DE102020007691A1

DE102020007691A1 - Verfahren zur Identifizierung und/oder zum Erhalten eines Wirkstoffs zur Behandlung und Therapie der familiären amyotrophen Lateralsklerose sowie Verwendung eines Wirkstoffs zur Behandlung dieser Erkrankung

Info

Publication number: DE102020007691A1
Application number: DE102020007691.2A
Authority: DE
Inventors: Gültekin Tamgüney
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2022-06-23
Also published as: US20240033282A1; WO2022127956A3; WO2022127956A2; EP4264262A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren und/oder Erhalten von Wirkstoffen zur Linderung oder Behandlung von ALS umfassend folgende Schritte:a. Bereitstellen einer Zusammensetzung enthaltend Zellen mit den Zelloberflächenrezeptoren Syndecan-3 und/oder Syndecan-1b. Inkontaktbringen der Zusammensetzung aus Schritt a) mit SOD-1 Aggregatenc. Inkontaktbringen der Zusammensetzung aus Schritt a) mit der zu screenenden Testsubstanz, wobei Schritt b) und Schritt c) gleichzeitig erfolgen kann oder Schritt c) vor Schritt b) erfolgen kannd. Bestimmung der Aufnahme der SOD1-Aggregate in die Zellen.Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Kit oder eine Zusammensetzung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, enthaltend wenigstens Zellen, welche die Zelloberflächenrezeptoren Syndecan-3 und/oder Syndecan-1 exprimieren, sowie SOD-1 Aggregate. Die Erfindung betrifft weiterhin Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder heparinähnliche Verbindungen, zur Verwendung bei der Herstellung eines Inhibitors für die Aufnahme von SOD1-Aggregaten in Neuronen oder neuronale Zellen eines Organismus sowie als Arzneimittel in der Behandlung von ALS.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren sowie ein Kit zur Identifizierung und/oder zum Erhalten eines Wirkstoffs zur Linderung, Behandlung und Therapie der familiären amyothrophen Lateralsklerosen (ALS), insbesondere mit Mutationen in SOD1. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung eines Wirkstoffs zur Behandlung der ALS, insbesondere mit Mutationen in SOD1.
Stand der Technik
Die amyotrophe Lateralsklerose ist eine progressive und tödlich verlaufende neurodegenerative Erkrankung, die mit dem Verlust von Motoneuronen einhergeht. Dies führt zu Symptomen, zu denen eine allgemeine Muskelschwäche gehört, die Schwierigkeiten bei Bewegung, Atmung, Essen und Sprechen verursacht. Sie betrifft etwa 5 unter 100.000 Individuen und 80% der betroffenen sterben innerhalb von 2-5 Jahren nach einer Erstdiagnose. Etwa 20% aller ALS Fälle gehen auf Genmutationen zurück und etwa 10% davon auf Mutationen im Gen für die Superoxid-Dismutase 1 (SOD1). Bei ALS-Patienten mit Mutationen in SOD1 finden sich neuronale Ablagerungen von mutiertem und fehlgefaltetem SOD1-Protein in Motoneuronen. Ablagerungen von Oligomeren und aggregierten SOD1-Proteinen sind toxisch für Motoneuronen und führen zu deren Absterben. Die progressive Ausbreitung von Lähmungserscheinung im Körper wird mit einer prionenartigen Vermehrung und Ausbreitung von toxischen SOD1-Oligomeren und -Aggregaten im Körper assoziiert, bei der fehlgefaltete Oligomere/Aggregate von mutiertem SOD1-Protein von einem Neuron aufs nächste übertragen werden und in der Empfängerzelle eine Fehlfaltung und anschließende Aggregation von nativer mutierter SOD1 induzieren, sodass wieder größere Mengen von toxischen SOD1-Spezies entstehen. Wie toxische SOD1-Aggregate zwischen Neuronen übertragen werden ist nicht vollständig verstanden.
Es gibt noch keine Heilung für ALS, aber es gibt Behandlungen, die helfen, die Krankheit in den Griff zu bekommen. Es gibt auch Medikamente zur Linderung spezifischer Krankheitssymptome und eine Reihe experimenteller Behandlungen, die sich in der Entwicklungsphase befinden. Die U.S. Food and Drug Administration (FDA) hat vier Behandlungen zugelassen, die speziell darauf abzielen, das Fortschreiten der ALS zu verlangsamen: Rilutek (Riluzol-Tablette), Tiglutik (Riluzol-Suspension), Exservan (Riluzol-Film zum Einnehmen) und Radicava (Edaravone). Kanada, Australien und Europa haben Rilutek ebenfalls zugelassen, und in Großbritannien wurde Tiglutik unter dem Namen Teglutik genehmigt. Exservan und Radicava werden in vielen Ländern noch geprüft. In Japan, China, den USA und der Schweiz ist Edaravon als Medikament zur Behandlung der ALS zugelassen.
Keine dieser Behandlungen kann die bereits durch ALS verursachten Schäden rückgängig machen, aber Forscher glauben, dass sie die Lebenserwartung der Patienten erhöhen könnten. Ärzte verschreiben sie oft in Kombination mit symptomatischen Behandlungen, um die Lebensqualität der Patienten zu verbessern. Obwohl Riluzol mit einem kurzen Überlebensvorteil von 2-3 Monaten assoziiert wurde, was einer 9%igen Erhöhung der 1-Jahres-Überlebensrate entspricht, war die anschließende Einführung von Riluzol zur Behandlung der ALS vielleicht Ausdruck eines verzweifelten Bedarfs an therapeutischen Optionen angesichts dieser verheerend fortschreitenden Krankheit. Trotz zunehmender wissenschaftlicher Rhetorik zu diesem Thema ist der Mechanismus des therapeutischen Nutzens von Riluzol unbestimmt. Es wurden mehrere Wege postuliert, die von der zentralen antiglutaminergen Modulation exzitotoxischer Pfade, der mitochondrialen Funktion und Veränderungen des Fettstoffwechsels bis hin zu peripheren axonalen Effekten auf die persistente Natriumkanalfunktion und die Potenzierung calciumabhängiger Kaliumströme reichen.
