KR102102993B1 - 니클로사미드 및 메트포르민을 포함하는 가족성 선종성 용종증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 병용 투여하여 가족성 선종성 용종증을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 병용으로 인해 가족성 선종성 용종증에 대한 예방 또는 치료에 현저한 시너지 효과를 발휘한다.

Description

니클로사미드 및 메트포르민을 포함하는 가족성 선종성 용종증 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating familial adenomatous polyposis comprising niclosamide and metformin}

본 발명은 가족성 선종성 용종증(familial adenomatous polyposis, FAP)을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 가족성 선종성 용종증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

가족성 선종성 용종증은 5번 염색체에 위치하는 선종성 용종증균 (Adenomatous Polyposis Coli, APC) 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 상염색체 우성 질환이다. APC 유전자의 돌연변이로 인해 선종-암 연속체의 진행이 일찍 진행되어, 10-20대의 젊은 환자들에서도 무수히 많은 용종(선종, 샘종)이 발생할 수 있다. 또한 선종성 용종증은 상부위장관에서도 발생할 수 있는데, 특히 십이지장에서 잘 생길 수 있으므로 상부내시경을 통한 주기적인 감시가 필요하다.

상피간엽이행(EMT, Epithelial-mesenchymal transition)은 상피 기원 암세포가 세포-세포 부착 변화, 세포 극성 및 전이성, 침습성, 및 증가된 이동성과 같은 고유한 상피 특성을 상실하는 생물학적 메커니즘이다. 대부분의 고형 종양은 상피 세포로부터 유래된 암종이다. 암종 세포는 이동성을 획득하고 인접 세포에 대한 세포-세포 유착을 감소시킴으로써 원발성 종양 근처의 침습, 혈관 침투 및 순환에 관여하고, 이들은 먼 기관으로 이동 및 콜로니화되어 거시적 전이를 형성한다. 암 환자의 90%는 원발성 종양이 아닌 전이 및 재발로 인해 사망하기 때문에, 암 전이의 예방은 암 치료에 매우 중요하다. EMT는 Wnt 의존 Snail 발현에 의해 투여되는 침투 및 전이와 관련된다. Snail, 징크-핑거 전사 인자는 종양 형성 및 발달에서 E-카드헤린의 전사 인자 억제제로서 작용하고 EMT를 유도한다. 따라서, E-카드헤린의 발현 감소는 악성 종양의 예측인자이다. MCF7 세포가 Snail로 과발현된 경우, 세포 침습이 증가하고 E-카드헤린의 발현은 감소하며, Wnt가 과발현된 경우에도 Snail은 E-카드헤린의 발현을 증가시킨다. 이러한 결과는 Snail이 EMT에서 유도제 역할을 수행함을 나타낸다.

Axin2는 Wnt 경로를 통해 Snail-매개 EMT 과정에서 중요한 역할을 수행한다. Snail의 분해를 유도하는 GSK3β는 핵으로부터 나와서, 핵을 안정화시키고 EMT를 유도한다. GSK3β는 Axin2에 의해 세포질에서 발견되며, Snail의 핵 내 발현을 증가시킨다. 핵 내 안정화된 Snail은 E-카드헤린의 전사 억제제로 작용하며 EMT를 유도한다. 따라서, Axin2는 Wnt 신호전달을 통한 Snail-매개 EMT를 조절하는데 매우 중요한 역할을 수행한다. 한편, Hippo 경로는 장기 크기, 항상성, 암 발달을 조절하는 고도로 보존된 경로이며, 포유동물에서 매우 보존되어 있다. 포유동물에서 Hippo 경로는 Mammalian sterile 20-유사 1/2(MST1/2), Salvador(SAV1), 큰 종양 억제제 유사체 1/2(Large tumor suppressor homolog 1/2, LATS1/2), 및 yes-관련 단백질(YAP), PDZ 결합 모티프를 갖는 전사 공동-활성자(transcriptional co-activator with PDZ binding motif, TAZ), TEA 도메인 패밀리 멤버(TEAD)로 구성된다.

Hippo 경로가 활성화되면, MST1/2 키나제는 SAV1에 결합하여 LATS1/2를 인산화하여 LATS1/2를 활성화시킨다. 활성화된 LATS1/2는 YAP를 인산화시키고, 이후 YAP을 활성화시켜 세포질 격리 및 분해를 유도한다. Hippo 경로가 활성화될 때, YAP의 인산화는 감소되며 핵 내에 남아있으며, YAP은 핵 내로 이동하여 TEAD의 전사 인헨서 인자(TEF) 패밀리에 결합하여 표적 유전자를 발현한다. 일반 세포에서, 세포간 접촉 세포의 증식은 Hippo 경로에 의해 제한된다. 그러나 암 세포와 같은 접촉 억제 이상의 경우, Hippo 경로가 억제되고 개인 및 세포 성장의 크기가 제어될 수 없고, 과도한 세포 증식 및 세포 사멸의 억제를 초래하여 종양 형성에 기여한다.

암이 진행되는 동안 Hippo-YAP 경로와 함께 Wnt 경로와 관련된 종래의 연구에서 Hippo-YAP 신호전달이 Wnt 신호전달을 억제하는 것으로 보고되었다. 그러나, 최근 연구에서 Wnt 신호전달은 Dishevelled (DVL)를 통해 YAP을 조절하는데 중요한 인자인 것으로 보고되었다. DVL은 Wnt 신호전달의 활성제로써, 인산화된 YAP에 결합하며, 이후 YAP의 활성화를 억제하기 위해 세포질로 YAP을 수송한다. 종양 억제제 p53 또는 LKB1 축이 정상일 때, Wnt 신호의 활성화제인 DVL은 YAP의 세포외 수송을 억제할 수 있으나, p53 또는 LKB1 축이 결함될 때, Wnt 및 Hippo-YAP 경로는 동시에 성장 및 크기를 모두 조절한다. 유방암 환자의 20년 생존률을 분석할 때, YAP 표적 유전자, 결합 조직 성장 인자(CTGF), 및 Wnt 신호 표적 유전자 Axin2가 동시에 발현될 때, p53 유전자의 돌연변이는 돌연변이가 없는 경우에 비해 예후가 좋지 않았다. 암 진행중 Wnt 및 Hippo-YAP 신호전달의 비정상적인 활성화는 암 예후 예측 암에서 중요한 바이오마커일 수 있다.

화학예방요법(chemoprevention)이란 약물이나 자연물을 이용해 암 또는 전암병변의 발생을 예방하거나 연장시키는 것을 말한다. FAP 환자는 많은 수의 용종이 발생하기 때문에 화학예방요법의 좋은 타겟 질환이 될 수 있다. FAP 환자에게 화학예방요법을 수행할 때, 결장 또는 직장에서 선종성 용종의 발생 및 증식을 억제하고, 대장 외의 다른 장기(예를 들어 십이지장 등)에서 선종성 용종의 발생을 예방하는 효과를 기대할 수 있다.

현재까지 FAP 환자에서 주로 연구된 화학예방요법 약제는 비스테로이드 항염증제(Non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)이다. NSAIDs는 아라키돈산(arachidonic acid)을 프로스타글란딘(prostaglandin)으로 전환하는 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase)를 억제한다. 프로스타글란딘은 선종-암화 과정에서 주요한 역할을 담당하는데 세포접착 변화, 세포사멸 억제, 또는 신생혈관 생성을 촉진한다. 사이클로옥시게나제는 COX-1 및 COX-2가 있으며 선종의 발생과 진행과정에는 주로 COX-2가 관여한다. 22명의 FAP 환자를 대상으로 한 무작위 이중맹검 위약 대조군 연구에서 설린닥(sulindac) 150mg을 9개월간 하루에 두번(bid) 투약하였을 때 용종의 개수 및 너비에 유의한 감소가 있었다. 수술 받지 않은 환자 18명을 분석하였을 때 약을 중단한 이후에도 9개월까지 효과가 지속되었다. 설린닥은 수술 후 직장이 남아 있는 환자에서도 직장 선종의 재발을 유의하게 억제하였으나, 최종적으로 암의 진행을 예방하는 효과에 대해서는 아직 입증되지 않았다. 설린닥에 의한 소화기계 부작용을 예방하고자 선택적 Cox-2 억제제가 화학예방요법으로 이용되었다. 77명의 FAP 환자를 대상으로 진행된 이중맹검 위약 대조군 연구에서 6개월간 세레콕시브(celecoxib) 100mg 또는 400mg bid 또는 위약을 투약하였을 때, 위약군과 비교하여 세레콕시브 400mg을 투약받은 환자에서 용종의 개수가 28% 감소하였으며(p=0.003), 용종의 크기는 30.7% 감소하였다(p=0.001). 선택적 Cox-2 억제제는 소화기계 부작용 없이 뚜렷한 효과를 보였지만, 용량에 비례하여 심장 및 뇌혈관 독성이 발생하여 사용이 제한적이다. 또한 최근에 기존의 설린닥 150mg bid와 항암제로 사용되어 온 엘로티닙(erlotinib) (EGFR 티로신 키나제 억제제) 75mg의 6개월 병합 투약이 위약군에 비해 대장 용종을 69.4% 감소시키는 효과를 보였다. 그러나, 엘로티닙의 투약은 피부병변, 구강점막염, 또는 설사 등의 부작용이 발생하여, 용량 조절 및 장기투약 효과에 대한 추가 연구가 필요한 상태이다.

