CN109718377A - KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及KPNB 1抑制剂和Bcl‑xL抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明首次揭示,将KPNB 1抑制剂和Bcl‑xL抑制剂联合应用,对于治疗肿瘤、特别是胶质瘤具有极其优异的抑制效果。通过联合用药,可以达到杀伤更多肿瘤细胞的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地,本发明涉及KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康的疾病之一,至今缺少理想的治疗手段和药物,开发新的药物迫在眉睫。胶质瘤是一种发生于脑或脊髓的肿瘤,最常发生部位为脑,因其来源神经胶质细胞而被称为胶质瘤。胶质瘤占脑和中枢神经系统肿瘤的30%、占脑恶性脑肿瘤的80%,是人类健康的严重威胁。脑胶质瘤的治疗通常采用手术,放疗和化疗相结合。胶质瘤常发生于脑,手术需要开颅,手术时间长。胶质瘤和正常神经组织交错生长,边界不清,瘤组织不易清理干净,胶质瘤易复发。对于化疗,由于血脑屏障的存在,使普通的抗肿瘤药物疗效不佳。对于放疗,也存在定位困难和对神经损伤的担心。目前胶质瘤仍是医学界的一个难题。因此寻求新的治疗方法和药物迫在眉睫。基因治疗作为一种新兴的方法,在不久的将来或许会成为肿瘤治疗的一个有效手段。
KPNB1的英文全称为karyopherinβ1(亲核素β1),又称为importinβ1(核质转运受体蛋白),属于亲核素β1家族(Harel,A.,et al.,Importin beta:conducting a muchlarger cellular symphony.Mol Cell 2004Nov 5,16(3),319-330)。KPNB1是一个核输入受体,可以帮助货物蛋白运(cargo proteins)送到细胞核中。KPNB1蛋白C端可以与亲核素α蛋白(Karyopherin-alpha proteins,KPNAs)的IBB结合域(importin beta bindingdomain)相互作用,中间区域可以与核孔蛋白FxFG重复序列相互作用,N端可以与RanGTP相互作用。KPNB1可以在接头蛋白KPNAs的帮助下与货物蛋白接触并将后者通过核孔复合体转运到细胞核中,也可以独自完成对货物蛋白的转运。随后,RanGTP与KPNB1结合,使得货物蛋白被释放。RanGTP在细胞核和胞浆中的浓度梯度确保了货物蛋白在胞浆中被KPNB1捕获,在细胞核中被KPNB1释放。除此以外,KPNB1还调节有丝分裂过程中纺锤体组装、染色体着丝粒与微管的连接以及核膜组装等过程。
高浓度的KPNB1会导致核输入效率和速率的提高。已知的许多KPNB1的货物蛋白在肿瘤发生过程中均起到重要作用,包括核心信号通路转导蛋白(如STAT3、NF-κB和Gli)、生长因子受体(如ErbB-2、EGFR和c-Met)、死亡受体(DR5)、肌动蛋白调节蛋白(CapG)以及转录因子(Snail)等。因为在癌症的进程中依赖如上蛋白的核转运,在一些癌症中KPNB1的表达常会上调。KPNB1的表达受EZH2-miR-30d轴和转录因子E2F的调控,而其介导的蛋白核转运会被p53诱导因子Ei24抑制。KPNB1敲低会通过有丝分裂期阻滞和诱导凋亡的作用导致癌细胞生长受抑制。
因KPNB1在肿瘤细胞中表达升高且参与肿瘤发生,KPNB1敲低会抑制肿瘤细胞生长,这使得KPNB1成为治疗癌症的候选靶点。然而抑制KPNB1对正常组织细胞的毒性仍需谨慎评估。目前,KPNB1抑制剂的缺乏是靶向KPNB1治疗癌症的主要限制因素。近来,一些小分子肽KPNA/KPNB抑制剂被用于研究核转运,然而这些抑制剂不具有细胞可透过性。伊维菌素(Ivermectin)是广谱的KPNA/KPNB抑制剂,但不能抑制KPNB1单独介导的核转运。Karyostatin 1A是最先发现的KPNB1抑制剂,然而其抗癌疗效与脱靶效应目前仍无定论。总的来说,抑制KPNB1介导的核转运的药物仍十分有限,且治疗效果有待改进。
B淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族蛋白可以控制细胞的存活和凋亡。Bcl-2家族蛋白都含有BH(B cell lymphoma(BCL)-2homology)活性域,根据其对凋亡的调控可以分为三类:第一类为抗凋亡蛋白,包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-B、Bcl-W、Mcl-1、Bcl-B和A1/Bfl-1;第二类为促凋亡蛋白,包括Bax和Bak;第三类为唯BH3域(BH-3 only)蛋白,包括Bim、Bid、Puma、Noxa、Bad和Bik等。在正常的健康细胞中,抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1可以结合并阻止促凋亡蛋白Bax和Bak的激活。应激信号可以激活唯BH3域(BH-3only)蛋白,激活后的BH-3 only蛋白可以结合抗凋亡蛋白并解除后者对Bax和Bak的抑制,或者直接激活Bax和Bak。激活后的Bax和Bak同源寡聚化后导致线粒体膜透化、细胞色素c释放到细胞质中,激活caspase和凋亡。因而,Bcl-2家族抗/促凋亡蛋白严格的控制了线粒体途径的凋亡,打破Bcl-2平衡已被证实是Ⅱ型肿瘤细胞获得性TRAIL耐药的主要原因。
因BH3-only蛋白被认为是引起凋亡的起始原因,因此模拟其功能的小分子可能具有很好的抗癌效果。第一个BH3蛋白类似物是ABT-737,类似Bad,对Mcl-1和A1/Bfl-1有较低的亲和性,对Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-W亲和性低。ABT-737不适合病人使用,而其衍生物navitoclax(ABT-263)可口服,且被证实可以结合并抑制Bcl-2和Bcl-xL(Souers,A.J.,etal.,ABT-199,a potent and selective BCL-2 inhibitor,achieves antitumoractivity while sparing platelets.Nat Med 2013 Feb,19(2),202-208)。ABT-263在淋巴细胞白血病患者中表现出很高的生物活性,但对固体肿瘤如小细胞肺癌的抑制效果有限。服用ABT-263会导致剂量依赖的血小板减少,因其可以抑制控制血小板生命周期的Bcl-xL。Bcl-xL的特异性抑制剂A-1155463可以抑制H146小细胞肺癌异位种植肿瘤的生长,但同时也会引起可逆性的小鼠血小板减少,且治疗效果有限。
