CN108368531B

CN108368531B - 改进的重组产生方法

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Publication number: CN108368531B
Application number: CN201680073781.4A
Authority: CN
Inventors: T·基利安; M·诺伊鲍尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2015-12-16
Filing date: 2016-12-15
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2036-12-15
Also published as: HK1258962A1; SG11201804894XA; EP3390653A1; WO2017102908A1; JP2019503675A; JP6945532B2; US20190002947A1; US10745731B2; EP3390653B1; US20200399670A1; CN108368531A

Abstract

本文中报导了一种用于真核细胞中重组产生多肽的方法，所述方法包括步骤(i)在培养用培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含选自反‑2‑甲基2‑戊烯酸、广谱HDAC抑制剂Quisinostat和亚型特异性HDAC抑制剂罗米地辛的化合物，和(ii)从细胞或培养用培养基回收多肽，并且由此在真核细胞中产生多肽。

Description

改进的重组产生方法

本发明属于真核细胞中重组产生异源多肽的领域。更详细地，本文中报导了一种用于产生多肽的方法，其中添加生产增强物至培养基。

背景

治疗性抗体已经变成药物开发中的重要治疗模式。抗体工程化中的新技术能够在抗体设计方面实现多种可能性，如价态、特异性和亲和力改变，从而产生种类广泛的不同抗体。为了鉴定并选择抗体，早期药物开发期间不得不评估大量潜在的治疗剂以鉴定有前景的候选物。出于这个原因，在快速和高效产生用于研究和早期药物开发的那些重组蛋白方面有巨大兴趣。

抗体是复杂的生物分子，需要翻译后修饰(如糖基化)和正确折叠以取得完整生物活性，并且因此，哺乳动物细胞是主要使用的重组产生用细胞。有二种方法在这些细胞中产生抗体：稳定基因表达和瞬时基因表达。稳定基因表达是产生重组抗体的很有效方法，原因是编码性核酸整合至宿主细胞的基因组中，这令其持续表达成为可能。但是，产生稳定表达抗体的细胞系很费力及费时。因此，瞬时基因表达是早期药物开发中的选择方法，因为它针对快速产生必需材料的需求提供了解决方案。尽管采用这种方法时基因表达并不持续，但可以在一些天内产生重组抗体。

丙戊酸(Valproic Acid；VPA)是临床上作为抗惊厥药和情绪稳定药物使用的短链脂肪酸(Blaheta等人；2005)。它多半用于治疗癫痫、双相型障碍或偏头痛。由于VPA抑制多种肿瘤细胞的增殖、诱导凋亡并引起多种肿瘤细胞分化，它经常涉及治疗癌症。近期研究鉴定了几条受VPA影响的额外细胞途径，如PKC抑制、Wnt-信号传导活化和ERK激活(Fujiki等人；2013)。VPA的另一个令人感兴趣的特征是其抑制组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的能力(Gottlicher等人；2001)。

丙戊酸(VPA)常用于瞬时基因表达(TGE)增强。随着发现VPA的组蛋白抑制活性，提出其对TGE的效应通过抑制组蛋白尾脱乙酰化来介导。因为认为瞬时转染的质粒整合至染色质结构中并且因此构成通过组蛋白修饰作用外遗传调节基因表达的基础，故提出这种假设。

但是，VPA处理还降低活细胞的细胞密度(VCD)和细胞活力。因此，分别显示VPA不仅诱导细胞周期停滞，随后还诱导外来以及固有凋亡途径(Xu等人；2007)。因此，VPA与胱天蛋白酶抑制剂联合处理显著地防止VPA诱导的凋亡性细胞死亡(Han等人；2013)。

Backliwal,G.等人(Biotechnol.Bioeng.(2008))报导，丙戊酸是丁酸钠的切实可行备选以增强哺乳动物细胞培养物中的蛋白质表达。本文中提出，丙戊酸的效应基于组蛋白脱乙酰酶抑制作用(HDACi)。

在多种细胞系(包括人胚肾(HEK)293细胞)中显示VPA直接抑制组蛋白脱乙酰酶(HDAC)(Gottlicher,Minucci等人,2001)。证实这种观察结果的同时，VPA处理后观察到组蛋白H4过度乙酰化(Phiel,Zhang等人,2001)。

在US 2009/023186中，报告了丙戊酸增强哺乳动物细胞中重组蛋白产生的用途。

在WO 2015/000624中，报告了一种使用羊B-细胞产生抗体的方法及其用途。

在WO 2010/050903中，报告了疫苗用嵌合鞭毛蛋白。

在WO 2015/036583中，报告了外遗传因子和靶向CD33和CD3的双特异性化合物联用治疗髓样白血病。

在WO 2014/022758中，报告了单一药物抗PD-L1和PD-L2双结合抗体和使用方法。

R.Furumai将FK228(酯肽)报告为抑制I类组蛋白脱乙酰酶的天然前药(CancerRes.62(2002)4916)。

发明概述

本文中报告了使用例如与已知的生产增强物丙戊酸相比具有减弱的细胞毒性的生产增强物，增加瞬时基因表达产率的方法。

如本文中报导的一个方面是一种用于真核细胞中重组产生多肽的方法，所述方法包括步骤：

-在培养用培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含(典型)NFκB激活物，和

-从细胞或培养用培养基回收多肽，并且由此在真核细胞中产生多肽。

在一个实施方案中(典型)NFκB激活物选自TNFα、白介素-1/Toll样受体(IL-1R/TLR)家族成员的配体，例如鞭毛蛋白、脂多糖和白介素-1β。

-在培养用培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含2M2P或Quisinostat或罗米地辛(Romidepsin)，和

在一个实施方案中，将2M2P或Quisinostat或罗米地辛在转染细胞后一小时至24小时添加至培养物。在一个实施方案中，将2M2P或Quisinostat或罗米地辛在转染细胞后约三小时添加至培养物。因此，在一个实施方案中，培养是在转染后已经向其添加2M2P或Quisinostat或罗米地辛的培养用培养基中进行。

在一个实施方案中，培养用培养基中添加2M2P(反-2-甲基2-戊烯酸)至约6-7mM(至少3mM)的终浓度。

-在培养用培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含非常规/非典型NFκB激活物，和

在一个实施方案中，非典型NFκB激活物选自EGF、PMA和白桦脂酸(betulinicacid)。

-在培养用培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含亚型特异性HDAC抑制剂，和

在一个实施方案中，亚型特异性HDAC抑制剂是HDAC-1和/或HDAC-2和/或HDAC-3抑制剂。在一个实施方案中，亚型特异性HDAC抑制剂选自庚二酸二苯酰胺106(pimelicdiphenylamide 106)、Apicidin和罗米地辛。

在上述方法中，调节不同功能途径以增加瞬时基因表达产率。现在已经发现如果将利用不同作用模式，即调节不同功能途径的生产增强物组合，瞬时基因表达产量进一步增加是可能的。调节相同功能途径的生产增强物的组合不引起瞬时基因表达产量的显著进一步增加。

-在培养用培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含由典型和非典型NFκB激活物、反-2-甲基2-戊烯酸和亚型特异性HDAC抑制剂组成的组的二个成员，和

-在培养用培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含选自反-2-甲基2-戊烯酸和化学上区别于短链脂肪酸衍生物的HDAC抑制剂的化合物，和

-在培养用培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含鞭毛蛋白和反-2-甲基2-戊烯酸，和

-在培养用培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含Quisinostat和反-2-甲基2-戊烯酸，和

-在培养用培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含罗米地辛且包含反-2-甲基2-戊烯酸和鞭毛蛋白之一，和

在一个实施方案中，培养用培养基中添加2M2P至约6-7mM的终浓度(转染后约3小时添加)。

在一个实施方案中，转染后27小时，鞭毛蛋白或罗米地辛分别以2ng/mL和15nM的浓度添加。

在一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。在一个优选的实施方案中，哺乳动物细胞是HEK293细胞。