한편, 메트포르민(Metformin)은 비구아니드 유도체로 제2형 당뇨병 치료제로 널리 사용되고 있다. 메트포르민은 간내 포도당 생성을 억제하고 말초조직에서 인슐린 저항성을 호전시킨다. 메트포르민은 인슐린 분비를 직접 자극하지 않기 때문에 저혈당의 부작용이 낮고, 정상인에서는 혈당 저하 효과가 없다. 혈당이 상승되어 있거나 당내불인성이 있는 환자에서 당뇨병 발생을 예방하기 위해 진행한 당뇨병 예방 프로그램(Diabetes Prevention Program, DPP)에서, 메트포르민을 7-8년간 투약하였을 때 중증의 부작용은 발생하지 않았다. 가장 흔한 부작용은 오심, 상복부 불쾌감, 설사, 또는 변비 등의 위장관계증상이며 약 4%의 환자에서 부작용으로 약물 복용을 중단하였다. 그러나 대부분의 위장관계 부작용 증상은 1개월 정도의 적응 기간을 거쳐 회복된다. 그 외 메트포르민은 투약군에서 약간의 체중감소를 보일 수 있다. 또한 metformin은 직접적으로 인슐린 분비를 자극하지 않기 때문에 비당뇨병 성인에서 저혈당을 일으키지 않는다.

또한, 니클로사미드(Niclosamide)는 1958년에 개발되어 현재까지 오랫동안 촌충 치료제로 사용되는 구충제의 하나이며, 세계 보건기구(World Health Organization, WHO)의 필수 의약품 목록에 가장 효과적이고 안전한 의약품으로 등록되어 있다. 기생충 감염 치료에서 권고한 바에 따르면 다양한 기생충에 따라 어른의 경우 2g의 단일 투여량으로 최대 2주간 투여를 권장한다. 니클로사미드는 전세계적으로 광범위하게 사용되어 왔으며, 경구 투여에 따른 부작용은 매우 적은 것으로 알려져 있다(1-4%). 예측 가능한 부작용으로는 오심, 복통, 변비, 두통, 식욕부진, 설사, 현기증, 또는 가려움증 등이 있으며, 심각한 부작용은 보고되어 있지 않다. 그리고 이러한 증상의 대부분은 소화기계와 관련한 부작용으로 약물 투여 중단으로 가역적인 회복이 가능하다. 또한 전세계적으로 가장 많이 사용하는 약리학교과서(Goodman and Gilman's, 8^th ed)에는 매우 안전한 약물로(quite free of undesirable effects) 소개되어 있다. 2002년 세계 보건기구의 'WHO Specifications and Evaluation for Public Health Pesticides' 보고서에서 니클로사미드에 대한 장기 섭취시킨 후 독성 검사를 시행한 결과를 공개하였는데, 랫(rat)에 24개월 섭취시켰을 때의 NOAEL(No-Observed-Adverse-Effect-Level)의 용량은 2000 ppm (2000 mg/kg)에 해당하였고, 마우스에 104주간 섭취시켰을 때의 NOAEL은 200 ppm (200 mg/kg)에 해당하였다. 랫 또는 마우스와 인간의 수명을 비교해 볼 때, 랫의 24개월은 인간 수명의 60년에 해당하며 마우스의 104 주는 인간 수명의 약 70년에 해당한다. 상기 임상연구에서 사용된 니클로사미드는 650mg으로 대략 10.8 mg/kg(인체 평균 체중기준 60kg 가정 시)에 해당하므로 인체에서 10.8 mg/kg/day로 6개월 섭취에 따른 독성의 문제는 극히 미미할 것으로 판단할 수 있다. 또한 상기 WHO 자료 및 다른 다양한 독성 자료에 따르면 니클로사미드에 의한 유전 독성이나 암 유발 가능성(carinogenecity)는 전혀 없다고 알려져 있다. 예를 들면 마우스 및 랫에서 5000 ppm (5000 mg/kg), 104 주간 처리에서 암유발 가능성에 대한 증거가 발견되지 않았다. 토끼의 다양한 임신 주기에 대한 니클로사미드의 대용량 투여 (1000 mg/kg)에서 배아독성(embrotoxic)이나 기형 유발(teratogenic effects) 가능성도 없었다.

즉, 메트포르민 및 니클로사미드는 현재까지 상대적으로 매우 안전한 약제로 알려져 있으며, 화학예방요법의 안전성에서 기존 약제보다 적합할 것으로 기대된다. 그러나 아직까지 FAP 환자에서 화학예방요법으로 메트포르민 또는 니클로사미드의 효과에 대한 연구는 없다.

결론적으로, 현재까지 FAP의 치료에 일부 약제의 효과가 증명되었으나, 앞에서 언급한 부작용 등으로 전세계적으로 승인된 약제가 없는 상태이며, 일부 매우 제한적으로 설린닥 또는 세레콕시브 등이 이용되고 있다. 따라서 FAP를 치료하기 위해, 안전하고 효과가 뚜렷한 새로운 화학예방요법 약제가 필요하다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 가족성 선종성 용종증(Familial adenomatous polyposis)에 대한 예방 또는 치료 효과가 우수한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 가족성 선종성 용종증(Familial adenomatous polyposis)에 대해 효과적인 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

가족성 선종성 용종증의 발생과 진행에 있어서 세포 또는 종양 증식과 관련된 여러 신호전달체계들이 피드백 등의 복잡한 상호 작용을 통해 영향을 주게 되므로, 어느 한가지 신호전달 분자를 표적으로 하는 것은 종양 억제 효과가 없거나 미미하게 나타날 수 있다. 본 발명자들은 가족성 선종성 용종증의 치료법을 찾고자 예의 노력한 결과, (a) 니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 (b) 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 병용할 경우 FAP의 치료 또는 예방 효과가 현저히 높아진다는 놀라운 발견을 하였다.

이러한 시너지 효과는, 후술하는 본 발명자들이 확인한 실험결과에 기초한 바와 같이, 니클로사미드의 Axin2-Wnt 신호전달 억제 효과와 메트포르민의 AMPK-mTOR 신호전달 억제 효과가 동시에 작용하여 선종성 용종의 증식에 관련된 대표적인 두가지 신호전달체계를 동시에 억제하고, 상기 두가지 신호전달체계와 Hipp-YAP 경로가 상호 작용할 수 있다는 점에 기인하는 것으로 추측되나, 여러 실험결과를 통해 확인된 이들 병용의 시너지 효과와 관련된 본 발명은 이러한 이론적 기전에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명자들은 APC의 돌연변이가 있는 경우 Wnt와 Hippo-YAP 신호가 활성화됨을 확인하고, Wnt 신호전달의 핵심 물질인 Axin2의 발현을 확인한 결과 APC 돌연변이가 있는 세포주에서 Axin2의 발현이 높음을 확인하였다. 그 중 DLD-1, SW480 세포주를 선택하여 Axin2을 발현을 억제하였을 때, YAP의 활성화가 증가함이 관찰되었으며, Axin2-GSK3 결합을 억제하는 니클로사미드를 처리하였을 때도 같은 결과가 나타났다. Axin2의 발현을 억제하면 핵 내 YAP의 발현이 높아지고 인산화된 YAP(S127)의 발현이 줄어들었다.

반면 메트포르민을 처리 하였을 때 YAP의 활성화가 억제되고 Snail 매개 EMT 관련 인자인 Axin2와 Snail의 발현 또한 감소되었다. 즉, 니클로사미드와 메트포르민을 병용 시 메트포르민이 니클로사미드의 YAP의 활성화 기능을 보완하고, 암세포 성장과 연관된 AMPK-mTOR 신호를 조절하며 Snail 매개 EMT를 효과적으로 억제하였다. 나아가, APC-min 마우스를 이용한 동물 임상 실험을 통해, 니클로사미드 및 메트포르민의 조합은 각각의 단독 투여에 비해 소장 용종의 수를 현저하게 감소시켜, 가족성 선종성 용종증의 예방 또는 치료에 시너지 효과를 발휘함을 확인하였다.

본 발명은 (a) 니클로사마이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 (b) 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 가족성 선종성 용종증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

일 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염으로 적합한 염은 산 또는 염기 부가염과 같이, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것으로 특별히 제한되는 것은 아니다.

