ITMI991066A1 - Glicosaminoglicani aventi peso molecolare medio di 2400 d atti al trattamento della demenza senile - Google Patents
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:
“Glicosaminoglicani aventi peso molecolare medio di 2400 D atti al trattamento della demenza senile"
TECNICA ANTERIORE
La demenza senile, in particolare nella forma di Alzheimer, è caratterizzata principalmente da depositi cerebrali di sostanza amiioide in placche, sia nei vasi cerebrali (amiioide vascolare) che nella sostanza cerebrale (amiioide cerebrale), definite entrambe come β amiioide o Αβ. L'altra caratteristica tipica della demenza senile sul piano fisiopatologico è presenza nei neuroni di gomitoli fibrillari detti NFT (neurofibrillary tangles).
E' noto che i proteoglicani (PGs), ed in particolare l'eparansolfato proteoglicano (HSPG) sono implicati sia nella polimerizzazione della Αβ che nell’aggregazione degli NFT come anche in altri eventi patologici legati alla malattia di Alzheimer e in genere alla demenza senile (Snow AD; Sekiguchi R; Nicholin D et al. An important role of heparan sulfate proteoglycan (Perlacan) in a model System for thè deposition and persistance of fibrillar beta amyloid in rat brain. Neuron 1994; 12:219-234) and (Perry G; Sieslak SL; Richey P, Kawai M et al.
Association of heparan sulfate proteoglycan with neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. J. Neurosci. 1991; 11:3679-3683).
Inoltre il lavoro originale di Snow (Willmer JP; Snow AD; Kisilevski R. The demonstration of sulfate glycosaminoglycans in association with thè amyloidogenic lesions in Alzheimer’s disease. J. Neuropath. Exp. Neurol. 1986; 45:340-346) descrive la presenza di PGs e di glicosaminoglicani (GAGs) nella placche amiloidi cerebrali di pazienti affetti da demenza senile.
Diversi studi hanno dimostrato (Kalaria RN; Kroon SN; Grahovac I; Perry G. Acetylcholinesterase and its association with heparan sulfate proteoglycans in cortical amyloid deposits of Alzheimer’s disease. Neuroscience 1992; 51:177-184) che l'associazione tra PGs e amiloide può essere dovuta sia ad un legame diretto con il precursore della β amiloide (ΑβΡΡ) che ad un legame con Αβ1-41 o con Αβ1-43 che comprendono le sequenze neurotossiche dell’ Αβ.
I PGs hanno dimostrato di aumentare anche la polimerizzazione della proteina Tau-2 (Perry G; Sieslak SL; Richey P, Kawai M et al. Association of heparan sulfate proteoglycan with neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. J. Neurosci. 1991; 11.3679-3683) che è la causa della formazione dei gomitoli neurofibrillari (NFT).
Alcuni GAGs come eparina, eparano e dermatano, hanno dimostrato di potersi legare al'ΑβΡΡ e quindi potrebbero essere efficaci nel prevenire la deposizione delle placche amiloidi cerebrali, impedendo il legame tra PGs e ΑβΡΡ.
Inoltre in uno studio condotto da Lorens et al. ( Lorens SA; Gushawan BS; Van De Kar L; Walegnga JM; Fareed J. Behavioral, endocrine, and nerochemical effects of sulfomucopolysaccharide treatment in thè aged Fischer 344 male rat. Semin Thromb. Haemost. 17 suppl. 1993; 2:164-173) ratti anziani hanno dimostrato un miglioramento del deficit comportamentale in seguito a somministrazione orale di glicosaminoglicani ad alto peso molecolare (GAP ovvero glicosaminoglicani polisolfati o Ateroid®).
Conti et al. (Conti L; Placidi GF; Cassano GB; Ateroid in thè treatment of dementia: results of a clinical trial (eds. Ban E; Lehmann HE) Diagnosis and Treatment of Old Age Dementias Mod. Probi. Pharmacopsychiatry. Basel, Larger 1989 voi 2, pp76-84) hanno dimostrato che in seguito al trattamento con Ateroid i pazienti affetti da demenza senile dimostrano un miglioramento della performance dei parametri psicopatologici e del comportamento sociale in modo significativamente superiore a quello dei pazienti trattati con placebo. Parnetti et al. (Parnetti; Ban TA; Senin U. Glycosaminoglycan polysulfate in primary degenerative dementia. Neuropsychobiology 1995; 31:76-80) hanno dimostrato che Ateroid può migliorare significativamente alcuni parametri biochimici alterati nella demenza senile, quali ad esempio la monoaminossidasi B delle piastrine e i livelli di dopamina e serotonina nel fluido cerebrospinale.
