CN1589135A - Bcl-2族蛋白的小分子拮抗剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及Bcl-族蛋白的天然和化学合成的小分子拮抗剂。本发明特别提供了棉酚衍生物和尤其在过表达Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2和/或Bcl-XL)的癌细胞中将棉酚衍生物用作Bcl-2和Bcl-XL蛋白抗编程性细胞死亡作用拮抗剂的方法。
Description
本申请要求2001年5月30日提交的美国临时专利申请顺序号60/293,983的优先权。
发明领域
本发明涉及Bcl-族蛋白的天然出现和化学合成的小分子拮抗剂。本发明特别提供了棉酚衍生物和尤其在过表达Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2和/或Bcl-XL)的癌细胞中将棉酚衍生物用作Bcl-2和Bcl-XL蛋白抗编程性细胞死亡作用拮抗剂的方法。
发明背景
多细胞生物体利用所谓的编程性细胞死亡过程启动受损伤或不需要的细胞破坏自身以利于生物体。控制编程性细胞死亡过程对生物体的正常发育而言是极为重要的,例如,胎儿的手指和足趾的发育要求通过编程性细胞死亡受控除去过度互连的组织。同样,大脑内神经突触正确形成也需如此。类似地,受控的编程性细胞死亡导致月经开始时子宫的内层(子宫内膜)脱落。
编程性细胞死亡不仅在发育和正常细胞维持中的组织塑造(sculpting)中起重要作用,而且还对使整个生物体的健康受到威胁的细胞起到初步防御作用。例如,在细胞介导的免疫反应中,效应细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞″CTLs″)通过诱导感染细胞发生编程性细胞死亡而破坏受病毒感染的细胞。生物体随后在不再需要时依赖于编程性细胞死亡过程来破坏效应细胞。由诱导彼此乃至自身的编程性细胞死亡的CTLs避免了自身免疫。该过程的缺陷与诸如红斑狼疮和类风湿性关节炎这样的各种自身免疫病有关。
多细胞生物体在发生癌变前利用编程性细胞死亡过程来启动带有受损核酸(例如DNA)的细胞破坏自身。然而,某些导致癌症的病毒能阻止已被它们转化的细胞发生编程性细胞死亡。例如,两种人乳头瘤病毒(HPV)通过产生可使p53编程性细胞死亡启动子失活的蛋白质(E6)而阻止以编程性细胞死亡方式除去转化细胞,从而导致了宫颈癌。单核细胞增多症和伯基特淋巴瘤(一种B淋巴细胞实体瘤)的病原体EB病毒(EBV)产生与Bcl-2类似的蛋白质和另一种使转化细胞中Bcl-2产生增加的蛋白质。这两种机制均使得被EB病毒转化的细胞耐受编程性细胞死亡,由此使癌细胞增殖并蔓延至整个生物体内。
某些因非病毒方式产生的癌症还发生了逃避编程性细胞死亡所致破坏的机制。例如,黑素瘤细胞通过抑制编码Apaf-1的基因表达而避免了编程性细胞死亡。其它癌细胞、尤其是肺癌和结肠癌细胞,分泌升高水平的可与FasL结合的可溶性诱饵分子,从而抑制它与Fas结合。由此阻止CTLs破坏这些癌细胞。其它癌细胞表达高水平的FasL,从而再次避免了CTLs的破坏。另有一些病毒操纵细胞的编程性细胞死亡机制而不直接导致癌症发生。例如,认为感染了人免疫缺陷病毒(HIV)的个体内免疫系统的破坏因被感染的CD4+T细胞(100,000个中约有1个)启动其姐妹细胞发生编程性细胞死亡而发展。
对编程性细胞死亡机制的错误调节还涉及各种变性疾病和血管疾病。
显然编程性细胞死亡过程和编程性细胞死亡机制的受控调节对多细胞生物体的存活而言是至关重要的。一般来说,被启动经历编程性细胞死亡的细胞中出现的生化改变以有序方式发生。然而,如上所述,对编程性细胞死亡过程和编程性细胞死亡机制的错误调节可以使生物体中产生严重的有害作用和疾病。
已经进行了各种尝试来控制和恢复对异常细胞(例如癌细胞)中的编程性细胞死亡机制的调节。一般来说,这些尝试作为用于下面的疾病的疗法只取得了有限的成功,所述疾病的特征在于因许多原因而对编程性细胞死亡机制的错误调节,诸如毒性、失效、高成本等。所需的是调节患有特征在于对编程性细胞死亡错误调节的疾病和疾患的受治疗者体内编程性细胞死亡的改进的组合物和方法。
发明概述
本发明涉及Bcl-族蛋白的天然出现和化学合成的小分子拮抗剂。本发明特别提供了棉酚衍生物和尤其在过表达Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2和/或Bcl-XL)的癌细胞中将棉酚衍生物用作Bcl-2和Bcl-XL蛋白抗编程性细胞死亡作用拮抗剂的方法。
Bcl-2是蛋白质家族的基本成员,首先是作为癌基因产物分离的。Bcl-2族蛋白目前包括抗编程性细胞死亡分子(诸如Bcl-2)和Bcl-XL以及前编程性细胞死亡分子(诸如Bax、Bak、Bid和Bad)。认为Bcl-2和Bcl-XL是Bcl-2族介导的编程性细胞死亡的重要调节物。
在优选的实施方案中,给予棉酚化合物可以提供对肿瘤疾患和涉及细胞异常过度增生(例如肿瘤细胞)的其它疾病的有效治疗。
在其它优选的实施方案中,本发明提供了治疗或预防受治疗者内癌症的方法,该方法包括对受治疗者给予有效抑制Bcl-2和/或Bcl-XL的用量的棉酚化合物(或其类似物)的步骤,由此增加对肿瘤的抑制和/或诱导编程性细胞死亡。优选将棉酚化合物或其类似物与肿瘤细胞编程性细胞死亡促进剂(例如香叶基香叶醇[3,7,11,15-四甲基-2,6,10,14-十六碳三烯(hexadecatraen)-1-醇])联合给药。本发明注意到增加肿瘤的编程性细胞死亡可以恢复与Bcl-2和/或Bcl-XL表达的基础水平相关的正常编程性细胞死亡控制。
本发明的方法特别适合于治疗特征在于Bcl-2族蛋白、包括但不限于Bcl-2和/或Bcl-XL过表达的癌症。
在其它优选的实施方案中,本发明的方法提供了对许多疾病的治疗,所述的疾病包括、但不限于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑素瘤、卵巢癌、脑癌、头颈癌、肝癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、神经母细胞瘤和成胶质细胞瘤以及T和B细胞介导的自身免疫病等。
在其它优选的实施方案中,本发明的方法包括对患有特征在于Bcl-2族蛋白过表达的疾病的患者给予有效量的棉酚酮。
在一个优选的实施方案中,本发明提供了调节细胞中的编程性细胞死亡的方法,该方法包括下列步骤:提供:细胞,其中所述的细胞过表达Bcl-2族蛋白;棉酚化合物;和在使所述细胞中的编程性细胞死亡得到调节的条件下用有效量的所述棉酚化合物处理所述的细胞。
本发明的方法并非限于任意具体棉酚化合物的给药方法。实际上,本发明包括许多棉酚对映体、代谢物、衍生物和药学上可接受的盐以及这些化合物的席夫碱的给药方法。例如适用于本发明的棉酚化合物包括、但不限于:(±)-棉酚;(-)-棉酚;(+)-棉酚;(±)-棉酚酮((±)-gossypolone);(-)-棉酚酮;(+)-棉酚酮;(±)-棉酚乙酸;(-)-棉酚乙酸;(+)-棉酚乙酸;(±)-乙基棉酚((±)-ethyl gossypol);(-)-乙基棉酚;(+)-乙基棉酚;(±)-半棉酚酮((±)-hemigossypolone);(-)-半棉酚酮;(+)-半棉酚酮;(±)-棉酚的席夫碱;(-)-棉酚的席夫碱;(+)-棉酚的席夫碱;(±)-棉酚酮的席夫碱;(-)-棉酚酮的席夫碱;(+)-棉酚酮的席夫碱;(±)-棉酚乙酸的席夫碱;(-)-棉酚乙酸的席夫碱;(+)-棉酚乙酸的席夫碱;(±)-乙基棉酚的席夫碱;(-)-乙基棉酚的席夫碱;(+)-乙基棉酚的席夫碱;(±)-半棉酚酮的席夫碱;(-)-半棉酚酮的席夫碱;和(+)-半棉酚酮的席夫碱等。
在优选的实施方案中,本发明提供了对患有特征在于Bcl-2族蛋白过表达的疾病的患者给予(-)-棉酚对映体的方法。在一些实施方案中,涉及的Bcl-2族蛋白包括、但不限于Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Al/BFL-1和BOO-DIVA、Bcl-w、Bcl-6、Bcl-8和Bcl-y等。在某些其它实施方案中,Bcl-2族蛋白具有前编程性细胞死亡活性。在其它实施方案中,Bcl-2族蛋白具有抗编程性细胞死亡活性。
在某些实施方案中,使用本发明的方法和组合物治疗患病的细胞和组织。在这方面,有多种疾病适合于使用本发明方法和组合物治疗或预防。这些疾病的非限制性实例包括:乳腺癌;前列腺癌;肺癌;淋巴瘤;皮肤癌;胰腺癌;结肠癌;黑素瘤;卵巢癌;脑癌;头颈癌;肝癌;膀胱癌;非小细胞肺癌;宫颈癌;白血病;神经母细胞瘤和成胶质细胞瘤;T和B细胞介导的自身免疫病;炎症疾病;感染;过度增生性疾病;AIDS;变性疾病;和血管疾病等。在某些实施方案中,所治疗的癌细胞是转移型的。
在某些实施方案中,适合于用本发明组合物和方法治疗的感染包括、但不限于由病毒、细菌、真菌、支原体等导致的感染。不过,本发明并非限于治疗任意具体的感染或感染因子。
在一个优选的实施方案中,本发明提供了调节组织中的细胞分裂的方法,该方法包括下列步骤:提供:组织,其中所述的组织过表达Bcl-2蛋白;棉酚化合物;抗癌药;和在使细胞分裂得到调节的条件下用有效量的棉酚化合物和所述的抗癌药处理所述的组织。在这些实施方案中的某些中,本发明涉及棉酚化合物与Bcl-2族蛋白结合而由此调节细胞分裂。
在另一个实施方案中,本发明提供了治疗受治疗者(例如患者)的方法,该方法包括对过表达Bcl-2族蛋白的受治疗者给予棉酚化合物。在这些实施方案的优选实例中,所述的棉酚化合物可与Bcl-2族蛋白结合。
本发明的某些实施方案涉及提供治疗受治疗者的方法,该方法包括对过表达Bcl-2族蛋白的受治疗者给予棉酚化合物和抗癌药的步骤。
有许多合适的抗癌药可用于本发明方法。实际上,本发明涵盖、但不限于大量抗癌药的给药,所述的抗癌药诸如有:诱导编程性细胞死亡的活性剂;多核苷酸(例如核酶);多肽(例如酶);药物;生物模拟物;生物碱;烷基化试剂;抗肿瘤抗生素;抗代谢物;激素;铂化合物;与抗癌药、毒素和/或放射性核素缀合的单克隆抗体;生物反应调节物(例如干扰素[例如IFN-α等]和白细胞介素[例如IL-2等]等);过继免疫治疗剂;造血生长因子;诱导肿瘤细胞分化的活性剂(例如全反式-视黄酸等);基因疗法试剂;反义疗法试剂和核苷酸;肿瘤疫苗;和血管发生抑制剂等。适合于与所公开的棉酚化合物一起共同给予的大量化疗化合物和抗癌疗法的实例是本领域技术人员所公知的。
在优选的实施方案中,抗癌药包括诱导或刺激编程性细胞死亡的活性剂。诱导编程性细胞死亡的活性剂包括、但不限于:照射(例如UV);激酶抑制剂(例如表皮生长因子受体[EGFR]激酶抑制剂、血管生长因子受体[VGFR]激酶抑制剂、成纤维细胞生长因子受体[FGFR]激酶抑制剂、血小板衍生生长因子受体[PGFR]激酶抑制剂以及诸如STI-571、Gleevec(甲磺酸伊马替尼)和Glivec(甲磺酸伊马替尼)这样的Bcr-Abl激酶抑制剂]);反义分子;抗体[例如曲妥单抗和Rituxan];抗雌激素[例如雷洛昔芬和他莫昔芬];抗雄激素[例如氟他胺、比卡鲁胺、非那雄胺、氨鲁米特(aminoglutethamide)、酮康唑和皮质类固醇];环加氧酶2(COX-2)抑制剂[例如塞来考昔、美洛昔康、NS-398和非甾类消炎药(NSAIDs)];和癌症化疗药[例如伊立替康(盐酸伊立替康和山梨醇注射剂)、CPT-11、氟达拉滨(Fludara)、达卡巴嗪(DTIC)、地塞米松、米托蒽醌、Mylotarg、VP-16、顺铂、5-FU、阿霉素(Doxrubicin)、泰索帝或紫杉醇];细胞信号传导分子;神经酰胺和细胞因子;以及星孢素等。
在其它实施方案中,本发明提供了治疗受治疗者癌症的方法,该方法包括对患有特征在于Bcl-2族蛋白过表达的疾病的患者给予有效量的棉酚化合物。
其它实施方案涉及治疗受治疗者癌症的方法,该方法包括对患有癌症的受治疗者给予有效量的棉酚化合物和抗癌药,其中所述的癌症的特征在于Bcl-2族蛋白过表达。
其它方法涉及治疗受治疗者癌症的方法,该方法包括下列步骤:对患有癌症的患者给予有效量的棉酚化合物,其中所述癌症的特征在于耐受癌症疗法(例如化学抗性、辐射抗性、激素抗性等)。
在某些实施方案中,本发明提供了治疗受治疗者癌症的方法,该方法包括对患有癌症的患者给予足以抑制Bcl-2蛋白活性和/或减少Bcl-2族蛋白过表达的剂量的棉酚化合物,其中所述的癌症的特征在于Bcl-2族蛋白过表达。
在本发明的某些实施方案中描述了治疗受治疗者癌症的方法,该方法包括对患有癌症的患者给予足以减少Bcl-2族蛋白过表达的剂量的棉酚化合物和抗癌药,其中所述的癌症的特征在于Bcl-2族蛋白过表达。
在其它实施方案中,本发明提供了治疗受治疗者癌症的方法,该方法包括对患有癌症的患者给予足以抑制Bcl-2族蛋白活性和/或减少所述Bcl-2族蛋白过表达的剂量的棉酚化合物,其中所述的癌症的特征在于Bcl-2族蛋白过表达。
在其它实施方案中,本发明提供了治疗受治疗者癌症的方法,该方法包括对患有癌症的患者给予足以抑制Bcl-2族蛋白活性和/或减少所述Bcl-2族蛋白过表达的剂量的棉酚化合物和抗癌药,其中所述的癌症的特征在于Bcl-2族蛋白过表达。
本发明的某些其它实施方案提供了药物组合物,该药物组合物包含棉酚化合物和用于对受治疗者给予所述棉酚化合物的说明书,所述受治疗者的特征在于Bcl-2族蛋白过表达。
本发明的其它实施方案提供了药物组合物,该药物组合物包括棉酚化合物和用于对受治疗者给予所述棉酚化合物的说明书,所述受治疗者的特征在于对癌症疗法有抗性。在优选的实施方案中,这些试剂盒中包括的说明书满足美国食品与药品管理章程、条例和治疗用化合物条款建义。
在另一个实施方案中,本发明提供了棉酚化合物和测试化合物的筛选方法,该方法包括下列步骤:提供:棉酚化合物;测试化合物;第一组细胞;和使所述的第一组细胞与所述的棉酚化合物和所述的测试化合物接触;并观察第一组细胞与棉酚化合物和测试化合物接触的作用。在这些实施方案中的某些中,本发明进一步提供了附加步骤:将在第一组细胞中观察到的作用与仅接触所述棉酚化合物或仅接触所述测试化合物的第二组细胞的作用进行比较。可以观察的作用包括、但不限于细胞增殖的改变、编程性细胞死亡状态改变(stats)和Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2和/或Bcl-XL)的表达改变等。在其它实施方案中,本发明进一步涉及通过上述方法筛选/鉴定到的测试化合物的其它销售方法。在这些实施方案中的某些中,可以由第三方以一种或多种形式(例如试剂盒,包括用于对患者给予所述测试化合物的说明书)对测试化合物许诺销售。
本发明的其它优点、有益之处和优选的实施方案对本领域技术人员而言是显而易见的。
附图描述
下面的附图构成了本说明书的组成部分,并且一并用来进一步证实本发明的某些方面和实施方案。然而,本发明并非限于这些附图中具体描述的实施方案。
附图1表示Bcl-2(SEQ ID NO:1)和Bcl-XL(SEQ ID NO:2)的序列对比。
附图2表示与Bak BH3肽复合的Bcl-2总体结构的带状结构示意图。
附图3表示棉酚对Bak BH3肽与Bcl-2(Bcl-XL)之间的结合的直接抑制。
附图4表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图5A表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图5B表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图6表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图7表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图8A表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图8B表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图9表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图10提供了棉酚、棉酚酮、和棉酚与棉酚酮席夫碱的化学结构。
本发明一个实施方案中基于细胞的试验结果。
附图11表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图12表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图13表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图14表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图15A表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图15B表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图16表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
附图17表示本发明一个实施方案中的结合试验结果。
定义
为了有利于理解本发明,下面定义了许多术语和惯用语。
本文所用的术语″棉酚化合物″指的是棉酚分子的对映体、衍生物、代谢物、席夫碱和药学上可接受的盐。因此,棉酚化合物包括、但不限于:(±)-棉酚;(-)-棉酚;(+)-棉酚;(±)-棉酚酮;(-)-棉酚酮;(+)-棉酚酮;(±)-棉酚乙酸;(-)-棉酚乙酸;(+)-棉酚乙酸;(±)-乙基棉酚;(-)-乙基棉酚;(+)-乙基棉酚;(±)-半棉酚酮;(-)-半棉酚酮;(+)-半棉酚酮;(±)-棉酚的席夫碱;(-)-棉酚的席夫碱;(+)-棉酚的席夫碱;(±)-棉酚酮的席夫碱;(-)-棉酚酮的席夫碱;(+)-棉酚酮的席夫碱;(±)-棉酚乙酸的席夫碱;(-)-棉酚乙酸的席夫碱;(+)-棉酚乙酸的席夫碱;(±)-乙基棉酚的席夫碱;(-)-乙基棉酚的席夫碱;(+)-乙基棉酚的席夫碱;(±)-半棉酚酮的席夫碱;(-)-半棉酚酮的席夫碱;和(+)-半棉酚酮的席夫碱等。
本文所用的术语″Bcl-2族蛋白″指的是:Bcl-2族中抗编程性细胞死亡的成员,包括、但不限于Bcl-2、Bcl-XL,、Mcl-1、Al/BFL-1和BOO-DIVA、Bcl-w、Bcl-6、Bcl-8和Bcl-y;和Bcl-2族中前编程性细胞死亡成员,包括、但不限于Bak、Bax、Bad、tBid、Harakiri、Bim、Bmf;以及含有由棉酚化合物调节的蛋白质的BH3(Bcl-2同源物3)其它成员。
本文所用的术语″Bcl-2过表达″或″Bcl-2族蛋白过表达″指的是与表达基础水平的Bcl-2族蛋白编码mRNA或具有基础水平的Bcl-2族蛋白的相应的正常类似非病理性细胞和组织相比,细胞或组织中编码Bcl-2族蛋白的mRNA水平升高(例如异常)和/或Bcl-2族蛋白水平升高。细胞或组织中编码Bcl-2族蛋白的mRNAs水平或Bcl-2族蛋白水平的检测方法包括、但不限于免疫组织化学法和核酸扩增法。
本文所用的术语″抗癌药″或″常用抗癌药″指的是癌症治疗中所用的任意化疗化合物、放疗或外科手术。
本文所用的术语″体外″指的是人工环境和人工环境内发生的过程或反应。体外环境可以由试管和细胞培养物组成,但不限于此。术语″体内″指的是天然环境(例如动物或细胞)和天然环境内发生的过程或反应。
本文所用的术语″宿主细胞″指的是位于体外或体内的任意真核细胞或原核细胞(例如哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)。
本文所用的术语″细胞培养物″指的是细胞的任意体外培养物。该术语中包括连续的细胞系(例如具有永生化表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如未转化的细胞)和包括卵母细胞和胚胎在内的体外维持的任意其它细胞群。
本文所用的术语″受治疗者″指的是用本发明方法治疗的生物体。这类生物体包括、但不限于人。在本发明的上下文中,术语″受治疗者″一般指的是因患有特征在于Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2、Bcl-XL,、Mcl-1、Al/BFL-1和Boo)过表达的疾病而接受或已经接受治疗(例如给予棉酚化合物和任选的一种或多种抗癌药)的个体。