일 실시예에서, 상기 니클로사미드의 약학적으로 허용가능한 염은 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성, 또는 산성 아미노산과의 염 등이 포함될 수 있다. 적합한 금속염은 나트륨염, 칼륨염 등과 같은 알칼리 금속염; 칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등과 같은 알칼리 토금속염; 알루미늄염 등이 포함될 수 있다. 유기 염기와의 염은 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 포함될 수 있다. 무기산과의 염은 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 포함될 수 있다. 유기산과의 염은 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 포함될 수 있다. 염기성 아미노산과의 염은 알기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 포함될 수 있다. 산성 아미노산과의 염은 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 포함될 수 있다.

일 실시예에서, 상기 메트포르민의 약학적으로 허용가능한 염은 유기산, 무기산 또는 산성 아미노산과의 염 등이 포함될 수 있다. 유기산과의 염은 초산, 프로피온산, 이소부틸산, 옥살릭산, 말레익산, 말로닉산, 숙신산, 수버릭산, 푸마릭산, 만데릭산, 프탈릭, 벤젠설포닉, p-토릴설포닉, 구연산, 주석산, 메탄설포닉산 또는 그 유사체 등과의 염이 포함될 수 있다. 무기산과의 염은 염산, 브롬산, 질산, 탄산, 일수소탄산, 인산, 일수소인산, 이수소인산, 황산, 일수소황산, 요오드화수소 또는 아인산 및 그 유사체 등과의 염이 포함될 수 있다. 산성 아미노산과의 염은 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 포함될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물의 니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 몰비는 1 : 10~10000, 바람직하게 1 : 100~7000, 더욱 바람직하게 1 : 2000~4000 (니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염)일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물이 니클로사미드 및 메트포르민을 상기 특정한 몰비로 포함하는 경우, 가족성 선종성 용종증의 예방 또는 치료 효과가 현저하게 상승될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 (a) 니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적으로 유효한 양, (b) 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적으로 유효한 양, 및 (c) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 "유효량"은 가족성 선종성 용종을 파괴, 변형, 통제 또는 제거하거나; 가족성 선종성 용종의 확장을 늦추거나 또는 최소화하거나; 또는 가족성 선종성 용종증의 치료 또는 관리에서 치료상 이점을 제공하기에 충분한 니클로사미드 및 메트포르민의 양을 말한다. "유효량" 은 또한 가족성 선종성 용종 세포의 사멸을 야기하기에 충분한 니클로사미드 및 메트포르민의 양을 말한다. "유효량"은 또한 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 어떤 쪽이 든 가족성 선종성 용종의 활성을 억제 또는 줄이기에 충분한 양을 말한다

또 다른 양태에서, 본 발명은 니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 치료적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 가족성 선종성 용종증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 상기 개체는 인간이다.

즉, 본 발명은 니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 이용하는 것을 특징으로 하는 의약 용도를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명의 의약 용도는 본 명세서에서 설명된 가족성 선종성 용종증의 치료 또는 예방 용도이다.

본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 가족성 선종성 용종의 발생, 성장 및 증식의 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 가족성 선종성 용종의 성장 및 증식을 억제하여 가족성 선종성 용종증을 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

일 실시예에서, 본 발명의 니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 일반적으로 치료적으로 유효한 양이 투여된다. 본 발명의 니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임의의 적합한 경로에 의하여 이러한 경로에 적당한 약학적 조성물의 형태, 그리고 의도된 치료를 위하여 효과적인 투여량으로 투여될 수 있다.

일 실시예에서, 니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 효과적인 투여량은 단일 또는 분할 투여로 일반적으로 약 0.0001 내지 약 200 mg/체중kg/일이고, 바람직하게는 약 0.001 내지 약 100 mg/kg/일이다. 또한, 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 효과적인 투여량은 단일 또는 분할 투여로 일반적으로 약 0.0001 내지 약 200 mg/체중kg/일이고, 바람직하게는 약 0.001 내지 약 100 mg/kg/일이다. 나이, 종, 및 치료될 질병 또는 상태(condition)에 따라 이 범위의 하한 미만의 투여량 수준이 적합할 수 있다. 다른 경우에는, 여전히 더 큰 투여량이 해로운 부작용없이 사용될 수 있다. 더 큰 투여량은 하루 동안 투여를 위하여, 여러 작은 투여량으로 분할될 수 있다. 적절한 투여량을 결정하기 위한 방법 들이 본 발명이 속한 분야에 잘 알려져 있다.

가족성 선종성 용종증의 치료를 위하여, 본 명세서에서 설명된 상기 니클로사미드 및 메트포르민, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염들은 다음과 같이 다양한 방법으로 투여될 수 있다

구강 투여(Oral administration)

본 발명의 약학적 조성물은 구강으로 투여될 수 있으며, 구강은 연하(swallowing)를 포함하는 개념이다. 구강 투여에 의하여 본 발명의 약학적 조성물이 위장관(gastrointestinal tract)에 들어가거나, 예를 들어, 구강(buccal) 또는 설하(sublingual) 투여와 같이, 입으로부터 혈류로 직접적으로 흡수될 수 있다.

구강 투여를 위한 적합한 조성물은 고형상, 액상, 겔(gel), 또는 파우더 형상일 수 있으며, 정제(tablet), 로젠지(lozenge), 캡슐(capsule), 과립제, 산제 등의 제형을 가질 수 있다.

구강 투여를 위한 조성물은 선택적으로 장용 코팅(enteric coating)될 수 있으며, 장용 코팅을 통하여 지연된(delayed) 또는 지속된(sustained) 방출을 나타낼 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 구강 투여를 위한 조성물은 즉시 또는 변형된(modified) 방출 패턴을 가진 제형일 수 있다.

액체 제형은 용액, 시럽 및 현탁액을 포함할 수 있으며, 이러한 액상 조성물은 연질 또는 경질 캡슐 내에 함유된 형태일 수 있다. 이러한 제형은 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 셀룰로오스, 또는 오일(oil)을 포함할 수 있다. 상기 제형은 또한 하나 이상의 유화제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다.

정제(tablet) 제형에서, 활성 성분인 약물의 양은 정제 총 중량 대비 약 0.05 중량% 내지 약 95 중량%, 더욱 일반적으로 제형의 약 2 중량% 내지 약 50 중량%로 존재할 수 있다. 또한, 정제는 약 0.5 중량% 내지 약 35 중량%, 더욱 일반적으로 제형의 약 2 중량% 내지 약 25 중량%를 포함하는 붕해제를 함유할 수 있다. 붕해제의 예로는 유당, 전분, 소디움스타치글리콜레이트, 크로스포비돈, 크로스카멜로스소디움(croscarmellose sodium), 말토덱스트린 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

정제로 제조하기 위해 포함되는 적합한 활택제는 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량% 양으로 존재할 수 있고, 탈크(talc), 이산화규소, 스테아린산, 칼슘, 아연 또는 마그네슘 스테아레이트, 소듐 스테아릴 푸마레이트 등이 활택제로 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 첨가제들의 종류에 한정되는 것은 아니다.

정제로 제조하기 위한 결합제(binder)로는 젤라틴, 폴리에틸렌글리콜, 당(sugar), 검(gum), 녹말(starch), 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등이 사용될 수 있으며, 정제로 제조하기 위한 적합한 희석제로는 만니톨, 자일리톨, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 녹말(starch), 미결정셀룰로오스 등이 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 첨가제들의 종류에 한정되는 것은 아니다.

선택적으로 정제에 포함될 수 있는 가용화제는 정제 총 중량 대비 약 0.1 중량% 내지 약 3 중량% 양이 사용될 수 있고, 예를 들어, 폴리소르베이트, 소디움 라우릴설페이트, 소디움 도데실설페이트, 프로필렌 카보네이트, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디메틸이소소르비드, 폴리옥시에틸렌글리콜화된 천연 또는 수소화 피마자유, HCOR^TM(Nikkol), 올레일에스테르, 젤루시어(Gelucire^TM), 카프릴릭/카프릴산 모노/디글리세리드, 소르비탄지방산에스테르, 솔루톨HS^TM 등이 본 발명에 따른 약학 조성물에 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 가용화제의 구체적 종류에 한정되는 것은 아니다.

비경구 투여(Parenteral Administration)

본 발명의 약학적 조성물은 혈류, 근육, 또는 내장 내로 직접 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 방법은 정맥내(intravenous), 근육내(intra-muscular), 피하 동맥내(subcutaneous intraarterial), 복강내(intraperitoneal), 척추강내(intrathecal), 두개내(intracranial) 주사 등을 포함한다. 비경구 투여를 위한 적합한 장치는 (바늘 및 바늘 없는 주사기를 포함하는) 주사기(injector) 및 주입 방법(infusion method)을 포함한다.

비경구 투여를 위한 조성물은 즉시 또는 변형된 방출 패턴을 가진 제형일 수 있으며, 변형된 방출 패턴은 지연된(delayed) 또는 지속된(sustained) 방출 패턴일 수 있다.

