ES2229264T5 - Receptor il-17. - Google Patents

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Abstract

SE DESCUBREN RECEPTORES AISLADOS PARA IL ODIFICAN DICHOS RECEPTORES Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS FABRICADAS A PARTIR DE ELLOS. LOS RECEPTORES AISLADOS PUEDEN SER UTILIZADOS PARA REGULAR UNA RESPUESTA INMUNITARIA.

Description

Receptor IL-17.
Campo técnico de la invención
De un modo general, la presente invención se refiere al campo de los receptores de citoquinas y más específicamente a las proteínas receptoras de citoquinas que tienen actividad inmunorreguladora.
Antecedentes de la invención
Las citoquinas son moléculas semejantes a hormonas que regulan diversos aspectos de la respuesta inmunitaria o inflamatoria. Las citoquinas ejercen sus efectos uniéndose de un modo específico a receptores presentes en las células y transduciendo una señal en las células. Rouvier y col. (J. Immunol. 150: 5445; 1993) publicaron un ADNc novedoso que denominaron CTLA-8. La proteína CTLA-8 putativa es homóloga en un 57% a la secuencia de aminoácidos predicha de una fase de lectura abierta (ORF) presente en el herpesvirus saimiri (HSV) denominada HVS13 (Nicholas y col., Virol. 179:1 89,1990; Albrecht y col., J. Virol. 66: 5047; 1992). Sin embargo, no se conoce la función, si tuvieran alguna, ni de CTLA-8 ni de HVS13, ni se conoce un receptor o proteína de unión ni para CTLA-8 ni para HVS13. De este modo, antes de la presente invención, había una necesidad en la técnica para determinar la función de CTLA-8 y HVS13 y para identificar las moléculas receptoras o proteínas de unión que jueguen un papel en la función de estas proteínas.
Sumario de la invención
La presente invención identifica un receptor novedoso que se une a la IL-17 (CTLA-8) y a la HVS13, un homólogo vírico de la IL-17; se proporcionan los ADN que codifican el receptor novedoso y las proteínas receptoras novedosas. El receptor es una proteína transmembranal del tipo I; el receptor del ratón tiene 864 restos de aminoácidos, el receptor humano tiene 866 restos de aminoácidos. Las formas solubles del receptor pueden prepararse y usarse para regular respuestas inmunitarias en un sentido terapéutico; de acuerdo con esto, también se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden formas solubles del receptor novedoso. También se describen las formas delecionadas y las proteínas de fusión que comprenden el receptor novedoso y los homólogos de las mismas. También se proporcionan métodos para regular una respuesta inmunitaria y métodos para suprimir el rechazo de órganos y tejidos injertados. Estos y otros aspectos de la presente invención se harán evidentes en referencia a la siguiente descripción detallada de la invención.
Descripción detallada de la invención
Se expresaron una proteína IL-17 (CTLA-8) soluble y una ORF presente en el herpesvirus saimiri (HVS13) como proteínas de fusión que comprenden una región Fc de inmunoglobulinas y se usaron para rastrear células en busca de la expresión de un receptor para IL-17. Se encontró que las células EL4 del timoma de linfocitos T se unían a las proteínas de fusión HVS13/Fc así como a la CTLA8 (IL-17) murina /Fc. Se preparó una genoteca de ADNc a partir de las células EL4 y se rastreó en busca de expresión del receptor. El receptor es una proteína transmembranal del tipo I con 864 restos de aminoácidos, que se denomina IL-17R (CTLA-8R). Se prepararon diversas formas del IL-17R, incluyendo la proteína IL-17R/Fc, un IL-17R soluble que contiene el péptido de señalización y el dominio extracelular del IL-17R, y una construcción IL-17R/Flag® soluble. Se aisló un IL-17R humano a partir de una genoteca de linfocitos de sangre periférica mediante hibridación cruzada entre especies que muestra similitudes con el IL-17R murino. También se describen sondas y cebadores de oligonucleótidos.
IL-17, HVS13 y proteínas homólogas
EL CTLA-8 se refiere a un ADNc clonado a partir de un clon activado del hibridoma de linfocitos T (Rouvier y col., J. Immunol. 150: 5445; 1993). El análisis de transferencia Northern indicó que la transcripción de CTLA-8 fue muy específica de tejido. Se encontró que el gen CTLA-8 se cartografía en el sitio cromosómico 1a en los ratones y en el 2q31 en los seres humanos. Aunque Rouvier y col. nunca identificaron una proteína codificada por el gen CTLA-8, se encontró que la secuencia de aminoácidos predicha del CTLA-8 era homóloga en un 57% a la secuencia de aminoácidos predicha de una ORF presente en el herpesvirus Saimiri, HVS13. La proteína CTLA-8 se denomina en el presente documento interleuquina-17 (IL-17).
Se ha publicado la secuencia completa de nucleótidos del genoma del HVS (Albrecht y col., J. Virol. 66: 5047; 1992). Se describen estudios adicionales en una de las fases de lectura abierta (ORF) del HVS, HVS13, en Nicholas y col., Virol. 179:1 89; 1990. HVS13 es un gen tardío que está presente en el fragmento HindIII-G del HVS. Se cree que los antisueros desarrollados frente a los péptidos que derivan del HVS13 reaccionan con una proteína tardía (Nicholas y col., supra).
Tal como se describe en el documento USSN 08/462.353, una continuación en parte del documento USSN 08/410.
536, presentada el 23 de marzo de 1995, se expresaron la proteína CTLA-8 murina completa y una proteína de fusión CTLA-8/Fc, se analizaron y se encontró que actúan como un co-estímulo en la proliferación de los linfocitos T. Se identificó la IL-17 (CTLA-8) humana mediante el uso de sondas en una genoteca de linfocitos T humanos usando un fragmento de ADN que deriva a partir de PCR degenerada; también se espera que existan homólogos de la IL-17 (CTLA-8) en otras especies. También se expresaron una proteína HVS13 completa, así como una proteína de fusión HVS13/Fc, y se encontró que actúan de una manera similar a la proteína IL-17 (CTLA-8). Por otro lado, también es probable que otras especies de herpesvirus codifiquen proteínas homólogas a la que codifica HVS13.
Proteínas y análogos
La presente invención proporciona el IL-17R y homólogos del mismo aislados que tienen actividad inmunorreguladora. Tales proteínas están sustancialmente libres de sustancias endógenas contaminantes y, de un modo opcional, sin el patrón de glucosilación natural asociado. Los derivados del IL-17R dentro del alcance de la invención también incluyen diversas formas estructurales de la proteína primaria que retienen la actividad biológica. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, una proteína IL-17R puede encontrarse en la forma de sales ácidas o básicas, o puede encontrarse en la forma neutra. También pueden modificarse mediante oxidación o reducción restos de aminoácidos individuales.
La estructura primaria de aminoácidos puede modificarse conformando conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos, tales como grupos glucosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares, o creando mutantes de la secuencia de aminoácidos. Los derivados covalentes se preparan uniendo grupos funcionales particulares a las cadenas laterales de los aminoácidos o al extremo N- o C-terminal.
Las formas solubles del IL-17R también están dentro del alcance de la invención. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos predicha del IL-17R murino se muestran en las SEQ ID Nº: 1 y 2. El análisis por ordenador indicó que la proteína tiene un péptido de señalización N-terminal con un sitio de corte entre el aminoácido 31 y el 32. Los expertos en la técnica reconocerán que el sitio real de corte puede ser diferente del predicho por el análisis por ordenador. De este modo, se espera que el aminoácido N-terminal del péptido cortado esté dentro de los, aproximadamente, cinco aminoácidos a ambos lados del sitio de corte predicho. El péptido de señalización está seguido por un dominio extracelular de 291 aminoácidos, un dominio transmembranal de veintiún aminoácidos y una cola citoplásmica de 521 aminoácidos. El IL-17R soluble comprende el péptido de señalización y el dominio extracelular (restos 1 a 322 de la SEQ ID Nº: 1) o un fragmento del mismo. De un modo alternativo, pueden sustituirse los restos 1 a 31 de la SEQ ID Nº: 1 por un péptido de señalización diferente.
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos predicha del IL-17R humano se muestran en las SEQ ID Nº: 9 y 10. Este comparte muchas características con el IL-17R murino. El análisis por ordenador indicó que la proteína tiene un péptido de señalización N-terminal con un sitio de corte entre el aminoácido 27 y el 28. Los expertos en la técnica reconocerán que el sitio real de corte puede ser diferente del predicho por el análisis por ordenador. De este modo, se espera que el aminoácido N-terminal del péptido cortado esté dentro de los, aproximadamente, cinco aminoácidos a ambos lados del sitio de corte predicho. El péptido de señalización está seguido por un dominio extracelular de 293 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y una cola citoplásmica de 525 aminoácidos. El IL-17R soluble comprende el péptido de señalización y el dominio extracelular (restos 1 a 320 de la SEQ ID Nº: 1) o un fragmento del mismo. De un modo alternativo, puede sustituirse el péptido de señalización natural por un péptido de señalización diferente.
Otros derivados de la proteína IL-17R y de los homólogos de la misma dentro del alcance de la invención incluyen conjugados covalentes o agregados de la proteína o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tales como fusiones N-terminales o C-terminales de síntesis en cultivo recombinante. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia polipeptídica de señalización (o líder) en la región N-terminal de la proteína que, de un modo co-traduccional o post-traduccional, dirija la transferencia de la proteína desde su sitio de síntesis a su sitio de función dentro o fuera de la membrana celular o pared (por ejemplo, el líder del factor \alpha de la levadura).
