DE60018061T2

DE60018061T2 - Verwendung von glykosaminoglykane zur behandlung seniler demenz

Info

Publication number: DE60018061T2
Application number: DE60018061T
Authority: DE
Inventors: Umberto Cornelli; Luigi De Ambrosi; Israel Hanin; Jawed Fareed; John Lee; Stanley Lorens; Ronald F. Mervis
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2020-05-13
Also published as: CN1178667C; ES2237425T3; IT1312107B1; JP2002544233A; HK1039903A1; PL352070A1; HUP0201100A3; US6979680B1; NO328902B1; KR100711142B1; HUP0201100A2; ATE288761T1; KR20020005033A; CN1350459A; HK1039903B; EP1181024B1; ZA200109331B; EP1181024A1; AU4405200A; DE60018061D1

Description

TECHNISCHER BEREICH
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Glykosaminoglykane mit einem Molekulargewicht von 2400 D, die für die Behandlung der senilen Demenz und zerebraler neurologischer Läsionen verursacht durch Iktus und Traumen geeignet sind.
STAND DER TECHNIK
Senile Demenz, insbesondere in der Form von Alzheimer, ist hauptsächlich charakterisiert durch zerebrale Ablagerungen von Amyloidsubstanz in Plaques entweder in den Hirngefäßen (vaskuläres Amyloid) oder in der zerebralen Substanz (zerebrales Amyloid), wobei beide Amyloidformen als β-Amyloid oder Aβ bezeichnet werden. Das andere typische Kennzeichen der senilen Demenz auf physiopathologischer Ebene ist das Vorkommen von Alzheimers' Fibrillenveränderungen, so genannten NFT (neurofibrillary tangles = Fädchenplaque).
Bekannt ist, dass die Proteoglykane (PG) und insbesondere das Heparansulfat-Proteoglykan (HSPG) entweder an der Polymerisation von Aβ oder an der Aggregation der NFTs beteiligt sind sowie desweiteren an anderen pathologischen Ereignissen, die mit der Alzheimer-Erkrankung und allgemein mit seniler Demenz in Verbindung stehen (Snow AD; Sekiguchi R; Nicholin D et al, "An Important Role of Heparan Sulfate Proteoglycan (Perlakan) in a Model System for the Deposition and Persistance of Fibrillar Beta Amyloid in Rat Brain"). Neuron 1994; 12: 219–234) und (Perry G; Sieslak SL; Richey P, Kawai M et al. "Association of Heparan Sulfate Proteoglycan with Neurofibrillary Tangles of Alzheimer's Disease". J. Neurosci. 1991; 11: 3679–3683). Darüber hinaus wird auch in der Originalveröffentlichung von Snow (Willmer JP; Snow AD; Kisilevski R. "The Demonstration of Sulfate Glycosaminoglycans in Association with the Amyloidogenic Lesions in Alzheimer's Disease". J. Neuropath. Exp. Neurol. 1986; 45: 340–346) das Vorkommen von PG und Glykosaminoglykanen (GAG) in den zerebralen Amyloidplaques bei Patienten nachgewiesen, die an seniler Demenz leiden. Mehrere Studien (Kalaria RN; Kroon SN; Grahovak I; Perry G. "Acetylcholinesterase and its Association with Heparan Sulfate Proteoglycans in Cortical Amyloid Deposits of Alzheimer's Disease". Neuroscience 1992; 51:177–184) zeigten, dass die Assoziation zwischen PG und Amyloid entweder durch direkte Verbindung mit dem Vorläufer von β- Amyloid (AβPP) oder einer Verbindung mit Aβ1-41 oder mit Aβ1-43 verursacht wird, welche die neurotoxischen Sequenzen von Aβ beinhalten.
Die PG führten auch zu einer verstärkten Polymerisation des Tau-2-Proteins (Perry G; Sieslak SL; Richey P, Kawai M et al. "Association of Heparan Sulfate Proteoglycan with Neurofibrillary Tangles of Alzheimer's Disease". J. Neurosci. 1991; 11: 3679–3683), welches der Auslöser für die Bildung der Fädchenplaque (NFT) ist.
Außerdem zeigten Ratten in einem fortgeschrittenen Alter in einer von Lorens et al. durchgeführten Studie (Lorens SA; Gushawan BS; Van De Kar L; Walegnga JM; Fareed J. "Behavioural, Endocrine, and Neurochemical Effects of Sulfomucopolysaccharide Treatment in the Aged Fischer 344 Male Rat". Semin Thromb. Haemost. 17 Suppl. 1993; 2:164–173) eine Verbesserung hinsichtlich des Verhaltensdefizits nach oraler Verabreichung von Glykosaminoglykanen mit einem hohen Molekulargewicht (GAP oder Glykosaminoglykane polysulfatiert oder Ateroid^®).
Conti et al. (Conti L; Placidi GF; Cassano GB; "Ateroid^® in the Treatment of Dementia: Results of a Clinical Trial (Eds. Ban E; Lehmann HE) Diagnosis and Treatment of Old Age Dementias" Mod. Probl. Pharmacopsychiatry. Basel, Larger 1989 vol. 2, 76–84) zeigten, dass an seniler Demenz erkrankte Patienten nach der Behandlung mit Ateroid^® eine signifikante Verbesserung bezüglich der Leistung der psychopathologischen Parameter und des Sozialverhaltens aufwiesen im Vergleich zu mit Placebo behandelten Patienten.
Parnetti et al. (Pametti; Ban TA; Senin U. "Glycosaminoglycan Polysulfate in Primary Degenerative Dementia". Neuropsychobiology 1995; 31: 76–80) belegten, dass Ateroid^® einige biochemische Parameter, die sich bei seniler Demenz verändern, wie beispielsweise die Monoaminoxidase B der Blutplaques und die Dopamin- und Serotoninkonzentrationen in der Zerebrospinalflüssigkeit signifikant verbessern kann.
Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass Ateroid^® hilfreich bei der Therapie der senilen Demenz ist. Bereits 1988 ließen sich U. Cornellli and T. Bann die Verwendung des Produkts zur Behandlung der senilen Demenz ( EP 293974 ) patentieren.
Andererseits wurden bereits zuvor Glykosaminoglykane, erhalten durch Depolymerisation von Heparin und mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2400 D, für bestimmte Verwendungszwecke von W.E. Barnett (U.S.) 4,351,938) und R.J. Linherdt et al ( U.S. 4,847,338 ) beschrieben.
Insbesondere beschreibt das US-Patent. 4,351,938 partiell depolymerisierte Heparinprodukte mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 2000 bis 7000 D zur Verwendung als Antikoagulanzien und Antithrombotika. Genannte Produkte wurden erhalten durch Reaktion mit einem Heparinsalz in wässriger Nitronsäurelösung US-Patent. 4,847,338 beschreibt ein Tetrasaccharid, ein Hexasaccharid, ein Octasaccharid und ein Decasaccharid, welche die Komplementaktivierung hemmen und weniger als 33% Antikoagulationsaktivität im Vergleich zu nativem Heparin besitzen.
Genannte Saccharide wurden durch enzymatische Depolymerisation von Heparin gewonnen.
ZUSAMMENFASSUNG
Wir haben nun überraschenderweise in einem in vivo Experiment festgestellt, dass die durch Heparindepolymerisation erhaltene Glykosaminoglykanefraktion mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2400 D eine außergewöhnliche Effektivität bei der Hemmung der β-Amyloidbildung und der Begünstigung des Neuronenwachstums zeigt.
Die Fraktionen mit niedrigerem (640 D) durchschnittlichen Molekulargewicht oder höherem (4800 D) Molekulargewicht zeigen definitiv niedrigere oder vernachlässigbare Effektivität
Daher ist es möglich, die Fraktion von Glykosaminoglykanen mit durchschnittlichem Molekulargewicht von 2400 D für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen zu verwenden, die für die Behandlung von seniler Demenz geeignet sind, insbesondere für die Therapie der Alzheimer-Erkrankung oder SDAT (senile Demenz vom Alzheimer-Typ) und zur Behandlung von zerebralen neurologischen Läsionen aufgrund von Iktus und Traumen.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt den HPLC-Test von Glykosaminoglykan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2400 D (± 200), wie gemäß dem beschriebenen Beispiel erhalten.
2 zeigt den NMR-Test von Glykosaminoglykan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2400 D (± 200), wie gemäß dem beschriebenen Beispiel erhalten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Fraktion von Glykosaminoglykanen mit durchschnittlichem Molekulargewicht von 2400 D für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die für die Behandlung von seniler Demenz geeignet sind, insbesondere für die Therapie der Alzheimer-Erkrankung oder SDAT (senile Demenz vom Alzheimer-Typ) und zur Behandlung von zerebralen neurologischen Läsionen aufgrund von Iktus und Traumen.
Genannte Fraktion der Glykosaminoglykane wird gewonnen durch Depolymerisation von Heparin, bevorzugt durchgeführt gemäß einer Methode beinhaltend die folgenden Schritten:

a) eine wässrige Lösung von Heparin wird gemäß dem US.-Patent 4,987,222 mit Gammastrahlen aus Co 60 behandelt;
b) die in Schritt a) erhaltene Lösung wird mittels Gelpermeation über Sephadex G/50 Harz fraktioniert;
c) die Mischung der Fraktionen mit Molekulargewichten von 1000 bis 3000 D wird bei einem Cut-Off von 600 D ultrafiltriert, gewaschen und anschließend gefriergetrocknet;
d) das gefriergetrocknete Produkt wird aufgelöst und mittels Gelpermeation über Sephadex G/25 Harz fraktioniert;
e) die Fraktionen im Molekulargewichtsbereich von 1920 bis 2560 D, entsprechend einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2400 D, werden gesammelt und gemischt.

Für die Herstellung der Fraktion von Glykosaminoglykanen mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2400 D mithilfe der bevorzugten erfindungsgemäßen Methode, wird zuerst eine 10 %ige wässrige Heparinlösung mit Gammastrahlen aus Co 60 in einem Intensitätsbereich von 120 KGy bis 150 KGy behandelt und nachfolgend mit 25 Kgy, bezogen auf das Heparin-Molekulargewicht, bestrahlt.
Die bestrahlte Lösung wird ultrafiltriert bei einem Cut-Off von 300 D, gereinigt, sterilfiltriert und gefriergetrocknet, wodurch das "ursprüngliche depolymerisierte Heparin" gewonnen wird.
Dieses "ursprünglich depolymerisierte" Heparin wird in einer 0,3 M NaCl-Lösung aufgelöst und dann einer Fraktionierung mittels Gelpermeation über Sephadex G/50 Harz unterzogen.
Die Fraktionen mit einem Molekulargewicht < 3000 D (etwa 10% von Gesamt) bilden das Rohmaterial für die vorliegende Erfindung.
Die erste Behandlung dieser Mischung besteht aus der Ultrafiltration bei einem Cut-Off von 600 D zur Entfernung der aus dem Depolymerisationsprozess stammenden molekularen Fragmente.
Die ultrafiltrierte Mischung wird mit 0,3 M NaCl gewaschen bis die Reaktion auf Carbazol aus dem Permeat verschwunden ist.
Die Endmischung mit einer Konzentration von etwa gleich 8 % in destilliertem Wasser wird über 0,2 μ Membranen sterilfiltriert und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Produkt wird in 0,3 M NaCl-Lösung bei einer Konzentration im Bereich von 10 % bis 15 % (w/v) aufgelöst.
Um die Fraktion mit durchschnittlichem Molekulargewicht von 2400 D zu erhalten, wird ein zweiter Gelpermeationsschritt angewandt unter Beibehaltung fast der gleichen Parameter wie bei der ersten Gelpermeation, jedoch unter Nutzung der spezifischen Charakteristika von Sephadex G/25.
Die verwendete Vorsäule ist beispielsweise vom Typ BP 252/15 und besitzt die folgenden Merkmale:

• Höhe: 105 cm

• Harzvolumen: 5200 ml

• Flussrate: 1000 ml/h
Die übernommenen Parameter stellen sich wie folgt dar:

• Ve = 17.000 ml

• Ve/Vo = 1/R = 1,26

• R = 0,79

• K = 0,09 = (Ve – Vo):(Vt – Vo)

wobei:

• Ve = Elutionsvolumen
• Vt = Harz-Gesamtvolumen
• Vo = Totvolumen (Anfangslösung im Ertrag)
• R = Auflösung (Peakamplitude)

Aus der zweiten Gelpermeation werden 10 bis 12 Fraktionen gewonnen, die eine Reihe von Molekulargewichtsbereichen von 3000 D bis etwa 1500 D umfassen. Für die Herstellung der erfindungsgemäßen Glykosaminoglykanefraktionen werden nur die Fraktionen mit einem Molekulargewicht im Bereich von 1920 D bis 2560 D gesammelt und gemischt.
Die resultierende Lösung wird ultrafiltriert bei einem Cut-Off von 300, um so das Natriumchlorid zu entfernen.
Die Lösung wird auf eine Konzentration von etwa 10 % gebracht, über 0,2 μ-Membranen gefiltert und anschließend gefriergetrocknet.
Diese Fraktion bildet etwa 80 % der Gesamtfraktionen mit einem Molekulargewicht < 3000 D.
Gemäß der erfindungsgemäßen Methode wird die gewünschte Glykosaminoglykanefraktion mit einem beachtlichen Reproduzierbarkeitsindex gewonnen und zwar entweder in Bezug auf den Ertrag des Verfahrens oder bezogen auf die konstante molekulare Zusammensetzung.

Unten stehend ist die Charakterisierung der erfindungsgemäßen Glykosaminoglykanefraktion angegeben. CHEMISCH-PHYSIKALISCHE CHARAKTERISTIKA

Aussehen:	hellgelbes Pulver
Durchschnittliches Molekulargewicht:	2400 D (± 200)
Molekulargewichtsverteilung:	95% < 2560 D -> 1920 D
Polydispersionsindex:	< 1,20
Organischer Schwefel:	9,5 – 11,5%
Verhältnis SO₃/COOH:	2,3 – 2,6
Spezifische Rotation:	> +35°
HPLC:	Abbildung Nr. 1

NMR:	Abbildung Nr. 2

Das durchschnittliche Molekulargewicht wurde über die HPLC bestimmt unter Verwendung von Säulen für die Ausschlusschromatographie im Vergleich zu LMW-Heparinen (niedermolekulares Heparin) als Kalibrations-Referenzsubstanz Batch-Nr. 1a (PH.EUR.) mit einem Molekulargewicht von 3700.
PROZENTUALE VERHÄLTNISSE DER SULFATIERUNG
Es wurden drei Proben untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
TABELLE Nr. 1
Die Prozentwerte werden berechnet aus der Summe zweier spezifischer Bereiche, die aus der NMR-Analyse herangezogen wurden.
Desulfatierte Uronsäuren: Bereich der Signale bei 102,2 und 106 ppm bezogen auf die Gesamturonsäurekonzentration bei 100,5 und 106 ppm.
Glukosamin.NSO₃-6-sulfatiert: Bereich der Signale bei 62,5 ppm bezogen auf den Bereich von Glukosamin-6 sulfatiert bei 68 ppm;
Glukosamin.N acetyliert: Bereich der Signale bei 55,5 ppm bezogen auf den Signalbereich von 61 bis 54 ppm;
Glukosamin.N,3 sulfatiert: Bereich der Signale bei 59 ppm bezogen auf den Signalbereich von 61 bis 54 ppm;
Die Werte der Sulfatierung am C6 von Glukosamin erwiesen sich als niedriger als bei den Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 4500 D (84 im Durchschnitt)
Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass mit abnehmendem Molekulargewicht die sekundären Alkoholgruppen, die sich am reduzierten endständigen Teil befinden und deren Signale in die Zone des C6 der 6-desulfatierten Glukosamine fallen, verstärkt werden.
STRUKTURCHARACTERISTIKA
1 zeigt den HPLC-Ausdruck der Fraktion von Glykosaminoglykanen mit einer Verteilung von 95% im Molekulargewichtsbereich von 2560 D bis 1920 D entsprechend 4–5 konstitutiven Disacchariden.
2 zeigt den NMR-Ausdruck der gleichen Fraktion, wobei das Fehlen von Signalen im Bereich von 84 bis 85 ppm festzustellen ist, welches charakteristisch für die durch Depolymerisation mit Gammastrahlen entfernte Bindungsstelle ist. Die Abspaltung der Galaktose-Kette und der Stickstoff-Verbindungen stellen eine spezifische Eigenschaft der Saccharidfraktion dar, wodurch Messungen ohne Interferenzen möglich sind, normalerweise mit pathologischem Charakter, abgeleitet aus dem Auftreten von Peptidstrukturen mit unterschiedlichen Aminosäurezusammensetzungen.
Die NMR-Analyse deckt darüber hinaus auf, dass sich im endständigen Bereich nur intakte Ringe befinden oder dieser sich letztendlich aus aliphatischen "Resten" zusammensetzt.
Die Ringe der reduzierten Enden sind niemals desulfatiert.
An den reduzierten Enden desulfatierte Glukuron-Strukturen sind nicht angeführt, da sie durch die Gammastrahlung zerstört werden.
In den Ringen der nicht reduzierten Enden sind die endständigen C4-Moleküle nur schwer von den nicht endständigen C4-Molekülen zu unterscheiden, da sie alle in den gleichen Bereich fallen; die einzigen, die eindeutig identifizierbar sind, stammen vom NS, 3S-Glukosamin, welches direkt an die Glukuronsäure im aktiven Pentamer angrenzt.
Die Strukturkerne entsprechen dem ursprünglichen Heparin mit praktisch unveränderten Sulfatierungsindizes.
Die anomerischen Signale, die von Redoxgruppen von GlcNSO₃6SO₃ und ldoA2SO₃ ausgehen, qualifizieren die Fraktion von erfindungsgemäßen Glykosaminoglykanen als Substanz mit endständigen Einheiten ähnlich denjenigen der Fragmente des natürlichen Heparins.
Besonders geeignet für die erfindungsgemäße Verwendung ist die Glykosaminoglykane-Fraktion mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht gleich 2400 D mit einem Polydispersionsindex unter 1,20, bei völligem Fehlen des Peptidanteils und frei von desulfatierten Einheiten am reduzierten Ende, welche ohne Resulfatierungsbehandlung und ohne Katalysatoren erhalten wurde. BIOLOGISCHE CHARAKTERISTIKA