Der Mechanismus, durch den Radicava bei ALS wirksam sein könnte, ist ebenfalls unbekannt. Es ist bekannt, dass das Medikament ein Antioxidans ist, und es wird angenommen, dass oxidativer Stress Teil des Prozesses ist, der Neuronen bei Menschen mit ALS tötet. In klinischen Studien zeigten einige Personen, denen Radicava verabreicht wurde, einen signifikant geringeren Rückgang der körperlichen Funktion im Vergleich zu Placebo, gemessen anhand der ALS Functional Rating Scale-Revised (ALSFRS-R), einem validierten Bewertungsinstrument zur Überwachung des Fortschreitens der Behinderung bei Patienten mit ALS. Der Zulassungsantrag für Radicava/Edaravone bei der Europäischen Arzneimittel-Agentur (EMA) wurde von dem Pharmaunternehmen Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation (MTPC) zurückgezogen, nachdem die Behörde sich aufgrund der Laufzeit der vorgelegten Studien und dem laut Behörde unzureichenden Nachweis eines verlängerten Überlebens die Ablehnung des Zulassungsantrages empfohlen hatte.
Zusammenfassend kann man sagen, dass die zur Behandlung zugelassenen Wirkstoffe, keinen bekannten Wirkmechanismus haben und, wenn überhaupt, nur zu einer sehr geringfügigen Verbesserung der Lebensqualität oder Lebensverlängerung führen.
Aufgabe und Lösung
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und ein Kit bereitzustellen, mit dem Wirkstoffe zur Linderung oder Behandlung der amyotrophen lateral Sklerose, im Folgenden als ALS bezeichnet, identifiziert werden können. Die Verwendung eines Wirkstoffs für die Behandlung der ALS ist ebenfalls Aufgabe der Erfindung.
Die Aufgaben der Erfindung werden gelöst durch Verfahren mit den Merkmalen des Hauptanspruchs und der nebengeordneten Ansprüche.
Vorteilhafte Ausgestaltungen des Haupt- und der Nebenansprüche ergeben sich aus den darauf rückbezogenen Ansprüchen.
Gegenstand der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Identifizieren und/oder zum Erhalten von Wirkstoffen zur Linderung oder zur Behandlung von ALS, welche insbesondere die Wirkung haben, eine Ausbreitung von toxischen SOD-1 Aggregaten zwischen Neuronen in Organismen, insbesondere im menschlichen Körper, aufzuhalten und somit eine progressive Paralyse im Körper von ALS-Patienten, mit Mutationen in SOD1, zu inhibieren.
Im Rahmen der Erfindung wurde herausgefunden, dass zwei spezifische Zelloberflächenrezeptoren, Syndecan-3 und Syndecan-1, welche zu den an der Zelloberfläche von Neuronen exprimierten Heparansulfatproteoglykanen (HSPG) gehören, Superoxiddismutase 1-Aggregate, im Folgenden als SOD1-Aggregate bezeichnet, binden und deren Aufnahme in Neurone vermitteln. Durch diese Aufnahme wird die zuvor beschriebene Ausbreitung von toxischen SOD1-Aggregaten zwischen Neuronen in Organismen verursacht und beschleunigt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass diese zuvor genannten Zelloberflächenrezeptoren, an die diese toxischen SOD1-Aggregate binden, insbesondere Syndecan-3 und/oder Syndecan-1, als Targets für das Identifizieren und/oder zum Erhalten von Wirkstoffen zur Behandlung von ALS eingesetzt werden sollen, wobei diese Wirkstoffe insbesondere auf ihre Fähigkeit untersucht werden sollen, eine Bindung von SOD1-Aggregaten an Syndecan-3 und/oder Syndecan-1 und die Aufnahme dieser SOD-1 Aggregate in Neurone zu inhibieren und damit die Linderung und Behandlung von ALS zu ermöglichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Identifizieren und/oder Erhalten von Wirkstoffen zur Linderung oder Behandlung von ALS umfasst folgende Schritte:

a. Bereitstellen einer Zusammensetzung enthaltend Zellen mit den Zelloberflächenrezeptoren Syndecan-3 und/oder Syndecan-1
b. Inkontaktbringen der Zusammensetzung aus Schritt a) mit SOD-1 Aggregaten
c. Inkontaktbringen der Zusammensetzung aus Schritt a) mit der zu screenenden Testsubstanz, wobei Schritt c) und Schritt b) gleichzeitig erfolgen kann oder Schritt c) vor Schritt b) erfolgen kann
d. Bestimmung der Aufnahme der SOD1-Aggregate in die Zellen.

In einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens wird nach Schritt d) ein zusätzlicher Verfahrensschritt e) durchgeführt, bei dem ein Vergleich der Ergebnisse der Aufnahme der SOD1-Aggregate in die Zellen mit einem Referenzwert, ohne Zugabe der Testsubstanz, synonym auch als Wirkstoff bezeichnet, nach Schritt b) durchgeführt wird. Dadurch wird vorteilhaft zum einen eine Kontrolle ermöglicht, ob der Verfahrensansatz grundsätzlich funktioniert und die Zellen grundsätzlich in der Lage sind, die SOD-1 Aggregate ohne Zugabe der Testsubstanz in die Zellen aufzunehmen. Zum anderen wird es beispielsweise möglich, die Wirkung der Testsubstanz hinsichtlich ihrer tatsächlichen Wirkung oder auch hinsichtlich ihrer spezifischen Wirkdauer und Dosis qualitativ und quantitativ im Vergleich zum Referenzwert der Aufnahme der SOD1-Aggregate in die Zellen ohne Zugabe der Testsubstanz zu bestimmen.
Sollte also keine, oder eine im Vergleich zum Referenzwert verminderte Aufnahme, von SOD-1 Aggregaten in die Zellen in Anwesenheit des zu screenenden Wirkstoffs nachgewiesen werden, so kann eine inhibierende Wirkung für diesen Wirkstoff nachgewiesen werden und dieser Wirkstoff kann dann entweder für weitere Untersuchungen bei der Behandlung von ALS ausgewählt werden oder auch direkt als Wirkstoff-Kandidat für klinische Studien ausgewählt werden.
Als Zellen können beispielsweise Neuronen, neuronale Zelllinien oder auch andere Zellen/ Zelllinien eingesetzt werden, die so verändert wurden, dass sie die Zelloberflächenrezeptoren Syndecan-3 und/oder Syndecan-1 exprimieren.
In einer Ausführung des Verfahrens kann es vorteilhaft sein, Zellen einzusetzen, die sowohl Syndecan-3 als auch Syndecan-1 exprimieren, da dadurch die inhibierende Wirkung des Wirkstoffs für die Aufnahme von SOD-1 Aggregaten über beide Syndecane gleichzeitig untersucht werden kann. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, Zellen einzusetzen, die entweder Syndecan-3 oder Syndecan-1 exprimieren.
Als SOD-1 Aggregate können jegliche SOD-1 Aggregate eingesetzt werden, die dafür bekannt sind, ALS beim Mensch oder auch im Tiermodell auszulösen. Dies können sowohl Wildtyp-SOD-1 Aggregate, als auch mutierte SOD-1 Aggregate sein, die dafür bekannt sind, ALS auszulösen. Als vorteilhaft haben sich auch SOD-1 Aggregate mit der familiären A4V- oder G93A-Mutation erwiesen.
Es sollten vorteilhaft SOD-1 Aggregate eingesetzt werden, die in der Lage sind, ein spezifisches Signal zu emittieren, welches nicht nur als Nachweis für die Bindung der SOD-1 Aggregate an die Syndecane, sondern auch als Nachweis für die Bestimmung der Aufnahme der SOD-1 Aggregate in die Zellen genutzt werden kann. Als geeignet haben sich hier beispielsweise Fluoreszenzsignale erwiesen, die mittels optischer Nachweisverfahren, vorzugsweise Durchflusszytometrie oder mikroskopischer Verfahren, die Aufnahme der SOD-1 Aggregate in die Zellen nachweisen können. Dazu sind die SOD-1 Aggregate vorzugsweise mit einem für den Nachweis geeigneten Fluoreszenzfarbstoff, wie beispielsweise DyLight488 oder weitere dem Fachmann bekannte und für die Anwendung geeignete Fluoreszenzfarbstoffe markiert.
Grundsätzlich sind zur Bestimmung der Aufnahme der SOD1-Aggregate in die Zellen alle dem Fachmann bekannten Verfahren zum Nachweis der Proteinaufnahme und der Quantifizierung dieser Proteine in Zellen geeignet. Hierzu können beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt, Immunoassays, vorzugsweise ELISA oder RIA, oder spektroskopische Verfahren, wie beispielsweise Massenspektrometrie, Massenspektroskopie, NMR, Durchflusszytometrie, mikrofluide Durchflusszytometrie, Kombinationen der zuvor genannten Verfahren oder auch jegliche mikroskopische Nachweisverfahren, genannt werden.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Kit oder eine Zusammensetzung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthaltend wenigstens die zuvor näher aufgeführten Zellen mit den Zelloberflächenrezeptoren Syndecan-3 und/oder Syndecan-1 sowie SOD-1 Aggregate, die ebenfalls zuvor näher beschrieben wurden.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Wirkstoffs zur Behandlung von ALS, der die Bindung von SOD1-Aggregaten an die Zelloberflächenrezeptoren Syndecan-1 und Syndecan-3 inhibiert und damit die Ausbreitung von toxischen SOD1-Aggregaten zwischen Neuronen im Körper aufhalten und somit eine progressive Paralyse im Körper von ALS-Patienten, mit Mutationen in SOD1, hemmen kann.
Für die Verwendung eines Wirkstoffs zur Behandlung von ALS hat sich die Verbindung Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) sowie Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen, wie beispielsweise Heparin (natürliches), Certoparin, Dalteparin, Enoxaparin, Nadroparin, Reviparin, Tinzaparin, Danaproid, Deligoparin, Fucoidan, als geeignet erwiesen. Durch die Verwendung dieser zuvor genannten Verbindungen kann vorteilhaft die prionenartige Ausbreitung von toxischen SOD1-Aggregaten zwischen Neuronen im Körper inhibiert werden.
PPS wird bisher als Arzneistoff zur Behandlung bei Interstitieller Cystitis, bei Thrombosen und Osteoarthritis verwendet. Eine weitere Verwendung ist in der Veterinärmedizin die Behandlung von Arthrosen bei Hunden und Pferden.
Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen können erfindungsgemäß daher auch zur Verwendung bei der Herstellung eines Inhibitors für die Aufnahme von SOD1-Aggregaten in Zellen eines Organismus eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen als Arzneimittel in der Behandlung von ALS.
Weiterhin sind Arzneimittel enthaltend Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen sowie einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger, Gegenstand der Erfindung. Hier sind alle nach dem Stand der Technik bekannte Arzneiträgerstoffe geeignet.
Die Verwendung von Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ALS ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. In einer möglichen Ausgestaltung der Erfindung wird Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen bereitgestellt, das/die ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel und eine therapeutisch wirksame Menge dieser Substanz oder dieser Verbindungen umfasst.
Weiterhin betrifft die Erfindung auch die Verwendung von Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen in der Herstellung eines Inhibitors für die Aufnahme von SOD1-Aggregaten in Zellen eines Organismus.
Die Erfindung betrifft weiterhin auch Verfahren zur Inhibierung der Aufnahme von SOD-1 Aggregaten in Neuronen eines Organismus bei dem Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen oder pharmazeutische Formulierung dieser Substanz oder Verbindungen eingesetzt wird. Bei diesem Verfahren, werden einem Organismus, Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen oder pharmazeutische Formulierung dieser oder das Arzneimittel verabreicht.
Die Verabreichung erfolgt dabei vorzugsweise in einer therapeutisch wirksamen Menge an den Organismus. Vorzugsweise ist hier der Organismus ein Mensch oder Tiermodelle. Die zuvor genannten Verbindungen können dem Organismus beispielsweise oral, intravenös oder durch Inhalation verabreicht werden.
Die Verwendung einer Zusammensetzung zur Behandlung und Therapie von ALS enthaltend wenigstens die Verbindung Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen bildet ebenfalls einen Gegenstand der Erfindung.
Im Weiteren wird die Erfindung anhand von experimentellen Ausführungsbeispielen, welche die Wirkungsweise von Syndecan-3 und Syndecan-1 sowie von PPS nachweisen, sowie einigen Figuren, welche die experimentellen Daten wiedergeben, näher und detaillierter erläutert. Die Erfindung ist nicht auf die hier offenbarten exemplarischen Ausführungsbeispiele beschränkt. Alle beschriebenen und/oder bebilderten Merkmale können sich einzeln oder auch kombiniert in unterschiedlichen Ausführungsformen manifestieren. Die Merkmale der unterschiedlichen Ausführungsformen dieser Erfindung und ihre jeweiligen Vorteile werden beim Lesen der nachfolgend ausgeführten Ausführungsbeispiele in Zusammenhang mit den Figuren offenbart. Dabei zeigen:

1: Polyacrylamid-Gelelektrophorese von nicht-aggregierter und aggregierter Wild Typ SOD1 und mutierter A4V und G93A SOD1, sowohl mit und als auch ohne Fluoreszenzmarkierung
2: Durchflusszytometrische Bestimmung der Aufnahme von aggregiertem und nicht aggregiertem SOD1 durch Neuro2A-Zellen vom Wildtyp (2a), A4V-Mutantentyp (2B) und G93A-Mutantentyp (2C) in Abhängigkeit von der Inkubbationszeit
2D: Aufnahme einer konfokalen Fluoreszenzmikroskopie von Neuro2a-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit Wildtyp SOD1-Aggregaten
3: Durchflusszytometrische Bestimmung der Aufnahme von fluoreszenzmarkierten SOD-1 Aggregaten in Neuro2a-Zellen unter Einfluss verschiedener Endozytoseinhibitoren
4: Durchflusszytometrische Bestimmung der Aufnahme von SOD-1 Aggregaten in Neuro2a-Zellen vom Wildtyp, A4V-Mutantentyp und G93A-Mutantentyp nach Inkubation mit Natriumchlorat, Heparin, Heparinase I und III sowie Chondroitinase
5: Durchflusszytometrische Bestimmung der Aufnahme von Wiltyp-und mutierten SOD-1 Aggregaten in Neuo2a-Zellen nach Behandlung mit PPS in steigenden Konzentrationen
6A: Durchflusszytometrische Bestimmung der Aufnahme von SOD-1 Aggregaten in Neuro2a-Zellen mit und ohne Behandlung mit Phosphoinositid-Phospholipase C
6B: Expression des Prion-Proteins mit und ohne Behandlung mit Phosphoinositid-Phospholipase C (PI-PLC)
6C: Durchflusszytometrische Bestimmung der Aufnahme von aggregiertem und nicht aggregiertem SOD1 durch Neuro2A-Zellen vom Wildtyp und von Neuro2A-Zellen ohne Expression von Sdc1 und/oder Sdc3
7A: Durchflusszytometrische Bestimmung der Aufnahme von fluoreszenzmarkierten SOD-1 Aggregaten in primäre kortikale Neuronen von Wildtyp Mäusen nach Inkubation mit Heparin, Heparinase I und III und Chondroitinase
7B Durchflusszytometrische Bestimmung der Aufnahme von fluoreszenzmarkierten SOD-1 Aggregaten in primäre kortikale Neuronen von Sdc1-Knockout-Mäusen (Sdc1^-/-) im Vergleich zu Wildtyp Mäusen
7C: Durchflusszytometrische Bestimmung der Aufnahme von fluoreszenzmarkierten SOD-1 Aggregaten in primäre kortikale Neuronen von Sdc3-Knockout-Mäusen (Sdc3^-/-) im Vergleich zu Wildtyp Mäusen
7D Durchflusszytometrische Bestimmung der Aufnahme von fluoreszenzmarkierten SOD-1 Aggregaten in primäre kortikale Neuronen von Wildtyp Mäusen, Sdc1-Knockout- Mäusen (Sdcl^-/-) und Sdc3-Knockout- Mäusen (Sdc3^-/-) über einen Zeitraum von 6 h

1) Expression, Markierung und Aggregation von SOD1
Für die experimentellen Ausführungsbeispiele wurde exprimierte und gereinigte rekombinante Wildtyp- (wt) SOD1 und mutierte menschliche SOD1-Aggregate mit der familiären A4V- oder G93A-Mutation aus E. coli eingesetzt.