Las fusiones de proteínas pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de las proteínas IL-17R y los homólogos (por ejemplo, poli-His). La secuencia de aminoácidos de las proteínas de la invención también puede estar unida a un péptido de identificación tal como el descrito por Hopp y col., Bio/Technology 6: 1204 (1988). Un péptido muy antigénico como ese proporciona un epítopo que se une de un modo reversible a un anticuerpo monoclonal específico, permitiéndose el análisis rápido y la purificación fácil de la proteína recombinante expresada. La secuencia de Hopp y col. también es cortada específicamente por la enteroquinasa de la mucosa bovina, permitiéndose la eliminación del péptido de la proteína purificada. Las proteínas de fusión coronadas con tales péptidos también pueden ser resistentes a la degradación intracelular en E. coli.
Las proteínas de fusión comprenden adicionalmente la secuencia de aminoácidos de un IL-17R unido a una región Fc de inmunoglobulinas. Una región Fc de ejemplo es una IgG1 humana que tiene las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos indicadas en la SEQ ID Nº: 4. también pueden usarse fragmentos de una región Fc, así como muteínas Fc como las descritas en el documento USSN 08/145.830, presentado el 29 de octubre de 1993. Dependiendo de la porción de la región Fc usada, una proteína de fusión puede expresarse en forma de un dímero, por medio de la formación de puentes disulfuro intercatenarios. Si las proteínas de fusión se hacen con las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo, es posible conformar un oligómero de proteína con tantas como cuatro regiones IL-17R.
En otra realización, el IL-17R y los homólogos del mismo comprenden adicionalmente un dominio de oligomerización en cremallera. Los dominios en cremallera se describen en el documento USSN 08/107.353, presentado el 13 de agosto de 1993, cuya pertinente descripción se incorpora en el presente documento como referencia. Los ejemplos de los dominios de cremalleras de leucina son los que se encuentran en el factor GCN4 de transcripción de la levadura y en una proteína de unión a ADN termoestable encontrada en el hígado de rata (C/EBP; Landschulz y col., Science 243: 1689, 1989), en las proteínas nucleares transformantes, fos y jun, que forman preferentemente un heterodímero (O'Shea y col., Science 245: 646, 1989; Turner y Tjian, Science 243: 1689, 1989), y en el producto génico del proto-oncogén murino c-myc (Landschulz y col., Science 240: 1759, 1988). Las proteínas fusogénicas de diversos virus diferentes, incluyendo paramixovirus, coronavirus, el virus del sarampión y muchos retrovirus, también poseen dominios de cremalleras de leucina (Auckland y Wild, Nature 338: 547, 1989; Britton, Nature 353: 394, 1991; Delwart y Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses 6: 703, 1990).
Los derivados del IL-17R también pueden usarse como inmunógenos, como reactivos en análisis in vitro, o como agentes de unión en procedimientos de purificación por afinidad. Tales derivados también pueden obtenerse mediante agentes de reticulación, tales como el éster de succinimida y M-maleimidobenzoilo y N-hidroxisuccinimida, en los restos de cisteína y lisina. Las proteínas de la invención también pueden unirse covalentemente a través de grupos laterales reactivos a diversos sustratos insolubles, tales como estructuras de agarosa activadas con bromuro cianógeno, activadas con bisoxirano, activadas con carbonildiimidazol o activadas con tosilo, o mediante absorción a superficies de poliolefina (con o sin reticulación con glutaraldehído). Una vez unidas a un sustrato, las proteínas pueden usarse para unir selectivamente (con fines de análisis o purificación) anticuerpos producidos contra el IL-17R o contra otras proteínas que sean similares al IL-17R, así como otras proteínas que se unan al IL-17R o sus proteínas homólogas.
La presente invención también incluye al IL-17R con o sin el patrón del glucosilación natural asociado. Las proteínas expresadas en los sistemas de expresión de mamíferos o de levaduras, por ejemplo, las células COS-7, pueden ser similares o ligeramente diferentes en su peso molecular y en el patrón de glucosilación a las moléculas naturales, dependiendo del sistema de expresión. La expresión de los ADN que codifican las proteínas de la invención en bacterias tales como E. coli proporciona moléculas sin glucosilar. Pueden producirse análogos mutantes funcionales de la proteína IL-17R o de los homólogos de la misma que tengan sitios de N-glucosilación inactivados mediante síntesis de oligonucleótidos y ligación o mediante técnicas de mutagénesis dirigida. Estas proteínas análogas pueden producirse en una forma homogénea hipocarbohidratada con un buen rendimiento usando los sistemas de expresión en levadura. Los sitios de N-glucosilación en las proteínas eucarióticas se caracterizan por el triplete de aminoácidos Asn-A_{1}-Z, en el que A_{1} es cualquier aminoácido excepto Pro, y Z es Ser o Thr. En esta secuencia, la asparagina proporciona un grupo amino lateral para la unión covalente de carbohidratos. Un sitio como ése puede eliminarse sustituyendo la Asn o el resto Z por otro aminoácido, delecionando la Asn o Z, o insertando un aminoácido que no sea Z entre A_{1} y Z, o un aminoácido distinto de Asn entre Asn y A_{1}.
Los derivados de la proteína IL-17R también pueden obtenerse mediante mutaciones del IL-17R natural o sus subunidades. Una proteína mutada IL-17R, tal como se denomina en el presente documento, es un polipéptido homólogo a una proteína IL-17R pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferentes del IL-17R natural debido a una o a una pluralidad de deleciones, inserciones o sustituciones. El efecto que cualquier mutación hace en un ADN que codifica un péptido IL-17R puede determinarse fácilmente analizando la capacidad del péptido IL-17R mutado para inhibir la co-estimulación de los linfocitos T o B mediante IL-17 (CTLA-8) o mediante proteínas homólogas, o la unión de proteínas que se unen específicamente a IL-17R (por ejemplo, anticuerpos o proteínas codificadas por el ADNc CTLA-8 o por la ORF HVS13). Por otro lado, la actividad de los análogos, muteínas, o derivados del IL-17R puede determinarse mediante cualquiera de los métodos de análisis descritos en el presente documento. Pueden hacerse mutaciones similares en los homólogos del IL-17R y analizarlos de una manera similar.
Los análogos biológicamente equivalentes de las proteínas de la invención pueden construirse, por ejemplo, haciendo diversas sustituciones de restos o secuencias o delecionando restos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden delecionarse o sustituirse restos de cisteína por otros aminoácidos para impedir la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos después de la renaturalización. Otros abordajes de mutagénesis implican la modificación de restos de aminoácidos dibásicos adyacentes para aumentar la expresión en los sistemas de levadura en los que está presente la actividad de la proteasa KEX2.
De un modo general, las sustituciones deben hacerse de un modo conservativo; es decir, los aminoácidos sustitutos más preferidos son aquellos que no afectan la capacidad de las proteínas de la invención de unir sus ligandos de una manera sustancialmente equivalente al mIL-17R o al hIL-17R naturales. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de aminoácidos de fuera del dominio o dominios de unión y la sustitución de aminoácidos que no alteren la estructura secundaria y/o terciaria del IL-17R y los homólogos del mismo. Los ejemplos adicionales incluyen la sustitución de un resto alifático por otro, tales como Ile, Val, Leu, o Ala entre ellos, o sustituciones de un resto polar por otro, tales como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Se conocen muy bien otras sustituciones conservativas
como esas, por ejemplo, las sustituciones de regiones enteras que tienen similares características de hidrofobia.
De un modo similar, cuando se adopta una estrategia de deleción o inserción, debe considerarse el potencial efecto de la deleción o inserción en la actividad biológica. Las subunidades de las proteínas de la invención pueden construirse delecionando restos o secuencias terminales o internos. Pueden prepararse fácilmente fragmentos del IL-17R que se unan a la IL-17 (por ejemplo, usando enzimas de restricción para delecionar porciones del ADN) y analizando su capacidad de unirse a la IL-17. Se proporcionan consejos adicionales acerca de los tipos de mutaciones que pueden hacerse mediante una comparación de la secuencia del IL-17R con proteínas que tienen estructuras similares, así como mediante la realización de un análisis estructural de las proteínas de la invención.
Por supuesto, las mutaciones en las secuencias de nucleótidos construidas para la expresión de análogos del IL-17R (CTLA-8R) deben conservar la fase de lectura abierta de las secuencias codificantes y, preferentemente, no crearán regiones de complementariedad que podrían hibridar para producir estructuras secundarias de ARNm tales como bucles u horquillas que afectarían de un modo adverso a la traducción del ARNm del receptor. Aunque puede predeterminarse un sitio para la mutación, no es necesario predeterminar específicamente la naturaleza de la mutación. Por ejemplo, para seleccionar las características óptimas de los mutantes en un sitio dado, puede realizarse mutagénesis aleatoria en el codón diana y rastrear las proteínas víricas mutadas y expresadas en busca de la actividad
deseada.
No todas las mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína IL-17R o un homólogo de la misma se expresarán en un producto final, por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos para aumentar la expresión, principalmente para evitar los bucles de estructura secundaria en el ARNm transcrito (véase el documento EPA 75.444A, incorporado en el presente documento por referencia), o para proporcionar codones que se traduzcan más fácilmente mediante el hospedador seleccionado, por ejemplo, los codones de preferencia de E. coli bien conocidos para la expresión en E. coli.