在一个实施方案中，表达是稳定表达或瞬时表达。在一个优选的实施方案中，表达是瞬时表达。

在一个实施方案中，培养持续3至16天。在一个实施方案中，优选地如果细胞是HEK细胞，培养持续3-10天。在一个优选的实施方案中，培养持续约7天。

附图简述

图1：经多种VPA浓度处理的HEK293细胞的相对细胞比生产率；每种处理N＝2；y-轴：相对细胞比生产率[％]；1：对照，2：0.5mM丙戊酸，3：1mM丙戊酸，4：2mM丙戊酸，5：3mM丙戊酸，6：4mM丙戊酸，7：6mM丙戊酸。

图2：不同组蛋白脱乙酰酶抑制剂对滴度的影响；

y-轴：相对细胞比生产率(specific productivity)[％]；

A：最有效浓度的确定；JNJ＝Quisinostat；PXD＝Belinostat；SAHA＝辛二酰苯胺异羟肟酸(伏立诺他)；B：每种处理N＝2(除了5例外：N＝1)；y-轴：相对细胞比生产率[％]；1：对照，2：丙戊酸，3：庚二酸二苯酰胺106，4：TMP269，5：丁苯羟酸(Bufexamac)，6：Belinostat，7：恩替诺特，8：Mocetinostat，9：Quisinostat。

图3：A：不同化合物的HDAC抑制剂活性；将HEK293F细胞与所示的分子以及脱乙酰化后转化成荧光染料的底物温育；基于荧光信号的强度计算HDAC抑制剂活性；无底物温育的HEK293F细胞显示为阴性对照；HEK293F细胞与底物和10μM广谱HDAC抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A)温育显示为阳性对照；每种处理N＝3；显著性水平：n.s.：p≥0.05；一个星号：p≤0.05；二个星号：p≤0.01；三个星号：p≤0.001；y-轴：相对HDAC抑制作用[％]；1：对照，2：10μM TSA(阳性对照)，3：3mM丙戊酸，4：3mM戊诺酰胺(valnoctamide)，5：3mM 2M2P，6：20μM庚二酸二苯酰胺106，7：300nM Quisinostat；

B：使用VPA和类似物和HDAC抑制剂不同处理的相对细胞比生产率；每种处理N＝3；显著性水平：二个星号：p≤0.01；三个星号：p≤0.001；

y-轴：相对细胞比生产率[％]；1：对照，未转染的，2：对照，转染的，3：3mM丙戊酸，4：3mM戊诺酰胺，5：3mM 2M2P，6：20μM庚二酸二苯酰胺106，7：300nM Quisinostat。

图4：VPA类似物对细胞比生产率的影响；每种处理N＝2；y-轴：相对细胞比生产率[％]；1：对照，2：丙戊酸-4mM，3：丙戊酰胺(valpromide)-2mM，4：丙戊酰胺-3mM，5：戊诺酰胺-2mM，6：戊诺酰胺-3mM，7：2M2P-2mM，8：2M2P-3mM。

图5：多种NFκB激活物对细胞比生产率的影响；每种处理N＝2；y-轴：相对细胞比生产率[X]；1：对照(转染的)，2：50ng/mL TNFα，3：50ng/mLEGF，4：10ng/mL鞭毛蛋白，5：10μM白桦脂酸，6：100nM佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯。

图6：用2M2P和鞭毛蛋白处理后，对细胞比生产率(A)和IgG浓度(B)的影响；每种处理N＝3；显著性水平：n.s.：p≥0.05；三个星号：p≤0.001；每种处理显示与阴性对照相比显著增加p≤0.001；

A：y-轴：相对细胞比生产率[％]；1：对照(转染的)，2：3mM 2M2P，3：2ng/mL鞭毛蛋白，4：3mM 2M2P+2ng/mL鞭毛蛋白；

B：y-轴：相对IgG浓度[％]；1：对照(转染的)，2：4mM丙戊酸，2：3mM2M2P，4：2ng/mL鞭毛蛋白，5：3mM 2M2P+2ng/mL鞭毛蛋白。

图7：差异性I类HDAC同工型抑制作用；每种处理N＝1；y-轴：相对IgG浓度[％]；1：对照(转染的)，2：10nM罗米地辛，3：200nM apicidin，4：1μM RGFP966，5：5μM PCI34051。

图8：NFκB激活和HDAC 1及2抑制TGE产率的影响；每种处理N＝3；显著性水平：n.s.：p≥0.05；三个星号：p≤0.001；每种处理显示与阴性对照相比显著增加p≤0.01；

A：y-轴：相对细胞比生产率[％]；1：对照(转染的)，2：2ng/mL鞭毛蛋白，3：15μM罗米地辛，4：2ng/mL鞭毛蛋白+15nM罗米地辛；

B：y-轴：相对IgG浓度[％]；1：对照(转染的)，2：4mM丙戊酸，3：2ng/mL鞭毛蛋白，4：15μM罗米地辛，5：2ng/mL鞭毛蛋白+15nM罗米地辛。

图9：VPA衍生物与HDAC 1及2抑制作用组合的影响；每种处理N＝3；显著性水平：n.s.：p≥0.05；三个星号：p≤0.001；每种处理显示与阴性对照相比显著增加p≤0.01；

A：y-轴：相对细胞比生产率；1：对照(转染的)，2：3mM 2M2P，3：15nM罗米地辛，4：3mM 2M2P+15nM罗米地辛；

B：y-轴：相对IgG浓度[％]；1：对照(转染的)，2：4mM丙戊酸，3：3mM2M2P，4：15nM罗米地辛，5：3mM 2M2P+15nM罗米地辛。

缩略语描述

2M2P：反-2-甲基2-戊烯酸

EGF：表皮生长因子

ERK：胞外信号调节的激酶

FITC：异硫氰酸荧光素

GAPDH：甘油醛3-磷酸脱氢酶

HDAC：组蛋白脱乙酰酶

IκB：NFκB抑制剂

IKK：IκB激酶

NEMO：NFκB必需调节物

NFκB：活化B细胞的核因子κ轻链增强物

PD：庚二酸二苯酰胺106

PEI：聚乙烯亚胺

TGE：瞬时基因表达

TNF：肿瘤坏死因子

VCM：戊诺酰胺

VPA：丙戊酸，2-丙基戊酸，2-丙基戊酸

VPM：丙戊酰胺

发明详述

本发明至少部分地基于以下发现：NFκB是瞬时基因表达(TGE)增强作用的调节物。通过激活NFκB并观察到TGE增强作用以及通过VPA处理后抑制NFκB并显示可以降低TGE增强作用，证实了NFκB的这种作用。

本发明进一步至少部分地基于以下发现：HDAC抑制剂Quisinostat介导的TGE增强作用也可能由NFκB抑制作用削弱。NFκB介导了HDAC抑制作用所致的TGE增强作用。

本发明进一步至少部分地基于以下发现：罗米地辛特异性抑制HDAC 1和HDAC 2同工型导致TGE产率强烈增加。这些HDAC同工型负责HDAC介导的TGE增强作用。

本发明进一步至少部分地基于以下发现：HDAC抑制作用与NFκB激活组合并未对TGE显示加合效应，这进一步表明相同的机制受影响。

本发明进一步至少部分地基于以下发现：缺少HDAC抑制剂活性的VPA化学类似物2M2P在特定浓度也增加TGE。另外与VPA和HDAC抑制剂相反，对NFκB的抑制不导致2M2P介导的TGE增强作用降低。在2M2P与NFκB激活或HDAC抑制作用的组合这两种情况下，导致加合效应。