本文所用的术语″诊断″指的是根据疾病的征兆和症状(例如耐常规癌症疗法)或遗传分析、病理分析、组织学分析等识别疾病。
本文所用的术语″竞争性结合″用以指第一分子(例如棉酚化合物)具有结合相同底物(例如Bcl-2和/或Bcl-XL)的活性,如同第二分子(例如前编程性细胞死亡Bcl-2族蛋白,诸如Bax、Bak、Bid和Bad等)一样。第一分子的结合功效(例如动力学或热力学)与第二分子的底物结合功效相同,或大于其功效,或小于其功效。例如结合所述底物的平衡结合常数(KD)对两种分子而言可以不同。
本文所用的术语″反义″用以指与特定RNA序列(例如mRNA)互补的RNA序列。该定义中包括细菌基因调节中涉及的反义RNA(″asRNA″)分子。反义RNA可以通过任意方法产生,包括以反义方向使目的基因与允许编码链合成的病毒启动子相剪接进行的合成。例如,一旦将被转录链导入胚胎,那么该转录链则与胚胎产生的天然mRNA合并而形成双链体。这些双链体将阻断mRNA的进一步转录或阻断其翻译。按照这种方式可以产生突变体表型。术语″反义链″用以指与″有义″链互补的核酸链。命名为(-)(即″负″)有时指反义链,而命名为(+)有时用于指有义(即″正″)链。可以使用可得到的计算分析方法测定反义分子可介入的核酸序列区。
本文所用的术语″样品″以广义理解。怀疑表现出特征在于Bcl-2族蛋白过表达的疾病的样品可以包括细胞、组织或体液、分离自细胞的染色体(例如展开的中期染色体)、基因组DNA(溶液形式或与固体支持物结合,诸如用于DNA印迹分析)、RNA(溶液形式或与固体支持物结合,诸如用于RNA印迹分析)、cDNA(溶液形式或与固体支持物结合)等。怀疑含有蛋白质的样品可以包括含有一种或多种蛋白质的细胞、组织部分、提取物等。
本文所用的术语″纯化的″或″纯化″指的是从样品中除去不需要的成分。本文所用的术语″基本上纯化的″指的是从天然环境中取出的分离或隔开的核酸或氨基酸序列分子,其中至少60%不含、优选75%不含且最优选90%不含它们天然相关的其它成分。例如″分离的多核苷酸″是基本上纯化的多核苷酸。
本文所用的术语″基因组″指的是生物体或宿主细胞的遗传物质(例如染色体)。
术语″目的核苷酸序列″指的是任意核苷酸序列(例如RNA或DNA),本领域技术人员可以认为是因任何原因其操作所需要的(例如治疗疾病、提供改善的质量等)。这类核苷酸序列包括、但不限于结构基因(例如报道基因、选择标记基因、癌基因、药物抗性基因、生长因子等)的编码序列或其部分,和不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调节序列(例如启动子序列、聚腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)。
本文所用的″核酸序列″和″核苷酸序列″指的是寡核苷酸或多核苷酸及其片段或部分,以及单链或双链形式的基因组或合成来源的DNA或RNA,可代表有义链或反义链。本文所用的术语″编码……的核酸分子″、″编码……的DNA序列″、″编码……的DNA″、″编码……的RNA序列″和″编码……的RNA″指的是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸沿脱氧核糖核酸或核糖核酸链排列的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的排列顺序决定沿翻译自mRNA的多肽(蛋白质)链的氨基酸排列顺序。因此DNA或RNA序列编码氨基酸序列。
术语″基因″指的是包括产生多肽或前体(例如胰岛素原)必需的编码序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。多肽可以由全长编码序列或由该编码序列的任意部分编码,只要保持全长或片段的所需活性或功能特性(例如酶活性、配体结合、信号转导等)即可。该术语还包括结构基因的编码区,包括位于编码区附近、距离5’和3’末端约1kb或1kb以上的序列,使得所述基因相当于全长mRNA的长度。位于所述编码区5’侧且存在于mRNA上的序列称作5’非翻译序列。位于该编码区3’侧或下游、且存在于mRNA上的序列称作3’非翻译序列。术语″基因″包括cDNA和基因的基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有被称作″内含子″或″间插区″或″间插序列″的非编码序列打断的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因区段;内含子可以含有诸如增强子这样的调节元件。从核或初级转录物中除去或″剪接出″内含子;因此内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。mRNA在翻译过程中确定新生多肽上氨基酸序列或顺序的作用。
本文所用的术语″外源性基因″指的是并非天然存在于宿主生物体或细胞中或以人工方式导入宿主生物体或细胞的基因。
本文所用的术语″载体″指的是诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒等这些在与适当控制元件结合时能够复制且可以在细胞之间转移基因序列的任意遗传元件。因此,该术语包括克隆载体和表达载体以及病毒载体。
本文所用的术语″基因表达″指的是通过基因的″转录″(即通过RNA聚合酶的酶作用)使基因中编码的遗传信息转化成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)的过程,对蛋白质编码基因而言,还包括通过mRNA的″翻译″转化成蛋白质的过程。基因表达可以在该过程的许多阶段得到调节。″上调″或″活化″指的是增加基因表达产物(即RNA或蛋白质)产生的调节,而″下调″或″阻抑″指的是减少产生的调节。上调或下调中涉及的分子(例如转录因子)通常分别称作″激活物″和″阻抑物″。
本文所用的术语″编码……的核酸分子″、″编码……的DNA序列″、″编码……的DNA″、″编码……的RNA序列″和″编码……的RNA″指的是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸沿脱氧核糖核酸或核糖核酸链排列的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的排列顺序决定翻译自mRNA的多肽(蛋白质)链上氨基酸的排列顺序。因此所述的DNA或RNA序列编码所述的氨基酸序列。
术语″同源性″和″同一性百分比″在涉及核酸时指的是互补性的程度。可以存在部分同源性(即部分同一性)或完全同源性(即完全同一性)。部分互补序列是至少部分抑制完全互补的序列与靶核酸序列杂交的序列,以功能性术语″基本同源″表示。可以使用杂交试验(DNA印迹或RNA印迹、溶液杂交等)在低严格条件下检验对完全互补的序列与靶序列相杂交的抑制。基本同源的序列或探针(即能够与另一目的寡核苷酸杂交的寡核苷酸)在低严格条件下能竞争并抑制完全同源的序列与靶序列的结合(即杂交)。这并不是说低严格条件允许非特异性结合;低严格条件要求两种序列彼此间的结合是特异性(即选择性)的相互作用。通过使用甚至缺乏部分互补性程度(例如低于约30%同一性)的第二靶物可检测是否缺乏非特异性结合;在没有非特异性结合存在的情况下,所述探针不与第二种非互补靶物杂交。
本文所用的术语″严格″用以指进行核酸杂交的条件,包括温度、离子强度和诸如有机溶剂这样的其它化合物的存在情况。在″高严格″条件下,核酸碱基配对仅在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间发生。因此,″弱″或″低″严格条件通常是来自遗传上不同的生物体的核酸序列所需要的,因为其中互补序列频率通常较低。尽管可以使用低严格条件实施本发明,但是在优选的实施方案中,一般使用中等至高严格条件。
″高严格条件″用于核酸杂交时指的是包括相当于下述的条件:在42℃(例如过夜)下在由5X SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA,用NaOH将pH调节至7.4)、0.5%SDS、5X Denhardt试剂[每500ml 50X Denhardt试剂含有5g Ficoll(Type 400,Pharamcia)、5g BSA(级分V;Sigma)]、100μg/ml变性鲑精DNA和50%(V/V)甲酰胺组成的溶液中结合或杂交。然后在室温下用包含2XSSPE、0.1%SDS的溶液将杂交的DNA样品洗涤两次,随后,当使用约500个核苷酸长度的探针时,在42℃下在0.1X SSPE、1.0%SDS中洗涤两次。本领域中已知在高严格条件下促进杂交的条件(例如升高杂交和/或洗涤步骤的温度、在杂交溶液中使用甲酰胺等)。
″中等的严格条件″在用于核酸杂交时指的是包括与下述相当的条件:在42℃下,在由5X SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA,用NaOH将pH调节至7.4)、0.5%SDS、5X Denhardt试剂[每500ml 50X Denhardt试剂含有5g Ficoll(Type 400,Pharamcia)、5g BSA(级分V;Sigma)]、100μg/ml变性鲑精DNA和50%(V/V)甲酰胺组成的溶液中进行结合或杂交;然后在室温下用包括1.0X SSPE、1.0%SDS的溶液洗涤,随后,当使用约500个核苷酸长度的探针时,在42℃下用2X SSPE、0.1%SDS洗涤。
″低严格条件″包括与下述相当的条件:在42℃下在由5X SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4 H2O和1.85g/l EDTA,用NaOH将pH调节至7.4)、0.1%SDS、5X Denhardt试剂[每500ml 50XDenhardt试剂含有5g Ficoll(Type 400,Pharamcia)、5g BSA(级分V;Sigma)]、100g/ml变性鲑精DNA和50%(V/V)甲酰胺组成的溶液中进行结合或杂交;然后,当使用约500个核苷酸长度的探针时,在42℃下用包含5X SSPE、0.1%SDS的溶液洗涤。此外,本领域中已知可以使用许多包括低严格条件的等同条件;可考虑的因素有诸如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)以及靶物(存在于溶液中或固定化的DNA、RNA、碱基组成等)性质,以及盐和其它成分(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在与否)的浓度,可以改变杂交溶液而产生不同于、上述条件、但与之相当的低严格杂交条件。
术语″基本上同源″在用以指单链核酸序列时指的是可以在如上所述的低严格条件下与单链核酸序列杂交的任意探针(即它是单链核酸序列的互补体)。基因可以产生多种RNA种类,它们是通过对初级RNA转录物进行差别剪接而生成的。相同基因的剪接变体cDNAs将含有具有序列同一性或完全同源性的区(代表两cDNAs上均存在相同外显子或相同外显子的部分)和完全非同一性的区(例如代表cDNA 1上存在外显子″A″,而cDNA 2含有外显子″B″)。因为这两种cDNA均含有具有序列同一性的区,所以它们均可与来源于完整基因或含有在两cDNA上均存在的序列的基因部分的探针杂交;因此两种剪接变体与这类探针基本上同源且彼此同源。本发明并非限于杂交仅在完全同源序列之间发生的情况。在某些实施方案中,杂交在基本上同源的序列之间发生。
本文所用的术语″目的蛋白质″指的是由目的核酸编码的蛋白质。
本文所用的术语″天然″(或野生型)在用以指蛋白质时,指的是由部分同源核酸编码的蛋白质,使得该蛋白质的氨基酸序列发生变化。本文所用的术语″变体″包括由具有不会导致蛋白质功能发生改变的保守和非保守氨基酸取代的同源基因编码的蛋白质,以及由具有导致蛋白质功能下降(例如无效突变)或蛋白质功能提高的氨基酸取代的同源基因编码的蛋白质。
本文所用的术语″反向RNA印迹″指的是通过在琼脂糖凝胶上对DNA进行电泳分析,以基于大小对该DNA进行分级分离,随后将分级分离的DNA从所述凝胶上转至诸如硝化纤维或尼龙膜这样的固体支持物上。然后用标记的寡核糖核苷酸探针或RNA探针探测固定化的DNA,以检测与所用所述核糖核酸探针互补的DNA种类。
本文所用的术语″病原体″指的是在宿主中导致疾病状态(例如感染、癌症等)的生物因子。″病原体″包括、但不限于病毒、细菌、古细菌(archaea)、真菌、原生动物、支原体和寄生虫生物体。
本文所用的术语″生物体″用以指任意种类或类型的微生物,包括但不限于细菌、古细菌(archaea)、真菌、原生动物、支原体和寄生虫生物体。本文所用的术语″真菌″用以指霉菌和酵母这样的真核生物体,包括两形真菌。
本文所用的术语″病毒″指的是微小感染病原体(有一些例外),使用光学显微镜无法观察到它们,它们缺乏独立的代谢,且仅能够在活宿主细胞中复制。单个颗粒(即病毒粒)由核酸和蛋白质壳或外壳组成;某些病毒粒还带有含有脂类的膜。术语″病毒″包括所有类型的病毒,包括动物、植物、噬菌体和其它病毒。
术语″细菌″指的是所有原核生物体,包括原核生物界中的所有门中的原核生物体。该术语还用以包括所有认为是细菌的微生物,包括支原体、衣原体、放线菌属、链霉菌属和立克次氏体。所有形式的细菌均包括在该定义中,包括球菌、杆菌、螺旋体、球形体、原生质体等。该术语中还包括属于革兰氏阴性或革兰氏阳性的原核生物体。″革兰氏阴性″和″革兰氏阳性″指的是使用本领域中众所周知的革兰氏染色方法的染色模式。(例如,参见Finegold和Martin,《诊断微生物学》(Diagnostic Microbiology),第6版,CV Mosby St.Louis,pp 13-15 1982)。″革兰氏阳性菌″是保持革兰氏染色中所用的主要染料的细菌,从而导致染色的细胞在显微镜下呈深蓝色至紫色。″革兰氏阴性菌″不会保持在革兰氏染色中所用的主要染料,但可被复染剂染色。因此,革兰氏阴性菌显红色。
本文所用的术语″抗原结合蛋白″指的是与特异抗原结合的蛋白质。″抗原结合蛋白″包括、但不限于免疫球蛋白,包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体以及人源化抗体、Fab片段、F(ab’)2片段和Fab表达文库。可将本领域中所公知的各种操作用于产生多克隆抗体。为了产生抗体,可以通过注射相当于所需表位的肽给各种宿主动物进行免疫接种,包括、但不限于家兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在优选的实施方案中,所述的肽与免疫原性载体(例如白喉类毒素、牛血清清蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白[KLH])缀合。随宿主种类的不同,可将各种佐剂用于增加免疫反应,包括、但不限于:弗氏(完全和不完全)佐剂;矿物凝胶,诸如氢氧化铝;表面活性物质,诸如溶血卵磷脂、伯洛沙姆类多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚;和可能有用的人佐剂,诸如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。
为了制备单克隆抗体,可以使用通过培养物中连续的细胞系产生抗体分子的任意技术(例如,参见Harlow和Lane,《抗体实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual),Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。它们包括、但不限于最初由Kohler和Milstein(Khler和Milstein,《自然》(Nature),256:495-497,1975)开发的杂交瘤技术以及三瘤(trioma)技术、人B-细胞杂交瘤技术(例如,参见Kozbor等《今日免疫学》(Immunol.Today),4:72[1983])和EBV-杂交瘤技术,以产生人单克隆抗体(Cole等在《单克隆抗体与癌症疗法》(Monoclonal Antibody and CancerTherapy),Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96[1985])。
按照本发明,对产生单链抗体所述的技术(U.S.4,946,778;引入本文作为参考)可以稍作调整以产生所需的特定单链抗体。本发明的其另一个实施方案使用了本领域中已知用于构建Fab表达文库的技术(Huse等《科学》(Science),246:1275-1281[1989]),以便快速和方便地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。
可以通过已知技术生产含有抗体分子的独特型(抗原结合区)的抗体片段。例如,这类片段包括、但不限于:可以通过对抗体分子的胃蛋白酶消化而产生的F(ab’)2片段;可以通过还原F(ab’)2片段的二硫键产生的Fab’片段;和可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段。
可以使用本领域中所公知的方法分离编码抗原结合蛋白的基因。在生产抗体的过程中,可以使用本领域中所公知的技术对所需抗体进行筛选(例如放射性免疫测定、ELISA酶联免疫吸附测定)、″夹心式″免疫测定、免疫放射分析、免疫扩散测定、凝胶扩散沉淀素反应、原位免疫测定(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集试验(例如凝胶凝集试验、血细胞凝集试验等)、补体结合测定、免疫荧光测定、蛋白质A测定和免疫电泳测定等。
本文所用的术语″用于对受治疗者给予所述棉酚化合物的说明书″包括试剂盒中包含的、用于治疗特征在于细胞或组织中Bcl-2族蛋白过表达的疾病的组合物的使用说明书。该术语还指试剂盒中包含的、用于治疗特征在于耐受至少一种常用抗癌疗法(例如化疗)的癌症的组合物的使用说明书。在某些实施方案中,所述的说明书进一步包括试剂盒中包含的下述遵循21 CFR§201的组合物推荐剂量或使用剂量的描述。涉及适用于本发明方法和组合物的标记和说明书要求的其它信息可以在U.S.FDA.的国际互联网页上找到。
术语″测试化合物″指的是可以用于治疗或预防疾病、病情、病患或身体功能紊乱,或者改变样品的生理或细胞状态(例如细胞中Bcl-2族蛋白水平)的任意化学实体、药物、药等。测试化合物包括已知和潜在的治疗化合物。可以通过使用本发明的筛选方法确定测试化合物是否具有治疗作用。″已知的治疗化合物″指的是已经证实(例如通过动物试验或对人体给药的前期实验)在这类治疗或预防中有效的治疗化合物。在优选的实施方案中,″测试化合物″是抗癌药。在特别优选的实施方案中,″测试化合物″是诱导细胞中编程性细胞死亡的抗癌药。
本文所用的术语″第三方″指的是参与为治疗特征在于Bcl-2族蛋白过表达而与棉酚化合物共同给予的测试化合物的销售、储存、分配或许诺销售的任何实体。
本文所用的术语″调节″指的是影响(例如促进或阻碍)包括、但不限于细胞生长、增殖、编程性细胞死亡等在内的细胞功能方面的化合物(例如棉酚化合物)的活性。
本发明的一般性描述
棉酚是来源于粗棉子油(棉属(Gossypium sp.))的天然双二酚类化合物。棉酚作为男性避孕药的人体试验已经证实了长期给予这些化合物的安全性。已经证实棉酚在人体内充分耐受,且在患有复发性神经胶质瘤密集预治疗的预后差的患者中具有低的、但可测定的反应率。
本发明提供了证实棉酚化合物显著抑制肿瘤生长、而在某些实施方案中棉酚化合物在与一种或多种常规抗癌药(例如多西他赛)联用(共同给药)时表现出甚至更强烈抑制肿瘤生长的体内数据。因此,在优选的实施方案中,对患有特征在于Bcl-2和/或Bcl-XL过表达的疾病(例如癌症)的患者给予棉酚化合物及其代谢物、对映体和衍生物。棉酚诱导表达高水平Bcl-2和/或Bcl-XL的癌细胞中的编程性细胞死亡,但棉酚对具有低水平Bcl-2和/或Bcl-XL表达的细胞几乎没有影响。
棉酚是已知的精子发生抑制剂,口服给药几乎没有副作用。然而,有些研究人员已经证实血钾过少可能是由于延长棉酚给药导致的。因此,在某些实施方案中,本发明的方法和组合物进一步包括对用棉酚化合物治疗的患者共同给予钾补充剂。
自从上个世纪八十年代以来,已经将棉酚作为抗癌治疗剂在体外和体内模型中进行了研究。然而,在本发明前,对棉酚抗癌的机理尚不了解。本发明中棉酚是Bcl-2和Bcl-XL的有效抑制剂这一发现表明,棉酚的抗肿瘤活性至少部分是由于对Bcl-2和Bcl-XL的抗编程性细胞死亡活性的抑制作用和随后诱导表达高水平Bcl-2族蛋白的癌细胞中的编程性细胞死亡所导致的。因此,本发明提供了靶向特征为过表达Bcl-2族蛋白的受治疗者的组合物和方法。