Las mutaciones pueden introducirse en loci particulares mediante síntesis de oligonucleótidos que contengan una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permitan una ligación a los fragmentos de la secuencia natural. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácidos deseada.
De un modo alternativo, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis específica de sitio y dirigida por oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado que tenga codones particulares alterados de acuerdo con la sustitución, deleción o inserción requerida. Los métodos de ejemplo para hacer las alteraciones indicadas anteriormente se describen en Walter y col. (Gene 42: 133, 1986); Bauer y col. (Gene 37: 73, 1985); Craik (Biotechniques, enero de 1985,12-19); Smith y col. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); y las patentes de Estados Unidos Nº 4.518.584 y 4.737.462 describen técnicas adecuadas y se incorporan en el presente documento como referencia.
Debido a la degeneración del código, puede haber una considerable variación en las secuencias de nucleótidos que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Otras realizaciones incluyen secuencias capaces de hibridar en condiciones moderadamente estrictas (solución de prelavado de 5 X SSC, SDS 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y condiciones de hibridación de 50ºC, 5 X SSC, toda una noche) con las secuencias de ADN que codifican el IL-17R, y otras secuencias que están degeneradas con respecto a la que codifica el IL-17R. En una realización preferida, los análogos del IL-17R son, al menos, aproximadamente, idénticos en un 70% de la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de las proteínas IL-17R tal como se indica en la SEQ ID Nº: 1 ó SEQ ID Nº: 9. De un modo similar, los análogos de los homólogos del IL-17R son, al menos, aproximadamente, idénticos en un 70% de la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de las proteínas homólogas naturales. En una realización más preferida, los análogos del IL-17R o los homólogos del mismo son, al menos, aproximadamente, idénticos en un 80% de la secuencia de aminoácidos a la forma natural de las proteínas de la invención.
El porcentaje de identidad puede determinarse usando un programa informático, por ejemplo, el programa informático GAP descrito por Devereux y col. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) y disponible en el grupo de genética por ordenador de la universidad de Wisconsin (UWGCG). Para los fragmentos que derivan de la proteína IL-17R, la identidad se calcula en base a la porción de la proteína IL-17R que está presente en el fragmento. Pueden usarse métodos similares para analizar los homólogos del IL-17R.
La capacidad de los análogos del IL-17R de unirse al CTLA-8 puede determinarse analizando la capacidad de los análogos para inhibir la proliferación de los linfocitos T inducida por la IL-17 (CTLA-8). De un modo alternativo, pueden usarse análisis adecuados, por ejemplo, un enzimoinmunoanálisis o una transferencia por puntos, empleando CTLA-8 o HSV13 (o un homólogo de los mismos que se una al IL-17R natural) para valorar la capacidad de los análogos del IL-17R de unirse al CTLA-8. Tales métodos son bien conocidos en la técnica.
Las proteínas IL-17R y los análogos descritos en el presente documento tendrán numerosos usos, incluyendo la preparación de composiciones farmacéuticas. Las proteínas de la invención también serán útiles para preparar kits que se usan para detectar la IL-17 o el IL-17R, por ejemplo, en especímenes de pacientes. Tales kits también se usarán para detectar la interacción de la IL-17 y el IL-17R, tal como se necesita cuando se rastrea en busca de antagonistas o miméticos de esta interacción (por ejemplo, péptidos o pequeñas moléculas que inhiban o imiten, respectivamente, la interacción). Es útil en tales kits una diversidad de formatos de análisis, que incluyen (pero no están limitados a) ELISA, transferencia por puntos, análisis de unión en fase sólida (tales como los que usan un biosensor), análisis de formato rápido y bioanálisis.
Expresión de receptores recombinantes para la IL-17
Las proteínas de la presente invención se producen, preferentemente, mediante métodos del ADN recombinante insertando una secuencia de ADN que codifica la proteína IL-17R o un homólogo de la misma en un vector de expresión recombinante y expresando la secuencia de ADN en un sistema de expresión microbiano recombinante en condiciones que promuevan la expresión. Las secuencias de ADN que codifican las proteínas proporcionadas por esta invención pueden montarse a partir de fragmentos de ADNc y engarzadores cortos de oligonucleótidos o a partir de una serie de oligonucleótidos, para proporcionar un gen sintético que es capaz de ser insertado en un vector de expresión recombinante y expresado en una unidad transcripcional recombinante.
Los vectores de expresión recombinantes incluyen fragmentos de ADN sintéticos o derivados de ADNc que codifican el IL-17R, homólogos, o análogos bioequivalentes, operativamente unidos a elementos de regulación transcripcional o traduccional adecuados que derivan de genes de mamíferos, microbianos, víricos o de insectos. Tales elementos de regulación incluyen un promotor transcripcional, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios adecuados de unión al ribosoma en el ARNm, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción, tal como se describe en detalle más adelante. La capacidad de replicación en un hospedador se confiere, normalmente, por un origen de replicación y puede incorporarse, adicionalmente, un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes.
Las regiones de ADN están operativamente unidas cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el ADN de un péptido de señalización (líder para la secreción) se une operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma esta unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado de tal forma que permita la traducción. De un modo general, estar operativamente unidos significa contiguo y, en el caso de los líderes para la secreción, contiguo y en fase de lectura. Las secuencias de ADN que codifican el IL-17R o los homólogos que deben ser expresados en un microorganismo, preferentemente, no contendrán intrones que podrían hacer terminar la transcripción del ADN en ARNm de un modo prematuro.
Los vectores de expresión útiles en el uso con bacterias pueden comprender un marcador de selección y un origen de replicación bacteriano que deriven de plásmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37.017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, Estados Unidos). Estas secciones de "cadenas principales" del pBR322 se combinan con un promotor apropiado y con la secuencia estructural a ser expresada. Típicamente, E. coli se transforma usando derivados del pBR322, un plásmido que deriva de una especie de E. coli (Bolivar y col., Gene 2: 95, 1977). El pBR322 contiene genes de resistencia a la ampicilina y la tetraciclina y, de este modo, proporciona un medio sencillo para identificar las células transformadas.
Los promotores que se usan comúnmente en los vectores de expresión microbianos recombinantes incluyen el de la \beta-lactamasa (penicilinasa) y el sistema promotor de la lactosa (Chang y col., Nature 275: 615, 1978; y Goeddel y col., Nature 281: 544, 1979), el sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; y el documento EPA 36.776) y el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412, 1982). Un sistema de expresión bacteriano particularmente útil emplea el promotor P_{L} del fago \lambda y el represor termolábil cI857ts. Los vectores plasmídicos disponibles en la colección americana de cultivos tipo que incorporan derivados del promotor P_{L} del fago \lambda incluyen el plásmido pHUB2, residente en la cepa JMB9 de E. coli (ATCC 37.092) y pPLc28, residente en la cepa RR1 de E. coli (ATCC 53.082).
Las secuencias promotoras adecuadas en los vectores para levaduras incluyen los promotores de la metalotioneína, quinasa del 3-fosfoglicerato (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas glucolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland y col., Biochem. 17: 4900, 1978), tales como la enolasa, deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato, hexoquinasa, descarboxilasa del piruvato, fosfofructoquinasa, isomerasa de la glucosa-6-fosfato, mutasa del 3-fosfoglicerato, quinasa del piruvato, isomerasa de las triosafosfato, isomerasa de la fosfoglucosa, y glucoquinasa. Los vectores y promotores adecuados para usar en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en R. Hitzeman y col., documento EPA 73.657.
Los vectores de levaduras preferidos pueden montarse usando secuencias de ADN del pBR322 para la selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen replicación) y secuencias de ADN de levadura que incluyen un promotor ADH2 reprimible por glucosa y el líder para la secreción del factor \alpha. El promotor ADH2 ha sido descrito por Russell y col. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y por Beier y col. (Nature 300: 724, 1982). El líder del factor \alpha de la levadura, que dirige la secreción de las proteínas heterólogas, puede insertarse entre el promotor y el gen estructural a ser expresado. Véase, por ejemplo, Kurjan y col., Cell 30: 933, 1982; y Bitter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. La secuencia líder puede modificarse para contener, cerca de su extremo 3', uno o más sitios de restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia líder a los genes foráneos.
Las secuencias de control de la transcripción y la traducción en los vectores de expresión que se usan en células de vertebrados para transformar pueden proporcionarse mediante fuentes víricas. Por ejemplo, los promotores e intensificadores usados comúnmente derivan del virus de polioma, del adenovirus 2, del virus 40 del simio (SV40), y del citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN que derivan del genoma vírico del SV40, por ejemplo, el origen del SV40, el promotor temprano y tardío, el intensificador y los sitios de procesamiento y poliadenilación pueden usarse para proporcionar los otros elementos genéticos requeridos para la expresión de una secuencia de ADN heteróloga. Los promotores temprano y tardío son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente a partir del virus en forma de un fragmento que también contiene el origen de replicación vírico del SV40 (Fiers y col., Nature 273: 113, 1978). También pueden usarse fragmentos del SV40 más pequeños o mayores, con la condición de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio HindIII hasta el sitio BglII localizado en el origen de replicación vírico. Adicionalmente, pueden utilizarse secuencias de señalización y/o control de promotores genómicos víricos con la condición de que tales secuencias de control sean compatibles con la célula hospedadora elegida. Los vectores de ejemplo pueden construirse tal como se describe en Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983).
