KR101928543B1 - 니클로사마이드를 함유하는 Axin-GSK3 단백질 결합 관련 질환 치료용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 니클로사마이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 가족성 대장용종증(FAP, familial adenomatosis polyposis)과 같은 Axin-GSK3 단백질 결합 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, FDA에서 승인받은 안전한 약물인 니클로사마이드를 이용하여, 별다른 치료법이 없어서 고통받고 있는 가족성 대장용종증(FAP, familial adenomatosis polyposis)을 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

니클로사마이드를 함유하는 Axin-GSK3 단백질 결합 관련 질환 치료용 약학조성물{Pharmaceutical Composition for Treating or Preventing Disease Concerining Axin-GSK3 Binding Containing Niclosamide}

본 발명은 니클로사마이드를 함유하는 Axin-GSK3 단백질 결합 관련 질환 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 니클로사마이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 가족성 대장용종증(FAP, familial adenomatosis polyposis), 다발성 대장 용종, 헬리코박터 (Helicobacter pylori)에 의한 염증이나 위암과 같은 Axin-GSK3 단백질 결합 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

상피-간엽 전환(epithelial-mesenchymal transition, EMT)은 인간 암에서 치료에 대하여 저항하는 침습성, 줄기세포성을 유도하는 생물학적 기작이며, 저분자의 저해제로 EMT를 복귀시켜 암을 치료하는 방법이 연구되고 있다. 살리노마이신은 효과적으로 암세포의 EMT를 되돌리는 것으로 알려져 있으며, 대표적인 항암제인 파클리탁셀에 비례하여 100배까지 암 분화능을 억제하고, 생체 실험에서 유방암의 전이를 억제한다고 보고되고 있다(Gupta PB, et al., Cell., 138:645-6592, 2009). 비록 살리노마이신은 인간에게 사용할 수 없지만, 이러한 결과는 인간 암에서 EMT를 제어하는 새로운 암치료 전략을 제시하고 있다.

전사인자 Snail은 인간 암에서 상피조직의 유전자를 억제함으로서 EMT를 유발한다 (Cano A. et al., Nature Cell Biol, 2, 76-83, 2000; Batlle E et al., Nature Cell Biol, 2, 84-89, 2000). Wnt 신호와 p53 종양억제유전자와 H. pyroli의 세균성 발암물질인 CagA 단백질의 주요 발암 경로는 번역 후, 전사 후 메커니즘을 통하여 Snail 활성을 조절한다 (Yook JI et al., J Biol Chem, 280, 11740-11748, 2005; Kim NH et al., J Cell Biol 195, 417-433, 2011; Lee et al., Nature Communications, 5:4423, 2014). 또한, β-catenin과 Snail 전사 기작은 GSK3에 의해 인산화되고 분해된다. 아울러, Wnt 신호 또는 CagA는 인산화를 막아서 TCF 전사 활성을 증가시키고 Snail 매게 EMT를 진행시킨다. GSK3 스캐폴딩 단백질인 Axin2는 GSK3의 핵-세포질 셔틀링을 조절함으로서 이 과정을 조절하는 기능을 한다 (Yook JI et al., Nature Cell Biol, 8, 1398-1406, 2006). 그 결과, 암세포에서 증가된 핵의 Snail이 생긴다. 흥미롭게도, Axin에 의한 GSK3 셔틀링 기능은 막의 LRP6 Wnt 수용기의 인산화와 세포내의 Wnt 신호 활성의 다음 활성화를 위해 요구된다. 이처럼 Axin-GSK3 복합체는 Wnt 신호와 Snail-매개 EMT 프로그램을을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 반대로 해석 하자면, Axin-GSK3 복합체의 억제는 인간 암의 Wnt 신호와 Snail-매개 EMT 프로그램을 겨냥한 저분자 저해제를 개발하는데 새로운 MoA (mode of action, 작용 기전)가 될 수 있다.

