PT1706133E

PT1706133E - Métodos para protecção contra radiação utilizando flagelina

Info

Publication number: PT1706133E
Application number: PT04813124T
Authority: PT
Inventors: Andrei V Gudkov
Original assignee: Cleveland Clinic Foundation
Priority date: 2003-12-02
Filing date: 2004-12-02
Publication date: 2010-12-07
Also published as: SI1706133T1; JP4750716B2; EP1706133B1; DE602004029500D1; CA2547869C; CN1913915A; HK1102492A1; SG148215A1; AU2004296828A1; KR20070009533A; CN1913915B; WO2005057218A2; WO2005057218A3; WO2005056055A3; AU2004296828B2; PL1706133T3; JP2007513183A; US20190381139A1; EA200601079A1; US20220105155A1

Description

ΕΡ 1 706 133/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Métodos para protecção contra radiação utilizando flagelina"

CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se a uma composição compreendendo flagelina para utilização como estabelecido na reivindicação 1 e à utilização desta composição tal como estabelecido na reivindicação 2.

ANTECEDENTES DO INVENTO A progressão de células normais para células tumorais envolve uma perda de mecanismos negativos de regulação de crescimento, incluindo resistência a estímulos de inibição de crescimento e ausência de dependência de factores de crescimento e hormonas. Os tratamentos de cancro tradicionais com base em radiação ou fármacos citotóxicos dependem das diferenças no controlo de crescimento de células normais e malignas. Os tratamentos tradicionais do cancro sujeitam as células a stress genotóxico grave. Nestas condições, a maioria das células normais param e portanto salvam-se, enquanto as células tumorais continuam a dividir-se e morrem.

No entanto, a natureza da estratégia convencional do tratamento do cancro é tal que os tecidos normais em divisão rápida ou propensos a apoptose ficam em risco. Os danos nestas células normais em divisão rápida causam os bem conhecidos efeitos secundários do tratamento do cancro (tecidos sensíveis: hematopoiese, intestino delgado, folículos pilosos). A sensibilidade natural de tais tecidos é complicada pelo facto das células de cancro adquirirem frequentemente defeitos na maquinaria suicida (apoptótica) e os procedimentos terapêuticos que causam morte em tecido sensível normal poderem não danificar as células de cancro. As tentativas convencionais para minimizar os efeitos secundários de terapias de cancro baseiam-se em (a) tornar as células tumorais mais susceptíveis ao tratamento, (b) tornar as terapias de cancro mais específicas para células tumorais ou (c) promover a regeneração de tecido normal após tratamento 2 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ (e.g., eritropoietina, GM-CSF e KGF). Algumas estratégias para a prevenção de danos por radiação revelam-se em Seed T. et ai., J. Radiation Research, 43, Supl., Dezembro de 2002, p. 5239-5244 .

Continuam a ser necessários agentes terapêuticos para mitigar os efeitos secundários associados a terapia com radiação no tratamento de cancro. Este invento preenche estas necessidades e proporciona outras vantagens relacionadas.

SUMÁRIO DO INVENTO

Este invento refere-se a uma composição compreendendo flagelina para utilização como estabelecido na reivindicação 1 e para a utilização desta composição tal como estabelecido na reivindicação 2. Os seguintes métodos e composições formam parte da presente divulgação, mas não parte do invento.

Revela-se aqui um método para tratar um mamífero que sofre de um cancro com NF-κΒ activo constitutivamente compreendendo administrar ao mamífero uma composição compreendendo uma quantidade farmaceuticamente aceitável de um agente que induz NP-kB. O agente pode ser flagelina ou TGFp, que pode ser TGFp latente. O agente pode ser administrado antes, concomitantemente ou após um tratamento para o cancro. O tratamento pode ser quimioterapia ou radioterapia.

Revela-se aqui um método para tratar um mamífero que sofre de danos em tecido normal atribuíveis a tratamento de um cancro compreendendo administrar ao mamífero uma composição compreendendo uma quantidade farmaceuticamente aceitável de um agente que induz NF-kB. O agente pode ser flagelina ou TGFp, que pode ser TGFp latente. O agente pode ser administrado antes, concomitantemente ou após um tratamento para o cancro. O tratamento pode ser quimioterapia ou radioterapia.

Revela-se aqui um método para tratar um mamífero que sofre de danos em tecido normal atribuíveis a stress, compreendendo administrar ao mamífero uma composição compreendendo uma quantidade farmaceuticamente aceitável de um agente que induz NF-κΒ. O agente pode ser flagelina ou TGFp, que pode ser TGFp latente. O agente pode ser administrado antes, 3 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ concomitantemente ou após um tratamento de uma doença de que o mamífero sofre.

Revela-se aqui um método para modular o envelhecimento celular num mamífero, compreendendo administrar ao mamífero uma composição compreendendo uma quantidade farmaceuticamente aceitável de um agente que induz NF-kB. O agente pode ser flagelina ou TGFp, que pode ser TGFp latente. O agente pode ser administrado antes, concomitantemente ou após o tratamento para uma doença de que o mamífero sofre.

Revela-se aqui uma composição farmacêutica compreendendo um agente que induz actividade de NF-κΒ, um fármaco quimioterapêutico e opcionalmente um adjuvante, diluente ou transportador farmaceuticamente aceitáveis. O agente pode ser flagelina ou TGFp, que pode ser TGFp latente.

Revela-se aqui um método para rastreio de um indutor de NF-κΒ compreendendo a adição de um suposto indutor a um sistema de expressão activada por NF-κΒ e adicionar separadamente um controlo a um sistema de expressão activada por NF-κΒ, por meio do que se identifica um indutor de NF-kB pela capacidade de aumentar o nível de expressão activada por NF-kB.

Revela-se aqui um método para proteger um mamífero dos efeitos de radiação compreendendo a administração ao referido mamífero de uma composição compreendendo uma quantidade

farmaceuticamente eficaz de um agente que induz NF-κΒ. O

agente pode ser flagelina, que pode ser derivado de uma espécie de Salmonella. A composição pode ser administrada em combinação com um radioprotector. O radioprotector pode ser um antioxidante, que pode ser amifostina ou vitamina E. O radioprotector pode também ser uma citoquina, que pode ser factor de células estaminais.

Revela-se aqui um método para proteger um doente de um ou mais tratamentos ou condições que desencadeiam apoptose compreendendo a administração ao referido doente de uma composição compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um agente que induz flagelina de NF-κΒ. O agente pode ser flagelina, que pode ser derivada de uma espécie de 4 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ Sâlmonella. Ο tratamento pode ser um tratamento de cancro, que pode ser quimioterapia ou radioterapia. A condição pode ser um stress, que pode ser radiação, ferimento, envenenamento, infecção e choque térmico.

Revela-se aqui um método de rastreio para um modulador de apoptose compreendendo a adição de um possível modulador a um sistema de apoptose baseado em células e a adição separada de um controlo a um sistema de apoptose baseado em células, por meio do que se identifica um modulador de apoptose pela capacidade de alterar a taxa de apoptose, em que o possível modulador é derivado de um parasita de mamíferos.

Revela-se aqui um método para rastreio de um modulador de NF-κΒ compreendendo a adição de um possível modulador a um sistema de expressão activada por NF-κΒ e adição separada de um controlo a um sistema de expressão activada por NF-κΒ, por meio do que se identifica um modulador de NF-κΒ pela capacidade de alterar a taxa de expressão activada por NF-κΒ, em que o possível modulador é derivado de um parasita de mamíferos. O parasita pode ser de uma espécie incluindo entre outras Salmonella, Mycoplasma e Chlamydia.

Revela-se aqui um método para rastreio de um modulador de TGFp compreendendo adicionar o possível modulador a um sistema de expressão activada por TGFp e adicionar separadamente um controlo a um sistema de expressão activada por ΤΰΡβ, por meio do que se identifica um modulador de TGFp pela capacidade de alterar a taxa de expressão activada por TGFp, em que o possível modulador é derivado de um parasita de mamífero. O TGFp pode ser TGFp latente. O parasita pode ser uma espécie incluindo, entre outras, Salmonella, Mycoplasma e Chlamydia.

Revela-se aqui um método de rastreio para um modulador de p53 compreendendo a adição de um possível modulador a um sistema de expressão activada por p53 e adição separada de um controlo a um sistema de expressão activada por p53, por meio do que se identifica um modulador de p53 pela capacidade de alterar a taxa de expressão activada por p53, em que o possível modulador é derivado de um parasita de mamíferos. O parasita pode ser de uma espécie incluindo, entre outras, Salmonella, Mycoplasma e Chlamydia. 5 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ

Revela-se aqui um modulador identificado por qualquer um dos métodos de rastreio aqui descritos. Revela-se aqui uma composição compreendendo um modulador aqui descrito. A composição pode ser uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade farmaceuticamente aceitável de um modulador aqui descrito.

Revela-se aqui um método para tratar cancro compreendendo administrar a um indivíduo, com necessidade de tal tratamento, uma composição farmacêutica compreendendo um modulador que aumenta apoptose.

Revela-se aqui um método para proteger um doente de um ou mais tratamentos que desencadeiam apoptose, compreendendo administrar ao referido doente uma composição farmacêutica compreendendo um modulador que inibe apoptose. 0(s) tratamento(s) pode(m) ser tratamento de cancro. O tratamento de cancro pode ser quimioterapia ou radioterapia.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS ESQUEMAS A figura 1 demonstra que a infecção por Salmonella leva a localização nuclear de NF-κΒ mesmo em células não infectadas. Cultivaram-se células HT29 em lamelas de vidro e foram sujeitas a infecção simulada, deixadas sem tratamento, infectadas com Salmonella typhimurium ou tratadas com TNFa (10 ng/ml). Painel A: sujeitaram-se células HT29 a infecção simulada ou infectaram-se a um MOI de 100 com Salmonella typhimurium estirpe SJW1103G que expressa GFP do promotor ssaH que só é activo dentro de células hospedeiras infectadas. Fotografaram-se as células utilizando microscopia de campo claro (BF) e imunofluorescência para detectar GFP ou coloração com DAPI, tal como indicado. As imagens foram misturadas (sobrepostas) para revelar as células que estavam infectadas. Painel B: deixaram-se células HT29 não tratadas, infectadas com Salmonella typhimurium estirpe 1103 ou tratadas com TNFa. Monitorizou-se a localização de NF-κΒ p65(RelA) em várias condições, tal como indicado, por imunofluorescência indirecta. Visualizaram-se as células por microscopia de campo claro (BF), coraram-se os núcleos celulares com DAPI e visualizou-se p65(RelA) com FITC. A coloração com DAPI foi 6 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ corada falsamente de vermelho para permitir a visualizaçao da mistura (sobreposição) mais fácil de distinguir. A figura 2 demonstra que um factor de proteína em meio de cultura de Salmonella leva a activação de NF-κΒ. Painel A: Utilizou-se meio de cultura de Salmomella dublin concentrado 100 vezes tratado tal como indicado ou bactérias infecciosas, tal como indicado, para provocar células HT29. Ensaiou-se a actividade de ligação de ADN a NF-κΒ por emsa em extractos de células completas preparados 45 min após tratamento. A autenticidade do complexo de ADN de NF-κΒrproteína foi determinada utilizando superdesvios de anticorpos específicos para p65(RelA) e específicos para p50. Painel B: Sujeitou-se meio de cultura de Salmonella dublin concentrado (IN) a cromatografia de permeação de gel numa coluna Superose 12. Analisaram-se as fracções de proteína eluídas por fraccionação em SDS-PAGE a 10% e visualizou-se por coloração com azul de Coomassie (CB). Indicam-se os marcadores de peso molecular na cromatografia e nos géis. Utilizaram-se alíquotas de cada fracção tal como indicado para estimular células HT29 e analisaram-se os WCE resultantes por EMSA para actividade de ligação de ADN a NF-κΒ. Painel C: Sujeitou-se meio de cultura de Salmonella dublin concentrado (IN) a cromatografia de permuta aniónica em matriz POROS HQ. Eluíram-se as proteínas com um gradiente de NaCl crescente tal como indicado e analisaram-se em SDS-PAGE a 10% e visualizaram-se por coloração com azul de Coomassie (CB). Utilizaram-se alíquotas de entrada e de cada fracção tal como indicado para estimular células HT29 e os WCE resultantes foram analisados por EMSA para actividade de ligação de ADN a NF-κΒ. Utilizou-se o material eluído correspondente às bandas de proteína B1-B6 e uma parte em branco do gel isolado de um gel de SDS-PAGE a 10% em duplicado, conjuntamente com amostras de tampão do início e do fim do gradiente do tampão de NaCl para estimular células HT29 e analisaram-se os WCE resultantes por EMSA para actividade de ligação de ADN a NF-κΒ. A figura 3 demonstra que o factor de activação de NF-κΒ no meio de cultura de Salmonella é flagelina, tal como identificada por espectrometria de massa. HPLC de microcapilar acoplado em tandem com espectrometria de massa da banda 2 digerida com tripsina. Os picos correspondentes a péptidos de 7 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ

Salmonella estão numerados e identificados com a sequência peptídica numerada correspondente à direita. A figura 4 demonstra que os mutantes de flagelina não conseguem activar NF-κΒ. Painel A: Ensaios EMSA para a actividade de ligação de ADN a NF-κΒ em WCE preparados após 45 min a partir de células não infectadas (UN) e após infecção directa de células HT29 com E. coli DH5a de tipo selvagem, Salmonella dublin de tipo selvagem ou mutante SopE“, mutante SopB~, mutante duplo SopE~/SopB“, Salmonella typhimurium estirpe 1103 de tipo selvagem, mutante fliC” (fliC::Tn10), duplo mutante fliC”/fljB” tal como indicado a uma MOI de 50. Painel B: ensaios EMSA para actividade de ligação de ADN a NF-κΒ em WCE preparados 45 min após provocação de células HT29 de células não infectadas (UN) ou com meios de cultura concentrados esterilizados por filtração de bactérias de tipo selvagem ou mutantes, tal como indicado. A figura 5 demonstra que é necessária a flagelina para activar as vias de sinalização múltipla durante infecção por Salmonella e leva a localização nuclear de NF-κΒ. Painel A: células HT29 deixadas sem tratamento, estimuladas com TNFa (10 ng/ml) ou com uma mistura de anisomicina [An] (20 pg/ml)/ PMA (12,5 ng/ml) durante 15 min, ou infectadas com Salmonella typhimurium estirpe 1103 de tipo selvagem ou com Salmonella typhimurium mutante duplo fliC~/fljB“ estirpe 134, tal como indicado. Prepararam-se WCE aos tempos indicados ou após 10 min para células tratadas com TNF ou 15 min para células tratadas com anisomicina/PMA e utilizaram-se em EMSA para analisar a actividade de ligação de ADN a NF-κΒ ou em ensaios de imuno-quinase (KA) utilizando anticorpos anti-IKK ou anti-JNK para medir actividade de quinase de IKK e JNK nos seus substratos respectivos GST-ΙκΒα 1-54 e GST-cJun 1-79 (tal como indicado). As análises de imunotransferências (IB) de quantidades equivalentes (40 pg) de proteína de cada extracto foram fraccionadas em géis de SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF e sondadas com os anticorpos indicados para detectar IKK, JNK, ERK e p38 em solução, tal como indicado. Indicam-se as análises de imunotransferência utilizando anticorpos fosfoespecíficos para em ERK e p38 para detectar ERK e p38 activados. Painel B: Imunofluorescência que demonstra que a Salmonella com flagelina mutante não é capaz 8 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ de infectar células HT29 e que a estimulação de células HT29 com flagelina purificada leva a localização nuclear p65(relA) de NF-κΒ, tal como determinado por imunofluorescência indirecta. A obtenção de imagens do tratamento indicou que as células HT29 cultivadas em lamela eram essencialmente idênticas às das figuras IA e B. Utilizou-se coloração falsa da coloração DAPI para melhorar a visualização de núcleos corados com DAPI e a localização nuclear p65. A figura 6 demonstra que a flagelina purificada activa vias de sinalização e expressão de gene pró-inflamatório em células do epitélio intestinal que mimetizam a de infecção por Salmonella de tipo selvagem. Deixaram-se células HT29 sem tratamento ou trataram-se com TNFa (10 ng/ml) ou uma mistura de anisomicina [An] (20 pg/ml)/PMA (12,5 ng/ml) durante 10 min ou com flagelina (1 pg/ml) durante os tempos indicados. Prepararam-se WCE e analisaram-se por EMSA para actividade de ligação de ADN a NF-κΒ, ensaios de imuno-quinase (KA) ou análise de imunotransferência utilizando anticorpos fosfoespecificos de ERK ou p38 para detectar activação e com anticorpos específicos de quinase, tal como descrito na figura 5A, para detectar a abundância de quinase no meio, tal como indicado. Painel A: EMSA para detectar actividade de ligação de ADN a NF-κΒ. Painel B: imunotransferência e ensaios de quinase para detectar as actividades de quinase de IKK, JNK, ERK e p38 e abundância de proteína, tal como na figura 5A. Painel C: RT-PCR semi-quantitativo de expressão de gene pró-inflamatório em células não tratadas, infectadas com Salmonella typhimurium de tipo selvagem e com o mutante duplo de flagelina, estimuladas com TNFa (10 ng/ml) ou flagelina (1 mg/ml). Recolheram-se as células HT29 nos tempos indicados após os tratamentos indicados e utilizou-se ARN isolado para preparar ADNc de primeira cadeia, que foi utilizado subsequentemente em reacções de RT-PCR utilizando iniciadores específicos de gene para ILla, ΐΐΛβ, IL-8, TNFa, MCPl e β-actina. Utilizou-se β-actina como um padrão para normalizar os padrões de expressão. Os produtos de PCR resultantes foram fraccionados em géis de agarose a 2% e visualizados por coloração com brometo de etídio. A figura 7 demonstra que a activação de NF-κΒ mediada por flagelina é dependente de MyD88. Utilizou-se Salmonella dublin 9 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ infecciosa de tipo selvagem (MOI de 100), IL-1 (20 ng/ml), flagelina purificada (1 pg/ml) (tal como indicado), sobrenadante (spt) do retido em filtro de 100 kDa concentrado e esterilizado por filtração de Salmonella dublin de tipo selvagem e de Salmonella Dublin mutante duplo SopE“/SopB“ estirpe SEI SB2 (S2, tal como indicado) para provocar MEF de tipo selvagem, com deleção MyD88_/“ ou deleção dupla TLR2_/~ /TLR4_/“, tal como indicado. Prepararam-se WCE 45 min após os tratamentos e examinaram-se por emsa para analisar a actividade de ligação de ADN a NF-κΒ. Utilizou-se IL-1 (20 ng/ml) como um controlo positivo para monitorizar a função MyD88. A figura 8 demonstra que TLR5 inibe a actividade de gene repórter NF-κΒ mediada por flagelina. Transfectaram-se células HT29 em triplicado em placas de 6 poços utilizando os vectores de expressão de mamifero DN-TLR indicados ou TLR5 anti-sentido (AS TLR5) (2 pg/poço), 2x gene repórter NF-κΒ Luc (100 ng/poço), pRL-τκ de luciferase de Renilla para normalização (50 ng/poço) ajustado a 4 pg de ADN total/poço com vector vazio pCDNA3.1 ADN. Painel A: Aumento de indução de 2x do gene repórter NF-κΒ Luc em células não estimuladas (sombreado claro) e em células tratadas com TNFa (10 ng/ml) (sombreado escuro). Prepararam-se lisados 12h após estimulação. Apresentam-se os resultados de uma experiência representativa. Painel B: Trataram-se células HT29 transfectadas como na figura 8A com flagelina (1 pg/ml) e prepararam-se lisados celulares e analisaram-se como na figura 8A. Apresentam-se os resultados de uma experiência representativa. A figura 9 demonstra que a estimulação com flagelina de células do epitélio intestinal leva à activação de um subconjunto de genes TLR. Estimularam-se células HT29 com flagelina (1 mg/ml) e isolou-se ARN após 3 h utilizando Trizol e utilizou-se para preparar ADNc de primeira cadeia. Apresentam-se os produtos de RT-PCR gerados com iniciadores específicos de gene para cada TLR, tal como indicado. Utilizou-se β-actina como um padrão para normalizar os padrões de expressão. 10 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ A figura 10 demonstra que TLR5 é expresso em numerosos tipos de células e tem respostas variáveis a flagelina. Painel A: prepararam-se extractos de células completas de células T84, HT29, A549, HeLa, 293T e T98G não estimuladas e fraccionaram-se num gel de SDS-PAGE a 8%, transferiram-se as proteínas para membrana de PVDF e sondaram-se com anticorpo anti-TLR5 para análise de imunotransferência (IB). Analisou-se a carga de proteína por sondagem com anticorpo anti-actina. Painel B: As células HT29, A549, HeLa, 293T e T98G foram deixadas não tratadas (—), tratadas com flagelina (F) ou TNFa (T) e prepararam-se WCE após 45 min e utilizaram-se em EMSA para monitorizar a actividade de ligação de ADN a NF-kB. A autenticidade do desvio de banda de NF-κΒ foi ensaiada por superdesvio do complexo com anticorpo específico de p65(RelA). A figura 11 demonstra que a deficiência de p53 acelerou o desenvolvimento de síndrome GI em ratinhos. Painel A: Injecção I.P. de PFTa (10 mg/kg) protege ratinhos C57B1/6J (salvo indicação contrária, utilizam-se aqui e seguidamente ratinhos machos com 6-8 semanas de idades) de uma única dose de 9 Gy de radiação gama e de uma dose de radiação cumulativa fraccionada de 12,5 Gy (5 x 2,5 Gy) . PFTa não tem qualquer efeito na sobrevivência de ratinhos tratados com doses únicas de 12,5 e 25 Gy de IR: (apresentam-se os resultados de experiências representativas; utilizou-se uma fonte Shepherd de 4000 Ci de césio-137 a uma taxa de dosagem de 4 Gy por minuto). Painel B: Os ratinhos C57B1/6J de tipo selvagem e mutantes p53-null diferem na sua sensibilidade relativa a doses de radiação gama baixas (10 Gy) e altas (15 Gy) : os ratinhos de tipo selvagem são mais sensíveis a 10 Gy mas mais resistentes a 15 Gy comparativamente a ratinhos p53-null. Painel C: Injectaram-se ratinhos tratados com 11 Gy de irradiação gama na totalidade do corpo, 12 h mais tarde, com l,5xl07 células de medula óssea de ratinhos C57B1/6J de tipo selvagem ou singenésicos p53-null. (Esta dose causa 100% de letalidade em grupos de ratinhos de controlo não reconstituídos). Dois meses mais tarde após recuperação completa de hematopoiese, trataram-se os animais com 15 Gy de radiação gama na totalidade do corpo e não apresentaram qualquer diferença nas taxas de mortalidade entre os dois grupos que diferiam no estado p53 da sua medula óssea. Painel D: A comparação da dinâmica de danos ao intestino delgado em ratinhos de tipo selvagem e p53-null nos 11 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ pontos temporais indicados após 15 Gy de radiação gama indica danificação acelerada em ratinhos p53-null (secções parafinadas coradas com hematoxilina-eosina; ampliação xl25). Os painéis de 24 h incluem imagens de coloração túnel no caso de secções de criptas: é evidente apoptose maciça no tipo selvagem mas não em epitélio deficiente em p53. A figura 12 demonstra a dinâmica de proliferação celular e sobrevivência no intestino delgado de ratinhos de tipo selvagem e p53-null. Painel A: Comparação das taxas de proliferação em intestinos de ratinhos de tipo selvagem e p53 null após tratamento com IR. (Esquerda) Auto-radiografias de secções de corpo inteiro (ampliação de 1,7 x) de ratinhos de 4 semanas de idade de tipo selvagem e p53 null injectados intraperitonealmente com 14C-timidina (10 pCi por animal) não tratados ou tratados com 15 Gy de radiação gama (Westphal et al 1997). As setas indicam os intestinos. (Direita) Comparação de incorporação de BrdU em intestino delgado de ratinhos de tipo selvagem e p53-null em diferentes pontos temporais após 15 Gy de radiação gama. Injectou-se BrdU (50 mg/kg) 2 h antes de sacrificar ratinhos e efectuou-se imunocoloração tal como anteriormente descrito (Watson e Pritchard 2000). Apresentam-se fragmentos de painéis de 96 h com ampliação elevada (x400). Painel B: Comparação do número de células positivas a BrdU/cripta no intestino delgado de ratinhos de tipo selvagem e p53-null a diferentes pontos temporais após 15 Gy de radiação gama. Analisaram-se três animais para cada ponto temporal, prepararam-se cinco secções transversais de íleo de cada animal e analisaram-se microscopicamente para estimar o número de criptas e vilosidades. Contaram-se os números de células positivas a BrdU nas criptas em 5 campos aleatórios com ampliação de 200x (100-30 criptas) e representou-se graficamente o número médio de células positivas a BrdU. Painel C: Rastreio do número e posição de células marcadas com BrdU no intestino delgado de ratinhos de tipo selvagem e p53-null durante diferentes pontos temporais após 15 Gy de radiação de gama. Injectou-se BrdU 30 min antes da irradiação e sacrificaram-se os ratinhos aos pontos temporais indicados. Verificou-se uma migração acelerada das criptas para as vilosidades, seguida por rápida eliminação de células marcadas em ratinhos p53-null. 12 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ A figura 13 demonstra que a flagelina recombinante é capaz de activação de NF-kB. a figura 14 apresenta uma experiência representativa para o ensaio da capacidade da flagelina proteger ratinhos de radiação. Injectaram-se ratinhos C56BL6 (machos de 6 semanas de idade, 10 animais por grupo) i.v. com 2,0 pg (0,1 mg/kg) ou 5 pg (0,25 mg/kg) de flagelina em PBS. Quatro horas mais tarde, irradiaram-se os ratinhos com 15 Gy e monitorizou-se a sobrevivência dos ratinhos diariamente. A figura 15 apresenta secções histológicas (coradas com HE) de epitélio de intestino delgado de ratinhos que foram tratados com 15 Gy de radiação gama com ou sem injecção i.v. de flagelina a 0,25 mg/kg. A destruição completa de criptas e vilosidades em ratinhos de controlo contrasta com a morfologia aproximadamente normal de tecido de animais tratados com flagelina. A figura 16 apresenta o efeito de flagelina na sensibilidade de ratinhos a 10 Gy de radiação gama na totalidade do corpo. A figura 17 apresenta o efeito de flagelina injectada i.v. nos pontos temporais indicados antes de irradiação na sensibilidade a ratinhos a 13 Gy (esquerda) e 10 Gy (direita) de radiação gama na totalidade do corpo. A figura 18 apresenta o efeito de flagelina na sensibilidade de ratinhos a 10, 13 e 15 Gy de radiação gama na totalidade do corpo. A figura 19 apresenta a estrutura de domínio da flagelina bacteriana. Traçado do esqueleto Ca, distribuição do núcleo hidrofóbico e informação estrutural de F41. Quatro núcleos hidrofóbicos distintos que definem os domínios Dl, D2a, D2b e D3. Todos os átomos da cadeia lateral hidrofóbica apresentam-se com o esqueleto Ca. Os átomos das cadeias laterais apresentam-se com código de cores: Ala, amarelo; Leu, Ile ou Vai, laranja; Phe e Tyr, roxo (átomos de carbono) e vermelho (átomos de oxigénio). c,' Posição e região de várias características estruturas da sequência de aminoácidos da 13 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ flagelina. Apresentam-se, de baixo para cima, o fragmento F41 em azul; três dobras de folha beta a castanho; a distribuição da estrutura secundária com uma hélice alfa a verde, estrutura beta a verde e dobra beta a roxo; marca de plica a cada 650 resíduos a azul; domínios DO, Dl, D2 e D3; a região de contacto da subunidade axial dentro do proto-elemento a azul-turquesa; a região de aminoácidos bem conservada a vermelho e a região variável a violeta; mutações pontuais em F41 que produzem os elementos de diferentes super-hélices. As letras em baixo indicam a morfologia dos elementos mutantes: L (D107E, R124A, R124S, G426A), tipo L liso; R (A449V) , tipo R liso; C (D313Y, A414V, A427V, N433D), encaracolado 33. (Samatey et al, Nature 2001) .

DESCRIÇÃO DETALHADA O presente invento baseia-se na protecção de células e tecidos normais contra apoptose causada por stress, incluindo radioterapia e radiação. Existem dois mecanismos principais que controlam a apoptose na célula: a via p53 (pró-apoptótica) e a via NF-κΒ (anti-apoptótica) . Ambas as vias estão frequentemente desreguladas em tumores: normalmente perde-se p53, enquanto NF-κΒ se torna activa constitutivamente. Assim, a inibição de p53 e a activação de NF-κΒ em células normais pode protegê-las de morte causada por stress, tal como tratamento de cancro, sem tornar as células tumorais mais resistentes ao tratamento porque estas apresentam estes mecanismos de controlo desregulados. Tal contradiz a interpretação convencional sobre p53 e NF-κΒ, que são considerados alvos para activação e repressão, respectivamente. A presente divulgação refere-se a indução da actividade de NF-κΒ para proteger células normais de apoptose. Por indução da actividade de NF-κΗ num mamífero, as células normais podem ser protegidas de apoptose atribuível a stress celular, que ocorre em tratamentos de cancro e hipertermia; a exposição a doses de radiação nocivas, por exemplo, trabalhadores em centrais nucleares, indústria de armamento ou produção de radiofármacos e soldados; e envelhecimento celular. Dado que NF-κΒ está constitutivamente activo em muitas células tumorais, a indução de actividade de NF-κΒ pode proteger as células normais de apoptose sem proporcionar um efeito 14 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ benéfico às células tumorais. Quando as células normais se encontrarem reparadas, a actividade de NF-κΒ pode ser restabelecida para níveis normais. A actividade de NF-κΒ pode ser induzida para proteger tecidos sensíveis a radioterapia e quimioterapia, tais como os do sistema hematopoiético (incluindo o sistema imunitário), o epitélio intestinal e os folículos pilosos.

