50 값을 산출한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 제조된 6번 및 12번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 농도별로 평가한 결과이다.
도 9a 및 b는 본 발명의 실시예에서 제조된 서열번호 63번 융합단백질과 야생형 바실러스 서브틸리스의 플라젤린(BsFlagellin)의 비강 내 투여 후 시간의 경과에 따른 약물 흡수정도를 형광 이미징으로 분석한 결과이다(도 9a: 서열번호 63번 융합단백질, 도 9b: 야생형 바실러스 서브틸리스의 플라젤린).
도 10은 AMLN 식이에 의한 NASH 유도 및 시험약물 처리 모델 모식도를 나타낸 것이다.
도 11은 AMLN 모델에서 시험약물 처리시 간의 체중, 간의 무게 및 간내 Triglyceride(TG)의 간내 축적을 나타내는 결과이다.
도 12는 AMLN 모델에서 실험약물에 의한 체지방량 개선효과를 나타내는 결과이다.
도 13은 AMLN 모델에서 실험약물에 의한 경구 당부하 개선효과를 나타내는 결과이다.
도 14는 AMLN 모델에서 실험약물에 의한 지방간질환 지표(NAS score), 지방세포 크기 및 조직학적 분석에서 개선효과를 나타내는 결과이다.
도 15는 MCD 식이에 의한 NASH 유도 및 시험약물 처리 모델 모식도를 나타낸 것이다.
도 16은 MCD 모델에서 시험약물 처리 후 체중과 식이 섭취량에 대한 결과이다.
도 18은 MCD 모델에서 실험약물 처리 후 혈액 내 대사인자 수치 개선효과를 나타내는 결과이다.
도 19는 MCD 모델에서 실험약물 처리 후 NAS score 개선효과를 나타내는 결과이다.
도 20은 MCD 모델에서 실험약물 처리 후 간섬유화 수치 개선효과를 나타내는 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
1. 실험방법
본 발명에서는 Fab 암(arm) 교환이 방지된 인간 IgG4 Fc 변이체-플라젤린 융합단백질을 제작하고, 이의 효과를 다른 형태의 Fc-플라젤린 융합단백질과 비교하고자 다양한 형태의 융합단백질을 제작하였다. 융합단백질 제작에 사용된 플라젤린은 Bacillus subtilis 플라젤린(BsFlagellin)이다.
(1) DNA 클로닝
하기 12가지 종류의 플라스미드를 제작하였다.
1. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP303)
2. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304)
3. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge-NL
4. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305)
5. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC-NL
6. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306)
7. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-NL
8. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-S220P
9. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-G223T
10. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P224H
11. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P225T
12. pFUSE-hIgG4-Fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-LGK
상기 1 내지 12번의 각 플라스미드가 암호화하는 인간 IgG4 Fc 변이체-플라젤린 융합단백질의 구성을 아래 표 1에 나타내었다:
Figure PCTKR2023005213-appb-img-000001
(인간 IgG4 Fc의 힌지 영역은 총 12개의 아미노산(ESKYGPPCPSCP)(서열번호 64)으로 이루어져 있다. 상기 1 내지 3번의 융합단백질에 포함된 인간 IgG4 Fc는 상용 플라스미드에 포함된 서열로서 인간 IgG4 Fc 힌지를 구성하는 아미노산 중 일부가 결실된 형태(PPCPSCP) (서열번호 65)의 힌지가 포함된 인간 IgG4 Fc이며, 상기 5번 내지 12번은 12개의 아미노산이 모두 포함된 full length의 야생형 힌지 서열 또는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 full length의 힌지 서열을 포함하고 있다.
상기 1 내지 12의 DNA 제작에 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다:
번호 Used Primer
1.pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP303) Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 14)
Reverse 5'- GAC CAT GGC AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3'
(서열번호 15)
2. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304) Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC -3'
(서열번호 16)
Reverse 5'- GAC CAT GGC AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC AGA CCC TCC GCC ACC ACG TAA TAA TTG AAG TAC GTT TTG AGG CTG -3'
(서열번호 17)
3. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge-NL Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 18)
Reverse 5'- TCA GAT CTA ACC ATG GCA CGT AAT AAT TGA AG -3'
(서열번호 19)
4. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305) Forward 5'- TAT ATC CAT GGT TAG ATC TGA ATC CAA ATA CGG TCC CCC ATG CCC ATC -3'
(서열번호 20)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 21)
5. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC-NL Forward 5' - C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 22)
Reverse 5'- TCA GAT CTA ACC ATG GCA CGT AAT AAT TGA AG -3'
(서열번호 23)
6. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306) Forward 5' - TAT ATC CAT GGT TAG ATC TGA ATC CAA ATA CGG TCC CCC ATG CCC ACC TTG CCC AGC ACC TGA - 3'
(서열번호 24)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 25)
7. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-NL Forward 5'- C CGG ATA TCG ATG AGA ATT AAC CAC AAT ATT GCA GCA CTT AAC - 3'
(서열번호 26)
Reverse 5'- TCA GAT CTA ACC ATG GCA CGT AAT AAT TGA AG -3'
(서열번호 27)
8. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-S220P Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA CCC AAA TAC GGT CCC CCA TGC CCA CCT TGC -3'
(서열번호 28)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 29)
9. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-G223T Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA TCC AAA TAC ACT CCC CCA TGC CCA CCT TGC - 3'
(서열번호 30)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3' (서열번호 31)
10. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P224H Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA TCC AAA TAC GGT CAC CCA TGC CCA CCT TGC -3'
(서열번호 32)
Reverse TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 33)
11. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P225T Forward 5'- GGA GGG TCT GCC ATG GTT AGA TCT GAA TCC AAA TAC GGT CCC ACA TGC CCA CCT TGC - 3'
(서열번호 34)
Reverse 5'- TAT ATG CTA GCA CTC ATT TAC CCA GAG ACA GGG AGA G -3'
(서열번호 35)
12. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L) Forward 5'- GAC AAG GAT ATC GAT GAG AAT TAA CCA CAA TAT TGC AGC ACT TAA CAC - 3'
(서열번호 36)
Reverse 5'- GAC GCT AGC TCA TTT ACC CAG AGA CAG GGA GAG GC - 3'
(서열번호 37)
다음과 같은 단계에 따라 클로닝을 수행하였다:
[PCR]
1) Solgent PCR Kit (STD16-R500)을 사용하여 제작한 ORF를 맞춘 상기 프라이머를 사용하여 pFUSE-hIgG4-Fc2-BS1을 Template DNA로 하여 CPSC(서열번호 80)와 CPPC(서열번호 79) PCR product를 제작하기 위해 클로닝을 진행했다.
2) PCR fragment DNA에 10X DNA dye 4.4㎕ 첨가하고, 겔 전기영동을 통해 PCR 결과물의 크기와 band의 유무를 확인하여 MEGAquick-spin Plus (17290)를 통해 Gel Extraction을 수행했다.