Queste osservazioni suggeriscono che Ateroid può essere benefico nel trattamento della demenza senile e già nel 1988 U. Cornelli e T. Ban hanno ottenuto il brevetto per l’impiego di questo prodotto nel trattamento della demenza senile (EP 293974).
Alcuni ricercatori (Leveugle B; Ding W; Laurence F. et al. Heparin Oligosaccharides that pass thè blood-brain barrier inhibit β -Amyloid percursor protein secretion and heparin binding to β-Amyloid peptide. J. Neurochem 1998; 70:736-744) hanno studiato gli oligosaccaridi della dimensione tra 2 e 8 saccaridi, derivati dell'eparina per depolimerizzazione con acido nitroso e successiva separazione per gel filtrazione dimostrando in un sistema in vitro che il prodotto più attivo nel ridurre la formazione di sostanza amiloide era il disaccaride avente peso molecolare medio di 640 D, e che tale attività si riduceva in modo drastico con l’aumento del peso molecolare.
SOMMARIO
Ora è stato sorprendentemente trovato in una sperimentazione in vivo che la frazione di glicosaminoglicani ottenuta da depolimerizzazione dell'eparina, avente peso molecolare medio di 2400 D mostra una eccezionale efficacia nell’inibire la formazione dell’amiloide β.
Le frazioni aventi peso molecolare medio inferiore (640 D) oppure peso molecolare superiore (4800 D) mostrano un'efficacia decisamente inferiore o trascurabile.
Pertanto la frazione di glicosaminoglicani avente peso molecolare medio di 2400 D può essere impiegata per la preparazione di composizioni farmaceutiche atte al trattamento della demenza senile, in particolare al trattamento del morbo di Alzheimer o SDAT (Senile dementia Alzheimer’s type).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce all’impiego di una frazione di glicosaminoglicani aventi peso molecolare medio di 2400 D per la preparazione di composizioni farmaceutiche atte al trattamento della demenza senile, in particolare al trattamento del morbo di Alzheimer o SDAT (Senile dementia Alzheimer’s type).
Detta frazione di glicosaminoglicani è ottenuta mediante depolimerizzazione dell’eparina operando preferibilmente secondo un metodo che comprende i seguenti stadi:
a) una soluzione acquosa di eparina viene trattata con radiazione gamma da Co 60 secondo il brevetto U.S.P. 4.987.222;
b) la soluzione ottenuta dallo stadio a) viene frazionata mediante gel permeazione su resina Sephadex G/50 Medium;
c) la miscela delle frazioni aventi peso molecolare da 1.000 a 3.000 D viene ultrafiltrata a taglio 600 D, lavata e liofilizzata;
d) il prodotto liofilizzato viene disciolto e frazionato mediante gel permeazione su resina Sephadex G/25 Medium;
e) si raccolgono e si miscelano le frazioni aventi peso molecolare compreso fra 1920 e 2560 D, a cui corrisponde un peso molecolare medio di 2400 D.
Per la preparazione della frazione di glicosaminoglicani avente peso molecolare medio di 2400 D, con il metodo preferito della presente invenzione, una soluzione acquosa dì eparina al 10% viene dapprima trattata con radiazione gamma da Co 60 con una intensità compresa fra 120 KGy e 150 KGy, a dosaggi successivi di 25 KGy in rapporto al peso molecolare dell'eparina.
La soluzione irradiata viene ultrafiltrata a taglio 300 D, purificata, filtrata sterilmente e liofilizzata ottenendo l’eparina “depolimerizzata madre". Questa eparina “depolimerizzata madre" viene sciolta in soluzione 0,3 M di NaCI e poi sottoposta a frazionamento mediante gel permeazione su resina Sephadex G/50 Medium.
Le frazioni aventi peso molecolare < 3.000 D (circa il 10% del totale) costituiscono la materia prima della presente invenzione.
Il primo trattamento di questa miscela consiste nella ultra-filtrazione a taglio 600 D per la eliminazione dei frammenti molecolari conseguenti al processo di depolimerizzazione.
La miscela ultrafiltrata viene lavata con NaCI 0,3 M fino a scomparsa della reazione al carbazolo nel permeato.
La miscela finale, portata a concentrazione di circa l'8% in acqua distillata, viene filtrata sterilmente su membrane 0.2 μ e liofilizzata.
Il prodotto liofilizzato viene disciolto in soluzione di NaCI 0.3 M a concentrazione compresa tra il 10% ed il 15% (p/v).