Os indutores de actividade de NF-κΒ podem também ser utilizados em várias outras aplicações. Podem ocorrer consequências patológicas e morte por exposição de mamíferos a uma variedade de condições graves incluindo, entre outras, radiação, ferimento, envenenamento, infecção, envelhecimento e choque térmico, pela actividade de mecanismos fisiológicos normais de resposta a stress, tais como indução de morte celular programada (apoptose) ou libertação de proteínas bioactivas, citoquinas. A apoptose funciona normalmente para "limpar" os tecidos de células em ferimentos e danificadas geneticamente, enquanto as citoquinas servem para mobilizar o sistema de defesa do organismo contra o patogénio. No entanto, em condições de ferimentos graves, ambos os mecanismos de resposta a stress podem por si só actuar como causa de morte. Por exemplo, a letalidade de radiação pode resultar de apoptose maciça mediada por p53 que ocorre nos sistemas hematopoiético, imunitário e digestivo. A regulação farmacológica racional de NF-κΒ pode aumentar a sobrevivência em condições de stress graves. 0 controlo destes factores pode permitir controlar tanto a resposta inflamatória, como a decisão de vida-morte de células de órgãos danificados. 0 papel protector de NF-κΒ é mediado por activação de transcrição de genes múltiplos que codificam: a) proteínas antiapoptóticas que bloqueiam ambas as vias apoptóticas principais, b) citoquinas e factores de crescimento que induzem proliferação e sobrevivência de HP e de outras células estaminais e c) proteínas antioxidantes que são potentes eliminadoras de ROS, tais como MnSOD (SOD-2). Assim, através de activação temporal de NF-ΚΒ para radioprotecção, pode ser possível conseguir não só supressão de apoptose em doentes de cancro, mas também a capacidade de reduzir a taxa de 15 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ incidência de cancro secundário devido ao efeito imunoestimulante simultâneo, que pode ser conseguido caso a activação de NF-κΒ seja atingida através de activação de receptores de tipo Toll.

Outra propriedade atraente da via NF-κΒ como alvo é a sua activação por numerosos factores naturais que podem ser considerados como candidatos a radioprotectores. Entre estes encontram-se múltiplos padrões moleculares associados a patogénios (PAMP). Os PAMP são moléculas que não se encontram no organismo hospedeiro, são caracteristicas de um vasto grupo de patogénios e não podem ser mutadas facilmente. São reconhecidos por receptores do tipo Toll (TLR), os elementos sensores chave da imunidade inata. Os TLR actuam como um primeiro mecanismo de aviso do sistema imunitário por indução de migração e activação de células imunitárias directamente ou através de libertação de citoquina. Os TLR são proteínas membranares de tipo I, que se sabe que actuam como homodímeros e heterodímeros. Através de ligação de ligando, os TLR recrutam proteína MyD88, um adaptador de sinalização indispensável para a maioria dos TLR. A cascata de sinalização que se segue leva a efeitos incluindo (i) activação da via NF-κΒ e (ii) activação de MAPK, incluindo Jun N-terminal quinase (JNK). A activação da via NF-κΒ por ligandos de receptor do tipo Toll torna os ligandos atraentes como possíveis radioprotectores. Contrariamente às citoquinas, muitos PAMP têm poucos efeitos além de activar os TLR e assim é pouco provável que produzam efeitos secundários. Além disso, muitos PAMP encontram-se presentes em humanos.

De modo consistente com a sua função de activação de imunócitos, todos os TLR são expressos no baço e em leucócitos de sangue periférico, com padrões de expressão mais específicos de TLR noutros órgãos linfóides e em subconjuntos de leucócitos. No entanto, os TLR também são expressos noutros tecidos e órgãos do corpo, e.g., TLRl é expresso de forma ubíqua, TLR5 também se encontra em epitélio e endotélio GI, enquanto se sabe que TLR 2, 6, 7 e 8 são expressos no pulmão. 1. Definições

Deve entender-se que a terminologia aqui utilizada tem apenas como objectivo a descrição de determinadas 16 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ concretizações e não deve ser entendida como limitante. Deve salientar-se que, tal como utilizadas no fascículo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem as suas versões no plural, salvo se o contexto indicar claramente o contrário.

Tal como aqui utilizadas, as expressões "administrar" quando utilizadas para descrever a dosagem de um agente que induz actividade de nf-kB, significam uma dose única ou doses múltiplas do agente.

Tal como aqui utilizada, a expressão "análogo", quando utilizada no contexto de um péptido ou polipéptido, significa um péptido ou polipéptido compreendendo um ou mais aminoácidos não padrão ou outras variações estruturais do conjunto convencional de aminoácidos.

Tal como aqui utilizada, a expressão "anticorpo" significa um anticorpo de classes IgG, igM, igA, igD ou igE, ou seus fragmentos ou derivados, incluindo Fab, F(ab')2, Fd e anticorpos em cadeia simples, diacorpos, anticorpos biespecíficos, anticorpos bifuncionais e seus derivados. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, anticorpo purificado por afinidade ou suas misturas que apresente especificidade de ligação suficiente para um epítopo pretendido ou uma sequência deste derivada. O anticorpo pode também ser um anticorpo quimérico. O anticorpo pode ser derivatizado por ligação de uma ou mais partes químicas, peptídicas, ou polipeptídicas conhecidas na especialidade. O anticorpo pode ser conjugado com uma parte química.

Tal como aqui utilizada, "apoptose" refere-se a uma forma de morte celular que inclui contracção progressiva do volume celular com a preservação da integridade dos organelos citoplasmáticos; condensação de cromatina (i.e., condensação nuclear), tal como avaliada por microscopia óptica ou electrónica; e/ou clivagem de ADN em fragmentos do tamanho do nucleossoma, tal como determinado por ensaios de sedimentação por centrifugação. A morte celular ocorre quando a integridade membranar da célula se perde (e.g., formação de bolha na 17 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ membrana) com submersão de fragmentos celulares intactos ("corpos apoptóticos") por células fagocíticas.

Tal como aqui utilizada, a expressão "cancro" significa qualquer condição caracterizada por resistência a estímulos apoptóticos.

Tal como aqui utilizada, a expressão "tratamento de cancro" significa qualquer tratamento para cancro conhecido na especialidade incluindo, entre outros, quimioterapia e radioterapia.

Tal como aqui utilizada, a expressão "em combinação com" quando utilizada para descrever a administração de um agente que induz a actividade de NF-κΒ e um tratamento adicional significa que o agente pode ser administrado antes, conjuntamente ou após o tratamento adicional ou uma sua combinação.

Tal como aqui utilizada, a expressão "derivado" quando utilizada no contexto de um péptido ou polipéptido, significa um péptido ou polipéptido diferente mas não na estrutura primária (aminoácidos e análogos de aminoácidos). A título ilustrativo, os derivados podem diferir por estarem glicosilados, uma forma de modificação pós-tradução. Por exemplo, os péptidos ou polipéptidos podem apresentar padrões de glicosilação devido a expressão em sistemas heterólogos. Se pelo menos uma actividade biológica é retida, então estes péptidos ou polipéptidos são derivados de acordo com o invento. Outros derivados incluem, entre outros, péptidos de fusão ou polipéptidos de fusão com um terminal N ou C modificados covalentemente, péptidos ou polipéptidos conjugados a PEG, péptidos ou polipéptidos associados com partes lipídicas, péptidos ou polipéptidos alquilados, péptidos ou polipéptidos ligados através de um grupo funcional da cadeia lateral de aminoácidos a outros péptidos, polipéptidos ou produtos químicos e modificações adicionais tais como seriam entendidas na especialidade.

Tal como aqui utilizada, a expressão "flagelina" significa flagelina de qualquer fonte incluindo, entre outras, qualquer espécie bacteriana. A flagelina pode ser de uma espécie de 18 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ Sâlmonella. Também se consideram especificamente fragmentos, variantes, análogos, homólogos ou derivados da referida flagelina; e suas combinações. Os vários fragmentos, variantes, análogos, homólogos ou derivados aqui descritos podem ser 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idênticos a flagelina de tipo selvagem.

Tal como aqui utilizada, a expressão "fragmento", quando utilizada no contexto de um péptido ou polipéptido, significa péptidos de cerca de 8 a cerca de 50 aminoácidos de comprimento. 0 fragmento pode ter 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 aminoácidos de comprimento.

Tal como aqui utilizada, a expressão "homólogo", quando utilizada no contexto de um péptido ou polipéptido, significa um péptido ou polipéptido que partilha um antepassado de evolução comum.

Tal como aqui utilizada, a expressão "TGFp latente" significa um precursor de TGFp que não é uma forma activa. Um TGFp latente pode ser um precursor de ΤΰΕβ contendo TGFp activo e péptido associado a latência (LAP). Um τυρβ latente pode também compreender LAP ligado a proteína de ligação de Τ6Ρβ latente. Um ΤΰΡβ latente pode também ser um complexo latente grande. Além disso, um ΤΰΡβ latente pode ser um ΤόΓβ latente que é modificado de modo que a taxa de conversão a ΤΰΡβ activo ou a capacidade de ser convertido a ΤΰΡβ foi diminuída. Ο τυΡβ latente modificado pode ser, por exemplo, um τυΡβ mutante que impede ou diminui a conversão a Τ6Ρβ activo.

Tal como aqui utilizada, a expressão "τυΡβ" significa qualquer isoforma de ΤΰΡβ activo ou latente incluindo, entre outros, ΤΰΡβΙ, TGF β2, Τ0Ρβ3, Τ0Ρβ4 ou Τ0Ρβ5 e suas combinações. Também se consideram especificamente fragmentos, variantes, análogos, homólogos ou derivados das referidas isoformas de τυΡβ e suas combinações. Os vários fragmentos, variantes, análogos, homólogos ou derivados aqui descritos podem ser 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idênticos a uma isoforma de ΤΟΡβ. 19 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ

Tal como aqui utilizada, a expressão "tratar" ou "tratamento" quando se refere a protecção de um mamífero de uma condição, significa prevenir, suprimir, reprimir ou eliminar a condição. Prevenir a condição envolve administrar uma composição deste invento a um mamífero antes do início da condição. Suprimir a condição envolve administrar uma composição deste invento a um mamífero após indução da condição mas antes do seu aparecimento clínico. Reprimir a condição envolve administrar uma composição deste invento a um mamífero após aparecimento clínico da condição de modo que a condição seja reduzida ou mantida. Eliminação da condição envolve administrar uma composição deste invento a um mamífero após aparecimento clínico da condição de modo que o mamífero deixe de sofrer da condição.

Tal como aqui utilizada, a expressão "célula tumoral" significa qualquer célula caracterizada por resistência a estímulos apoptóticos.

Tal como aqui utilizada, a expressão "variante", quando utilizada no contexto de um péptido ou polipéptido, significa um péptido ou polipéptido que difere na sequência de aminoácidos pela inserção, deleção ou substituição conservativa de aminoácidos, mas que mantém pelo menos uma actividade biológica. Para os objectivos deste invento, "actividade biológica" inclui, entre outras, a capacidade de se ligar a um anticorpo específico. Uma substituição conservativa de um aminoácido, i.e., substituição de um aminoácido por um aminoácido diferente com propriedades semelhantes (e.g., hidrofilicidade, grau e distribuição de regiões carregadas) é reconhecida na especialidade como envolvendo tipicamente uma alteração pequena. Estas alterações pequenas podem ser identificadas, em parte, considerando o índice hidropático dos aminoácidos, tal como entendido na especialidade. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). O índice hidropático de um aminoácido baseia-se na consideração da sua hidrofobicidade e carga. Sabe-se na especialidade que os aminoácidos com índices hidropáticos semelhantes podem ser substituídos e manter ainda a função da proteína. Num aspecto, os aminoácidos com índices hidropáticos de V 2 são substituídos. A hidrofilicidade de aminoácidos pode também ser utilizada para revelar substituições que 20 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ resultariam em proteínas que mantêm a função biológica.

Considerando a hidrofilicidade de aminoácidos no contexto de um péptido pode calcular-se a maior hidrofilicidade média local desse péptido, uma medida útil que foi relatada como correlacionando-se bem com antigenicidade e imunogenicidade. Patente U.S. N° 4 554 101. A substituição de aminoácidos com valores de hidrofilicidade semelhantes pode resultar em péptidos que mantêm a actividade biológica, por exemplo imunogenicidade, tal como é entendido na especialidade. Num aspecto, as substituições são efectuadas com aminoácidos que têm valores de hidrof ilicidade dentro da gama de ±2 um do outro. Tanto o índice de hidrofobicidade, como o valor de hidrofilicidade de aminoácidos são influenciados pela cadeia lateral específica desse aminoácido. De forma consistente com essa observação, sabe-se que as substituições de aminoácidos que são compatíveis com a função biológica dependem da similaridade relativa dos aminoácidos e, em particular, das cadeias laterais desses aminoácidos, tal como divulgado pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e outras propriedades. 2. Métodos de tratamento a. Tumor com NF-κΒ activo constitutivamente

Revela-se aqui um método para tratar um mamífero que sofre de um cancro com NF-κΒ activo constitutivamente compreendendo administrar ao mamífero uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que induz actividade de NF-κΒ. 0 agente que induz actividade de NF-kB pode ser administrado em combinação com um tratamento de cancro. 0 agente pode ser administrado simultânea ou metronomicamente com outros tratamentos anticancro, tais como quimioterapia e radioterapia. A expressão "simultânea" ou "simultaneamente", tal como aqui utilizada, significa que o outro tratamento anticancro e o composto deste invento são administrados num intervalo de 48 horas, de preferência 24 horas, com maior preferência 12 horas, ainda com mais preferência 6 horas e com a maior preferência 3 horas ou menos, um do outro. A expressão "metronomicamente", tal como aqui utilizada, significa a administração dos compostos em 21 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ tempos diferentes da quimioterapia e a uma determinada frequência relativamente a administração repetida e/ou regime de quimioterapia. O agente pode ser administrado em qualquer altura antes da exposição ao tratamento de cancro incluindo, entre outros, cerca de 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h,

10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h ou 1 h antes da exposição. O agente pode ser administrado em qualquer altura após exposição ao tratamento de cancro incluindo, entre outros, cerca de 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 26 h, 28 h, 30 h, 32 h, 34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 42 h, 44 h, 46 h ou 48 h após exposição. O tratamento de cancro pode compreender a administração de um agente citotóxico ou agente citostático ou uma sua combinação. Os agentes citotóxicos impedem que as células de cancro se multipliquem através de: (1) interferência com a capacidade das células replicarem o ADN e (2) indução de morte celular e/ou apoptose nas células de cancro. Os agentes citostáticos actuam através de modulação, interferência ou inibição dos processos de transdução de sinalização celular que regula a proliferação celular e por vezes a níveis baixos contínuos.

As classes de compostos que podem ser utilizados como agentes citotóxicos incluem os seguintes: agentes alquilantes (incluindo, sem limitações, mostardas de azoto, derivados de etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureias e triazenos): mostarda de uracilo, clormetina, ciclofosfamida (Cytoxan®), ifosfamida, melfalano, clorambucilo, pipobromano, trietilenomelamina, trietilenotiofosforamina, bussulfano, carmustina, lomustina, estreptozocina, dacarbazina e temozolomida; antimetabolitos (incluindo, sem limitações, antagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores de adenosina-desaminase): metotrexato, 5- fluorouracilo, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, fosfato de fludarabina, pentostatina e gemcitabina; produtos naturais e seus derivados (por exemplo, alcaloides de vinca, antibióticos antitumorais; enzimas, linfoquinas e epipodofilotoxinas): vinblastina, vincristina, 22 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ vindesina, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, ara-c, paclitaxel (paclitaxel está disponível comercialmente como Taxol®), mitramicina, desoxicoformicina, initomicina-c, 1-asparaginase, interferões (de preferência IFN-α), etoposido e teniposido.