Puede construirse un sistema útil para la expresión estable de alto nivel de ADNc de receptores de mamíferos en células C127 epiteliales mamarias y murinas como se describe, sustancialmente, en Cosman y col. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986). Un vector eucariótico preferido para la expresión del ADN del IL-17R se denomina pDC406 (McMahan y col., EMBO J. 10: 2821, 1991), e incluye secuencias reguladoras que derivan del SV40, del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y del virus de Epstein-Barr (EBV). Otros vectores preferidos incluyen el pDC409 y el pDC410, que derivan del pDC406. El pDC410 deriva del pDC406 mediante sustitución del origen de replicación del EBV consecuencias que codifican el antígeno T grande del SV40. El pDC409 difiere del pDC406 en que se ha delecionado un sitio de restricción BglII de fuera del sitio de multiclonación, haciéndose único el sitio BglII de dentro del sitio de multiclonación.
Una línea celular útil que permite la replicación episómica de vectores de expresión, tales como el pDC406 y el pDC409, que contienen el origen de replicación del EBV, es la CV-1/EBNA (ATCC CRL 10.478). La línea celular CV-1/EBNA deriva por transfección con un gen que codifica el antígeno 1 nuclear del virus de Epstein-Barr (EBNA-1) de la línea celular CV-1 y expresa de un modo constitutivo el EBNA-1 controlado por el intensificador/promotor inmediatamente temprano del CMV humano.
Células hospedadoras
Las células hospedadoras transformadas son células que han sido transformadas o transfectadas con vectores de expresión construidos usando técnicas del ADN recombinante y que contienen secuencias que codifican las proteínas de la presente invención. Las células hospedadoras transformadas pueden expresar la proteína deseada (IL-17R u homólogos del mismo), pero las células hospedadoras transformadas con fines de clonación o amplificación del ADN de la invención no necesitan expresar la proteína. Preferentemente, las proteínas expresadas se secretarán en el sobrenadante del cultivo, dependiendo del ADN seleccionado, pero pueden depositarse en la membrana celular.
Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de proteínas víricas incluyen células procariotas, levaduras o eucariotas superiores bajo el control de los promotores apropiados. Los procariotas incluyen organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, E. coli o Bacillus spp. Las células eucariota superiores incluyen líneas celulares establecidas con origen en mamíferos, como se describe más adelante. También pueden emplearse los sistemas de traducción sin células para producir proteínas víricas usando ARN que derive de las construcciones de ADN descritas en el presente documento. Los vectores de clonación y expresión apropiados para el uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras y de mamíferos se describen en Pouwels y col. (Cloning Vectors. A Laboratory Manual,
Elsevier, Nueva York, 1985), cuya descripción pertinente se incorpora en el presente documento como referencia.
Los hospedadores de expresión procariotas pueden usarse para la expresión del IL-17R o los homólogos que no requieran un procesamiento proteolítico y de puentes disulfuro amplio. Generalmente, los vectores de expresión procariotas comprenden uno o más marcadores de selección fenotípica, por ejemplo, un gen que codifique proteínas que confieran resistencia frente a antibióticos o suministro de un requerimiento autotrófico, y un origen de replicación reconocido por el hospedador para asegurar la amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros por preferencia.
El IL-17R recombinante también puede expresarse en hospedadores de levaduras, preferentemente, de especies de Saccharomyces, tales como S. cerevisiae. También pueden emplearse levaduras de otros géneros, tales como Pichia o Kluyveromyces. Generalmente, los vectores de levaduras contendrán un origen de replicación del plásmido 2 \mu de levadura o una secuencia de replicación autónoma (ARS), promotor, ADN que codifique la proteína vírica, secuencias para la poliadenilación y la terminación de la transcripción y un gen de selección. Preferentemente, los vectores de levaduras incluirán un origen de replicación y un marcador de selección que permita la transformación de tanto levaduras como E. coli, por ejemplo, el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen trp1 de S. cerevisiae, que proporciona un marcador de selección de una cepa mutante de levaduras carente de la capacidad de crecer en triptófano, y un promotor que derive de un gen de levadura muy expresado para inducir la transcripción de una secuencia estructural cadena abajo. De este modo, la presencia de la disfunción del trp1 en el genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona un ambiente eficaz para la detección de la transformación mediante crecimiento en ausencia del triptófano.
Los protocolos de transformación de levaduras adecuados son conocidos por los expertos en la técnica; la técnica de ejemplo se describe por INEN y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978, que selecciona transformantes Trp^{+} en medio de selección que consiste en extracto de levadura 0,67%, casaminoácidos 0,5%, glucosa 2%, adenina 10 \mug/ml y uracilo 20 \mug/ml. Las cepas hospedadoras transformadas con vectores que comprenden el promotor ADH2 pueden hacerse crecer para la expresión en un medio rico que consiste en extracto de levadura 1%, peptona 2% y glucosa 1% complementado con adenina 80 \mug/ml y uracilo 80 \mug/ml. La desrepresión del promotor ADH2 ocurre después del agotamiento de la glucosa del medio. Los sobrenadantes brutos de levadura se recogen mediante filtración y se mantienen a 4ºC antes de la purificación adicional.
Pueden emplearse diversos sistemas de cultivo de células de mamífero o de insecto para expresar la proteína recombinante. Se examinan los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos en Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23: 175, 1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector apropiado incluyendo, por ejemplo, las líneas celulares CV-1/EBNA (ATCC CRL 10.478), células L, C127, 3T3, del ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos que no se transcriben tales como un origen de replicación, un promotor adecuado y un intensificador unidos al gen a ser expresado, y otras secuencias que no se transcriben flanqueantes 5' ó 3', y secuencias que no se traducen 5' ó 3', tales como los sitios de unión al ribosoma, un sitio de poliadenilación, sitios de procesamiento donadores y aceptadores, y secuencias de terminación de la transcripción necesarias.
Purificación de receptores para la IL-17
El IL-17R, los homólogos o análogos purificados se preparan cultivando sistemas de hospedador/vector adecuados para expresar los productos recombinantes de la traducción de los ADN de la presente invención que, seguidamente, se purifican a partir del medio de cultivo o a partir de extractos celulares. Por ejemplo, los sobrenadantes de los sistemas que secretan la proteína recombinante en el medio de cultivo se pueden concentrar primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon.
Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender una estructura opuesta de moléculas de proteína o lectina o anticuerpo unidas a un soporte adecuado. De un modo alternativo, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dimetilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa o de otros tipos empleados comúnmente en la purificación de proteínas. De un modo alternativo, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Los grupos sulfopropilo son los preferidos. La cromatografía de filtración en gel también proporciona un medio para purificar las proteínas de la invención.
La cromatografía de afinidad es un método particularmente preferido para purificar el IL-17R y los homólogos del mismo. Por ejemplo, puede purificarse un IL-17R expresado en forma de una proteína de fusión que comprende una región Fc de inmunoglobulinas usando la cromatografía de afinidad con la proteína A o la proteína G. Por otro lado, puede purificarse una proteína IL-17R que comprende un dominio de oligomerización en cremallera en una resina que comprende un anticuerpo específico frente al dominio de oligomerización en cremallera. También pueden ser útiles los anticuerpos monoclonales frente a la proteína IL-17R en la purificación mediante cromatografía por afinidad, utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica. También puede usarse un ligando (por ejemplo, IL-17 o HVS-13) para preparar una matriz de afinidad para la purificación por afinidad del IL-17R.
Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución y fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios hidrófobos para RP-HPLC, por ejemplo, gel de sílice que tenga grupos metilo u otros grupos alifáticos pendientes, para purificar adicionalmente una composición de IL-17R. También pueden emplearse algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una proteína recombinante homogénea.
La proteína recombinante producida en el cultivo bacteriano se aísla, normalmente, mediante extracción inicial a partir de los sedimentos celulares, seguido de una o más etapas de concentración, precipitación por sales, cromatografía de intercambio iónico acuoso o cromatografía de exclusión por tamaño. Finalmente, puede emplearse una cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en las etapas de purificación final. Las células microbianas empleadas en la expresión de la proteína vírica recombinante pueden romperse mediante cualquier método conveniente, incluyendo los ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o uso de agentes de lisis celular.
La fermentación de las levaduras que expresan la proteína de la invención en forma de una proteína secretada simplifica mucho la purificación. La proteína recombinante secretada que proviene de una fermentación a gran escala puede purificarse mediante métodos análogos a los descritos en Urdal y col. (J. Chromatog. 296: 171, 1984). En este antecedente se describen dos etapas de HPLC de fase inversa secuenciales para la purificación del GM-CSF humano recombinante en una columna preparativa de HPLC.
La proteína sintetizada en cultivos recombinantes se caracteriza por la presencia de componentes celulares, incluyendo proteínas, en cantidades y en un carácter que depende de las etapas de purificación que se han llevado a cabo para recuperar la proteína de la invención a partir del cultivo. De un modo ordinario, estos componentes tendrán origen en las levaduras, procariotas o eucariota superiores no humanos y, preferentemente, están presentes en cantidades contaminantes inocuas, en el orden de menos del, aproximadamente, 1% en peso. Adicionalmente, el cultivo celular recombinante permite la producción de las proteínas de la invención sin otras proteínas que pueden estar normalmente asociadas con las proteínas tal como se encuentran en la naturaleza en las especies de origen.