Per ottenere la frazione di peso molecolare medio di 2.400 D viene applicato un secondo trattamento di gel permeazione mantenendo circa gli stessi parametri della prima gel permeazione, utilizzando però le specifiche caratteristiche del Sephadex G/25 Medium.
La colonna pilota impiegata può essere del tipo BP 252/15 con le seguenti caratteristiche:
• Altezza . : 105 cm
• Volume della resina : 5.200 ml
• Flusso . : 1.000 ml/h
I parametri adottati sono rappresentati da:
• Ve . = 17.000 ml
• Ve/Vo . = 1/R = 1,26
• R . = 0,79
• K . = 0,09 = (Ve - Vo) : (Vt - Vo)
dove:
• Ve = volume di eluzione
• Vt = volume totale della resina
• Vo = volume morto (soluzione iniziale in uscita)
• R = risoluzione (ampiezza del picco)
Dalla seconda gel permeazione si ottengono da 10 a 12 frazioni comprendenti una serie di pesi molecolari variabili da 3.000 D a circa 1.500 D. Per la preparazione della frazione di glicosaminoglicani secondo la presente invenzione vengono raccolte e miscelate soltanto le frazioni con pesi molecolari compresi tra 1920 D e 2560 D.
La risultante soluzione viene uitrafiltrata mediante cut off 300 fino ad eliminazione del sodio cloruro.
La soluzione viene sottoposta a concentrazione fino a circa il 10%, filtrata a 0.2 μ e liofilizzata.
Questa frazione costituisce circa l'80% del totale delle frazioni aventi peso molecolare < 3.000D.
Mediante il metodo secondo la presente invenzione si ottiene la desiderata frazione di glicosaminoglicani con notevole indice di riproducibilità sia per quanto riguarda la resa del processo sia per quanto riguarda la costanza della composizione molecolare.
Di seguito viene riportata la caratterizzazione della frazione di glicosaminoglicani della presente invenzione.
CARATTERISTICHE CHIMICO-FISICHE
Aspetto . : polvere color giallo chiaro
Peso molecolare medio . : 2.400 D (±200)
Distribuzione pesi molecolari . : 95% < 2560 D - > 1920 D
Indice di Polidispersione . : < 1,05
Zolfo Organico . : 9,5-1 1 ,5%
Rapporto S03/COOH . : 2, 3-2, 6
Rotazione specifica . : > 35°
HPLC . : Figura n° 1
NMR . : Figura n° 2
Il peso molecolare medio è stato determinato mediante HPLC utilizzando colonne per cromatografia ad esclusione, in confronto con LMW Heparins for Calibration Reference Substance Batch n.1a (PH.EUR.) a peso molecolare = 3700.
RAPPORTI PERCENTUALI DI SOLFATAZIONE
Sono stati esaminati tre campioni con i risultati della tabella 1.
Acidi uranici desolfatati: area dei segnali 102,2 e 106 ppm rispetto agli acidi uranici totali a 100,5 e 106 ppm;
Glucosamina.NS03-6-solfatata: area dei segnali a 62,5 ppm rispetto all’area della Glucosamina-6-solfatata a 68 ppm;
Glucosamina.N acetilata: area dei segnali a 55,5 ppm rispetto all’area dei segnali tra 61 e 54 ppm;
Glucosamina.N, 3 solfatata; area del segnale a 59 ppm rispetto all’area dei segnali tra 61 e 54 ppm.
I valori della solfatazione in C.6 della glucosamina risultano più bassi di quelli delle frazioni a peso molecolare 4.500 D (media 84).
Questo è dovuto al fatto che, con abbassarsi del peso molecolare, aumentano i gruppi alcoolici secondari presenti nelle unità terminali ridotte i cui segnali cadono nella zona dei C6 delle Glucosamine 6 desolfatate.
CARATTERISTICHE STRUTTURALI
La fig. 1 riporta il grafico ottenuto mediante HPLC della frazione di glicosaminoglicani con la distribuzione dei pesi molecolari compresi per il 95% tra 2560 D e 1920 D, pari a circa 4 - 5 Disaccaridi costitutivi.
La fig. 2 riporta il tracciato NMR della stessa frazione nel quale si nota l’assenza di segnali tra 84 e 85 ppm caratteristici del sito di legame che viene eliminato dalla depolimerizzazione mediante radiazione gamma. Il distacco della catena galattosidica e dei suoi componenti azotati rappresenta una specifica caratteristica di questa frazione saccaridica che consente di operare senza le interferenze, sovente di carattere patologico, derivanti dalla presenza di strutture peptidiche a differente composizione aminoacidica.