Outros agentes citotóxicos proliferativos são navelbina, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosamida e droloxafina.

Os agentes que afectam os microtúbulos interferem com a mitose celular e são bem conhecidos na especialidade pela sua actividade citotóxica. Os agentes que afectam os microtúbulos úteis no invento incluem, entre outros, alocolquicina (NSC 406042), halicondrina B (NSC 609395), colquicina (NSC 757), derivados de colquicina (e.g., NSC 33410), dolastatina 10 (NSC 376128), maitansina (NSC 153858), rizoxina (NSC 332598), paclitaxel (Taxol®, NSC 125973), derivados de Taxol® (e.g., derivados (e.g., NSC 608832), tiocolquicina NSC 361792), tritilcisteína (NSC 83265), sulfato de vinblastina (NSC 49842), sulfato de vincristina (NSC 67574), epotilonas naturais e sintéticas incluindo, entre outras, epotilona A, epotilona B e discodermolide (consultar Service, (1996) Science, 274:2009) estramustina, nocodazole, MAP4 e semelhantes. Descrevem-se também exemplos de tais agentes em Bulinski (1997) J. Cell Sei. 110:3055 3064; Panda (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:10560-10564; Muhlradt (1997) Câncer Res. 57:3344-3346; Nicolaou (1997) Nature 387:268-272; Vasquez (1997) Mol. Biol. Cell. 8:973-985; e Panda (1996) J. Biol. Chem 271:29807-29812. São também adequados agentes citotóxicos tais como epidofilotoxina; uma enzima antineoplásica; um inibidor de topoisomerase; procarbazina; mitoxantrona; complexos de coordenação de platina tais como cisplatina e carboplatina; modificadores da resposta biológica; inibidores de crescimento; agentes terapêuticos anti-hormonais; leucovorina; tegafur; e factores de crescimento hematopoiéticos.

Os agentes citostáticos que podem ser utilizados incluem, entre outros, hormonas e esteróides (incluindo análogos sintéticos): 17-alfa-etinilestradiol, dietilestilbestrol, 23 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ testosterona, prednisona, fluoximesterona, propionato de dromostanolona, testolactona, megestrolacetato, metilprednisolona, metiltestosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, acetato de medroxiprogesterona, leuprolide, flutamide, toremifeno, zoladex.

Incluem-se também outros agentes citostáticos que são antiangiogénicos tais como inibidores de metaloproteinase de matriz e outros inibidores de VEGF, tais como anticorpos anti-VEGF e pequenas moléculas tais como ZD6474 e SU6668. Podem também ser utilizados anticorpos anti-Her2 de Genentech. Um inibidor de EGFR adequado é EKB-569 (um inibidor irreversível). Também se incluem anticorpo C225 Imolone imuno-específico para EGFR e inibidores de src. É também adequado para utilização como um agente citostático Casodex® (bicalutamida, Astra Zeneca) que torna os carcinomas dependentes de androgénio não proliferativos. É ainda outro exemplo de um agente citostático o agente anti-estrogénio Tamoxifen® que inibe a proliferação ou crescimento de cancro de mama dependente de estrogénio. Os inibidores da transdução de sinais de proliferação celular são agentes citostáticos. Os exemplos representativos incluem inibidores de factor de crescimento epidérmico, inibidores de Her-2, inibidores de MEK-1 quinase, inibidores de MAPK quinase, inibidores de PI3, inibidores de Src quinase e inibidores de PDGF .

Podem tratar-se vários cancros incluindo, entre outros, os seguintes: carcinoma incluindo o de bexiga (incluindo cancro de bexiga acelerado e metastático), mama, cólon (incluindo cancro colorrectal), rim, fígado, pulmão (incluindo cancro de pulmão de células pequenas e de células não pequenas e adenocarcinoma de pulmão), ovários, próstata, testículos, tracto genito-urinário, sistema linfático, recto, laringe, pâncreas (incluindo carcinoma pancreático exócrino), esófago, estômago, vesícula biliar, cérvix, tiróide e pele (incluindo carcinoma das células escamosas); tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, 24 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ linfoma de células T, linfoma de Hodgkins, linfoma não Hodgkins, linfoma das células pilosas, linfoma histiocítico e linfoma de Burkatts; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide incluindo leucemias mielogénicas agudas e crónicas, sindrome mielodisplásico, leucemia mielóide e leucemia pró-mielocitica; tumores do sistema nervoso central e periférico incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwanomas; tumores de origem mesenquimal incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores incluindo melanoma, xenoderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, cancro folicular da tiróide e teratocarcinoma. b. Tratamento de efeitos secundários de tratamento de cancro

Revela-se aqui um método para tratar um mamífero que sofre de danos no tecido normal atribuível a tratamento de um cancro com NF-κΒ activo constitutivamente compreendendo administrar ao mamífero uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que induz actividade de NF-κΒ. 0 agente que induz actividade de NF-κΒ pode ser administrado em combinação com um tratamento de cancro descrito anteriormente. c. Modulação de envelhecimento celular

Revela-se aqui um método para modular o envelhecimento celular num mamífero, compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que induz actividade de NF-κΒ. 0 agente que induz actividade de NF-kB pode ser administrado em combinação com outros tratamentos. O agente pode ser administrado em qualquer altura antes da administração do outro tratamento incluindo, entre outros, cerca de 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h ou 1 h antes de administração. O agente pode ser administrado em qualquer altura depois da administração do outro tratamento incluindo, entre outros, cerca de 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 26 h, 28 h, 30 h, 32 h, 34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 42 h, 44 h, 46 h ou 48 h após administração. 25 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ d. Tratamento de stress

Esta divulgação também se refere a um método para tratar um mamífero que sofre de danos no tecido normal atribuíveis a stress, compreendendo administrar ao mamífero uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que induz actividade de NF-κΒ. O agente que induz actividade de NF-κΒ pode ser administrado em combinação com outros tratamentos. O stress pode ser atribuível a qualquer fonte incluindo, entre outros, radiação, ferimento, envenenamento, infecção e choque térmico.

Pode administrar-se a composição compreendendo um indutor de NF-kB em qualquer altura antes da exposição ao stress incluindo , entre outros , cerca de 48 h , 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h ou 1 h antes de exposição. A composição compreendendo um indutor de NF-κΒ pode ser administrada em qualquer altura após a exposição a stress incluindo, entre outros, cerca de 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 26 h, 28 h, 30 h, 32 h, 34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 42 h, 44 h, 46 h ou 48 h após exposição. e. Radiação

Este invento refere-se à protecção de células dos efeitos de exposição à radiação. A danificação e morte de células normais por radiação ionizante é uma combinação de danos directos induzidos por radiação das células expostas e de uma reacção celular programada geneticamente activa a stress induzido por radiação, resultando numa morte suicida ou apoptose. A apoptose desempenha um papel chave na perda celular maciça que ocorre em vários órgãos sensíveis a radiação (i.e., sistemas hematopoiético e imunitário, epitélio do tracto digestivo, etc.), cuja falha determina a sensibilidade geral a radiação do organismo. A exposição a radiação ionizante (IR) pode ser a curto ou longo prazo, pode ser aplicada em doses únicas ou múltiplas, a todo o corpo ou localmente. Assim, os acidentes nucleares ou ataques militares podem envolver exposição a única dose elevada de irradiação em todo o corpo (por vezes seguido de 26 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ envenenamento a longo prazo com isótopos radioactivos). Tal também se aplica (com controlo rigoroso da dose aplicada) para o pré-tratamento de doentes para transplante de medula óssea quando é necessário preparar os órgãos hematopoiéticos para a medula do dador por "limpeza" destes dos precursores de sangue do hospedeiro. O tratamento de cancro pode envolver doses múltiplas de irradiação local que excede largamente a dose letal se fosse aplicada como irradiação de todo o corpo. O envenenamento ou tratamento com isótopos radioactivos resulta em exposição local a longo prazo à radiação de órgãos alvo (e.g., glândula tiróide no caso de inalação de 1251). Finalmente, existem muitas formas físicas de radiação ionizante que diferem significativamente na gravidade dos efeitos biológicos. A nível molecular e celular, as partículas de radiação são capazes de produzir quebra e reticulação do ADN, proteínas, membranas celulares e outras estruturas macromoleculares. A radiação ionizante também induz danos secundários aos componentes celulares através da formação de radicais livres e espécies reactivas de oxigénio (ROS). Vários sistemas de reparação contrariam estes danos, tais como várias vias de reparação de ADN que restabelecem a integridade e fidelidade do ADN e produtos químicos e enzimas antioxidantes que removem os radicais livres e ROS e reduzem as proteínas e lípidos oxidados. Os sistemas de verificação celular detectam os defeitos de ADN e atrasam a progressão do ciclo celular até que o dano seja reparado ou até se atingir a decisão de sujeitar a célula a paragem de crescimento ou morte celular programada (apoptose). A radiação pode causar danos a organismos mamíferos desde efeitos mutagénicos e carcinogéneos pouco graves a baixas doses, até morte quase imediata a doses elevadas. A sensibilidade global a radiação do organismo é determinada por alterações patológicas desenvolvidas em vários tecidos sensíveis, que incluem o sistema hematopoiético, o sistema reprodutor e vários epitélios com taxa elevadas de renovação celular. O resultado patológico agudo da irradiação gama que leva a morte é diferente para doses diferentes e é determinado pela 27 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ falha de determinados órgãos que definem o limite da sensibilidade do organismo a cada dose particular. Assim, a letalidade a baixas doses ocorre por aplasia da medula óssea, enquanto doses moderadas matam mais rapidamente por indução de sindrome gastrointestinal (GI). As doses muito elevadas de radiação podem causar morte quase imediata devido a desencadearem degenerescência neuronal.

Os organismos que sobrevivem um periodo de toxicidade aguda de radiação podem sofrer de consequências remotas a longo prazo que incluem carcinogénese e fibrose induzidas por radiação, que se desenvolvem em órgãos expostos (e.g.; rim, fígado ou pulmões) meses e anos após irradiação. O ADN celular é o alvo principal de IR que causam vários tipos de danos ao ADN (stress genotóxico) por mecanismos directos e indirectos (baseados em radicais livres). Todos os organismos mantêm um sistema de reparação de ADN capaz de recuperação eficaz de ADN danificado por radiação; os erros no processo de reparação de ADN podem levar a mutações.

Os tumores são em geral mais sensíveis a radiação gama e podem ser tratados com doses locais múltiplas de radiação que causam danos relativamente baixos a tecidos normais. No entanto, em alguns casos, os danos a tecidos normais são um factor limitante na aplicação de radiação gama para tratamento de cancro. A utilização de irradiação gama durante terapia de cancro por aplicação conformai tridimensional convencional, ou mesmo a aplicação BeamCath mais focada apresentam toxicidade que limitam a dose causada pelo efeito cumulativo de irradiação e que induz danos nas células estaminais de tecidos normais em renovação rápida, tal como a medula óssea e o tracto gastrointestinal (GI).

Em doses elevadas, a letalidade induzida por radiação está associada aos denominados síndromes de radiação hematopoiética e gastrointestinal. A sindrome hematopoiética é caracterizada pela perda de células hematopoiéticas e dos seus progenitores tornando impossível a regeneração do sangue e do sistema linfóide. Ocorre usualmente morte como consequência de infecção (resultante da imunossupressão), hemorragia e/ou anemia. A sindrome GI é causada por morte celular maciça no 28 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ epitélio intestinal, predominantemente no intestino delgado, seguido de desintegração da parede intestinal e morte por bacteriemia e sépsis. A sindrome hematopoiética é usualmente prevalecente às doses mais baixas de radiação e leva a uma morte mais tardia do que a sindrome GI.

No passado, os radioprotectores eram tipicamente antioxidantes - tanto sintéticos como naturais. Mais recentemente, adicionaram-se citoquinas e factores de crescimento à lista de radioprotectores; considera-se que o mecanismo da sua radioprotecção é resultado de facilitarem o efeito de regeneração de tecidos sensíveis. Não existe uma distinção funcional clara entre os dois grupos de radioprotectores, no entanto, dado que algumas citoquinas induzem a expressão de proteínas antioxidantes celulares, tais como superóxido-dismutase de manganês (MnSOD) e metalotioneina. A medida de protecção para um determinado agente é expressa como factor de modificação de dose (DMF ou DRF) . O DMF é determinado por irradiação do indivíduo tratado com radioprotector e de indivíduos não tratados de controlo com uma gama de doses de radiação e seguidamente comparação da sobrevivência ou de algum outro critério. O DMF é usualmente calculado para uma sobrevivência de 30 dias (LD50/30 relativo ao tratamento com o fármaco dividido por LD50/30 relativo ao tratamento com veículo) e quantifica a protecção do sistema hematopoiético. De modo a estimar a protecção ao sistema gastrointestinal, calcula-se LD50 e DMF para sobrevivência aos 6 ou 7 dias. Os valores de DMF aqui apresentados são para 30 dias, salvo indicação em contrário.

Os indutores de NF-κΒ têm actividade pró-sobrevivência forte ao nível celular e no organismo como um todo. Em resposta a doses de radiação super-letais, os indutores de NF-κΒ inibem tanto a sindrome gastrointestinal como a hematopoiética que são as principais causas de morte por exposição a radiação aguda. Em resultado destas propriedades, podem utilizar-se indutores de NF-κΒ para tratar os efeitos de eventos de radiação natural e de acidentes nucleares. Além disso, dado que os indutores de NF-κΒ actuam através de um mecanismo diferente de todos os radioprotectores que se 29 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ conhecem actualmente, estes podem ser utilizados em combinação com outros radioprotectores, aumentando assim drasticamente a escala de protecção de radiação ionizante.

Contrariamente aos agentes radioprotectores convencionais (e.g., captadores de radicais livres), os agentes antiapoptóticos podem não reduzir os danos primários mediados por radiação mas podem actuar contra os eventos secundários que envolvem reacção celular activa ao dano primário, complementando assim as linhas de defesa existentes. A pifitrina alfa, um inibidor farmacológico de p53 (um mediador chave da resposta a radiação em células de mamífero), é um exemplo desta nova classe de radioprotectores. No entanto, a actividade dos inibidores de p53 é limitada à protecção do sistema hematopoiético e não tem qualquer efeito protector no tracto digestivo (síndrome gastrointestinal), reduzindo assim, o valor terapêutico destes compostos. São necessários urgentemente fármacos antiapoptóticos com uma maior gama de actividade.

Os indutores de NF-κΒ podem ser utilizados como um agente radioprotector para aumentar a gama de doses de radiação toleráveis por aumento da resistência à radiação do organismo humano além dos níveis atingíveis pelas medidas actualmente disponíveis (blindagem e aplicação de agentes bioprotectores existentes) e aumentar drasticamente as hipóteses de sobrevivência da tripulação no caso de acidentes nucleares a bordo ou eventos de partículas de sonar em larga escala. Com um DMF (sobrevivência a 30 dias) aproximado superior a 1,5, o indutor de NF-κΒ flagelina é mais eficaz do que qualquer composto natural relatado actualmente.

Os indutores de NF-κΒ são também úteis para tratar perda de células insubstituíveis causada por irradiação em doses baixas, por exemplo, no sistema nervoso central e órgãos reprodutores. Os indutores de NF-κΒ podem também ser utilizados durante a quimioterapia de cancro para tratar os efeitos secundários associados a quimioterapia, incluindo alopecia.