헬리코박터 (Helicobacter pylori)는 사람의 위장에 생활하는 대표적인 발암 요인이다. 국제보건 기구는 (WHO)는 헬리코박터를 명확한 발암인자 (definite carcinogen) 박테리아 감염으로 규정하고 있다. 헬리코박터는 서구에서 30-40%, 저개발국가는 70% 이상의 유병율을 보이며, 우리나라에서도 50%이상의 인구에 감염이 존재한다 (Leomardo et al., Helicobacter, 19, supple1:1-5, 2014). 헬리코박터는 사람의 위장에 감염되어 위장 점막의 염증을 초래하고, 나아가 위암의 중요한 원인인자가 된다. 헬리코박터는 위장에 감염되어 위점막 세포에 cytotoxin-associated gene A (CagA) 단백질을 주입하고, 이러한 CagA가 위장 점막 세포의 염증과 암 발생에 중요한 역할을 수행한다. 최근 CagA가 Axin과 유사한 기능을 수행한다는 것이 밝혀졌다. 구체적으로 헬리코박터가 상피세포에 CagA를 주입하면 CagA는 Axin과 마찬가지로 GSK-3에 결합을 하고, 이를 통해 GSK-3 인산화 효소 기능이 억제되며, 나아가 Snail 발현이 증가한다 (Lee et al., Nature Communications, 5:4423, 2014). 초기 연구에서 암 전이과정에서 Snail 발현이 증가한다고 알려져 있었지만, 최근의 결과에 따르면 Snail은 암 발생 뿐만 아니라 상피세포의 염증 유발을 직접적으로 유도한다고 알려져 있다 (Lyons et al., Cancer Res. 68;4525-4530, 2008; Du et al., Cancer Res. 70:10080-10089, 2010). 따라서 GSK-3에 결합하여 Axin의 기능을 억제하고 나아가 Snail 발현을 억제하는 화합물은 헬리코박터에 의한 염증과 위암 발병을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 니클로사마이드(niclosamide)는 FDA에서 승인받은 구충제로, 50년 가까이 장내 촌충류의 감염에 대해 널리 사용되고 있다. 니클로사마이드가 생체실험이나 시험관실험에서 인간 대장암의 효과적인 물질임이 보고된 이후로(Osada T, et al., Cancer Res. 71:4172-4182, 2011; 13. Sack U, et al., J Natl Cancer Inst. 103:1018-1036, 2011), 최근 연구에서 니클로사마이드가 인간암의 다양한 유형에 사용될 수 있다고 보고되었다(Li Y, Li PK, Roberts MJ, Cancer Lett.,349:8-14, 2014; Wang YC et al., PLoS One. 8:e74538, 2013).

니클로사마이드는 시험관 내 실험에서 마이크로몰 농도레벨에서 암세포 사멸을 유발한다. 반면에 생체 내 실험에서 생리학적 농도는 혈장 및 암 조직에서 nM수준이고, 생체 내 실험에서 세포 독성이 없는 MoA(작용 양식)을 나타낸다. Notch 신호, Dishevelled, S100A4, and Frizzled receptor 와 같이 많은 타겟들이 제안되는 반면에, 니클로사마이드의 MoA(작용기전)을 제공하는 직접적인 타겟은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다.

본 발명에서는 가족성 대장용종증(FAP, familial adenomatosis polyposis), 헬리코박터 감염과 같은 Axin-GSK3 단백질 결합 관련 질환의 치료법을 찾고자 예의 노력한 결과, 니클로사마이드를 경구 투여한 APC-MIN 동물모델에서 선종 형성을 억제하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 Axin-GSK3 단백질 결합 관련 질환 치료용 약학조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 니클로사마이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 Axin-GSK3 단백질 결합 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, FDA에서 승인받은 안전한 약물인 니클로사마이드를 이용하여, 별다른 치료법이 없어서 고통받고 있는 가족성 대장용종증(FAP, familial adenomatosis polyposis)이나 다발성 대장 용종, 헬리코박터 감염을 효과적으로 치료할 수 있다.

도 1은 니클로사마이드의 처리가 대장암 세포에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A 는 니클로사마이드의 농도별 처리에 따른 대장암 세포의 생존율을 나타낸 것이고, B는 베타-카테닌 발현(좌측)과 TCF/LEF 전사활성(우측)을 나타낸 것이다.
도 2는 니클로사마이드의 처리에 따른 Snail의 발현 변화(A)와 E-캐드헤린 활성(B) 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 니클로사마이드의 처리에 따른 대장암 세포의 핵-세포질 분획에서의 GSK3, β-catenin 및 Snail의 양을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 니클로사마이드에 의하여 Axin-GSK3 복합체 형성이 억제되는 지를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 AB는 니클로사마이드가 GSK3에 직접적으로 결합하는지를 확인하기 위한 표면 플라즈마 공명(SPR) 분석결과를 나타낸 것이고, C는 GSK3의 Axin 결합 부분과 니클로사마이드의 구조분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 니클로사마이드의 상피-간엽 전환(EMT) 복원능을 확인하기 위한, 니클로사마이드를 처리한 대장암 세포의 세포이동능(A)과 대장암 세포를 투여한 마우스에서의 니클로사마이드에 의한 종양형성 변화결과(B)를 나타낸 것이다.
도 7은 이종 종양이식 실험에서 니클로사마이드 처리에 의한 Snail과 E-캐드헤린의 단백질의 양의 변화를 면역블럿 어세이로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 돌연변이 APC로 형질전환된 293 세포에서 니클로사마이드에 의한 TCF/LEF 전사활성 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 APC-MIN 동물모델에 니클로사마이드를 투여하였을 때의 선종의 크기변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 니클로사마이드에 의한 헬리코박터 CagA와 GSK-3간의 결합을 억제하고, Snail 발현을 억제한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서는 니클로사마이드가 세포 내에서 Axin-GSK3 복합체 형성을 직접적으로 억제하고, 대장암세포에서 Snail-매개 상피-간엽 전환(EMT)를 복구시키며, Wnt 활성을 약확시킨다는 것을 확인하였다. 또한, FAP환자에서 확인되는 APC 돌연변이에서 유도되는 TCF/LEF의 전사활성의 활성화를 니클로사마이드가 억제하는 것을 확인하였다. 아울러, 대장 내 선종을 형성하도록 확립된 APC-MIN 모델에 니클로사마이드를 경구 투여하는 경우, 선종 형성이 억제되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 니클로사마이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 Axin-GSK3 단백질 결합 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

니클로사마이드(niclosamide, 또는 Niclocide(상표명))는 50년 가까이 구충제로 사용되어온 약물로, 잠재적으로 항종양 활성을 가지는 것으로 알려져 있으며, 경구적으로 이용가능한 약이다.