[Enzyme Restriction]
3) 2)를 수행한 PCR fragment 와 Template DNA에 제한효소(Enzyme restriction)를 처리하고, 각각의 플라스미드의 enzyme cutting 완료 후, 10X DNA dye 4.4㎕ 첨가하고, 겔 전기 영동을 통해 PCR fragment 와 Template DNA 결과물의 크기와 band의 유무를 확인하여 MEGAquick-spin Plus (17290)를 통해 Gel Extraction을 수행했다.
[Ligation]
4) Molar Ratio를 기준으로 Vector (Template DNA): Insert (PCR fragment) = 1:5의 비율로 Ligation을 진행했다. Ligation 과정은 Takara T4 DNA Ligase Kit (2011A) 매뉴얼 대로 진행했다.
[Transformation]
5) DH5a competent cell을 얼음에서 1분동안 녹인 후에 Zeocin(+) TB plate를 37도씨 incubator에 방치한다.
6) 녹은 DH5a competent cell의 10% volume으로 Ligation Product를 넣어주고 20분동안 얼음에서 방치한다.
7) 42℃에서 30초 동안 열 충격을 준다.
8) Heat Shock 후에 얼음에서 5분 동안 방치한다.
9) 이후에 Zeocin(+) TB Plate에 Transformation 된 E-coli를 도말한다.
10) Overnight로 Colony를 키우고 colony를 picking한다.
11) Picking된 colony를 Zeocin (+) LB media의 3㎖ Inoculation을 18hr 동안 진행한 후에 Mini Prep을 한다.
12) 클로닝이 완료된 플라스미드의 염기서열을 확인하기 위해 각각의 DNA Sequencing을 진행한다.
상기 1 내지 12번 융합단백질의 DNA 염기서열 및 단백질 아미노산 서열을 하기 표 3에 나타내었다.
번호 서열정보
1.pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP303) DNA 서열번호 38
단백질 서열번호 39
2. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge (MSP304) DNA 서열번호 40
단백질 서열번호 41
3. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-partial hinge-NL DNA 서열번호 42
단백질 서열번호 43
4. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC (MSP305) DNA 서열번호 44
단백질 서열번호 45
5. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPSC-NL DNA 서열번호 46
단백질 서열번호 47
6. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306) DNA 서열번호 48
단백질 서열번호 49
7. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-NL DNA 서열번호 50
단백질 서열번호 51
8. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-S220P DNA 서열번호 52
단백질 서열번호 53
9. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-G223T DNA 서열번호 54
단백질 서열번호 55
10. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P224H DNA 서열번호 56
단백질 서열번호 57
11. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC-P225T DNA 서열번호 58
단백질 서열번호 59
12. pFUSE-hIgG4-fc2-bsFlagellin-full hinge-CPPC (MSP306L) DNA 서열번호 60
단백질 서열번호 61
(2) 제작한 플라스미드의 동물 세포에서의 발현 및 단백질 정제
1) 12well plate에 well 당 poly-L-lysine 500ul 사용하여 5분간 RT에서 coating한 후 serum free DMEM으로 1회, 10% FBS DMEM으로 1회 wash 한다. Transfection 당일 cell confluency가 약 60%가 되게끔 HEK293T를 seeding한다
2) 실험 당일 serum free DEME 100ul에 DNA을 각각 1ug과 TurboFect Transfection Reagent (Thermo Scientific) 2ul을 섞은 후 20분간 RT incubation한 후 transfection 한다. Transfection volume은 1ml으로 한다.
3) 24hr 후 transfection efficiency 확인 후 0.5% FBS DMEM으로 media change 한다.
4) 24hr 후 media 400ul을 harvest 한 후 debris 제거를 위해 12300g에서 1분간 원심 분리하여 상층액을 사용한다.
5) 또한, flask 배양 방식으로 CHO S cell line에서 6 X 106 cells/ml 을 200ml 배지에 DNA를 1mg/L의 농도로 일시발현한다.
6) 배양 후 원심분리와 필터링 후 친화 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피 정제 과정을 거쳐 각 단백질을 수득했다.
(3) TLR5 아고니스트 어세이
상기 방법에 따라 제조한 (i) 내지 (vi) 단백질의 TLR5 활성화능을 다음 단계에 따라 확인하였다:
1) 단백질은 정량하여 준비한다.
2) HEK-Blue cell은 75T-Flask에서 DMEM (4.5 g/L glucose, 2mM L-glutamine), 10% FBS, 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 100ug/ml Normocin이 들어간 media를 사용하여 culture.
3) Cell은 thawing하고 3회 정도 Normocin (100ug/ml)이 들어간 media에서 키우다가 본 실험 전에 2회 이상 Normocin (100ug/ml), Blasticidin (15ug/ml), Zeocin (100ug/ml)을 넣은 media에서 subculture 후에 사용한다.
4) Cell은 Flask의 70~80%가 차면 media만 넣고 tapping으로 cell을 분리 centrifuge (1000rpm/5min) 후에 1:6으로 subculture.
5) 흔들어서 잘 녹여주고 foil로 감싸서 37℃에서 30min 반응 후 4℃ 냉장고에 보관, 사용시에는 37℃로 warming up 후에 사용한다.
6) 반응시킬 protein이나 물질들을 20ul를 기준으로 필요한 농도에 맞춰서 준비해준다. 96well plate에 물질을 넣어주고 ice올려둔다. Blank는 PBS를 20ul 넣어준다.
7) 140,000 cell/ml을 기준으로 cell을 counting 후 HEK-Blue detection solution과 잘 섞어준 다음 180ul씩 각 well에 넣어준다.
8) Cell은 소량의 PBS를 사용하여 counting해주고 96well-triplicate 기준으로 총 수량을 정한다.
9) 37℃, CO2 incubator에서 16h 후에 620nm에서 읽어준다.
(4) Biolayer interferometry 분석
[TLR5avitag의 biotinylation]
1) Sample preparation: BirA500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit를 이용하여 진행하였다.
2) TLR5avitag (~1 mg/ml) 300 ul + BiomixA 50 ul + BiomixB 50 ul + BirA 10 ul + buffer (20 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl) = final volume 500 ul의 조건으로 sample을 섞어주었다.
3) 18℃에서 5시간동안 incubation을 실시하였다.
4) 1L Buffer (20 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl)에 dialysis 3회 반복하여 남아있는 잔여물을 모두 제거한다.
5) SDS-PAGE gel loading하고 PVDF membrane transfer 후 streptavidin-HRP 이용하여 biotinylation을 확인하였다.
[BLI experiment]
6) SA biosensors를 200 μl baseline buffer에 5분이상 hydration한다.