대부분의 비경구 제형은 액상 조성물이며, 이러한 액상 조성물은 본 발명에 따른 유효성분, 염, 완충제, 등장화제 등을 포함하는 수용액이다.

비경구 제형은 또한 건조된 형태(예를 들어, 동결 건조) 또는 멸균 비-수용액으로서 제조될 수 있다. 이들 제형은 멸균수(sterile water)와 같은 적합한 비히클(vehicle)과 함께 사용될 수 있다. 용해도 증강제(solubility-enhancing agents) 또한 비경구 용액의 제조에 사용될 수 있다.

국소 투여(Topical Administration)

본 발명의 약학적 조성물은 피부 또는 경피로 국소적으로 투여될 수 있다. 이 국소 투여를 위한 제형은 로션, 용액, 크림, 젤, 하이드로젤, 연고, 폼(foam), 임플란트(implant), 패치 등을 포함한다. 국소 투여 제형을 위한 약학적으로 허용 가능한 담체는 물, 알코올, 미네랄 오일, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜 등을 포함할 수 있다. 국소 투여는 또한 전기천공법(electroporation), 이온도입법(iontophoresis), 음파영동(phonophoresis) 등에 의하여 수행될 수 있다.

국소 투여를 위한 조성물은 즉시 또는 변형된 방출 패턴을 가진 제형일 수 있으며, 변형된 방출 패턴은 지연된(delayed) 또는 지속된(sustained) 방출 패턴일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 니클로사미드 및 메트포르민의 병용을 통해 가족성 선종성 용종증에 대한 치료 또는 예방에 현저한 시너지 효과를 발휘한다. 본 발명의 치료 또는 예방 방법은 니클로사미드 및 메트포르민의 병용을 통해 가족성 선종성 용종증에 대한 치료 또는 예방에 현저한 시너지 효과를 발휘한다.

도 1a, b는 돌연변이 APC를 293 세포에 형질주입시킨 후 TCF/LEF 및 TEAD 리포터 활성을 측정한 결과이다. 도 1c는 단백질 풍부 pSer127-YAP, YAP의 이동성 쉬프트, 도 1d는 CTGF 전사체 및 TEAD 리포터 활성을 Axin2 녹다운을 통해 평가한 것이다.
도 2a, b는 니클로사미드가 CRC 세포에 처리될 때 Axin2, Snail 단백질 풍부도, Axin2 전사 수준, TCF/LEF 활성을 평가한 것이다. 도 2c는 니클로사미드에 따른 pSer127-YAP 풍부도, 포스-태그 겔에서 YAP의 이동성 쉬프트, 핵 YAP 수준을 평가한 것이다. 도 2d는 니클로사미드에 따른 CTGF 전사 및 TEAD 리포터 활성을 평가한 것이다. 도 2e는 모든 세포주에서의 YAP의 인산화를 측정한 것이며, 도 2f는 전체 핵 영역에서 상대적인 형광 강도를 측정한 것이다.
도 3a, b는 면역블롯 분석, 포스-태그 겔상에서 CRC 세포에서 메트포르민 매개 YAP의 조절이 YAP의 이동성 쉬프트, CTGF 전사체 및 TEAD 리포터 활성에 미치는 영향을 평가한 것이다. 도 3c는 mTOR 기질 리포좀 단백질 S6의 인산화를 평가한 것이며, 도 3d는 CRC 세포에서 메트포르민의 전사 수준 및 TCF/LEF 리포터 활성을 평가한 것이다.
도 4a는 면역블롯 분석을 통해 니클로사미드 및 메트포르민의 병용 투여시 핵 YAP 및 p-Ser127-YAP의 발현을 평가한 것이다. 도 4b는 CTGF 전사 수준 및 TEAD 리포터 활성을 평가한 것이다. 도 4c는 면역형광분석을 통해 니클로사미드 및 메트포르민의 병용 투여 그룹에서 핵 YAP를 평가한 것이다.
도 5a는 니클로사미드 및/또는 메트포르민의 투여시 AMPK 활성화를 평가한 것이며, 도 5b는 인산화된 AMPK에 의한 ATP 수준을 평가한 것이다. 도 5c는 mTOR 이펙터로서 작용하는 S6의 활성화를 평가한 것이다.
도 6a, b는 면역블롯 분석을 통해 Wnt 신호전달(도 6a), Axin2 전사 수준(도 6b 왼쪽), 및 TCF/LEF 리포터 활성(도 6b 오른쪽)을 평가한 것이다. 도 6c는 상피 마커 및 중간엽 마커의 증가 또는 감소를 확인한 것이며, 도 6d는 CRC 세포의 이동을 평가한 것이다.
도 7a는 약물 투여에 따른 마우스의 체중 변화이며, 도 7b-d는 약물 투여에 따른 종양원성 잠재력이 억제됨을 확인한 것이다.
도 8a는 약물 투여에 따른 마우스의 체중 변화이며, 도 8b는 약물 투여 14주 후 소장 용종의 수를 측정한 것이며, 도 8c는 입체 현미경을 통해 소장의 용종을 관찰한 결과이다.
도 9는 면역형광분석을 통해 FAP 오르가노이드에 니클로사미드 및 메트포르민의 병용 치료 효과를 평가한 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실험 재료 및 방법

1. 세포 배양, 형질주입(transfection) 및 시약

둘베코 수정 이글 배지(Dullbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM, Lonza, 12-604F)에서 배양된 DLD-1 (ATCC, CCL-221) 및 인간 배아 신장 293 세포 및 SW480(한국 세포주 은행, KCLB No. 10228)를 10% 태아 소혈청 (FBS, Life technologies) 및 100 IU / ml 페니실린/스트렙토 마이신을 사용하여 Roswell Park Memorial 연구소 1640(RPMI 1640, Lonza, 12-702F)에서 성장시켰다. SW480 및 DLD-1 세포는 절단된 APC 유전자를 보유하는 세포이다. 모든 세포를 37℃ 및 5% CO₂의 가습 인큐베이터에서 배양하였다. Tet-pLKO-puro 벡터(Addgene으로부터 수득한 #21915)를 유도성 shRNA 녹다운에 사용하였다. Axin2에 대한 shRNA의 표적 서열은 5'-ACCACCACTACATCCACCA-3'(서열번호: 1)이었다. 돌연변이 APC 발현 벡터 pCMV-neo-Bam APC 1-1309(# 16508) 및 pCMV-neo-Bam APC 1-1941(# 16510)을 Addgene으로부터 수득하였다. 마이코플라즈마 감염 테스트는 PCR 기반 키트(시그마, MP0040)로 수행되었다. 형질주입은 제조사의 프로토콜(Invitrogen, 11668-019)에 따라 Lipofectamine 2000에 의해 수행되었다. 니클로사미드(2 ', 5-dichloro-4'-nitrosalicylanilide)는 CAYMAN에서 구입했으며, 메트포르민은 TCI America(TCI, M2009)에서 수득하였다. 니클로사미드 및 메트포르민을 인비트로(in vitro) 실험에서 DMSO 및 증류수에 용해시켰다.

2. 세포 이동 분석

니클로사미드 및 메트포르민에 관한 이동 분석을 위해, DLD-1, SW480 세포 (5 Х 10⁴)를 트랜스웰 삽입물 (5.0 μm 구멍(pore), BD Biosciences)에 시딩하였다. 세포에 1 x PBS 및 면직물을 첨가하기 전에 필터 삽입물을 미리 적셨다. 하부 챔버에 1mL의 배지를 첨가했다. 삽입물 상단의 배지에 5 Х 10⁴/100ul의 세포를 추가하였다. 48시간 배양 후 0.5 μM 니클로사미드 및 5mM 메트포르민을 함유하는 배지를 하단에 첨가한 후, 1xPBS로 18시간 동안 2 회 세척하고 4% 포름알데히드로 고정시켰다. 위쪽 부분은 면으로 닦고, 아래쪽 부분의 셀은 0.25% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 5개의 무작위 필드에서 세포 수를 측정하였다.