在迄今为止的临床试验中,棉酚已经在患者中表现出低毒性。在某些实施方案中,预计棉酚化合物为转移癌提供了有效的单一活性剂疗法。本发明进一步显示棉酚化合物代表了新类型的特异性拮抗Bcl-2和Bcl-XL的抗编程性细胞死亡作用的抗癌药。
Bcl-2是包括抗编程性细胞死亡分子(例如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Al/BFL-1和BOO-DIVA、Bcl-w,、Bcl-6、Bcl-8和Bcl-y等)和前编程性细胞死亡分子(例如Bax、Bak、Bid、和Bad等)的蛋白质家族的基本成员。Bcl-2基因是位于第18条染色体上的人原癌基因。Bcl-2基因作为易位基因座在B-细胞白血病中发现。还在某些B-细胞淋巴瘤中发现了这种易位。在癌性B细胞中,第18条染色体上含有Bcl-2基因座的部分与第14条染色体上含有抗体重链的部分发生相互易位。这种t(14;18)易位将Bcl-2基因置于重链基因增强子附近。Bcl-2基因产物Bcl-2蛋白是在内质网(ER)膜、核被膜和线粒体外膜上发现的膜内在蛋白质。推测Bcl-2和Bcl-XL起着编程性细胞死亡的重要拮抗剂的作用。
尽管理解机理对实施本发明而言并非必不可少,且本发明并非限于这些机理,但是推测抗编程性细胞死亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL通过与前编程性细胞死亡Bcl-2族成员,诸如Bak、Bad、Bax、Mtd(Bok)、Bim、Hrk(DP5)、Blk、Bnip3、Bnip3L和Diva形成杂二聚体而抑制编程性细胞死亡。认为Bcl-2族的其它抗编程性细胞死亡成员(或相关蛋白)包括、但不限于Mcl-1、Al/BFL-1和BOO-DIVA、Bcl-w,、Bcl-6、Bcl-8和Bcl-y。
在某些实施方案中,本发明提供了作为抑制靶物的含BH3结构域的蛋白质。应理解本说明书提及Bcl-2族蛋白时,相同的内容同样适用于含BH3结构域的蛋白质。因此,在某些实施方案中,本发明提供了用于调节与含BH3结构域的蛋白质的异常表达相关的生物疾患的组合物和方法。同样,在某些其它实施方案中,本发明提供了用于筛选可调节(例如抑制或促进)含BH3结构域之蛋白质的异常表达的因子和化合物的方法和组合物。
Bcl-2和Bcl-XL是高度同源的蛋白质。许多形式的人体癌症(例如骨髓白血病和乳腺癌)过表达Bcl-2和/或Bcl-XL。已经发现Bcl-2和Bcl-XL在人乳腺癌中过表达。特别发现Bcl-2在60-80%的人乳腺癌中过表达。Bcl-2的表达与雌激素受体(ER)阳性乳腺癌高度相关。Bcl-XL在40-70%的人乳腺癌、30-60%的前列腺癌、80%的B-细胞淋巴瘤、90%的结肠直肠腺癌和许多其它形式的癌症中过表达。主要在ER阴性乳腺癌中发现了Bcl-XL。Bcl-XL的表达一般与预后差和存活期缩短有关。
几条线的证据证实,Bcl-2和Bcl-XL不仅使癌症发展,而且可以使癌症耐受常规抗癌疗法诱导的编程性细胞死亡。高水平的胞内Bcl-2可保护细胞(例如癌细胞)免于受到编程性细胞死亡的破坏。大量实体瘤受到至少一种抗编程性细胞死亡Bcl-2蛋白的保护。大多数目前可得到的癌症化疗剂靶向细胞DNA整体或复制,并间接引起肿瘤细胞中的编程性细胞死亡。表达高水平Bcl-2和/或Bcl-X1的癌症通常耐受化疗剂或放疗。
然而,Bcl-2和Bcl-XL的表达模式在某些过表达Bcl-2族蛋白的癌症中不同。几种报导暗示Bcl-2或Bcl-XL蛋白的表达足以使癌细胞表现出Bcl-2族介导的对化疗或放疗的耐受性。(参见J.C.Reed,《药理学》(Pharmacology),41:50l-553[1997];J.C.Reed等《细胞生物化学杂志》(J.Cell Biochem.),6:23-32[1996])。其它研究暗示某些癌细胞能够将Bcl-2的过表达转换成Bcl-X1的过表达。(参见Z.Han等《癌症研究》(Cancer Res.),56:62l-628[1996])。因此,本发明的某些实施方案提供了对患有特征在于Bcl-2过表达的癌症的患者给予治疗量的一种或多种Bcl-2拮抗剂(例如小分子)的方法。类似地,本发明的其它实施方案提供了对患有特征在于Bcl-XL过表达的癌症的患者给予治疗量的一种或多种Bcl-XL拮抗剂(例如小分子)的方法。在其它实施方案中,本发明提供了对患有特征在于Bcl-2族蛋白过表达的癌症的患者给予两种或多种Bcl-2族拮抗剂(例如小分子)的组合的方法。本发明进一步关注提供包括Bcl-2族蛋白(例如抗编程性细胞死亡Bcl-2族蛋白)的一种或多种拮抗剂和一种或多种其它抗癌药(例如紫杉醇、多西他赛等)的组合物和方法。在优选的实施方案中,本发明包括抗癌方法和组合物,这些抗癌方法和组合物包括对受治疗者提供治疗有效量的棉酚、棉酚酮以及棉酚和棉酚酮的席夫碱和这些化合物的对映体和药学上可接受的盐。
对Bcl-2和Bcl-XL的三维(3D)结构的深入研究表明,两种分子均带有对其抗编程性细胞死亡作用而言重要的疏水结合口袋(称作BH3结合口袋)。进一步的研究证实,Bak、Bad和Bax带有可使分子与Bcl-2和Bcl-XL中的BH3口袋结合的结合结构域(称作BH3结合结构域)。特别地,已经测定了BCl-XL自身和与Bak BH3(Bcl-2同源性结构域3)肽相复合时的实验3D高分辨结构(S.W.Muchmore等,《自然》(Nature),381:335-341[1996];和M.Aritom等《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.),272:27886-27892[1997])(S.Michael等《科学》Science,275:983-986[1997])。Bcl-2和Bcl-XL在其氨基酸序列方面共有高度同源性(45%的同一性和56%的相似性)。已经证实,当靶蛋白(Bcl-2)与模板蛋白(Bcl-XL)之间存在30%以上序列同一性时,目前的计算同源性模型化方法,诸如MODELLER(A.Sali等《结构、功能和遗传》(Structure,Function,and Genetics),23:318-326[1995]),可提供靶蛋白的确切3D结构。(参见A.Sali,《最新生物技术观点》(Curr.Opin.Biotech.),6:437-451[1995])。因此,在本发明优选的实施方案中,将计算机同源性模型化用于模拟基于Bcl-XL(模板蛋白)的实验3D结构坐标的Bcl-2(靶蛋白)的3D结构。
对与Bcl-XL复合的棉酚的高分辨3D NMR结构分析显示,棉酚还通过BH3结合口袋与Bcl-XL结合。基于结构的经验测试方法显示棉酚及其对映体是Bcl-XL抗编程性细胞死亡作用的有效抑制剂,在较低程度上也是Bcl-2的抗编程性细胞死亡作用的抑制剂。
因此,对Bcl-2/Bcl-XL的抗编程性细胞死亡功能的抑制作用代表了克服某些癌症对化疗或放疗耐受性的新型和有希望的策略。
发明详述
本发明涉及天然和化学合成的Bcl-2族蛋白的小分子拮抗剂。特别地,本发明提供了棉酚衍生物和尤其在过表达Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2和/或Bcl-XL)的癌细胞中将棉酚衍生物用作Bcl-2和Bcl-XL蛋白的抗编程性细胞死亡作用的拮抗剂的方法。在下面的部分中详细描述本发明的示例性组合物和方法:I.Bcl-2和Bcl-XL的结合活性;II.用于发现Bcl-2和Bcl-XL的小分子抑制剂的基于结构的途径;III.Bcl-2族蛋白在癌症细胞系中的表征;IV.棉酚抑制癌细胞生长和增殖;V.提出的棉酚活性机理;VI.棉酚单独和与常规抗癌药联用时在MDA-231异种移植小鼠中的活性;VII.与棉酚联用或共同给药的治疗剂;和VII.药物制剂、给药途径和给药方案。
I.Bcl-2和Bcl-XL的结合活性
尽管理解所述机理对实施本发明而言并非必不可少,且本发明并非限于该机理,但是推测Bcl-2和Bcl-XL蛋白的抗编程性细胞死亡作用至少部分是由于它们能够与前编程性细胞死亡Bcl-2族成员,诸如Bak、Bax和Bad杂二聚化而导致的。Bcl-2和Bcl-XL的实验结构表明,Bcl-2和Bcl-XL的BH1(Bcl-2同源结构域1)、BH2和BH3结构域形成Bak或Bad BH3结构域可与之相结合的疏水结合口袋(BH3结合口袋)。(例如,参见S.W.Muchmore等《自然》(Nature),381:335-341[1996];M.Aritomi等《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.),272:27886-27892[1997];S.Michael等《科学》(Science),275:983-986[1997];和A.M.Petros等《蛋白质科学》(Protein Sci.),9:2528-2534[2000];和A.M.Petros等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),98:3012-3017[2001])。Bcl-2/Bcl-XL中的这种结合口袋是抗编程性细胞死亡功能所必需的。(例如,参见X.M.Yin等《自然》(Nature),369:32l-323[1994];S.C.Cosulich等《最新生物学》(Curr.Biol.),7:913-920[1997];S.Michael等,文献同上;和A.M.Petros等,文献同上)。因此,本发明预计可结合Bcl-2和/或Bcl-XL中的BH3结合位点的小分子能够阻断Bcl-2和/或Bcl-XL与Bcl-2蛋白家族的前编程性细胞死亡成员(例如Bad、Bak,和Bax等)的杂二聚化,使Bcl-2和/或Bcl-XL的抗编程性细胞死亡功能得到拮抗,且在具有Bcl-2和/或Bcl-XL过表达的细胞中诱导编程性细胞死亡。在优选的实施方案中,本发明提供了可结合Bcl-2和/或Bcl-XL的结合口袋(例如BH3)的小分子拮抗剂。在这些实施方案中的某些中,本发明进一步提供了与本文公开的Bcl-2和/或Bcl-XL的小分子抑制剂(例如棉酚化合物)联合给药的一种或多种其它抗癌药(例如紫杉醇、多西他赛等)。在特别优选的实施方案中,将棉酚化合物与至少一种诱导编程性细胞死亡的抗癌药联合给药。
本发明预见到Bcl-2和Bcl-XL的小分子抑制剂具有超过诸如反义寡核苷酸、抗体和肽这样其它商购的蛋白拮抗剂的几个优点,包括更好的口服利用度、更好的稳定性和较低的成本,但不限于此。
II.基于结构的手段用于发现Bcl-2和Bcl-XL的小分子抑制剂
本发明应用基于结构的有效实际筛选方法从大3D化学数据库中鉴定诸如Bcl-2和Bcl-XL这样的Bcl-2族蛋白的小分子拮抗剂。该手段使用计算停泊法鉴定可结合靶蛋白中的结合位点(例如Bcl-2和Bcl-XL中的BH3)的潜在有机小分子抑制剂。在一个实施方案中,在停泊研究中使用联合原子逼近法处理Bcl-XL蛋白。仅向该蛋白质中加入极性氢,并分配Kollman联合原子部分电荷。除去所有水分子。使用AutoDock工具AddSol对所述蛋白质原子赋予原子溶剂化参数和片段体积(参见,AutoDock网页;G.Morris等《计算机化学杂志》(J.Computational Chemistry),19:1639-1662[1998])。
在另一个实施方案中,使用MODELLER同源性模型化方法模拟Bcl-2的3D结构。(A.Sali等《结构、功能和遗传》(Structure,Function,and Genetics),23:318-326[1995];和A.Sali,《最新生物技术观点》(Curr.Opin.Biotech.),6:437-451[1995])。附图1中提供了使用BLAST程序在Bcl-2与Bcl-XL之间获得的序列对比,将它们用于本发明中的同源性模型化。由于Bak BH3肽可以良好亲和性与Bcl-2与Bcl-XL二者相结合(参见,J.L.Wang等《癌症研究》(Cancer Res.),60:1498-1502[2000];和J.L.Wang等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),97:7124-7129[2000]),所以基于与Bak BH3肽复合的Bcl-XL的实验NMR结构模拟与Bak BH3肽复合的Bcl-2的3D结构。(S.Michael等《科学》(Science),275:983-986[1997])。使用CHARMM程序(B.R.Brooks等《计算化学杂志》(J.Comp.Chem.),4,187-217[1983];和P.V.R.Schleyer等:CHARMM:《计算化学百科全书》中使用程序概述的能量函数及其参数化(The Energy Function and Its Parameterization with anOverview of the Program,in The Encyclopedia of ComputationalChemistry),1:271-277编辑,John Wiley & Sons,Chichester[1998]),借助MSI CHARMM力场,通过精细水中的分子动力学(MD)模拟进一步精修模拟的3D复合结构。附图2中描绘了Bcl-2与Bak BH3肽复合的精修结构。附图2显示与Bak BH3肽复合的Bcl-2总体结构呈带状。通过生化和生物学试验证实可能的抑制剂。
与随机筛选相比,基于结构的3D-数据库检索极为有效且成本较低。构建了含有约7,000个从草药中鉴定和分离的小有机化合物的三维数据库,并用于目前使用程序DOCK(S.Makino和I.D.Kuntz,《计算化学杂志》(J.Comput.Chem.)18:1812-1825[1997])的基于最新结构的数据库筛选。将具有最高DOCK得分的前250个化合物看作潜在的Bcl-2和Bcl-XL抑制剂。在最初筛选的分子中,9个化合物可来自商品来源,得到它们以用于进一步的体外结合试验。
使用建立的灵敏并定量的基于荧光偏振(FP)的体外结合试验对可能的非肽小分子抑制剂进行进一步测试。(参见,I.J.Enyedy等《药物化学杂志》(J.Med.Chem.),44:313-4324[2001])。使用这种方法筛选9个候选化合物与Bak BH3肽竞争性结合Bcl-2的能力。从9个化合物中发现,有3个化合物显示出IC50值好于25μM;在FP结合试验中发现天然Bak BH3肽的IC50值为0.3μM。证实这3个鉴定的小分子均可阻断Bcl-2与Bak BH3肽结合。发现棉酚与Bcl-2的结合亲和性为10M,且可与Bak肽竞争。
由于Bcl-2和Bcl-XL具有相似的3D结构,所以推断某些潜在的Bcl-2抑制剂也可以与Bcl-XL结合。因此,进一步的筛选工作旨在使用基于FP的上述结合试验发现Bcl-XL的潜在非肽小分子拮抗剂。
尽管Bcl-2和Bcl-XL具有抗编程性细胞死亡功能,但是这两种蛋白质在人体癌症中具有不同的表达模式。此外,尽管Bcl-2和Bcl-XL共有结构上类似的BH3结合位点,但是存在一定差异。发现尽管某些Bcl-2的小分子抑制剂对Bcl-XL也具有良好的结合亲和性,但是另有其它一些Bcl-2的小分子抑制剂仅微弱地结合Bcl-XL(不过,弱结合物仍然可以用作抑制剂)。相反,某些相对弱的Bcl-2小分子抑制剂具有更强的结合Bcl-XL的效力。特别发现Bcl-2蛋白的中度有效抑制剂,棉酚,表现出对Bcl-XL有强的结合活性,IC50值为0.4μM(附图3)。附图3显示,如基于FP的结合试验所测定的,棉酚对Bak BH3肽与Bcl-2(Bcl-XL)之间的结合有直接抑制作用。非-FP标记的Bak肽对Bcl-XL的IC50值为0.3μM。
在这种基于FP的Bcl-XL结合试验中,经测定Bak肽与Bcl-XL结合的IC50值为0.3μM。因此,棉酚是Bcl-XL的有效抑制剂,它具有与Bak肽类似的效力,并且也是Bcl-2的中度有效抑制剂。
III.Bcl-2族蛋白在癌细胞系中的特征化
为了更好地理解Bcl-2和Bcl-XL的小分子抑制剂的分子机理,在来自National Cancer Institute的抗癌药物筛选程序的各种乳腺癌细胞系和其它癌细胞系中鉴定Bcl-2族蛋白的表达。从5个有代表性的癌细胞系(即MDA-MB-231、T-47D和MDA-435、乳腺癌细胞系、HL-60白血病细胞系和HT-29结肠癌细胞系)和1种正常成纤维细胞系(WI-38)中得出的结果如附图4中所示。HL-60白血病细胞系具有最高水平的Bcl-2表达,而MDA-MB-231和MDA-MB-435乳腺癌细胞系也显示出极高水平的Bcl-2。乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T-47D以及结肠癌细胞系HT-29也表现出极高水平的Bcl-XL表达。正常成纤维细胞系显示出低水平的Bcl-2和Bcl-XL。
Bcl-2族蛋白起程序性细胞死亡判断者的作用。抗编程性细胞死亡分子(例如Bcl-2和Bcl-XL)与前编程性细胞死亡分子(例如Bid、Bax、Bak和Bad)之间的平衡在编程性细胞死亡中起重要作用。由于这一原因,所以还测定了前编程性细胞死亡蛋白Bid、Bax、Bak和Bad在癌细胞系MDA-MB-231、T-47D、MDA-435、HL-60和HT-29以及正常成纤维细胞系WI-38中的表达状态。(附图4)。包括正常成纤维细胞系WI-38在内的所有测试细胞系均表达高水平的Bax,且大多数癌细胞系还表达高水平的Bak。在不同细胞系之间,Bid和Bad表达水平上存在显著变化。总的来说,所测试的5种癌细胞系均显示有高水平的抗编程性细胞死亡和前编程性细胞死亡Bcl-2族蛋白,而正常成纤维细胞系(WI-38)显示出低水平的Bcl-2和Bcl-XL,但有高水平的前编程性细胞死亡Bcl-2族蛋白Bax和Bad。
还测试了National Cancer Institute(NCI)在抗癌药物筛选尝试中使用的几种其它乳腺癌细胞系。这些细胞系包括BT-549、HS 578T、MCF-7和NCI/ADR-抗性。在它们中,MCF-7和BT-549具有高水平的Bcl-2蛋白,而BT-549还具有高水平的Bcl-XL蛋白。HS 578T和NCI/ADR-RES具有中等水平的Bcl-XL蛋白。因此,在检验的7种人乳腺癌细胞系(即MDA-MB-231、T-47D、MDA-435、BT-549、HS 578T、MCF-7和NCI/ADR-抗性)中,5种细胞系具有高水平的Bcl-2和Bcl-XL表达之一或它们两者。两种乳腺癌细胞系具有中等水平的Bcl-2或Bcl-XL表达。7种测试的乳腺癌细胞系中没有1种具有低Bcl-2和低Bcl-XL表达。
IV.棉酚抑制癌细胞生长和增殖
荧光偏振试验显示,棉酚可取代Bak BH3肽与Bcl-2和与Bcl-XL的结合。因此,本发明预见可与Bcl-2或Bcl-XL中的BH3结合结构域结合的小分子抑制剂(例如棉酚)可阻断这些分子的抗编程性细胞死亡功能,继而在具有增加的Bcl-2和/或Bcl-XL表达的癌细胞中诱导编程性细胞死亡。进一步预见小分子抑制剂(例如棉酚)还可减少具有高Bcl-2和/或Bcl-XL表达的癌细胞的存活力和增殖。棉酚可抑制癌症中的细胞增殖(生长),更具体的说是可抑制人乳腺癌(例如MDA-MB-231)中的细胞增殖。MDA-MB-231乳腺癌细胞系具有高水平的Bcl-2和Bcl-XL表达。在5天MTT试验中测试了棉酚抑制MDA-MB-231细胞生长的能力。棉酚显示可抑制MDA-MB-231细胞生长,IC50值为2.0μM。
如Hoechst染料试验检测的用20μM棉酚处理MB-23和WI-38细胞24小时后得到的结果分别如附图5A和5B中所示。用棉酚处理MDA-MB-231癌细胞可诱导癌细胞中的编程性细胞死亡,但并不诱导正常WI-38成纤维细胞中的编程性细胞死亡。附图5A显示在MDA-231细胞中诱导编程性细胞死亡。附图5B显示棉酚处理不会诱导具有低水平(例如基础水平)的Bcl-2和Bcl-XL表达的正常WI-38成纤维细胞中的编程性细胞死亡。
在其它试验中,棉酚显示可诱导具有高水平Bcl-XL表达、低水平Bcl-2表达的T-47D乳腺癌细胞中的编程性细胞死亡。还发现棉酚可诱导其它具有高Bcl-XL表达的癌细胞系、诸如人结肠癌细胞系HT-29中的编程性细胞死亡,但不会在具有低Bcl-2和低Bcl-XL表达的癌细胞系,诸如前列腺癌细胞系DU-145中诱导编程性细胞死亡。