Alle drei SOD1-Aggregat-Varianten (wt SOD1, A4V SOD1, G93A SOD1) wurden mit DyLight 488 fluoreszenzmarkiert. SOD1-Aggregate wurden durch Behandlung mit Trifluorethanol hergestellt. Die Analyse aller drei nichtaggregierten und aggregierten SOD1-Varianten erfolgte durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (1A), gefolgt von einem Immunoblotting mit einem Antikörper gegen humane SOD1. Die Ergebnisse zeigten, dass die monomere SOD1 etwa 16 kDa groß war und natürlich gebildete Dimere von etwa 32 kDa aufwies. Die Fluoreszenzmarkierung von SOD1 mit DyLight 488 stabilisierte die dimere Form aller drei SOD1-Varianten unter diesen Elektrophoresebedingungen. Bei der Aggregation bildete fluoreszenzmarkierte SOD1 hochmolekulare Spezies, die als kontinuierlicher Schmier (in 1A und 1B der innerhalb der eckigen Klammer mit * markierte Gelbandenbereich) mit geringerer elektrophoretischer Mobilität nachgewiesen werden konnten. Das Immunoblotting von Gelen, das unter nichtdenaturierenden Bedingungen mit demselben menschlichen SOD1-Antikörper durchgeführt wurde, bestätigte, dass die Aggregation von SOD1 zu hochmolekularen Spezies geführt hatte, die eine geringere elektrophoretische Mobilität als nichtaggregierte SOD1 aufwiesen (1B).
2) Nachweis einer verbesserten Aufnahme von SOD1-Aggregaten durch Zellen
Um die Aufnahme von SOD1 durch Neuro2a-Zellen in Abhängigkeit von der Zeit zu untersuchen, wurden Neuro2a-Zellen der Wildtyp-Form (2A) sowie den A4V- (2B) und den G93A-Mutanten (2C) mit fluoreszenzmarkiertem, nicht aggregiertem oder aggregiertem SOD1 inkubiert. Anschließend wurde die Menge der Aufnahme von aggregierter oder nicht-aggregierter SOD1 nach 1, 3, 6 und 12 Stunden mittels Durchflusszytometrie ermittelt. Neuro2a-Zellen waren in der Lage, sowohl nicht-aggregierte als auch aggregierte SOD1 zu internalisieren. Bei Inkubationen von mehr als einer Stunde zeigte sich, dass die Aufnahme von aggregierter SOD1 im Gegensatz zu der von nicht-aggregierter SOD1 deutlich erhöht war, was an durchweg höheren Niveaus von internalisierten SOD1-Aggregaten zu erkennen war. Interessanterweise internalisierten Neuro2a-Zellen Wildtyp-SOD1-Aggregate ebenso gut wie Aggregate, die von den beiden mutierten SOD1-Varianten gebildet wurden, was darauf hindeutet, dass eine Mutation in SOD1 für ihre zelluläre Aufnahme nicht wesentlich ist. Eine selektive Behandlung der Zellen mit Trypsin für 30 Minuten nach vorheriger Behandlung mit fluoreszenzmarkierter SOD1 veränderte das Fluoreszenzsignal nicht signifikant. (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass das gemessene Signal von SOD1-Proteinen ausging, die die Zellen internalisiert hatten, und nicht von SOD1-Proteinen, die an die äußere Zellmembran gebunden waren. Auch die konfokale Fluoreszenzmikroskopie von Neuro2a-Zellen, die 24 Stunden lang mit Wildtyp-SOD1-Aggregaten (hellgrau) behandelt wurden, zeigte, dass die Zellen (mit Hoechst, dunkelgrau gefärbte Zellkerne) die SOD1-Aggregate internalisiert hatten (2D).
3) Makropinozytose von SOD1-Aggregaten in Zellen
Der genaue Mechanismus, durch den SOD1-Aggregate in die Zellen gelangen, ist bisher unbekannt. Die Endozytose extrazellulärer Proteine kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. Um zu analysieren, durch welchen Mechanismus SOD1-Aggregate von Neuro2a-Zellen internalisiert werden, wurden die Zellen mit verschiedenen Endozytoseinhibitoren behandelt und die Aufnahme von fluoreszenzmarkierten SOD1-Aggregaten mittels Durchflusszytometrie gemessen (3).
Chlorpromazin hemmt die Clathrin-vermittelte Endozytose, indem es den Aufbau von Clathrin-Gittern auf der Zelloberfläche verhindert. Genistein ist ein Inhibitor von Protein-Tyrosinkinasen und wird zur Hemmung der Caveola-vermittelten Endozytose eingesetzt. Weder die Behandlung mit Chlorpromazin noch mit Genistein hemmte die Aufnahme von SOD1-Aggregaten signifikant, was darauf hindeutet, dass die Aufnahme nicht von Caveolin abhängig war oder durch Clathrin vermittelt wurde.