3. 면역블롯 분석

니클로사미드 및 메트포르민을 16시간 동안 처리 한 다음, PBS로 2회 세척하고 1% 트리톤 X-100 용해 완충액(50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % triton X-100)과 함께 배양하였다. 세포를 스크래퍼를 통해 수집하고 4℃에서 15분 동안 13,200rpm으로 원심분리 하였다. 핵 단백질 분획의 분리를 위해, 10% Nonidet NP-40이 첨가된 버퍼A(10mM HEPES[pH7.9], 10mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT) 및 버퍼C(20mM HEPES[pH7.9], 0.4M NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT)로 5분(버퍼A) 및 15분(버퍼C) 동안 얼음상에서 용해시켰다. 제조자의 지침에 따라 전체 및 핵 추출이 사용되었다. 상청액을 수집하고 새로운 튜브로 옮겨 단백질 용출액을 추출하였다. BCA 단백질 분석(Thermo)을 사용하여 단백질을 정량하고, 5x 샘플 완충제를 첨가하고 10분 동안 끓인 후 얼음에 저장하였다. SDS-폴리아크릴아미드를 전기영동에 의해 분리하고 니트로셀룰로스 막(Whatman)으로 옮겼다. 이송 후, 막을 5% 탈지유(BD bioscience)로 1시간 동안 차단하고, 실온에서 3시간 동안 또는 4℃에서 12시간 이상 동안 배양하였다. 로딩 제어 HDAC1과 비교한 상대적 YAP 풍부도는 NIH (https://imagej.nih.gov/ij/)에서 다운로드한 ImageJ 프로그램을 통해 결정하였다. Snail (Cell Signaling, #3895S), Axin1 (Cell signaling, #2087S), Axin2 (Cell Signaling, #2151S), YAP (Sanatacruz, sc-101199), p-YAP(S127) (Cell Signaling, #4911S), S6 (Cell Signaling, #2217S), p-S6(S235/236) (Cell Signaling, #4858S), α-Tubulin (Ab frontier, LF-PA0146A), HDAC1 (Santacruz, sc-81598)에 대한 항체는 상용 업체로부터 얻었다. 포스-태그 겔(Phos-tag gel)은 WAKO Chemicals (AAL-107)로부터 구입하였다. WEST SAVE(Ab frontier, LF-QC0101) CP-BU MEDICAL X-RAY FILM BLUE (AGFA)을 사용하여 검출을 수행하였다.

4. 정량적 실시간-PCR 및 리포터 분석

전체 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen)으로 추출하였다. cDNA는 SuperScript III 합성 키트(Invitrogen)를 사용하여 제조하였다. SYBR 그린 믹스 프로토콜(n = 3)에 따라 ABI-7300 기기로 실시간 정량적 PCR(qPCR) 분석을 수행하였다. GAPDH로 표준화하여 각 샘플로부터의 각각의 ΔCt 값을 계산하였다. qPCR 반응 후 해리 곡선으로 프라이머 특이성을 확인하였다. 실시간 qPCR에 사용되는 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다. TEAD 또는 TCF/LEF의 경우, 세포를 100ng의 리포터 벡터 및 1ng의 pSV- 레닐라(pSV-Renilla) 발현 벡터로 형질주입하였다. 루시퍼라제 및 레닐라 활성은 형질주입 48시간 후 이중 루시퍼라제 리포터 시스템 키트(Promega)를 사용하여 측정하였고 레닐라 활성을 통해 표준화하였다. 실험 결과는 3 회 실험에 의해 평균화되었다.

실시간 정량적 PCR에 사용된 프라이머 서열

유전자	정방향	역방향
E-cadherin	TGAGTGTCCCCCGGTATCCTC (서열번호: 2)	CAGTATCAGCCGCTTTCAGATTTT (서열번호: 3)
Claudin	GGCTGCTTTGCTGCAACTGTC (서열번호: 4)	GAGCCGTGGCACCTTACACG (서열번호: 5)
Occludin	CGGTCTAGGACGCAGCAGAT (서열번호: 6)	AAGAGGCCTGGATGACATGG (서열번호: 7)
Snail	TCTCTGAGGCCAAGGATCTC (서열번호: 8)	CTTCGGATGTGCATCTTGAG (서열번호: 9)
Zeb1	GCACCTGAAGAAGACCAGAG (서열번호: 10)	TGCATCTGGTGTTCCATTTT (서열번호: 11)
Fibronectin	CAGGATCACTTACGGAGAAACAG (서열번호: 12)	GCCAGTGACAGCATACACAGTG (서열번호: 13)
Axin2	AAGGGCCAGGTCACCAAAC (서열번호: 14)	CCCCCAACCCATCTTCGT (서열번호: 15)
CTGF	CAAAATCTCCAAGCCTATCAAGTT (서열번호: 16)	CTCCACAGAATTTAGCTCGGTAT (서열번호: 17)
GAPDH	TCCGCGGCTATATGAAAACAG (서열번호: 18)	TCGTAGTGGGCTTGCTGAA (서열번호: 19)

5. 면역형광 분석

면역 형광 연구를 위해, 세포를 빙냉 PBS로 2 회 세척하고 실온에서 15분 동안 4% 포름알데히드로 배양하였다. 염색을 위해, 세포를 45분 동안 0.5% Triton X-100으로 투과시키고, 1시간 동안 3% 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS로 차단한 다음, 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 이후 세포를 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척 한 후, 항-마우스-Alexa Fluor-594 (Invitrogen, A11005) 2차 항체와 함께 배양하였다. 세포는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)와 함께 Vectorshield(Vector)로 고정되었다. 공초점 현미경(Zeiss LSM780)을 사용하여 세포 형광을 모니터링하였다. 이미지는 Image J 소프트웨어(Media Cybernetics, Inc., USA)를 사용하여 분석하였다. 전체 핵 영역에서 상대 형광 강도를 측정하였다.

6. ATP 검출 분석

상대적인 ATP 수준을 결정하기 위해, 세포를 1x10⁶ 세포/웰로 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. ATP 수준을 측정하기 전에 포도당을 함유한 배지의 존재 또는 부재하에 시드된 세포를 6시간 동안 제조 하였다. ATP 수준은 제조사의 방법에 따라 ELISA 검출 시스템에 기초한 ATP 분석 키트(K354, BioVision)를 사용하여 분석되었다.

7. 인비보 이종이식 분석(In vivo xenograft assay)

모든 동물 실험은 연세대학교의 동물실험윤리위원회 규정에 따라 수행되었으며, 연세대학교 치과 과학 대학의 동물 관리 위원회 및 국립 암 센터 연구소의 승인을 받았다. 암컷 BALB / c 누드 마우스(6 주령, 나라 바이오테크 (Nara Biotech)로부터 구입)를 피하 주사하여 동소(orthotopic) 이종이식(xenograft) 분석에 사용하였다. 니클로사미드 및 메트포르민 조합의 항 종양 효과를 연구하기 위해, 대조군 또는 실험군의 SW480 세포를 트립신 처리하고 수확하여 피하 조직(0.1ml PBS 당 1X10⁶ 세포)에 주사하였다. 인비보(in vivo) 니클로사미드 및 메트포르민의 병용 치료를 위해, 마우스에 SW480 세포의 피하 주사 후, 비히클, 니클로사미드(200mg/kg, P.O), 또는 메트포르민(2mg / mL, P.O)으로만, 또는 니클로사미드(200mg / kg, P.O) 및 메트포르민(2mg/mL, P.O)을 함께 처리하였다. (2mg / mL, PO). 마우스에 종양 세포를 주사한 다음날로부터 4주 동안 5회 적용하였다. 버니어(Vernier) 캘리퍼로 종양 성장 및 체중을 일주일에 2 회 모니터링하고, 종양 부피를 아래 식에 따라 계산하였다.

V (mm3) = (a X b²)/2: a, 가장 긴 직경; b, 가장 짧은 직경.

8. APC min 마우스 실험

C57BL/6J 야생형 암컷 마우스를 C57BL/6J-APC min +/- (APC min, The Jackson Laboratory strain 002020) 수컷 마우스와 교배시킴으로써 APC min 마우스를 제조 하였다. 유전자형 분석 작업은 다음과 같이 진행되었다. 0.4 mg/ml 프로테나제 K를 함유하는 200-300 μl의 직접 PCR 용해 시약 (Viagen, 102-T)을 0.5 cm 마우스 꼬리에 추가하였다. 조직 덩어리가 관찰되지 않을 때까지 수조에서 55°C에서 5-6 시간 동안 배양하였다. 이후 조(crude) 용해물을 85℃ 수조에서 45분 동안 배양하였다. 유전자형 분석 전에 13200rpm에서 10초 동안 원심분리하여 모발을 침전시켰다. Taq 폴리머라제 PCR 프리-믹스(bioneer, K-2012)를 사용하여 APC 프라이머 (APCmin WT; GCCATCCCTTCACGTTAG (서열번호: 20); APCmin Com; TTCCACTTTGGCATAAGGC (서열번호: 21); APCmin Mut; TTCTGAGAAAGACAGAAGTTA (서열번호: 22))와 함께 20 μl 중합효소 연쇄반응 (PCR)에서 1 μl의 용해물을 사용하여 유전자형 분석을 수행하였다. APC min 마우스는 연세대학교 치과 대학에 수용되었다. APC min 마우스가 6 주령에 도달했을 때, 화학 처리를 시작하였다. 니클로사미드 및 메트포르민의 병용 치료를 위해, 마우스를 비히클 또는 니클로사미드(50mg/kg, P.O) 단독 또는 메트포르민(2mg/mL, P.O) 단독으로, 또는 니클로사미드(50mg/kg, P.O) 및 메트포르민(2mg/mL, P.O)으로 14주 동안 처리하였다. 14주 처리 후, 마우스를 희생시키고 전체 내장을 해부하였다. 조직을 24시간 동안 4% 포름알데히드에 고정시킨 다음, 70% 에탄올로 2회 세척하였다. 소장 내 용종의 수는 입체현미경을 사용하여 계산하였다. 1mm 미만 용종의 크기는 작은 크기, 1mm 내지 3mm 사이는 중간 크기였으며, 3mm 초과는 큰 것으로 간주하였다.