使用膜联蛋白-V流式细胞术(FACS)测定进行进一步试验,以便更加定量地评价棉酚诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞中的编程性细胞死亡的效力。例如,附图6显示如利用膜联蛋白-V流式细胞术所检测的,用棉酚处理人MDA-MB-23l乳腺癌细胞24小时时棉酚诱导的编程性细胞死亡。观察到5.0μM的棉酚诱导59%的细胞发生编程性细胞死亡。棉酚诱导的编程性细胞死亡是剂量依赖性的。在10和20.0μM下,棉酚分别诱导74%和96%的癌细胞发生编程性细胞死亡。MDA-231过表达Bcl-2和Bcl-XL二者。
由于棉酚是Bcl-XL的有效抑制剂,所以本发明预计棉酚可以在具有高水平Bcl-XL、低水平Bcl-2的癌细胞中诱导编程性细胞死亡。实际上,棉酚在如上所示具有高水平Bcl-XL、低水平Bcl-2的人T-47D乳腺癌细胞中可以剂量依赖性的方式诱导编程性细胞死亡。附图7显示如使用膜联蛋白-V流式细胞术所检测的,用棉酚处理人TD-47癌细胞24小时时编程性细胞死亡的剂量依赖性诱导。
这些试验表明,棉酚是Bcl-XL的有效抑制剂,可诱导表达高水平(例如与一般细胞类型实例的基础表达率相比为过表达)Bcl-XL的癌细胞发生编程性细胞死亡,但不会在具有正常水平的Bcl-2和Bcl-XL表达的细胞(例如WI-38)中诱导编程性细胞死亡。
本发明的优选实施方案提供了对患有特征在于Bcl-2族蛋白过表达的疾病的受治疗者给予一种或多种棉酚化合物的方法。预计可用于本发明的棉酚化合物包括、但不限于:(±)-棉酚;(-)-棉酚;(+)-棉酚;(±)-棉酚酮;(-)-棉酚酮;(+)-棉酚酮;(±)-棉酚乙酸;(-)-棉酚乙酸;(+)-棉酚乙酸;(±)-乙基棉酚;(-)-乙基棉酚;(+)-乙基棉酚;(±)-半棉酚酮;(-)-半棉酚酮;(+)-半棉酚酮;(±)-棉酚的席夫碱;(-)-棉酚的席夫碱;(+)-棉酚的席夫碱;(±)-棉酚酮的席夫碱;(-)-棉酚酮的席夫碱;(+)-棉酚酮的席夫碱;(±)-棉酚乙酸的席夫碱;(-)-棉酚乙酸的席夫碱;(+)-棉酚乙酸的席夫碱;(±)-乙基棉酚的席夫碱;(-)-乙基棉酚的席夫碱;(+)-乙基棉酚的席夫碱;(±)-半棉酚酮的席夫碱;(-)-半棉酚酮的席夫碱;和(+)-半棉酚酮的席夫碱;以及棉酚衍生物、棉酚分子的代谢物和药物上可接受的盐。
在特别优选的实施方案中,对患者给予(-)-棉酚对映体(包括其衍生物、代谢物、席夫碱和药物上可接受的盐)。
对(-)-棉酚和(+)-棉酚对映体结合的NMR分析最终表明(-)-棉酚对映体和(+)-棉酚均可与Bcl-XL结合(附图8A和8B)。
附图9表示来自MDA-MB-231(2-LMP)乳腺癌细胞系、比较(-)-棉酚和(+)-棉酚对映体和外消旋棉酚的生长抑制实验的数据(3000/200μl/孔,使用MTT试验,5天;外消旋棉酚IC50为3.2μM;(-)-棉酚IC50为1.7μM;和(+)-棉酚IC50为10μM)。前期研究表明(+)-棉酚对映体在人体内被消除的T1/2为(-)-棉酚的29倍。因此,(+)-棉酚对映体的毒性可能高于(-)-棉酚对映体。因此,在某些实施方案中,本发明预计给予的(-)-棉酚对映体的毒性可能低于棉酚的外消旋形式或(+)-棉酚对映体。
在其它实施方案中,对患有特征在于Bcl-2族蛋白过表达的头颈癌患者给予(-)-棉酚(super-G)。下面提供的表1比较了(-)-棉酚和顺铂(治疗头颈癌的标准活性剂)在许多头颈癌细胞系中对细胞生长的抑制作用。表1表明(-)-棉酚可有效抑制具有增加的Bcl-XL蛋白的人头颈癌细胞系中癌细胞的生长。这些癌细胞系极为耐受治疗头颈癌的标准化疗药顺铂。
表1
super-G(IC50μM) | Bcl-XL | Bcl-2 | 顺铂(IC50μM) | |
UM-SCC-23 | 1.5 | +++ | - | 25 |
UM-SCC-1 | 1.5 | +++ | - | 30 |
UM-SCC-25 | 8 | + | - | 43 |
附图10提供了棉酚、棉酚酮以及棉酚和棉酚酮的席夫碱的化学结构。
V.提出的棉酚活性机理
尽管理解所述机理对实施本发明而言并非必不可少,且本发明并非限于该机理,但是预计Bcl-2/Bcl--XL介导的编程性细胞死亡途经中的关键分子之一是细胞色素-c(Cyt-c)。因此,进一步推测Bcl-2/Bcl-XL的关键功能之一是与BaX、Bak或Bad异二聚化并阻断cyt-c从线粒体中释放出来。因此,测试了棉酚诱导癌细胞中Cyt-c从线粒体中释放至细胞溶胶的能力。用5或20μM棉酚将乳腺癌细胞系MDA-231和T47D处理24小时。附图11显示在MDA-231和T47D乳腺癌细胞系中,用20μM棉酚处理后,Cyt-c从线粒体中释放入细胞溶胶(HM,在重膜中发现的Cyt-c;Cytosol,在细胞溶胶中发现的Cyt-c)。
尽管不受任何特定机理限制,但是还预计Bcl-2介导的编程性细胞死亡包括在Cyt-c从线粒体中释放出来时天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)(例如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3和-9)的活化。因此,进行试验以便确定棉酚是否活化天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3。在用棉酚处理12或24小时后测定天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3在MDA-231乳腺癌细胞裂解物中裂解的量。附图12显示用棉酚处理后,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3以剂量依赖性方式被裂解成17和21kD片段。在用棉酚处理的T-47D人乳腺癌细胞和HT-29结肠癌细胞中获得了类似的结果,在处理后上述两种细胞均具有高水平的Bcl-XL表达和相对低水平的Bcl-2表达。相反,用5、10或20μM的棉酚处理具有低Bcl-2和Bcl-XL表达的人DU-145前列腺癌细胞24小时后,对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的活化没有效果。因此,棉酚对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的活化是特异性的,且与癌细胞中Bcl-XL表达的水平相关。
VI.棉酚单独和与常规抗癌药联用时在MDA-231异种移植小鼠中的活性
在裸鼠的人乳腺癌MDA-MB-231(亚克隆2LMP)异种移植模型中进一步评价棉酚化合物作为抗癌治疗剂的可能性。从第7天开始实施棉酚治疗方案,此时小鼠肿瘤生长至直径8-10mm。各治疗组中有5只小鼠,带有10个人肿瘤(每侧各一个肿瘤)。对照组中有5只不给予棉酚的小鼠。在治疗的小鼠中,每天口服给予两种不同剂量、即30和90mg/kg剂量的棉酚,持续3周。发现在每天30和90mg/kg剂量下,在第29天时,棉酚对肿瘤生长的抑制作用高于70%,置信水平大于95%。在用棉酚治疗的小鼠中没有观察到体重下降或死亡。看起来在30mg/kg和90mg/kg剂量下棉酚的抗癌活性不存在任何显著差异。这些结果提示每天30mg/kg剂量的棉酚成功抑制了肿瘤生长,而不需要用佐剂或其它抗癌化合物或疗法补充棉酚疗法。
Bcl-XL的过表达看起来可阻止癌细胞发生由某些常用抗癌疗法(例如多西他赛)诱导的编程性细胞死亡。因此,本发明的某些实施方案提供了给予有效剂量的棉酚(及其对映体、衍生物和药物上可接受的盐)与至少一种常用抗癌疗法(例如化疗剂,诸如多西他赛,和/或放疗)联用的方法。
在优选的实施方案中,将棉酚与一种或多种常用抗癌疗法联用,以治疗特征在于Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2和/或Bcl-XL)过表达的疾病(例如癌症)。
尽管理解所述机理对实施本发明而言并非必不可少,且本发明并非限于该机理,但是预计将至少一种棉酚化合物与常用抗癌疗法(例如化疗药,诸如多西他赛)联用,可使耐受常用抗癌疗法的具有高水平Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2和/或BCL-XL)表达的癌细胞对用棉酚和/或其它抗癌药(例如多西他赛)的治疗敏感。然而,本发明并不限于任何棉酚化合物与抗癌治疗剂具体组合的给药;本发明也不限于给予活性剂的任何具体顺序或水平。
由于棉酚在约30mg/kg的每日剂量下对肿瘤生长有显著抑制作用,所以选择这种剂量水平测试棉酚与其它常用抗癌治疗剂的组合。一组10只小鼠从第7天开始接受口服给予的30mg/kg棉酚的每日剂量,且持续4周。也是从第7天开始,对相同的10只小鼠每周腹膜内给予剂量7.5mg/kg的多西他赛,持续3周。本实验结果如附图13中所示。特别地,附图13显示了棉酚或多西他赛单用或二者联用时对人乳腺癌异种移植MDA-MB-231裸鼠体内的肿瘤生长的抑制作用。每一实验组中有10只小鼠。附图13显示,单独给予棉酚(每天30mg/kg)或单独给予次佳剂量(每周7.5mg/kg)的多西他赛可显著抑制测试动物体内的肿瘤生长,然而,接受棉酚与多西他赛联合疗法的测试动物甚至对肿瘤生长显示出更强的抑制作用。重要的是,在该组中,用棉酚与多西他赛组合治疗的10只小鼠中有3只(6个肿瘤)表现出肿瘤完全退化。总之,与对照组相比,联合疗法组中的肿瘤生长得到90%以上的抑制。使用SAS(See,G.Verbeke和G.Molenberghs,《实践中的线性混合模型:SAS-定向手段》(Linear mixed models in practice:An SAS-orientated approach),Springer-Verlag,126卷[1997])程序进行统计学分析,将结果列在如下所示的表2中。
表2
对照组 | 棉酚 | 多西他赛 | |
棉酚 | 0.008*(0.06++) | ||
多西他赛 | 0.003(0.01) | ||
棉酚+多西他赛 | 0.00001(0.0000004) | 0.005(0.009) | 0.01(0.002) |
*第41天
++第47天
结果表明,棉酚和多西他赛的抗癌活性在研究的第41天和第47天与对照组相比均具有统计学显著性。此外,棉酚与多西他赛组合的抗癌活性比对照(未治疗)组和单独用棉酚或多西他赛治疗的组显著。这些数据共同表明棉酚单独使用时具有显著抗癌活性,但是在某些实施方案中,与常用抗癌药(例如化疗剂,诸如多西他赛)联合给药时甚至具有更强的活性。
尽管理解所述机理对实施本发明而言并非必不可少,且本发明并非限于该机理,但是预计在常用抗癌药与棉酚的几种组合中观察到的协同作用是由于两种化合物的不同作用机理所导致的(例如棉酚抑制Bcl-XL活性,而多西他赛靶向微管)。
此外,在其它实施方案中,尽管理解所述机理对实施本发明而言并非必不可少,且本发明并非限于该机理,但是预计在某些常用抗癌药与棉酚化合物的组合中观察到的协同作用是由于两种化合物的类似作用机理所导致的(例如棉酚和一种或多种其它抗癌药均抑制Bcl-XL活性)。
例如,在一个实施方案中,(-)-棉酚对映体与常用抗癌治疗剂紫杉醇共同给药时提供了协同的有益作用。附图14显示了共同给予(-)-棉酚对映体和紫杉醇的协同作用。简单的说,本实验在MCF-7乳腺癌细胞系中使用了100∶1比例的(-)-棉酚和(+)-棉酚对映体:紫杉醇(-)-棉酚IC508.71μM;(+)-棉酚IC5022.88μM;紫杉醇+(-)-棉酚IC502.755μM;和紫杉醇+(+)-棉酚IC5010.57μM)。类似地,附图15A和15B提供了联用指数,它表明(-)-棉酚与紫杉醇以及(+)-棉酚与紫杉醇之间存在极强的协同作用。附图16显示棉酚酮与Bcl-XL的结合。附图17显示(-)-棉酚的乙基席夫碱的结合。
VII.与棉酚联用或共同给药的治疗剂
有广泛的治疗剂可应用于本发明。可以与棉酚化合物共同给药或与棉酚化合物相关的任意治疗剂适用于本发明。
本发明的某些实施方案包括对受治疗者给予有效量的棉酚(及其对映体、衍生物和药物上可接受的盐)和至少一种抗癌药(例如常用抗癌药,诸如化疗药,和/或放疗)的方法。在这些实施方案中的某些中,所述的受治疗者患有特征在于胞内Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2和/或Bcl-XL)过表达的疾病。
适用于本发明的抗癌药机理包括、但不限于诱导编程性细胞死亡的活性剂、诱导/导致核酸破坏的活性剂、抑制核酸合成的活性剂和影响蛋白质合成或稳定性的活性剂。
适用于本发明组合物和方法的抗癌药类型包括、但不限于:1)生物碱,包括微管抑制剂(例如长春花新碱、长春花碱和长春地辛等),微管稳定剂(例如紫杉醇[泰素]和多西他赛等),和染色质功能抑制剂,包括拓扑异构酶抑制剂,诸如表鬼臼毒素(例如依托泊苷[VP-16]和替尼泊苷[VM-26]等)和靶向拓扑异构酶I的活性剂(例如喜树碱和Isirinotecan[CPT-11]等);2)共价结合DNA的活性剂[烷基化剂],包括氮芥(例如氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺和白消安[马利兰]等);亚硝基脲(例如卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀等)和其它烷基化剂(例如达卡巴嗪、羟甲基蜜胺、塞替派和丝裂霉素(Mitocycin)等);3)非共价结合DNA的活性剂[抗肿瘤抗生素],包括核酸抑制剂(例如放线菌素D等)、安慈拉环素(例如柔红霉素[道诺霉素和盐酸柔红霉素]、多柔比星[Adriamycin]和伊达比星[Idamycin]等)、蒽二酮类(例如安慈拉环素类似物,诸如[米托蒽醌]等)、博来霉素(硫酸博来霉素)等和普卡霉素(Mithramycin)等;4)抗代谢物,包括叶酸抗代谢物(例如甲氨蝶呤、Folex和氨甲蝶呤制剂等)、嘌呤抗代谢物(例如6-巯基嘌呤[6-MP,Purinethol]、6-硫代鸟嘌呤[6-TG]、硫唑嘌呤、阿昔洛韦、更昔洛韦、氯脱氧腺苷、2-氯脱氧腺苷[CdA]和2’-脱氧考福霉素[喷司他丁]等)、嘧啶拮抗剂(例如氟嘧啶类[例如5-氟尿嘧啶(Adrucil)、5-氟脱氧尿苷(FdUrd)(氟尿苷)等)和阿糖胞苷(例如塞德萨[ara-C]和氟达拉滨等);5)酶,包括L-天冬酰胺酶和羟基脲等;6)激素,包括糖皮质激素,诸如抗雌激素(例如他莫昔芬等)、非甾类抗雄激素(例如氟他胺等)和芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑[瑞宁得]等);7)铂化合物(例如顺铂和卡铂等);8)与抗癌药、毒素和/或放射性核素等缀合的单克隆抗体;9)生物反应调节剂(例如干扰素[例如[IFN-α等]和白细胞介素[例如IL-2等]等);10)过继免疫疗法;11)造血生长因子;12)诱导肿瘤细胞分化的活性剂(例如全反式视黄酸等);13)基因疗法技术;14)反义疗法技术;15)肿瘤疫苗;16)针对肿瘤转移酶的疗法(例如巴马司他(Batimistat)等);和17)血管发生抑制剂。
在优选的实施方案中,本发明提供了对受治疗者给予有效量的棉酚和至少一种可诱导编程性细胞死亡的常用抗癌药的方法。在某些优选的实施方案中,所述的受治疗者患有特征在于Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2和/或Bcl-XL)过表达的疾病。在其它优选的实施方案中,本发明提供了对患有特征在于Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2和/或Bcl-XL)过表达的疾病的受治疗者给予有效量的棉酚和紫杉烷(例如多西他赛)的方法。
紫杉烷类(例如多西他赛)是有效的抗癌治疗剂类型。(例如,参见K.D.Miller和G.W.Sledge,Jr.《癌症研究》(CancerInvestigation),17:121-136[1999])。尽管本发明并不限于任何特定的机理,但是推测紫杉烷介导的细胞死亡通过胞间微管稳定化和随后的诱导编程性细胞死亡途径来进行。(例如,参见,S.Haldar等《癌症研究》(Cancer Research),57:229-233[1997])。在许多系统中,Bcl-2和Bcl-XL对这种途径起负控制的作用。
在某些其它实施方案中,特别关注顺铂和紫杉醇与棉酚化合物的联用。顺铂和紫杉醇对诱导肿瘤细胞中的编程性细胞死亡具有充分确定的作用(例如,参见Lanni等《国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.),94:9679[1997];Tortora等《癌症研究》(Cancer Research)57:5107[1997];和Zaffaroni等《英国癌症研究》(Brit.J.Cancer)77:1378[1998])。然而,用这些和其它化疗剂治疗难以在不引起显著毒性的情况下进行。目前应用的活性剂一般难溶于水、毒性十分明显,且在影响正常细胞和患病细胞的剂量下给药。例如,发现的最理想的抗癌化合物紫杉醇(泰素)难溶于水。紫杉醇已经在诸如B16黑素瘤、L1210白血病、MX-1乳腺肿瘤和CS-1结肠肿瘤异种移植物这样的各种肿瘤模型中显示出极佳的抗肿瘤活性。然而,紫杉醇极差的水溶性在对人给药时存在问题。因此,目前使用的紫杉醇制剂需要cremaphor来增溶。人体临床剂量范围在200-500mg。将该剂量溶于1∶1的乙醇:cremaphor溶液,并稀释成1升的静脉内给药液体。目前使用的cremaphor是聚乙氧基化蓖麻油。通过溶于cremaphor混合物并用大体积水性载体稀释来经输注给药。直接给药(例如皮下)会产生局部毒性,且活性水平低。
本发明还提供了在将顺铂和/或紫杉醇投递给受治疗者后监测治疗成功的机会。例如,据报导,这些药物在体外诱导编程性细胞死亡的能力是体内功效的标志(Gibb,《妇科肿瘤学》(GynecologicOncology),65:13[1997])。因此,除定向地投递这两种药物之一或二者以提供有效的抗肿瘤治疗并降低毒性外,可以通过本发明监测诱导编程性细胞死亡的技术来估计治疗剂的有效性。重要的是两种治疗剂对包括、但不限于乳腺癌和结肠癌在内的各种肿瘤类型具有活性(Akutsu等《欧洲癌症杂志》(Eur.J.Cancer)31A:2341[1995])。
常用于癌症疗法的任何药物均可应用于本发明。适合与公开的棉酚化合物一起给药的常用抗癌药包括、但不限于阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C,或更优选顺铂。可以通过与免疫治疗剂合并来制备这些活性剂,并用作本文所述的联用治疗组合物或试剂盒。
在本发明的某些实施方案中,治疗性棉酚化合物疗法进一步包括一种或多种可直接交联核酸(例如DNA)的一种或多种活性剂,促进DNA损伤,产生本发明的抗肿瘤活性剂协同作用。可以使用诸如顺铂这样的活性剂和其它DNA烷基化剂。已经将顺铂广泛用于治疗癌症,应用于临床施用的有效剂量为每3周20mg/M2、持续5天,总计3个疗程。可以通过任意合适的方法,包括静脉内、皮下、肿瘤内、腹膜内或局部(例如对粘膜表面)注射来投递本发明的组合物。
破坏DNA的活性剂还包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物。这类化疗化合物包括、但不限于:阿霉素,也称作多柔比星;依托泊苷;维拉帕米、鬼臼毒素等。这些化合物广泛用于治疗肿瘤的临床环境,且通过静脉内大剂量注射给药,剂量范围对于阿霉素为按21天间隔25-75mg/M2,对依托泊苷而言静脉给药为35-50mg/M2,口服给药则是静脉内剂量的双倍。
破坏核酸前体和亚单位合成和保真度的活性剂也可导致DNA损伤,可用作本发明中的化疗剂。已经开发了许多核酸前体。特别有用的是可以进行广泛测试且易得到的活性剂。其中,诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)这样的活性剂优先被肿瘤组织所利用,使得这种活性剂特别可用于靶向肿瘤细胞。投递的剂量可以在3-15mg/kg/天,不过可以根据包括疾病状态、细胞对疗法的顺应性、耐活性剂的量等不同因素考虑改变其它剂量。