7) Baseline buffer 로 각 sample 단백질을 희석한다. TLR5avitag은 5 μg/ml, 리간드 단백질(CPPC, entolimod, flagellin)은 81, 27, 9, 3 nM의 농도로 희석한다.
[palate 측정]
8) Octet Data Acquisition 프로그램에서 process를 설정한다.
9) late Definition: 측정할 plate well type(plate 구성 참고)을 입력한다
10) Assay Definition: 1-9 lane 순서대로 sensor가 이동하게끔 Well과 각 step을 세팅하여(위 plate 구성 및 각 step별 설정 참고) 실험을 진행시킨다.
11-1) 1~3 lane에 걸쳐 sensor wash를 진행
11-2) 4 lane에서 TLR5avitag을 sensor상에 고정
11-3) 5~7 lane에 걸쳐 sensor wash를 진행
11-4) 8 lane에서 TLR5와 ligand의 association을 확인
11-5) 9 lane에서 TLR5와 ligand의 dissociation을 확인
12) 측정이 시작되면 각 5개 sensor의 baseline이 잘 잡히는지 확인한다.
13) 측정된 결과는 Octet Data Analysis 프로그램을 이용하여 분석한다 (Association and dissociation, 1:1 binding model 설정으로 fitting).
(5) Gel filtration 실험
[Buffer & Column conditions]
1) Buffer & Column conditions
- Gel-filtration buffer: 20mM HEPES (Biobasic, HB0264) pH 7.4 150mM NaCl (Biobasic, DB0483)
- 모든 단백질은 gel-filtration buffer 조건에 있으며, 단백질간 binding 또한 gel-filtration buffer 조건 하에 진행되었음. Column 내 환경 또한 gel-filtration buffer로 하여 실험을 진행하였음.)
- Column: Superdex 200 10/300 GL
- FPLC: AKTA FPLC (GE-healthcare)
2) 각각 단독으로 단백질을 column에 inject하며 각 물질의 분자량 및 elution 위치를 파악하였다.
[Sample mixing & chromatography running]
3) Protein들의 농도를 계산해서 TLR5와 리간드 protein을 각각 1:0, 1:1, 1:2, 0:1 비율로 혼합한다. total volume은 gel-filtration buffer를 이용하여 300 μl 로 맞춰준다.
4) Column에 3 column volume (75ml) 이상의 gel-filtration buffer를 흘려주어 equilibration을 진행한다.
5) 0.5 ml/min의 속도로 1 ml equilibration 진행한다.
6) 18℃에서 30분간 incubation한 뒤 sample을 centrifuge(12000 rpm, 4℃ 10 min)하여 침전물을 가라앉힌 후 상층액을 모아 FPLC에 injection한다. (Sample은 syringe를 이용해 sample loop에 injection한다.)
7) 1 column volume(25 ml) gel-filtration buffer를 흘려주어 sample의 elution peak를 UV 280 nm로 결과를 확인한다.
(6) AMLN diet에 의한 NASH 동물 모델 유도 실험
1) AMLN(Amylin Liver NASH) diet 급이
정상 식이 그룹인 12수의 동물을 제외하고 나머지 88수의 동물을 대상으로 AMLN (Amylin Liver NASH) diet (D09100310, RESEARCH DIETS Inc., New Brunswick, U.S.A.)를 18주간 급이하여 비알코올 지방간을 유도하였다.
2) 군 분리
18주간 AMLN diet를 급이한 동물을 대상으로 체중과 body fat mass를 측정하고, 두 가지 측정값에 대해 각 그룹간 평균이 유사하도록 군 분리를 실시하였다
3) 사료
1. 실험동물용 일반 고형 사료
순화 기간 동안 모든 동물에 제공하였으며, 질환 유도 기간 및 군 분리 후 정상 동물군에 제공하였다. (TEKLAD CERTIFIED GLOBAL 18% PROTEIN RODENT DIET 2018)
2. Amylin Liver NASH diet (AMLN diet, D09100310)
순화기간 종료 후 정상 동물군을 제외한 모든 동물에 AMLN diet를 제공하였다.
4) 투여
약물 투여는 군 분리한 후 다음날부터 실시하였고, 대조물질(Obeticholic acid, OCA)은 12주간 1일 1회 경구 투여하였으며, 시험물질은 비강 내 투여 그룹의 경우 12주간 1주 2회 투여하였으며, 정맥투여는 12주간 1주 1회 실시하였다.
5) 투여 방법 및 횟수
1. 군 분리 후 다음날부터 대조물질을 12주간 1일 1회 경구투여 하였으며, 시험물질은 12주간 1주 2회 비강 내 투여 또는 1주 1회 정맥 투여를 실시하였다.
2. 대조물질의 경구 투여는 경구 투여용 존데를 부착한 일회용 주사기를 이용하여 위 내로 강제 투여하였고, 시험물질의 정맥 투여는 0.3 mL insulin syringe를 이용하여 마우스의 꼬리 정맥을 통해 정맥투여 하였으며, 비강내 투여는 흡입 마취 하에 micro pipette을 이용하여 비강 내 투여하였다.
6) 군 구성 및 투여 용량
군 구성은 총 6개의 군으로 아래의 표 4와 같이 나누어 진행하였다.
Figure PCTKR2023005213-appb-img-000002
7) 관찰 및 검사
1. 검사일 설정
관찰, 측정 및 검사일은 투여 개시일을 Day 1일로 하였고, 투여 개시일부터 7일간을 투여 1주로 계산하였다.
2. 임상증상 관찰
모든 동물에 대하여 1일 1회 일반증상을 관찰하였고, 1일 2회 빈사 및 사망동물의 유무를 확인하였으며 관찰은 투여 1일부터 투여 종료시까지 실시하였다.
8) 체중측정
군 분리를 위해 시험물질 투여 전일에 전자 저울로 체중을 측정하였고, 투여 개시 후 주 1회 체중을 측정하였으며 이를 기준으로 시험물질 투여액량을 결정하였다. 시험물질 투여가 최종 종료되면 16시간 절식 후 체중을 측정한 후 부검을 실시하였다.
9) 사료 섭취량 측정
사료 섭취량은 군 분리 후 주 1회 사육상자별 사료 섭취량을 측정하였고, 체중 측정 전일 사료 급이량을 측정한 후 체중 측정 당일 잔량을 측정하여 사료 섭취량을 계산하였다.
10) Body fat mass 측정
군 분리를 위해 body fat mass를 측정하였고, 시험물질 투여 후 12주에 body fat mass를 추가로 측정하였다. 측정 이세는 동물을 isoflurane으로 흡압 마취한 후 dual energy X-ray absorptiometry (InAlyzer, Medikors)를 이용하여 fat mass를 측정하였다.