L’indagine NMR rivela inoltre che nelle zone terminali ci sono solo anelli intatti od eventualmente costituiti da “remnant” alitatici.
Gli anelli dell’estremità riducente non sono mai desolfatati.
Non si evidenziano strutture glucuroniche desolfatate alle estremità riducenti in quanto vengono distrutte dalla radiazione gamma.
Negli anelli delle estremità non riducenti i C4 terminali sono difficili da distinguere dai C4 non terminali perché cadono tutti nella stessa zona; gli unici che si identificano in modo univoco sono quelli della glucosamina NS,3S esattamente adiacenti all'acido glucuronico del pentamero attivo.
I nuclei strutturali corrispondono all’eparina iniziale con indici di solfatazione praticamente inalterati.
I segnali anomerici derivanti dai gruppi riducenti GlcNS036S03 e ldoA2S03 qualificano la frazione di glicosaminoglicani secondo l'invenzione come sostanza con unità terminali simili a quelli dei frammenti da eparina naturale.
Particolarmente adatta per l’impiego secondo la presente invenzione e la frazione di glicosaminoglicani avente peso molecolare medio di 2400 D con indice di polidispersione minore di 1,05, con totale assenza di componenti peptidiche e priva di unità desolfatate all'estremità riducente, ottenuta senza trattamento di risolfatazione ed in assenza di catalizzatori.
CARATTERISTICHE BIOLOGICHE
Attività eparinica Ph.E. assente
Attività eparinica USP assente
Attività anti Xa < 50 U aXa/mg
Attività anti Ila < 10 U alla/mg
Dalla caratterizzazione soprariportata risulta che la frazione di glicosaminoglicani secondo la presente invenzione dimostra l’assenza di una attività eparinica verso i parametri della coagulazione nonostante il mantenimento delle caratteristiche strutturali della molecola eparinica, ovviamente con peso molecolare molto più basso deN’eparina.
ESEMPIO
100 g di Eparina sodica da mucosa intestinale suina, avente un peso molecolare di 14.000 D ed una attività di 190 U/mg, vengono disciolti in 1 I di acqua distillata e disaerata. La soluzione viene travasata in contenitori di pyrex che vengono chiusi con tappo di vetro dopo gorgogliamento di Argon.
La soluzione viene sottoposta ad un trattamento complessivo di 130 kGy a dosaggi successivi di circa 25 kGy di radiazione gamma da Co60, ottenendo la depolimerizzazione dell’Eparina.
La soluzione irradiata viene ultrafiltrata a taglio 300 D, purificata con successivi passaggi in NaCI al 3% e liofilizzata, dopo concentrazione a circa il 10%.
Questa Eparina “depolimerizzata madre” viene disciolta al 10% in soluzione 0,3M di NaCI e frazionata mediante colonna di Gel Permeazione contenente Sephadex G 50 medium.
Dopo aver separato le componenti a peso molecolare >8.000 D e le quote riferibili alla Eparina di circa 4.500 D, si ricuperano le frazioni a peso molecolare <3.000 D.
Queste frazioni vengono purificate mediante ultrafiltrazione a taglio 600 D per la eliminazione dei frammenti molecolari conseguenti al processo di depolimerizzazione.
Dopo una serie di tre lavaggi in NaCI 0,3M per ottenere la scomparsa della reazione al carbazolo nel permeato, la miscela viene concentrata a circa l’8% e si liofilizza la soluzione passata per filtrazione 0.2 micrometri.
Il prodotto liofilizzato viene sciolto in una soluzione di NaCI 0,3M in quantità tale da ottenere una concentrazione finale del 10% (p/v). Questa soluzione viene frazionata mediante Gel Permeazione su colonna contenente Sephadex G/25 medium.
Si raccolgono le frazioni a peso molecolare compreso tra 1920 D e 2560 D.
La soluzione ottenuta viene purificata mediante ultrafiltrazione a cut off 300 fino ad eliminazione del sodio cloruro.
La soluzione viene concentrata a circa il 10% e liofilizzata.
Resa: circa 9 g di polvere di colore giallo chiaro.
Analisi: peso molecolare medio = 2400 (±200); Zolfo organico = 9,9%. Rapporto Solfati /carbossili = 2,5; Attività antiXa = 45 U antiXa/mg.
Esame HPLC, figura 1.
Esame NMR, figura 2.
A scopo di confronto, con lo stesso metodo vengono preparate anche le seguenti frazioni di glicosaminoglicani:
- frazione avente peso molecolare medio di 640 D ( da 320 a 1600 D); - frazione avente peso molecolare medio di 4800 D ( da 3350 a 6060 D).