니클로사마이드는 최근 분자 타겟은 명확하게 밝혀지지 않았지만, Wnt, S100A4, Notch 및 안드로겐 수용체와 같은 많은 신호 경로를 조절하는 항암 약물로서 기능을 할 수 있다고 제시되고 있다(Osada T, et al. Cancer Res.71:4172-4182, 2011; Sack U, et al. J Natl Cancer Inst. 2011;103(13):1018-1036, 2011; Li Y, et al., Cancer Lett. 349:8-14, 2014).

가족성 대장용종증(FAP, familial adenomatosis polyposis)은 APC(adenomatous polyposis coli)의 결함에 의하여 발병하며, FAP 환자는 어린 나이에 장내에 수백의 선종성 용종이 발생하며, 궁극적으로 100% 대장선종암(colorectal adenocarcinoma) 진행된다(Minde DP et al., Mol Cancer.2011;10:101, 2011; Half E et al., Orphanet J Rare Dis.,4:22, 2009). US FDA와 유럽보건 단체가 몇몇 부가적인 치료법으로 소염제를 승인하는 하였으나 치료 효과는 미미하다.

본 발명에 따른 니클로사마이드의 경구 복용은 FAP를 치료하는 새로운 약물로 효과적일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 FAP 환자와 동일한 유전 배경 및 증상을 가진 APC-Min 마우스 모델에 니클로사마이드를 투여한 결과, 니클로사마이드를 복막 내에 투여한 쥐의 경우 14주에, 장내 선종은 상당히 줄어들었다. 반면에 몸무게에는 변함이 없었다. 14주 동안 니클로사마이드를 경구투여한 APC-MIN 모델에서는 장내 선종 형성이 상당히 억제되었으며, 약물 치료동안에 실험동물은 안정적이었다.

이 결과를 통하여 니클로사마이드가 FAP 환자를 위한 새로운 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

또한 본 발명에서는 헬리코박터 감염에 의한 염증과 위암 진행을 억제하는 결과를 제시하였으며, 이러한 결과는 GSK-3 활성 감소에 의한 유발되는 다양한 염증성 질환에 효과적으로 사용 될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에서는 니클로사마이드가 Axin과 GSK3가 결합하여 복합체를 형성하는 것을 억제하여, Wnt 활성을 약화시키고 대장암 세포에서 Snail-매게 EMT 를 복구한다는 것을 확인하였다. 또한, FAP 환자를 위한 잠재적 치료법으로서 니클로사마이드의 임상적 타당성을 제공하였다.

본 발명의 일 양태에서는 니클로사마이드가 대장암 세포의 세포사멸을 유도하는 지 확인하였으며, 도 1의 A에 나타난 바와 같이, 니클로사마이드는 μM 농도 수준에서 대장암 세포의 사멸을 유도하는 것을 확인하였으며, 반면 nM 농도에서는 세포사멸이 일어나지 않는 것을 확인하였다.

본 발명에서는 니클로사미드를 nM 농도에서 사용하여, 암세포 사멸이 아닌 다른 메카니즘으로, 대장 선종을 억제하는 것을 확인하였다.

본 발명에서는 니클로사마이드의 분자 타겟으로서 GSK3-Axin2 상호작용을 확인하였다. 니클로사마이드가 암세포에서 Snail-매게 EMT를 복구하여, Wnt 활성을 억제하는 새로운 MoA를 제공하였다.

따라서, 본 발명의 니클로사마이드는 Axin-GSK3 단백질 결합 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있으며, 상기 Axin-GSk 단백질 결합 관련 질환은 가족성 대장용종증(FAP, familial adenomatosis polyposis), 선종성 대장염, 선종성 대장암, 알츠하이머, 당뇨병, 류마티스 관절염, 염증성 피부질환, 골관절염, 백혈구 감소증 등을 들 수 있다.

본 발명에서는 또한, Wnt 신호 경로의 이상은 암, 골 대사, 퇴행성 질환, 섬유증을 포함하는 많은 질병과 연관되어 있으며, Frizzled 수용체, Porcupine, Dishevelled, p300 및 CBP와 같은 Wnt 치료법의 타겟에도 불구하고, Wnt경로를 조절하는 효과적인 분자 타겟은 아직 밝혀지고 있지 않다.