9. 환자 유래 FAP 오가노이드 배양

FAP 환자의 대장에서 내시경적 생검으로 채취한 조직을 PBS (100μg/ml primocin 혼합) 로 세척후 0.5mm 조각으로 자르고, 37℃ digestion buffer (DMEM, 2.5% FBS, 6.25mg/ml collagenase type IX)에서 30분간 둔다. 그 후 분리된 세포를 20 μL 매트리젤에 혼합하여 48 well에 분주한다. 폴립 오가노이드 배양액 (advanced DMEM/F12 with 1% penicillin/streptomycin, Glutamax, 1×N2, 1×B27 without retinoic acid, 2 mM L-glutamine, 50 ng/ml EGF, 1 mM N-Acetyl-L-cysteine, 10mM Nicotinamide, 10nM Gastrin I, 10μM SB202190, 500 nM A-83-01, 2.5μM PGE2 및 100 ng/ml Noggin)을 2일 마다 교체해 주고, 적당한 크기로 자라면 trypsin/EDTA로 오가노이드를 분리하여 다른 well에 분주하여 동일한 방법으로 배양 및 증식시킨다. 증식된 FAP 오가노이드는 액화질소에 동결 보관한 후 필요할 때 녹여서 동일한 방법으로 배양하여 실험에 이용한다.

10. 통계 분석

세포 생존력, 세포 이동 및 리포터 분석에 대한 모든 통계적 분석은 양측 스튜던트 t- 테스트(two-tailed Student's t-tests)로 수행하였다; 데이터는 평균 및 s.d로 표시하였다. 이중 별표는 P<0.01를 나타내며, 하나의 별표는 P<0.05를 나타낸다. 동물 실험의 통계적 유의성은 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 결정하였다. 데이터는 종양 부피에 대한 평균 및 s.e.m으로 표시되었다. 표본 크기를 미리 결정하기 위해 통계적 방법을 사용하지 않았다.

실험 결과

실시예 1: Axin2는 돌연변이 APC에 의해 유도된 YAP 활성과 관련됨

대부분의 CRC에서, Wnt 신호 전달은 APC 유전자의 돌연변이에 의해 과활성화되며, 이는 종양 형성을 개시할 수 있다. YAP는 APC-결함 선종 발달에 필수적이며, Hippo-YAP 신호전달은 APC로부터 다운스트림에 중요한 이펙터 경로이다. 이를 확인하기 위해, 돌연변이 APC를 293 세포에 형질주입시키고, TCF/LEF 및 TEAD 리포터 활성을 측정 하였다. TEAD 및 TCF/LEF의 활성은 APC 돌연변이에 의해 증가되었다(도 1a, b).

APC 돌연변이를 갖는 결장 암종에서, Axin2 및 Snail은 종종 침습성 병변에서 발견되며, 전형적(canonical) Wnt 의존성 Axin2의 조절 축은 암에서 Snail 매개 EMT의 조절에 중요한 역할을 한다. 또한 Axin2는 TCF/LEF 전사 인자의 전형적인 다운스트림 표적이며, APC 기능 상실로 인해 CRC에 매우 풍부하다. 이는 높은 Axin2 수준을 확인한 세포주에서 APC 돌연변이와 일치하였다. 한편, Axin1 발현은 APC 돌연변이 유형에 관계없이 모든 세포주에서 관찰되었다.

이들 중에서 유도성 Axin2 녹다운 세포주를 생성하기 위해 2 개의 세포주 (DLD-1, SW480)가 선택되었다. 유도성 Axin2 녹다운 세포에서 YAP의 발현이 니클로사미드 처리에 따라 변화하는지 조사하였다. YAP에는 단백질 안정성을 조절하거나 세포질 보유에 참여하는 여러 인산화 부위가 있다. Ser127 인산화는 YAP의 세포질 전좌에 필요하다. 결과적으로, 단백질 풍부 pSer127-YAP, YAP의 이동성 쉬프트(도 1c), CTGF 전사체 및 TEAD 리포터 활성(도 1d)을 Axin2 녹다운을 통해 검사 하였다.

도 1에 개시된 내용은 구체적으로 다음과 같다. (a) Renilla와 함께 Hop 및 Top flash로 일시적으로 형질주입된 HEK 293 세포에서 상대적인 TCF/LEF 리포터 (탑 플래쉬) 활성(왼쪽) 및 상대적인 TEAD 리포터 활성(오른쪽). (b) 각각 30μg의 전체 세포 용해물(WCL)은 Axin1, Axin2에 대한 면역블롯 분석에 사용되었다. APC 돌연변이 세포주는 DLD-1, SW480, SW620, Caco-2 및 HT-29이며, 한편 HEK293, MCF7, MDA-MB-231, HCC1954, HCT116 및 RKO 세포주는 APC 야생형이다. (c) 유도성 Axin2 세포주의 발현은 전-세포 용해물(WCL)에 의한 내인성 YAP 및 Axin2 단백질 풍부도를 보여주었다. YAP 인산화 수준은 p-S127-YAP 항체 및 48 시간 동안 독시사이클린(Dox) 3μg / mL를 처리한 Axin2 CRC 세포주의 유도성 녹다운에서 포스-태그 겔상의 이동성 쉬프트에 의해 결정되었다. (d) Axin2의 상대적 전사체 풍부도는 Axin2의 shRNA를 발현하는 세포에서의 정량적 PCR 분석에 의해 결정되었다(왼쪽). Axin2의 shRNA를 발현하는 세포의 상대적 CTGF 리포터 활성(Dox +)(오른쪽). 양측 스튜던트 t- 테스트를 통해 대조군과 비교하여 통계적 유의성을 **, P <0.01; ***, P <0.001로 나타내었다. (e) CTGF 의 상대적 전사체 풍부도는 Axin2의 shRNA를 발현하는 세포에서의 정량적 PCR 분석에 의해 결정되었다(왼쪽). Axin2의 shRNA를 발현하는 세포의 상대적 TEAD 리포터 활성(Dox +)(오른쪽). 대조군과 비교한 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t- 테스트를 통해 **, P <0.01; ***, P <0.001로 나타내었다.

실시예 2: 니클로사미드는 YAP 핵 위치 및 TEAD 전사 활성을 조절함

니클로사미드는 Wnt 활성 및 Snail 매개 EMT 프로그램을 약화시키며, 니클로사미드가 CRC 세포에 처리될 때 Axin2, Snail 단백질 풍부도, Axin2 전사 수준, TCF/LEF 활성이 억제되는 것으로 나타났다(도 2 a, b). 핵 YAP는 CRC 세포에서 YAP의 인산화를 조절함으로써 과발현되고, YAP는 EMT를 유도하여 암 침습 및 전이를 유발한다. 니클로사미드를 처리하는 동안 YAP 발현이 어떻게 조절되는지를 조사할 때, 흥미롭게도 핵에서 YAP의 발현 패턴이 나타났다. 니클로사미드는 pSer127-YAP 풍부도, 포스-태그 겔에서 YAP의 이동성 쉬프트를 감소시켜 핵 YAP 수준을 증가시켰다(도 2c). 면역블롯 분석과 일관되게, CTGF 전사 및 TEAD 리포터 활성은 니클로사미드에 의해 증가되었다(도 2d). 니클로사미드에 의한 YAP의 전위가 Lats/YAP 축의 p53 업스트림에 기인한 것인지 결정하기 위해, HCL116 (p53 야생형), HCT116 p53 -/-, DLD-1 및 SW480 (p53 돌연변이형)이 니클로사미드와 함께 처리되었다.

결과적으로, 모든 세포주에서 YAP의 인산화가 감소되었다(도 2e). 이것은 YAP의 인산화에 관여하는 니클로사미드의 작용이 p53의 독립적인 기능임을 가리킨다. 그리고 내인성 YAP에 의한 면역형광분석은 이들 단백질이 주로 CRC 세포의 핵에 위치한다는 것을 밝혀냈다. 도 2f는 전체 핵 영역에서 상대적인 형광 강도를 측정한 것이다.