在优选的实施方案中,用于本发明的抗癌药是那些适合于与公开的棉酚化合物共同给药、或者与公开的棉酚化合物相关的活性剂,使得可以将它们投递到受治疗者、组织或细胞中,而不会损失抗癌作用的保真度。为了更具体的描述癌症治疗剂,诸如铂复合物、维拉帕米、鬼臼毒素、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、bisulfan、亚硝基脲、阿霉素、放线菌素D、道诺霉素、多柔比星、博来霉素、plicomycin、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、紫杉醇、TRANSPLATINUM、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤以及其它类似的抗癌药,本领域技术人员可参照大量工具手册,包括、但不限于临床医师参考书以及Goodman和Gilman的《治疗剂的药物基础》(″Pharmaceutical Basis of Therapeutics″)第9版,Hardman等,1996。
在某些实施方案中,将所述药物通过光裂解连接物与棉酚化合物连接。例如,可应用于本发明的几种异双功能光裂解连接物由Ottl等描述(Ottl等《生物缀合物化学》(Bioconjugate Chem.),9:143[1998])。这些连接物可以水溶性的或可溶于有机物。它们含有可以与胺类或醇类反应的活化酯和可以与硫羟基反应的环氧基。在这两基团之间是3,4-二甲氧基-6-硝基苯基光异构化基团,它在暴露于近紫外光(365nm)时可释放完整形式的胺或醇。因此,当治疗剂在通过这类连接物与本发明组合物连接时,可以通过使靶区域暴露于近紫外光而以生物活性或可活化形式释放。
在代表性的实施方案中,使紫杉醇的醇基与可溶于有机物的连接物的活性酯反应。该产物继而与合适的树突状聚合物的部分硫醇化表面反应(可以通过与亚化学计量用量的2-iminothiolano反应而将所述的树枝状聚合物的伯胺转化成含有硫羟基的部分)。就顺铂而言,药物的氨基与连接物的水溶性形式反应。如果氨基活性不够,那么可以使用含伯氨基的顺铂活性类似物,诸如磺胺嘧啶二氯化铂(II)(Pasani等《无机化学学报》(Inorg.Chim.Acta)80:99[1983]和Abel等《欧洲癌症杂志》(Eur.J.Cancer)9:4[1973])。因此缀合后,药物是失活的,且对正常细胞无害。当位于肿瘤细胞内时,使之暴露于与合适近紫外波长的激光接触,从而使活性药物释放入细胞。
类似地,在本发明的其它实施方案中,将顺铂(或其类似物)的氨基与诸如2-硝基苄氧基羰基这样的极为疏水的光裂解保护基连接(Pillai,V.N.R.《合成》(Synthesis):1-26[1980])。当暴露于近紫外光(约365nm)时,疏水性基团被裂解,从而释放完整药物。由于药物本身是亲水性的,所以它扩散出树枝状聚合物并进入肿瘤细胞,在其中引起编程性细胞死亡。
可选的光裂解连接物是酶裂解接头。已经证实许多光裂解连接物为有效的抗肿瘤缀合物,可以通过使癌症治疗剂(诸如多柔比星)与带有适宜短肽接头的水溶性聚合物连接而制备(例如,参见,Vasey等《临床癌症研究》(Clin.Cancer Res.),5:83[1999])。所述接头在细胞外保持稳定,但一旦进入细胞内,即被硫醇蛋白酶裂解。在优选的实施方案中,使用缀合物PK1。作为可选的光裂解连接物策略,可以使用酶可降解接头,诸如Gly-Phe-Leu-Gly。
本发明并不限于治疗技术的性质。例如,可应用于本发明的其它缀合物包括、但不限于用于BNCT的缀合硼粉(boron dusters)(Capala等《生物缀合物化学》(Bioconjugate Chem.),7:7[1996])、使用放射性同位素和诸如与蓖麻毒蛋白这样的毒素的缀合物。
还可以将抗微生物治疗剂用作本发明中的治疗剂。可以使用可以杀伤、抑制或者减弱微生物功能的任意活性剂以及预计具有这类活性的任意活性剂。抗微生物活性剂包括、但不限于天然和合成的抗生素、抗体、抑制蛋白、反义核酸、破坏膜的活性剂等,可以单独或以组合方式使用它们。实际上,可以使用任意类型的抗生素,包括、但不限于抗菌药、抗病毒药、抗真菌药等。
在其它实施方案中,本发明的另一种成分是与能够特异性靶向特定细胞类型(例如肿瘤细胞)的靶向剂结合的棉酚化合物(棉酚化合物-靶向剂复合物)。一般来说,与靶向剂结合的棉酚化合物通过靶向剂与细胞表面部分的相互作用而靶向肿瘤细胞,并通过受体介导的胞吞作用进入细胞。
已知位于靶细胞(例如肿瘤细胞)表面上的任意部分均可应用于本发明。例如,针对于这类部分的抗体使本发明的组合物靶向含有该部分的细胞表面。另一方面,靶向部分可以是针对于存在于细胞表面上的受体的配体,反之亦然。类似地,还可以将维生素用于将本发明的治疗剂靶向至特定细胞。
在本发明的某些实施方案中,靶向部分还可以作为活性剂,用于鉴定特征在于表达靶向剂(配体)相结合的受体、例如肿瘤特异性抗原的特定肿瘤,所述的肿瘤特异性抗原包括、但不限于可应用于本发明的癌胚抗原、前列腺特异性抗原、酪氨酸酶、ras、sialyly lewis抗原、erb、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、MN、gp100、gp75、p97、蛋白酶3、粘蛋白、CD81、CID9、CD63、CD53、CD38、C0-029、CA125、GD2、GM2和O-乙酰基GD3、M-TAA、M-fetal或M-urinary。另一方面,靶向部分可以是肿瘤阻抑物、细胞因子、趋化因子、肿瘤特异性受体配体、受体、编程性细胞死亡诱导物或分化剂。
预计被靶向的肿瘤阻抑物蛋白包括、但不限于p16、p21、p27、p53、p73、Rb、维尔姆斯瘤(WT-1)、DCC、1型神经纤维瘤(NF-1)、vonHippel-Lindau(VHL)病肿瘤阻抑物、Maspin、Brush-1、BRCA-1、BRCA-2、多发性肿瘤阻抑物(MTS)、人黑素瘤gp95/p97抗原、肾细胞癌相关G250抗原、KS1/4全癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺特异性抗原、黑素瘤抗原gp75、CD9、CD63、CD53、CD37、R2、CD81、C0029、TI-1、L6和SAS。当然,它们仅是代表性的肿瘤阻抑物,预计本发明可以与本领域技术人员已知或称作肿瘤阻抑物的任意其它活性剂联用。
在本发明的优选实施方案中,靶向针对的是由癌基因(例如Bcl-2和/或Bcl-XL)表达的因子。它们包括、但不限于:酪氨酸激酶,包括膜相关和胞质形式,诸如Src族成员;丝氨酸/苏氨酸激酶,诸如Mos;生长因子和受体,诸如血小板衍生生长因子(PDDG)、SMALL GTPases(G蛋白),包括ras族;依赖细胞周期蛋白的激酶(cdk);myc族成员,包括c-myc、N-myc以及L-myc和bcl-2及家族成员。
可应用于本发明内容中的受体及其相关配体包括、但不限于叶酸受体、肾上腺素能受体、生长激素受体、黄体生成素受体、雌激素受体、表皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体等。
可应用于本发明靶向方面的激素及其受体包括、但不限于生长激素、促乳素、胎盘催乳激素、黄体生成素、促卵泡激素、绒毛膜促性腺激素、促甲状腺素、来普汀(leptin)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、血管紧张肽I、血管紧张肽II、α-内啡肽、α促黑激素(α-MSH)、缩胆囊素、内皮缩血管肽I、高良姜素(galanin)、肠抑胃肽(GIP)、胰高血糖素、胰岛素、糊精、促脂解素、GLP-1(7-37)后叶激素运载蛋白和促生长素抑制素。
此外,本发明预计可将维生素(脂溶性和非脂溶性维生素)用作靶向剂,靶向含有受体的细胞或者摄取这些维生素的细胞。特别优选用于该方面的是诸如维生素D和及其类似物、维生素E、维生素A等这样的脂溶性维生素,或诸如维生素C等这样的水溶性维生素。
在本发明的某些实施方案中,可将任意数量的癌细胞靶向部分与棉酚化合物结合。因此,与靶向部分结合的棉酚化合物可以特异性靶向癌细胞(即更加可能的情况是结合癌细胞,而不与健康细胞结合)。
在本发明优选的实施方案中,靶向部分通过短键(例如直接偶联)、中等长度键(例如使用小分子双功能连接物,诸如由Pierce ChemicalCompany销售的SPDP)或长键(例如由Shearwater Polymers销售的PEG双功能连接物)与棉酚化合物结合(例如共价结合或非共价结合)。
在某些实施方案中,棉酚化合物与树枝状聚合物(例如PAMAM)或脂质体或其它载体结合。本领域技术人员能够方便地设计利用树枝状聚合物多价结构的树枝状棉酚化合物分子。
在本发明优选的实施方案中,靶向剂是抗体或抗体的抗原结合片段(例如Fab单位)。例如,在许多癌(包括乳腺HER2肿瘤)表面上发现的被充分研究的抗原是仅在恶性肿瘤细胞中表达的糖蛋白p185(Press等《癌基因》(Oncogene)5:953[1990])。重组人源化抗-HER2单克隆抗体(rhuMabHER2)也显示可抑制过表达HER2的乳腺癌细胞的生长在晚期乳腺癌治疗的III期临床试验中对此抗体进行了评估(与常规化疗剂联合)(Pegran等《美国临床肿瘤协会学报》(Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.),14:106[1995])。Park等已经将rhuMabHER2的Fab片段与小的单层脂质体结合,然后使其装载化疗剂多柔比星(dox)并靶向至过表达HER2的肿瘤异种移植物(Park等《癌症通讯》(Cancer Lett.),118:153[1997]和Kirpotin等《生物化学》(Biochem.),36:66[1997])。这些装载有Dox的″免疫脂质体″与相应未装载靶向的dox的脂质体或游离dox相比,对肿瘤表现出增加的细胞毒性,与游离dox相比,系统性毒性降低。
可以制备抗体以靶向各种生物靶物(例如病原体、肿瘤细胞、正常组织)上的抗原或免疫原(例如肿瘤、组织或病原体特异性抗原)。这类抗体包括、但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库。
在某些优选的实施方案中,抗体识别肿瘤特异性表位(例如TAG-72(Kjeldsen等《癌症研究》(Cancer Res.)48:2214-2220[1988];美国专利US5,892,020、US5,892,019和US5,512,443);人癌抗原(美国专利US5,693,763、US5,545,530和US5,808,005);来自骨癌细胞的TP1和TP3抗原(美国专利US5,855,866);来自腺癌细胞的Thomsen-Friedenreich(TF)抗原(美国专利US5,110,911);来自人前列腺癌的″KC-4抗原″(美国专利US4,708,930和US4,743,543);人结肠直肠癌抗原(美国专利US4,921,789);来自囊腺癌(cystadenocarcinoma)的CA125抗原(美国专利US4,921,790);来自人乳腺癌的DF3抗原(美国专利US4,963,484和US5,053,489);人乳腺肿瘤抗原(美国专利US4,939,240);人黑素瘤的p97抗原(美国专利US4,918,164);癌或血清类粘蛋白相关抗原(CORA)(美国专利US4,914,021);与人鳞状细胞肺癌反应而不与人小细胞肺癌反应的人肺癌抗原(美国专利US4,892,935);人乳腺癌糖蛋白的T和Tn半抗原(Springer等《碳水化合物研究》(Carbohydr.Res.)178:271-292[1988]),MSA乳腺癌糖蛋白(Tjandra等《英国手术杂志》(Br.J.Surg.)75:811-817[1988]);MFGM乳腺癌抗原(Ishida等《肿瘤生物学》(Tumor Biol.)10:12-22[1989]);DU-PAN-2胰腺癌抗原(Lan等《癌症研究》(Cancer Res.)45:305-310[1985]);CA125卵巢癌抗原(Hanisch等《碳水化合物研究》(Carbohydr.Res.)178:29-47[1988]);YH206肺癌抗原(Hinoda等《癌症杂志》(Cancer J.),42:653-658[1988])。特别将上述每一篇参考文献引入本文作为参考。
本领域中公知的各种步骤可用于生产多克隆抗体。为了生产抗体,可以通过注射相当于所需表位的肽给各种宿主动物而进行免疫接种,包括、但不限于家兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在优选的实施方案中,所述的肽与免疫原性载体(例如白喉类毒素、牛血清清蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白[KLH])缀合。随宿主种类的不同,可将各种佐剂用于增加免疫反应,包括、但不限于:弗氏(完全和不完全)佐剂;矿物凝胶,诸如氢氧化铝;表面活性物质,诸如溶血卵磷脂、伯洛沙姆类多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚;和可能有用的人佐剂,诸如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacteriumparvum)。
为了制备单克隆抗体,可以使用通过培养物中连续的细胞系产生抗体分子的任意技术(例如,参见Harlow和Lane,《抗体实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual),Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。它们包括、但不限于最初由Kohler和Milstein(Khler和Milstein,《自然》(Nature),256:495-497 1975)开发的杂交瘤技术以及trioma技术、人B-细胞杂交瘤技术(例如,参见Kozbor等《今日免疫学》(Immunol.Today),4:72[1983])和用于产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等在《单克隆抗体与癌症疗法》(Monoclonal Antibody and CancerTherapy),Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96[1985])。
在本发明的其它实施方案中,可以使用最新技术在无菌动物中产生单克隆抗体(例如,参见PCT/US90/02545)。
按照本发明,可以使用人抗体,且可以通过使用人杂交瘤(Cote等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)80:2026-2030[1983])或通过体外用EBV病毒转化人B细胞(Cole等在《单克隆抗体与癌症疗法》(Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy)中所述,Alan R.Liss,pp.77-96[1985])得到该抗体。
根据本发明,针对生产单链抗体所述的技术(美国专利US4,946,778;引入本文作为参考)可稍作变动以用于产生特异性单链抗体。本发明的其它实施方案使用了针对构建Fab表达文库所述的技术(Huse等《科学》(Science)246:1275-1281[1989]),以便快速和便利地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。
可以通过公知技术生产含有抗体分子的独特型(抗原结合区)的抗体片段。例如,这类片段包括、但不限于:可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化而产生的F(ab’)2片段;可以通过还原F(ab’)2片段的二硫键而产生的Fab’片段;和可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而严生的Fab片段。
在生产抗体的过程中,可以使用本领域众所公知的技术完成对所需抗体的筛选(例如放射性免疫测定、ELISA酶联免疫吸附测定、″夹心式″免疫测定、免疫放射分析、免疫扩散测定、凝胶扩散沉淀素反应、原位免疫测定(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集试验(例如凝胶凝集试验、血细胞凝集试验等)、补体结合测定、免疫荧光测定、蛋白质A测定和免疫电泳测定等)。
就乳腺癌而言,可以用叶酸、EGF、FGF和针对肿瘤相关抗原MUC1、cMet受体和CD56(NCAM)的抗体(或抗体片段)靶向细胞表面。
用于鉴定和筛选合适的肽靶向部分的极为灵活的方法是噬菌体展示技术(例如,参见Cortese等《最新生物技术观点》(Curr.Opin.Biotechol.),6:73[1995]),该技术通常可以使用商购试剂盒实施。噬菌体展示步骤产生了与噬菌体表面结合的肽的大量多样化的组合文库,对这些肽筛选与固定化表面受体的紧密结合。紧密结合后,分离病毒构建体并测序以鉴定肽序列。使用最佳肽作为下一肽文库的起点重复该循环。最终鉴定合适的高亲和性肽,然后筛选生物相容性和靶特异性。按照这种方式能够产生可以与树枝状聚合物缀合的肽,从而产生对靶细胞受体(例如肿瘤细胞受体)或其它所需靶物具有高度特异性和亲和性的多价缀合物。
上述涉及的靶向手段是″预靶向″手段(例如,参见Goodwin和Meares,《癌症》(Cancer)(增刊)80:2675[1997])。这种策略的实例包括开始用肿瘤特异性单克隆抗体与链霉抗生物素的缀合物治疗患者。用适宜的生物素化清除剂从血流中除去剩余的可溶性缀合物。当仅剩下定位于肿瘤的缀合物时,导入连接棉酚的生物素化活性剂,它继而通过强而特异性的生物素-链霉抗生物素相互作用定位于肿瘤部位。
在本发明的某些实施方案中,所述的靶向活性剂(部分)优选是核酸(例如RNA或DNA)。在某些实施方案中,将核酸靶向部分设计为通过碱基配对而与特定核酸(例如染色体DNA、mRNA或核糖体RNA)进行杂交。在其它实施方案中,所述的核酸与配体或生物靶物结合。已经鉴定了结合下列蛋白的核酸:HIV的逆转录酶、Rev和Tat蛋白(Tuerk等《基因》(Gene),137[(1)]:33-9[1993]);人神经生长因子(Binkley等《核酸研究》(Nuc.Acids Res.),23(16):3198-205[1995]);和血管内皮生长因子(Jellinek等《生物化学》(Biochem.),83(34):10450-6[1994])。尽管许多方法是本领域中公知的,但是优选通过SELEX程序鉴定可结合配体的核酸(例如,参见美国专利US5,475,096、US5,270,163和US5,475,096以及PCT公开号WO97/38134、WO98/33941和WO99/07724,将全部文献引入本文作为参考)。
VIII.药物制剂、给药途径和给药方案
为了解释治疗剂的投递,下列讨论主要集中在用于治疗癌症的棉酚化合物和多西他赛的投递上,不过,本发明并不限于包括共同给予多西他赛与棉酚化合物的组合物和方法。
本发明提供了可包括至少一种棉酚化合物且在优选的实施方案中包括至少一种常用抗癌药的药物组合物,可以将棉酚化合物和抗癌药溶在任意的无菌生物相容性药物载体、包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水中进行给药。在某些实施方案中,本发明的药物组合物可以含有一种活性剂(例如棉酚化合物)。在其它实施方案中,该药物组合物可以含有至少两种活性剂(例如棉酚化合物和一种或多种常用抗癌药)的混合物。在其它实施方案中,本发明的药物组合物含有在一种或多种下列条件下对患者给药的至少两种活性剂(例如棉酚化合物和一种或多种常用抗癌药):不同周期、不同期限、不同浓度、不同给药途径等。
本发明的组合物和方法可用于治疗特征在于Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Al/BFL-1和BOO-DIVA等)过表达的疾病或改变相关的生理状态。本发明提供了通过给予抗编程性细胞死亡Bcl-2族蛋白拮抗剂而诱导编程性细胞死亡的方法,所述的Bcl-2族蛋白包括、但不限于Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Al/BFL-1和BOO-DIVA。
本发明涉及按照可接受的药物投递方法和制备技术给予棉酚化合物,且在某些实施方案中还包括给予一种或多种常用抗癌药。例如,可以经静脉内对受治疗者给予溶于诸如生理盐水这样的药物上可接受载体的棉酚化合物和合适的抗癌药。可以使用用于胞内投递药物活性剂的标准方法(例如通过脂质体投递)。这类方法对本领域技术人员而言是众所周知的。