Administración de las composiciones del IL-17R
La presente invención proporciona métodos para usar composiciones terapéuticas que comprenden una cantidad eficaz de una proteína y un diluyente y vehículo adecuados, y métodos para regular una respuesta inmunitaria. El uso del IL-17R o los homólogos junto con receptores de citoquinas solubles o citoquinas, u otras moléculas inmunorreguladoras también se contempla. Por otro lado, el ADN que codifica el IL-17R soluble también será útil; un tejido u órgano a ser trasplantado puede ser transfectado con el ADN mediante cualquier método conocido en la técnica. De este modo, el órgano o tejido expresa el IL-17R soluble, que actúa en el área localizada del injerto para suprimir el rechazo del injerto. También mostrarán eficacia métodos similares que comprendan la administración de tales ADN en el sitio del injerto a la hora de mejorar el rechazo del injerto.
Para el uso terapéutico, la proteína purificada se administra a un paciente, preferentemente, un ser humano, para el tratamiento de una manera adecuada con la indicación. De este modo, por ejemplo, las composiciones de la proteína IL-17R administradas para regular la función inmunitaria pueden administrarse mediante una inyección de dosis rápida, infusión continua, liberación sostenida a partir de implantes, u otra técnica adecuada. De modo típico, se administrará un agente terapéutico en la forma de una composición que comprenda el IL-17R purificado, junto con vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Tales vehículos serán atóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas.
De un modo ordinario, la preparación de tales composiciones de proteínas conlleva la combinación de la proteína de la invención con tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de, aproximadamente, 10 restos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión y otros estabilizantes y excipientes. Son ejemplos de diluyentes apropiados la solución salina neutra o la solución salina mezclada con seroalbúmina conespecífica. Preferentemente, el producto se formula en forma de liofilizado usando soluciones apropiadas de excipientes (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Las dosis apropiadas pueden determinarse en estudios. La cantidad y frecuencia de la administración dependerá, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y la gravedad de la indicación a ser tratada, de la respuesta deseada, del estado del paciente y demás.
Los receptores de la IL-17 (CTLA-8) pueden administrarse con el fin de inhibir la proliferación de los linfocitos T o para inhibir la activación de los linfocitos T. De este modo, el IL-17R soluble es probable que sea útil para prevenir o tratar el rechazo de órganos o injertos, las enfermedades autoinmunitarias, alergia o asma. Las proteínas receptoras de la invención también serán útiles para la prevención o tratamiento de las enfermedades inflamatorias en las que los linfocitos T activados juegan un papel. De modo similar, el HVS13 y los homólogos del mismo estimulan la proliferación de los linfocitos B y la secreción de inmunoglobulinas; de este modo, los receptores que se unen a HVS13 o CTLA-8 serán útiles in vivo para inhibir la proliferación de células B o la secreción de inmunoglobulinas. Los receptores del CTLA-8 también serán útiles para inhibir la unión del HVS13 o del CTLA-8 a las células que expresan el IL-17R.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar y no para limitar. Los expertos en la técnica reconocerán que pueden hacerse variaciones de la invención realizada en los ejemplos, especialmente a la luz de las enseñanzas de diversos antecedentes citados en el presente documento, cuyas descripciones se incorporan como referencia.
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Ejemplo 1
Este ejemplo describe la identificación de células que expresan un receptor (o estructura opuesta) para HVS13/
mCTLA-8. Se preparó una proteína quimérica (HVS13/Fc de tipo II) que consiste en una región Fc de una inmunoglobulina humana (SEQ ID Nº: 4) seguida de los aminoácidos 19 a 151 del HVS13 (SEQ ID Nº: 8). Se construyó una CTLA8 murino/Fc (mCTLA-8/Fc) fusionando los aminoácidos 22 a 150 del mCTLA-8 (SEQ ID Nº: 6) a la región Fc de la IgG1 humana. Se construyó una proteína Fc control mediante un método similar. Se expresaron las proteínas HVS13/Fc y mCTLA-8 y se usaron para identificar fuentes celulares mediante citometría de flujo.
Se incubaron previamente las células (1 x 10^{6}) en hielo durante 30 minutos en 100 \mul de tampón FACS (PBS, FCS 1% y NaN_{3} 0,1%) que contenía suero normal de cabra 2% y suero normal de conejo 2% para bloquear la unión inespecífica. Se añadieron 100 \mul de HVS13/Fc, mCTLA-8/Fc o proteína Fc de control a 5 \mug/ml y se incubó en hielo durante 30 minutos. Después de lavar, las células se tiñeron con anti-IgG humana (específica de Fc) marcada con biotina seguido de estreptavidina conjugada con PE (Becton Dickson & Co, Mountain View, CA) en 100 \mul de tampón FACS. Seguidamente, se lavaron las células y se analizaron usando un FACScan (Becton Dickinson). Se analizaron un mínimo de 5000 células en cada muestra. Se seleccionaron más de una docena de líneas celulares y se encontró que las proteínas de fusión HVS13/Fc y mCTLA-8/Fc se unían específicamente a la línea celular EL4 del timoma murino. Estas células no se unían a la proteína de fusión control/Fc.
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Ejemplo 2
Este ejemplo describe la clonación del gen que codifica el IL-17R. Después de la identificación de una fuente de una estructura opuesta al HVS13, se rastreó una genoteca de expresión de las EL4 de mamífero mediante el método autorradiográfico de unión en portaobjetos (Gearing y col., EMBO J. 8: 3667, 1989). Se mantuvieron las células CV1/EBNA en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero fetal de ternera (FCS) 10% (vol./vol.) a 37ºC en una atmósfera húmeda que contenía CO_{2} 10% y con dos pases a la semana. Se transfectaron monocapas de células CV1/EBNA en subconfluencia sobre portaobjetos con cámara tratados con fibronectina (Labtek) mediante un procedimiento con DEAE-dextrano mediado por cloroquina con ADN plasmídico que provenía de transformantes mezclados (2000 transformantes por conjunto) de la genoteca de ADNc de las EL4 murinas.
Se analizaron las células CV1/EBNA transfectadas con los conjuntos de ADNc de las EL4 murinas en busca de unión a la HVS13/Fc dos días después de la transfección usando la unión de anti-IgG humana de cabra marcada con [^{125}I] y autorradiografía en portaobjetos. Se lavaron las monocapas de células transfectadas con medio de unión (RPMI 1640 que contiene seroalbúmina bovina 1% y leche desnatada en polvo 50 mg/ml), seguidamente, se incubaron con 1 \mug/ml de HVS13/Fc durante una hora a temperatura ambiente. Se lavaron las células y se incubaron con anti-IgG humana de cabra marcada con ^{125}I (New England Nuclear Cambridge, MA). Las células se lavaron dos veces con medio de unión, tres veces con PBS, y se fijaron en PBS que contenía glutaraldehído 2,5% durante 30 minutos, se lavaron dos veces más con PBS y se dejaron secar al aire. Seguidamente, los portaobjetos con cámara se sumergieron en emulsión fotográfica GTNB-2 de Kodak y se expusieron durante 3 días a 4ºC antes de revelar.
Se transfectaron células CV1/EBNA con 40 conjuntos de, aproximadamente, 2000 ADNc. Se encontró que dos conjuntos de ADNc conferían unión a la proteína HVS13/Fc. Estos conjuntos se dividieron en conjuntos de 100 ADNc y, subsecuentemente, hasta clones individuales. Se aislaron dos clones de ADNc únicos. Se transfectaron células CV1/EBNA con estos clones para determinar si la proteína codificada confería, de este modo, unión tanto a la HVS13/Fc como a la mCTLA-8/Fc. Tanto la HVS/Fc como la mCTLA-8/Fc se unían a las células CV1/EBNA transfectadas con el ADNc clonado, pero no a las células transfectadas con el vector vacío. El control/Fc no se unía a ninguna de ellas.
Mediante la secuenciación de estos clones se encontró que contenían un inserto de 3,2 kb y de 1,7 kb derivado del mismo ARNm. El clon de 3,2 kb contenía una fase de lectura abierta de 2595 pb rodeada de 120 pb en la secuencia no codificante 5' y de 573 pb en la secuencia no codificante 3'. No había codones de terminación en fase cadena arriba del inicio predicho de metionina, que está precedido por un resto de purina (guanina) en la posición -3, que es la más importante indicación de un buen sitio de inicio de la traducción (Kozak, Mol. Cell. Biol. 9: 5134, 1989). También tiene una guanina en la posición +4, que lo hace un inicio de traducción óptimo. Es previsible que la fase de lectura abierta codifique una proteína transmembranal del tipo I de 864 aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos predicha se muestran en las SEQ ID Nº 1 y 2.
El análisis por ordenador indicó que la proteína tiene un péptido de señalización N-terminal con un sitio de corte entre los aminoácidos 31 y 32. El péptido de señalización está seguido de un dominio extracelular de 291 aminoácidos, un dominio transmembranal de veintiún aminoácidos, y una cola citoplásmica de 521 aminoácidos. Hay ocho sitios potenciales de glucosilación ligada a N en el dominio extracelular de la proteína. El peso molecular predicho de esta proteína es 97,8 kilodaltons con un punto isoeléctrico estimado de 4,85. La comparación de tanto la secuencia de nucleótidos como la de aminoácidos con las bases de datos GenBank o EMBL no encontró homología significativa consecuencias de nucleótidos y de proteínas conocidas.