本发明进一步至少部分地基于以下发现：当VPA与2M2P或HDAC抑制剂组合时，未观察到联合效应。

已经发现NFκB是瞬时基因表达(TGE)增强作用的调节物。另外，已经发现NFκB激活介导HDAC抑制作用所致的增强作用。已经进一步发现，特异性抑制HDAC同工型1和2足以获得与广谱HDAC抑制剂VPA和Quisinostat介导的增强作用相当的TGE增强作用。另外，已经鉴定罗米地辛为新的TGE增强物。另外，已经鉴定2M2P为新TGE增强物。2M2P具有与HDAC抑制作用和NFκB激活无关的作用模式。已经发现2M2P与NFκB激活的组合导致与VPA相当的TGE增长。已经发现HDAC抑制作用不是增强TGE产率的唯一方式。VPA与2M2P或与Quisinostat的组合研究提供以下证据：VPA似乎将2M2P的未知作用和HDAC抑制作用统一。最后，已经发现2M2P与通过罗米地辛的同工型特异性HDAC抑制作用组合提供了功效比VPA更高的增强物组合。

定义

丙戊酸(VPA)指2-丙基戊酸(2-丙基戊酸)并且是短链脂肪酸。

如本文中所用，除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数称谓。因此，例如，谈及“细胞(a cell)”包括多个此类细胞及本领域技术人员已知的其等同物等。同样，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”可以在本文互换使用。与之相反，谈及“一个细胞(one cell)”不包括多个此类细胞，而限于单个(分离的)细胞。

还应指出，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。

另外还应指出，术语“包含”涵盖术语“由……组成”作为限制。

术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。

“抗体片段”指不是完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')₂；双体抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“嵌合”抗体指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。

抗体的“类”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。有五个大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种类别可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。

术语“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication91-3242中所述的EU编号体系，也称作EU索引。

术语“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的细胞相同的功能或生物学活性。

“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人源化”抗体指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个和一般两个可变结构域，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应并且全部或基本上全部的FR区与人抗体的那些FR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”(例如，非人抗体)指已经历过人源化的抗体。

“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman,S.等人,J.Chrom.B 848(2007)79-87。

“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括在细胞内所含的核酸分子，其中所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。

如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生根据本发明待使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。

术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt,T.J.等人,KubyImmunology，第6版，W.H.Freemanand Co.，N.Y.(2007)第91页)。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。

如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入已经将该载体引入的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。

如本文中报导的方法

已经发现NFκB作为瞬时基因表达的调节物发挥作用。NFκB抑制作用削弱丙戊酸对滴度的影响。多种分子所致的NFκB激活导致滴度增加。这种影响可以由NFκB抑制作用对抗。

因此，本文中报导一种用于真核细胞中重组产生多肽的方法，所述方法包括步骤：

-在培养用培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含典型NFκB激活物，和

术语“包含化合物的培养用培养基”指在一个时间点在培养中，这种化合物被/已经添加至/存在于培养基中。这个时间点可以正好在转染后、在培养伊始或在接种培养物后的定义时间点(＝培养起点)。在一个实施方案中，时间点是在转染细胞后。在一个实施方案中，时间点是转染细胞后一小时至约30小时。在一个实施方案中，时间点是转染细胞后约三小时。因此，在一个实施方案中，培养是在转染细胞后在已经向其添加了NFκB激活物的培养用培养基中进行。

已经发现向培养用培养基添加反-2-甲基2-戊烯酸(2M2P)导致瞬时基因表达滴度增加。已经发现2M2P通过与NFκB激活以及HDAC抑制作用无关的机制增强TGE。已经发现不能通过抑制IKK来降低2M2P对TGE的增强，并且因此，通过独立于NFκB之外的机制改善比生产率。

已经进一步发现向培养用培养基添加Quisinostat或罗米地辛导致瞬时基因表达滴度增加。

-在培养用培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含2M2P或Quisinostat或罗米地辛，和

在一个实施方案中，将2M2P或Quisinostat或罗米地辛在转染细胞后一小时至24小时添加至培养物。在一个实施方案中，将2M2P或Quisinostat或罗米地辛在转染细胞后约三小时添加至培养物。因此，在一个实施方案中，在转染后已经向其添加2M2P或Quisinostat或罗米地辛的培养用培养基中进行培养。

在一个实施方案中，培养用培养基中添加2M2P至约6-7mM的终浓度。

在一个实施方案中，非常规或非典型NFκB激活物选自但不限于生长因子、PKC激活物或活性氧类诱导试剂如白桦脂酸。

NFκB可以例如借助PI3激酶激活过程由EGF激活、借助PKC激活过程由PMA激活或在白桦脂酸扰动线粒体膜后由活性氧类激活(Lallena,Diaz-Meco等人,1999；Biswas,Cruz等人,2000；Gloire,Legrand-Poels等人,2006)。

在一个实施方案中，非常规/非典型NFκB激活物选自EGF、PMA和白桦脂酸。

已经发现，亚型特异性组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)作为瞬时基因表达的调节物发挥作用。选择性抑制HDAC-1、HDAC-2和/或HDAC-3导致瞬时基因表达增加。

在一个实施方案中，亚型特异性HDAC抑制剂是HDAC-1和/或HDAC-2和/或HDAC-3抑制剂。在一个实施方案中，亚型特异性HDAC抑制剂选自庚二酸二苯酰胺106、Apicidin和罗米地辛。

术语“包含由典型和非典型NFκB激活物、反-2-甲基2-戊烯酸和亚型特异性HDAC抑制剂组成的组中二个成员的培养用培养基”指在培养过程的一个时间点处，这两种化合物存在于/已经添加至培养用培养基中。这个时间点可以是转染、培养伊始或接种培养物(＝培养起点)后的定义的时间点。这还包括依次添加化合物，即在转染细胞后的第一时间点添加/已经添加一种化合物并且在转染细胞后的第二时间点添加/已经添加另一种化合物。在一个实施方案中，时间点是转染细胞后一小时至三十小时。在一个实施方案中，第一时点是转染细胞后约一小时至五小时并且第二时间点是转染细胞后约二十一小时至三十小时。在一个实施方案中，第一时点是转染细胞后约三小时并且第二时间点是转染细胞后约二十四小时至二十七小时。因此，在一个实施方案中，在转染细胞后接种培养物并在定义的时间点已经向其添加所述两种化合物的培养用培养基中进行培养。

鞭毛蛋白是TLR5激动剂。已经发现鞭毛蛋白与2M2P的组合导致相当于采用丙戊酸时所获得的生产产率增加。

已经发现2M2P和罗米地辛(HDACi)的组合导致与丙戊酸相比的产物产率增加。

下文概述这些发现和方面。

丙戊酸

作为唯一生产增强物，测试了范围0.5mM至6mM的不同浓度丙戊酸(结果参见下表和图1；每个浓度N＝2)。用3mM VPA观察到最高比生产率，但是相对于4mM VPA，没有明显的比生产率差异。另外，细胞比生产率在较高浓度和较低浓度降低。

化合物	相对细胞比生产率[％]
		无(对照)	100
0.5mM丙戊酸	184
		1mM丙戊酸	204
2mM丙戊酸	246
		3mM丙戊酸	284
4mM丙戊酸	273
		6mM丙戊酸	223

因此，在一个实施方案中，丙戊酸以2.5mM至5mM的浓度使用。在一个优选的实施方案中，丙戊酸以3mM至4mM的浓度使用。如果将丙戊酸作为如本文报导的方法中的唯一生产增强物或与其他生产增强物组合而作为混合物使用，则前文给出的浓度是独立的。丙戊酸本身以列举的浓度使用。

除丙戊酸之外的组蛋白脱乙酰酶抑制剂

二甲基亚砜(DMSO)是全部所应用的HDAC抑制剂的溶剂以产生母液，但是在转染后3小时添加至瞬时转染细胞培养物的DMSO为0.1vol％时，与未处理的对照相比，未见比生产率差异(数据未显示)。