Grazie alle caratteristiche farmaceutiche che risultano dalla sperimentazione di seguito riportata, i glicosaminoglicani aventi peso molecolare medio di 2400 D possono essere impiegati per la preparazione di composizioni farmaceutiche atte al trattamento della demenza senile ed in particolare del morbo di Alzheimer o SDAT (Senile dementia Alzheimer’s type).
Dette composizioni comprendono una quantità farmaceuticamente efficace di detti glicosaminoglicani in miscela con diluenti o eccipienti farmaceuticamente accettabili, e possono essere preparate in forma atta alla somministrazione sottocutanea, intramuscolare, endovenosa e orale.
Dette composizioni contengono una quantità di detti glicosaminoglicani compresa fra 50 e 200 mg per dose unitaria.
La presente invenzione comprende anche un metodo terapeutico per il trattamento di pazienti affetti da demenza senile, ed in particolare dal morbo di Alzheimer o SDAT, che consiste nella somministrazione di una quantità di glicosaminoglicani aventi peso molecolare medio di 2400 D compresa fra 50 e 400 mg per giorno. In particolare, per la somministrazione sottocutanea, intramuscolare ed endovenosa è prevista una quantità da 50 a 200 mg per giorno e per la somministrazione orale è prevista una quantità da 200 a 400 mg per giorno.
SPERIMENTAZIONE FARMACOLOGICA
Per lo studio dell’attività farmacologica della frazione di glicosaminoglicani secondo la presente invenzione è stato applicato un modello sperimentale nel ratto che riproduce alcune delle lesioni tipiche della demenza senile (Sigurdsson EM; Lorens SA; Hejna MJ; Dong WX; Lee JM. Locai and distai histopathological effects of un iterai amyloid-β 25-35 injections into thè amydgala of young F344 rats. Neuro Biol. Aging 1996; 17:893-901).
In particolare sono stati studiati i seguenti parametri:
- Proteina Tau-2, correlata all’entità della reazione alla sostanza β amiloide (reattività indiretta);
- Proteina GFAP (proteina gliale fibrillare acida), correlata alla reattività degli astrociti alla β amiloide (reattività diretta).
MATERIALI IMPIEGATI NELLA SPERIMENTAZIONE
- β amiloide:
Αβ 25-35 sale sodico in una soluzione di acido trifluoroacetico (TFA) (VEH1) con un contenuto di peptide di 82-89% (BACHEM, Torrance, CA).
La β amiloide con il rispettivo veicolo (VEH 1) veniva diluita con Nanopure H20 in quantità tale da ottenere una concentrazione di 5 nmol/3,0 mi, immediatamente prima dell’uso e mantenuta a 4°C.
- Glicosaminoglicani, TGSS:
sono stati impiegati tre tipi di TGSS (tailored glycosaminoglycans) preparati come sopra descrìtto e aventi diverso peso molecolare come
Questi prodotti erano costituiti da polvere di colore giallo chiaro solubile in acqua, che veniva conservata in un essiccatore a temperatura ambiente.
Per la iniezione nei ratti venivano preparate soluzioni alla concentrazione di 1 mg/ml in soluzione fisiologica (VEH2).
Le soluzioni venivano mantenute alla temperatura di 4°C per un periodo non superiore a due settimane.
• VEH 1:
Acido trifluoroacetico (TFA)(tO nmoli in 3 μ litri di H20 distillata), veicolo della β amiloide.
• VEH 2:
Soluzione fisiologica, veicolo dei TGSS.
METODI DELLA SPERIMENTAZIONE
Il modello impiegato per la sperimentazione si basa sugli effetti di una iniezione di Αβ 25-35 nella regione centro cerebrale dell’amigdala.
La sequenza aminoacidica di Αβ 25-35 è la sequenza ritenuta neurotossica (Yankner BA; Duffy LK; Kirscner DA; Neurotrophic and neurotoxic effects of amyloid-β protein. Reversai by tachykinin neuropeptides. Science 1990:250-282) in quanto produce le lesioni tipiche di Αβ 1-41 o Αβ 1-43.
Per gli esperimenti sono stati usati ratti maschi giovani (3-4 mesi), di ceppo Fischer 344, che ricevevano un'iniezione intracerebrale nel'amigdala di destra con 5 nmol/3,0 μΙ di Αβ 25-35 o il rispettivo veicolo (VEH 1).
I TGSS o il rispettivo veicolo VEH2 venivano somministrati 2 volte al giorno per via sottocutanea da due giorni prima dell’iniezione intracerebrale di Αβ e per 32 giorni dopo detta iniezione, con le dosi specificate più avanti.