Para determinar la distribución celular y tisular del ARNm del IL-17R, se examinó ARN poli(A)^{+} que provenía de diversas líneas celulares o tejidos murinos mediante análisis de transferencia Northern, usando el ADNc del IL-17R como sonda. Se compraron filtros que contenían ARN poli(A)+ (2 \mug por línea) de diversos tejidos a Clontech (Palo Alto, CA). Se aisló el ARN poliadenilado de diversas células o líneas celulares, se fraccionó (2 \mug por línea) en un gel de agarosa 1%-formaldehído y se transfirió a una membrana de nailon Hybond (Amersham). Los filtros se sometieron a la sonda con una sonda de ARN anti-sentido de ARN que corresponde a la región codificante del ADNc del IL-17R. Se realizó la hibridación a 63ºC seguida de tres lavados en 0,2% x SSC, SDS 0,1% a 68ºC. Las membranas se expusieron durante 8 a 48 horas a -70ºC.
La sonda del IL-17R hibridó con una especie única de ARNm de, aproximadamente, 3,7 kb, en todos los tejidos. Dentro de los tejidos examinados, se observaron señales de hibridación fuertes en el bazo y el riñón. Se observaron señales moderadas en el pulmón y en el hígado y señales débiles en el cerebro, corazón, músculo esquelético y testículos. Se detectaron ARNm de un tamaño similar en las siguientes células y líneas celulares: células epiteliales del hígado fetal (D11), fibroblastos (3T3), células epiteliales del intestino de rata (1CE6), linfocitos B esplénicos, células musculares (BB4), mastocitos (H7), células del timo negativas triples (TN), pre-linfocitos B (70Z/3), hibridoma de linfocitos T (EL4); y los clones de linfocitos T 7C2 y D10. Se encontró que todas las líneas celulares analizadas expresaban el ARNm del IL-17R, lo que sugiere una expresión ubicua del mensajero del IL-17R.
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Ejemplo 3
Este ejemplo describe la construcción de una construcción para expresar una proteína IL-17R/Flag® soluble denominada IL17R/Flag. La IL17R/Flag® contiene una secuencia líder y la región del IL-17R del aminoácido 1 al aminoácido 322 (SEQ ID Nº: 1) y el octapéptido denominado Flag® (SEQ ID Nº: 3). Esencialmente, la construcción se prepara como se describe para otras construcciones solubles, ligando un fragmento de ADN que codifica los aminoácidos 1 a 322 de la SEQ ID Nº: 1 (preparado como se describe en el ejemplo 4) a un vector de expresión apropiado que contiene una secuencia líder adecuada. Se transfecta una línea celular adecuada tal como la línea celular de riñón de mono CV-1/EBNA (ATCC CRL 10.478) con la construcción de ADN resultante. La IL-17R/Flag® puede purificarse usando una columna de afinidad de anticuerpos para Flag® y analizarse su actividad biológica usando cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.
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Ejemplo 4
Este ejemplo describe la construcción de una construcción de ADN del IL-17R para expresar una proteína de fusión IL17R/Fc. Se construyó una forma soluble del IL-17R fusionado con la región Fc de la IgG1 humana en el vector de expresión de mamíferos pDC409 del siguiente modo. Se sintetizaron un par de cebadores de oligonucleótidos que contenían una secuencia con sentido y una secuencia antisentido del IL-17R. El cebador con sentido contenía un sitio SalI en el extremo 5' del ADNc y el cebador antisentido contenía un sitio BglII y contenía el IL-17R cortado justo antes de la región transmembranal y un codón de terminación. El fragmento de ADN de 980 pb se amplificó a partir del ADNc del IL-17R. El producto de la PCR se cortó con SalI y BglII y se usó en una ligación a tres bandas con un fragmento que llevaba la región IgG1 humana cortada con BglII y NotI y con el plásmido (pDC409; véase el documento USSN 08/235.397) cortado previamente con SalI y NotI. El inserto codificado contenía los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos del resto 1 al 322 del IL-17R (SEQ ID Nº: 1). La secuencia se confirmó mediante secuenciación de la región entera.
Se transfectaron células CV-1/EBNA con los plásmidos de expresión del IL17R/Fc y se recogieron los sobrenadantes durante 1 semana. Se purificaron las proteínas de fusión CTLA-8/Fc en una columna de sefarosa de proteína A (Pharmacia, Uppsala, Suecia) como se describe más adelante. Se determinó la concentración de proteínas en un enzimoinmunoanálisis específico para el dominio constante de la IgG1 humana y mediante análisis BCA (Pharmacia), y se confirmó la pureza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS seguido de tinción con plata del
gel.
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Ejemplo 5
Este ejemplo describe la purificación de las proteínas de fusión del IL-17R. Se purificó la proteína de fusión IL-17R/Fc mediante métodos ordinarios usando cromatografía con proteína A o proteína G. Se purifica, aproximadamente, un litro del sobrenadante del cultivo que contiene la proteína de fusión IL-17R/Fc mediante filtración de los sobrenadantes de las células de mamífero (por ejemplo, en un filtro de 0,45 \mu) y se aplica el filtrado a una columna de afinidad con anticuerpos y proteína A/G (Schleicher y Schuell, Keene, NH) de 1,5 cm x 12,0 cm, a 4ºC y a una velocidad de flujo de 80 ml/hora. Se lavó la columna con NaCl 0,5 M en PBS hasta que no se detectó proteína libre en el tampón de lavado. Finalmente, la columna se lavó con PBS. La proteína de fusión unida se eluye de la columna con tampón de citrato 25 mM, pH 2,8, y se lleva a pH 7 con tampón de Hepes 500 mM, pH 9,1.
Una proteína de fusión del IL-17R que comprende el Flag® también puede detectarse y/o purificarse usando un anticuerpo que se una al Flag®, sustancialmente como se describe en Hopp y col., Bio/Technology 6: 1204 (1988). Se mide la actividad biológica mediante la inhibición de la actividad del CTLA-8 en cualquier análisis biológico que cuantifique el efecto co-estimulador del CTLA-8, por ejemplo, tal como se describe en los ejemplos del presente documento.
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Ejemplo 6
Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales frente al IL-17R. Por ejemplo, se emplean preparaciones purificadas del IL-17R recombinante o células transfectadas que expresen altas concentraciones del IL-17R, para generar anticuerpos monoclonales frente al IL-17R usando técnicas ordinarias, tales como las que se describen en la patente de Estados Unidos Nº 4.411.993. Es probable que tales anticuerpos sean útiles para interferir en la unión del IL-17R al CTLA-8, como componentes de análisis de diagnóstico o de investigación para el IL-17R, o en la purificación por afinidad del IL-17R.
Para inmunizar roedores, el inmunógeno de IL-17R se emulsiona en un adyuvante (tal como el adyuvante de Freund completo o incompleto, alumbre, u otro adyuvante, tal como el adyuvante R700 de Ribi (Ribi, Hamilton, MT)) y se inyecta subcutáneamente, en cantidades que varían de 10 a 100 \mug, en un roedor seleccionado, por ejemplo, ratones BALB/c o ratas de Lewis. De diez días a tres semanas después, los animales inmunizados se someten a una dosis de recuerdo con inmunógeno adicional y después, de un modo periódico, se someten a una dosis de recuerdo en un programa de inmunización semanal, cada dos semanas o cada tres semanas. Periódicamente, se toman muestras de suero mediante hemorragia retro-orbital o mediante escisión de la punta de la cola para analizarlas mediante análisis de transferencia por puntos (en sándwich de anticuerpos), ELISA (enzimoinmunoanálisis), inmunoprecipitación, u otros análisis adecuados, que incluyen el análisis FACS. Después de la detección de una valoración apropiada del anticuerpo, se somete a los animales positivos a una inyección intravenosa con el antígeno en solución salina. Tres a cuatro días después, se sacrifican los animales, se recogen los esplenocitos y se fusionan con una línea celular de mieloma murino (por ejemplo, NS1 o, preferentemente, Ag 8,653 [ATCC CRL 1580]). Las líneas celulares de hidridomas generadas mediante este procedimiento se siembran en placas múltiples de microvaloración en un medio de selección (por ejemplo, uno que contenga hipoxantina, aminopterina, y timidina, o HAT) para inhibir la proliferación de las células sin fusionar, de los híbridos mieloma-mieloma y de los híbridos esplenocito-esplenocito.
De este modo, los clones de los hibridomas generados pueden rastrearse mediante ELISA en busca de reactividad con el IL-17R, por ejemplo, mediante adaptaciones de las técnicas descritas por Engvall y col., Immunochem. 8: 871 (1971) y en la patente de Estados Unidos Nº 4.703.004. Una técnica de rastreo preferida es la técnica de captura del anticuerpo descrita por Beckman y col., J. Immunol. 144: 4212 (1990). Seguidamente, los clones positivos se inyectan en las cavidades peritoneales de los roedores isogenéticos para producir ascitis que contengan altas concentraciones (>1 mg/ml) del anticuerpo monoclonal anti-IL-17R. El anticuerpo monoclonal resultante puede purificarse mediante precipitación en sulfato amónico seguida de cromatografía de exclusión en gel. De modo alternativo, también puede usarse la cromatografía de afinidad en base a la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G, así como la cromatografía de afinidad en base a la unión a la proteína IL-17R.