对限于某些HDAC亚类的HDAC抑制剂以及广谱HDAC抑制剂测试其对细胞比生产率的影响：

-庚二酸二苯酰胺106是对HDAC 1和3具有最高亲和力、对HDAC 2具有高亲和力并对HDAC 8具有轻微亲和力的I类HDAC抑制剂(Chou,Herm等人,2008)；该抑制剂以范围0.2–20μM的浓度添加。

-将TMP269描述为偏好IIa类HDAC 4、5、7和9的HDAC抑制剂(Burli,Luckhurst等人,2013)；该抑制剂以范围0.6–15μM的浓度添加。

-已经将丁苯羟酸描述为选择性IIb类HDAC抑制剂(Bantscheff,Hopf等人,2011)；该抑制剂以范围2–50μM的浓度添加。

-Belinostat异羟肟酸盐是对HDAC 6和HDAC 1具有最高偏好性的广谱抑制剂(Khan,Jeffers等人,2008；Atadja 2009)；苯甲酰胺恩替诺特是对IIa类成员HDAC 9具有额外抑制活性的I类HDAC抑制剂(Bertrand 2010)；Mocetinostat是对HDAC 1及2具有最低IC₅₀值并对HDAC 3和HDAC 11具有轻微抑制活性的苯甲酰胺(Arts,King等人,2009)；Quisinostat是一种嘧啶基异羟肟酸并且是对HDAC 1、2、4和11具有最高效力的非常强力的广谱HDAC抑制剂(Arts,King等人,2009)；将广谱HDAC抑制剂Belinostat、恩替诺特、Mocetinostat和Quisinostat分别以浓度1μM、300nM、2μM和300nM添加。

与Backliwal等人(上文)提出的假设相反，本发明人已经发现，甚至比丙戊酸更强力的组蛋白脱乙酰酶抑制剂也未显示生产增强作用(参见图2和下表；N＝2(丁苯羟酸例外：N＝1))。

化合物	相对细胞比生产率[％]	使用的浓度/剂量
			无	100	-
丙戊酸	326	4mM
			庚二酸二苯酰胺106	160	20μM
TMP269	99	15μM
			丁苯羟酸	94	10μM
Belinostat	115	1μM
			恩替诺特	108	300nM
Mocetinostat	135	2μM
			Quisinostat	279	300nM

因此，不能通过HDACi获得丙戊酸的作用。与其他HDACi相反，丙戊酸和Quisinostat的确诱导生长抑制和细胞死亡。

HDAC特异性抑制剂

已经发现与IIa类和IIb类HDAC抑制剂之相反，I类HDAC抑制剂庚二酸二苯酰胺106对TGE显示增强的影响(参见图2)。

进一步测试了不同I类同工型选择性HDAC抑制剂：

-双环酯肽罗米地辛是强力和选择性HDAC 1和HDAC 2抑制剂(Furumai,Matsuyama等人,2002)；罗米地辛以10nM至1μM的浓度范围使用。

-将环四肽Apicidin描述为强力I类HDAC抑制剂，对HDAC 2和HDAC 3具有最高亲和力(Khan,Jeffers等人,2008)；该抑制剂以20nM至2μM的浓度范围测试。

-RGFP966是特异性HDAC 3抑制剂；它以1μM至100μM的浓度范围使用(Malvaez,McQuown等人,2013)。

-将HDAC 8特异性抑制剂PCI34051以500nM至50μM的浓度范围添加(Balasubramanian,Ramos等人,2008)。

下表中显示结果(参见图7；N＝1)。

化合物	相对滴度[％]
		无	100
3mM丙戊酸	188
		10nM罗米地辛	212

丙戊酸类似物

测试几种VPA化学类似物的作用：

-丙戊酰胺(VPM)和反-2-甲基-2-戊烯酸(2M2P)是具有很微弱HDAC抑制剂活性至没有HDAC抑制剂活性的VPA结构类似物(Phiel,Zhang等人,2001；Gurvich,Tsygankova等人,2004；Eyal,Yagen等人,2005)。

-戊诺酰胺(VCM)的HDAC抑制剂活性没有在文献中直接描述，但已知VCM的羧酸(valnoctic acid)具有微弱HDAC抑制剂活性(Eyal,Yagen等人,2005)。

测定了某些化合物的HDACi。下表和图3A和图3B(N＝3)中显示结果。

与对照(无2M2P)相比，就滴度增加而言测试3至11mM的2M2P浓度(N＝2)。

2M2P浓度	相对滴度[％]
		无	100
3mM	165
		6mM	257
7mM	258
		8mM	172
9mM	120
		10mM	42
11mM	0(有毒的)

基于上文评估的VPA浓度，其类似物以2mM至4mM的浓度范围使用。在4mM，全部分子均显示出高毒性。在3mM，VPM已经有细胞毒性。在2mM使用VPM和VCM观察到微弱TGE增强作用。在3mM，与阴性对照相比，2M2P明确增加蛋白质表达产率(参见下表；图4；N＝2)。

化合物	相对细胞比生产率[％]	使用的浓度/剂量
			无	100	-
丙戊酸	315	4mM
			丙戊酰胺	155	2mM
丙戊酰胺	0(有毒的)	3mM
			戊诺酰胺	133	2mM
戊诺酰胺	125	3mM
			2M2P	123	2mM
2M2P	196	3mM

下表中显示用一些化合物获得的结果。

NFκB激活物

已经发现，可以通过调节NFκB转录对生产产率(滴度)获得积极影响。

已经进一步发现，借助典型和非典型途径激活NFκB导致生产产率增加。

可以借助不同途径激活NFκB。测试了以下NFκB激活物的作用：

-将肿瘤坏死因子(TNF)α以及表皮生长因子(EGF)和来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的鞭毛蛋白以2ng/mL–50ng/mL的浓度范围添加(Osborn,Kunkel等人,1989；Sun和Carpenter1998；Hayashi,Smith等人,2001)。

-将白桦脂酸和佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)分别在2.5μM–40μM和10nM–500nM之间的浓度范围补充(Kasperczyk,La Ferla-Bruhl等人,2005；Holden,Squires等人,2008)。

与阴性对照相比，测试的全部化合物均显示增强细胞比生产率(参见下表；图5；N＝2)。

<u>化合物</u>	<u>相对细胞比生产率[％]</u>
		<u>无</u>	<u>100</u>
<u>50ng/mL TNFα</u>	<u>139</u>
		<u>50ng/mL EGF</u>	<u>173</u>
<u>10ng/mL鞭毛蛋白</u>	<u>154</u>
		<u>10μM白桦脂酸</u>	<u>121</u>
<u>100nM PMA</u>	<u>149</u>

另外研究了对NFκB的抑制作用。由于不可获得NFκB的直接抑制剂，通过施用BAY11-7082抑制了促进IκB降解的IκB激酶(Pierce,Schoenleber,1997)。

NFκB可以通过NFκB与其内源抑制剂IκB持久结合来抑制。BAY11-7082以5μM至15μM的浓度范围与3mM VPA组合。在观察到VPA与BAY11-7082组合所致的高毒性后，测试几个BAY11-7082添加时间点。伴随高度影响和最低毒性的BAY11-7082添加时间点是转染后24小时。BAY11-7082的影响持续约4天。在VPA、2M2P或Quisinostat处理后，将BAY11-7082以最佳浓度(15μM)和最佳时间点(转染后24小时)添加。与相应的单一处理相比，在VPA和Quisinostat处理后，细胞比生产率可以随添加BAY11-7082而显著降低。与单一处理相比，2M2P与BAY11-7082组合时未观察到细胞比生产率降低。总之，BAY11-7082仅可以在抑制HDAC的分子处理后才降低TGE增强作用。