Per l’analisi istologica gli animali venivano anestetizzati con pentobarbital sodio e perfusi per via arteriosa (transaortica) con una soluzione di formaldeide al 4%.
Venivano effettuate 5 sezioni coronali (da 40 μm ) distanziate con intervalli di 0,2 mm.
Le sezioni venivano messe a contatto con anticorpi per la proteina Tau-2 e per la proteina gliale fibrillare acida(GFAP).
I ratti Fischer 344 erano ottenuti dalla Harlan Sprague-Dawley Ine. (Indianapolis In).
Al momento deH’arrivo pesavano 250-300 g e avevano da tre a quattro mesi di età.
Gli animali venivano tenuti in gabbie individuali con un ciclo luce-buio di 12 ore (luce alle 7.00 am) in condizioni di stabulazione approvate secondo la AAALAC (American Association Animai Laboratory and Care).
Essi avevano accesso al cibo e all’acqua ad libitum e sono stati mantenuti in queste condizioni ambientali per 2-3 settimane prima dell’esperimento.
L’iniezione intracerebrale di Αβ 25-35 veniva fatta sotto anestesia da pentobarbital sodio (50 mg/Kg, i.p.; Butler, Columbus, OH).
All’atto in cui gli animali erano anestetizzati, veniva anche somministrata per via intramuscolare atropina solfato (0,4 mg/Kg; Sigma, St. Louis, MO) e ampicillina sale sodico (50 mg/Kg; Sigma, St. Louis, MO). L’iniezione intracerebrale nella amigdala di destra era effettuata con l’impiego di uno strumento stereotassico (Kopf) tarato in modo che la profondità non superasse i 3,3 mm sotto la linea interaurale.
Le coordinate per l'iniezione sono state determinate sulla base dell’atlante Paxinos and Watson misurate dal bregma cranico con coordinate AP-3.0, ML-4,6 e DV-8,8.
Le coordinate antera-posteriori (AP) sono state posizionate dove la struttura dell'amigdala è più larga.
Le coordinate medio laterali (ML) sono state centrate in relazione al nucleo mediale e basoiaterale della amigdala ed infine le coordinate dorso ventrali (DV) sono state centrate in corrispondenza dei limiti dorsoventrali della amigdala.
Il volume iniettato di 3 μΙ è stato infuso in 6 minuti, usando una pompa per microsiringhe di tipo CMA/100 (Carnegie Medici AD, Soln, Sweden). La cannula è rimasta in sito per 2 minuti dopo l’iniezione e poi è stata cautamente rimossa.
Dopo l'intervento gli animali restavano su una piastra riscaldata fino al momento in cui riacquistavano il riflesso di raddrizzamento.
Dopo 35 giorni di trattamento gli animali venivano anestetizzati con pentobarbital sodio (100 mg/Kg I.P.) e perfusi per via transaortica con 250 mi di un tampone sodio/potassio fosfato 0.1 M a pH 7.4 (PB).
Successivamente veniva perfusa formaldeide al 4% in 500 mi di PB, alla velocità di 500 ml/ora a temperatura ambiente.
Immediatamente dopo l'inizio delia perfusione si iniettava per via transortica 1U/g di eparina (Upjohn Kalamzoo. MI).
Dopo la perfusione il cervello veniva isolato e fissato con una soluzione al 20% di saccarosio per 1 h ed in seguito veniva sezionato in blocchi da 6 mm intorno al sito di iniezione e tenuto a temperatura di 4°C in una soluzione al 20% di saccarosio e 0,1% di sodio azide e allo 0,01% di bacitracina in PB per 24 ore.
I blocchi di tessuto venivano di seguito trasferiti in una soluzione al 20% di glicerolo e al 2% di dimetilsolfossido in tampone sodio fosfato 0,1 M e ivi mantenuti, a temperatura di 4°C sino al momento della sezione .
Le sezioni coronali di 40 μm venivano tagliate in serie di 5 a distanza di 0,2 mm l’una dall’altra e analizzate istologicamente per l’analisi delle proteine Tau-2 e GFAP.
ANALISI ISTOLOGICA
Cresyl violetto
Le sezioni venivano ripulite con xilene e idratate con alcool e H20. La colorazione veniva attuata mettendo la sezione a contatto con una soluzione contenente 200 mi di acido acetico 0,2M, 133 mi di sodio acetato 0,2M e 67 ml di cresyl violetto acetato allo 0,1%. Le sezioni venivano in seguito disidratate con successivi passaggi in alcool etilico e pulite con xilene. La sezione così colorata veniva coperta con apposito vetrino per la lettura al microscopio.