본 발명에서는 Wnt 활성화 동안에, APC-Axin-Dishevelled 스캐폴딩 복합체는 TCF/LEF 활성을 조절한다. Axin-GSK3 상호작용을 억제하는 것이 Wnt 활성을 약화시키고, Snail-매게 EMT 프로그램을 복구시킬 수 있는 새로운 타겟이 될 수 있다는 것을 확인하였다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용된 담체는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로 “약제학적으로 허용되는 담체”라고 한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈-계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.

본 발명에 따른 의약 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.

경구 및 비경구 투여가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

약제학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매중의 멸균 주사용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올중의 용액)일 수 있다. 허용적으로 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링겔 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 불휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 불휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다.

본 발명의 약제학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 캡슐, 정제 및 수성 현탁액 및 용액을 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 용량형으로도 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토즈 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐형으로 경구 투여하는 경우 유용한 희석제로는 락토즈 및 건조된 옥수수 전분이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여될 때 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 필요한 경우, 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 본 발명의 화합물을 실온에서 고형이지만 직장 온도에서는 액상인 적합한 비자극성 부형제와 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 경구 투여는 목적하는 치료가 국소 적용으로 접근이 용이한 부위 또는 기관과 관련이 있을 때 특히 유용하다. 피부에 국소적으로 적용하는 경우, 약제학적 조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 함유한 적합한 연고로 제형되어야 한다. 본 발명의 화합물을 국소 투여하기 위한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 유동 파라핀, 백색 와셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물이 포함된다. 다른 방도로서, 약제학적 조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 화합물을 함유한 적합한 로션 또는 크림으로 제형될 수 있다. 적합한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리솔베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물이 포함된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 직장 좌제에 의해 또한 적합한 관장제로 하부 장관으로 국소 적용할 수 있다. 국소 적용된 경피 패치가 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비내 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 약제의 분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조하며 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용율을 증강시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 본 분야에 알려진 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수중의 용액으로서 제조할 수 있다.

본 발명의 화합물은 통상적인 항염증제와 혼합하거나 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제, 리폭시게나제 억제제 및 IL-1β외의 사이토킨의 억제제와 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 염증과 같은 IL-1 매개된 질환 증세를 예방 또는 퇴치하기 위해 면역조절제(예, 브로피리민, 항-사람 알파 인터페론 항체, IL-2, GM-CSF, 메티오닌 엔케팔린, 인터페론 알파, 디에틸디티오카바메이트, 종양 괴사 인자, 날트렉손 및 rEPO) 또는 프로스타글란딘과 배합하여 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물이 다른 치료 제제와 배합하여 투여될 때 이들은 환자에게 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.

용어 “치료학적 유효량”은 사람의 경우 상기 증세의 치료에 사용하기 위해 일일당 체중 kg 당 약 1 mg 내지 약 100 mg의 용량 수준(전형적으로 약 60 mg 내지 약 6g/환자/일)을 가리킨다.

용어 “예방학적 유효량”은 사람의 경우 상기 증세의 예방에 사용하기 위해 일일당 체중 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg의 용량 수준(전형적으로 약 6 mg 내지 약 6g/환자/일)을 가리킨다.

그러나, 특정 환자에 대한 특정 유효량은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 규정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 변할 수 있음은 이해될 것이다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명에 따른 의약 조성물을 어류의 피하세포에 투입할 경우 새낭 또는 소화관에 투여할 수 있다. 주사는 근육조직내의 근육세포 또는 다른 세포에 주사할 수 있으며 복강내의 내장세포에 주사할 수 있다.

바람직한 양태로서, 구강내 투여를 위한 의약 조성물은 고체상의 부형제와 함께 활성 성분을 혼합함으로써 제조할 수 있으며 정제 또는 당의정 형태로 제조하기 위해 과립형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소비톨과 같은 슈가 형태 또는 옥수수, 밀가루, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터 전분, 메틸 셀룰로스, 하이드로시프로필메틸-셀룰로스 또는 나트륨 카복시메틸세룰로스와 같은 세룰로스, 아라빅 검, 타가칸쓰 검을 포함하는 검류와 같은 카보하이드레이트 또는 젤라틴, 콜라겐과 같은 단백질 필러를 사용할 수 있다. 필요한 경우에는, 교차결합된 폴리비닐피롤리돈, 아가 및 알긴산 또는 나트륨 알긴산과 같은 각각의 염 형태의 붕해제 또는 용해제를 첨가할 수 있다.

바람직한 양태로서, 비경구적 투여의 경우 본 발명의 의약 조성물은 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액 (Hank's solution), 링거 용액 (Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입 (injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀루로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액 (oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 니클로사마이드에 의한 대장암 세포의 세포사멸 활성 분석

니클로사마이드가 대장암 세포의 세포사멸을 유도하는지 확인하기 위하여, 생존율 및 이동성에 미치는 영향을 확인하였다.

대장암 세포주 HCT116, SW480 및 DLD-1 세포 (ATCC, American Type Culture collection) 1 x 10⁵ 세포를 6-well 플레이트에서 하룻밤 배양한 후, PBS로 세척하고, 니클로사마이드를 각 농도별(0μM, 0.125μM, 0.25μM, 0.5μM, 1μM, 2μM, 5μM 및 10μM)로 처리한 배양배지에서 48시간 배양하였다. 세포사멸은 트리판 블루어세이로 측정하였으며, 세포 생존 능력은 방정식[1 - (사멸세포수/총세포수)]로 계산하였다.