11) 경구 당부하 검사
경구 당부하 검사는 질 투여 후 85일에 측정하였다. 모든 동물을 경구 당부하 시험 전날부터 16시간 절식시키고 혈당을 측정한 후, 2 g/kg의 glucose (D-(+)-Glucose, sigma, U.S.A)를 10 mL/kg 용적으로 강제 경구 투여한 후, 15분, 30분, 60분과 120분에 혈당을 측정하였다.
혈당의 측정은 혈당 측정기인 Accu-CHEK®을 이용하여 동물의 꼬리 미부 끝 부분을 scissor로 미세하게 절개하여 자연스럽게 흘러나오는 whole blood로 측정하였다. 시간대 별 혈당 측정치를 이용하여 경시적 변화를 기록하고, 그래프의 밑면적(Area Under the Curve, AUC)를 SigmaPlot (version 10.0 Systat Software Inc., U.S.A.)을 사용하여 산출하여 각 그룹 간 내당능을 비교하였다. 모든 혈당 측정이 종료되고 난 후 각 그룹별 시험물질을 투여하였다.
12) 부검
부검은 투여를 종료한 후 각 그룹별 음수 제공 하에 16시간 절식을 시키고 부검은 개체 순서에 따라 진행하였다.
1. 복대정맥을 통해 혈액 채취 후 복부 장기에 대해 육안검사를 실시하였다.
2. 내부 장기의 이상 유무를 확인한 후 간 조직과 부고환 지방 조직을 적출하였고, 적출된 간 조직 개체 별 사진 촬영을 실시하였다.
3. 간 조직과 부고환 지방 조직을 생리식염수로 세척하고 여과지로 수분을 제거한 후 전자저울로 절대 중량을 측정하여 부검 전 절식된 체중에 대한 각각의 상대 중량을 아래와 같이 산출하였다.
산식 : 상대 장기 중량 = 장기 무게(g)/부검 전 절식 체중(g)
4. 적출하여 무게를 측정한 간 조직 일부는 2 set로 소분하여 1 set는 간 조직 내 TG 분석을 위하여 액체질소로 급속 냉동 후 -70℃이하의 deep freezer (Model 706, Thermo Fisher Scientific Inc., U.S.A.)에 보관하였고, 나머지 1 set는 조직학적 검사를 위해 10% 중성 완충 포르말린에 고정 및 남은 간 조직 -70℃이하의 deep freezer에 보관하였다.
5. 복대정맥에서 채취한 혈액은 EDTA-2K tube (Microtainer, BD, U.S.A.)와 0.6 mL SST tube (Microtainer, BD, U.S.A.)에 각각 소분하였고, 0.6 mL SST tube에 담은 혈액은 완전히 굳힌 다음 EDTA-2K tube와 4℃에서 5,000 rpm으로 15분간 원심분리한 후 혈청 및 혈장을 취하여 각각 1.5 mL tube에 담아 -70℃이하의 deep freezer에 보관하였다.
13) 간 조직 내 Triglyceride(TG) 분석
부검시 적출한 간 조직을 200 mg 칭량하고 정상 생리식염수로 적출한 간 조직을 세척하였다. 간 조직 200 mg당 1% Triton X-100 in PBS를 1 mL씩 넣은 후 homogenization하였다. 간 균질액을 4℃에서 10,000 x g로 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 분리한 후 TG quantification kit (STZ-396, Cell Biolabs)를 이용하여 microplate reader (SpectraMax M2, Molecular Devices, U.S.A.)로 간 조직 내 TG 함량을 측정하였다.
14) 혈청학적 검사
부검시 복대정맥에서 채취하여 냉동 보관 중인 혈청을 이용하여 혈청 생화학 분석기(Blood chemistry analyzer, AU480, Beckman Coulter, Germany)로 간 염증 혈액 마커(AST, ALT, ALP, GGT) 및 혈중 지질 profile(T-chol, TG, H이-C, LDL-c) 등을 측정하였다. 분석 후 남은 검체(혈청)는 deep freezer에 보관하였다.
15) 조직학적 검사
1. 조직 슬라이드 제작
조직병리학적 검사를 위해 간과 부고환 지방조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였고, 고정된 조직을 삭정, 탈수 및 파라핀 포매 등의 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 블록을 제작하고 박절하였다. 박절한 간 조직 절편에 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 실시하여 NAFLD activity score (NAS)를 평가하였다. 또한 박절한 부고환 지방 절편에 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 실시하여 부고환 지방 조직 내 adipocyte size를 분석하였다.
2. Non-alcoholic fatty liver disease activity score(NAS) 평가
H&E 염색 슬라이드에서의 NAS 평가는 아래의 표 5를 참고하여 진행하였다.
Figure PCTKR2023005213-appb-img-000003
3. H&E 염색을 통한 부고환 지방 조직 분석
부고환 지방 조직 내 adipocyte의 size를 측정하기 위하여 현미경을 통해 조직 슬라이드의 영상을 확보한 후 image J program을 이용하여 adipocyte의 size를 측정하여 분석하였다.
16) 자료의 통계처리
실험에서 얻어진 모든 실험 결과는 평균치 ± 표준편차로 표시하였고 SPSS (version 20, IBM SPSS Statistics, U.S.A.)를 사용하여 검정하였다. 모든 자료들에 대해 분산의 동질성을 비교하기 위한 Levene's test를 실시하였으며, 분산이 동질성을 갖는 경우 One-way analysis of variance (ANOVA)를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과의 유의차가 있는 시험군을 알아내기 위하여 Dunnett's test를 실시하였다. (유의수준: 양측 5%, 1% 및 0.1%)
(7) MCD diet에 의한 NASH 동물 모델 유도 실험
1) MCD(Methionine-Choline Deficient) diet 급이
정상 식이 그룹인 12수의 동물을 제외하고 나머지 80수의 동물을 대상으로 MCD (Methionine-Choline Deficient) diet (A02082002B, RESEARCH DIETS Inc., New Brunswick, U.S.A.)를 4주간 급이하여 비알코올 지방간을 유도하였다.
2) 군 분리
4주간 MCD diet를 급이한 동물을 대상으로 체중을 측정하였고, 그룹간 체중 측정값의 평균이 유사도록 군분리를 실시하였다.
3) 사료
1. 실험동물용 일반 고형 사료
순화 기간 동안 모든 동물에 제공하였으며, 질환 유도 기간 및 군 분리 후 정상 동물군에 제공하였다. (TEKLAD CERTIFIED GLOBAL 18% PROTEIN RODENT DIET 2018)
2. Methionine-Choline Deficient (MCD diet, A02082002B)
순화기간 종료 후 정상 동물군을 제외한 모든 동물에 MCD diet를 제공하였다.
4) 투여
약물 투여는 군 분리한 후 다음날부터 실시하였고, 대조물질은 8주간 1일 1회 경구 투여하였으며, 시험물질은 비강 내 투여 그룹의 경우 8주간 1주 2회 투여하였다. 정맥 투여 그룹은 투여 개시 후 2주간 1주 1회 투여하였고 투여 후 3주부터는 1주 2회 정맥 투여를 실시하였다.