同样地，检查所述NFκB激活物所致的TGE增强作用是否可以用BAY11-7082逆转。将HEK293F细胞用相应最佳浓度的TNF、EGF或鞭毛蛋白处理。另外，刺激后24小时将BAY11-7082添加至以相同方式处理的HEK293F细胞。可以从下表中所含的数据见到：与相应的单一处理相比，BAY11-7082处理后，TGE增强作用显著降低。

下表中展示结果(N＝3)。

化合物	相对细胞比生产率[％]
		无	100
3mM丙戊酸	237
		3mM丙戊酸+15μM BAY 11-7082	230
3mM 2M2P	144
		3mM 2M2P+15μM BAY 11-7082	149
300nM Quisinostat	218
		300nM Quisinostat+15μM BAY 11-7082	205
50ng/mL TNFα	157
		50ng/mL TNFα+15μM BAY 11-7082	115
20ng/mL EGF	151
		20ng/mL EGF+15μM BAY 11-7082	133
2ng/mL鞭毛蛋白	134
		2ng/mL鞭毛蛋白+15μM BAY 11-7082	122

可以见到，BAY 11-7082减少HDACi介导的生产产率增加，但不减少2M2P介导的生产产率增加。还可以见到，BAY 11-7082减少NFκB激活物介导的生产产率增加。

组合

i)无组蛋白脱乙酰酶抑制作用

已经发现不能通过抑制IKK来降低2M2P对TGE的增强，并且因此，通过独立于NFκB之外的另一种机制改善比生产率。

已经发现2M2P和NFκB激活物可以组合用于增加影响。

鞭毛蛋白是TLR5激动剂。鞭毛蛋白与2M2P的组合导致相当于采用丙戊酸时所获得的生产产率增加。

在一个例子中，用2M2P处理HEK293F细胞。另外在2M2P处理后24小时，用鞭毛蛋白刺激细胞。各种NFκB激活物当中，鞭毛蛋白显示出最轻度的毒性。与各单一处理相比，可以通过组合进一步增加细胞比生产率。在2M2P和鞭毛蛋白处理后的IgG浓度与VPA处理后的产率比较。下表和图6中显示结果(N＝3)。

化合物	相对IgG浓度[％]
		无	100
4mM丙戊酸	173
		3mM 2M2P	128
2ng/mL鞭毛蛋白	133
		3mM 2M2P+2ng/mL鞭毛蛋白	175

化合物	最终滴度[mg/L]
		无	39.8
3mM丙戊酸	68.8
		3mM 2M2P+2ng/mL鞭毛蛋白	69.8

这种影响不由HDAC抑制作用介导。

ii)有组蛋白脱乙酰酶抑制作用

进行VPA、Quisinostat和2M2P彼此组合的研究。为了降低VPA的细胞毒性，将浓度降至2mM，以与也有毒的分子Quisinostat和2M2P组合。下表中显示结果(N＝3)。

化合物	相对细胞比生产率[％]
		无	100
2mM丙戊酸	278
		3mM 2M2P	169
2mM丙戊酸+3mM 2M2P	276

化合物	相对细胞比生产率[％]
		无	100
2mM丙戊酸	278
		300nM Quisinostat	258
2mM丙戊酸+300nM Quisinostat	269

化合物	相对IgG浓度[％]
		无	100
2mM丙戊酸	217
		300nM Quisinostat	169
2mM丙戊酸+300nM Quisinostat	152

化合物	相对细胞比生产率[％]
		无	100
3mM 2M2P	169
		300nM Quisinostat	258
3mM 2M2P+300nM Quisinostat	266

化合物	相对IgG浓度[％]
		无	100
3mM 2M2P	146
		300nM Quisinostat	169
3mM 2M2P+300nM Quisinostat	152

iii)HDAC抑制剂、NFκB激活物和VPA衍生物的组合

随着鉴定到具有轻度毒性并强烈影响TGE增强作用的特异性HDAC抑制剂，与NFκB激活物鞭毛蛋白和VPA类似物2M2P组合的罗米地辛产生了很有效的TGE增强物组合。分别在转染后3小时和24小时，分别以2ng/mL和15nM的浓度添加鞭毛蛋白和罗米地辛。在下表和图8中显示结果(N＝3)。

还组合罗米地辛。转染后3小时以3mM的浓度添加2M2P并且2M2P处理后24小时以15nM的浓度添加罗米地辛。在瞬时表达的抗体产率方面观察到协同作用。另外，与单独VPA处理相比，该组合导致更高的抗体产率(参见下表和图9；N＝3)。

重组方法

可以从真核细胞(例如HEK293细胞、CHO细胞)表达任何多肽(例如，抗体、单链抗原结合多肽如scFv、scFab或darpin或者多链抗原结合多肽如dsFv或Fab)并且从其上清液纯化。多肽是否为分离的多肽或包含于多聚体实体或异聚体实体并不重要。

用于克隆或表达/分泌编码多肽的载体的合适宿主细胞包括本文所述的真核细胞。在表达后，多肽可以从细胞或培养上清液分离。此后，可以进一步纯化多肽。

可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮生长的哺乳动物细胞系可以有用。可用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是COS-7细胞系(由SV40转化的猴肾CV1细胞)；HEK293细胞系(人胚肾)；BHK细胞系(幼仓鼠肾)；TM4小鼠支持细胞系(在例如Mather,Biol.Reprod.23(1980)243-251中所述的TM4细胞)；CV1细胞系(猴肾细胞)；VERO-76细胞系(非洲绿猴肾细胞)；HELA细胞系(人宫颈癌细胞)；MDCK细胞系(犬肾细胞)；BRL-3A细胞系(布法罗大鼠肝细胞)；W138细胞系(人肺细胞)；HepG2细胞系(人肝细胞)；MMT 060562细胞系(小鼠乳腺瘤细胞)；TRI细胞系(例如，Mather等人,Anal.N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述)；MRC5细胞系；和FS4细胞系。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括CHO细胞系(中国仓鼠卵巢细胞)，包括DHFR阴性CHO细胞系(例如参见Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216)；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0细胞系。关于适于产生多肽的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,Antibody Engineering 248(2004)255-268(B.K.C.Lo,(编著),Humana Press,Totowa,NJ)。

抗体片段

在某些实施方案中，采用如本文中报导的方法产生的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见例如Plueckthun,引自The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编著),(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还参见WO93/16185；及US 5,571,894和US 5,587,458。关于包含救援受体(salvage receptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')₂片段的讨论，参见US 5,869,046。

双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。三体抗体和四体抗体也在Hudson等人,Nat.Med.9(2003)129-134中描述。

单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如US 6,248,516B1)。

可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞产生(例如，大肠杆菌或噬菌体)，如本文所述。

多特异性抗体

在某些实施方案中，采用如本文中报导的方法产生的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段。

用于产生多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein,C.和Cuello,Nature 305(1983)537-540,WO 93/08829和Traunecker,A.等人,EMBO J.10(1991)3655-3659)和“结入扣”工程化(例如，参见US 5,731,168)。也可以通过以下方式产生多特异性抗体：工程化静电转向效应用于产生抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(例如，参见US4,676,980和Brennan,M.等人,Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(例如，参见Kostelny,S.A.等人,J.J.Immunol.,148(5)(1992)1547-1553)；使用“双体抗体(diabody)”技术制备双特异性抗体片段(例如，参见Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(例如，参见Gruber,M.等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69中所述那样。

本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibody)”(参见，例如US 2006/0025576A1)。

本文的抗体或片段还包括“双作用Fab”或“DAF”，其包含与CD19以及另一种不同抗原结合的抗原结合位点(例如参见，US 2008/0069820)。

本文中的抗体或片段也包括在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2010/145793中描述的多特异性抗体。