그 결과, 도 1의 A에 나타난 바와 같이, 니클로사마이드는 μM 농도 수준에서 대장암 세포의 사멸을 유도하는 것을 확인하였으며, 반면 nM 농도에서는 세포사멸이 일어나지 않는 것을 확인하였다.

실시예 2: 니클로사마이드에 의한 대장암 세포의 snail 매개 EMT 복귀 활성 확인

니클로사마이드가 snail 매개 EMT 복귀를 유도하는 지 확인하기 위하여, 베타-카테닌(β-catenin) 발현과 TCF/LEF reporter (Topflash) 활성 변화, Snail과 E-캐드헤린 단백질 발현을 확인하였다.

먼저, 대장암 세포에 nM 단위의 니클로사마이드를 0nM, 0.125nM, 0.25nM 및 0.5nM 농도로 24시간 동안 처리한 후, 대장암 세포의 베타-카테닌(β-catenin) 활성과 TCF/LEF reporter (Topflash) 활성 변화를 측정하였다.

베타-카테닌은 β-catenin (#610154, BD Transduction, 1:5,000) 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하였으며, 그 결과, 도 1의 B(좌측)에 나타난 바와 같이, 대장암 세포에서의 베타-카테닌의 발현은 니클로사마이드의 처리 농도가 높아짐에 따라 감소하였다.

TCF/LEF 전사활성은 리포터 유전자의 100ng과 transfection control pRL-SV40-Renilla의 1ng로 형질전환하였다. 리포터 활성도는 감염 48시간 후에 듀얼 루시페라아제 에세이 시스템(Promega)으로 측정하고 공동 형질전환된 renilla 활성을 측정하여 표준화하였으며, 리포터 유전자 활성도는 음성대조군으로부터 획득한 빛 단위에 비례하여 빛 단위로 나타내었다.

그 결과, 도 1의 B(우측)에 나타낸 바와 같이, TCF/LEF 전사활성은 니클로사마이드의 처리 농도가 높아짐에 따라 감소하였다.

웨스턴 블럿을 통하여, Snail의 발현 변화를 확인하였으며, 듀얼 루시페라아제 에세이 시스템을 통하여 E-캐드헤린 단백질의 발현을 확인하였다, 그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이 니클로사마이드의 처리 농도가 높아짐에 따라 Snail의 발현이 감소하는 반면에, 도 2B에 나타난 바와 같이, E-캐드헤린은 증가하였다.

니클로사마이드 처리에 의하여, E-캐드헤린 전사 억제제로서 기능하는 Snail이 감소하여, 대장암 세포에서 E-캐드헤린 프로모터 활성이 증가된 것으로 판단된다.

실시예 3: 니클로사마이드의 대장암 세포에서의 Axin2 기능 억제확인

니클로사마이드가 대장암 세포에서 Axin2의 기능을 억제하는지를 확인하기 위하여 세포 핵 내의 GSK3 양의 변화를 확인하였다.

대장암 세포주 HCT116, SW480 및 DLD-1 세포에 0.25nM의 니클로사마이드를 24시간 동안 처리한 후, 핵-세포질 분획의 GSK3, β-catenin 및 Snail의 양을 면역블러팅 분석하였다.

세포 내의 Snail과 GSK3 단백질의 양은 저장액 용액에서 핵과 세포질을 분리하여 확인하였다(Kim NH, et al., Sci Signal. 4:ra71, 2011; Yook JI, et al. Nat Cell Biol., 8:1398-140, 2006). 간단하게, 대장암 세포(1 x 10⁶세포)를 원심분리 튜브에 모은 후, PBS로 세척하고, 얼음에서 5분간 저장액 버퍼(10 mM HEPES, pH7.9; 10 mM KCl; 1 mM DTT with protease inhibitors) 400 μl로 처리한다. 세포막은 10% NP-40의 추가로 파괴하여 최종농도를 0.6% 최종농도로 맞춘 후, 잘 섞은 후, 30초간 고속원심분리하였다. 상층액에서 세포질 분해물을 분리하고, 핵 침전물은 차가운 PBS로 두번 세척하였다. 핵 단백질은 15분 동안 얼음에서 고장액 버퍼(20 mM HEPES, pH7.9; 0.4 M NaCl; 1mM DTT with protease inhibitors)를 처리해서 추출한 후 고속원심분리하고, 핵-세포질 분획의 GSK3, β-catenin 및 Snail의 양을 면역블러팅 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 니클로사마이드 처리에 의하여, 핵의 GSK3가 증하였으며, 베타-카테닌과 Snail의 양은 감소하는 것으로 확인되었다.

상기 결과는 니클로사마이드가 대장암 세포에서 Axin의 기능을 조절할 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 4: 니클로사마이드의 Axin-GSK3 복합체 형성 억제능 확인

니클로사마이드가 Axin-GSK3 상호작용을 억제할 수 있는지를 확인하기 위하여, 니클로사마이드의 유무조건 하에서 면역침강 실험을 수행하고자 full-length Axin2를 가지는 세포 용해물을 조사하였다.