Im Gegensatz dazu hemmte die Behandlung mit Cytochalasin D, einem Inhibitor der Aktinpolymerisation, signifikant die Aufnahme, was auf einen aktinabhängigen Prozess hindeutet. Die Behandlung mit Methyl-β-cyclodextrin (MβCD), einem cholesterinsenkenden Mittel, reduzierte ebenfalls signifikant die Aufnahme von SOD1-Aggregaten, was darauf hindeutet, dass die Aufnahme von Lipidflößen abhängig ist. Die Behandlung mit EIPA (5-N-Ethyl-N-isopropylamilorid), einem Inhibitor von Na+/H+-Austauschern, Wortmannin, einem Inhibitor der Phosphoinositid-3-Kinase, und IPA-3 (2,2'-dihydroxy-1,1'-dinaphthyldisulfid), einem Inhibitor der p21-aktivierten Kinase 1 (PAK1), reduzierte die Aufnahme von SOD1-Aggregaten signifikant, was darauf hindeutet, dass Makropinozytose beteiligt war. In dem verwendeten Zellassay hemmte Dynasor die Aufnahme von SOD1-Aggregaten. Dynasor wurde ursprünglich als Inhibitor von Dynamin identifiziert, einem GTPase- Protein, das für die Membranspaltung während der Clathrin-vermittelten Endozytose in eukaryotischen Zellen wesentlich ist. Dynasore reduziert jedoch auch labiles Cholesterin in der Plasmamembran und stört die Lipidfloß-Organisation und die Membranspaltung auf dynaminunabhängige Weise, was zur Hemmung der Makropinozytose führt. In Anbetracht der Tatsache, dass Chlorpromazin im Gegensatz zu MβCD die Aufnahme von SOD1-Aggregaten nicht hemmte, liefern unsere Ergebnisse weitere Belege für eine Aufnahme von SOD1-Aggregaten durch Makropinozytose. Die „***“ oder „****“ über den Balken geben die statistische Signifikanz der Ergebnisse an. Dabei entspricht „***“ einer Signifikanz mit p ≤ 0.001 und „****“ einer Signifikanz mit p ≤ 0.0001 im Vergleich zur Kontrolle.
4) Heparansulfatproteoglykanen (HSPG) vermitteln die Aufnahme von SOD1-Aggregaten
Der Zellzugang über Makropinozytose kann durch Bindung spezifischer Viren, Bakterien oder Proteinaggregate, einschließlich aggregierter Tau-Spezies, Amyloid-beta, α-Synuclein und infektiöser Prion-Proteine, an HSPG, die an die Zellmembran gebunden sind, induziert werden. Um festzustellen, ob Zellen SOD1-Aggregate über HSPG aufnehmen, wurden Neuro2a-Zellen vom Wild Typ 48 Stunden lang mit Natriumchlorat behandelt, das die ordentliche Sulfatierung von HSPG aufhebt, bevor die Zellen 12 Stunden lang mit SOD1-Aggregaten inkubiert wurden und ihre Aufnahme mittels Durchflusszytometrie gemessen wurde. Die Behandlung mit steigenden Natriumchlorat-Konzentrationen reduzierte die Aufnahme von SOD1-Aggregaten dosisabhängig (4A).
Als nächstes wurde Heparin verwendet, ein natürlich vorkommendes Glykosaminoglykan, das strukturell mit Heparansulfat verwandt ist, um die Bindung von SOD1-Aggregaten an HSPG kompetitiv zu hemmen. Die SOD1-Aggregate wurden dazu für 6 Stunden bei 4 °C mit 1 mg/mL Heparin behandelt. Anschließend wurden die Neuro2a-Zellen für 6 Stunden mit diesen vorbehandelten SOD1-Aggregaten inkubiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Heparin die Aufnahme sowohl von Wildtyp- als auch von mutierten SOD1-Aggregaten durch Neuro2a-Zellen hemmte (4B), ein Prozess, der dosisabhängig war (Daten nicht gezeigt). In ähnlicher Weise führte die 2-stündige Behandlung von Neuro2a-Zellen mit einer Mischung aus Heparinase I und III (2 U/mL), zwei Enzymen, die Heparansulfate auf HSPG als ihr primäres Ziel erkennen, zu einer verringerten Aufnahme sowohl von Wildtyp- als auch von mutierten SOD1-Aggregaten durch Neuro2a-Zellen, wenn sie nach 6 Stunden durchflusszytometrisch gemessen wurde (4C). Im Gegensatz dazu beeinflusste die 2-stündige Behandlung von Neuro2a-Zellen mit Chondroitinase AC (2 U/mL), einem Enzym, das spezifisch Chondroitinsulfate, ein anderes Glykosaminoglykan, das als Kohlenhydratanteil auf einigen Proteoglykanen zu finden ist, spaltet, die Aufnahme von SOD1-Aggregaten nicht signifikant (4D). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass SOD1-Aggregate spezifisch von HSPG aufgenommen werden, da die Aufnahme chemisch mit Natriumchlorat, kompetitiv mit Heparin und enzymatisch mit Heparinasen, aber nicht mit Chondroitinase gehemmt werden konnte. Die „^***“ oder „****“ über den Balken geben die statistische Signifikanz der Ergebnisse an. Dabei entspricht „^***“ einer Signifikanz mit p ≤ 0.001 und „****“ einer Signifikanz mit p ≤ 0.0001 im Vergleich zur Kontrolle.
5) Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) hemmt die Aufnahme von SOD1 -Aggregaten
PPS gehört zu den wirksamsten Medikamenten, die in experimentellen Modellen der Prionenerkrankung eingesetzt wurden. Zu PPS ist bekannt, dass es das Überleben infizierter Tiere nach intrazerebroventrikulärer Perfusion in dosisabhängiger Weise verlängern kann. Auch wird PPS für die experimentelle Behandlung von menschlichen Prionenerkrankungen im Rahmen von klinischen Studien eingesetzt. PPS wirkt in Konkurrenz zu endogenen HSPG auf der Zelloberfläche als Co-Rezeptor für infektiöse Prionen. Die Behandlung von Neuro2a-Zellen mit steigenden PPS Konzentrationen hemmte kompetitiv die zelluläre Aufnahme fluoreszenzmarkierter Wildtyp- und mutierter SOD1-Aggregate bei nichtzytotoxischen Konzentrationen (5).
6) Nachweis der Syndecan-1 und Svndecan-3 vermittelten Aufnahme von SOD1-Aggregaten in Neuro2a-Zellen
Die Glypicane 1-6 sind eine Familie von HSPG, die über einen GPI-Anker an der äußeren Zellmembran befestigt sind. Um nachzuweisen, ob Glypicane die Aufnahme von SOD1-Aggregaten vermitteln können, wurden Neuro2a-Zellen mit Phosphoinositid-Phospholipase C (PI-PLC) behandelt, die GPI-verankerte Proteine aus der äußeren Zellmembran freisetzt. Die Behandlung von Neuro2a-Zellen mit Phosphoinositid-Phospholipase C verringerte die Aufnahme von SOD1-Aggregaten in Neuro2a-Zellen nicht, wie mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen wurde (6A).
Die Expression des Prion-Proteins, eines weiteren GPI-verankerten Proteins, wurde nach der PI-PLC-Behandlung um über 90% reduziert (6B), was zeigt, dass die PI-PLC-Behandlung effektiv zur Freisetzung von GPI-verankerten Proteinen geführt hat.
Diese Daten belegen, dass Glypicane nicht die Aufnahme von SOD1-Aggregaten vermitteln.
Die Syndykane 1-4 stellen eine Familie von transmembranen HSPG dar. Da Syndecan-3 (Sdc3) und Syndecan-1 (Sdc1) eine sehr hohe Sequenzhomologie aufweisen und in Neuronen exprimiert werden, verwendeten wir CRISPR/Cas9, um gezielt Neuro2a-Zellen zu erzeugen, die keine Expression von Sdc3 oder von Sdc1 oder keine Expression von Sdc1 und Sdc3 aufweisen. Wie zuvor für Wildtyp-Neuro2a-Zellen gezeigt (2), war die Aufnahme von aggregierter SOD1 höher, als die von nicht-aggregierter SOD1, und zwar nicht nur in Wildtyp-Zellen, sondern auch in Zellen, denen die Expression von Sdc3 oder von Sdc1 und Sdc3 fehlte (6C). In Zellen, in denen sowohl die Sdc1- als auch die Sdc3-Expression fehlte (weißer Balken), wurde die Aufnahme von monomerer und aggregierter SOD1 gegenüber den Wildtyp-Zellen signifikant reduziert und zwar um fast 60%. (6C). Die „^***“ oder „****“ über den Balken geben die statistische Signifikanz der Ergebnisse an. Dabei entspricht „***“ einer Signifikanz mit p ≤ 0.001 und „****“ einer Signifikanz mit p ≤ 0.0001 im Vergleich zur Kontrolle.
7) Syndecan-1 und Syndecan-3 vermittelte Aufnahme von SOD1-Aggregaten in primäre Neuronen
Um zu untersuchen, ob die Ergebnisse in Neuro2a-Zellen auf primäre kortikale Neuronen ausgedehnt werden können, wurden isolierte, kultivierte und behandelte primäre kortikale Neuronen von Wildtyp-Mäusen mit Heparinase und Chondroitinase behandelt, wie schon zuvor für Neuro2a-Zellen, bevor diese mit DyLight 488-markierten SOD1-Aggregaten exponiert wurden (7A). Ebenso wurde die Aufnahme von SOD1-Aggregaten nach Blockierung mit Heparin getestet, wie schon zuvor für Neuro2a-Zellen durchgeführt (7A). Die Aufnahme von SOD1-Aggregaten wurde wiederum mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass die enzymatische Behandlung mit Heparinase und die kompetitive Blockierung mit Heparin, nicht aber die enzymatische Behandlung mit Chondroitinase, die Aufnahme von SOD1-Aggregaten in primären kortikalen Neuronen hemmt, wie dies bei Neuro2a-Zellen beobachtet wurde (4). Die „^***“ oder „****“ über den Balken geben die statistische Signifikanz der Ergebnisse an. Dabei entspricht „^***“ einer Signifikanz mit p ≤ 0.001 und „****“ einer Signifikanz mit p ≤ 0.0001 im Vergleich zur Kontrolle.