如本发明方法中的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体是多特异性抗体组的成员。双特异性抗体包含至少两个结合位点，其各自由一对与不同抗原或与相同抗原上不同表位结合的抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)形成。这种双特异性抗体是1+1样式。其他双特异性抗体样式是2+1样式(包含针对第一抗原或表位的二个结合位点和针对第二抗原或表位的一个结合位点)或2+2样式(包含针对第一抗原或表位的二个结合位点和针对第二抗原或表位的二个结合位点)。

在全部方面的一个实施方案中，本发明方法的抗体包括(全部位置均依据Kabat的EU索引)

i)人IgG1亚类的同型二聚Fc区，任选地具有突变P329G、L234A和L235A，或

ii)人IgG4亚类的同型二聚Fc区，任选地具有突变P329G、S228P和L235E，或

iii)人IgG1亚类的同型二聚Fc区，任选地具有突变P329G、L234A、L235A、I253A、H310A和H435A，或任选地具有突变P329G、L234A、L235A、H310A、H433A和Y436A，或

iv)异二聚Fc区，其中

a)一条Fc区多肽包含突变T366W，并且另一条Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或

b)一条Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，并且另一条Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或

c)一条Fc区多肽包含突变T366W和S354C，并且另一条Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，

或

v)人IgG1亚类的异二聚Fc区，其中两条Fc区多肽包含突变P329G、L234A和L235A，并且

或

vi)人IgG4亚类的异二聚Fc区，其中两条Fc区多肽包含突变P329G、S228P和L235E，并且

或

vii)i)、ii)和iii)之一与vi)、v)和vi)之一的组合。

在全部方面的一个实施方案中，本发明方法的抗体是二价双特异性抗体，其包含

a)与第一抗原特异性结合的抗体的第一轻链和第一重链，和

b)与第二抗原特异性结合的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH相互替换。

a)下的抗体不含有如b)下报告的修饰并且a)下的重链和轻链是分离的链。

在b)下的抗体中

在轻链内部

轻链可变域VL替换为所述抗体的重链可变域VH，

并且

在重链内部

重链可变域VH替换为所述抗体的轻链可变域VL。

a)与第一抗原特异性结合的抗体的第一轻链和第一重链，和

b)与第二抗原特异性结合的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH是相互替换，并且其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1相互替换。

在b)下的抗体中

在轻链内部

轻链可变域VL替换为所述抗体的重链可变域VH，并且恒定轻链结构域CL替换为所述抗体的恒定重链结构域CH1；

并且

在重链内部

重链可变域VH替换为所述抗体的轻链可变域VL，并且恒定重链结构域CH1替换为所述抗体的恒定轻链结构域CL。

a)与第一抗原特异性结合的抗体的第一轻链和第一重链，和

b)与第二抗原特异性结合的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1相互替换。

在b)下的抗体中

在轻链内部

恒定轻链结构域CL替换为所述抗体的恒定重链结构域CH1；

并且在重链内部

恒定重链结构域CH1替换为所述抗体的恒定轻链结构域CL。

在全部方面的一个实施方案中，如本文报告的抗体是多特异性抗体，其需要至少两条重链多肽的异二聚化。

异二聚化

已经描述了几种修饰CH3以支持异二聚化的方案，例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述。一般，在本领域已知的方案中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域均以互补方式工程化，从而包含一个工程化CH3结构域的重链可以不再与相同结构的另一个重链同型二聚化(例如CH3工程化的第一重链可以不再与CH3工程化的另一条第一重链同型二聚化；并且CH3工程化的第二重链可以不再与CH3工程化的另一条第二重链同型二聚化)。因而，包含一个工程化CH3结构域的重链被迫与另一条以互补方式工程化的包含CH3结构域的重链异二聚化。对于这个实施方案，通过氨基酸置换，以互补方式工程化第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域，从而第一重链和第二重链被迫异二聚化，而第一重链和第二重链可以不再同型二聚化(例如因空间排列原因)。

构思上文提到并包括的本领域已知支持重链异二聚化的不同方案作为不同的备选物用于提供如本文报告的多特异性抗体，所述多特异性抗体包含衍生自第一抗体的与第一抗原特异性结合的“非交联Fab区”和衍生自第二抗体的与第二抗原特异性结合的“交联Fab区”，前述Fab区与上文描述的特定氨基酸置换组合。

可以通过“结入扣(knob-into-hole)”技术改变如本文报告的多特异性抗体的CH3结构域，所述技术以例如WO 96/027011、Ridgway J.B.等人,Protein Eng.9(1996)617-621和Merchant,A.M.等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中的几个例子详述。在这种方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域的一者可以是“结”，而另一者是“扣”。二硫键的引入进一步稳定异二聚体(Merchant,A.M等人,Nature Biotechnol.16(1998)677-681；Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产率。

在一个优选的实施方案中，多特异性抗体包含在“结链”的CH3结构域中的T366W突变和在“扣链”的CH3结构域中的突变T366S、L368A、Y407V(根据Kabat EU索引编号)。也可以例如通过向“结链”的CH3结构域引入Y349C突变并向“扣链”的CH3结构域引入E356C突变或S354C突变，使用CH3结构域之间的额外链间二硫键(Merchant,A.M等人,NatureBiotechnol.16(1998)677-681)。因此，在另一个优选的实施方案中，多特异性抗体包含在两个CH3结构域之一中的突变Y349C和T366W和在两个CH3结构域的另一者中的突变E356C、T366S、L368A和Y407V，或者多特异性抗体包含在两个CH3结构域之一中的突变Y349C和T366W和在两个CH3结构域的另一者中的突变S354C、T366S、L368A和Y407V(在一个CH3结构域中的额外Y349C突变和在另一个CH3结构域中的额外E356C或S354C突变形成链间二硫键)(根据Kabat EU索引编号)。

还可以备选或额外地使用如EP 1 870 459所描述的其他结入扣技术。在一个实施方案中，多特异性抗体包含在“结链”的CH3结构域中的突变R409D和K370E和在“扣链”的CH3结构域中的突变D399K和E357K(根据Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中，多特异性抗体包含在“结链”的CH3结构域中的T366W突变和在“扣链”的CH3结构域中的突变T366S、L368A和Y407V并且额外地包含在“结链”的CH3结构域中的突变R409D和K370E和在“扣链”的CH3结构域中的突变D399K和E357K(根据Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中，多特异性抗体包含在两个CH3结构域之一中的突变Y349C和T366W和在两个CH3结构域的另一者中的突变S354C、T366S、L368A和Y407V，或者多特异性抗体包含在两个CH3结构域之一中的突变Y349C和T366W和在两个CH3结构域的另一者中的突变S354C、T366S、L368A和Y407V，并且额外地包含在“结链”的CH3结构域中的突变R409D和K370E及在“扣链”的CH3结构域中的突变D399K和E357K(根据Kabat EU索引编号)。

除“结入扣技术”之外，修饰多特异性抗体重链的CH3结构域以执行异二聚化的其他技术也是本领域已知的。本文中将这些技术，尤其在WO 96/27011、WO 98/050431、EP1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的那些，构思为与多特异性抗体组合的“结入扣技术”的备选物。

在如本文报告的全部方面和实施方案的一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。在一个优选的实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。