综上,本领域迫切需要寻求更为安全、有效的抗肿瘤治疗方案,以提升治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
在本发明的第一方面,提供KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂的用途,用于制备治疗胶质瘤的混合物、药物组合物或药盒。
在一个优选例中,所述的KPNB1抑制剂包括:特异性抑制KPNB1的小分子化合物;特异性干扰KPNB1基因表达的干扰分子;特异性敲除KPNB1基因的基因编辑试剂;或特异性与KPNB1基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
在另一优选例中,所述的KPNB1抑制剂是特异性抑制KPNB1的小分子化合物,包括:Importazole(PubChem CID:2949965,别名N-(1-phenylethyl)-2-pyrrolidin-1-ylquinazolin-4-amine)。
在另一优选例中,所述的KPNB1抑制剂是特异性干扰KPNB1基因表达的干扰分子,其是shRNA,其对应的DNA序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中,所述的Bcl-xL抑制剂包括:特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物;特异性干扰Bcl-xL基因表达的干扰分子;特异性敲除Bcl-xL基因的基因编辑试剂;或特异性与Bcl-xL基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
在另一优选例中,所述的Bcl-xL抑制剂是特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物,包括:A-1155463(PubChem CID:59447577,别名2-[8-(1,3-benzothiazol-2-ylcarbamoyl)-3,4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl]-5-[3-[4-[3-(dimethylamino)prop-1-ynyl]-2-fluorophenoxy]propyl]-1,3-thiazole-4-carbo xylic acid),ABT-263(PubChem CID:24978538,别名4-[4-[[2-(4-chlorophenyl)-5,5-dimethylcyclohexen-1-yl]methyl]piperazin-1-yl]-N-[4-[[(2R)-4-morpholin-4-yl-1-phenylsulfanylbutan-2-yl]amino]-3-(trifluorome thylsulfonyl)phenyl]sulfonylbenzamide)。
在本发明的另一方面,提供一种药物组合物,所述的药物组合物中包括KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂,以及药学上可接受的载体。
在一个优选例中,所述的KPNB1抑制剂是特异性抑制KPNB1的小分子化合物,其在组合物中的含量为0.5~300μM,较佳地为1~200μM;更佳地为2~100μM,如5,10,15,20,30,50,60,80μM。
在另一优选例中,所述的Bcl-xL抑制剂是特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物,其在组合物中的含量为0.1~100μM,较佳地为0.2~50μM;更佳地为0.5~20μM,如0.8,1,3,5,8,10,15μM。
在另一优选例中,所述的特异性抑制KPNB1的小分子化合物与所述的特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物的按照摩尔比为:(2~15):1。
在另一优选例中,所述的药物组合物的剂型是:注射剂,输液剂,片剂,胶囊剂,丸剂;较佳地为注射剂。
在本发明的另一方面,提供一种药盒,所述的药盒中,含有:
KPNB1抑制剂;以及
Bcl-xL抑制剂;
所述的药盒用于治疗胶质瘤。
在一个优选例中,所述的药盒中,所述的KPNB1抑制剂包括:特异性抑制KPNB1的小分子化合物;特异性干扰KPNB1基因表达的干扰分子;特异性敲除KPNB1基因的基因编辑试剂;或特异性与KPNB1基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
在另一优选例中,所述的KPNB1抑制剂是特异性抑制KPNB1的小分子化合物,包括:Importazole(PubChem CID:2949965,别名N-(1-phenylethyl)-2-pyrrolidin-1-ylquinazolin-4-amine);或
所述的KPNB1抑制剂是特异性干扰KPNB1基因表达的干扰分子,其是shRNA,其对应的DNA序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中,所述的Bcl-xL抑制剂包括:特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物;特异性干扰Bcl-xL基因表达的干扰分子;特异性敲除Bcl-xL基因的基因编辑试剂;或特异性与Bcl-xL基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