Pode tratar-se um mamífero para exposição à radiação, por administração ao mamífero de uma composição compreendendo uma 30 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo um indutor de NF-κΒ. A composição compreendendo um indutor de NF-κΒ pode ser administrada em combinação com um ou mais radioprotectores. Os radioprotectores podem ser quaisquer agentes que tratem os efeitos de exposição a radiação incluindo, entre outros, antioxidantes, captadores de radicais livres e citoquinas.

Os indutores de NF-κΒ podem inibir morte celular programada induzida pela radiação em resposta a danos no ADN e outras estruturas celulares; contudo, os indutores de NF-kB podem não lidar com os danos das células e podem não evitar as mutações. Os radicais livres e as espécies reactivas de oxigénio (ROS) são a principal causa de mutações e outros danos intracelulares. Os antioxidantes e os eliminadores de radicais livres são eficazes na prevenção de danos pelos radicais livres. A combinação de um indutor de NF-κΒ e de um antioxidante ou eliminador de radicais livres pode resultar em lesões menos extensas, maior sobrevivência e saúde melhorada para os mamíferos expostos à radiação. Os antioxidantes e os eliminadores de radicais livres que podem ser utilizados na prática do invento incluem, entre outros, tióis, tais como cisteina, cisteamina, glutationa e bilirrubina; amifostina (WR-2721); vitamina A; vitamina C; vitamina E; e flavonóides tais como manjericão sagrado (Ocirnum sanctum), orientina e vicenina.

Podem também administrar-se indutores de NF-κΒ em combinação com várias citoquinas e factores de crescimento que conferem radioprotecção por reabastecimento e/ou protecção das populações de células estaminais, que são radiossensiveis. Pode obter-se radioprotecção com efeitos secundários muito diminuídos pela utilização de factor de células estaminais (SCF, ligante de c-kit), de ligante Flt-3 e do fragmento de interleuquina-1, IL-lb-rd. Pode obter-se protecção através de indução de proliferação de células estaminais (todas as citoquinas mencionadas) e prevenção da sua apoptose (SCF) . O tratamento permite a acumulação de leucócitos e seus precursores antes da irradiação permitindo assim uma reconstituição mais rápida do sistema imunitário após irradiação. A SCF salva eficazmente ratinhos irradiados letalmente com DMF na gama 1,3-1,35 e é também eficaz contra a 31 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ síndrome gastrointestinal. Ο ligante Flt-3 também proporciona uma elevada protecção em ratinhos (70-80% de sobrevivência a 30 dias a LD 100/30, equivalente a DMF>1,2) e em coelhos (15, 16) . Vários factores, que, dada a sua natureza, não são citoquinas estimulam a proliferação dos imunócitos e podem ser utilizados em combinação com indutores de NF-κΒ. O 5-AED (5-androstenodiol) é um esteróide que estimula a expressão de citoquinas e aumenta a resistência a infecções bacterianas e viricas. Uma injecção subcutânea de 5-AED em ratinhos 24 h antes da irradiação melhorou a sobrevivência com DMF=1,26. Podem também ser utilizados compostos sintéticos, tais como tricloro(dioxoetileno-O,0'-)telurato de amónio (AS-101), para induzir excreção de várias citoquinas e para combinação com indutores de NF-kB.

Podem também utilizar-se factores de crescimento e citoquinas para proporcionar protecção contra a síndrome gastrointestinal. O factor de crescimento queratinocítico (KGF) promove a proliferação e diferenciação da mucosa intestinal e aumenta a sobrevivência celular após irradiação nas criptas intestinais. A citoquina hematopoiética e a SCF radioprotectora também podem aumentar sobrevivência de células estaminais intestinais e a sobrevivência de curto prazo do organismo que lhes está associado.

Os indutores de NF-κΒ podem proporcionar protecção contra as síndromes gastrointestinal (GI) e hematopoiética. Uma composição compreendendo um indutor de NF-κΒ e um ou mais inibidores de síndrome GI podem ser mais eficazes, dado que ratinhos expostos a 15 Gy de irradiação letal em todo o corpo morreram, na sua maioria de síndrome GI. Podem ser utilizados na prática do invento inibidores da síndrome GI incluindo, entre outros, citoquinas tais como SCF e KGF. A composição compreendendo um indutor de NF-κΒ pode ser administrada em qualquer altura anterior à exposição à radiação incluindo, entre outros, cerca de 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h ou 1 h antes da exposição. A composição compreendendo um 32 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ indutor de NF-κΒ pode ser administrada em qualquer altura após exposição à radiação incluindo, entre outros, cerca de 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 26 h, 28 h, 30 h, 32 h, 34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 42 h, 44 h, 46 h, ou 48 h após exposição à radiação. 3. Agente

Revela-se aqui um agente que induz actividade de NF-κΒ. O agente pode ser um composto sintetizado artificialmente ou um composto de ocorrência natural. O agente pode ser um composto de baixo peso molecular, polipéptido ou péptido ou um seu fragmento, análogo, homólogo, variante ou derivado. 0 agente pode também ser uma citoquina que induz NF-kB incluindo, entre outras, IL2, IL6, TNF e TGFp. O agente pode também ser uma prostaglandina. O agente pode também ser um factor de crescimento incluindo, entre outros, KGF e PDGF. O agente pode também ser um anticorpo que induz actividade de NF-kB. a. Flagelina O agente pode ser flagelina, que pode ser de uma bactéria incluindo, entre outras, uma espécie de Salmonella, tal como S. typhimurium. Tal como apresentado nos exemplos que se seguem a flagelina apresenta uma forte actividade pró-sobrevivência ao nivel celular e no organismo na sua globalidade.

Pode obter-se um fragmento, variante, análogo, homólogo ou derivado de um indutor de NF-κΒ, tal como flagelina, com propriedades benéficas, por concepção racional baseada na estrutura do dominio de flagelina. A estrutura de domínio da flagelina de Salmonella está descrita na literatura (figura 19). A flagelina tem domínios conservados (Dl e D2) no terminal N e no terminal C e um domínio hipervariável no meio (D3) (Samatey, et at 2001, Eaves-Pyles T, et al 2001a) . Os resultados com uma proteína recombinante contendo os aminos Dl e D2 e os carboxilos Dl e D2 separados por uma ansa de Escherichia coli (ND1-2/ECH/CD2) indicam que Dl e D2 são bioactivos quando acoplados a um elemento ECH. Esta quimera, 33 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ mas não a ansa sozinha, induziu degradação de ΙκΒα, activação de NF-κΒ e produção de NO e IL-8 em duas linhas celulares epiteliais intestinais. O dominio não conservado D3 está à superfície do filamento flagelar e contém os principais epítopos antigénicos. A potente actividade pró-inflamatória da flagelina pode residir nas regiões altamente conservadas em N e C, Dl e D2. b. Indutores de NF-κΒ do parasita

As propriedades da flagelina sugerem que se podem encontrar moduladores de NF-κΒ adicionais nos parasitas. Há vários parasitas que dependem da repressão de apoptose dado que não conseguem sobreviver sem as células do hospedeiro. Estes organismos podem ter-se adaptado a uma persistência eficaz no organismo hospedeiro através da excreção de factores antiapoptose. Tal como os tumores avançados, os factores excretados por estes organismos podem ser capazes de aumentar a sua própria sobrevivência e resolver o seu conflito com o mecanismo de defesa de resposta ao stress do hospedeiro.

Os factores antiapoptose de organismos parasitas ou simbióticos atravessaram milhões de anos de adaptação para minimizar danos ao organismo hospedeiro que afectariam a viabilidade. Como resultado, estes factores podem necessitar de poucas ou nenhumas modificações adicionais e podem ser utilizados directamente tal como são ou com muito poucas modificações. Os factores podem ser úteis para tratar apoptose mediada pelo stress, tal como efeitos secundários associados a quimioterapia e radioterapia.

Revelam-se aqui métodos para rastrear parasitas para identificar moduladores de NF-κΒ. Os moduladores candidatos podem ser de parasitas de primatas humanos ou não humanos. Os parasitas são preferentemente parasitas extracelulares do hospedeiro. Os parasitas podem também ser simbiontes. Os parasitas dos quais se podem isolar moduladores incluem, entre outros, Mycoplasma, Chlamydia e Salmonella. Estes moduladores podem ser identificados utilizando os métodos de rastreio aqui descritos, assim como por abordagens de selecção bioquímica e genética, ensaios in vitro, agentes de protecção de morte celular e in vivo. 34 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ 4. Composição

Revela-se aqui uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um indutor de NF-κΒ. A composição pode ser uma composição farmacêutica, que pode ser produzida utilizando métodos bem conhecidos na especialidade. Tal como anteriormente descrito, a composição que compreende um indutor de NT-κΒ pode ser administrada a um mamífero para o tratamento de doenças associadas a apoptose incluindo, entre outras, exposição à radiação, efeitos secundários de tratamentos de cancro, stress e envelhecimento celular. A composição pode também compreender agentes adicionais incluindo, entre outros, um radioprotector ou um fármaco quimioterapêutico. a. Administração

As composições para utilização de acordo com este invento podem ser administradas de qualquer forma incluindo, entre outras, oral, parentérica, sublingual, transdérmica, rectal, transmucosa, tópica, por via de inalação, administração por via bucal ou suas combinações. A administração parentérica inclui, entre outras, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intratecal e intra-articular. Para utilização veterinária, a composição pode ser administrada como uma formulação aceitável e adequada de acordo com a prática veterinária normal. O veterinário pode facilmente determinar o regime de dosagem e via de administração que é mais adequada para um animal específico. b. Formulação

As composições para utilização de acordo com este invento podem estar na forma de comprimidos ou pastilhas formulados de forma convencional. Por exemplo, os comprimidos ou cápsulas para administração oral podem conter excipientes convencionais incluindo, entre outros, agentes aglutinantes, agentes de carga, lubrificantes, desintegrantes e agentes molhantes. Os agentes aglutinantes incluem, entre outros, xarope, goma-arábica, gelatina, sorbitol, goma adragante, mucilagem de amido e polivinilpirrolidona. Os agentes de carga incluem, entre outros, lactose, açúcar, celulose microcristalina, amido de milho, fosfato de cálcio e sorbitol. Os lubrificantes incluem, entre outros, esterato de magnésio, ácido esteárico, 35 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ talco, polietilenoglicol e sílica. Os desintegrantes incluem, entre outros, amido de batata e glicolato de sódio de amido. Os agentes molhantes incluem, entre outros, laurilsulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos na especialidade.

As composições para utilização de acordo com este invento podem também ser formulações líquidas incluindo, entre outras, suspensões aquosas ou em óleo, soluções, emulsões, xaropes e elixires. As composições podem também ser formuladas como um produto seco para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes da utilização. Tais preparações líquidas podem conter aditivos incluindo, entre outros, agentes de suspensão, agentes emulsionantes, veículos não aquosos e conservantes. Os agentes de suspensão incluem, entre outros, xarope de sorbitol, metilcelulose, xarope de glucose/açúcar, gelatina, hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose, gel de estearato de alumínio e gorduras hidrogenadas comestíveis. Os agentes emulsionantes incluem, entre outros, lecitina, monoleato de sorbitano e goma-arábica. Os veículos não aquosos incluem, entre outros, óleos comestíveis, óleo de amêndoa, óleo de coco fraccionado, ésteres oleosos, propilenoglicol e álcool etílico. Os conservantes incluem, entre outros, p-hidroxibenzoato de metilo ou de propilo e ácido sórbico.

As composições para utilização de acordo com este invento podem também ser formuladas como supositórios, que podem conter bases de supositórios incluindo, entre outras, manteiga de cacau ou glicéridos. As composições para utilização de acordo com este invento podem também ser formuladas para inalação, que pode ser numa forma incluindo, entre outras, uma solução, suspensão ou emulsão que pode ser administrada como um pó seco ou na forma de um aerossol utilizando um propulsor, tal como diclorodifluorometano ou triclorofluorometano. As composições para utilização de acordo com este invento podem também ser formuladas como formulações transdérmicas compreendendo veículos aquosos ou não aquosos incluindo, entre outros, cremes, pomadas, loções, pastas e emplastros, adesivos ou membranas medicadas.

As composições para utilização de acordo com este invento podem também ser formuladas para administração parentérica 36 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ incluindo, entre outras, por injecção ou infusão continua. As formulações para injecção podem estar na forma de suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação incluindo, entre outros, agentes de suspensão, estabilização e dispersão. A composição pode também ser proporcionada numa forma de pó para reconstituição com um veículo adequado incluindo, entre outros, água estéril e isenta de pirógenos.

As composições para utilização de acordo com este invento podem também ser formuladas como uma preparação depot, que pode ser administrada por implante ou por injecção intramuscular. As composições podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (como uma emulsão num óleo aceitável, por exemplo), resinas de permuta iónica ou como derivados fracamente solúveis (tal como um sal fracamente solúvel, por exemplo). c. Dosagem

Uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente necessário para utilização em terapia varia com a natureza da doença a ser tratada, do período de tempo durante o qual se pretende induzir actividade de NF-κΒ e da idade e condição do doente e é em última instância determinada pelo médico assistente. Contudo, de um modo geral, as doses utilizadas para tratamento de humanos adultos estão tipicamente na gama de 0,001 mg/kg a cerca de 200 mg/kg por dia. A dose pode ser cerca de 1 pg/kg a cerca de 100 pg/kg por dia. A dose pretendida pode ser convenientemente administrada numa dose única ou como doses múltiplas administradas a intervalos adequados, por exemplo como duas, três, quatro ou mais subdoses por dia. Muitas vezes pretendem-se doses múltiplas ou essas doses são necessárias porque a actividade de NF-κΒ em células normais pode diminuir quando cessa a administração do agente. A dosagem de um indutor de NF-κΒ pode ser qualquer dosagem incluindo, entre outras, cerca de 1 pg/kg, 25 pg/kg, 50 pg/kg, 75 ' pg/kg, 100 pg/kg, 125 pg/kg, 150 pg/kg, 175 pg/kg, 200 pg/kg, 225 pg/kg, 250 pg/kg, 275 pg/kg, 300 pg/kg, 325 pg/kg, 350 pg/kg, 375 pg/kg, 400 pg/kg, 425 pg/kg, 450 pg/kg, 475 pg/kg, 500 pg/kg, 525 pg/kg, 550 pg/kg, 37 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ 575 pg/kg, 600 pg/kg, 625 pg/kg, 650 pg/kg, 675 pg/kg, 700 pg/kg, 725 pg/kg, 750 pg/kg 775 pg/kg, 800 pg/kg, 825 pg/kg, 850 pg/kg, 875 pg/kg, 900 pg/kg, 925 pg/kg, 950 pg/kg, 975 pg/kg ou 1 mg/kg. 5. Métodos de rastreio

Revelam-se aqui métodos de identificar agentes que induzem actividade de NF-κΒ. Pode identificar-se um agente que induz actividade de NF-κΒ por um método compreendendo adicionar um presumível indutor de actividade de NF-κΒ a um sistema de expressão activada por NF-κΒ, comparando o nivel de expressão activada por NF-κΒ com um controlo, em que se identifica um indutor de actividade de NF-κΒ pela capacidade de aumentar o nivel do sistema de expressão activada por NF-kB.