Rosso Congo
Le sezioni venivano ripulite e idratate con una serie di trattamenti con alcool etilico e acqua.
La colorazione veniva fatta mettendo a contatto la sezione con una soluzione contenente 1% di rosso Congo e 50% di etanolo per un periodo di 1h.
Le sezioni venivano in seguito immerse in una soluzione satura di carbonato di litio e lavate sotto acqua corrente per 15 minuti. La contro colorazione veniva fatta in ematossilina di Harris per 2 minuti ed in seguito si aggiungeva acqua e una soluzione acida alcolica all’1%. Le sezioni venivano lavate in acqua, immerse in una soluzione acquosa di ammonio solfato e ancora lavate con acqua corrente. Le sezioni erano infine disidratate in alcool etilico e ripulite con xilene. Le sezioni così colorate venivano coperte con apposito vetrino per la lettura al microscopio.
Proteina Tau -2
Le sezioni da 40 μm venivano ripulite dal crioprotettore e mantenute per una notte in soluzione tampone PBS a 4°C.
Al mattino le sezioni venivano messe a contatto per 30 minuti con una soluzione allo 0,3% di H202 in soluzione tampone tris a pH 7,6 (PBS) ed in seguito lavate 3 volte per 10 minuti con soluzione allo 0,3% di triton X-100 in PBS. Le sezioni venivano poi incubate per 24 ore con anticorpo Tau-2 (Sigma) diluito 1:500 a temperatura ambiente.
Il diluente per anticorpo conteneva 2% di triton X-100, 0,1% di sodio azide, 0,01% di bacitracina, 2% di albumina serica e il 10% del siero normale di cavallo in PBS.
Di seguito il tessuto veniva lavato 3 volte, per 10 minuti, con una soluzione contenente 0,3% di triton X-100 in PBS e successivamente incubato per 1h con un anticorpo per l'immunoglobulina (Vectastain ABC Elite Kit, Vector Laboratories Burlingame CA) diluito 1:200 in una soluzione allo 0,3% di triton X-100 in PBS. Dopo 2 lavaggi con una soluzione allo 0,3% di triton X-100 in PBS, per un totale di 15 minuti, il tessuto era incubato per 1 h con perossidasi horseradish avidin (Vector) diluita 1 :2000 con una soluzione allo 0,3% triton X-100 in PBS.
Le sezioni venivano poi lavate in PBS per 1 ora e poi ancora per 15 minuti con un tampone sodio acetato (0,2M a pH 6,0). Le sezioni venivano fatte poi reagire con 3-3 diaminobenzidina tetra idrocloruro (DAB) e con nickel ammonio solfato (35 mg di DAB, 2,5 g di ammonio nickel solfato per 100 mi di tampone sodio acetato con lo 0,3% di H202). Le sezioni venivano poi messe in tampone sodio acetato e in seguito in PBS a 4°C e ivi mantenute per una notte.
Dopo questa operazione le sezioni venivano asciugate e coperte con vetrino per la lettura al microscopio.
Proteina GFAP
La colorazione veniva fatta con il metodo impiegato per la Tau-2 con l'eccezione che l’anticorpo veniva diluito in siero di pecora anziché in siero di cavallo.
L’anticorpo primario GFAP (DAKO, Danimarca) era usato in diluizione 1:500.
Le sezioni colorate con cresyl violetto erano analizzate misurando la dimensione dei depositi di Αβ.
L’area dei depositi di Αβ era misurata a intervalli di 0,2mm. I depositi di Αβ erano anche analizzati per la rifrangenza verde mela, usando la luce polarizzata dei vetrini colorati con rosso Congo.
Nel contesto di queste evidenziazioni istochimiche le cellule reattive alla Tau-2 venivano contate in tutte le sezioni coronali mentre l'astrocitosi reattiva veniva valutata, con uno score da 0 a 2.
Gli animali erano considerati positivi se esibivano colorazioni positive da 1 a 2.
PROCEDURA SPERIMENTALE E RISULTATI
Per ogni esperimento sono stati impiegati quattro diversi gruppi di ratti: 1. GRUPPO VEH 1 VEH2: ratti iniettati con il veicolo VEH1(TFA) nel’amigdala e iniettati con il veicolo VEH2 (soluzione fisiologica) per via sottocutanea;
2. GRUPPO Αβ VEH2: ratti iniettati con Αβ 25-35 nella amigdala e con il veicolo VEH2 (soluzione fisiologica) per via sottocutanea;
3. GRUPPO Αβ TGSS: ratti iniettati con Αβ 25-35 nella amigdala e con TGSS per via sottocutanea; .
4. GRUPPO VEH1 TGSS: ratti iniettati con il veicolo VEH1 (TFA) nell’amigdala e con un TGSS pervia sottocutanea.
Ogni blocco di esperimenti prevedeva almeno 6 animali per gruppo.