在另一优选例中,所述的Bcl-xL抑制剂是特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物,包括:A-1155463(PubChem CID:59447577,别名2-[8-(1,3-benzothiazol-2-ylcarbamoyl)-3,4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl]-5-[3-[4-[3-(dimethylamino)prop-1-ynyl]-2-fluorophenoxy]propyl]-1,3-thiazole-4-carbo xylic acid),ABT-263(PubChem CID:24978538,别名4-[4-[[2-(4-chlorophenyl)-5,5-dimethylcyclohexen-1-yl]methyl]piperazin-1-yl]-N-[4-[[(2R)-4-morpholin-4-yl-1-phenylsulfanylbutan-2-yl]amino]-3-(trifluorome thylsulfonyl)phenyl]sulfonylbenzamide)。
在另一优选例中,所述的药盒中还含有:使用说明书,说明治疗胶质瘤的方法。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。
附图说明
图1显示了靶向KPNB1的序列引起KPNB1蛋白水平变化。
图2显示了联合靶向KPNB1的干扰RNA和A-1155463用药降低U87的存活。
图3显示了联合靶向KPNB1的干扰RNA和ABT-263用药降低U87的存活。
图4显示了联合靶向KPNB1的干扰RNA和A-1155463用药降低U251的存活。
图5显示了联合靶向KPNB1的干扰RNA和ABT-263用药降低U251的存活。
图6显示了联合KPNB1的抑制剂IPZ和A-1155463用药降低U87细胞的存活。
图7显示了联合KPNB1的抑制剂IPZ和ABT-263用药降低U87细胞的存活。
图8显示了联合KPNB1的抑制剂IPZ和A-1155463用药降低U251细胞的存活。
图9显示了联合KPNB1的抑制剂IPZ和ABT-263用药降低U251细胞的存活。
具体实施方式
本发明人经过长期而广泛的研究,将KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂联合应用,对于治疗肿瘤、特别是胶质瘤具有极其优异的抑制效果。通过联合用药,可以达到杀伤更多肿瘤细胞的目的。
KPNB1抑制剂
所述的“KPNB1抑制剂”包括了KPNB1的活性或功能抑制剂,也包括了KPNB1的核酸抑制物、拮抗剂、抑制剂、阻滞剂、阻断剂等,只要它们能够下调KPNB1的表达水平、抑制KPNB1的活性或功能。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的,也可以是蛋白水平的。
所述的KPNB1抑制剂可以是多种可降低KPNB1的活性、降低KPNB1的稳定性、下调KPNB1的表达、减少KPNB1有效作用时间的物质,这些物质均可用于本发明,作为对于下调KPNB1有用的物质,从而可用于缓解或治疗胶质瘤。例如,所述的KPNB1抑制剂可以是:核酸抑制物、蛋白抑制剂、抗体、配体、化合物、核酸酶、核酸结合分子等,前提是其能够下调KPNB1的表达、抑制其活性或功能。所述的核酸抑制物包括:以KPNB1的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的shRNA,反义核酸、小干扰RNA、微小RNA,或能表达或形成所述shRNA,反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
作为本发明的优选方式,所述的KPNB1抑制剂是特异性抑制KPNB1的小分子化合物,包括:IPZ(Importazole,PubChem CID:2949965,别名N-(1-phenylethyl)-2-pyrrolidin-1-ylquinazolin-4-amine)。经过大量的筛选比较,本发明人发现,该小分子化合物当与Bcl-xL抑制剂联合应用时,效果特别理想。
在本发明中,所述的小分子化合物可以是纯净形式存在的化合物,或纯度大于85%(较佳地大于90%,例如大于95%,98%,99%)的化合物。
在得知其化学结构的情况下,所述的小分子化合物可通过化学合成的方式获得。本发明还包括化合物的前体,所述的“前体”指当用适当的方法服用后,该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成具有活性的该化合物。
作为本发明的另一优选方式,所述的KPNB1抑制剂是特异性干扰KPNB1基因表达的干扰分子。
RNA干扰技术是一种沉默基因表达的技术。RNA干扰技术的原理是较长双链RNA被特异核酸酶Dicer切割加工成21-23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA。小干扰RNA随后形成沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)解旋成单链。反义链引导该沉默复合体通过碱基配对特异性结合到目标mRNA上,使mRNA分解。小发夹RNA(short hairpinRNA,shRNA)是一种形成急转弯结构的RNA序列,可以经由RNA干扰使基因沉默。
作为本发明的更优选方式,所述的特异性干扰KPNB1基因表达的干扰分子是shRNA,其对应的DNA序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
此外,针对KPNB1的siRNA分子也可被应用于特异性干扰KPNB1基因表达。
Bcl-xL抑制剂
所述的“Bcl-xL抑制剂”包括了Bcl-xL的活性或功能抑制剂,也包括了Bcl-xL的核酸抑制物、拮抗剂、抑制剂、阻滞剂、阻断剂等,只要它们能够下调Bcl-xL的表达水平、抑制Bcl-xL的活性或功能。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的,也可以是蛋白水平的。