Os agentes candidatos podem estar presentes numa biblioteca (i.e., um conjunto de compostos). Tais agentes podem, por exemplo, ser codificados por moléculas de ADN pertencentes a uma biblioteca de expressão. O agente candidato pode estar presente em meio condicionado ou em extractos celulares. Outros de tais agentes incluem compostos conhecidos na especialidade como "moléculas pequenas", que têm pesos moleculares inferiores a 105 Dalton, de preferência inferiores a 104 Dalton e ainda com maior preferência inferiores a 103 Dalton. Tais agentes candidatos podem ser proporcionados como membros de uma biblioteca combinatória, que inclui agentes sintéticos (e.g., péptidos) preparados de acordo com reacções químicas pré-determinadas múltiplas. Os peritos na especialidade considerarão que se pode preparar uma grande variedade de tais bibliotecas de acordo com procedimentos estabelecidos e podem rastrear-se membros de uma biblioteca de agentes candidatos de forma simultânea ou sequencial tal como aqui descrito.

Os métodos de rastreio podem ser efectuados em vários formatos, incluindo ensaios in vitro, baseados em células e in vivo. Podem utilizar-se quaisquer células em ensaios baseados em células. Preferentemente, as células incluem células de mamífero, com maior preferência células de primata humano e não humano. Pode efectuar-se rastreio baseado em células utilizando células tumorais modificadas geneticamente que expressam marcadores substitutos para activação de NF-κΒ. Tais 38 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ marcadores incluem, entre outros, beta-galactosidase bacteriana, luciferase e proteína fluorescente verde melhorada (EGFP). A quantidade de marcador substituto expresso pode ser medida utilizando técnicas padrão na especialidade incluindo, entre outras, colorimetria, luminometria e fluorimetria.

As condições sob as quais se adiciona à célula um modulador presumível, tal como agitação, são condições nas quais a célula pode sofrer apoptose ou sinalização se não estiverem presentes essencialmente quaisquer outros compostos reguladores que poderiam interferir com apoptose ou sinalização. As condições eficazes incluem, entre outras, condições adequadas de meio, temperatura, pH e oxigénio que permitem o crescimento celular. Um meio apropriado é tipicamente um meio sólido ou líquido compreendendo factores de crescimento e fontes de carbono, azoto e fosfato assimiláveis, assim como sais, sais minerais, metais e outros nutrientes adequados, tais como vitaminas e inclui um meio eficaz no qual a célula pode ser cultivada de modo a que a célula possa apresentar apoptose ou sinalização. Por exemplo, para uma célula de mamífero, o meio pode compreender meio de Eagle modificado da Dulbecco contendo soro fetal de vitelo a 10%.

As células podem ser cultivadas em vários recipientes incluindo entre outros frascos de cultura de tecidos, tubos de ensaio, placas de microtitulação e placas de petri. A cultura é efectuada a uma temperatura, pH e conteúdo em dióxido de carbono adequados à célula. Tais condições de cultura estão também no âmbito da perícia na especialidade.

Os métodos para adicionar um modulador presumível à célula incluem electroporação, microinjecção, expressão celular (i.e., utilizando um sistema de expressão incluindo moléculas de ácido nucleico nu, vírus recombinante, vectores de expressão de retrovírus e expressão de adenovírus), utilização de agentes de emparelhamento iónico e utilização de detergentes para permeabilização celular. 39 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ

Exemplo 1

Desenvolvimento acelerado da deficiência em p53 na síndrome 61 em ratinhos A principal causa de morte de mamíferos por radiação ionizante (IR) depende da dose de radiação. Em doses até 9- 10 Gy, os ratinhos morrem 12-20 dias mais tarde, principalmente de depleção de medula óssea letal - síndrome hematopoiética (HP). A esta dose os ratinhos irradiados podem ser salvos da morte por transplante de medula óssea. Os animais que receberam >15 Gy morrem aos 7-12 dias após o tratamento (antes da síndrome hematopoiética os matar) de complicações causadas por danos no intestino delgado síndrome gastrointestinal (GI) (Gudkov e Komarova 2003). Em ambos os casos das síndromes HP e GI, o dano letal dos tecidos inicia-se com apoptose dependente de p53 maciça (Potten 1992, Merritt 1994, Cui et al 1995, Potten et al 1994), sendo essa a observação que nos permitiu anteriormente sugerir que p53 poderia ser um factor determinante da morte induzida por radiação. Consistentemente com este facto, ratinhos deficientes em p53 são resistentes a doses de radiação que matariam pela síndrome HP (Westphal et al 1997, Komarov et al 1999) e a letalidade de animais de tipo selvagem a receber 6- 11 Gy de radiação gama pode ser reduzida por inibição farmacológica temporária de p53 pela molécula pequena inibidora de p53 pifitrina-alfa (PFT) (Komarov et al 1999). A definição de p53 como um factor sensibilizador de tecidos para stress genotóxico foi reforçada adicionalmente por demonstração da dependência de p53 da perda de cabelo (alopecia) que ocorre em resultado de quimioterapia ou radiação experimentais (Botchkarev et al 2000). Portanto, com base em observações anteriores, poder-se-ia esperar que p53 continuasse a desempenhar um papel importante no desenvolvimento de síndrome GI letal após doses elevadas de IR. Surpreendentemente, a deficiência em p53 sensibiliza ratinhos para que doses mais elevadas de IR causem síndrome gastrointestinal letal (figura 11) . A proliferação celular contínua nas criptas epiteliais com deficiência em p53 após IR correlaciona-se com morte acelerada de células danificadas da cripta e destruição rápida de vilosidades. A p53 prolonga a sobrevivência por indução de paragem de crescimento nas criptas do intestino delgado conservando assim a integridade 40 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ dos intestinos (figura 12). Assim, a função pró-apoptótica de p53 promove a sindrome hematopoiética enquanto a sua função de paragem de crescimento atrasa o desenvolvimento da sindrome gastrointestinal. A dinâmica de populações celulares no intestino delgado foi analisada em grande detalhe. A proliferação celular nos epitélios intestinais está limitada às criptas onde se localizam as células estaminais e as células progenitoras de proliferação precoce. Após algumas divisões celulares, as descendentes já diferenciadas das células estaminais da cripta deslocam-se para as vilosidades para se protegerem no topo da vilosidade. No intestino delgado do ratinho a "viagem" completa da célula (do compartimento proliferativo até ao topo da vilosidade) leva normalmente entre 3 e 5 dias (Potten 1992, Potten et al 1997, Booth et al 2002, Somosy et al 2002) . Apesar da reacção do intestino delgado à radiação gama ter sido bem analisado do ponto de vista patomorfológico, a causa exacta da letalidade por Gl ainda não é clara, incluindo o evento primário. Pode ocorrer morte em consequência directa de danos às células da cripta epitelial e após erosão das vilosidades que leva a desequilíbrio de fluidos e electrólitos, bacteriemia e endotoxemia. Além das respostas inflamatória e do estroma, as disfunções endoteliais parecem ser factores importantes que contribuem para a letalidade (Potten et al 1997, Somosy et al 2002) . Resumidamente, a supressão farmacológica de p53 que provou ser tão eficaz como método de protecção contra sindrome HP induzida por IR, é inútil (e talvez mesmo prejudicial) contra sindrome Gl. Assim, é necessário desenvolver abordagens alternativas de radioprotecção do epitélio do intestino delgado que se basearão noutro mecanismo, tal como, por exemplo, activação de NF-κΒ e inibição subsequente de morte celular.

Exemplo 2

A infecção por Salmonella activa NF-kB A infecção por Salmonella leva a uma poderosa activação de IKK e NF-κΒ e activação do programa de gene pró-inflamatório (Elewaut et al 1999) . Estudos anteriores sugeriram que cerca de 30-40% de células epiteliais intestinais são infectadas durante uma infecção típica por Salmonella em células 41 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ epiteliais intestinais em cultura (Valdivia et al 1996). Quisemos analisar a questão de como é que a infecção bacteriana de cerca de 30% de células do hospedeiro poderia dar oriqem a actividade de liqação a ADN de nf-kB equivalente a activação de NF-κΒ em quase todas as células do hospedeiro, tal como conseguido com o tratamento com TNFa.

Para analisar detalhadamente este fenómeno submeteram-se células HT29 a infecção simulada ou a infecção a uma MOI de 50 durante uma hora com S. typhimurium de tipo selvagem que tinha sido transformada com o plasmideo pFMlO.l que codifica proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do promotor ssaH de Salmonella que apenas começa a funcionar quando as bactérias invadem a célula hospedeira (Valdivia et al. 1997) . Detectaram-se as células que foram invadidas por Salmonella por microscopia de fluorescência directa de expressão de GFP. Monitorizou-se a localização de p65(RelA) por imunofluorescência indirecta de anticorpo de coelho anti-p65 detectado com anticorpo de burro anti-coelho conjugado com FITC. Utilizou-se DAPI para corar os núcleos.

Tal como se pode observar na figura IA, a expressão de GFP ocorre em cerca de trinta a quarenta porcento das células. Seguidamente analisámos a localização da NF-κΒ subunidade p65 (RelA) em células não tratadas (com infecção simulada), infectadas com Salmonella ou estimuladas com TNFa (10 ng/ml). Localizou-se P65 (RelA) no citoplasma de células não tratadas, enquanto p65 (RelA) foi localizada no núcleo de células infectadas com Salmonella ou em células tratadas com TNFa (figura 1B) . Estes resultados demonstram que a infecção com Salmonella activa NF-κΒ virtualmente em todas as células apesar de apenas uma minoria destas ficarem infectadas.

Exemplo 3

A flagelina activa NF-kB

Dado que a infecção com Salmonella das células epiteliais intestinais em cultura leva a apenas cerca de 30% de infecção, mas leva à activação de NF-κΒ em praticamente todas as células, antecipamos que a activação de nf-kB se efectuou em resposta ao reconhecimento pela célula do hospedeiro das componentes estruturais das bactérias ou produtos produzidos 42 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ pelas bactérias e não pelo processo de invasão. Demonstrou-se que não é necessário haver invasão para que ocorra activação do programa de gene pró-inflamatório tal como se pensava anteriormente (16). Para investigar esta possibilidade utilizou-se meio de cultura de S. dublin esterilizado por filtração, não tratado ou fervido durante vinte minutos, para provocar células epiteliais intestinais HT29 e monitorizou-se a actividade de ligação de ADN a NF-κΒ por ensaios de desvio da mobilidade electroforética (EMSA) de extractos de células completas (WCE) preparados quarenta e cinco minutos após a exposição (3, 40). Observou-se uma activação potente de NF-kB em resposta ao meio em ambas as condições o que indica que o factor de activação é resistente ao calor.

Tratou-se subsequentemente o meio concentrado nativo e esterilizado por filtração com ADNase, ARNase, proteinase K ou submeteu-se a um fraccionamento de tamanho grosseiro em filtros de ultracentrifugação de 100 kDa. Utilizaram-se então os meios tratados das diferentes formas para provocar células epiteliais intestinais HT29 e prepararam-se WCE após quarenta e cinco minutos e analisou-se a actividade de ligação de ADN a NF-κΒ por EMSA (figura 2A). A infecção directa de células HT29 por S. typhimurium 1103 ou a exposição aos meios de cultura (supt), tal como indicado, induziu actividade de ligação de ADN a NF-κΒ tendo-se divulgado que o factor indutor de actividade era sensível a digestão por protease e ficou retido num filtro de 100 kDa (figura 2A) . Para determinar adicionalmente a identidade da actividade de indução de NF-kB, fraccionaram-se meios de cultura concentrados e esterilizados por filtração por cromatografia de permeação em gel com Superose 12 (figura 2B) e por cromatografia de permuta aniónica (figura 2C) . Ensaiaram-se alíquotas de fracções de cromatografia relativamente à sua capacidade para activar NF-κΒ em células HT29 e analisaram-se por EMSA. Tal como se pode observar no gel corado com azul de Coomassie (figura 2B, painel superior), o aumento da actividade de ligação de ADN a NF-κΒ (figura 2B, painel inferior, pistas 4-6) correspondeu a um aumento de abundância de uma proteína de aproximadamente 55 kDa. A cromatografia de permuta aniónica em matriz POROS HQ e a eluição de proteínas ligadas com um gradiente salino crescente tal como indicado (figura 2C) demonstrou que a actividade de ligação de ADN a NF-κΒ correspondia a fracções 43 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ cromatográficas contendo uma quantidade aumentada de proteína de 55 kDa (figura 2C, painel superior e dados não

apresentados). As fracções eluídas observadas na figura 2C foram concentradas e fraccionadas em géis de SDS-PAGE preparativos a 12% e cortaram-se dos géis as bandas correspondentes a B1-B6 e as proteínas foram eluídas, precipitadas, renaturadas e utilizadas para estimular células HT29. Ensaiaram-se extractos de células inteiras dessas células para actividade de indução de ligação de ADN a nf-kB por EMSA e apenas a banda 2 (B2) correspondente à proteína de 55 kDa (figura 2C, painel inferior) foi capaz de desencadear actividade de ligação de ADN a NF-κΒ enquanto o tampão do início ou do final do gradiente de sal não foi capaz de activar actividade de ligação de ADN a NF-kB.

As proteínas correspondentes às bandas de proteína B1-B6 e as áreas em branco do gel foram processadas adicionalmente para sequenciação de péptidos. A digestão por tripsina da proteína correspondente a B2 e a análise por armadilha de iões por electrovaporização LC/MS identificou a sequência de aminoácidos de vinte e um péptidos. A flagelina (setenta e cinco porcento de cobertura pelos vinte e um péptidos) foi identificada inequivocamente como sendo a proteína consistente com indução de actividade de ligação de ADN a NF-kB (figura 3).

Exemplo 4 Ά flagelina é necessária para activar NF-κΒ em células epiteliais intestinais

Para determinar se a flagelina foi de facto o factor responsável pelo desencadear da activação de NF-κΒ após exposição de células epiteliais intestinais para dirigir infecção bacteriana ou meios de cultura filtrados de Salmonella patogénica, preparamos bactérias infecciosas e meios de culturas fervidos e filtrados de E. coli DH5a não flagelada, S. dublin estirpe 2229 patogénica, mutante isogénico S. dublin 2229 SopE~, mutante isogénico S. dublin 2229 SopB-, mutante duplo isogénico S. dublin 2229 SopE~/SopB“ (estirpe SE1SB2); S. typhimurium estirpe 1103 e mutante de inserção isogénico S. typhimurium fliC TnlO (estirpe 86) e um mutante duplo isogénico S. typhimurium 1103 fliC“/fljB“. SopE 44 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ é uma proteína codificada por um bacteriófago patogénico de Salmonella que é injectada na célula do hospedeiro e actua como um factor de permuta para as GTPases pequenas Rho, Racl e CdC42 que iniciam rearranjos do citoesqueleto e eventual activação das vias MAPK, SAPK e NF-kB (7, 15), enquanto SopB é uma proteína de Salmonella que funciona como uma fosfato de inositol-fosfatase e participa em rearranjos do citoesqueleto e estimula excreção de cloreto pelas células do hospedeiro (44). Utilizaram-se bactérias e meios de cultura para provocar células HT29 epiteliais intestinais e prepararam-se extractos WCE após quarenta e cinco minutos e analisaram-se para actividade de ligação de ADN a NF-κΒ por EMSA. As estirpes de Salmonella podiam activar NF-κΒ enquanto as estirpes de Salmonella que não produzem flagelina (mutantes fliC e fliC” /fljB” como indicado) também não conseguiram activar NF-kB (figura 4A e B). E. coli DH5a que não é flagelada e não produz flagelina não conseguiu activar NF-κΒ. Também verificamos através de numerosas experiências que a infecção directa por S. dublin activou sempre NF-κΒ em maior extensão do que S. typhlmurlum tal como observado na figura 4A enquanto meios de cultura de ambas as espécies activaram NF-κΒ praticamente igualmente bem (figura 4B) . Acreditamos que esta diferença é devida provavelmente a S. dublin libertar mais flagelina no meio de cultura das células do que S. typhimurium durante a infecção dado que a purificação de flagelina de S. dublin e de S. typhimurium e a adição de quantidades equivalentes de flagelina purificada por cromatografia originou perfis de activação de NF-κΒ semelhantes. Note-se a falha total dos mutantes genéticos duplos de flagelina activarem NF-kB comparativamente com uma activação muito minoritária observada no mutante único de inserção fliC::Tn!0 de flagelina de fase I (ao lado das últimas pistas na figura 4A e B) que é provavelmente devido à expressão extremamente limitada de flagelina de fase II (de fljB), apesar das estirpes de Salmonella aqui utilizadas serem geneticamente incapazes ou raramente mudarem de fase na produção de flagelina. Dado que parece que a flagelina é necessária para activação da via do NF-κΒ através de infecção directa de células epiteliais intestinais, parece possível que a flagelina seja também a determinante principal de outras vias de sinalização mitogénicas e activadas por stress e que são activadas por infecção de Salmonella patogénica de células epiteliais 45 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ intestinais: a infecção directa por Salmonella de células epiteliais intestinais resulta em activação JNK (8) e também em activação de NF-κΒ através de IKK (3).