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Ejemplo 7
Este ejemplo ilustra la capacidad del IL-17R de inhibir la respuesta de proliferación de los linfocitos T a los mitógenos. Se recogieron, de un modo aséptico, los órganos linfoides y se creó una suspensión celular. Se aislaron los linfocitos T esplénicos y del nódulo linfático a partir de la suspensión celular. La pureza de las preparaciones de linfocitos T esplénicos resultantes fue, habitualmente, >95% de CD3^{+} y <1% de sIgM^{+}. Los linfocitos T esplénicos murinos purificados (2 x 10^{5}/pocillo) se cultivaron con PHA 1% o bien con Con A 1 \mug/m, y se valoró un IL-17R soluble en el análisis. Se determinó la proliferación después de tres días con adición de 1 \muCi de [^{3}H]timidina. Se determina la secreción de citoquinas (interleuquina 2) en los linfocitos T murinos cultivados durante 24 horas con 1 \mug/ml de Con A en presencia o ausencia de 10 \mug/ml de IL-17R/Fc o en presencia de una proteína Fc control. Se midió la producción de IL-2 mediante ELISA y se produjeron resultados expresados en ng/ml
de IL-2.
El IL-17R/Fc soluble inhibía significativamente la proliferación inducida por mitógeno de los linfocitos T esplénicos murinos purificados de una manera dependiente de dosis, mientras que un Fc control no tuvo efecto sobre la proliferación de los linfocitos T murinos. Se observó la inhibición completa de la proliferación inducida por mitógeno a una concentración de IL-17R/Fc soluble de 10 \mug/ml. El análisis de la producción de IL-2 por los linfocitos T esplénicos activados con Con A en presencia o ausencia de IL-17R/Fc en el cultivo reveló que la adición de IL-17R/Fc al cultivo de linfocitos T inhibió la producción de IL-2 hasta concentraciones 8-9 veces inferiores que las observadas en los cultivos que contenían medio solo o medio más una proteína Fc control. Se observaron resultados similares cuando se usaron linfocitos T humanos purificados.
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Ejemplo 8
Este ejemplo presenta el aislamiento de un ADN que codifica el IL-17R humano mediante hibridación cruzada entre especies. Se preparó una genoteca de linfocitos humanos de sangre periférica y se rastreó, sustancialmente, como se describe en el documento USSN 08/249189, usando ADN del IL-17R murino en condiciones de una moderadamente alta estrictez. Se obtuvieron diversos clones de diversas longitudes. Los datos de la secuenciación indicaron que el IL-17R humano era, aproximadamente, idéntico en un 76% al IL-17R murino al nivel de nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos predicha del IL-17R humano se muestran en las SEQ ID Nº: 10 y 11. Se depositó un plásmido (pGEMBL) que contenía ADN que codifica el receptor humano de la IL-17 (denominado pGEMBL-HuIL-17R) en E. coli DH10 en la colección americana de cultivos tipo, 12.301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20.852-1776, Estados Unidos, el 5 de junio de 1995, bajo las condiciones del tratado de Budapest, y se le asignó el número de acceso 69.834.
El IL-17R humano comparte muchas características con el IL-17R murino. El análisis por ordenador indicó que la proteína tiene un péptido de señalización N-terminal con un sitio de corte entre el aminoácido 27 y el 28. El péptido de señalización está seguido por un dominio extracelular de 293 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos, y una cola citoplásmica de 525 aminoácidos. El IL-17R soluble comprende el péptido de señalización y el dominio extracelular (restos 1 a 320 de la SEQ ID Nº: 1) o un fragmento del mismo. De modo alternativo, puede sustituirse el péptido de señalización natural por un péptido de señalización diferente. Se preparó una proteína de fusión con Fc del tipo I (en la que el ADN que codifica la región Fc de una molécula de inmunoglobulina se fusiona con el ADN que codifica el IL-17R inmediatamente antes, y el lugar del ADN que codifica la región transmembranal del IL-17R), sustancialmente como se describe en el ejemplo 4. También puede expresarse una proteína hIL-17R soluble sustancialmente como se describe en el ejemplo 3, o mediante cualquier otro método para preparar y expresar el dominio extracelular del IL-17R o un fragmento del mismo.
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Ejemplo 9
Este ejemplo presenta la localización y la cartografía fina del gen del IL-17R murino. Se analizó un panel de muestras de ADN de un cruzamiento interespecífico que había sido caracterizado con por encima de 900 marcadores genéticos a lo largo del genoma. Los marcadores genéticos incluidos en este mapa abarcaban entre 50 y 80 centi-Morgans en cada autosoma del ratón y en el cromosoma X (Chr) (Saunders y Seldin, Genomics 8: 524, 1990; Watson y col., Mammalian Genome 2: 158, 1992).
Inicialmente, se digirió el ADN de los dos ratones parentales [C3H/HeJ-gld y (C3H/HeJ-gld x Mus spretus) F1] con diversas endonucleasas de restricción y se hibridó con la sonda de ADNc del IL-17R para determinar los variantes de longitud de los fragmentos de restricción (RFLV), para permitir el análisis del haplotipo. Se detectaron RFLV de BglII informativos: C3H/HeJ-gld, 10,0 kb; Mus spretus, 7,8 kb y 2,2 kb). En cada ratón retrocruzado se observaron o bien la banda parental del C3H/HeJ-gld o bien todas las tres bandas (ambas bandas del Mus spretus y una banda del C3H/HeJ-gld de intensidad media) indicando que se detectó un locus único.
La comparación de la distribución del haplotipo de los RFLV del IL-17R indicó que este gen se co-segregaba en 111 de los 114 eventos meióticos examinados junto con el locus del gen Raf1 del Chr 6 del ratón. El mejor orden génico (Bishop, Genet. Epidemiol. 2: 349, 1985) \pm la desviación típica (Green, en Genetics and Probability in Animal Breeding Experiments. E. Green, ed; Macmillan, Nueva York, págs: 77-113, 1981) fue: (centrómero) Raf1-2,6 cM \pm 1,5 cM-IL-17R-2,5 cM \pm 1,5 cM-Cd4.
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Ejemplo 10
Este ejemplo demuestra que el IL-17R soluble suprime el rechazo de injertos de órganos in vivo. Se trasplantaron corazones de ratones C57BL/6 (H-2^{b}) recién nacidos (menos de 24 horas de edad) en el pabellón auditivo de receptores BALB/c (H-2^{b}) adultos sustancialmente como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.492.888, expedida el 20 de febrero de 1996 (utilizando el método de Fulmer y col., Am. J. Anat. 113: 273, 1963, modificado como describen Trager y col., Transplantation 47: 587, 1989, y Van Buren y col., Transplant. Proc. 15: 2967, 1983). Se valoró la supervivencia de los corazones trasplantados mediante inspección visual de los injertos en busca de actividad pulsátil, tal como se determina mediante examen de los injertos oreja-corazón de los receptores anestesiados en un microscopio de disección con luz débil reflejada comenzando el día 5 ó 6 después del trasplante. Se definió el tiempo del rechazo del injerto como el día después del trasplante en el que cesa la actividad contráctil.
En un conjunto de experimentos, se eliminaron los corazones de los recién nacidos, se enjuagaron con PBS estéril para eliminar el exceso de sangre y se colocaron en pabellones auditivos preparados. Se administró a los ratones receptores o bien IL-17R murino/Fc (100 \mug en 200 \mul; véase el ejemplo 4 del presente documento) soluble o bien IgG de rata como control, intraperitonealmente en los días 0 a 3 después del trasplante. En un segundo conjunto de experimentos, se inyectó a los ratones receptores IL-17R o IgG humana en los días 0, 1 y 2; la cantidad y la ruta de inyección fueron como previamente. Los resultados de estos experimentos se muestran en la tabla 1.
TABLA 1 Efectos del IL-17R murino soluble (smuIL-17R) en la supervivencia del alotransplante cardíaco heterotópico neovascularizado
1
La tabla 1 muestra que los aloinjertos de corazón sobreviven, aproximadamente, 13 días en los ratones control individuales tratados con IgG de rata. Cuando se administró a los receptores del aloinjerto hasta cuatro inyecciones diarias de IL-17R soluble, se prolongó la supervivencia del injerto, con una supervivencia media de 20, aproximadamente, siete días mayor que el tiempo de supervivencia de los injertos idénticos en los ratones control. Cuando se obtuvo una liberación prolongada del IL-17R mediante encapsulación del IL-17R soluble en perlas de alginato, se observó que una administración única de 100 \mug del IL-17R soluble prolongó la supervivencia del injerto virtualmente de la misma manera que la observada previamente con el IL-17R soluble en solución. Estos resultados demuestran que el IL-17R soluble suprime el rechazo de los tejidos injertados.
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Ejemplo 11
Este ejemplo demuestra que el ADN que codifica el IL-17R soluble será útil en la supresión del rechazo de los injertos de órganos in vivo. Se trasplantaron corazones de ratones C57BL/6 (H-2^{b}) recién nacidos en el pabellón auditivo de receptores BALB/c (H-2^{b}) adultos como se describe anteriormente en el ejemplo 10, excepto en que se inyectaron a los corazones 15 \mul de PBS que contenía o bien ADN que codifica IL-17R/Fc (pDC409-IL-17R; ejemplo 4) o bien ADN control (pDC409 vacío) a una concentración de, aproximadamente, 1 mg/ml, en el ventrículo. Se usó una aguja de 0,254 mm y se tuvo cuidado en minimizar el trauma en la oreja. Seguidamente, se trasplantaron los corazones transfectados en receptores BALB/c y se determinó la supervivencia del injerto como se describe previamente. Los resultados se presentan en la tabla 2.