在某些实施方案中,本发明的制剂可用于非肠道给药,诸如静脉内、皮下、肌内和腹膜内给药。还可以使用如上所述的基因疗法进行某些抗癌药(例如治疗多肽)的治疗性共同给药。
正如药物领域中众所周知的,用于任何一位患者的剂量取决于许多因素,包括患者的身材、体表面积、年龄、所给予的具体化合物、性别、给药时间和途经、一般健康情况和与同时给予的其它药物的相互作用。
因此,在本发明的某些实施方案中,对患者给予单独的棉酚化合物,或将棉酚化合物与一种或多种常用抗癌药(例如核苷酸序列、药物、激素等)联合给药,或制成混合了赋形剂或其它药物上可接受载体的药物组合物给药。在本发明的一个优选实施方案中,所述的药物上可接受的载体是药学上惰性的。
随所治疗疾病的不同,可以配制这些药物组合物并经全身或局部给药。可以在最新版《Remington氏药物科学》(″Remington’sPharmaceutical Sciences″)(Mack Publishing Co,Easton Pa.)中找到配制和给药技术。例如,合适的途经包括:口服给药或跨粘膜给药;以及非肠道给药,包括肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内或鼻内给药。
为了进行注射,可以在水性溶液中,优选在生理上相容的缓冲液(诸如Hanks溶液、林格液或生理缓冲盐水)中将本发明的药物组合物配制成水溶液。为了进行组织或细胞给药,将适于特定屏障的渗透剂用于制剂。这类渗透剂是本领域中普遍公知的。
在其它实施方案中,可以使用本领域中众所周知的药物上可接受的载体将本发明的药物组合物配制成适合于口服给药的剂型。这类载体能够使所述药物组合物配制成由所治疗的患者经口腔或鼻部摄取的片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、悬浮剂等。在优选的实施方案中,通过口服对患者给予棉酚化合物。
适用于本发明的药物组合物包括含有可有效达到所需目的的量的活性组分的组合物。例如,棉酚化合物的有效量可以是可诱导与正常非病理性实例的特定细胞或组织相比Bcl-2族蛋白的水平有所升高的细胞或组织中编程性细胞死亡的用量。确定有效量是本领域技术人员的能力范畴,可以根据本文提供的公开内容尤其容易确定。
除活性组分外,优选的药物组合物还可以含有药物上可接受的载体,所述载体包括有利于将活性组分加工成可以作为药物使用的制剂的赋形剂和助剂。配制成用于口服给药的制剂可以是片剂、锭剂、胶囊或溶液形式。
可以按照本身公知的方式(例如通过常规混合、溶解、制粒、制锭、磨光、乳化、包囊、包埋或冻干工艺)生产本发明的药物组合物。
用于非肠道给药的药物组合物包括水溶性形式的活性化合物水溶液。另外,可以制备活性化合物的混悬液,并可以制备成合适的注射油混悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括:脂肪油,诸如芝麻油;或合成脂肪酸酯类,诸如油酸乙酯或甘油三酯;或脂质体。含水注射混悬液可以含有可增加该混悬液粘度的物质,诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。所述混悬液还可以任选含有合适稳定剂或可增加所述化合物溶解度的试剂,以制成高度浓缩溶液。
可以通过将活性化合物(例如棉酚化合物)与固体赋形剂合并、任选研磨所得混合物,且如果需要,在加入适宜助剂后加工颗粒混合物而得到片芯或锭芯,由此获得口服应用的药物制剂。合适的赋形剂有:碳水化合物或蛋白质填充剂,诸如糖,包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨醇;来自玉米、小麦、稻、马铃薯等的淀粉;纤维素,诸如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠;和树胶,包括阿拉伯胶和黄蓍胶;和蛋白质,诸如明胶和胶原蛋白。如果需要,可以加入崩解剂或增溶剂,诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐、诸如藻酸钠。
本发明组合物的可吞咽制剂可以进一步包括美国农业部(UnitedStates Department of Agriculture)对包括一般认为安全(GRAS)的食品和物质批准的任意物质,诸如食品添加剂、香料、着色剂、维生素、矿物质和植物营养物。本文所用的术语植物营养物指的是分离自植物的具有生物作用的有机化合物,包括、但不限于下列类化合物:异黄酮类化合物、寡聚原花色素、吲哚-3-甲醇、1-异硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷(sulforaphone)、纤维配体、植物甾醇、阿魏酸、anthocyanocides、三萜类、ω3/6脂肪酸、聚乙炔(polyacetylene)、醌类、萜类、cathechins、棓酸酯和quercitin。
给锭芯提供合适的包衣层,诸如浓糖溶液,该溶液中还可以含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波醇凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液(lacquer solutions)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或锭剂包衣层中加入染料或色素以鉴别产品或表征活性化合物的量(即剂量)。
可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的适于推入的胶囊和由明胶和诸如甘油或山梨醇这样的包衣材料制成的密封软胶囊。所述的适于推入胶囊可以含有混合了诸如乳糖或淀粉这样的填充剂或粘合剂、诸如滑石或硬脂酸镁这样的润滑剂和任选的稳定剂的活性组分。在软胶囊中,可以将活性化合物与或不与稳定剂一起溶于或悬浮于适宜液体,诸如脂肪酸、液体石蜡或液体聚乙二醇。
可以制备用药物上可接受载体配制的包括本发明化合物的组合物、将它们置于适宜容器中并标记治疗的适应疾病。就棉酚化合物而言,标记上指定的疾病可以包括治疗与错误调节编程性细胞死亡、过度增生性疾病、癌症、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、变性疾病和血管疾病相关的疾病。可以将该药物组合物制成盐,且它们可以与许多酸成盐,包括、但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。与相应的游离碱形式相比,盐一般更易溶于水或其它质子溶剂。在其它情况中,优选的制剂可以是含有1mM-50mM组氨酸、0.1%-2%蔗糖、2%-7%甘露糖醇、pH范围在4.5-5.5的冻干粉,在使用前与缓冲剂合并。
就用于本发明方法的任意化合物而言,最初可以根据细胞培养试验估计治疗有效剂量。然后优选在动物模型(特别是鼠模型)中确定剂量,以获得在具有升高水平的Bcl-2族蛋白的细胞中诱导编程性细胞死亡的所需循环浓度范围。治疗有效剂量指的是改善疾病状态(例如未受调节的细胞增殖性疾病,包括、但不限于癌症)的棉酚化合物(在某些实施方案中包括一种或多种常用抗癌药)的用量。可以通过标准药物步骤在细胞培养物或实验动物中测定这类化合物的毒性和治疗功效,例如测定LD50(达50%群体致死的剂量)和ED50(对50%群体治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比为治疗指数,可以将其表示为LD50/ED50比。优选表现出高治疗指数的化合物。从细胞培养试验和进一步的动物研究中得到的数据可以用于确定例如哺乳动物应用的剂量范围(例如人、马(Equus caballus)、猫(Felis catus)和家犬(Canisfamiliaris)等)。这类化合物的剂量优选在包括ED50且几乎没有或无毒性的循环浓度范围内,然而,本发明并不限于该范围。该剂量可在所述范围内改变,这取决于所用的剂型、患者的敏感性和给药途径。
确切剂量由各位临床医师根据所治疗的患者进行选择。可对剂量和给药进行调节,以提供足够水平的活性部分或维持所需效果。可以考虑的其它因素包括疾病状态的严重程度、患者的年龄、体重和性别、饮食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感性和对疗法的耐受性/反应。可以每3-4周、每周一次或每两周一次给予长效药物组合物,这取决于具体制剂的半衰期和清除速率。可以每天给予一次或每天给予几次其它药物组合物。
正常剂量可以在0.1-100,000微克之间改变,总剂量可高达约为1g,这取决于给药途径。文献中提供了送递药物的具体剂量和方法的指导(参见美国专利US4,657,760、US5,206,344或US5,225,212,将全部文献引入本文作为参考)。对患者骨髓给予某些活性剂可能要求以不同于静脉内注射的方式进行送递。
本发明的优选实施方案提供了对患者给予有效量的棉酚以抑制细胞(例如癌细胞)增殖的药物组合物和方法。在某些其它优选的实施方案中,本发明进一步提供了除棉酚外还对患者共同给予有效量的至少一种常用抗癌药以使细胞(例如癌细胞)增殖受到抑制的药物组合物和方法。
在优选的实施方案中,所述的受治疗者患有特征在于Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Al/BFL-1和BOO-DIVA等)过表达的疾病。在某些实施方案中,特征在于Bcl-2族蛋白过表达的疾病包括、但不限于过度增生性疾病、癌症、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、变性疾病和血管疾病。在其它实施方案中,适合于用本发明组合物和方法治疗的癌症包括、但不限于乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑素瘤、卵巢癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、骨髓瘤、肾上腺癌、白血病、神经母细胞瘤和成胶质细胞瘤。然而,本发明并不限于治疗任何具体类型的癌症。
在某些实施方案中,通过下列步骤选择怀疑特征在于具有升高水平的Bcl-2族蛋白、适合于用本发明治疗的疾病:获得关注的怀疑具有高水平Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Al/BFL-1和BOO-DIVA等)的样品(例如细胞、组织、体液等);使用一种或多种充分建立的免疫组织化学技术(例如ELISA和蛋白质印迹等)测定样品中Bcl-2族蛋白的水平;并将该样品中Bcl-2族蛋白的水平与相关参比的非病理性样品中的Bcl-2族蛋白水平进行比较。在其它实施方案中,通过比较样品(例如细胞、组织、体液等)中与相关非病理性样品中标记的水平相比直接或间接显示该样品中Bcl-2族蛋白的水平升高的一种或多种标记(例如多核苷酸、多肽、脂类等)的水平,来选择怀疑特征在于具有升高水平的Bcl-2族蛋白的疾病。在其它实施方案中,怀疑特征在于具有升高水平的Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Al/BFL-1和BOO-DIVA等)的疾病选自对用一种或多种常用抗癌疗法(例如化疗、放疗和/或外科手术)治疗无反应或对其治疗停止反应的疾病。
本发明并不限于为将活性剂送递给受治疗者所选择的给药途径。实际上,涵盖许多合适的给药途径,对它们的选择属于本领域技术人员的范围。
在某些优选的实施方案中,对患者给予剂量范围约为1-200mg/天、约5-50mg/天且最优选约10-40mg/天的棉酚化合物。在特别优选的实施方案中,对患者给予(例如经口服)证实具有一定生物活性(例如Rb和细胞周期蛋白D1水平改变)的可耐受日剂量(例如30-40mg/day)的棉酚化合物。
在其它优选的实施方案中,对患者联合给予紫杉烷(例如多西他赛)与棉酚化合物。传统的多西他赛给药方案为80-100mg/m2q3周。然而,最新研究提示可以以q周方案安全地给予紫杉烷,其中允许较高的剂量强度。(例如,参见J.D.Hainsworth等《临床肿瘤学杂志》(J.Clin.Oncology),16:2164-2168[1998];J.D.Hainsworth等《临床肿瘤学杂志》(J.Clin.Oncology),19:3500-3505[2001];和C.Kouroussis等《癌症化疗药物》(Cancer Chemo.Pharm.)46:488-492[2000])。与给予紫杉烷相关的患者毒性包括中性白细胞减少、虚弱、脱发、过敏反应、皮肤毒性和水肿。本发明优选的实施方案提供了每周给予紫杉烷以减轻患者毒性而保持药物功效的方法。在其它实施方案中,预计在用公开的棉酚化合物治疗患者的过程中比每周一次更为频繁地给予紫杉烷(例如多西他赛)可以产生协同作用。
尽管本发明既不限于任何特定的机理、也不限于对给予的活性剂作用的任何理解,但是下列实施例提供了对测定棉酚化合物与一种或多种与棉酚共同给予的候选抗癌药之间可能存在的药物相互作用的典型测试步骤的描述。
多西他赛由特异性细胞色素p450酶CYP3A4广泛代谢。对多西他赛得到的药动学数据表明它的清除在患者之间具有较大变异性。多西他赛极差的清除率可以使曲线下的面积(AUC)增加,由此对患者的毒性更大。几种研究已经报导了棉酚可减少细色素P-450和混合功能的氧化酶,不过,这些结果已经受到置疑,且没有特别针对该问题进行人体研究。因此,有可能棉酚可以在某些患者中抑制CYP3A4活性并导致毒性多西他赛累积。
在一个实施方案中,对患者给予日剂量的棉酚、持续1周,此后他们接受首次剂量的多西他赛。在患者接受首次剂量的多西他赛后评价多西他赛在患者系统中的药动学分布。(参见R.Bruno等《临床肿瘤学杂志》(J.Clin.Oncology),16:187-196[1998])。开始给予约15mg/m2/周的减剂量多西他赛。逐步使多西他赛的剂量增加至约35mg/m2/周的最大耐受剂量。同时收集棉酚化合物给药对CYP3A4表型化表达的作用的有关信息。
使用红霉素呼吸试验(ERMBT)可容易和再现地测定CYP3A4的表型化表达。(例如,参见,P.Watkins,《遗传药理学》(Pharmacogenetics)4:171-184[1994];和J.Hirth等《临床癌症研究》(Clin.CancerRes.),6:1255-1258[2000])。已经证实ERMBT试验可以预测CYP3A4底物的稳态谷血药浓度。因此,本发明的某些实施方案涉及使用用于测定棉酚与多西他赛之间可能存在的药物相互作用的ERMBT方共同给予棉酚化合物和紫杉烷(例如多西他赛)。本领域技术人员会理解可以将类似的测试方法用于测定棉酚化合物与共同给予的候选化合物之间可能存在的药物相互作用。
在某些实施方案中,对从用本发明方法和组合物治疗后或治疗过程中的患者获得的样品应用标准免疫组织化学技术以便测定Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2、Bcl-XL、和Bax等)水平的改变。例如,在某些实施方案中,将使用针对Bcl-2(DAKO,Carpinteria,CA)、Bcl-XL和/或Bax(Zymed,South San Francisco,CA)抗体的免疫组织化学技术用于测定患者样品中这些Bcl-2蛋白的水平。在优选的实施方案中,使用本领域技术人员已知的充分建立的标准分析从免疫组织化学研究中得到的结果,将任何胞质或核染色看作是阳性的。在每种情况中通过对至少1,000个肿瘤细胞进行计数可确定Bcl-2、Bcl-XL和Bax的表达水平并表示为百分比。当对Bcl-2和Bcl-XL而言阳性细胞百分比大于25%、对Bax而言大于50%时,表达可看作是高水平的。(例如,参见,G.Rassidakis等《美国病理学杂志》(Amer.J.Path.),159:527-535(2001);和S.Shi等《组织化学与细胞化学杂志》(J.Histochem.Cytochem.),39:741-748[[1991])。在其它实施方案中,获得全血的间断样品以用于对外周血淋巴细胞(PBLs)中的Bcl-2和Bcl-XL表达进行荧光激活细胞分选(FACS)分析和对循环的上皮细胞进行免疫磁性筛选。
在优选的实施方案中,当建立了联合给予最大耐受剂量的棉酚化合物(特定的日剂量,例如30mg/天)与特定的抗癌组合疗法候选物时,获得了给药研究的初步端点。在某些实施方案中,当指定样品(例如细胞、组织或流体样品)在患者受到研究的任意时间点显示出>500个中性白细胞或属于3或4级的任意其它毒性时,即建立了剂量限制毒性(dose-limiting toxicity,DLT)。
在某些其它实施方案中,为了评价剂量增加,对于从每一剂量水平开始的两位患者最少需要9周的治疗。将最大耐受剂量(maximumtolerated dose,MTD)定义为33%的患者经历DLT的剂量。如果特定剂量没有达到MTD,那么将该剂量水平定义为MTD。在优选的实施方案中,按照称作时间-事件CRM或(TITE-CRM)(K.Cheung和R.Chappell,《生物统计学》(Biometrics)[印刷中])的连续再评价法(ContinualReassessment Method)中所述的标准对患者给予指定剂量(J.O’Quigley等《生物统计学》(Biometrics)46:33-48[1990])。简单的说,TITE-CRM法假定了一种毒性反应发生时间作为剂量函数的模型,并在给新患者指定剂量水平时采用从在本试验中登记的全部患者中获得的信息。因为该方法在每一剂量下治疗的患者数量方面极为灵活,所以在整个试验过程中可以连续补充受治疗者,而根本不用暂停实验,但条件是以与安全性分布一致的剂量治疗患者。
在优选的实施方案中,在治疗后,使患病细胞和组织进行细胞活力、诸如形态改变这样的编程性细胞死亡诱导、DNA完整性、线粒体途经、Bcl-2族蛋白表达改变和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化以及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶上游和下游效应物和抑制剂试验。本领域技术人员易于设计和完成在治疗细胞和组织中测试它们和其它一些细胞和生化参数的试验。
实施例
下列实施例用来证实和进一步解释本发明的某些优选实施方案,但不应理解为限定本发明的范围。
实施例1
同源性模型化
人Bcl-2的序列获自基因库(Gene Bank)(进入号gi4557355)(SEQ ID NO:1)。将与Bcl-2相比具有45%氨基酸序列同一性、56%序列相似性和3%缺口的Bcl-XL的NMR结构(pdb代码:来自蛋白质数据库的1BXL)用作模板。使用同源性-模型化程序MODELLER(4.0版)构建Bcl-2的结构。(A.Sali等《结构、功能和遗传》(Structure,Function,and Genetics),23:318-326[1995];和A.Sali,《最新生物技术观点》(Curr.Opin.Biotech.),6:437-451[1995])。使用分子动态程序CHARMM(27b2版)进行进一步精修。(B.R.Brooks,《计算机化学杂志》(J.Comput.Chem.),4:187-217[1983])。使用QUANTA程序(Molecular Simulations Inc.,San Diego,CA)将氢原子分配到模型化结构中。以与复合了Bak BH3肽的Bcl-XL的NMR结构相同的方向将Bak BH3肽置于Bcl-2 BH3结构域结合位点内(蛋白质数据库中的1BXL)。(S.Michael等《科学》(Science),275:983-986[1997])。通过将复合物结构插入60直径的TIP3P水球体并除去含有与任意蛋白质重原子相距小于2.5的重原子的溶剂分子而使所述的复合物结构溶剂化。
使用从QUANTA 98中的MSI CHARMM力场(ref 23)中设定的全原子参数进行MD模拟,介电常数ε=1且恒定温度T=300K。将使用1fs时间步骤的蛙跳法应用于数字积分。用具有8-12切换范围的力切换法处理远程静电力,(参见B.R.Brooks等《计算机化学杂志》(J.Comput.Chem.),4:187-217[1983])。使用漂移法和12的截止值计算范德华力。将非键列表保持至14并逐步校正。通过使用CHARMM中涉及的球形混合平均势场保持溶剂水不蒸发。(B.R.Brooks,文献同上)。应用Steepest Descent法进行100个循环、应用Adopted-BasisNewton Raphson法进行另1000个循环,使溶剂化蛋白质的能量最小化。在该步骤后进行3.0ns MD模拟。这种模拟在国家健康研究院(National Institutes of Health)高级生物医药计算机中心(Advanced Biomedical Computing Center)的Origin2000计算机上进行。