Ph.E. Heparin-Aktivität = fehlt

USP Heparin-Aktivität = fehlt

Anti-Xa-Aktivität = <50 U aXa/mg

Anti-Ila-Aktivität = <10 U aXa/mg
Aus der oben angeführten Charakterisierung ergibt sich, dass die erfindungsgemäße Glykosaminoglykanefraktion das Fehlen der Heparin-Aktivität bezüglich der Koagulationsparameter belegt, trotz der Erhaltung der Strukturcharakteristika des Heparinmoleküls mit offensichtlich wesentlich geringerem Molekulargewicht als Heparin.
BEISPIEL
100 g Natrium-Heparin aus der Darmschleimhaut vom Schwein mit einem Molekulargewicht von 14000 D und einer Aktivität von 190 U/mg werden in 1 l destilliertem und entgasten Wasser gelöst. Die Lösung wird in Pyrex-Behälter abgefüllt, die nach der Begasung mit Argon mit einem Glasstopfen verschlossen werden.
Die Lösung wird insgesamt einer Bestrahlung mit 130 kGy an Gammastrahlen aus Co 60 unterzogen und darauf folgenden Dosen von etwa 25 kGy, wodurch es zur Depolymerisation des Heparins kommt.
Die bestrahlte Lösung wird bei einem Cut-Off von 300 D ultrafiltriert, über anschließende Passagen in 3 % NaCl gereinigt und nach einer Aufkonzentrierung auf etwa 10 % gefriergetrocknet.
Dieses "ursprüngliche depolymerisierte" Heparin wird bei 10 % in 0,3 M NaCl-Lösung gelöst und über eine Gelpermeationssäule, die Sephadex G 50 enthält, fraktioniert.
Nach Auftrennung der Verbindungen mit einem Molekulargewicht > 8000 D und den auf Heparin bezogenen Aliquoten mit etwa 4500 D werden die Fraktionen mit einem Molekulargewicht < 3000 D gewonnen.
Diese Fraktionen werden bei einem Cut-Off von 600 D durch Ultrafiltration gereinigt, wobei die Molekülfragment, die sich in Folge des Depolymerisationsverfahrens bilden, entfernt werden.
Nach einer Reihe von Waschvorgängen in 0,3 M NaCl zur Entfernung der Reaktion auf Carbazol im Permeat, wird die Mischung aufkonzentriert auf etwa 8 % und die Lösung über 0,2 Mikrometerfilter gegeben und gefriergetrocknet.
Das gefriergetrocknete Produkt wird in 0,3 M NaCl-Lösung gelöst und zwar in einer entspechenden Menge, um eine Endkonzentration von 10% (x/v) zu erreichen. Diese Lösung wird über eine Gelpermeationssäule mit Sephadex G/25 fraktioniert.
Die Fraktionen mit einem Molekulargewicht im Bereich von 1920 D bis 2560 D werden gesammelt.
Die erhaltene Lösung wird über Ultrafiltration mit einem Cut-Off bei 300 D gereinigt, um so das Natriumchlorid zu entfernen.
Die Lösung wird auf etwa 10 % aufkonzentriert und gefriergetrocknet.
Ertrag: etwa 9 g an hellgelbem Pulver.
Analyse: durchschnittliches Molekulargewicht 2400 (± 200); organischer Schwefel 9,9%. Verhältnis Sulfate/Carboxyl = 2,5; Anti- Xa-Aktivität = 45 U Anti-Xa/mg.
HPLC-Test, 1.
NMR-Test, 2.
Aus Vergleichszwecken wurden mit der gleichen Methode die folgenden Glykosaminoglykanefraktionen hergestellt:

– Fraktion mit durchschnittlichem Molekulargewicht von 640 D (von 320 bis 1600 D);
– Fraktion mit durchschnittlichem Molekulargewicht von 4800 D (von 3350 bis 6060 D);

Dank der pharmazeutischen Charakteristika, die sich aus den unten angegebenen Experimenten ergeben, werden die Glykosaminoglykane mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2400 D zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet, die geeignet sind für die Behandlung der senilen Demenz und insbesondere der Alzheimer-Erkrankung oder SDAT (Senile Demenz vom Alzheimer-Typ) sowie von zerebralen neurologischen Läsionen aufgrund von Iktus oder Traumen und Formen von Nervendegeneration.
Genannte Zusammensetzungen umfassen pharmazeutisch wirksame Mengen der genannten Glykosaminoglykane in Mischungen mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnern oder Trägerstoffen und werden in geeigneten Formulierungen für die subkutane, intramuskuläre, intravenöse und orale Verabreichung hergestellt. Genannte Verbindungen enthalten genannte Glykosaminoglykane mengenmäßig im Bereich von 50 bis 200 mg pro Einzeldosierung.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch eine therapeutische Methode zur Behandlung von an seniler Demenz leidenden Patienten und insbesondere von Patienten mit Alzheimer-Erkrankung oder SDAT und zerebralen neurologischen Läsionen verursacht durch Iktus und Traumen. Die Verabreichung besteht aus einer Menge an Glykosaminoglykanen mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2400 D im Bereich von 10 bis 400 mg pro Tag. Speziell für die subkutane, intramuskuläre und intravenöse Verabreichung wird eine Dosierung von 10 bis 200 mg pro Tag erwartet und die orale Verabreichungsdosierung wird auf 25 bis 400 mg pro Tag geschätzt.
PHARMAKOLOGISCHE UNTERSUCHUNG
Für die Studie zur pharmakologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Fraktion an Glykosaminoglykanen wurde ein Untersuchungsmodell zur Reproduktuion einiger für senile Demenz typischer Läsionen an Ratten angewandt (Sigurdsson EM; Lorens SA; Hejna MJ; Dong WX; Lee JM. "Local and Distal Histopathological Effects of Unilateral Amyloid-β 25–35 Injections into the Amygdala of Young F344 Rats". Neuro Biol Aging 1996; 17:893–901).
Im Speziellen wurden die folgenden Parameter untersucht:

– Tau-2-Protein, in Korrelation zur Entität der Reaktion auf die β-Amyloidsubstanz (indirekte Reaktivität);
– GFAP-Protein (glial fibrillary acid protein = fibrilläres saures Gliafaserprotein), in Korrelation zur Reaktivität der Astrocyten auf β-Amyloid (direkte Reaktivität).

FÜR DIE UNTERSUCHUNG VERWENDETE MATERIALIEN

• β Amyloid: A β 25–35 Natriumsalz in einer Lösung von Trifluoressigsäure (TFA) (VEH1) mit einem Peptidgehalt von 82–89 % (BACHEM, Torrance, CA). β-Amyloid mit dem jeweiligen Träger (VEH1) wurde kurz vor der Verwendung mit Nanopure-H₂O mengenmäßig so verdünnt, dass sich eine Konzentration von 5 nmol/3,0 ml ergab und auf 4°C gehalten.
• Glykosaminoglykane, TGSS: drei Typen von TGSS (tailored glycosaminoglycans) wurden, wie oben beschrieben, hergestellt mit unterschiedlichen Molekulargewichten, wie der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen ist:

Diese Produkte bestanden aus einem hellgelben wasserlöslichen Pulver, welches in einem Trockner bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde.
Für die Injektion in Ratten wurden die Lösungen in einer Konzentration von 1 mg/ml in physiologischer Lösung (VEH2) hergestellt.
Die Lösungen wurden bei einer Temperatur von 4°C über einen Zeitraum von nicht länger als zwei Wochen aufbewahrt.

• VEH1: Trifluoressigsäure (TFA) (10 nmol in 3 μl destilliertes H₂O), Trägerstoff für β-Amyloid.
• VEH 2: Physiologische Lösung, Trägerstoff für TGSS.