Als nächstes wurden isolierte, kultivierte, primäre kortikale Neuronen von Sdc1-Knockout-(Sdc1-/-) und Sdc3-Knockout- (Sdc3-/-) Mäusen mit fluoreszenzmarkierten SOD1-Aggregaten behandelt. Die durchflusszytometrische Messung zeigte, dass die Aufnahme von fluoreszenzmarkierten SOD1-Aggregaten bei primären kortikalen Neuronen ohne Sdc1-/- ( 7B) oder Sdc3-/- (7C) im Vergleich zu primären kortikalen Neuronen von Wildtyp-Mäusen um 50 % reduziert war. Die Echtzeit-Bildgebung der Aufnahme von SOD1-Aggregaten in kultivierten primären kortikalen Neuronen von Sdc1-/- Mäusen oder Sdc3-/- Mäusen über einen Zeitraum von 6 h zeigte auch, dass die Aufnahme von SOD1-Aggregaten im Vergleich zu kultivierten primären kortikalen Neuronen von Wildtyp-Mäusen um etwa die Hälfte reduziert war (7D).
Die Daten belegen, dass Syndecan-1 und Syndecan-3 eine entscheidende Rolle bei der Aufnahme von SOD1-Aggregaten in neuronale Zellen spielen und legen nahe, dass beide Rezeptoren die Zell-zu-Zell-Übertragung von pathologischen SOD1-Aggregaten bei ALS vermitteln können, was zu einer Ausbreitung der Krankheit entlang der motorischen Achse führen könnte.
Obwohl die Erfindung in den experimentellen Beispielen und der vorangegangenen Beschreibung ausführlich dargestellt und beschrieben wurde, sind diese experimentellen Daten und Beschreibungen als illustrativ oder exemplarisch und nicht einschränkend zu betrachten. Es versteht sich, dass Änderungen und Modifikationen durch gewöhnliche Fertigkeiten im Rahmen der folgenden Ansprüche vorgenommen werden können. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung weitere Ausführungsformen mit einer beliebigen Kombination von Merkmalen aus verschiedenen Ausführungsformen, die oben und unten beschrieben sind.
Während die Erfindung anhand von besonderen Ausführungsbeispielen im vorangehenden Teil der Anmeldung eingehend beschrieben und bebildert wurde, sollen diese Beschreibung und die Figuren lediglich als Beispiel gelten, ohne dadurch einschränkend zu wirken. Es ist davon auszugehen, dass ein Fachmann im Rahmen seines Fachwissens selbst weitere Änderungen und Modifikationen der nachfolgenden Ansprüche vornehmen würde und könnte, die durch den Schutzbereich der Ansprüche mit abgedeckt sind. Insbesondere sind im Rahmen der Erfindung weitere Ausführungsformen mit jeder Art von Kombinationen der erwähnten Merkmale einzelner Ausführungsbeispiele mit umfasst.

Claims

Verfahren zum Identifizieren und/oder Erhalten von Wirkstoffen zur Linderung oder Behandlung von ALS umfassend folgende Schritte: a. Bereitstellen einer Zusammensetzung enthaltend Zellen mit den Zelloberflächenrezeptoren Syndecan-3 und/oder Syndecan-1 b. Inkontaktbringen der Zusammensetzung aus Schritt a) mit SOD-1 Aggregaten c. Inkontaktbringen der Zusammensetzung aus Schritt a) mit der zu screenenden Testsubstanz, wobei Schritt b) und Schritt c) gleichzeitig erfolgen kann oder Schritt c) vor Schritt b) erfolgen kann d. Bestimmung der Aufnahme der SOD1-Aggregate in die Zellen.
Verfahren nach vorhergehendem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass gemäß Schritt e) ein Vergleich der Ergebnisse der Aufnahme der SOD1-Aggregate in die Zellen mit einem Referenzwert ohne Zugabe der Testsubstanz nach Schritt c) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Zellen Neuronen, neuronale Zelllinien oder Zellen/Zelllinien eingesetzt werden, die so verändert wurden, dass sie die Zelloberflächenrezeptoren Syndecan-3 und/oder Syndecan-1 exprimieren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass SOD-1 Aggregate eingesetzt werden, die dafür bekannt sind, ALS beim Mensch oder im Tiermodell für ALS auszulösen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Wild Typ SOD-1 Aggregate oder mutierte SOD-1 Aggregate eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass SOD-1 Aggregate mit der familiären A4V- oder G93A-Mutation eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass SOD-1 Aggregate eingesetzt werden, die markiert sind oder in der Lage sind, ein spezifisches Signal zu emittieren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass SOD-1 Aggregate eingesetzt werden, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Aufnahme der SOD-1 Aggregate in die Zellen gemäß Schritt d) mittels Proteinanalyseverfahren in Zellen erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Aufnahme der SOD-1 Aggregate in die Zellen gemäß Schritt d) mittels optischer Verfahren erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Aufnahme der SOD-1 Aggregate in die Zellen gemäß Schritt d) mittels Durchflusszytometrie, immunologischer Nachweisverfahren, spektrometrischer oder mittels mikroskopischer Verfahren erfolgt.
Kit oder eine Zusammensetzung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, enthaltend wenigstens Zellen, welche die Zelloberflächenrezeptoren Syndecan-3 und/oder Syndecan-1 exprimieren sowie SOD-1 Aggregate.
Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen zur Verwendung bei der Herstellung eines Inhibitors für die Aufnahme von SOD1-Aggregaten in Zellen eines Organismus.
Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen als Arzneimittel in der Behandlung von ALS.
Arzneimittel enthaltend Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen sowie einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger.
Verwendung von Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ALS.
Verwendung von Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen in der Herstellung eines Inhibitors für die Aufnahme von SOD1-Aggregaten in Zellen eines Organismus.
Verwendung einer Zusammensetzung zur Behandlung und Therapie von ALS enthaltend wenigstens die Verbindung Pentosanpolysulfat-Natrium (PPS) oder Verbindungen aus der Gruppe der Heparine oder herparinähnlichen Verbindungen.