所述的Bcl-xL抑制剂可以是多种可降低Bcl-xL的活性、降低Bcl-xL的稳定性、下调Bcl-xL的表达、减少Bcl-xL有效作用时间的物质,这些物质均可用于本发明,作为对于下调Bcl-xL有用的物质,从而可用于缓解或治疗肿瘤。例如,所述的Bcl-xL抑制剂可以是:核酸抑制物、蛋白抑制剂、抗体、配体、化合物、核酸酶、核酸结合分子等,前提是其能够下调Bcl-xL的表达、抑制其活性或功能。所述的核酸抑制物包括:以Bcl-xL的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的shRNA,反义核酸、小干扰RNA、微小RNA,或能表达或形成所述shRNA,反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
作为本发明的优选方式,所述的Bcl-xL抑制剂是特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物,包括:A-1155463(PubChem CID:59447577,别名2-[8-(1,3-benzothiazol-2-ylcarbamoyl)-3,4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl]-5-[3-[4-[3-(dimethylamino)prop-1-ynyl]-2-fluorophenoxy]propyl]-1,3-thiazole-4-carbo xylic acid),ABT-263(PubChem CID:24978538,别名4-[4-[[2-(4-chlorophenyl)-5,5-dimethylcyclohexen-1-yl]methyl]piperazin-1-yl]-N-[4-[[(2R)-4-morpholin-4-yl-1-phenylsulfanylbutan-2-yl]amino]-3-(trifluorome thylsulfonyl)phenyl]sulfonylbenzamide)。经过大量的筛选比较,本发明人发现,该小分子化合物当与KPNB1抑制剂联合应用时,效果特别理想。
在本发明中,所述的小分子化合物可以是纯净形式存在的化合物,或纯度大于85%(较佳地大于90%,例如大于95%,98%,99%)的化合物。
在得知其化学结构的情况下,所述的小分子化合物可通过化学合成的方式获得。本发明还包括化合物的前体,所述的“前体”指当用适当的方法服用后,该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成具有活性的该化合物。
KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂的联合应用
本发明提供了一种联合用药的方法,包括利用靶向KPNB1的抑制剂联合靶向Bcl-xL的抑制剂的用药方法。
本领域中,已经将KPNB1与肿瘤相关联,发现KPNB1敲低会通过有丝分裂期阻滞和诱导凋亡的作用导致癌细胞生长受抑制。然而抑制KPNB1介导的核转运的药物仍十分有限。Bcl-xL的特异性抑制剂对于抑制部分肿瘤效果也已被本领域了解。但是,单一地抑制KPNB1或Bcl-xL的实际效果仍然不够理想。而本发明人经过大量的研究筛选后发现,将KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂联合应用,对于治疗肿瘤、特别是胶质瘤具有极其优异的抑制效果。
因此,本发明提供了KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂的用途,用于制备治疗胶质瘤的混合物、药物组合物或药盒。
在给药时,可以先利用KPNB1抑制剂下调KPNB1的表达或活性,再以Bcl-xL抑制剂加以抑制;或者也可同时进行。应理解,多种给药方式均被包含在本发明中。
组合物或混合物
本发明提供了一种小分子化合物的混合物,含有:特异性抑制KPNB1的小分子化合物和特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物作为活性组分。较佳地,所述的混合物中,所述的特异性抑制KPNB1的小分子化合物的浓度是0.5~300μM,较佳地为1~200μM;更佳地为2~100μM;所述的特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物的浓度是0.1~100μM,较佳地为0.2~50μM;更佳地为0.5~20μM。
本发明提供了一种药物组合物,含有:(a)有效量的特异性抑制KPNB1的小分子化合物;(b)有效量的特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物;以及(c)药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明中,术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此,术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中,“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中,“药学上可接受的载体”是用于将本发明的活性组分传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。“药学上可接受的载体”可以是液体或固体。
本发明的药物组合物或混合物可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式。剂型可以是多种多样的,只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自:注射剂,输液剂,片剂,胶囊剂,丸剂。其中活性组分可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。
本发明的特异性抑制KPNB1的小分子化合物和特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物的混合物或药物组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。通常,在本发明的药物组合物中,特异性抑制KPNB1的小分子化合物和特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物作为活性成分可以占药物组合物总重量的0.01-20%,其余可以为药学上可接受的载体。