도 2에 개시된 내용은 구체적으로 다음과 같다. (a) 면역 블롯은 세포가 16 시간 동안 니클로사미드 0.5μM로 처리될 때 내인성 Axin2, Snail 단백질 풍부를 나타낸다. (b) Renilla 루시퍼라제와 함께 탑 플래쉬로 일시적으로 형질주입시키고 16 시간 동안 니클로사미드 0.5μM로 처리된 세포에서의 상대적 Axin2 전사체 풍부도(왼쪽) 및 TCF/LEF 리포터 (탑 플래쉬) 활성(오른쪽). 대조군과 비교한 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t- 테스트를 통해 *, P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001로 나타냈다. (c) 세포질 및 핵 분획에서의 YAP 인산화 상태는 p-S127-YAP 항체 및 포스-태그 겔 A상의 이동성 쉬프트에 의해 결정되었다. (d) 상대적인 CTGF 전사 수준(왼쪽) 및 상대적인 TEAD 리포터 활성(오른쪽)은 리포터 분석 및 qPT-PCR을 통해 측정되었다. 대조군과 비교한 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-테스트를 통해 *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001로 나타냈다. (e) HCT116 야생형, HCT116 p53 null (p53 -/-), DLD-1 및 SW480 세포를 0.25 μM의 니클로사미드로 처리하였고, YAP의 인산화는 이동성 쉬프트 포스-태그로 관찰되었다. 세포는 혈청 및 포도당이 부족하며 실험전 6시간 동안 니클로사미드로 처리되었다. (f) CRC 세포는 80~90% 밀도 조건에서 배양되었고 니클로사미드로 처리되었다. 그리고 이후 내인성 YAP의 세포내 위치는 공초점 현미경을 통해 측정되었다. DAPI 핵 염색; 스케일 바, 5μm. 이미지 J를 사용하여 YAP의 세포 내 위치를 정량하였다. 대조군과 비교한 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-테스트를 통해 ***, P < 0.001로 표시되었다.

실시예 3: 메트포르민은 세포질 내 YAP의 유지에 영향을 줌

메트포르민은 YAP의 인산화를 증가시킴으로써 Hippo 경로를 조절하고 YAP의 핵 위치화(localization)를 감소시킨다. CRC 세포에서 메트포르민 매개 YAP의 조절은 면역블롯 분석, 포스-태그 겔상에서 YAP의 이동성 쉬프트, CTGF 전사체 및 TEAD 리포터 활성을 감소시키는 것으로 나타났다(도 3a, b). 메트포르민은 니클로사미드보다 덜 강력하지만, 메트포르민은 Axin2 및 Snail의 단백질 풍부도를 억제하는 것으로 나타났다. 또한, mTOR 기질 리포좀 단백질 S6의 인산화가 발견되었다(도 3c). 블롯분석 결과와 유사하게, 메트포르민의 전사 수준 및 TCF/LEF 리포터 활성은 CRC 세포에서 감소되었다(도 3d).

도 3에 개시된 내용은 구체적으로 다음과 같다. (a) 세포질 및 핵 분획 내 YAP 인산화 상태는 p-S127-YAP 항체 및 포스-태그 겔상 이동성 쉬프트를 통해 결정된다. (b) 상대적인 CTGF 전사 수준(왼쪽) 및 상대적인 TEAD 리포터 활성(오른쪽)은 리포터 분석 및 qPT-PCR을 통해 결정되었다. CRC 세포들은 메트포르민 10mM로 처리되었다. 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-테스트를 통해 **, P<0.01로 나타내었다. (c) 면역블롯은 CRC 세포가 16시간 동안 메트포르민 10mM로 처리될 때 내인성 Axin2, Snail, p-S235/236-리보좀 단백질 S6 단백질 풍부도를 나타낸다. (d) Renilla 루시퍼라제와 함께 탑 플래쉬로 일시적으로 형질주입되고 16시간 동안 메트포르민 10mM로 처리된 세포에서 상대적인 Axin2 전사 풍부도(왼쪽) 및 TCF/LEF 리포터(탑 플래쉬) 활성(오른쪽). 대조군과 비교한 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-테스트를 통해 *, P < 0.05; **, P < 0.01로 나타냈다.

실시예 4: 인산화 의존성 YAP의 조절을 통한 니클로사미드 및 메트포르민의 조합 효과

상기 결과들은 니클로사미드가 핵 내 YAP를 증가시키며 메트포르민이 핵 내 YAP의 발현을 감소시킴을 확인하였다. 니클로사미드 및 메트포르민의 조합 변화를 관측하기 위해, CRC 세포에 클로사미드 0.25μM, 메트포르민 10mM, 또는 니클로사미드 0.25μM + 메트포르민 10mM을 16시간 동안 처리하였다.

결과적으로 면역블롯 분석을 통해, 니클로사미드 단독에 비해 니클로사미드 및 메트포르민이 함께 투여될 때 핵 YAP 및 p-Ser127-YAP의 발현이 감소되는 것으로 확인되었다(도 4a). 그리고 CTGF 전사 수준 및 TEAD 리포터 활성 또한 동일한 결과를 나타내었다(도 4b). 그리고 면역형광분석에서 니클로사미드 단독으로 처리된 그룹에 비해 니클로사미드 및 메트포르민 조합 그룹에서 핵 YAP가 감소되는 것으로 나타났다(도 4c). 상대적인 형광 강도는 전체 핵 영역에서 측정되었다.

도 4에 개시된 내용은 구체적으로 다음과 같다. (a-c) 각각의 세포는 니클로사미드 0.25μM, 메트포르민 10mM, 또는 니클로사미드 0.25μM + 메트포르민 10mM로 처리되었다. 세포질 및 핵 분획 내 YAP 인산화 상태에 대한 면역블롯 분석은 p-S127-YAP 항체를 통해 측정되었다. (a) 상대적인 CTGF 전사 수준(왼쪽) 및 상대적인 TEAD 리포터 활성(오른쪽). 대조군과 비교한 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-테스트를 통해 **, P < 0.01; ***, P < 0.001로 나타내었다. (b), 면역형광 (c)는 처리 후 측정하였다. 대조군과 비교한 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-테스트를 통해 **, P < 0.01; ***, P < 0.001로 나타내었다.

실시예 5: 니클로사미드 및 메트포르민은 mTOR-AMPK 경로를 억제함

AMPK는 에너지 고갈 및 저산소 상태와 같은 다양한 대사 스트레스에 의해 증가하는 AMP에 의해 활성화되며, ATP 사용을 억제하여 에너지 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. AMPK의 활성화를 유도하는 메트포르민은 LKB1-AMPK-mTOR 경로를 통해 종양을 억제한다. 활성화 된 LKB1은 AMPK의 인산화를 촉진하고 TSC2 (Tuberous Sclerosis Complex 2)를 통해 mTORC1을 억제함으로써 항암 효과를 나타낸다.

니클로사미드와 함께 처리된 메트포르민의 시간에 따른 효과의 변화를 관찰하기 위해, 에너지 스트레스에서 AMPK의 활성화를 관찰하였다. 그 결과, 단백질 발현을 통해 AMPK 활성화가 증가되었으며(도 5a), 인산화된 AMPK에 의해 ATP 수준을 낮춤으로써 암세포 성장이 억제되었다(도 5b).

또한, mTOR 경로의 억제는 두 약물로의 단일 처리와 비교할 때 mTOR 이펙터로서 작용하는 S6의 활성화를 억제함으로써 확인되었다(도 5C). 이러한 결과는 니클로사미드 및 메트포르민의 조합이 AMPK-mTOR 경로를 조절함을 가리킨다.

도 5에 개시된 내용은 구체적으로 다음과 같다. (a) 각각의 세포는 16시간 동안 5.5mM 글루코스 배지에서 니클로사미드 0.5μM, 메트포르민 5mM, 또는 니클로사미드 0.5μM + 메트포르민 5mM로 처리되었다. 내인성 AMPK, p-AMPK 단백질 풍부도는 면역블롯 분석을 통해 측정되었다. (b) 세포에 6시간 동안 니클로사미드 및 메트포르민을 처리하면서 글루코스가 없이 배양한 이후에 ATP 수준을 측정하였다. (c) 면역블롯은 세포를 16시간 동안 니클로사미드 0.25μM, 메트포르민 10mM, 또는 니클로사미드 0.25μM + 메트포르민 10mM로 처리할 때 내인성 Axin2, Snail 단백질 풍부도를 나타낸다.