Exemplo 5

A flagelina desencadeia activação da proteína quinase activada por mitogénio, da proteína quinase activada por stress e das vias de sinalização IKK

As células epiteliais intestinais funcionam como

sentinelas da invasão das superfícies luminais e orquestram a atracção de células imunitárias efectoras para a área por produção de genes de quimioquinas como IL-8 e da proteína 1 quimio-atractora de macrófagos (MCPl) e genes de citoquinas pró-inflamatórias tal como TNFa, il-1 e IL-6 (1, 4-6). A expressão desses genes depende principalmente da acção de factores de transcrição que são activados em resposta à transmissão de sinais através das vias de sinalização MAPK, SAPK e IKK. Dado que NF-κΒ é considerado um

regulador/activador central do programa de genes pró-inflamatórios, decidimos analisar o efeito que as estirpes mutantes não produtoras de flagelina de Salmonella tinham na activação das vias de sinalização MAPK, SAPK e IKK comparativamente com infecção de células epiteliais intestinais com Salmonella de tipo selvagem ou por exposição das células epiteliais intestinais a flagelina purificada. A infecção de células HT29 com S. typhimurium de tipo selvagem resultou na activação das MAPK, ERK1&2, das SAPK p38 e JNK e IKK (figura 5) tal como determinado por utilização de anticorpos fosfo-específicos indicadores de activação em análise de imunotransferências (IB) ou de ensaios de imuno-quinase (KA) específicos de anticorpo para JNK e IKK utilizando os seus respectivos substratos GST-cJun 1-79 e GST-ΙκΒαΙ-54. De forma interessante, o estímulo de MAPK é de natureza transitória já que a activação diminui ao fim de quarenta e cinco minutos enquanto a actividade de p38, JNK e IKK aumenta com o tempo até uma hora. Tal como observado na figura 4, o mutante duplo fliC-/fljB" de Salmonella também foi incapaz de induzir actividade IKK e NF-κΒ (figura 5 tal como indicado). Surpreendentemente, o mutante duplo fliCVfljB- de Salmonella foi incapaz de induzir as SAPK p38 e JNK e activou MAPK apenas brevemente (quinze minutos). Este resultado é 46 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ intrigante dado que outras proteínas de Salmonella tais como SopE e SopE2 conseguem activar as GTPases pequenas Rac e CdC42 e essas GTPases da família Rho foram relacionadas com activação de JNK e p38 (7, 8, 14, 15) mas parece contudo não funcionar na estirpe flagelina menos. O mutante duplo f]iC“/fljB“ de Salmonella falhou na invasão de células HT29 comparativamente com estirpes de Salmonella de tipo selvagem tal como determinado pelo ensaio de protecção/invasão de gentamicina. O mutante duplo de flagelina f]iC“/fljB“ apresentou uma diferença de quatro ordens de grandeza na sua capacidade de invadir células HT29. Para demonstrar adicionalmente este ponto infectamos células HT29 com Salmonella de tipo selvagem ou com o mutante duplo f]iC“/fljB“ de Salmonella (estirpe 134), sendo ambas as estirpes transformadas com o plasmídeo pFMlO.l que codifica GFP sob o controlo do promotor ssaH de Salmonella e apenas funciona a partir do momento em que as bactérias invadem as células do hospedeiro (10, 36) . A Salmonella de tipo selvagem foi claramente capaz de infectar células HT29 (GFP, figura 5B) enquanto as bactérias mutantes de flagelina não conseguiram invadir células HT29 tal como evidenciado pela falta de expressão de GFP (figura 5B). A fim de determinar se a flagelina é suficiente ou se são necessárias para a invasão outras proteínas produzidas pelas bactérias, adicionamos flagelina purificada ou meios de cultura esterilizados por filtração ou uma combinação de ambos a células HT29 que foram provocadas com o mutante duplo f]iC“/fljB“ de Salmonella e ensaiadas para invasão. As células epiteliais intestinais não foram invadidas utilizando todas as combinações ensaiadas de flagelina purificadas e/ou meios de cultura com a estirpe mutante dupla f]iC“/f1jB“2. Não se pensa que exista uma relação directa entre os genes de flagelina e a eficácia do sistema de excreção do tipo III para entregar proteínas produzidas pelas bactérias tal como SopE, SopE2 e SipA ou outras proteínas Sip (7, 14, 15, 45, 46) que desempenham papéis importantes na iniciação da internalização bacteriana. Além disso, para avaliar a eficácia da flagelina para estimular a localização nuclear de p65 (RelA) em células epiteliais intestinais, provocamos células HT29 com flagelina purificada e analisamos a localização de p65 (RelA) utilizando imunofluorescência 47 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ indirecta e verificamos localização nuclear de p65 (RelA) em praticamente todas as células (figura 5B tal como indicado). A flagelina purificada (0,5pg/ml) activou de forma potente NF-κΒ em células HT29 de modo semelhante ao observado para tratamento de células HT29 com TNF (10 ng/ml) de um modo dependente do tempo (figura 6A) quando se prepararam WCE a diferentes tempos tal com indicado após exposição e ensaiou-se para actividade de ligação de adn a NF-κΒ por emsa. a análise das vias de sinalização MAPK, SAPK e IKK (figura 6B) nesses mesmos extractos utilizando anticorpos fosfo-especificos para activação para monitorizar activação de quinase por ΜΑΡΚ e p38 ou ensaios de quinase de imunoprecipitação específicos de anticorpo para actividades JNK e IKK, demonstrou que a actividade JNK e IKK aumentou ao longo do tempo durante uma hora enquanto a actividade de p38 e MAPK (ERK1&2) atingiu um máximo aos trinta minutos e iniciou o seu declínio para níveis nitidamente mais baixos após uma hora (figura 6B tal como indicado). O perfil de activação das moléculas sinalizadoras ERK1&2, p38, JNK e IKK de MAPK, SAPK e IKK em células epiteliais intestinais em resposta à exposição a flagelina purificada foi notavelmente semelhante ao de células epiteliais intestinais infectadas com Salmonella do tipo selvagem (figura 5A). Destas observações concluímos que a activação temporal das vias de sinalização aqui analisadas (MAPK, SAPK e IKK), que reflecte acontecimentos precoces em infecção por Salmonella, é determinada quase exclusivamente por reconhecimento e resposta de células epiteliais intestinais a flagelina.

Pretendemos analisar adicionalmente o efeito de flagelina purificada e flagelina presente em Salmonella no padrão temporal de expressão do gene de citoquina pró-inflamatória em células epiteliais intestinais de modo a diferenciar os efeitos de flagelina sozinha relativamente a infecção por

Salmonella flagelada ou Salmonella não flagelada. Deixaram-se células HT29 sem tratamento, estimuladas com TNFa (lOng/ml) ou estimuladas com flagelina (0,5ug/ml) ou infectadas com Salmonella typhimurium de tipo selvagem ou pelo mutante duplo fliC/fljB de Salmonella (a uma MOI de 50). Após os intervalos de tempo indicados após tratamento ou infecção recolheram-se células HT29 em PBS gelado e lisaram-se os sedimentos 48 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ celulares em Trizol, purificou-se ARN e utilizou-se para preparar ADNc de primeira cadeia (consultar os Procedimentos experimentais). Utilizaram-se aliquotas do ADNc em reacções de RT-PCR semi-quantitativo utilizando iniciadores específicos dos genes de ILla, IL-Ιβ, IL-8, TNFa, MCP1 e β-actina (sequências disponíveis a pedido) e fraccionaram-se os produtos em géis de agarose a 1,2% contendo brometo de etidio. A expressão dos genes alvo NF-κΒ conhecidos IL-Ιβ, IL-8, TNFa e MCPl foi aumentada em resposta a exposição a TNFa ou a flagelina purificada (figura 6C). A infecção por Salmonella do tipo selvagem também levou à activação desses mesmos genes apesar da expressão de TNFa e MCP ter sido comparativamente transitória e ter ocorrido imediatamente após a infecção. O mutante duplo f]iCT/fljB“ de Salmonella não conseguiu induzir expressão de IL-Ιβ, IL-8 e TNFa, sendo contudo induzida a expressão de MCPl, apesar de ocorrer a níveis inferiores aos induzidos por Salmonella do tipo selvagem e igualmente a expressão de MCPl não foi de natureza transitória mas continuou ao longo do tempo (9h) (figura 6C) . O nível de expressão de β-actina serviu como um padrão interno para comparação. Interessantemente, IL-Ια, que não é um gene alvo NF-κΒ, foi estimulado em resposta a provocação de células HT29 por todos os tratamentos. Obviamente, o mutante duplo fliCT /fljB” de Salmonella pode activar outras vias de sinalização desconhecidas levando a expressão de IL-la.

Exemplo 6 A flagelina activa a ligação de ADN a NF-κΒ de uma forma dependente de MyD88.

Dado que a flagelina foi capaz de activar as vias de sinalização necessárias de acordo com activação de genes pró-inflamatórios e esta actividade foi reminiscente da acção de uma citoquina do tipo TNFa que activa todas as células nas quais está presente um seu receptor de superfície celular funcional (consultar localização nuclear de p65 [RelA] na figura 1 e figura 5C), decidimos analisar o potencial dos receptores do tipo Toll, receptores de reconhecimento de padrões de patogénios conhecidos, para activar a via NF-κΒ em resposta a exposição a flagelina. Para testar esta hipótese analisámos o efeito que tinha um adenovírus que expressa MyD88 (aa 152-296) negativo dominante (47) sobre a activação de 49 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ NF-κΒ mediada por flagelina em células HT29. MyD88 é uma proteína adaptadora utilizada pelo receptor IL-1 e todas as TLR conhecidas que partilham homologia com IL-1 através do seu dominio de sinalização citoplasmático e é necessária para activação imediata da via NF-kB (48, 49). A expressão de DN-MyD88 em células HT29 bloqueou a activação de actividade de ligação de NF-κΒ a ADN ensaiada por EMSA em resposta à exposição a IL-1 ou flagelina, observação que é consistente com a acção de uma activação de NF-κΒ mediada por TLR. Para analisar adicionalmente esta possibilidade, utilizamos inicialmente MEF de tipo selvagem, MyD88_/” e TLR2”1”/TLR4~/~ (uma oferta de S. Akira, Univ. de Osaka, JA) para verificar o papel de MyD88 e para analisar o papel potencial de duas das TLR em resposta a flagelina ou para dirigir infecção por Salmonella de tipo selvagem e levar à activação de NF-kB (figura 7) . A infecção por Salmonella de tipo selvagem activa NF-κΒ de forma potente tanto no MEF de tipo selvagem como no MEF deficiente em TLR (pistas 2 e 15) mas esta activação é algo deficiente nos MEF deficientes em MyD88 (pista 10) . A provocação de todos os três tipos de células com meios de cultura de S. dublin de tipo selvagem esterilizado por filtração e concentrado ou com a estirpe SE1SB2 de S. dublin de mutante isogénico duplo SopE“/SopB~, activou NF-κΒ em células de MEF de tipo selvagem e de MEF duplamente deficientes TLR2/4, mas não conseguiu activar NF-κΒ em células deficientes em MyD88 (comparar as pistas 11 e 12 com as pistas 3, 4, 6, 7, 16 e 17) . NF-κΒ foi activada de forma potente em MEF de tipo selvagem por exposição a flagelina purificada (0,5pg/ml) o que teve como consequência eliminar a possibilidade de LPS desempenhar um papel na activação de NF-κΒ nessas experiências. A exclusão de LPS como um contribuinte principal para activação de NF-κΒ é também proporcionada pela potente activação dos MEF deficientes duplos TLR2/4 (pistas 16 e 17) . Os TLR 2 e 4 respondem a lipopéptidos, peptidoglicanos, determinados LPS e LPS Gram-negativos bacterianos, respectivamente (50-52). O estimulo por IL-1 verificou os requisitos funcionais de MyD8 8 na transmissão de sinais mediados por IL-1 e flagelina.

Para definir adicionalmente um possivel papel para as TLR no reconhecimento de flagelina ensaiamos a capacidade de TLR sobrexpressas activarem NF-κΒ em células que normalmente 50 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ respondem fracamente à exposição a flagelina. A escolha das células que respondem ligeiramente a flagelina purificada assegurou que as componentes e adaptadores de sinalização que a flagelina utiliza estavam presentes e eram funcionais e que o factor limitante foi provavelmente apenas o receptor que responde a flagelina. Verificamos que células HeLa e células HEK293T activaram a ligação de ADN a NF-κΒ em resposta a estimulo por IL-1 mas fracamente quando expostas a flagelina e escolhemos células HEK293T para utilizar adicionalmente devido à sua maior eficiência de transfecção. Sobrexpressaram-se TLR 1-9 marcadas com um epitopo FLAG no terminal amino (gentis ofertas de R. Medzhitov, Yale Univ. e R. Ulevitch, TSRI) (42, 43) em células HEK 293T em transfecções temporárias conjuntamente com o gene repórter dirigido por luciferase e dependente de 2x-NF-kB e determinou-se a expressão de luciferase em resposta à ausência de tratamento, flagelina (0,5pg/ml) ou TNFa (lOng/ml) . TLR5 foi a única TLR cuja expressão resultou numa resposta apreciável à provocação das células com flagelina (Tabela 1).

Para determinar adicionalmente a possibilidade de TLR5 ser a TLR através da qual a flagelina activou NF-κΒ, construímos mutações de sinalização negativa dominante por deleção da parte carboxilo de cada TLR para um triptofano conservado no domínio TIR. Uma mutação semelhante no receptor IL-1 anula a sua capacidade de conduzir a activação de NF-kB (54, 55) .