所用的特异性抑制KPNB1的小分子化合物和特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。必要的时候,特异性抑制KPNB1的小分子化合物和特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物还可与其它活性成分或药物联合给药。
药盒
本发明还提供了一种用于治疗肿瘤的药盒,所述的药盒中,含有:容器1,以及置于容器1中的KPNB1抑制剂;以及容器2以及置于容器2中的Bcl-xL抑制剂。
当所述的KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂均为小分子化合物时,所述的药盒中,也可含有所述的KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂的混合物,其中KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂的含量如前述。
此外,所述的药盒中还可以还有一些辅助用药的材料,例如注射用针管等。
此外,所述的药盒中还可含有使用说明书,说明治疗肿瘤的耐药性的方法。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
材料
本发明中根据人的KPNB1基因设计的shRNA对应的DNA序列如下:
shKPNB1-1(SEQ ID NO:1):
5’-CCGGGCTTGCTATTGATGCTAATGCCTCGAGGCATTAGCATCAATAGCAAGCTTTTTTG-3’;
shKPNB1-2(SEQ ID NO:2):
5’-CCGGGGAAGTGTTGGGTGGTGAATTCTCGAGAATTCACCACCCAACACTTCCTTTTTTG-3’。
识别KPNB1的抗体购买自武汉三鹰生物科技有限公司,识别GAPDH的抗体购买自康成生物工程有限公司。
抑制剂ABT-263购买自Selleck(中国,上海蓝木化工有限公司)。A-1155463购买自美国Medchem Express公司。IPZ购买自默克密理愽(Merck Millipore)公司。
具体实施方式
实施例1、siRNA的设计和干扰载体的制备
从NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载人KPNB1mRNA(GenebankAccession:NM_002265.5)的互补DNA(Complementary DNA,cDNA)序列信息,设计针对KPNB1的shRNA,前期筛选获得10条靶点序列。
在NCBI的同源序列比对分析nucleotide blast中输入靶点序列进行比对分析,要求靶点序列和人的其它mRNA基因没有高度同源性,可作特异性干扰KPNB1的干扰靶点。再根据这些序列按sense-loop-antisense的顺序人工设计shRNA,sense是指靶点序列的正义链,antisense是指靶点序列的反义链,loop是指形成环的序列,这里使用CTCGAG。再在两端加上限制性内切酶AgeI和EcoRI识别的序列,得到如下所示针对一个靶点的两条shRNA序列:正义链:5’-CCGG-sense-CTCGAG-antisense-TTTTTTG-3’;反义链:5’-AATTCA AAAAA-CTCGAG-TCTCTTGAA-antisense-3’;其中的sense即是shKPNB1-1或-2,antisense则是sense的碱基配对互补链。
把上面的RNA序列对应的DNA序列委托Invitrogen公司合成得到DNA oligo。
DNA Oligo加入ddH2O溶解,浓度10mM。分别取22.5ul的DNA oligo与5ul的10×退火缓冲液(成分为100mM Tris-HCl(pH 7.5),10mM EDTA,1mM NaCl)混合,95℃水浴12min后拿出,在室温下冷却至室温。25℃下,用T4连接酶(日本TAKARA公司生产)将互补双链与AgeI、EcoRI酶切的pLKD-CMV-GFP-U6-shRNA载体连接30min,体系按说明书配制(DNA4μl,载体2μl,PEG4000 2μl,10×T4buffer 2μl,T4连接酶1μl,ddH2O 9μl)。
取连接产物加入装有大肠杆菌DH5α感受态细胞的1.5ml规格离心管使其混合,置于冰上30分钟,然后放入42℃水浴90秒,再放回冰上2分钟后加入800μl不含抗生素的培养基,置37℃细菌培养箱中摇1小时。4500转/分离心收集得到的细菌后涂固体LB培养基平板,37℃细菌培养箱过夜培养至长出菌落。挑取单克隆置1.5ml规格离心管进行培养,用PCR方法鉴定是否转化成功,鉴定所用的引物为:
PLKD-F:CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA(SEQ ID NO:3);
PLKD-R:gaaatacggttatccacgcg(SEQ ID NO:4);
转化成功的取样送测序,测序使用的引物是:
PLKD-F:CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA(SEQ ID NO:3)。
取测序正确的细菌和5ml添加抗生素的培养基加入50ml规格离心管培养6小时,然后与200ml添加了抗生素的培养基一起倒入1L规格的培养瓶中扩大培养,使用QIAGENPlasmid Maxi Kit大抽试剂盒(德国凯杰生物技术有限公司生产)抽提出质粒,质粒抽提按QIAGEN Plasmid Maxi Kit说明书进行操作。
通过以上操作,得到pLKD-CMV-GFP-U6-KPNB1-shRNA质粒。
实施例2、干扰慢病毒颗粒的包装