면역침강 어세이는 다음과 같이 수행하였다(Yook JI, et al. Nat Cell Biol.8:1398-1406, 2006).

독시사이클린-유도된 His-tagged Axin2 발현 벡터를 MCF-7 세포(ATCC, American Type Culture collection)로 형질전환하여 배양하고, 전체세포의 Triton X-100 용해물에 Ni-Ti 비드 (Invitrogen)와 각 농도의 니클로사마이드를 처리하여 반응시켰다. 비드에 회복된 단백질은 SDS-PAGE를 수행한 후, GSK3 용 면역블럿 분석을 수행하였으며, 1/20 부피의 대조군을 넣었다.

그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이,니클로사마이드가 전체 세포 용균액에서 Axin2와 결합하는 GSK3를 감소시키는 것을 확인하였다.

종래 발표된 Axin-GSK3 결합의 구조 분석 결과에서는 Axin의 알파 헬릭스의 소수성 잔기가 GSK3의 C-말단 루프에 의해 형성된 소수성 홈으로 쌓인다고 개시하고 있어(Dajani R et al., EMBO J. 22:494-501, 2003), 본 발명자들은 니클로사마이드가 GSK3의 소수성 홈에 결합하여 Axin의 기능을 방해할 것이라는 가설을 세우고, 이를 확인하기 위하여, 19-mer FITC-결합된 Axin 펩타이드와 결합하는 재조합 GSK3의 니클로사마이드에 의한 경쟁적인 저해를 확인하기 위한 시험관 내 분석을 디자인하였다.

His-tagged 재조합 GSK3베타는 알려진 방법으로 sf9 곤충세포로 부터 얻었다(Lee DG, et al. Nat Commun. 5:4423, 2014). 양친매성의 알파-helix로서 GSK3와 결합하는 것으로 알려진 FITC-결합 19-mer Axin 펩타이드(Axin1, 383-401,VEPQKFAEELIHRLEAVQR)는 화학적으로 합성하였다(Peptron). 합성된 Axin 펩타이드와 니클로사미이드의 경쟁적인 결합을 확인하기 위하여, His-tagged 재조합 GSK3와 Ni-Ti 비드를 니클로사마이드와 함께 2시간 동안 처리하고, PBS로 3번 세척한 후, Ni-Ti 비드를 사용하여, 정량적인 형광 측정을 수행하였다. 형광 강도는 3회 실험으로부터 음성대조군에서 획득한 형광 강도와 비례하여 나타내었다.

그 결과, 니클로사마이드의 투여 농도에 비례하여 재조합 GSK3와 합성된 Axin 펩타이드사이의 상호작용이 억제되는 것을 확인하였다(도 4B).

니클로사마이드가 GSK3에 직접적으로 결합하는지를 확인하기 위하여, 표면 플라즈마 공명(SPR) 분석을 실시하였다.

SPR은 ProteOnTM XPR36 Protein Interaction Array system (Bio-Rad Laboratories, Inc., CA, USA)을 사용하였으며, 정제된 재조합 GSK3 베타는 ProteOn GLH sensor chip에 고정하였다. 니클로사마이드 또는 19-mer 야생형 Axin 펩타이드 또는 변이된 펩타이드(VEPQKAAEEAIHRAEAVQR, mutation underlined)는 각각 다른 농도에서 phosphate-buffered saline + Tween 20 + 1% DMSO로 희석한 후, 100μl/min의 속도로 칩에 흘려보내었으며, 결과는 ProteOn Manager Software 2.0 using the standard Langmuir models for fitting kinetic data에 의해 분석하였다. 복합체 형성률은 결합상수(ka, in the unit of M-1s-1)로 표시하였고, 복합체 감쇄율은 해리상수(kd, in the unit of s-1)는 하기 평형식 1과 같이 표시하였다.

ka

A+B ⇔ AB (1)

kd

고친화도 상호작용은 낮은 해리상수로 나타나고, 점진적 인식과 상호작용체와의결합(rapid "on rate," or high ka), 복합체 형성의 안정도(slow "off rate," or low kd)는 식 KD = kd/ka 와 같다.

그 결과, 도 5A 및 B에 나타난 바와 같이, 야생형 Axin 펩타이드나 니클로사마이드는 GSK3에 직접적으로 결합하였다. 평형해리상수는 SPR분석에서 각각 K_D값이 35 μM, 34 μM이다. 센서 표면에서 GSK3 단백질에 고정시키는 소수성 잔기에 돌연변이를 가지는 변이된 Axin 펩타이드는 100마이크로몰까지 결합하지 못했다.

또한, GSK3의 Axin 결합 부분과 니클로사마이드의 상호작용을 구조적으로 분석하기 위해, 분자 도킹 분석을 수행하였다.