5) 투여 방법 및 횟수
1. 군 분리 후 다음날부터 대조물질을 12주간 1일 1회 경구투여 하였으며, 시험물질은 12주간 1주 2회 비강 내 투여 및 1주 1회 정맥 투여를 실시하였다.
2. 대조물질의 경구 투여는 경구 투여용 존데를 부착한 일회용 주사기를 이용하여 위 내로 강제 투여하였고, 시험물질의 정맥 투여는 0.3 mL insulin syringe를 이용하여 마우스의 꼬리 정맥을 통해 정맥투여 하였으며, 비강내 투여는 흡입 마취 하에 micro pipette을 이용하여 비강 내 투여하였다.
6) 군 구성 및 투여 용량
군 구성은 총 6개의 군으로 아래의 표 6과 같이 나누어 진행하였다.
Figure PCTKR2023005213-appb-img-000004
7) 관찰 및 검사
1. 검사일 설정
관찰, 측정 및 검사일은 투여 개시일을 Day 1일로 하였고, 투여 개시일부터 7일간을 투여 1주로 계산하였다.
2. 임상증상 관찰
모든 동물에 대하여 1일 1회 일반증상을 관찰하였고, 1일 2회 빈사 및 사망동물의 유무를 확인하였으며 관찰은 투여 1일부터 투여 종료시까지 실시하였다.
8) 체중측정
군 분리를 위해 시험물질 투여 전일에 전자 저울로 체중을 측정하였고, 투여 개시 후 주 1회 체중을 측정하였으며 이를 기준으로 시험물질 투여액량을 결정하였다. 시험물질 투여가 최종 종료되면 16시간 절식 후 체중을 측정한 후 부검을 실시하였다.
9) 사료 섭취량 측정
사료 섭취량은 군 분리 후 주 1회 사육상자별 사료 섭취량을 측정하였고, 체중 측정 전일 사료 급이량을 측정한 후 체중 측정 당일 잔량을 측정하여 사료 섭취량을 계산하였다.
10) 부검
부검은 투여를 종료한 후 각 그룹별 음수 제공 하에 16시간 절식을 시키고 부검은 개체 순서에 따라 진행하였다.
1. 복대정맥을 통해 혈액 채취 후 복부 장기에 대해 육안검사를 실시하였다.
2. 내부 장기의 이상 유무를 확인한 후 간 조직과 부고환 지방 조직을 적출하였고, 적출된 간 조직 개체 별 사진 촬영을 실시하였다.
3. 간 조직과 부고환 지방 조직을 생리식염수로 세척하고 여과지로 수분을 제거한 후 전자저울로 절대 중량을 측정하여 부검 전 절식된 체중에 대한 각각의 상대 중량을 아래와 같이 산출하였다.
산식 : 상대 장기 중량 = 장기 무게(g)/부검 전 절식 체중(g)
4. 적출하여 무게를 측정한 간 조직 일부는 2 set로 소분하여 1 set는 간 조직 내 hydroxyproline 분석을 위하여 액체질소로 급속 냉동 후 -70℃이하의 deep freezer (Model 706, Thermo Fisher Scientific Inc., U.S.A.)에 보관하였고, 나머지 1 set는 조직학적 검사를 위해 10% 중성 완충 포르말린에 고정 및 남은 간 조직 -70℃이하의 deep freezer에 보관하였다.
5. 복대정맥에서 채취한 혈액은 EDTA-2K tube (Microtainer, BD, U.S.A.)와 0.6 mL SST tube (Microtainer, BD, U.S.A.)에 각각 소분하였고, 0.6 mL SST tube에 담은 혈액은 완전히 굳힌 다음 EDTA-2K tube와 4℃에서 5,000 rpm으로 15분간 원심분리한 후 혈청 및 혈장을 취하여 각각 1.5 mL tube에 담아 -70℃이하의 deep freezer에 보관하였다.
11) 간 조직 내 hydroxyproline 분석
간 조직을 10 mg당 100 uL dH2O에 넣고 homogenization하였다. 간 균질액에 HCl (~12N) 100 μL를 넣고 Teflon cap으로 꽉 닫아서 120℃에 3시간 가수분해하였다. 가수분해 된 sample을 vortex하고, 10,000 xg로 3분간 원심분리한 후, 가수분해 된 sample을 96 well plate에 10 μL를 옮기고 증발시킨 후 Hydroxyproline Colorimetric Assay Kit (K555-100, BioVision)을 이용하여 간 조직 내 hydroxyproline 농도를 microplate reader (SpectraMax M2, Molecular Devices, U.S.A.)로 560 nm에서 측정하였다.
12) 혈청학적 검사
부검시 복대정맥에서 채취하여 냉동 보관 중인 혈청을 이용하여 혈청 생화학 분석기(Blood chemistry analyzer, AU480, Beckman Coulter, Germany)로 간 염증 혈액 마커(AST, ALT, ALP, GGT) 및 혈중 지질 profile(T-chol, TG, H이-C, LDL-c) 등을 측정하였다. 분석 후 남은 검체(혈청)는 deep freezer에 보관하였다.
13) 절식 혈중 인슐린 분석
절식 혈중 인슐린 분석은 부검 시 EDTA-2K tube에 담아 채취한 혈액을 통해 얻은 혈장으로 Rat/Mouse Insulin ELISA Kit (#EZRMI-13K, Millipore)을 이용하여 ELISA reader (SpectraMax M2, Molecular Devices, U.S.A.)로 측정하였다.
14) 조직학적 검사
1. 조직 슬라이드 제작
조직병리학적 검사를 위해 간 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였고, 고정된 조직을 삭정, 탈수 및 파라핀 포매 등의 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 블록으로 제작하고 박절하였다. 박절한 조직 절편에 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 실시하여 NAFLD activity score (NAS)를 평가하였고, Sirius-red 염색을 실시하여 fibrosis score 및 area를 평가하였다.
2. Non-alcoholic fatty liver disease activity score(NAS) 평가
H&E 염색 슬라이드에서의 NAS 평가는 상기 표 5를 참고하여 진행하였다.
3. Fibrosis score 평가
Sirius-red 염색 슬라이드에서의 fibrosis score 평가는 아래의 표 6을 참고하여 진행하였다.
Figure PCTKR2023005213-appb-img-000005
4. Fibrosis area 분석
Cellsens 소프트웨어를 이용하여 Sirius-red 염색 슬라이드를 200배 배율로 촬영한 뒤, Image J 소프트웨어를 이용하여 염색된 부분의 면적을 측정하였다. 이후 염색된 부분을 관심 영역(region of interest, ROI)의 총 면적으로 나누고, 이 비율을 기준으로 군간 평균을 비교하였다. 배경 염색 혹은 아티팩트 등 위양성으로 관찰될 수 있는 경우, threshold를 조절하여 측정하였다.