在37℃5%CO2的细胞培养箱中培养HEK 293T细胞(下简称293T,购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库),培养基使用添加了10%胎牛血清(美国纽约Gibco公司生产)的DMEM(美国纽约Gibco公司生产)培养基。传代培养293T细胞于直径为10cm的培养皿中,当细胞长到汇合度为50%左右,用无血清的培养基培养4小时。按Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司生产)说明书操作,准备好22.5μg上面得到的pLKD-CMV-GFP-U6-KPNB1-shRNA质粒(或不含shRNA的空载体质粒)、7.9μg病毒外壳质粒psPAX2(中国上海纽恩生物科技有限公司提供)、14.6μg包装质粒pMD2.G(中国上海纽恩生物科技有限公司提供)的转染混合物。
把混合物添加到已经饥饿培养过的细胞中进行转染,4-6小时后更换为正常的培养基。分别在换液培养24和48小时后收集培养基,经0.22μm孔径的膜过滤后,再用CP 80MX离心机(日本日立公司生产)经4℃、100000g超速离心2小时,得到病毒沉积块。用OPTI-MEM(美国纽约Gibco公司生产)培养基重悬收集得到干扰KPNB1的慢病毒(shKPNB1)和含有空载体的慢病毒(control)。
慢病毒的滴度测定采用稀释计数法,把293T细胞铺96孔板,每孔约5000个细胞,过夜培养。准备好用培养基10倍梯度稀释的病毒共10份,即最低、最高浓度分别为原液的1/10-10、1/10-1,每份100μl换掉对应孔的培养基培养过夜后更换正常培养基。换掉新鲜培养基再培养两天后,置荧光显微镜下观察最后两个有荧光的孔的荧光细胞的克隆数,用以下公式计算病毒滴度:
滴度(TU/ml)=(X+Y*10)*10/(2*Z);
其中,X是指倒数第二个有荧光的孔的荧光细胞克隆数,
Y是指倒数第一个有荧光的孔的荧光细胞克隆数,
Z是指X对应孔所加病毒的稀释率。
实施例3、干扰效率在蛋白水平的验证
蛋白样品的制备:
在直径6cm培养皿中培养细胞至大约30%汇合度,分别加入对照慢病毒感染颗粒和干扰KPNB1的病毒感染颗粒(感染复数为10),继续培养细胞4天。收细胞时先转移培养基至空的15ml规格离心管,用PBS漂洗两次细胞,每次用PBS 3ml,然后用2ml 0.25%胰蛋白酶消化细胞,待细胞都变圆漂浮后把之前吸走的培养基倒回培养皿。把消化下来的细胞随培养基转移到15ml规格离心管中,1200转/分离心5分钟收集细胞。弃掉上清,加入含有1×PMSF(中国南通碧云天公司生产)和1×蛋白酶抑制剂cocktail(美国Thermo Scientific公司生产)的RIPA细胞裂解液(中国南通碧云天公司生产)。吹打混匀细胞和裂解液,放于冰上裂解1小时,每20分钟用漩涡混合器振荡混匀。最后离心,离心机设置为:4℃、13000转/分、15分钟。吸取离心后的上清液至洁净的离心管中即为提得的蛋白样品。把蛋白样品和等体积的2×蛋白上样缓冲液(二硫苏糖醇(DTT):0.1572g,溴酚蓝;0.01g,Tris-HCl(1M pH6.8):0.5ml,10%SDS:2ml,甘油:1ml,H2O:定容至10ml)混合煮沸5分钟,完成样品制备。
Tris(1M pH 6.8)缓冲液的配制方法:称取Tris Base 24.228g溶于约160ml超纯水,充分搅拌溶解,用盐酸调节pH至6.8,同时用超纯水定容至200ml。
Western Blot方法检测蛋白表达:
准备好配制凝胶需要的试剂:
30%acrylamide mix的配制方法:称取丙烯酰胺29.2g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,用超纯水溶解并定容至100ml。
Tris(1.5M pH 8.8)配制方法:称取Tris Base 36.342g溶于约160ml超纯水,充分搅拌溶解,用盐酸调节pH至8.8,同时用超纯水定容至200ml。
Tris(0.5M pH 6.8)缓冲液的配制方法:称取Tris Base 12.114g溶于约160ml超纯水,充分搅拌溶解,用盐酸调节pH至6.8,同时用超纯水定容至200ml。
10%SDS的配制方法:称取5g十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS),溶于超纯水至50ml。
10%APS的配制方法:称取5g过硫酸铵(Ammonium persulfate,APS),溶于超纯水至50ml。
TEMED是指N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine,中文名N,N,N’,N’-四甲基二乙胺。
准备好电泳装置(中国上海天能科技有限公司生产的VE-180型垂直电泳槽)和配制1.5mm厚凝胶的玻璃板(中国上海天能科技有限公司生产)。把玻璃板用洗洁精、清水洗涤干净,再用去离子水冲洗一遍,放入电热鼓风干燥箱中烘干。待玻璃板全干后组装好配胶装置,配制10%分离胶(ddH2O:4.0ml,30%acrylamide mix:3.3ml,Tris(PH 8.8 1.5M):2.5ml,10%SDS:100μl,10%APS:100μl,TEMED:4μl),将其注入至玻璃板,加入后用300μl超纯水封住上表面。
室温放置30分钟以上,待水和凝固的分离胶两相界面变清晰,准备好5%浓缩胶(ddH2O:2.7ml,30%acrylamide mix:0.67ml,Tris(PH 6.8 0.5M):0.5ml,10%SDS:40μl,10%APS:40μl,TEMED:4μl),倒掉玻璃板中的水,注入浓缩胶,插上梳子,室温放置20分钟待其凝固后即可使用。
电泳:
配制10×电泳液(Tris:30.3g,甘氨酸:144.0g,SDS:10.0g,去离子水:定容至1000ml),将50ml 10×电泳液与450ml H2O2混合即得到500ml1×电泳液。
安装好电泳装置并用清水冲洗干净,拔掉梳子。倒上500ml电泳液,保持电泳槽内槽充满电泳液,样品在6000转/分条件下离心1s收集后加入泳道,邻近样品放的其中一个空白孔加入预染marker(加拿大Fermentas公司生产,货号SM0671)。电泳时电源限定条件:恒流15-20mA。待指示剂显示样品接近凝胶下边界时停止电泳。
转膜:
配制10×转膜液(Tris:30.3g,甘氨酸:144.0g,H2O:定容至:1000ml)。