实施例2
Bcl-XL蛋白的表达和纯化
由pET15b表达载体(Novagen,Darmstadt,Germany)过表达带有N-末端His-tag的重组Bcl-XL蛋白。在这种构建体中,除去推定的C-末端膜锚定区(残基214-237)和螺旋1与螺旋2之间的环(残基49-88),以有利于蛋白纯化。事先已证实这种环对该蛋白质的抗编程性细胞死亡活性并非必不可少。(参见,S.W.Muchmore等《自然》(Nature),381:335-341[1996])。目前的Bcl-XL构建体从1升细胞培养物中产生约20mg的纯化Bcl-XL蛋白。
按照M.Jansson等在《生物分子NMR杂志》(J.Biomol.NMR),7:13l-141(1996)和M.L.Cai等在《生物分子NMR杂志》(J.Biomol.NMR),11:97-102(1998)中所述的方法,将用于NMR研究的蛋白样品用15N均匀标记以便筛选,用15N和13C均匀双标记以便结构表征。
实施例3
Bcl-2族蛋白在人癌细胞中的表达
选择表达不同水平Bcl-2和/或Bcl-X1蛋白的几种癌细胞系(表3)
以便测试棉酚抑制人癌细胞增殖的活性。
表3
癌细胞系 | Bcl-2表达 | Bcl-XL表达 | |
I组 | T47乳腺癌MDA-453乳腺癌 | ±- | ++++++ |
II组 | MDA-435乳腺癌 | +++ | ± |
III组 | MDA-231乳腺癌 | +++ | +++ |
IV组 | WI-38正常细胞SK-MEL-28黑素瘤 | -± | -- |
使用表3中所示的充分表征的癌细胞系进行的实验可用于测试棉酚作为潜在抗癌药的几种重要特征。首先,预计棉酚在使用表达不同水平Bcl-2族蛋白的许多癌细胞类型进行的结合试验中的活性和选择性可指示适合用棉酚治疗的适宜候选癌症类型的范围。其次,在具有高Bcl-2和高Bcl-XL水平的癌细胞中测试棉酚将指示抑制单独一种蛋白质是否足以诱导编程性细胞死亡或同时抑制两种蛋白质是否可以达到更强的功效。第三,使用表达不同水平Bcl-2族蛋白的癌细胞类型进行的试验将指示棉酚在具有低Bcl-2和低Bcl-XL表达的癌细胞中是否显示出选择性。
实施例4
基于荧光偏振的结合试验
本发明使用已建立的基于荧光偏振(FP)的灵敏的定量体外结合试验,以测定小分子抑制剂(例如棉酚化合物)与Bcl-2和Bcl-X1的结合亲和性。(例如,参见J.L.Wang等《癌症研究》(Cancer Res.),60:1498-1502[2000];J.L.Wang等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),97:7124-7129[2000];A.Degterev等《国家细胞生物学》(Nat.Cell Biolog.),3:173-182[2001];和I.J.Enyedy等《药物化学杂志》(J.Med.Chem.),44:4313-4324[2001])。本试验监测由重组Bcl-2或Bcl-XL取代荧光标记的BH3结构域肽。一旦肽结合Bcl-2或Bcl-XL蛋白,则荧光偏振会增强。当小分子抑制剂与Bcl-2或Bcl-XL结合并取代了荧光标记的BH3结构域肽时,荧光偏振会减弱。测定与两种蛋白质的结合亲和性对测定其选择性而言是重要的。尽管Bcl-2或Bcl-XL的结构极为相似,但是在这两种蛋白质之间存在一定差异。Bcl-2/Bcl-XL的小分子抑制剂在这两种蛋白质之间可能显示出选择性。因此,使用本文所述的NMR法进一步确定和证实棉酚与Bcl-2和Bcl-XL结合。
在200μM下对BclL-2抑制剂(例如棉酚及其对映体、衍生物和药物上可接受的盐)进行最初的筛选。如果观察到抑制剂的显著抑制作用(大于50%),则测定其IC50值。将5ml溶于反应缓冲液的测试化合物加入到含有相同浓度的Bcl-2或Bcl-XL和示踪物的孔中。所有化合物中DMSO的终浓度应小于0.5%。在室温下保温10分钟后读取最终的读数。为了测定最初活性化合物的IC50,使用1nM-200μM之间的9-10个浓度。将未标记的Bak肽用作阳性对照,而将无活性的化合物用作阴性对照。
在一个实施方案中,如下进行Bcl-2的荧光偏振试验。合成并在氨基末端标记荧光素标记的16肽示踪物Flu-Bak-BH3(来源于Bak BH3结构域的序列GQVGRQLAIIGDDINR(SEQ ID NO:2))。融合了GST的46-kDa重组可溶性Bcl-2蛋白商购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。该反应在含有10μl 1x磷酸缓冲盐水、5μlGST-Bcl-2蛋白和5μl肽示踪物的每孔20μl总体积中进行。将该反应体系在室温下保温20分钟。使用Ultra Reader(Tecan U.S.Inc,Research Triangle Park,NC)读取485nm和535nm处的读数。通过分析经背景、缓冲液、Bcl-2蛋白、示踪物和Bcl-2蛋白与示踪物混合物获得的最强和最弱信号进行一系列证明实验。通过对5.4nM-540nM的浓度范围的Bcl-2蛋白和0.145nM-1,450nM浓度范围的荧光示踪物进行滴定,测定Bcl-2蛋白与荧光素标记的16肽之间的结合Kd。在290nM荧光示踪物和270nM Bcl-2蛋白的终浓度下得到最佳结合。为了验证这种特异性,用未标记的16-mer肽竞争荧光标记的肽的结合。数据证实,未标记的16-mer肽能够消除标记示踪物的结合,其中IC50约为0.3μM,该值与文献中报导的数值近似。
在200μM下对棉酚和棉酚类似物进行初步筛选。将5微升溶于反应缓冲液的测试化合物加入到含有此前测定的相同浓度的示踪物和Bcl-2的各孔中。所有化合物中的DMSO终浓度均小于1%。在室温下保温10分钟后读取最终的读数。为了测定活性化合物的IC50,从200μM开始制备一式三份的6-7点连续稀释液。
细胞和试剂。人乳腺癌细胞系(T47D、MDA-231、MDA-453)和人白血病细胞HL-60获自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(ATCC)。使所有肿瘤细胞系生长并维持在含有10%FCS的RPMI 1640培养基中,但MDA-MB-231除外,它使用Dulbecco改进的Eagle培养基作为基础培养基。使培养物维持在37℃和5%CO2下的加湿培养箱中。
实施例5
通过NMR证实棉酚与Bcl-XL的结合
使用高分辨NMR技术测定棉酚与Bcl-XL的结合。在pH7.2下进行NMR实验,所以将带有循环水(water flip back)的脉冲场梯度(PFG)HSQC用于使信号强度得到最大化(S.Grzesiek和A.Bax.,《美国化学协会杂志》(J.Am.Chem.Soc.),115:12593-12594[1993];和G.S.Sheppard等,《美国化学协会论文摘要》(Abstracts ofPapers of the Amer.Chem.Soc.),213:81[1997]),使来自水信号的破坏最小化。在添加浓抑制剂溶液之前(游离Bcl-XL)和之后记录Bcl-XL的HSQC光谱。然后将两光谱进行比较,以便鉴定通过添加所述抑制剂引起的化学漂移。使用nmrPipe、pipp和nmrDraw软件进行数据加工(参见D.S.Garrett等《磁共振系列杂志》(J.Magn.Reson.Ser.),B95:214-220[1991];和F.Delaglio等《生物分子NMR杂志》(J.Biomol.NMR),6:277-293[1995])。将漂移峰与分配表进行交叉参考,揭示出受抑制剂的存在影响的残基。
实施例6
通过NMR测定棉酚与Bcl-XL的结合亲和性
对Bcl-XL进行类似的HSQC实验,以便通过滴定其从nM-mM的浓度而获得小分子抑制剂的结合亲和性。由于在NMR时标的快速交换极限中小分子抑制剂可结合Bcl-XL蛋白,所以随着所述抑制剂的量增加,某些峰漂移以逐步方式发生最大移位。分析化学位移值的改变与抑制剂浓度而得到其Kd值。(例如,参见P.E.Johnson等《生物化学》(Biochemistry),35:13895-13906[1996])。
实施例7
对棉酚诱导的编程性细胞死亡机理的深入研究
进行一系列生物化学试验以便确定棉酚化合物作为Bcl-2族蛋白(例如Bcl-2和/或Bcl-XL)小分子抑制剂的作用机理。尽管理解机理对实施本发明而言并非必不可少,且本发明并非限于该机理,但是预计理解棉酚化合物对过表达Bcl-2族蛋白的细胞和组织起作用的机理对于本发明而言是有利的。
测定用不同剂量棉酚化合物处理细胞不同次数后其中Bcl-2蛋白的表达和磷酸化状态。然后特别通过特异性抗体、使用蛋白质印迹分析测定Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-Xs、Bak、Bad、Bax、Bid的表达水平。使用蛋白质印迹、应用识别磷酸化蛋白的特异性抗体测定诸如Bcl-2、Bcl-XL和Bad这样蛋白质的磷酸化状态。
通过几种方法检验棉酚对细胞线粒体的作用。最重要的试验是细胞色素c释放和成孔试验。用抑制剂将细胞处理24-48小时,并按R.M.Kluck等在《科学》(Science),275:1132-1136(1997)中所述的方法稍作改动后进行细胞分级分离。简单的说,采集细胞,并用冰冷的PBS洗涤一次,重新悬浮于1ml冰冷缓冲液C(pH7.4的10mMHepes-KOH、0.42M NaCl、2.5%(v/v)甘油、1.5mM MgCl2、0.5mM EDTA钠、0.5mM EGTA、1mM二硫苏糖醇)和蛋白酶抑制剂混合物(PIM)中。通过15次经过22号针头使细胞混悬液在冰上匀浆化。在4℃下将匀浆物以750g离心两次10分钟以除去核。在4℃下以10,000g将去核后的上清液级分离心15分钟,使所得富集线粒体的沉淀重新悬浮于100ml缓冲液C+PIM(冷)中。在4℃下以10,000g将除去线粒体后的上清液级分离心1小时以除去膜污染物,并将所得上清液(可溶性部分)用于胞质细胞色素-c释放检测,所述的沉淀是线粒体膜(重膜蛋白)部分。使可溶性级分蛋白和等量的重膜蛋白进行SDS-PAGE,并通过蛋白质印迹、使用针对细胞色素c(Becton Dickinson,FranklinLakes,NJ)、电压依赖性阴离子通道(VDAC)(Calbiochem,La Jolla,CA)、Smac和AIF(编程性细胞死亡诱导因子)(Santa CruzBitoechnology,Santa Cruz,CA)的抗体进行分析。该步骤通过三种线粒体途经测定了用棉酚化合物处理细胞(例如癌细胞)后编程性细胞死亡的信号传导:cyto-c释放、Smac释放和AIF释放。
通过采集并用PBS洗涤经处理的细胞、在处理后悬浮于25mMHEPES(pH7.5)、5mM MgCl2、5mM EDTA,、5mM二硫苏糖醇、2mM苯甲基磺酰氟、10g/mL胃酶抑制剂A和10g/mL亮抑蛋白酶肽中,从而测定天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的活化。然后使经处理的细胞裂解。通过在4℃下以12000xg离心20分钟而净化细胞裂解物。通过荧光CaspACE试验系统(Promega Corp.,Madison,WI)测定上清液中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1、-2、-3、-6、-8和-9的活性。简单的说,在30℃下,将通过二辛可宁酸(bicinchoninic acid)试验(Promega Corp.)测定为50mg总蛋白与50mM底物Ac-YVAD-AMC、Ac-VDVAD-AMC、Ac-DEVD-AMC、Ac-VEID-AMC、Ac-IETD-AMC或AC-LEHD-AMC一起保温1小时。通过使用荧光分光光度计(HitachiF-4500)、按照G.Denecker等在《细胞分子生命科学》(Cell Mol.LifeSci.),58:356-370(2001)和V.M.Kolenko等《编程性细胞死亡》(Apoptosis),5:17-20[2000])中所述在360nm的激发处和460nm的发射处测定甲基香豆基-7-胺(AMC)的释放。
使用标准天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂试验测定天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂(例如Z-VAD-FMK,非特异性,Z-DEVD-FMK,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3、-6、-7、-8和-10,以及Z-LEHD-FMK,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9)对棉酚化合物活性的作用。所有这些天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂均可商购(Enzyme System Products,Livermore,CA)。
实施例8
细胞存活试验
将细胞接种在24或96-孔平板上,用培养基制备2-10倍棉酚化合物稀释液。通过用棉酚化合物将细胞处理24小时测定对细胞存活的抑制,测定方法是锥虫蓝试验。通过用抑制剂将细胞处理3-6天测定对细胞生长的抑制,测定方法是MTT试验。
MTT试验是用于获得细胞存活力测定值的快速、准确和便利的方法。MTT试验首先由Mosmann开发(Mosmann,《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Meth.),65:55[1983])。它是许多实验室用于获得毒性结果的简单显色试验(例如,参见,Kuhlmann等《毒理学学报》(Arch.Toxicol.),72:536[1998])。简单的说,线粒体产生ATP,为细胞提供足够的能量。为了实现该目的,线粒体将丙酮酸代谢成乙酰辅酶A。在线粒体中,乙酰辅酶A与三羧酸循环中的各种酶反应而生成ATP。特别可用于MTT试验的酶之一是琥珀酸脱氢酶。MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2-二苯基四唑鎓溴化物)是由琥珀酸脱氢酶裂解成紫色甲产物的黄色底物。颜色的改变可显示线粒体功能的改变。未存活的细胞不能产生甲(formazan),因此产生的量与存活细胞的量直接相关。将540nm处的吸光度用于确定甲产物的量。
可以将体外试验结果与体内毒性试验进行比较,以便外推至动物存活的条件。一般来说,评价来自单剂量物质的急性毒性。在某些实施方案中,在14天内监测动物的任何毒性征兆(体温升高、呼吸困难、死亡等)。一般来说,急性毒性标准是半数致死剂量(LD50),它是杀死半数治疗群体的预计剂量。通过使测试动物在受控条件下接触几何级数的剂量而测定该剂量。其它试验包括亚急性毒性测试,该试验测定动物对不超过14天重复剂量的棉酚化合物(或一种或多种常用抗癌药)的反应。亚慢性毒性测试包括将重复剂量测试90天进行测试。某些慢性毒性测试与亚慢性测试类似,但可以持续90天期限以上。还可以进行体内测试以便测定对某些组织的毒性。例如,在本发明的某些实施方案中,测定(例如通过检测肿瘤组织大小和/或生长的改变)肿瘤毒性(即本发明组合物对肿瘤组织存活的作用)。
在用抑制剂处理细胞后,对细胞形态进行定性评价,以便确定与诸如细胞膨胀、核膨胀、膜起泡、液泡化和编程性细胞死亡体形成这样的编程性细胞死亡相关特征。
在某些实施方案中,通过使用TUNEL试验检测DNA片段化情况而对编程性细胞死亡进行DNA水平检测。当细胞发生编程性细胞死亡时,编程性细胞死亡内切核酸酶不仅通过产生传统DNA梯度而影响细胞DNA,而且在这些DNA片段的末端产生游离3’-OH基。用TdT-FragFLTMDNA片段化试剂盒(Oncogene,Boston,MA)对这些基团进行末端标记,以便使用基于分子生物学的、末端标记、组织化学或细胞化学技术检测编程性细胞死亡细胞。本试验的原理是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)可以与响应于编程性细胞死亡信号而产生的DNA片段的暴露3’-OH端结合,并催化生物素标记和未标记的脱氧核苷酸加成。使用链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物检测生物素化核苷酸。使二氨基联苯胺与标记的样品反应而在DNA片段化位点生成不溶性着色底物。(例如,参见L.Lagneaux等《英国血液学杂志》(Br.J.Haematol.),112:344-352(2001);和K.kitamura《白血病》(Leukemia),14:1743-1750[2000])。
在其它实施方案中,将核水平检测方法(例如荧光染料hoechst33258和碘化丙锭染色)用于对处理细胞中的编程性细胞死亡进行定量。通过用2.5μg/ml二苄亚胺(bisbenzimide)Hoechst 33258荧光染料(Calbiochem,La Jolla,CA)染色随后用荧光显微镜进行检查,由此检测发生编程性细胞死亡的细胞中核染色质的形态改变。在某些实施方案中,用碘化丙锭(propidium iodide,PI,2.5μg/ml)和Hoechst 33258(2.5μg/ml)对细胞进行双重染色,以便使编程性细胞死亡细胞与坏死细胞区别开来。将完整的蓝色核、凝聚/片段化的蓝色核、凝聚/片段化的粉红色核和完整的粉红色核分别看作是存活的、早期编程性细胞死亡的、晚期编程性细胞死亡的和坏死的细胞。(例如,参见B.R.Gastman等《癌症研究》(Cancer Res.),60:6811-6817(2000);和N.,Hail Jr.,和R.Lotan,R.《癌症流行病学预防生物标记》(Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.),9:1293-1301[2000])。
在其它实施方案中,本发明通过流式细胞术对编程性细胞死亡情况进行细胞水平检测。通过流式细胞术、使用应用488-nm激光线的FACSCAN(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)检测发生编程行细胞死亡情况的细胞,并使用细胞问询软件(Cell Quest software)(Becton Dickinson)进行分析。使用TACSTM膜联蛋白V-FITC试剂盒(Trevigen,Gaithersburg,MD)测定暴露在细胞外部上的磷脂酰丝氨酸(编程性细胞死亡的主要特征之一)。用FL-1检测膜联蛋白V-FITC荧光并用FL-2检测碘化丙锭。(Hail Jr.和R.Lotan,R.《癌症流行病学预防生物标记》(Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.),9:1293-1301[2000])。
实施例9
软琼脂中的集落形成
将软琼脂集落形成试验用于直接测定癌细胞的转化能力。已知本试验与体内致癌力密切相关。
先前已报导Bcl-2反义G3139单独可抑制细胞增殖,预计与化疗药的联合治疗可产生较好的作用。使用联合疗法进行实验以便评价Bcl-2抑制剂与已知化疗药联用时编程性细胞死亡作用或对细胞增殖的抑制作用。在优选的实施方案中,将这些结果用于筛选协同活性剂的组合。
实施例10
体内抗肿瘤活性研究
体内前期研究表明棉酚是有效的Bcl-XL抑制剂,它单独和与其它常用抗癌药(例如多西他赛)联用时均表现出显著的抗肿瘤活性。本发明优选的实施方案使用人癌症异种移植模型提供了充分的体内抗肿瘤效力和选择性研究。
为了设计用于棉酚疗法的最佳剂量方案,研究中首先应用了人乳腺癌细胞系MDA-231(克隆2LMP),然后使用了其它肿瘤异种移植模型,诸如MDA-435(LCC6)和T47D。MDA-231表达高水平的Bcl-2和Bcl-XL;MDA-435表达高水平的Bcl-2和低水平的Bcl-XL;T47D表达低水平的Bcl-2和高水平的Bcl-XL。在全部检验的7种人乳腺癌细胞系中,没有一种细胞系具有低水平Bcl-2和低水平Bcl-XL。然而,人前列腺DU-145小鼠异种移植模型表达低水平的Bcl-2和Bcl-XL,因此在某些测试棉酚和棉酚衍生物特异性的实施方案中用作阴性对照。