15) 자료의 통계처리
실험에서 얻어진 모든 실험 결과는 평균치 ± 표준편차로 표시하였고 SPSS (version 20, IBM SPSS Statistics, U.S.A.)를 사용하여 검정하였다. 모든 자료들에 대해 분산의 동질성을 비교하기 위한 Levene's test를 실시하였으며, 분산이 동질성을 갖는 경우 One-way analysis of variance (ANOVA)를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과의 유의차가 있는 시험군을 알아내기 위하여 Dunnett's test를 실시하였다. (유의수준: 양측 5%, 1% 및 0.1%)
2. 실험결과
(1) TLR5 아고니스트 어세이
상기 실험방법에 따라 제조한 1 내지 11번 각각의 단백질의 TLR5 활성화능을 평가하고, 이에 대한 결과를 도 1 내지 도 5에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, hIgG4 Fc의 힌지 일부 서열이 융합된 단백질(1번)과 힌지 전체서열이 융합된 단백질(4) 모두 TLR5 활성화능을 나타냈으며, 그 정도는 힌지 전체서열이 융합된 단백질에서 높게 나타났다.
도 2에 나타낸 바와 같이, Bsflagellin과 hIgG4 Fc를 연결하는 링커(GGGGS)(서열번호 12)가 1개인 융합단백질(1번)과 3개인 융합단백질(2번) 모두 TLR5 활성화능을 나타냈으며, 그 정도는 링커가 3개인 융합단백질에서 높게 나타났다.
도 3에 나타낸 바와 같이, Bsflagellin과 hIgG4 Fc를 연결하는 링커(GGGGS) (서열번호 12)가 1개인 융합단백질(1번)과 링커가 없는 융합단백질(3번) 모두 TLR5 활성화능을 나타냈으며, 그 정도는 비슷한 것으로 확인되었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 야생형의 hIgG4 Fc에 융합된 단백질(4번)과 비교해 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이(S228P)를 포함하고 있는 hIgG4 Fc에 융합된 단백질(6번)의 TLR5 활성화능이 현저히 높은 것으로 확인되었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이(S228P)를 포함하고 있는 hIgG4 Fc에 융합된 단백질(6번)과 추가적인 변이를 포함하는 전하 변이체들 모두 TLR5 활성화능이 나타난 것으로 확인되었다.
(2) 융합단백질과 TLR5와의 결합력 분석
상기 제조한 융합단백질 중에서 6번 융합단백질(MSP306)과 zTLR5와의 단백질-단백질 상호작용을 융합단백질-TLR5 결합에 대한 biolayer interferometry법으로, 그리고 융합단백질과 TLR5의 복합체 형성을 gel-filtration chromatography법으로 분석하였다.
이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이 6번 융합단백질은 결합력이 pM 수준으로 매우 뛰어난 것으로 확인되었다.
또한, 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능의 EC50 값을 산출해 본 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 6번 융합단백질의 TLR5 활성화능의 EC50는 21.44nM로서 매우 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 효과가 가장 우수한 6번 융합단백질과, hIgG4 Fc의 C-말단 3번째 서열만 6번과 상이한 12번 융합단백질의 TLR5 활성화능을 비교해 본 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 6번 및 12번 융합단백질의 활성이 거의 동일한 것으로 확인되었다.
3. 곤충세포에서의 단백질 발현 및 비강 흡수 실험
(1) 곤충세포에서의 단백질 발현
[Original Baculovirus의 제작]
1) 6 well plate에 각 well 당 100 x 104개의 Sf9 cell을 seeding 한다.
2) 항생제가 포함되지 않는 배양액을 2ml까지 채운 후 28℃에서 30분 동안 방치한다. 방치하는 동안 그 다음 단계를 진행한다.
3) CellfectinII solution(gibco) 8μl와 항생제가 포함되지 않는 배양액 100μl을 섞은 후 실온에서 30분 동안 방치한다.
4) 별도의 용기에 midi-prep DNA (서열번호 62, 1μg/μl concentration) 1.5μl와 linearized baculovirus DNA 1.5μl을 넣고 조심스럽게 섞은 후 실온에서 5분 동안 방치한 후 항생제가 포함되지 않는 배양액 100μl을 첨가한 후 섞어준다.
5) 단계 3)의 혼합액과 단계 4)의 혼합액을 섞은 후 실온에서 30분간 방치한다.
6) 단계 2)의 plate를 꺼내 기존의 배양액을 제거한 후 각 well에 새로운 배양액 1ml를 넣어준다.
7) 각 well에 단계 5)의 혼합액을 첨가하여 plate를 밀봉한 후 low T incubator에서 4시간동안 방치한다.
8) 배양액으로 씻어낸 후 항생제가 없는 배양액으로 바꿔준다.
9) plate를 밀봉한 후 28℃ incubator에서 5일동안 방치한다.
10) Original baculovirus를 이용하여 Primary Baculovirus를 바로 제작하지 않고 보관하는 경우, 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다. 바로 제작하는 경우 다음 과정을 따른다.
[Primary Baculovirus의 제작]
1) 실험 전 Sf9 cell을 Log phage 상태가 되도록 배양한다.
2) 75T 플라스크에 1000 x 104cells개의 Sf9 cell을 seeding 한 후 28℃에서 30분동안 방치한다.
3) Sf cell이 플라스크 바닥에 부착했는지 확인한 후 배양액을 모두 제거한다.
4) 새로운 배양액 1ml 넣어준 후 original baculovirus 500ul를 한 방울씩 파이펫으로 떨어뜨려 준다. original baculovirus가 잘 퍼지도록 부드럽게 흔들어준 후 28℃에서 1시간동안 방치한다.
5) 새로운 배양액 10ml를 첨가한 후 28℃에서 3일동안 방치한다.
6) Primary Baculovirus를 이용하여 Secondary Baculovirus를 바로 제작하지 않고 보관하는 경우, 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다. 바로 제작하는 경우 다음 과정을 따른다.
[Secondary Baculovirus의 제작]
1) 실험 전 Sf9 cell을 Log phage 상태가 되도록 배양한다.
2) 175T 플라스크에 2000 x 104개의 Sf9 cell을 seeding 한 후 28℃에서 30분동안 방치한다.
3) Sf cell이 플라스크 바닥에 부착했는지 확인한 후 배양액을 모두 제거한다.
4) 새로운 배양액 2ml 넣어준 후 primary baculovirus 500ul를 한 방울씩 파이펫으로 떨어뜨려 준다. primary baculovirus가 잘 퍼지도록 부드럽게 흔들어준 후 28℃에서 1시간동안 방치한다.
5) 새로운 배양액 20ml를 첨가한 후 28℃에서 3일동안 방치한다.