Clonou-se cada dn-tlr conjuntamente com uma TLR5 com clonagem inversa (AS-TLR5) no vector de expressão de mamífero pCDNA3.1 (invitrogen). Todas as proteínas mutantes foram expressas com sucesso. Transfectou-se cada vector de expressão de mamífero DN-TLR e vector de expressão vazio conjuntamente com 2x NF-kB Luc, tal como anteriormente descrito (3) para células HT29 que respondem muito bem a flagelina. As células transfectadas foram deixadas sem tratamento, estimularam-se com TNFa (10 ng/ml) ou com flagelina purificada (0,5pg/ml). Observou-se que a expressão do gene repórter não era afectada pela expressão de DN-TLR em resposta a estímulo com TNFa de células transfectadas (figura 8A); contudo, apenas a expressão quer de DN-TLR5, quer de uma construção TLR5 anti-sentido resultou em perto de cinquenta porcento e vinte e cinco porcento de inibição de activação de gene repórter mediada por flagelina, respectivamente (figura 8B), enquanto também se verificou que 51 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ DN-TLR2 inibia ligeiramente a expressão do repórter mediada por flagelina. Estes resultados implicam que TLR5 está envolvida no reconhecimento da superfície celular de flagelina e inicia a via de sinalização que leva à activação de nf-kB. O efeito de DN-TLR2 na activação de gene repórter dependente de NF-κΒ pode não ser específica, dado que a sua expressão também inibiu a activação do repórter mediada por TNFa comparativamente com outras DN-TLR. A DN-TLR2 pode também competir para uma proteína adaptadora desconhecida que tanto TLR2 como TLR5 podem partilhar. De qualquer modo, pelos resultados apresentados na figura 7, mostrou-se que TLR2 e TLR4 não eram necessárias para activação de NF-κΒ mediada por flagelina.

Exemplo 7

A activação mediada por flagelina de NF-κΒ leva a expressão aumentada de um subconjunto de TLR 0 estímulo de células epiteliais intestinais com S. typhimurium ou com flagelina purificada levou à activação do programa de genes pró-inflamatórios (figura 6C). Pretendemos analisar se a expressão de genes TLR estaria também alterada em células estimuladas por flagelina. Trataram-se células HT29 com flagelina purificada (0,5 pg/ml) e isolou-se ARN total a partir de células tratadas e não tratadas três horas após estímulo e utilizou-se para fazer ADNc de primeira cadeia. Utilizou-se RT-PCR semi-quantitativo utilizando iniciadores específicos de gene para cada uma das TLR e preparou-se ADNc de primeira cadeia a partir de células não estimuladas ou estimuladas com flagelina, para gerar produtos de ADN que foram fraccionados em géis de agarose a 1,2% contendo brometo de etídio. A expressão das TLR 2, 3 e 7 aumentou após estímulo com flagelina (figura 9). O padrão de expressão das outras TLR permaneceu inalterado servindo a expressão de β-actina como um controlo para abundância interna. TLR5 é expressa em células que não respondem bem a flagelina. Este estudo e outros (22, 33) identificaram TLR5 como sendo possivelmente a TLR através da qual a flagelina activa NF-κΒ. Relatos anteriores não fizeram qualquer determinação da presença ou abundância de TLR5 nas células que 52 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ utilizaram para verificar a sua função (22, 33) . Pretendemos determinar se a abundância de proteína TLR5 não ocorria ou diminuía grandemente em células que não respondiam ou respondiam fracamente à provocação por flagelina. Analisou-se a abundância de TLR5 em várias linhas celulares por análise de imunotransferência utilizando um anticorpo específico de TLR5 e comparou-se com a capacidade de flagelina purificada induzir actividade de ligação de ADN a NF-κΒ de WCE preparadas a partir destas. Utilizaram-se as linhas celulares epiteliais intestinais T84 e HT29 assim como a linha celular de adenocarcinoma de pulmão A549, a linha celular de adenocarcinoma cervical humano HeLa, a linha celular de rim embrionário humano que expressa o antigénio T grande HEK293T e a linha celular de glioblastoma T98G. Detectou-se proteína TLR5 em todas as linhas celulares analisadas por imunotransferência com anticorpo específico de TLR5 (figura 10A). As células T84 apresentaram a maior abundância enquanto os níveis de expressão de outras linhas celulares foram semelhantes e não pareceram diferir mais do que o dobro (figura 10A). Analisou-se a actividade de ligação de ADN a NF-κΒ em células não estimuladas e células estimuladas por TNFa e flagelina com ensaios EMSA de WCE preparadas a partir de cada tipo de células (figura 10B) . As células HT29 e A549 responderam fortemente a estímulo por flagelina e por TNFa enquanto as células HeLa, 293T e T98C responderam fracamente (HeLa, 293T) ou não responderam de todo (T98G) a estímulo por flagelina. Determinou-se a autenticidade do complexo de ligação de ADN a NF-κΒ utilizando anticorpo específico de p65 para promover um super-desvio do complexo ADN:proteína NF-kB. É interessante verificar que algumas células que expressam TLR5 ou não respondem totalmente ou respondem apenas fracamente. Tal pode ficar a dever-se quer a falta da presença do receptor na membrana plasmática e localização intracelular, inactivação ou mutações prejudiciais no gene TLR5 nestas linhas celulares, quer a falta ou abundância diminuída de um co-receptor ou proteína adaptadora necessários (tal como é o caso nalgumas células para TLR4 e o seu co-receptor/adaptador MD2 (30, 56, 57) ) . IL-1 pode activar a actividade de ligação de ADN a NF-κΒ em todas as linhas celulares analisadas e portanto parece que o aparelho de sinalização a jusante de MyD88 a NF-κΒ está intacto. 53 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ

Exemplo δ isolamento de flagelina recombinante

De modo a confirmar que a flagelina recombinante era capaz de induzir NF-κΒ, ensaiou-se a actividade utilizando células repórter com luciferase (luc) sensíveis a NF-κΒ. A construção de repórter contém três locais de ligação NF-κΒ do promotor de E-selectina combinado com o promotor minimo de Hsp70 e é utilizado rotineiramente para a detecção de NF-κΒ. Mediu-se a actividade de luciferase em lisados celulares 6 horas após adição de flagelina ao meio. Utilizou-se TNFa como um controlo positivo. Apresentam-se os resultados de uma experiência representativa na figura 13 e indicam que a flagelina recombinante é capaz de activar de NF-kB.

Exemplo 9

A flagelina atrasa a morte de ratinhos causada por síndrome 61 induzida por IR

Tal como indicado anteriormente, a flagelina é um activador potente de NF-κΒ e pode actuar possivelmente como um inibidor de morte por apoptose. Dado que as citoquinas capazes de induzir NF-κΒ actuam como radioprotectoras, ensaiamos se a flagelina pode também servir como um radioprotectora. A irradiação do corpo total de ratinhos com radiação gama e 15 Gy leva à morte no prazo de 8 dias com síndrome GI proporcionando um modelo convencional de danos induzidos por radiação do tracto GI (consultar anteriormente). Para ensaiar se a flagelina é capaz de proteger o epitélio GI contra IR, ensaiamos os efeitos de flagelina injectada i.v. na dinâmica da letalidade de ratinhos após 15 Gy de radiação. Utilizamos uma gama de doses de flagelina, todas significativamente inferiores à dose mais elevada tolerada conhecida da literatura (300 pg/ratinho, Eaves-Pyles T, et al 2001b). Irradiou-se 4 horas após o tratamento. Apresentam-se os resultados de uma experiência representativa na figura 14. Tal como esperado, os ratinhos irradiados de controlo (os que receberam PBS i.v.) morreram após 5 a 8 dias pós-tratamento, enquanto os animais que receberam flagelina viveram significativamente mais; a extensão da sobrevivência dos animais correlacionou-se com a dose de flagelina. A análise 54 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ patomorfológica do intestino delgado no dia 7 após irradiação revela diferenças drásticas entre os grupos tratados com flagelina e os de controlo (figura 15). A entrega intravenosa, intraperitoneal e subcutânea de 0,2 mg/kg de flagelina seguida de 13 Gy de irradiação proporcionou um grau de protecção semelhante, levando a 85-90% de sobrevivência de 30 dias em ratinhos (dados não apresentados). As experiências foram efectuadas essencialmente como descrito anteriormente para experiências de dose óptima mas com 13 Gy de irradiação e várias vias de entrega.

Exemplo 10 Ά flagelina salva ratinhos de sindrome hematopoiética induzida por IR letal

Seguidamente ensaiamos se a flagelina tem um efeito em morte por sindrome HP induzida por IR em ratinhos que é induzido experimentalmente por doses baixas de radiação (habitualmente até 11 Gy) que são incapazes de causar toxicidade letal por Gl. Efectuaram-se as experiências de forma semelhante às anteriormente descritas (figuras 14 e 15), contudo, em vez de 15Gy, os ratinhos receberam 10 Gy, a dose que causou 100% de morte em grupos de controlo ao dia 13 (figura 16). O grupo tratado com flagelina (5 pg/ratinho) apresentou protecção completa desta dose de IR indicando que a radioprotecção mediada por flagelina actua não só contra sindromes GI mas também contra sindromes HP induzidas por IR.

Exemplo 11

Dependência temporal do efeito protector de flagelina

De modo a estimar a dependência da actividade radioprotectora da flagelina sobre o tempo do tratamento por injecção de ratinhos a tempos diferentes antes da irradiação gama a 13 Gy. Apresentam-se os resultados de uma de tais experiências na figura 17. Os resultados obtidos mostram que a flagelina é eficaz como radioprotectora contra 13 Gy se for injectada l-4h antes do tratamento mas deixa de ser eficaz se for injectada 24 h antes da irradiação.

De modo a estimar a dependência da actividade radioprotectora da flagelina com o tempo de tratamento, 55 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ injectaram-se ratinhos em vários pontos temporais relativamente ao momento da irradiação gama. Efectuaram-se experiências essencialmente como explicado anteriormente, utilizando injecção intraperitoneal de 5 pg/ratinho (0,2 mg/kg) de CBLB-501 ou, para ratinhos de controlo, 5 pg/ratinho (0,2 mg/kg) de ARN polimerase bacteriana. Efectuaram-se as experiências na estirpe de ratinhos NIH-Swiss. Os resultados demonstram que a flagelina -501 proporciona cerca de 90% de sobrevivência após irradiação de 13 Gy se for injectada 1 ou 2 horas antes do tratamento (figura 17). Apenas se apresenta o gráfico -1 h por razões de clareza, contudo, ambos os pontos temporais (-1 e -2 h) proporcionam um grau e dinâmica de sobrevivência semelhantes. O ponto temporal das 4 h mostra uma protecção algo inferior. A flagelina injectada 24 horas antes da irradiação não teve qualquer efeito protector contra morte induzida por 13 Gy.

Interessantemente, a administração de flagelina 24 horas antes de 10 Gy de irradiação gama proporcionou 100% de protecção. Enquanto 13 Gy de irradiação em ratinhos induz primariamente morte por sindrome GI, a morte induzida por 10 Gy é maioritariamente mediada por sindrome hematopoiética. Assim, tal protecção a longo prazo de 10 Gy de irradiação pode ser mediada por proliferação ou sobrevivência aumentadas de células estaminais hematopoiéticas induzida por flagelina e/ou citoquinas secundárias com vida longa.

Exemplo 12

Determinação de LD50/3o, LD50/7 e DMF para flagelina

Obtivemos uma estimativa da protecção dependente da dose de radiação para a flagelina. Tal como demonstrado anteriormente (figura 17), o tratamento com flagelina foi suficiente para 100% de protecção contra 10 Gy de irradiação gama (esta dose provoca morte por sindrome hematopoiética) e 90% de sobrevivência a 30 dias com 13 Gy (tanto sindrome hematopoiética como sindrome GI). Efectuaram-se experiências como anteriormente descrito utilizando flagelina a 5 pg/ratinho (0,2 mg/kg) injectada intraperitonealmente 1 h antes da irradiação. 56 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ

Contudo, a 15 Gy, aos 100% de sobrevivência a 7 dias seguiu-se morte atrasada após 13 dias (0% de sobrevivência de 30 dias) enquanto o grupo de controlo tinha sucumbido completamente à síndrome Gi ao dia 7 10 Gy 13 Gy 15 Gy

Figura 8. Efeito de CBLB na sensibilidade de ratinhos a 10, 13 e 15 Gy de radiação gama na totalidade do corpo; consultar texto para detalhes. (Figura 18) . A cinética de mortalidade do grupo tratado com CBLB-501 após 15 Gy de irradiação faz lembrar tal grupo de controlo a 10 Gy, o que faz suspeitar de morte causada por sindrome hematopoiética. Os resultados proporcionam uma estimativa do LD50/30 de flagelina de cerca de 13,5-14 Gy e DMF30 de cerca de 1,75-1,8. Este nível de radioprotecção é significativamente superior ao obtido para qualquer composto natural descrito. 57 ΕΡ 1 706 133/ΡΤ

Tabela ι

TLR5 responde a flagelina e activa NF-kB

As células 293T foram transfectadas com vector vazio (pCDNA3.1) ou com os alelos de TLR de tipo selvagem listados individuais. Deixaram-se células sem tratamento (Sem Estim), trataram-se com TNFa (lOng/ml) ou flagelina (lpg/ml). A actividade repórter de NF-κΒ foi ajustada por normalização da expressão para controlar a actividade da luciferase de Renilla e calculou-se o número de vezes de indução como actividade de gene repórter em células tratadas/actividade de gene repórter em células não estimuladas. ND é não determinado.

Sem estimulo TNF FliC Vector 1 13,5 4,9 TLRl 1,7 ND 5,1 TLR2 1,6 ND 5,3 TLR3 1,5 ND 5,0 TLR4 1,8 ND 5,4 TLR5 1,6 ND 9,2* TLR7 1,5 ND 5,2 TLR8 1,4 ND 5, 0 TLR9 1,5 ND 5,1

Lisboa, 2010-11-30

Claims

ΕΡ 1 706 133/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo flagelina para utilização num método de protecção de um mamífero contra os efeitos de radiação.
2. Utilização de uma composição compreendendo flagelina no fabrico de um medicamento para proteger um mamífero contra os efeitos de radiação.
3. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou utilização de acordo com a reivindicação 2 em que a composição ou medicamento é para administração em combinação com um radioprotector.
4. Composição para utilização ou utilização de acordo com a reivindicação 3 em que o radioprotector é um antioxidante.
5. Composição para utilização ou utilização de acordo com a reivindicação 4 em que o antioxidante é seleccionado do grupo que consiste em amifostina e vitamina E.
6. Composição para utilização ou utilização de acordo a reivindicação 3 em que o radioprotector é uma citoquina.
7. Composição para utilização ou utilização de acordo com a reivindicação 6, em que a citoquina é um factor de células estaminais.
8. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a composição ou medicamento é para administração em combinação com um factor de crescimento.
9. Composição para utilização ou utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o factor de crescimento é factor de crescimento queratinocítico.
10. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a composição ou medicamento é para administração em combinação com 5-androstenodiol. ΕΡ 1 706 133/ΡΤ 2/2
11. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a composição ou medicamento é para administração em combinação com tricloro(dioxoetileno-0'0-)telurato de amónio.
12. Composição para utilização ou utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a composição ou medicamento é para administração antes, concomitantemente ou após o tratamento com radiação.
13. Composição para utilização ou utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o mamífero é um ser humano. Lisboa, 2010-11-30