분자 도킹 측정은 Maestro 10.4 molecular docking suite를 사용하였다. Axin 펩타이드가 붙어있는 사람(pTyr216)-GSK3β의 결정구조는 RCSB Protein Data Bank (PDB ID: 3ZDI)로 측정하였다. 모든 물 분자들과 금속 이온들을 제거되고 수소 원자를 단백질에 추가하였으며, 샘플과 다른 리간드에 생리적인 pH에 양자를 부가하기 위해 Epik module을 사용하였다. 모든 화합물은 LigPrep를 사용하여 에너지를 최소화하고 standard precision (SP) module of the Glide docking module within the Schrodinger Suite을 사용하여 수용체 구조에 도킹시켰다. Glide 도킹 분석에 앞서, 공동 결정 리간드의 중심에 수용체 grid box를 생성시켰다. 기하학적 형태를 최적화하기 위하여 post-minimization을 수행하였다.

그 결과, 도 5C에 나타난 바와 같이, 니클로사마이드의 1-클로로-3-나이트로벤젠 그룹은 인간 GSK3베타의 Val 263, Leu 266, Val 267 및 Ile 270 잔기로부터 형성된 소수성 구멍에 들어가고, π-π 상호작용을 통하여 Phe 293 잔기에 쌓여졌다. 니클로사마이드는 추가적으로 Pro294, Thr275, Val 263와 수소결합을 형성하고, Axin-GSK3 표면에서 Tyr288와 할로겐 결합한다. 따라서, 니클로사마이드는 단백질-단백질 상호작용(PPI)을 억제함으로서 Axin-GSK3 복합체를 방해하는 것으로 확인되었다.

실시예 5:니클로사마이드의 상피-간엽 전환(EMT) 복원능 확인

Snail에 의한 상피-간엽 전환(EMT)은 세포 이동과 종양 형성의 잠재력을 증가시킨다. 니트로사마이드의 상피-간엽 전환(EMT) 복원능을 확인하기 위하여, 니트로사마이드가 대장암세포의 이동능과 대장암 세포의 종양형성에 미치는 영향을 확인하였다.

먼저, 니트로사마이드가 대장암세포의 세포이동능에 미치는 영향을 확인하였다. 대장암 세포주 HCT116, SW480 및 DLD-1 세포를 니트로사마이드 유무조건에서, 48시간 배양 후에 막의 위쪽을 면봉으로 문지르고 기저막에 삽입된 세포 이동의 수를 0.25% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 카운팅하였다. 세포는 5개의 무작위 필드에서 카운팅하였다.

그 결과, 니클로사마이드를 nM 수준으로 처리했을 때, 대장암 세포의 이동 잠재력은 크게 감소하였다(도 6A).

다음으로, HCT116, SW480 세포의 생체 내 실험에서 종양 형성 잠재성의 니클로사마이드의 영향을 조사하였다.

암컷 무흉선의 누드 쥐(6주령)에 대장암 세포주 HCT116 (5 x 10⁶세포)와 SW480 (5 x 10⁶세포) 를 100 μl PBS에 섞어 옆구리 피하조직에 주사하였다. 쥐는 무작위로 두 그룹으로 배정하고 복강 내 매일 vehicle 과 니클로사마이드를 주입하고 24시간동안 처리하였다. 니클로사마이드는 10% Cremophor EL (BASF)와 0.9% NaCl로 용해시킨 후, 복강 내 주사하였다. 대장암 세포 주입 후에 쥐는 매일 관찰하고, 주마다 2번 무게 변화를 측정하였다. 그리고 종양이 관찰될 때 calipers로 측정하였다. 종양 크기는 방정식 (LXW2)/2로 계산하였다. 여기서, L은 종양의 긴 지름이고 W는 짧은 지름이다.

그 결과, 도 6B에 나타난 바와 같이, 니클로사마이드의 복강 내 투여는 생체 내 실험에서 대장암 세포의 종양 성장을 상당히 억제하였다(도 6B).

Snail-메개 EMT를 조절하는 니클로사마이드의 생체 내 MoA를 조사하기 위하여, 종양 이종이식 실험(xenografts)을 통하여, 니클로사마이드 처리에 의한 종양 내의 Snail과 E-캐드헤린의 단백질양 변화를 확인하였다.

누드 마우스에 대장암 세포주인 SW480 세포 (5 x 10⁶)를 피하로 주사하였다. 종양의 크기가 평균 500 mm³이 되었을때, 쥐를 무작위로 3그룹으로 나누고 vehicle 또는 니클로사마이드(50 mg/kg, 200 mg/kg)를 복강 내에 3일 동안 주사하였다. 취를 희생시킨 후, Pro-prep protein extraction solution (#17081, Intron)을 사용하여 종양 조직 부분을 분리하였으며, 종양 샘플 안에 있는 Snail과 E-캐드헤린의 단백질의 양을 면역블럿 어세이로 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 생체 내 실험 샘플에서 Snail 존재는 감소하는 반면에, E-캐드헤린의 양은 니클로사마이드의 처리농도가 증가함에 따라 함께 증가하였다.