6) Secondary Baculovirus를 이용하여 Tertiary Baculovirus를 바로 제작하지 않고 보관하는 경우, 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다. 바로 제작하는 경우 다음 과정을 따른다.
[Tertiary Baculovirus의 제작]
단백질 발현이 확인되면 Tertiary Baculovirus을 제작한다. 이후의 과정은 진탕배양기를 사용한다.
1) 실험 전 Sf9 cell을 Log phage 상태가 되도록 배양한다.
2) 플라스크에 180-200 x 104개의 Sf9 cell을 seeding 한 후 적정양의 Secondary Baculovirus를 첨가한 후 28℃의 진탕배양기에서 90rpm 속도로 3일동안 배양한다.
3) 배양액을 회수한 후 4℃에 보관한다.
[단백질 획득]
1) 60-80 x 104cells/ml의 밀도로 Hi5 cell을 seeding 한다.
2) 180-200 x 104cells/ml의 밀도까지 Hi5 cell을 배양한 후 적정양의 Tertiary Baculovirus를 첨가한 후 28℃의 진탕배양기에서 90rpm 속도로 3일동안 배양한다.
3) 3일 배양 후 Hi5 cell을 튜브에 모은 후 4℃, 8000rpm의 조건으로 10분동안 원심 분리한다.
4) 단계 3)이 진행되는 동안 Roche Ni resin 5ml을 column에 넣은 후, [20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 30mM Imidazole] 용액 10ml를 흘려보낸다.
5) 단계 3)의 원심분리가 종료되면 상층액을 회수한 후 단계 4)에서 준비한 resin에 흘려보내준다.
6) [20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 30mM Imidazole] 용액 150ml를 흘려보낸다.
7) resin에 protein이 확인되면 다음 세 종류의 용액을 각각 15ml씩 흘려보낸다.
- 용액 1 : 20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 100mM Imidazole
- 용액 2 : 20 HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 300mM Imidazole
- 용액 3 : 20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl + 500mM Imidazole
8) SDS-PAGE를 통해 단백질을 확인한 후 농축한다.
9) 20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl 용액 9ml을 넣어 Imidazole을 1/10 희석한 후 다시 농축한다.
10) FPLC를 통해 SEC를 진행한 뒤 peak, SDS-PAGE를 확인하여 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 정제된 단백질을 수득했다 (20mM HEPES(pH 7.0) + 200mM NaCl).
(2) 비강투여된 물질의 생체 내 이미징
시간에 따른 Bsflagellin 및 상기 곤충세포에서 발현한 서열번호 63의 융합단백질의 생체 내 이미징을 다음 단계에 따라 확인하였다:
[실험의 준비]
1)8주령의 수컷 SKH1 mouse을 구입하여 순화 후 실험에 사용하였다.
2)서열번호 63 융합단백질의 비교 대상인 BsFlagellin은 Invivogen에서 구입하여 사용하였다.
[물질의 표지]
물질의 생체 내 추적을 위한 물질의 표지는 다음 단계에 따라 진행하였다
1)Flamma 774 NHS ester (pws1603, bioacts)을 1mg으로 희석하였다.
2)BsFlagellin 혹은 서열번호 63의 융합단백질을 Flamma 774 NHS ester와 혼합한다.
3)혼합된 물질을 4℃에서 3일동안 반응시킨다.
4)반응 종료 후 Amicon Ultra centrifugal filter unit을 통해 표지되지 않은 물질을 분리하였다.
5)분리된 물질은 BCA 정량법을 이용하여 농도를 결정하였다.
[생체 내 이미징 분석]
1)이전 단계에서 준비한 물질을 SKH1 마우스(n=2)에 10ug/head로 비강으로 주입하였다.
2)SKH1 마우스(n=1)에 PBS를 같은 용량으로 주입하였다.
3)생체 내 이미징 분석을 위해 마우스를 호흡 마취한다.
4)마취 한 마우스를 비강 주입 후 3, 6, 24 시간 후에 IVIS™ imaging system(Perkin Elmer)을 이용하여 마우스의 목 부분까지 형광 검출 영상을 얻었다.
이에 대한 결과를 도 9a 및 b에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, BsFlagellin(도 9b) 혹은 서열번호 63의 융합단백질(도 9a)을 비강투여한 결과, 모든 마우스의 olfactory epithelium 및 lymph node(Depp cervical, mandibular)에서 두 물질에 표지된 형광이 검출되었다.
물질 주입 24시간 후의 형광 검출 영상에서 BsFlagellin(도 9b)보다 서열번호 63의 융합단백질이 체내 흡수가 빠르게 진행됨을 확인할 수 있었다.
4. AMLN 식이에 의한 비알코올성 지방간질환 동물모델에서의 약리활성 평가
상기 실험방법에 따라 NASH 유도 모델의 군을 분리하고, 시험약물 처리를 나타내는 모식도를 도 10에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이 실험물질 투여 실시 후 AMLN diet를 급이한 모든 개체에서 G1 Normal diet control 그룹 대비 체중이 증가하였으며 실험물질인 MSP306 투여 그룹에서 물질투여 1주차 후 체중이 감소하였다.
실험물질 투여 후 주 1회 사료 섭취량을 측정한 결과 투여 기간 동안 G6 AMLN diet MSP306 high dose IV 고용량 정맥투여 그룹은 투여 시작일과 투여 후 1주에 G2 AMLN vehicle control 그룹 대비 유의한 수준으로 사료 섭취량이 감소하였다.
부검 시 적출한 간 조직의 상대 중량 결과에서 고용량의 MSP306 투여 그룹에서 유의하게 간 상대 중량이 감소하였고, 간 조직 내 TG Triglyceride(TG) 수치를 측정한 결과, 실험물질 MSP306 투여 그룹에서 용량의존적으로 간 조직 내 TG 수치가 감소하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 실험물질 투여 실시 후 12주에 측정한 Body Fat mass 결과에서 MSP306 투여 그룹에서 수치가 감소하는 경향을 보였으며, G6 AMLN diet MSP306 high dose IV 고용량 정맥투여 그룹에서 G2 AMLN diet vehicle control 그룹 대비 유의한 수준으로 fat mass 수치가 감소하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 경구 당부하 검사를 위해 부검 하루 전 하룻밤 동안 절식 후 2 g/kg의 glucose를 경구 투여하였고, 실험물질 투여 전 측정한 혈당 결과에서 실험물질 투여그룹이 G2 AMLN diet vehicle control 그룹과 비교하여 혈당이 유의하게 감소하였으며, 특히 G6 AMLN diet MSP306 IV 고용량 정맥투여 그룹에서 투여 후 120분까지 유의한 차이로 혈당 감소가 지속되었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 부검 시 적출한 간 조직을 고정하고 H&E 염색을 실시하여 간 조직의 NAFLD Activity Score(NAS)를 평가한 결과 실험물질 G5 AMLN diet high dose IN 고용량 비강투여군 및 G6 AMLN diet high dose IV 정맥투여 군에서 G2 AMLN diet vehicle control 그룹 대비 NAS 결과가 유의한 수준으로 감소하였으며, 부고환 지방 조직 내 adipocyte size 가 유의한 수준으로 감소하였다.