실시예 6: 니클로사미드 및 메트포르민은 전형적 Wnt 신호전달의 억제와 함께 Snail 매개 EMT를 억제함

니클로사미드 및 메트포르민의 조합은 니클로사미드에 의한 핵에서의 YAP의 발현을 완화시키는 것으로 나타났다. 그 다음, 니클로사미드 및 메트클로민 조합의 Wnt 신호전달의 억제 효과를 실험하였다. 니클로사미드는 Axin2 및 Snail을 효과적으로 감소시킴을 확인하여, 이는 Wnt 신호전달에서 EMT와 관련된 주요 단백질임을 알 수 있으며, 또한 메트포르민도 미세하게 감소시킴을 확인하였다. 두 약물의 조합은 내인성 Axin2 및 Snail을 현저하게 감소시키며, 면역블롯 분석을 통해 Wnt 신호전달(도 6a), Axin2 전사 수준(도 6b 왼쪽), 및 TCF/LEF 리포터 활성(도 6b 오른쪽)을 효과적으로 억제한다. 이에 기초하여, 두 약물 조합의 전사 수준을 qPCR을 통해 확인하였다. 결과적으로, 니클로사미드 및 메트포르민의 처리는 상피 마커를 현저하게 증가시키고 중간엽 마커를 감소시켰다(도 6c). 트랜스 웰 분석을 수행하여 두 약물의 이동 능력을 확인 하였다. 이는 CRC 세포가 니클로사미드 및 메트포르민 조합으로 처리 될 때, 니클로사미드 또는 메트포르민으로만 처리 될 때보다 이동이 상당히 감소된 결과와 일치하였다(도 6d).

도 6에 개시된 내용은 구체적으로 다음과 같다. (a) 세포를 16시간 동안 니클로사미드 0.5μM, 메트포르민 5mM, 또는 니클로사미드 0.5μM 및 메트포르민 5mM로 처리하였다. 내인성 Axin2, Snail 단백질 풍부도는 면역블롯 분석을 통해 측정되었다. (b) Renilla 루시퍼라제와 함께 탑 플래쉬로 일시적으로 형질주입된 세포에서 상대적인 Axin2 전사 풍부도(왼쪽) 및 TCF/LEF 리포터(탑 플래쉬) 활성(오른쪽). 대조군과 비교한 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-테스트를 통해 *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001로 나타냈다. (c) 니클로사미드 0.25μM, 메트포르민 10mM, 또는 니클로사미드 0.25μM + 메트포르민 10mM을 16시간 동안 처리한 CRC 세포에서 qRT-PCR을 통해 측정된 상대적인 상피 마커(왼쪽) 및 중간엽 마커(오른쪽) 전사 수준. 대조군과 비교한 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-테스트를 통해 *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001로 나타냈다. (d) 니클로사미드 0.5μM, 메트포르민 10mM, 또는 니클로사미드 0.5μM + 메트포르민 5mM로 처리된 세포의 이동성은 트랜스 웰 이동 분석을 통해 측정되었다. 대조군과 비교한 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-테스트를 통해 *, P < 0.05; ***, P < 0.001로 나타냈다.

실시예 7: 니클로사미드 및 메트포르민은 이종이식 모델에서 종양원성을 억제함

약리학적 접근 방법으로 상기 약물 조합의 인비보(in vivo) 치료 가능성을 조사하기 위해, 니클로사미드, 메트포르민, 니클로사미드 및 메트포르민의 조합으로 경구 투여된 마우스에 SW480 세포를 피하 주사하였다. 약물 투여 과정에서, 마우스 체중에서 명백한 부작용이 관찰되지 않았다(도 7a). 니클로사미드 또는 메트포르민 단독 투여는 종양의 형성을 억제하였으며, 두 약물의 병용시 종양원성 잠재력이 억제되었다(그림 7b-d).

도 7에 개시된 내용은 구체적으로 다음과 같다. (a-d) 인비보에서 니클로사미드 및 메트포르민의 병용 치료를 위해, 마우스들은 SW480(1x10⁶) 세포의 피하 주사 이후 매일 비히클, 니클로사미드 단독(200mg/kg, P.O.), 메트포르민 단독(2mg/mL, P.O.) 또는 니클로사미드(200mg/kg, P.O.) 및 메트포르민(2mg/mL, P.O.) 조합으로 처리되었다. 체중(a) 및 종양 성장(b,c)는 일주일에 두번 관찰하였다. 실험 종결 이후, 모든 종양들을 마우스로부터 분리하였다 (d). 대조군과 비교한 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-테스트를 통해 *, P<0.05로 나타내었다.

실시예 8: 니클로사미드 및 메트포르민은 APC-min 마우스에서 선종 형성을 억제함

APC min 마우스에서 니클로사미드 및 메트포르민의 조합시 용종 형성을 측정하기 위해, 6주령의 암컷 및 수컷 마우스들을 무작위로 그룹을 나누었다. APC min 마우스들에 14주 동안 비히클(n=8), 니클로사미드 50mg/kg(n=9), 메트포르민 2mg/ml, 니클로사미드 50mg/kg 및 메트포르민의 조합을 구강 투여하였다. 약물로 인한 체중 감소는 발견되지 않았다(도 8a). 약물 투여 14 주 후, 소장 용종의 수는 대조군, 니클로사미드 또는 메트포르민 단독 그룹과 비교하여 니클로사미드 및 메트포르민 조합 그룹에서 유의하게 감소하였다(도 8b). 그리고 APC min 마우스를 희생시키고 소장에서 입체현미경을 통해 용종을 관찰하였다(도 8c).

도 8에 개시된 내용은 구체적으로 다음과 같다. (a-c) APC min 마우스에 니클로사미드 및 메트포르민 조합 요법을 실험하기 위해, APC 마우스들은 비히클, 니클로사미드 단독(50mg/kg, P.O.), 메트포르민 단독(2mg/mL, P.O.) 또는 니클로사미드(50mg/kg, P.O.) 및 메트포르민(2mg/mL, P.O.)의 조합으로 매일 처리되었다. 체중(a) 및 용종의 총 수(b). 실험 종결 이후 관찰된 소장 용종(c). 대조군과 비교한 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-테스트를 통해 *, P < 0.05; **, P < 0.01로 나타내었다.

실시예 9: 환자유래 FAP 오르가노이드에 니클로사미드 및 메트포르민의 병용 치료 효과 확인

환자 FAP 조직 생검(biopsies)으로부터 FAP 오르가노이드를 준비하여 2μl 매트리젤에 시드(seeded)하고, 2일마다 폴립 오가노이드 배양액 (실험재료 및 방법)을 교환하였다. 니클로사미드(0.5 또는 1μM), 메트포르민(2mM) 또는 니클로사미드 및 메트포르민의 조합으로 8일 동안 처리한 후, 오르가노이드를 calcein AM으로 염색하여 관찰하였으며, 이를 도 9a에 나타내었다(배율, x40). ImageJ를 이용하여 FAP 오르가노이드 세포의 형광 강도에 대한 정량 분석을 수행하였으며, 이를 도 9b에 나타내었다 (3배수 실험, n=3). Means±SD. *P<0.05, **P<0.01 (스튜던트 t-테스트).

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating familial adenomatous polyposis comprising niclosamide and metformin <130> DP-2019-0616, P19-149 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence of shRNA for Axin2 <400> 1 accaccacta catccacca 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-cadherin forward primer <400> 2 tgagtgtccc ccggtatcct c 21 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-cadherin reverse primer <400> 3 cagtatcagc cgctttcaga tttt 24 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Claudin forward primer <400> 4 ggctgctttg ctgcaactgt c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Claudin reverse primer <400> 5 gagccgtggc accttacacg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Occludin forward primer <400> 6 cggtctagga cgcagcagat 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Occludin reverse primer <400> 7 aagaggcctg gatgacatgg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail forward primer <400> 8 tctctgaggc caaggatctc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail reverse primer <400> 9 cttcggatgt gcatcttgag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zeb1 forward primer <400> 10 gcacctgaag aagaccagag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zeb1 reverse primer <400> 11 tgcatctggt gttccatttt 20 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin forward primer <400> 12 caggatcact tacggagaaa cag 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin reverse primer <400> 13 gccagtgaca gcatacacag tg 22 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Axin2 forward primer <400> 14 aagggccagg tcaccaaac 19 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Axin2 reverse primer <400> 15 cccccaaccc atcttcgt 18 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF forward primer <400> 16 caaaatctcc aagcctatca agtt 24 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF reverse primer <400> 17 ctccacagaa tttagctcgg tat 23 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 18 tccgcggcta tatgaaaaca g 21 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 19 tcgtagtggg cttgctgaa 19 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APCmin WT primer <400> 20 gccatccctt cacgttag 18 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APCmin Com primer <400> 21 ttccactttg gcataaggc 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APCmin Mut primer <400> 22 tcgtagtggg cttgctgaa 19

Claims (4)

1. 니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
   메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 가족성 선종성 용종증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 Wnt/YAP/mTOR 신호전달 및 Snail 매개 상피간엽이행(EMT)의 억제를 통해 가족성 선종성 용종증 예방 또는 치료 효과를 나타내는, 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 몰비는 1 : 10~10000 (니클로사미드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염)인, 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 가족성 선종성 용종증은 APC(adenomatous polyposis coli) 유전자의 돌연변이에 의해 발생하는 가족성 선종성 용종증인, 약학 조성물.

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