Seguendo questo schema di trattamento sono stati impiegati tre tipi di TGSS con tre diversi pesi molecolari come segue:
C3 - 2400 Dalton, alla dose 2,5 mg/Kg s.c.
C8 - 640 Dalton, alla dose di 2,5 mg/Kg s.c.
C7 - 4800 Dalton, alla dose di 2,5 mg/Kg s.c.
Ogni TGSS è stato studiato con due diversi esperimenti per avere la conferma dei risultati.
Per ciascun tipo di trattamento si è analizzato il seguente numero di animali:
Gli animali trattati con VEH1 intra amigdala (controlli senza amiloide) e con uno qualsiasi dei TGSS (C3 o C8 o C7) hanno sempre dimostrato risultati praticamente identici ai controlli del gruppo 1, trattati con i soli veicoli VEH1 VEH2.
a) Reattività alla proteina Tau-2 (numero di cellule reattive): valori medi ± deviazione standard.
Da questa serie di esperimenti risulta che C3 e C7 sono entrambi attivi nel ridurre la reattività alla proteina Tau-2 mentre C8 che ha il peso molecolare più basso, corrispondente al disaccaride, non svolge attività alcuna.
I controlli non trattati con Αβ si comportano in modo identico quando sono iniettati per via sottocutanea sia con soluzione fisiologica (gruppo 1) sia con un TGSS (gruppo 4).
b) Reattività degli astrociti (%di animali che rappresentavano reattività 1 o 2): Valori medi.
Per quanto concerne la reattività degli astrociti il solo prodotto che dimostra un'attività significativa è C3 (gruppo 3a). I prodotti C8 e C7 (gruppi 3b e 3c) non sono dotati di attività alcuna.
Dall’esame di questi risultati emerge sorprendentemente che il TGSS C3, avente peso molecolare medio di 2400 D, ha una attività molto più elevata dei TGSS che hanno rispettivamente un peso molecolare più basso e più alto.
In particolare il peso molecolare medio di 2400 Dalton è ottimale per la riduzione della reattività evidenziata con la proteina Tau-2 che per quella evidenziata con la reazione degli astrociti.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Impiego di glicosaminoglicani aventi peso molecolare medio di 2400 D per la preparazione di composizioni farmaceutiche atte al trattamento della demenza senile, in miscela con diluenti o eccipienti farmaceuticamente accettabili.
- 2. Composizioni farmaceutiche atte al trattamento della demenza senile comprendenti una quantità efficace di un glicosaminoglicano avente peso molecolare medio di 2400 D in miscela con diluenti o eccipienti farmaceuticamente accettabili.
- 3. Composizioni secondo la rivendicazione 2, caratterizzate da! fatto che detto glicosaminoglicano ha peso molecolare medio di 2400 D con Ìndice di polidispersione minore di 1,05, totale assenza di componenti peptidiche ed è privo di unità disolfatate all'estremità riducente.
- 4. Composizioni secondo la rivendicazione 2, caratterizzate dal fatto che detta demenza senile consiste nelle malattie di tipo Alzheimer o SDAT.
- 5. Composizioni secondo la rivendicazione 2, caratterizzate dal fatto che detto glicosaminogiicano è ottenuto da depolimerizzazione dell'eparina mediante trattamento con radiazione gamma seguito da gel permeazione.
- 6. Composizioni secondo la rivendicazione 2, preparate in forma atta alla somministrazione sottocutanea, intramuscolare, endovenosa ed orale.
- 7. Composizioni secondo la rivendicazione 2 comprendenti una quantità di detto glicosaminoglicano di 50-200 mg per dose unitaria.
- 8. Metodo terapeutico per il trattamento di pazienti affetti da demenza senile, che consiste nella somministrazione di una quantità da 50 a 400 mg per giorno di un glicosaminoglicano avente peso molecolare medio di 2400 D.
- 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, consistente nella somministrazione di una quantità da 50 a 200 mg per giorno di detto glicosaminoglicano per via sottocutanea o intramuscolare o endovenosa.
- 10. Metodo secondo la rivendicazione 8, consistente nella somministrazione di una quantità da 200 a 400 mg per giorno di detto glicosaminoglicano per via orale.
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