在MDA-231模型中,实施一系列综合剂量和方案研究以便测定:1)最低活性剂量,定义为与对照组相比,抑制肿瘤生长达50%、且统计学置信度为95%的剂量;2)可抑制肿瘤生长、但不产生毒性的最佳给药方案,定义为重量下降大于25%;3)棉酚对大肿瘤(超过2,000mm3)的效果;4)在对照组中对小鼠给予棉酚多长时间而仍不会导致发病或死亡(例如体重下降)。
在确定最佳剂量和方案后,测试与至少一种其它常用化疗药的联合疗法,所述的常用化疗药包括、但不限于:1)多柔比星(4mg/kg);2)5-FU(10mg/kg);3)VP-16/依托泊苷(40mg/kg);4)环磷酰胺(100mg/kg);5)顺铂(10mg/kg)。作为阳性对照,使用7.5mg/kg剂量的泰索帝。对照组小鼠不接受治疗,或仅接受载体。为了达到统计学显著性,在本联合方案中每组最少使用10只小鼠。
就全部试验而言,将小鼠随机分组,然后给脂肪垫注入在不含血清的培养基中制备的1-5×106个细胞。在治疗期限中每周对动物测量和称重两次,随后持续4-6周、每周进行两次测定。在动物死亡或最终处死动物时对每只动物进行大体尸体剖检观察。
使用用于检测组织和细胞中编程性细胞死亡的TUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶[TdT]-介导的dUTP-洋地黄毒苷切口末端标记)测定组织中编程性细胞死亡的比例。该方法极为灵敏,能够在原位测定极少编程性细胞死亡的细胞。(参见Y.Gavrieli等《细胞生物学杂志》(J.Cell Biol.),119:493-501[1992];和M.Dowsett等《细胞计量术》(Cytometry),32:291-300[1998])。对石蜡包埋的组织进行切片并将载玻片在标记缓冲液中保温5分钟,然后在加湿室中与溶于标记缓冲液的TdT、dNTP混合物和Mg++一起保温。将链霉抗生物素-辣根过氧化物酶对每一样品施用10分钟、洗涤并用甲基绿或苏木精进行复染。通过计数、并将每一光学显微镜视野中在40x放大倍数下观察到的编程性细胞死亡细胞数除以细胞总数来计算编程性细胞死亡率,用百分比表示。
实施例11
棉酚与多西他赛之间的药物相互作用
通过比较基线处的基线ERMBT水平以及用棉酚预处理1周后的水平来评价单独棉酚对红霉素呼吸试验(ERMBT)[CYP3A4代谢的表型化试验]的作用。(例如,参见Watkins,《药物遗传学》(Pharmacogenetics)4:171-184[1994];和J.Hirth等《临床癌症研究》(Clin.Cancer Res.),6:1255-1258[2000])。ERMBT产生了每小时呼出的14C百分比测定值,通常使用正态分布近似估计。(参见D.Wagner,《临床药物疗法》(Clin.Pharm Therap.),64:129-130[1998])。使用标准(α=0.05)双侧配对t检验比较T呼出14C/小时的平均水平。使用来自前期工作的估计值(J.Hirth等《临床癌症研究》(Clin.Cancer Res.),6:1255-1258(2000),基线的平均呼出14C/小时(n=21,平均值=2.41)、其标准偏差(SD=1.08)、一定时间内ERMBT测定值的相关性(r=0.81),并在每一测定值假定恒定差,来自30位受治疗者的数据进行的当前研究具有96%的能力检测到20%平均ERMBT水平下降(2.41-1.93)和81%的能力检测到15%平均ERMBT水平下降(2.41-2.05)。将平均值、标准偏差和ERMBT值范围制表并与配对t检验的显著性一起报导。
实施例12
多西他赛在患者样品中的药动学描记
使用最佳取样策略取血,对与棉酚联合治疗时多西他赛的药动学进行描记。(参见,P.Baille等《临床癌症研究》(Clin.Cancer Res.),3:1535-1538[1997])。在多西他赛输注结束(the end ofinfusion,EOI)之前,以及EOI后的0.25、0.75、3.00、6.50和24小时时直接取血。同时检测所有样品。使用Bayesian标准,应用NONMEM软件,基于对单独的多西他赛测定的药物浓度和预先估计的群体药动学参数(参见e,R.Bruno等《临床肿瘤学杂志》(J.Clin.Oncol.),16:187-196[1998])的计算曲线下的多西他赛血浆浓度面积(areaunder the curve,AUC)。(S.L.Beal和L.B.Shener,《非线性混合作用模型用户指南》(Nonlinear Mixed Effects Model UsersGuides)(San Francisco,CA,NONMEM Project Group,SanFrancisco的University of California),1999)。通过拟合非线性混合作用模型来直接估计清除率(CL)。(R.Bruno等《临床肿瘤学杂志》(J.Clin.Oncol.),16:187-196[1998])。将AUC计算为剂量和清除率的函数,定义为AUC=剂量/CL。将来自基线和棉酚预治疗1周后的ERMBT值分别对清除率绘图。将普通最小二乘回归用于定义多西他赛CL与ERMBT或ERMBT自然对数之间的相关性。将估计的斜率与预先公布的单一疗法多西他赛CL的值(J.Hirth等《临床肿瘤学杂志》(J.Clin.Oncol.),6:1255-1258(2000)一起给出,以便描述与棉酚联合给药时和单一活性剂给药时多西他赛CL的任何差异。
实施例13
Bcl-2族蛋白在患者样品中的表达
使用标准免疫组织化学(IHC)测定法检测收集在石蜡块内的组织样品中Bcl-2和Bcl-XL的表达。将IHC结果对分并制表,以报导表达这些标记的患者百分比。另外将结果对抗肿瘤反应制表。进行χ2统计或费氏精确检验以便评价表达与抗肿瘤反应之间的相关性,这取决于所得表中预计的细胞计数的大小。
实施例14
外周血淋巴细胞研究
在研究治疗前、第8天(棉酚预治疗1周后)和第9周(完成一个周期的棉酚+多西他赛后)从研究参与者中采集血样,用于进行涉及外周血淋巴细胞(PBL)和循环上皮细胞(CEC)的探察性研究。使用荧光活化细胞分选技术(FACS),对给予棉酚前后PBL中Bcl-2和Bcl-XL的表达进行表征。在每一时间点处报导具有表达的PBLs平均数及其标准偏差。使用上述免疫磁性分离法(参见,T.Walker等《美国临床肿瘤学协会学报》(Proc.Amer.Soc.Clin.Oncology),19:54b[2001])对每一患者测定发现CEC的简便性。报导每一时间点处患者中每10ml采集血液中的CEC平均数及其标准偏差。
将上述说明书中所述的全部公开文献和专利引入本文作为参考。本领域技术人员显然可以对本发明所述的方法和系统进行各种修改和改变而不会脱离本发明的范围和实质。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明,但是应理解所述的本发明并非过度限于这类具体的实施方案。实际上,对相关领域技术人员而言显而易见的是,为实施本发明所述的方式所作的各种修改均属于所附权利要求的范围。
Claims (92)
1.调节细胞中的编程性细胞死亡的方法,该方法包括下列步骤:
a.提供:
i.细胞,其中所述的细胞过表达Bcl-2族蛋白;
ii.棉酚化合物;和
b.在所述细胞中的编程性细胞死亡得到调节的条件下用有效量的所述棉酚化合物处理所述的细胞。
2.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物与所述的Bcl-2族蛋白结合,且所述细胞中的编程性细胞死亡得到调节。
3.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(±)-棉酚。
4.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(-)-棉酚。
5.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(+)-棉酚。
6.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(±)-棉酚酮。
7.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(-)-棉酚酮。
8.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(+)-棉酚酮。
9.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(±)-棉酚乙酸。
10.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(-)-棉酚乙酸。
11.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(+)-棉酚乙酸。
12.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(±)-乙基棉酚。
13.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(-)-乙基棉酚。
14.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(+)-乙基棉酚。
15.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(±)-半棉酚酮。
16.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(-)-半棉酚酮。
17.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(+)-半棉酚酮。
18.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(±)-棉酚的席夫碱。
19.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(-)-棉酚的席夫碱。
20.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(+)-棉酚的席夫碱。
21.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(±)-棉酚酮的席夫碱。
22.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(-)-棉酚酮的席夫碱。
23.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(+)-棉酚酮的席夫碱。
24.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(±)-棉酚乙酸的席夫碱。
25.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(-)-棉酚乙酸的席夫碱。
26.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(+)-棉酚乙酸的席夫碱。
27.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(±)-乙基棉酚的席夫碱。
28.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(-)-乙基棉酚的席夫碱。
29.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(+)-乙基棉酚的席夫碱。
30.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(±)-半棉酚酮的席夫碱。
31.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(-)-半棉酚酮的席夫碱。
32.权利要求1所述的方法,其中所述的棉酚化合物是(+)-半棉酚酮的席夫碱。
33.权利要求1所述的方法,其中所述的Bcl-2族蛋白是选自Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Al/BFL-1和BOO-DIVA组成的组。
34.权利要求1所述的方法,其中所述的细胞是患病细胞。
35.权利要求34所述的方法,其中所述的疾病包括选自过度增生性疾病、癌症、AIDS、变性疾病、血管疾病和感染组成的组的疾病。
36.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括乳腺癌。
37.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括前列腺癌。
38.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括淋巴瘤。
39.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括皮肤癌。
40.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括胰腺癌。
41.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括结肠癌。
42.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括黑素瘤。
43.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括卵巢癌。
44.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括脑癌。
45.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括肝癌。
46.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括膀胱癌。
47.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括非小细胞肺癌。
48.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括宫颈癌。
49.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括骨髓瘤。
50.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括肾上腺癌。
51.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括白血病。
52.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括神经母细胞瘤。
53.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括成胶质细胞瘤。
54.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症包括头颈癌。
55.权利要求35所述的方法,其中所述的癌症是转移型的。
56.权利要求35所述的方法,其中所述的感染是由病原体导致的。
57.权利要求56所述的方法,其中所述的病原体是细菌。
58.权利要求56所述的方法,其中所述的病原体是真菌。
59.权利要求56所述的方法,其中所述的病原体是病毒。
60.调节组织中的细胞分裂的方法,该方法包括下列步骤:
a.提供:
i.组织,其中所述的组织过表达Bcl-2蛋白;
ii.棉酚化合物;
iii.抗癌药;和
b.在使细胞分裂得到调节的条件下用有效量的所述棉酚化合物和所述的抗癌药处理所述的组织。
61.权利要求60所述的方法,其中所述的棉酚化合物与所述的Bcl-2族蛋白结合,且所述细胞中的细胞分裂得到调节。
62.治疗受治疗者的方法,该方法包括对过表达Bcl-2族蛋白的受治疗者给予棉酚化合物。
63.权利要求62所述的方法,其中所述的棉酚化合物与所述的Bcl-2族蛋白结合。
64.治疗受治疗者的方法,该方法包括对过表达Bcl-2族蛋白的受治疗者给予棉酚化合物和抗癌药。
65.治疗受治疗者中癌症的方法,该方法包括对患有特征在于Bcl-2族蛋白过表达的疾病的患者给予有效量的棉酚化合物。
66.权利要求65所述的方法,其中所述特征在于Bcl-2族蛋白过表达的疾病包括选自过度增生性疾病、癌症、AIDS、变性疾病、血管疾病和感染组成的组中的疾病。
67.权利要求66所述的方法,其中所述的癌症选自乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑素瘤、卵巢癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、骨髓瘤、肾上腺癌、白血病、神经母细胞瘤和成胶质细胞瘤组成的组。
68.权利要求66所述的方法,其中所述的癌症是转移型的。
69.权利要求66所述的方法,其中所述的感染是由病原体导致的。
70.权利要求69所述的方法,其中所述的病原体是细菌。
71.权利要求69所述的方法,其中所述的病原体是真菌。
72.权利要求69所述的方法,其中所述的病原体是病毒。
73.治疗受治疗者中癌症的方法,该方法包括对患有癌症的患者给予有效量的棉酚化合物和抗癌药,其中所述癌症的特征在于Bcl-2族蛋白过表达。
74.治疗受治疗者中癌症的方法,该方法包括对患有癌症的患者给予有效量的棉酚化合物,其中所述癌症的特征在于对癌症疗法有耐受性。
75.权利要求74所述的方法,其中所述的癌症疗法是化疗。
76.权利要求74所述的方法,其中所述的癌症疗法是放疗。
77.权利要求74所述的方法,其中所述的癌症疗法是激素疗法。
78.治疗受治疗者中癌症的方法,该方法包括对患有癌症的患者给予足以减少Bcl-2蛋白过表达的剂量的棉酚化合物,其中所述癌症的特征在于所述Bcl-2族蛋白过表达。
79.治疗受治疗者中癌症的方法,该方法包括对患有癌症的患者给予足以减少所述Bcl-2族蛋白过表达的剂量的棉酚化合物和抗癌药,其中所述癌症的特征在于Bcl-2族蛋白过表达。
80.药物组合物,其中包含:
a.棉酚化合物;和
b.对受治疗者给予所述棉酚化合物的说明书,所述受治疗者的特征在于Bcl-2族蛋白过表达。
81.药物组合物,其中包含:
a.棉酚化合物;和
b.对受治疗者给予所述棉酚化合物的说明书,所述受治疗者的特征在于对癌症疗法产生耐受性。
82.棉酚化合物和测试化合物的筛选方法,该方法包括:
a.提供:
i.棉酚化合物;
ii.测试化合物;
iii.第一组细胞;和
b.使所述的第一组细胞与所述的棉酚化合物和所述的测试化合物接触;和
c.观察所述第一组细胞与所述棉酚化合物和所述测试化合物相接触的效果。
83.权利要求82所述的方法,其中进一步包括步骤d):将在所述细胞中观察到的所述效果与仅接触所述棉酚化合物或仅接触所述测试化合物的第二组所述细胞中的效果进行比较。
84.权利要求82所述的方法,其中所述的观察包括观察所述第一组细胞与所述棉酚化合物和所述测试化合物接触对所述第一组细胞增殖的影响。
85.权利要求82所述的方法,其中所述的观察包括观察所述第一组细胞与所述棉酚化合物和所述测试化合物接触对所述第一组细胞中编程性细胞死亡的影响。
86.权利要求82所述的方法,其中所述的观察包括观察所述第一组细胞与所述棉酚化合物和所述测试化合物接触对所述第一组细胞中Bcl-2族蛋白表达的影响。
87.权利要求82所述的方法,其中所述的观察包括观察所述第一组细胞与所述棉酚化合物和所述测试化合物接触对所述第一组细胞中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶水平的影响。
88.权利要求82所述的方法,其中进一步包括步骤e):销售所述的测试化合物。
89.权利要求88所述的方法,其中所述的销售所述化合物包括与棉酚化合物一起销售。
90.权利要求88所述的方法,其中所述的测试化合物是以试剂盒的形式销售。
91.权利要求90所述的方法,其中所述的试剂盒中包含对受治疗者给予所述测试化合物的说明书。
92.权利要求88所述的方法,其中所述的测试化合物由第三方销售。
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