接下来配制好1×转膜液(10×转膜液:80ml,甲醇:160ml,H2O:定容至800ml)。准备好转膜装置,两组9×8cm规格滤纸,每组三张。把PVDF膜先浸泡在甲醇中约20秒待其浸透无白点,再放入转膜液中平衡后,转移至装有转膜液的小盒中备用。然后用塑料片轻轻切去浓缩胶,再切割分离胶两端和与玻璃接触的面。用塑料片蘸少许转膜液,塞入分离胶下使其松动,然后将其倒扣至装有转膜液的塑料盆中轻轻摇晃,分离胶即从玻璃上脱离到转膜液中。
打开转膜用的塑料板,浸没到转膜液中,在转膜液中按如下顺序组装:负极板(黑)放上海绵→一组滤纸(三张)→分离胶→PVDF膜→一组滤纸(三张)→海绵→正极板。然后夹持好装置,倒上转膜液,确保转膜的三明治样结构完全浸没在转膜液中,盖上带有电源线的盖子,整个电泳装置置于塑料盆中,电泳盒外围加上冰水混合物即可开始转膜。转膜时电源限定条件:U=100V;I=350mA;t=75min。
封闭:
配制好10×TBS缓冲液(1L含Tris 24.23g、NaCl 80.06g,HCl调pH至7.6),然后用去离子水稀释10倍得到1×TBS,再加入0.5%(v/v)的吐温-20配制成TBST。准备好5%脱脂奶,将5g脱脂牛奶(中国内蒙古伊利实业集团股份有限公司)溶于100ml TBST溶液中。转膜完毕后,取出PVDF膜装入自封袋,倒入20ml的5%脱脂牛奶,用封口机封牢,置于脱色摇床上摇20分钟,再转至4℃冰箱过夜存放。
一抗孵育:
从冰箱取出PVDF膜后,先用1×TBST洗涤3次,每次5分钟。按1:1000稀释率取用抗体KPNB1(武汉三鹰生物技术有限公司,10077-1-AP)及1:8000稀释率取用抗体HRP偶联的GAPDH(上海康成公司生产,KC-5G5),加入到5ml TBST中,摇匀即得到抗体工作液。把洗涤后的膜装入自封袋,倒入配好的抗体工作液,中速运转的脱色摇床上孵育120分钟。一抗孵育完后,若一抗上已经有辣根过氧化物酶标记(如内参蛋白GAPDH的抗体),则直接跳至显影步骤,若没有,则需要二抗孵育。
二抗孵育:
先用1×TBST洗涤3次,每次5分钟。吸取辣根过氧化物酶标记的兔疫球蛋白抗体(即二抗,美国Cell Signaling Technology公司生产,稀释率为1:2000),加入到5ml 1×TBST中摇匀。把洗涤后的膜装入自封袋,倒入配好的二抗工作液,封口机封住,摇床上摇120分钟。
显影:
二抗孵育结束后,用1×TBST洗涤6次,前3次每次10分钟,后3次每次5分钟。在此期间准备好显影液、定影液、自来水、胶片、显影暗匣,剪刀,卫生纸。以下操作在显影暗室中红光灯辅助下完成。分别吸取400μl显影底物A和B(中国天根生化科技有限公司生产)混匀,平衡至室温。把PVDF膜放在洁净的剪开的自封袋内表面上。迅速加上显影底物,孵育1-5分钟,若肉眼可见明显条带,则终止孵育。弃掉显影底物液体,把膜转移至三面剪开的自封袋中,合上自封袋,用卫生纸小心吸掉多余的液体,放入显影暗匣,用绝缘胶带固定。放上胶片,胶片曝光一定时间(5~30秒)后,依次放入显影液、定影液各20秒,然后把胶片放在清水中。最后在自来水下洗净胶片,晾干,扫描至计算机,得到检测结果。
显影后的膜用1×TBST洗10分钟后,可放入有抗体洗脱缓冲液的自封袋中,密封后放入50~60℃的水浴锅中孵育30分钟。再用1×TBST洗2次,每次10分钟。洗完后用脱脂奶封闭即可重复上面的步骤检测其它蛋白如内参蛋白GAPDH。
Western Blot的结果如图1所示,表明本发明用到的干扰RNA shKPNB1-1和shKPNB1-2能显著降低KPNB1的蛋白水平。
实施例4、MTT法检测KPNB1shRNA与Bcl-xL联合用药对胶质瘤细胞存活的影响
MTT法是检测细胞增殖的一种经典实验方法(Tim Mosmann,Rapid colorimetricassay for cellular growth and survival:Application to proliferation andcytotoxicity assays,Journal of Immunological Methods,1983,65(1–2):55-6,3)。胶质瘤细胞系U87和U251(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)细胞培养在37℃5%CO2的细胞培养箱中,培养基为添加了10%胎牛血清的DMEM培养基。在直径6cm培养皿中培养细胞至大约30%汇合度,分别加入实施例2得到的对照慢病毒感染颗粒和干扰KPNB1的病毒感染颗粒(感染复数为10),继续培养细胞4天。后用96孔板(美国Corning公司生产)培养,每孔约1500个细胞,每孔培养基150μl。
分别用ABT-263或A-1155463处理细胞48小时后,每孔加入15μl浓度为5mg/ml的MTT(上海生工生物工程公司生产)继续孵育4小时。然后吸掉培养物,每孔加入150μl DMSO,在酶标仪(美国Bio-Rad公司生产,iMark168-1130型)的490nm波长下测定吸光度。
结果如图2、图3、图4、图5所示,表明干扰KPNB1表达的同时给予ABT-263(可抑制Bcl-2和Bcl-xL)或A-1155463(Bcl-xL的特异性抑制剂),在较低浓度即可以显著降低两种胶质瘤细胞的存活率。
上述结果说明,抑制KPNB1的同时抑制Bcl-xL可达到非常理想的促胶质瘤细胞凋亡的效果。与单一对其中一个分子进行抑制相比,实现了协同增效的作用。
实施例5、MTT法检测KPNB1抑制剂IPZ与Bcl-xL联合用药对胶质瘤细胞存活的影响
胶质瘤细胞系U87和U251,在直径6cm培养皿中培养细胞至大约30%汇合度,加入IPZ或不加(空白对照),继续培养细胞4天。之后用96孔板(美国Corning公司生产)培养,每孔约1500个细胞,每孔培养基150μl。
分别用ABT-263或A-1155463处理细胞48小时后(浓度如图3所示),每孔加入15μl浓度为5mg/ml的MTT(上海生工生物工程公司生产)继续孵育4小时。然后吸掉培养物,每孔加入150μl DMSO,在酶标仪(美国Bio-Rad公司生产,iMark168-1130型)的490nm波长下测定吸光度。
结果如图6、图7、图8、图9所示,表明给予IPZ的同时给予ABT-263(可抑制Bcl-2和Bcl-xL)或A-1155463(Bcl-xL的特异性抑制剂),可以在较低浓度显著降低两种胶质瘤细胞的存活率。与单用其中一种抑制剂相比,起到了协同增效的作用。