TABLA 2 Efectos de la expresión del IL-17R murino soluble por las células cardíacas en la supervivencia del alotransplante cardíaco heterotópico neovascularizado
2
La tabla 2 muestra que los aloinjertos de corazón sobreviven, aproximadamente, 15 días en los ratones control individuales trasplantados con corazones transfectados con el vector vacío. Cuando los corazones trasplantados se transfectaron con ADN que codifica el IL-17R soluble, se prolongó la supervivencia del injerto. Para tres de los cinco ratones de este grupo, los injertos sobrevivieron como término medio, aproximadamente, 24 días, nueve días más que el tiempo de supervivencia de los injertos idénticos en los ratones control. Los injertos de los otros dos ratones a un eran pulsátiles (es decir, no mostraron rechazo) más de 60 días después del trasplante y, aparentemente, habían sido aceptados por los receptores. Estos resultados demuestran que la transfección de tejidos que van a ser injertados con ADN que codifica el IL-17R soluble mejora el rechazo de estos tejidos por el receptor.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(I)
SOLICITANTE: Yao, Zhengbin.
\hskip3.9cm
Spriggs, Melanie 
\hskip3.9cm
Fanslow, William 
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(II)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Novel Receptor That Binds IL-17
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(III)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
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(IV)
DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
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A.
DESTINATARIO: Immunex Corporation
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B.
CALLE: 51 University Street
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C.
CIUDAD: Seattle
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D.
ESTADO: Washington
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E.
PAÍS: Estados Unidos
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F.
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 98101
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(V)
FORMA INFORMÁTICA LEGIBLE:
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A.
SOPORTE INFORMÁTICO: disquete
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B.
ORDENADOR: Apple Macintosh
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C.
SISTEMA OPERATIVO: Apple Operating system 7.1
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D.
PROGRAMA: Microsoft Word for Apple, version 5.1a
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(VI)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
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A.
NÚMERO DE SOLICITUD:
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B.
FECHA DE PRESENTACIÓN:
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C.
CLASIFICACIÓN:
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(VII)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
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A.
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/538.765
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B.
FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 de agosto de 1995
\vskip0.500000\baselineskip
C.
CLASIFICACIÓN:
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(VII)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
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A.
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/410.535
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B.
FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 de marzo de 1995
\vskip0.500000\baselineskip
C.
CLASIFICACIÓN
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(VIII)
INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE:
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A.
NOMBRE: Perkins, Patricia Anne
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B.
NÚMERO DE REGISTRO: 34.695
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C.
NÚMERO DE EXPEDIENTE DE REFERENCIA: 2617-WO
\vskip0.800000\baselineskip
(IX)
INFORMACIÓN PARA LA TELECOMUNICACIÓN:
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A.
TELÉFONO: (206) 587-0430
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B.
TELEFAX: (206)
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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1.
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(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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A.
LONGITUD: 3288 pares de bases
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B.
TIPO: ácido nucleico
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C.
CADENA: simple
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D.
TOPOLOGÍA: lineal
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(II)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
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(III)
HIPOTÉTICO: NO
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(IV)
ANTISENTIDO: NO
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(VI)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
ORGANISMO: Ratón
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B.
CLON: Receptor HVS13
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(IX)
CARACTERÍSTICA:
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A.
NOMBRE/CLAVE: CDS
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B.
LOCALIZACIÓN:121...2715
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(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
3
4
5
6
7 
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2.
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
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A.
LONGITUD: 865 aminoácidos
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B.
TIPO: aminoácido
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D.
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(II)
TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
8
9
10
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
B.
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
C.
CADENA: sin relevancia
\vskip0.500000\baselineskip
D.
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(II)
TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(VII)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
C.
CLON: Péptido FLAG®
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
100 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
LONGITUD: 213 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
B.
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
C.
CADENA: sin relevancia
\vskip0.500000\baselineskip
D.
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(II)
TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(VI)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
ORGANISMO: Ser humano
\vskip0.800000\baselineskip
(VII)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
B.
CLON: Fc de la IgG1
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA. SEQ ID Nº: 4:
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
B.
TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
C.
CADENA: sin relevancia
\vskip0.500000\baselineskip
D.
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(II)
TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(VI)
FUENTE INMEDIATA.
\vskip0.500000\baselineskip
B.
CLON: Poliengarzador
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
LONGITUD: 498 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
B.
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
C.
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
D.
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(II)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNC a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
(III)
HIPOTÉTICO. NO
\vskip0.800000\baselineskip
(IV)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(VI)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
ORGANISMO: CTLA-8 murino
\vskip0.800000\baselineskip
(IX)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
B.
LOCALIZACIÓN: 14..490
\vskip0.800000\baselineskip
(IX)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
NOMBRE/CLAVE: péptido_sig
\vskip0.500000\baselineskip
B.
LOCALIZACIÓN: 14..88
\vskip0.800000\baselineskip
(IX)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
NOMBRE/CLAVE: péptido_mat
\vskip0.500000\baselineskip
B.
LOCALIZACIÓN: 89..487
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
14
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
LONGITUD: 159 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
B.
TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
C.
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(II)
TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
LONGITUD: 151 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
B.
TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
C.
CADENA: sin relevancia
\vskip0.500000\baselineskip
D.
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(II)
TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(III)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(IV)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(VI)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
ORGANISMO: Herpesvirus saimiri
\vskip0.500000\baselineskip
B.
CLON: ORF13
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
LONGITUD: 3223 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
B.
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
C.
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
D.
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(II)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
(III)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(IV)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(VI)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
ORGANISMO: Ser humano
\vskip0.500000\baselineskip
B.
CLON: IL-17R
\vskip0.800000\baselineskip
(IX)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
B.
LOCALIZACIÓN: 93..2693
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
19
20
21
22
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
A.
LONGITUD: 867 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
B.
TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
D.
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(II)
TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:
24
25
26
27

Claims (17)

1. ADN aislado o recombinante seleccionado del grupo constituido por:
(a)
ADN que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 322 de la SEQ ID Nº: 2;
(b)
ADN que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 320 de la SEQ ID Nº: 10; y
(c)
ADN capaz de hibridar con el ADN de (a) o (b) en condiciones estrictas, y que codifica el IL-17R que se une a la IL-17; y
(d)
ADN que codifica un fragmento de una proteína codificada por el ADN de (a), (b), o (c), cuyo fragmento se une a la IL-17.
\vskip1.000000\baselineskip
2. ADN aislado o recombinante seleccionado del grupo constituido por:
(a)
ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 322 de la SEQ ID Nº: 2;
(b)
ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 320 de la SEQ ID Nº: 10; y
(c)
moléculas de ADN que codifican proteínas que son al menos 70% idénticas en la secuencia de aminoácidos a las proteínas de (a) o (b) y que se une a la IL-17; y
(d)
moléculas de ADN que codifican fragmentos de proteínas codificadas por el ADN de (a), (b), o (c), cuyos fragmentos se unen a la IL-17.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
4. Un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, que expresa un IL-17R soluble.
5. Una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4.
6. Un procedimiento para preparar una proteína IL-17R, que comprende cultivar una célula hospedadora según la reivindicación 5 en condiciones que promuevan la expresión y recuperar el IL-17R.
7. Una proteína receptora de la interleuquina-17 (IL-17R) aislada y purificada que se une a la IL-17, seleccionada del grupo constituido por:
(a)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 322 de la SEQ ID Nº: 2;
(b)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 320 de la SEQ ID Nº: 10;
(c)
una proteína codificada por una molécula de ADN capaz de hibridar con un ADN que codifica una proteína de (a) o (b) en condiciones estrictas, y que se une a la IL-17; y
(d)
un fragmento de una proteína de (a), (b), o (c), que se une a la IL-17.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Una proteína IL-17R aislada y purificada, seleccionada del grupo constituido por:
(a)
una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 322 de la SEQ ID Nº: 2;
(b)
una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos del aminoácido 1 al 320 de la SEQ ID Nº: 10;
(c)
una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es, al menos, aproximadamente, idéntica en un 70% a las secuencias de aminoácidos de las proteínas (a) o (b), y que se une a la IL-17; y
(d)
fragmentos de las proteínas de (a), (b), o (c), que se unen a la IL-17.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un IL-17R aislado y purificado de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende un IL-17R soluble.
10. Una composición que comprende una proteína IL-17R de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8 o la reivindicación 9 y un diluyente o vehículo adecuado.
11. Una proteína IL-17R según la reivindicación 7 o la reivindicación 8 o la reivindicación 9 o una composición, según la reivindicación 10, para el uso en la regulación de una respuesta inmunitaria o inflamatoria en un mamífero.
12. Un anticuerpo que inmunorreaccione con el IL-17R.
13. Un anticuerpo según la reivindicación 12, que es un anticuerpo monoclonal.
14. Una proteína o una composición, según la reivindicación 11, para el uso en la supresión del rechazo de un órgano injertado o un tejido injertado en un receptor de injertos.
15. El uso de una proteína IL-17R según la reivindicación 7 o la reivindicación 8 o la reivindicación 9 en la preparación de una composición para suprimir el rechazo de un órgano injertado o un tejido injertado en un receptor de injertos.
16. El uso de un ADN que codifica un IL-17R soluble de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en la preparación de una composición para suprimir el rechazo de un órgano injertado o un tejido injertado en un receptor de injertos.
17. El uso de un ADN que codifica un IL-17R soluble de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o una proteína IL-17R de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8 o la reivindicación 9 en la preparación de una composición o composiciones para la administración separada, simultánea o secuencial para suprimir el rechazo de un órgano injertado un tejido injertado en un receptor de injertos.
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