UNTERSUCHUNGSMETHODEN
Das für die Untersuchung verwendete Modell basiert auf den Wirkungen einer Injektion mit Aβ 25–35 in die zentral-zerebralen Region der Amygdala.
Die Aminosäuresequenz von Aβ 25–35 ist die Sequenz, die als neurotoxisch angesehen wird (Yankner BA; Duffy LK; Kirscner DA; "Neurotrophic and Neurotoxic Effects of Amyloid-β Protein. Reversal by Tachykinin Neuropeptides". Science 1990: 250–282), da diese die für Aβ 1–41 oder Aβ 1–43 typischen Läsionen hervorruft.
Für die Untersuchungen wurden junge (3–4 Monate) männliche Ratten vom Fischer 344 Stamm genommen, die eine intrazerebrale Injektion mit 5 nmol/3,0 μl Aβ 25–35 oder dem jeweiligen Trägerstoff (VEH 1) in die rechte Amygdala erhielten.
TGSS oder der jeweilige VEH2-Trägerstoff wurden 2mal täglich subkutan verabreicht beginnend zwei Tage vor der intrazerebralen Injektion von Aβ über einen Zeitraum von 32 Tagen nach der genannten Injektion in den unten angegebenen Dosierungen.
Zur histologischen Analyse wurden die Tiere anästhesiert mit Pentobarbital-Natrium und arteriell (transaortal) mit einer 4%igen Formaldehydlösung perfundiert.
Es wurden 5 koronale Schnitte (40 μm) im Abstand von 0,2 mm ausgeführt.
In die Schnitte wurden Antikörper für das Tau-2-Protein und für das fibrilläre saure Gliafaserprotein (GFAP) eingebracht.
Die Fischer 344 Ratten wurden über Harlan Sprague-Dawley Inc. (Indianapolis In) bezogen
Zum Lieferzeitpunkt wogen die Tiere 250–300 g und waren zwischen 3 und 4 Monate alt. Die Tiere wurden in Einzelkäfigen gehalten unter einem 12-Stunden-Zyklus von Licht und Dunkel (hell ab 7 Uhr morgens). Die Haltungsbedingungen entsprachen den von der AAALAC (American Association Animal Laboratory and Care) geforderten Richtlinien.
Die Tiere hatten Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum und wurden unter diesen Bedingungen für 2–3 Wochen vor dem Experiment gehalten.
Die intrazerebrale Injektion von Aβ 25–35 wurde unter Anästhesie mit Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg, i.p.; Butler, Columbus, OH) durchgeführt.
Bei der Anästhesierung der Tiere wurden auch Atropinsulfat (0,4 mg/kg; Sigma, St. Louis, MO) und Ampicillin-Natriumsalz (50 mg/kg; Sigma, St. Louis, MO) intramuskulär gegeben. Die intrazerebrale Injektion in die rechte Amygdala wurde mit einem stereotaxischen (Kopf) Instrument durchgeführt und zwar so, dass dieses nicht tiefer als 3,3 mm unterhalb der Interauralline eindrang
Die Koordinaten für die Injektion wurden auf der Basis des Paxinos und Watson-Atlas bestimmt, gemessen vom kranialen Bregma mit den Koordinaten AP-3.0, ML-4.6 und DV-8.8.
Die anteroposterioren (AP) Koordinaten wurden dort positioniert, wo die Struktur der Amygdala aufgelockerter ist.
Die mittleren lateralen (ML) Koordinaten wurden in Bezug auf die mittlere und untere Kerngruppe der Amygdala ausgerichtet und die dorsoventralen (DV) Koordinaten letztendlich im dorsoventralen Grenzbereich der Amygdala.
Das injizierte Volumen von 3 μl wurde innerhalb von 6 Minuten unter Verwendung einer Pumpe für Mikrospritzen vom Typ CMA/100 (Carnegie Medici AD, Soln, Schweden) infundiert. Die Kanüle verblieb nach der Injektion für 2 Minuten in situ und wurde dann vorsichtig entfernt.
Nach der Operation befanden sich die Tiere zunächst auf einer beheizten Platte, bis zu dem Moment, an dem sie den Aufrichtungsreflex wiedererlangten.
Nach 35 Tagen der Behandlung wurden die Tiere mit Pentobarbital-Natrium (100 mg/kg I.P.) anästhesiert und über den transaortalen Verabreichungsweg perfundiert mit 250 ml Natrium/Kaliumphosphat-Puffer 0,1 M, pH 7,4 (PB).
Nachfolgend wurde 4%iges Formaldehyd in 500 ml PB mit einer Geschwindigkeit von 500 ml/Stunde bei Raumtemperatur perfundiert.
Sofort nach Beginn der Perfusion wurde 1 U/g Heparin (Upjohn Kalamzoo. Ml) transaortal injiziert.
Nach der Perfusion wurde das Gehirn isoliert und mit einer Lösung von 20 % Sucrose für 1 h fixiert und dann um die Injektionsstelle herum in 6 mm große Blöcke geschnitten und bei einer Temperatur von 4°C in einer 20%igen Sucroselösung mit 0,1 % Natriumazidlösung und 0,01 % Bacitracin in PB für 24 Stunden aufbewahrt.
Die Gewebeblöcke wurden "on end" in eine Lösung mit 20% Glycerin und 2% Dimethylsulfoxid in 0,1 M Natriumphosphatpuffer transferiert und darin bei einer Temperatur von 4°C bis zum Zeitpunkt der Mikrotomie aufbewahrt.