5. MCD 식이에 의한 비알코올성 지방간질환 동물모델에서의 약리활성 평가
상기 실험방법에 따라 NASH 유도 모델의 군을 분리하고, 시험약물 처리를 나타내는 모식도를 도 15에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이 실험물질 투여 실시 후 주 1회 체중을 관찰하였고, MCD diet를 급이한 모든 개체에서 G1 Normal diet control 그룹 대비 체중 감소하였고, 시험 종료 시까지 지속적으로 체중이 감소하였다.
실험물질 투여 첫날과 그 이후 매주 사료 섭취량을 측정하였고, 투여 첫날 실험물질 G6 MCD diet MSP306 IV 고용량 정맥투여 그룹은 G2 MCD diet vehicle control 그룹과 비교 시 유의한 수준으로 사료 섭취량이 감소하였지만 그 이후에는 유의한 사료 섭취량의 감소는 관찰되지 않았다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 부검 후 채취한 혈청을 이용하여 혈청학적 검사 결과를 실시하였고, 혈중 AST 결과에서 G6 MCD diet MSP306 IV 고용량 정맥 투여 그룹은 G2 MCD diet vehicle control 그룹과 비교하여 유의한 수준으로 혈중 AST, ALT, TG 수치가 감소하였다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 간 조직학적 검사에서 간 조직의 NAFLD activity score (NAS)를 평가한 결과, G4 MCD diet MSP306 low dose IN 저용량 비강 투여 그룹과 G5 MCD diet MSP306 high dose IN 고용량 비강 투여 그룹이 유의한 수준으로 NAFLD activity score 가 감소하였다
도 19에 나타낸 바와 같이, 간 조직의 섬유화 정도를 평가한 결과 G4 MCD diet MSP306 low dose IN 저용량 비강 투여 그룹, G5 MCD diet MSP306 high dose IN 고용량 비강 투여 그룹, G6 MCD diet MSP306 high dose IV 고용량 정맥 투여 그룹이 유의하게 fibrosis score와 fibrosis area가 감소하였다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 간 조직의 주요 섬유화 및 염증 조절인자들의 발현을 확인한 결과 MCD vehicle 그룹에 비하여 MCD MSP306 투여그룹에서 섬유화 및 염증 조절인자들의 발현이 유의하게 감소하였다.
항염증 및 조직재생관련 인자들의 발현양상에서는 MCD vehicle 그룹에 비하여 MCD MSP306 투여그룹에서 항염증 및 조직재생 관련 인자들의 발현이 상승하였다.
본 발명에 따른 조성물은 고지방식이 투여에 의해 유도된 대사증후군 및 비알코올성 지방간질환 동물모델에서 야생형 플라젤린과 비교해 현저히 향상된 예방 및 치료 효과를 나타내므로, 대사증후군 또는 간 질환 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Claims (24)

  1. 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 바실러스(Bacillus)속, 살모넬라(Salmonella)속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 비브리오(Vibrio) 속, 세라티아(Serratia) 속, 시겔라(Shigella) 속, 트레포네마(Treponema) 속, 레기오넬라(Legionella) 속, 보렐리아(Borrelia) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 바르토넬라(Bartonella) 속, 프로튜스(Proteus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 여시니아(Yersinia) 속, 캄필로박터(Campylobacter) 속, 로세부리아(Roseburia) 속 및 마리노박터(Marinobacter) 속으로 이루어진 군에서 선택된 미생물 유래의 플라젤린인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 듀블린(Salmonella Dublin), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 피브리솔벤스(Vibrio fibrisolvens), 세라티아 마세센스(Serratia marcesens), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 보렐리아 버그도페레이(Borrelia burgdorferei), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 바르토넬라 클라리제이애(Bartonella clarridgeiae), 프로튜스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에스테리키아 콜라이(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 여시니아 페스티스(Yersinia pestis), 캄필로박터(Campylobacter spp), 로세부리아(Roseburia spp) 및 마리노박터(Marinobacter spp)로 이루어진 군에서 선택된 미생물 유래의 플라젤린인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린은 TLR5 (toll-like receptor 5)에 의해 인식되는 보존된 서열(conserved sequence)을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단편은 야생형(wild-type) 플라젤린에서 초가변 영역(hypervariable region)이 제거된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단편은 야생형(wild type) 플라젤린의 C-말단 도메인 0, C-말단 도메인 1, C-말단 도메인 2, N-말단 도메인 2, N-말단 도메인 1, N-말단 도메인 0 및 상기 각 도메인들과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내는 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린의 변이체는 야생형(wild-type) 플라젤린과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내며 톨-유사 수용체 5(Toll-like receptor 5, TLR5) 자극 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 힌지(hinge)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 힌지는 CPPC 서열을 포함하는 4 내지 12개의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이는 상기 IgG4 Fc의 중쇄 간 이황화 결합 형성을 부여하는 돌연변이인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 위치 228에서 Ser이 Pro로 치환된 것(S228P), 위치 409에서 Arg이 Lys으로 치환된 것(R409K), 또는 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 위치 220에서 Ser이 Pro로 치환된 것(S220P), 위치 223에서 Gly이 Thr으로 치환된 것(G223T), 위치 224에서 Pro이 His으로 치환된 것(P224H) 및 위치 225에서 Pro이 Thr으로 치환된 것(P225T)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc의 C-말단 3번째 아미노산이 Leu에서 Pro으로 치환된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체의 N-말단 또는 C-말단이 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 결합된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 직접 연결되거나 또는 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 플라젤린, 이의 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc의 변이체는 서열번호 6 내지 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 링커는 상기 링커는 (GGGGS)n (n은 1 내지 5)의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61 또는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 상기 간 질환은 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염, 알코올성 지방간, 간염, 간 섬유화, 간 경변, 간 부전 및 간암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징을 하는 약학적 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 대사증후군은 당뇨, 대사증후군, 인슐린 저항성, 고지혈증 및 고혈압으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  22. 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인, 간 질환 또는 대사증후군 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  23. 간 질환 또는 대사증후군 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질의 용도로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 융합 단백질의 용도.
  24. 플라젤린(Flagellin), 이의 단편 또는 이의 변이체; 및 인간 IgG4 Fc의 변이체를 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 간 질환 또는 대사증후군 치료 방법으로서, 상기 인간 IgG4 Fc 변이체는 Fab 암(arm) 교환을 방지하는 돌연변이를 갖는 것인 간 질환 또는 대사증후군 치료 방법.
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