上述结果说明,抑制KPNB1的同时抑制Bcl-xL可达到非常理想的促胶质瘤细胞凋亡的效果。
以上实施方式只是较佳的实施方式中的一种,并非对本发明的限制。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。未作特殊说明的实验试剂和方法,均指常规试剂和方法。在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 干扰RNA的DNA序列(shRNA)
<400> 2
ccgggcttgc tattgatgct aatgcctcga ggcattagca tcaatagcaa gcttttttg 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 干扰RNA的DNA序列(shRNA)
<400> 2
ccggggaagt gttgggtggt gaattctcga gaattcacca cccaacactt ccttttttg 59
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 3
cctatttccc atgattcctt cata 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 4
gaaatacggt tatccacgcg 20
Claims (16)
1.KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂的用途,用于制备治疗胶质瘤的混合物、药物组合物或药盒。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的KPNB1抑制剂包括:特异性抑制KPNB1的小分子化合物;特异性干扰KPNB1基因表达的干扰分子;特异性敲除KPNB1基因的基因编辑试剂;或特异性与KPNB1基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
3.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述的KPNB1抑制剂是特异性抑制KPNB1的小分子化合物,包括:Importazole。
4.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述的KPNB1抑制剂是特异性干扰KPNB1基因表达的干扰分子,其是shRNA,其对应的DNA序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
5.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的Bcl-xL抑制剂包括:特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物;特异性干扰Bcl-xL基因表达的干扰分子;特异性敲除Bcl-xL基因的基因编辑试剂;或特异性与Bcl-xL基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
6.如权利要求5所述的用途,其特征在于,所述的Bcl-xL抑制剂是特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物,包括:A-1155463,ABT-263。
7.一种药物组合物,其特征在于,所述的药物组合物中包括KPNB1抑制剂和Bcl-xL抑制剂,以及药学上可接受的载体。
8.如权利要求7所述的药物组合物,其特征在于,所述的KPNB1抑制剂是特异性抑制KPNB1的小分子化合物,其在组合物中的含量为0.5~300μM,较佳地为1~200μM;更佳地为2~100μM。
9.如权利要求7所述的药物组合物,其特征在于,所述的Bcl-xL抑制剂是特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物,其在组合物中的含量为0.1~100μM,较佳地为0.2~50μM;更佳地为0.5~20μM。
10.如权利要求9所述的药物组合物,其特征在于,所述的特异性抑制KPNB1的小分子化合物与所述的特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物的按照摩尔比为:(2~15):1。
11.如权利要求7所述的药物组合物,其特征在于,所述的药物组合物的剂型是:注射剂,输液剂,片剂,胶囊剂,丸剂;较佳地为注射剂。
12.一种药盒,其特征在于,所述的药盒中,含有:
KPNB1抑制剂;以及
Bcl-xL抑制剂;
所述的药盒用于治疗胶质瘤。
13.如权利要求12所述的药盒,其特征在于,所述的药盒中,所述的KPNB1抑制剂包括:特异性抑制KPNB1的小分子化合物;特异性干扰KPNB1基因表达的干扰分子;特异性敲除KPNB1基因的基因编辑试剂;或特异性与KPNB1基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
14.如权利要求13所述的药盒,其特征在于,所述的KPNB1抑制剂是特异性抑制KPNB1的小分子化合物,包括:Importazole;或
所述的KPNB1抑制剂是特异性干扰KPNB1基因表达的干扰分子,其是shRNA,其对应的DNA序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
15.如权利要求12所述的药盒,其特征在于,所述的Bcl-xL抑制剂包括:特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物;特异性干扰Bcl-xL基因表达的干扰分子;特异性敲除Bcl-xL基因的基因编辑试剂;或特异性与Bcl-xL基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
16.如权利要求15所述的药盒,其特征在于,所述的Bcl-xL抑制剂是特异性抑制Bcl-xL的小分子化合物,包括:A-1155463,ABT-263。
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