在如本文中报导的全部方面的一个实施方案中，抗体是二价或三价抗体。在一个实施方案中，抗体是二价抗体。

在如本文中报导的全部方面的一个实施方案中，多特异性抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体属于人IgG1亚类或具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体属于人IgG2亚类。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体属于人IgG3亚类。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体属于人IgG4亚类或具有额外突变S228P的人IgG4亚类。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体属于人IgG1亚类或人IgG4亚类。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体属于具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类(根据KabatEU索引编号)。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体属于具有突变L234A、L235A和P329G人IgG1亚类(根据Kabat EU索引编号)。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体属于具有突变S228P和L235E的人IgG4亚类(根据Kabat EU索引编号)。在如本文报告的全部方面的又一个实施方案中，多特异性抗体属于具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类(根据Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中，如本文报告的方法中的抗体属于具有突变PVA236、L234A/L235A和/或GLPSS331的人IgG1亚类(根据Kabat的EU索引编号)或属于IgG4亚类。在又一个实施方案中，抗体属于在E233、L234、L235、G236、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331和/或P329中含有至少一个突变的任何IgG类，在一个实施方案中，属于IgG1或IgG4亚类(根据Kabat的EU索引编号)。进一步在一个实施方案中，抗体属于IgG4亚类并含有突变S228P，或突变S228P和L235E(Angal,S.等人,Mol.Immunol.30(1993)105-108)(根据Kabat的EU索引编号)。

如本文报告的方法中的抗体的重链C末端可以是以氨基酸残基PGK结尾的完整C末端。重链的C末端可以是其中已经移除一个或两个C端氨基酸残基的缩短的C末端。在一个优选的实施方案中，重链的C末端是以PG结尾的缩短的C末端。

在一个实施方案中，抗体包含了包括如本文具体说明的C末端CH3结构域的重链，包含C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在一个实施方案中，抗体包含了包括如本文具体说明的C末端CH3结构域的重链，包含C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。

实施例

提供以下实施例、附图和序列以辅助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。可以理解，可以对所述方法作修改而不脱离本发明的精神。

材料和方法

使用的化学品

试剂盒和主混合物

名称	生产商
		Transcriptor第一链cDNA合成酶	Roche
Taq Man探针Master	Roche
		HDAC活性测定法	Biovision
RNeasy plus Mini试剂盒	Qiagen
		Agilent RNA 6000Nano试剂盒	Agilent

重组DNA技术

如Sambrook,J.等人,Molecular cloning:A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中所述的标准方法用来操作DNA。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。

基因和寡核苷酸合成

通过化学合成制备目的基因区段。将合成的基因片段克隆入大肠杆菌质粒用于增殖/扩增。通过DNA测序验证亚克隆基因片段的DNA序列。备选地，通过化学合成的寡核苷酸复性或通过PCR装配短合成性DNA片段。相应的寡核苷酸由metabion GmbH(Planegg-Martinsried，德国)制备。

基本/标准哺乳动物表达质粒的描述

为了表达目的基因/蛋白质(例如全长抗体重链、全长抗体轻链或在其N末端含有寡甘氨酸的Fc-链)，使用包含以下功能性元件的转录单位：

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包含内含子A，

-人重链免疫球蛋白5'非翻译区域(5’UTR)，

-鼠免疫球蛋白重链信号序列，

-待表达的基因/蛋白质(例如全长抗体重链)，和

-牛生长激素多聚腺苷化序列(BGH pA)。

除了包含待表达目的基因的表达单元/盒之外，基本/标准哺乳动物表达质粒还含有

-来自载体pUC18的允许这个质粒在大肠杆菌中复制的复制起点，和

-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。

细胞培养

在振荡培养箱(Kuhner,Mytron)中，将HEK293F细胞在摇瓶中F17培养基(LifeTechnologies)内于36.5℃，7.0％CO₂和80％湿度培养。细胞每三至四天分裂并且培养不超过五周。为了避免过度生长并且保持其处于指数期生长，活细胞密度(VCD)绝不超过60*10⁵个细胞/mL。

瞬时基因表达(TGE)

瞬时基因表达是持续5-7天的程序。这种表达系统的标准操作规程适用多种细胞培养体积(范围从80mL至2L)的摇瓶。首先，将一半的细胞培养体积按8*10⁵个细胞/mL的活细胞密度(VCD)接种。在培养两天后，细胞分裂至约12*10⁵个细胞/mL的VCD。在次日，用基于聚乙烯亚胺(PEI)的转染试剂转染20*10⁵个细胞/mL和25*10⁵个细胞/mL之间VCD的细胞。转染后3小时，添加生产增强物(如果有的话)。在转染后24小时，补充补料溶液和葡萄糖浓剂以避免养分限制。取决于细胞活力(不应当降至50％以下)，转染后五至七天收获上清液并对其进行抗体纯化。

为了比较瞬时基因表达率，总是共转染编码一个不同抗体的相同质粒。

为了等摩尔共转染二种质粒，计算一个质粒的碱基对数与总碱基对数的比率并乘以DNA总量(0.5mg/L)。质粒一具有10530bp大小并且质粒二具有7184bp大小并且在水中溶解至终浓度1mg/mL。为了转染1升细胞培养物，将297μL质粒一和203μL质粒二在室温溶解于40mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。添加1.25mL

溶液并充分混合该溶液。在温育10-15分钟后，将混合物添加至细胞。在含有每次实验必需的完整细胞培养物的批次中转染细胞，以避免源自不同转染效率的变异。

将80mL转染的细胞培养物批添加至125ml摇瓶。对于每次实验，使用二个或三个125mL摇瓶作为生物学重复并且按相同方式处理。转染后三小时，将细胞分入125mL摇瓶并且开始用小分子或配体处理细胞。通过未处理的对照样品测定基本蛋白质表达。为了用标准操作规程比较样品，还用终浓度4mM或3mM的VPA处理细胞。VPA和其类似物溶解于双蒸水中。在二甲基亚砜(DMSO)中溶解HDAC抑制剂和BAY11-7082溶解于并且以1000倍于终浓度的更高浓度配制母液。表皮生长因子(EGF)复溶于补充0.1％牛血清白蛋白(BSA)的10mM无菌乙酸中。肿瘤坏死因子(TNF)α用补充0.1％BSA的PBS复溶。鞭毛蛋白溶解于无菌双蒸水中。所应用的分子不直接添加至培养物，而是稀释于预温至36.5℃的16mL培养基中并然后添加至培养物。

转染后24小时，将36.5℃的补料溶液和3mg/mL葡萄糖添加至培养物。

细胞密度和活力的测定

为了确定细胞活力和活细胞密度(VCD)，将1mL培养用培养基(细胞悬液)转移入Cedex低污垢样品杯。将该杯置入Vicell仪(Beckman Coulter)。该仪器将细胞与台盼蓝混合以着染死细胞。在分析50幅图像后，计算VCD并通过计算与总细胞数目有关的活细胞数目百分数，测定活力。

IgG浓度测定

通过比浊试验测定瞬时表达的抗体的总浓度。将1mL细胞悬液转移入Eppendorf杯并按10,000rpm(9,300g)离心10分钟。将上清液转移入一个新杯并接受Cobas Integra400plus(Roche)分析。与内标物比较，计算绝对浓度。

细胞比生产率

细胞比生产率是每个细胞和每日的蛋白质产量。该计算基于下式，以计算产物浓度变化(ΔP)/消逝时间(Δt)：

Pr＝比生产率；c(t)＝生产性生物量

出于生产率指一个细胞，生产性生物量是平均活细胞密度

经变换以计算细胞比生产率，该式结果如下：

为了将单位变换成[pg/(细胞*d)]，该式改编如下：

此后，计算整个培养时间范围的平均比生产率。最后，相对于转染的阴性对照确定平均比生产率的值。

HDAC活性测定

根据生产商的说明通过原位HDAC活性荧光测定试剂盒(Biovision)测HDAC活性。将HEK293F细胞于F17培养基(Life Technologies)中悬浮至细胞密度5*10⁵个细胞/mL。将一百微升培养物/孔吸入黑色ELISA板。平板以1000g离心5分钟。抛弃上清液并将细胞重悬于反应混合物中，所述反应混合物含有F17培养基、1％HDAC底物和就HDAC抑制剂活性受测试的分子。使用10μM曲古抑菌素A作为阳性对照，并且通过重悬细胞于含1％HDAC底物的F17培养基中，测定基础HDAC活性。另外，将细胞重悬于无HDAC底物的F17培养基中作为背景对照。对每份样品以及每个对照一式三份执行HDAC活性测定法。将96孔板在36.5℃、80％湿度和7％CO₂温育1小时。在这段时间期间，活性HDAC令HDAC底物去乙酰基，这释放猝灭的底物荧光信号。在温育后，通过无限荧光平板读数仪(TECAN)分析荧光信号。通过扣减背景对照的荧光信号，将样品和对照的荧光信号归一化。假定源自底物去乙酰化的荧光信号与HDAC活性直接相关。相对于阳性对照(100％抑制)和阴性对照(0％抑制)计算HDAC抑制作用。