Die koronalen Schnitte mit einer Dicke von 40 μm wurden in Serien von 5 mit einem Abstand von 0,2 mm voneinander geschnitten und für die Analyse der Tau-2- und GFAP-Proteine histologisch untersucht.
HISTOLOGISCHE ANALYSE
Cresylviolett
Die Schnitte wurden mit Xylol gereinigt und mit Alkohol und H₂O hydratisiert. Die Färbung wurde durchgeführt, indem die Schnitte in Kontakt mit einer Lösung enthaltend 200 ml 0,2 M Essigsäure, 133 ml 0,2 M Natriumacetat und 67 ml 0,1 % Cresylviolett-Acetat gebracht wurden. Dann wurden die Schnitte durch nachfolgende Passagen in Ethanol entwässert und mit Xylol gereinigt. Für die Mikroskopie wurde der so gefärbte Schnitt mit einem geeigneten Deckglas abgedeckt.
Congorot
Die Schnitte wurden gereinigt und mit einer Reihe von Ethanol- und Wasserbehandlungen hydratisiert.
Die Färbung wurde durchgeführt, indem die Schnitte in Kontakt mit einer Lösung enthaltend 1 % Congorot und 50% Ethanol für 1 h in Kontakt gebracht wurden.
Danach wurden die Schnitte in eine mit Lithiumcarbonat gesättigte Lösung getaucht und 15 Minuten unter fließendem Wasser gewaschen. Die Gegenfärbung bestand aus Harris Hämatoxylin für 2 Minuten; anschließend wurde Wasser und eine 1%ige alkoholische Säurelösung zugegeben. Die Schnitte wurden in Wasser gewaschen, in eine wässrige Ammoniumsulfatlösung getaucht und nochmals unter fließendem Wasser gewaschen. Schließlich wurden die Schnitte in Ethanol entwässert und mit Xylol gereinigt. Die so gefärbten Schnitte wurden zur Mikroskopie mit einem geeigneten Deckglas abgedeckt.
Tau-2-Protein
Die 40 μm Schnitte wurden vom Gefrierschutzmittel gereinigt und über Nacht in PBS-Pufferlösung bei 4°C aufbewahrt.
Am Morgen wurden die Schnitte für 30 Minuten in Kontakt mit einer 0,3%igen Lösung von H₂O₂ in Tris-Puffer mit pH 7,6 (PBS) gebracht und später 3mal für 10 Minuten mit einer Lösung von 0,3 % Triton X-100 in PBS gewaschen. Die Schnitte wurden für 24 Stunden mit Tau-2-(Sigma) Antikörpern, 1:500 verdünnt, bei Raumtemperatur inkubiert. Der Verdünner für die Antikörper enthielt 2 % Triton X-100, 0,1 % Natriumazid, 0,01 % Bacitracin, 2 % Serumalbumin und 10 % normales Pferdeserum in PBS. On end wurden die Gewebeschnitte wurden "on end" 3mal für 10 Minuten mit einer Lösung enthaltend 0,3 % Triton X-100 in PBS gewaschenund danach für 1 h mit Antikörpern für Immunoglobulin (Vectastain ABC Elite Kit, Vector Laboratories Burlingame CA), verdünnt 1:200 mit einer Lösung von 0,3 % Triton X-100, in PBS inkubiert. Nach 2maligem Waschen mit einer Lösung von 0,3 % Triton X-100 in PBS für insgesamt 15 Minuten wurden die Gewebeschnitte für 1 h mit Meerrettisch-Avidin-Peroxidase (Vector), verdünnt 1:2000 mit einer Lösung von 0,3 % Triton X-100 in PBS, inkubiert.
Die Schnitte wurden dann für 1 Stunde in PBS gewaschen und dann nochmals für 15 Minuten mit Natriumacetat-Puffer (0,2 M bei pH 6.0). Die Schnitte wurden dann mit 3–3 Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) und Nickelammoniumsulfat (35 mg DAB, 2.5 g Ammoniumnickelsulfat in 100 ml Natriumacetat-Puffer mit 0,3 % H₂O₂) zur Reaktion gebracht.
Die Schnitte wurden anschließend in Natriumcetat-Puffer gegeben und nachfolgend in PBS bei 4°C und darin über Nacht aufbewahrt.
Nach diesem Vorgang wurden die Schnitte getrocknet und mit einem Deckglas für die Mikroskopie abgedeckt.
GFAP-Protein
Die Färbung wurde mit einer Methode durchgeführt, die für die Tau-2-Proteine verwendet wird mit Ausnahme, dass die Antikörper mit Schafserum anstelle von Pferdeserum verdünnt wurden.
Der primäre Antikörper für GFAP (DAKO, Dänemark) wurde in einer Verdünnung von 1:500 verwendet.
Analysiert wurden die mit Cresylviolett gefärbten Schnitte durch Messung der Größe der Aβ-Ablagerungen.
Die Bereiche der Aβ-Ablagerungen wurden in Abständen von 0,2 mm gemessen. Die Aβ-Ablagerungen in den Congorot gefärbten Schnitten auf den Objektträgern wurden auch polarisationsoptisch auf Apfelgrün-Refraktionsvermögen hin analysiert.
Im Zusammenhang mit diesen histochemischen Untersuchungen wurden die Zellen, die mit den Tau-2-Proteinen reagierten, in allen koronalen Schnitten gezählt, während die reaktive Astrocytosis mit einer Bewertung von 0 bis 2 geschätzt wurde.
Die Tiere wurden als positiv bewertet, wenn sie eine positive Färbung mit einer Farbintensität von 1 bis 2 zeigten.
EXPERIMENTELLES VERFAHREN UND RESULTATE
Für jedes der Experimente wurden vier verschiedene Gruppen von Ratten verwendet:

1. VEH1 + VEH2 GRUPPE: Ratten, denen der VEH1 (TFA) Trägerstoff in die Amygdala und der VEH2 (physiologische Lösung) Trägerstoff auf subkutanem Weg injiziert wurde;
2. Aβ + VEH2 GRUPPE: Ratten, denen Aβ 25–35 in die Amygdala und der VEH2 (physiologische Lösung) Trägerstoff auf subkutanem Weg verabreicht wurde;
3. Aβ + TGSS GRUPPE: Ratten, denen Aβ 25–35 in die Amygdala und TGSS auf subkutanem Weg injiziert wurde;
4. VEH1 + TGSS GRUPPE: Ratten, denen der VEH1 (TFA) Trägerstoff in die Amygdala und TGSS auf subkutanem Weg injiziert wurde.

Jeder Experimentblock wurde für mindestens 6 Tiere pro Gruppe angelegt. Diesem Behandlungsschema folgend wurden drei Typen von TGSS mit drei verschiedenen durchschnittlichen Molekulargewichten verwendet, wie folgt:
C3-2400 Dalton, bei 2,5 mg/kg s.c. Dosis
C8-2400 Dalton, bei 2,5 mg/kg s.c. Dosis
C7-2400 Dalton, bei 2,5 mg/kg s.c. Dosis
Jedes TGSS wurde in zwei verschiedenen Experimenten untersucht, um die Ergebnisse zu bestätigen.
Für jeden Behandlungstyp wurde die folgende Anzahl an Tieren analysiert:
Die Tiere, die mit einer Injektion von VEH1 in die Amygdala (Kontrollen ohne Amyloid) und mit einem der TGSS (C3 oder C8 oder C7) behandelt wurden, zeigten immer Resultate, die praktisch identisch mit den Kontrollen der Gruppe 1 waren, die nur mit VEH1 + VEH2 Trägerstoffen behandelt wurden.
a) Reaktivität gegenüber Tau-2-Protein (Anzahl der reaktiven Zellen): Durchschnittswerte ± Standardabweichung
Aus dieser Reihe von Experimenten lässt sich schließen, dass sowohl C3 als auch C7 aktiv an der Senkung der Reaktivität gegenüber dem Tau-2-Protein beteiligt sind, während C8, welches das niedrigste dem Disaccharid entsprechende Molekulargewicht besitzt, keine Aktivität zeigt.
Die Kontrollen, die nicht mit Aβ behandelt wurden, verhalten sich identisch, wenn sie auf subkutanem Weg entweder mit physiologischer Lösung (Gruppe 1) oder mit einem TGSS (Gruppe 4) injiziert werden
Die starke Abnahme der Reaktivität gegenüber dem Tau-2-Protein durch die Wirkung der C3-Verbindung wurde auch durch Tests bestätigt, bei denen Ratten C3 auf oralem Weg verabreicht wurde.
Das experimentelle Modell und die Screeningmethode waren identisch mit den oben beschriebenen mit dem Unterschied, dass C3 oral statt subkutan in einer Dosierung von 20 mg/kg verabreicht wurde.
Die C3-Verabreichung erfolgte einmal pro Tag beginnend mit Tag drei vor der Injektion von Aβ 25–35 bis zum Tag vierzehn nach dieser Injektion. Die Ratten wurden vierzehn Tage nach der Injektion von Aβ 25–35 getötet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben, aus der ersichtlich ist, dass C3 die Reaktivität gegenüber dem Tau-2-Protein in mit Aβ 25–35 behandelten Ratten stark herabsetzt.
b) Reaktivität der Astrocyten (% an Tieren, die eine Reaktivität von +1 oder +2 zeigten): Durchschnittswerte
Was die Reaktivität der Astrocyten anbelangt, ist C3 (Gruppe 3a) das einzige Produkt, welches eine signifikante Aktivität zeigt. Die Produkte C8 und C7 (Gruppen 3b und 3c) haben keine Aktivität.
Die Überprüfung dieser Ergebnisse ergab überraschenderweise, dass C3 TGSS mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2400 D eine viel höhere Aktivität besitzt als TGSS, welche jeweils höhere und niedrigere Molekulargewichte besitzen. Insbesondere ist das durchschnittliche Molekulargewicht von 2400 Dalton optimal für die Senkung der Reaktivität, die für das Tau-2-Protein angegeben ist und die für die Reaktion der Astrocyten angegebene.
In einem anderen Experiment mit Ratten wurde die Fähigkeit des C3-Produktes untersucht folgend auf die intravenöse Verabreichung die Blut-Gehirn-Schranke zu überwinden.
Zu diesem Zweck wurde das mit Tritium (³H) markierte Produkt verwendet.
Die Markierung entsprach 700.000 DPM/mg an ³H-C3.
Nach einer intravenösen Gabe von 2,5 mg/kg wurden die Ratten mit Pentobarbital-Natrium anästhesiert und nach einer festgelegten Zeit von 45 Minuten getötet.
Die Markierungskonzentrationen im Blut, in der Zerebrospinalflüssigkeit (ZSF) und letztendlich im Gehirn (nach einer langsamen Infusion zur Entfernung des Blutes von den Gefäßen) wurden analysiert.
Die ZSF wurde mit einer Glasskapillaren aus dem vierten Ventrikel entnommen (mit einem Volumen, das immer über 200 μl lag, nach dem vollständigen Ausbluten des Tieres).
DPM wurde durch Szintillation bestimmt, indem 20 μl Homogenisat (Gehirn) in 5 ml physiologischer Lösung verdünnt wurde.
Die Ergebnisse, dargestellt in der nachfolgenden Tabelle, zeigen, dass ³H-C3 dazu in der Lage ist, die Blut-Gehirn-Schranke in signifikanter Menge zu passieren.
Bei den Kontrolltieren lagen die Werte für DPM/mI in allen analysierten Geweben immer unter 41.
Im Anschluss an diese Ergebnisse wurde eine Kontrolle auf das Vorkommen von Anti-Xa-Aktivität im Serum, in der ZSF und im Gehirn ausgeführt.
Bekannt ist, dass der Xa-Faktor (X-Faktor Blutgerinnug) nur durch Sulfatoligosaccharid-Fraktionen mit mehr als vier Sacchariden gehemmt wird.
In einer Reihe von Ratten, die wie im vorausgehenden Punkt behandelt wurden, war zu beobachten, dass nach 45 Minuten nach der Behandlung mit C3 bei einer Dosierung von 2,5 mg/kg auf intravenösem Verabreichungsweg die Anti-Xa-Aktivität im Plasma, in der ZSF und im Hirngewebe signifikant ist.
Dies ist eine weitere Bestätigung dafür, dass das Produkt, das die Blut-Gehirn-Schranke passiert, aus C3 und nicht aus inaktiven Abbauprodukten wie beispielsweise Disacchariden oder Tetrasacchariden besteht.
Bei den Ratten, denen Aβ 25–35 injiziert und die entweder mit C3 oder nicht aktiv behandelt wurden, wurde das neuronale Wachstum ebenfalls analysiert.
Zu diesem Zweck wurde die "Rapid Golgi" Färbemethode verwendet, welche aufgrund ihrer Komplexität nur auf eine beschränkte Anzahl von Tieren angewandt wurde.
Wie bereits zuvor angegeben wurde C3 in einer Dosierung von 2,5 mg/kg zweimal täglich subkutan verabreicht, beginnend vom zweiten Tag vor der intrazerebralen Injektion von Aβ 25–35 an und dann für 32 aufeinander folgende Tage.
Die zerebralen Neuronen der V Schicht der Gyrus cinguli des Gehirns wurden analysiert.
Der Test beinhaltete die Messung der Dendritenlänge und das Verhältnis der Anzahl der Endverzweigungen und der Anzahl der primitiven Zweige (Verhältnis T/B). Je höher das Verhältnis T/B, um so größer ist die Komplexität und die Anzahl der neuronalen Verknüpfungen.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.

* p<0,05 Aβ + VEH2 Vs VEH1 + VEH2
** p<0,05 + VEH2 Vs Aβ + C3

Die Tabelle zeigt, dass Aβ dem Neuronenwachstum einen Schaden zufügt und dass C3 diesen erzeugten Schaden behebt. Darüber hinaus kann man feststellen, dass C3 eine Art der neutrophen Aktivität aufweist, welche in Fällen von Nervendegeneration oder Traumata mit neuronalen Schäden hilfreich sein kann.

Claims

Verwendung von durch Depolymerisation von Heparin erhaltenen Glykosaminoglykanen mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2400 D für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen geeignet zur Behandlung seniler Demenz und neurologischer zerebraler Läsionen aufgrund von Iktus und Traumata.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der genannten senilen Demenz um die Krankheiten Alzheimer oder SDAT handelt.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutischen Zusammensetzungen eine wirksame Menge an genannten Glykosaminoglykanen umfassen in einer Mischung mit pharmazeutisch zulässigen Verdünnungsmitteln oder Trägerstoffen.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Glykosaminoglykane einen Polydispersionsindex unter 1,20 haben, keine Peptidanteile enthalten und frei von desulfatierten Einheiten am Redoxende sind.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Depolymerisation von Heparin durchgeführt wird mittels der Behandlung einer wässrigen Lösung von Heparin mit Gammastrahlen gefolgt von einer Gelpermeation.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Behandlung durchgeführt wird durch subkutane, intramuskuläre, intravenöse oder orale Verabreichung der genannten Zusammensetzungen.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Behandlung durchgeführt wird mit einer Menge von 25 bis 400 mg an genannten Glykosaminoglykanen pro Tag über den oralen Verabreichungsweg.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Glykosaminoglykanen ein durchschnittliches Molekulargewicht von 2400D +/– 200 D besitzen.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das durchschnittliche Molekulargewicht der Glykosaminoglykane, definiert in einem der Ansprüche 1 bis 7, im Bereich von 1920 bis 2560 D liegt.