상기 결과들로부터, 니클로사마이드가 Snail-메개 EMT를 복귀시킴으로서 종양 형성 잠재성을 억제하는 것을 알 수 있다.

실시예 6: 니클로사마이드에 의한 아데노마(선종) 형성 억제능 확인

APC 유전자의 돌연변이에 의하여 발생하는 선종성 대장암과 가족성 선종성 용종증(FAP)의 치료에 니클로사마이드의 효과를 확인하였다.

니클로사마이드가 Axin-GSK3 억제를 통해 Wnt 활성과 EMT를 억제한다는 실시예 2~5의 결과를 바탕으로, 니클로사마이드가 돌연변이 APC로부터 유도된 TCF/LEF 전사 활성을 약화시킬 수 있는지를 확인하였다.

293 세포(ATCC)에 돌연변이 APC 발현 벡터인 pCMV-neo-Bam APC 1-1309 (#16508, Addgene) 또는 pCMV-neo-BamAPC 1-1941 (#16510, Addgene) 및 Topflash 리포터 벡터를 형질감염시킨 후, 니콜로사마이드(0μM, 0.125μM, 0.25μM 및 0.5μM)을 24시간 처리하였다. TCF/LEF 전사 활성은 실시예 2와 동일하게 luciferase 활성을 측정하여 정량하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 293 cell에 돌연변이 APC를 형질전환시켰을 때, TCF/LEF 전사활성은 증가하였고, 니클로사마이드는 투여-농도가 증가함에 따라 증가된 전사활성은 감소하였다.

또한, in vivo에서 니클로사마이드의 치료효과를 확인하기 위하여, APC-MIN (multiple intestinal neoplasia, APCΔ850) mice 모델에서 선종 형성에 미치는 니클로사마이드의 영향을 확인하였다.

APC-MIN 쥐는 야생형 C57BL/6J (APC+/+) 암컷과 MIN C57BL/6J (APCMin/+) 수컷의 교배로 만들었으며, APC-MIN 자손은 PCR-based assay로 식별하여, 3주령에서 하위집단에 무작위로 배정했다. vehicle 또는 니클로사마이드(50 mg/kg)를 매일(6 days/week) 복강내 주사하였고, 쥐는 매일 관찰하고, 매주마다 두번 무게를 측정하였다. 14주 종료 후, 쥐를 희생하고, 전체 창자를 수득하여, 창자 조각을 가위로 세로로 연 후, 살린으로 세척하고 펼친 후, 조직을 수득하였다. 조직은 10% 포르말린으로 24시간 동안 고정하고 70% 알콜로 세척하였다. 고정된 창자 조직은 입체 현미경을 사용하여 관찰하였으며, 선종의 크기를 (small, < 1 mm; medium 1~3 mm; large > 3mm) 구별하여, 각 쥐마다 카운트하였다. 경구 투약의 경우, APC-MIN 쥐는 15% sugar gel vehicle이 섞인 니클로사마이드를 매일(6 days/week) 14주 동안 섭취시켰다. 선종의 수와 사이즈는 입체현미경으로 측정하였다.

그 결과를 도 9에 나타내었다. 니클로사마이드를 복막 내에 투여한 쥐의 경우 14주에, 장내 선종은 상당히 줄어들었다. 반면에 몸무게에는 변함이 없었다. 14주 동안 니클로사마이드를 경구투여한 APC-MIN 모델에서는 장내 선종 형성이 상당히 억제되었으며, 약물 치료동안에 실험동물은 안정적이었다.

이 결과를 통하여 니클로사마이드가 FAP 환자를 위한 새로운 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 7: 니클로사마이드에 의한 Helicobacter 기능 억제

니클로사마이드가 Axin-GSK3 억제를 통해 Wnt 활성과 EMT를 억제한다는 실시예 2~5의 결과와 헬리코박터 (Helicobactor pyroli)의 CagA가 Axin과 유사하게 GSK-3와 결합 한다는 점에 착안하여 니클로사마이드에 의한 Helicobactor pyroli의 CagA에 의한 GSK-3 결합 및 Snail 유도 효과를 확인하였다. 이 샘플에 다양한 양의 니클로사마이드를 넣은 후 면역침전법으로 검사하였을 때, Axin2와 유사하게 니클로사마이드에 의해 CagA와 GSK3의 결합이 억제됨을 확인하였다 (도 10A). 또한 293 세포에 CagA와 Snail 발현을 유도한 후 니클로사마이드를 처리하면 CagA에 의한 Snail 발현을 억제함을 볼 수 있다 (도 10B) 이러한 결과는 니클로사마이드가 Axin과 유사한 기능을 수행하는 CagA의 기능을 억제하여 헬리코박터에 의한 위암 발병과 염증을 억제하는 것을 알 수 있다.

이 결과를 통하여 니클로사마이드가 헬리코박터 감염 환자를 위한 새로운 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (3)

1. 니클로사마이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 가족성 대장용종증(FAP, familial adenomatosis polyposis) 및 헬리코박터 감염에 의한 위염으로 구성된 군에서 선택되는 Axin-GSK3 단백질 결합 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
   
   
   
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