流式细胞术

为了确定荧光RNA转染后的转染效率，使用FACS Canto II(BD)，通过流式细胞术分析细胞。将细胞悬液(2mL)转移入2mL Eppendorf杯并按1,500rpm(200g)离心10分钟。为了减少背景荧光，抛弃上清液并将细胞重悬于2mL F17培养基中。将细胞悬液转移入14mL圆底聚苯乙烯管(Falcon)并在黑暗下保存。在488nm激发波长和525nm发射波长分析一万个细胞。使用FlowJo软件，进一步分析活群体。将信号强度与未转染的对照样品比较并测定转染效率。

荧光显微术

通过每mL细胞悬液添加两滴Hoechst33343溶液(Life Technologies)并温育20分钟，复染FITC标记的RNA转染的细胞的胞核。通过荧光显微镜(Zeiss)对细胞成像以定性确定转染效率。

细胞实验和分子生物学实验的统计结果

通过单因素方差分析(one-way ANOVA)，初步分析细胞比生产率、相对增强作用以及相对IgG浓度的显著性。通过Student t检验比较各处理，以确定显著性水平(p-值)。显著性水平显示为星号。一个星号对应于p-值≤0.05，二个星号对应于p-值≤0.01，三个星号对应于p-值≤0.001。

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-Zilberman,Y.等人,J.Cell Sci.122(2009)3531-3541.

Claims

1.使用真核细胞重组产生多肽的方法，包括步骤：

-在培养用培养基中培养包含编码所述多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含选自由反-2-甲基2-戊烯酸、广谱HDAC抑制剂Quisinostat和亚型特异性HDAC抑制剂罗米地辛组成的组中的化合物，和

-从所述经培养的真核细胞或所述培养用培养基回收多肽，并且由此使用真核细胞产生多肽。

2.使用真核细胞重组产生多肽的方法，包括步骤：

-在培养用培养基中培养包含编码所述多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养用培养基包含第一和第二化合物，其中所述第一和第二化合物是选自由反-2-甲基2-戊烯酸、亚型特异性HDAC抑制剂和典型和非典型NFκB激活物组成的组中的化合物，和

3.根据权利要求2所述的方法，其中典型NFκB激活物选自由TNFα、IL-1R/TLR的配体、脂多糖和IL-1b组成的组中的化合物。

4.根据权利要求2所述的方法，其中非典型NFκB激活物选自由EGF、PMA和白桦脂酸组成的组中的化合物。

5.根据权利要求3所述的方法，其中非典型NFκB激活物选自由EGF、PMA和白桦脂酸组成的组中的化合物。

6.根据权利要求2所述的方法，其中亚型特异性HDAC抑制剂是HDAC-1和/或HDAC-2和/或HDAC-3抑制剂。

7.根据权利要求3所述的方法，其中亚型特异性HDAC抑制剂是HDAC-1和/或HDAC-2和/或HDAC-3抑制剂。

8.根据权利要求4所述的方法，其中亚型特异性HDAC抑制剂是HDAC-1和/或HDAC-2和/或HDAC-3抑制剂。

9.根据权利要求5所述的方法，其中亚型特异性HDAC抑制剂是HDAC-1和/或HDAC-2和/或HDAC-3抑制剂。

10.根据权利要求2所述的方法，其中亚型特异性HDAC抑制剂选自由庚二酸二苯酰胺106、Apicidin和罗米地辛组成的组中的化合物。

11.根据权利要求3所述的方法，其中亚型特异性HDAC抑制剂选自由庚二酸二苯酰胺106、Apicidin和罗米地辛组成的组中的化合物。

12.根据权利要求4所述的方法，其中亚型特异性HDAC抑制剂选自由庚二酸二苯酰胺106、Apicidin和罗米地辛组成的组中的化合物。

13.根据权利要求5所述的方法，其中亚型特异性HDAC抑制剂选自由庚二酸二苯酰胺106、Apicidin和罗米地辛组成的组中的化合物。

14.根据权利要求2所述的方法，其中第一化合物是反-2-甲基2-戊烯酸并且第二化合物是鞭毛蛋白。

15.根据权利要求2所述的方法，其中第一化合物是反-2-甲基2-戊烯酸并且第二化合物是Quisinostat。

16.根据权利要求2所述的方法，其中第一化合物是罗米地辛并且第二化合物是反-2-甲基2-戊烯酸或鞭毛蛋白。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中将权利要求1所述的化合物或权利要求2至16中任一项所述的第一化合物在转染细胞后一小时至五小时添加。

18.根据权利要求17所述的方法，其中将权利要求1所述的化合物或权利要求2至16中任一项所述的第一化合物在转染细胞后三小时添加至培养物。

19.根据权利要求17所述的方法，其中第二化合物在转染细胞后二十一小时至三十小时添加至培养物。

20.根据权利要求18所述的方法，其中第二化合物在转染细胞后二十一小时至三十小时添加至培养物。

21.根据权利要求19所述的方法，其中将第二化合物在转染细胞后二十四至二十七小时添加至培养物。

22.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在培养用培养基中添加反-2-甲基2-戊烯酸至6-7mM的终浓度。

23.根据权利要求17所述的方法，其中在培养用培养基中添加反-2-甲基2-戊烯酸至6-7mM的终浓度。

24.根据权利要求18所述的方法，其中在培养用培养基中添加反-2-甲基2-戊烯酸至6-7mM的终浓度。

25.根据权利要求19所述的方法，其中在培养用培养基中添加反-2-甲基2-戊烯酸至6-7mM的终浓度。

26.根据权利要求20所述的方法，其中在培养用培养基中添加反-2-甲基2-戊烯酸至6-7mM的终浓度。

27.根据权利要16所述的方法，其中添加鞭毛蛋白至终浓度2ng/mL并且添加罗米地辛至终浓度15nM。

28.根据权利要求14或16所述的方法，其中第一化合物在转染细胞后一小时至五小时添加。

29.根据权利要28所述的方法，其中添加鞭毛蛋白至终浓度2ng/mL并且添加罗米地辛至终浓度15nM。

30.根据权利要求14或16所述的方法，其中第一化合物在转染细胞后三小时添加至培养物。

31.根据权利要30所述的方法，其中添加鞭毛蛋白至终浓度2ng/mL并且添加罗米地辛至终浓度15nM。

32.根据权利要求14或16所述的方法，其中第一化合物在转染细胞后一小时至五小时添加，且第二化合物在转染细胞后二十一小时至三十小时添加至培养物。

33.根据权利要32所述的方法，其中添加鞭毛蛋白至终浓度2ng/mL并且添加罗米地辛至终浓度15nM。

34.根据权利要求14或16所述的方法，其中第一化合物在转染细胞后三小时添加至培养物，且第二化合物在转染细胞后二十一小时至三十小时添加至培养物。

35.根据权利要34所述的方法，其中添加鞭毛蛋白至终浓度2ng/mL并且添加罗米地辛至终浓度15nM。

36.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中多肽是抗体。

37.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中真核细胞是CHO细胞或HEK细胞。