CZ20014092A3

CZ20014092A3 - Glykosaminoglykany s průměrnou molekulovou hmotností 2400 vhodné pro léčení senilní demence

Info

Publication number: CZ20014092A3
Application number: CZ20014092A
Authority: CZ
Inventors: Umberto Cornelli; Ambrosi Luigi De; Israel Hanin; Jawed Fareed; John Lee; Stanley Lorens; Ronald F. Mervis
Original assignee: Umberto Cornelli
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2002-04-17
Also published as: IT1312107B1; JP2002544233A; NO20015544D0; AU4405200A; ES2237425T3; RU2248800C2; ITMI991066A1; HK1039903B; PT1181024E; ATE288761T1; EP1181024A1; DE60018061D1; HUP0201100A2; HK1039903A1; NO20015544L; KR100711142B1; KR20020005033A; PL352070A1; AU764743C; HUP0201100A3

Description

GLYKOSAMINOGLYKANY S PRŮMĚRNOU MOLEKULOVOU HMOTNOSTÍ 2400 |Daj VHODNÉ PRO LÉČENÍ SENILNÍ DEMENCE

Oblast techniky

Tento vynález pojednává o glykosaminoglykanech s nízkou molekulovou hmotností, vhodných pro léčbu senilní demence a mozkových neurologických poranění způsobených iktem a traumaty.

/

Dosavadní stav techniky

Senilní demence, zejména ve formě Alzheimerovy choroby, je principiálně charakterizována depozity amyloidních látek v plácích v mozku, ať v mozkových cévách (vaskulámí amyloid) nebo v mozkové tkáni (mozkový amyloid), oba definované jako βamyloidy nebo Αβ. Jiné typické charakteristiky senilní demence ve fyziopatologické úrovni jsou přítomnost neuronů fibrilárních tanil, nazývaných neurofibrilární tanily (NFT).

Je známo, že proteoglykany (PGs) a zejména heparansulfátové proteoglykany (HSPG) se účastní jak při polymerizaci Αβ nebo při agregaci NFT, tak při jiných patologických příhodách vztahujících se k Alzheimerově chorobě a obecně k senilní demenci (Snow AD, Sekiguchi R, Nicholin D et al. „ An Important Role of Heparan Sulphate Proteoglycan (Perlakan) in a Model System for the Deposition and Persistance of Fibrillar Beta Amyloid in Rat Brain“ Neuron 1994, 12: 219-234) a Perry G, Sieslak SL, Richey P, Kawai M et al. „ Association of Heparan Sulfáte Proteoglycan with Neurofibrillary Tangles of Alzheimer's Disease“ J. Neurosci, 1991, 11:3679-3683).

Dále původní Snowova studie (Willmer JP, Snow AD, Kisilevski R „ The Demonstration of Sulfáte Glycosaminoglycans in Association with the Amyloidogenic Lesions in Alzheimer's Disease“, J.Neuropath. Exp. Neurol.1986, 45: 340-346) popisuje přítomnost PGs a glykosaminoglykanů (GAGs) v mozkových amyloidových plácích pacientů, trpících senilní demenci.

Několik studií ukázalo (Kalaria RN, Kroon SN, Grahovak I, Perry G.

„Acetylcholinesterase and its Association with Heparan Sulfáte Proteoglycans in Cortical

Amyloid Deposits of Alzheimefs Disease “ Neuroscience 1992, 51:177-184), že spojení mezi PGs a amyloidy může být způsobeno jak přímým spojením s prekurzorem βamyloidu (ΑβΡΡ), tak spojením s Αβ1-41 nebo s Αβ1-43, obsahujících neurotoxické sekvence Αβ.

Proteoglykany dokázaly také zvýšit polymerizaci Tau-2 proteinu (Perry G, Sieslak SL, Richey P, Kawai M et al. „Association of Heparan Sulfáte Proteoglycan with Neurofibrillary Tangles of Alzheimefs Disease”.

Navíc ve studiích provedených Lorensem et al. (Lorens SA, Gushawan BS, Van De Kar L, Walegnga JM, Fareed J. „Behavioural, Endocrine, and Neurochemical Effects of Sulfomucopolysaccharide Treatment in the Aged Fischer 344 Male Rat“ Semin Thromb.Heamost. dodatek 17, 1993, 2:164-173) bylo u starých krys prokázáno zlepšení poruch v chování po orálním podávání glykosaminoglykanů s vysokou molekulovou hmotností (GAP nebo polysulfatované glykosaminoglykany nebo Ateroid®).

Conti et al. (Conti L,Placidi GF, Cassanovo GB. „Ateroid® in The Treatment of Dementia: Results of a Clinical Trial“, Eds. Ban E, Lehman HE „ Diagnosis and Treatment of Old Age Dementias“ Mod.Probl.Pharmacopsychiatry. Basel, Larger 1989 sv.2, 76-84) ukázal, že po léčbě Ateroidem® se u pacientů trpících senilní demencí projevilo zlepšení psychopatologických parametrů výkonu a sociálního chování v podstatně vyšší míře než u pacientů, kterým bylo podáváno placebo.

Parnetti et al. (Parnetti, Ban TA, Senin U. „Glykosoaminoglycan Polysulfate in Primary Degenerative Dementia“ Neuropsychobiology 1995, 31: 76-80) ukázal, že Ateroid® může podstatně zlepšit některé biochemické parametry změněné při senilní demenci, jako např. hladinu monoaminoxidasy B v krevních plácích a hladinu dopaminu a serotoninu v mozkomíšní tekutině.

Tato pozorování naznačují, že Ateroid® může být velice užitečný při léčbě senilní demence a již v oce 1988 obdrželi U.Cornelli a T.Bann patent č. EP 293974 na použití tohoto výrobku při léčbě senilní demence.

Podstata vynálezu

Nyní jsme překvapivě zjistili z in vivo experimentů, že frakce glykosaminoglykanů získaných z depolymerizace heparinu, které mají průměrnou molekulovou hmotnost

2400 Da, vykazují vynikající účinnost při inhibici tvorby β-amyloidu a v povzbuzení růstu neuronů.

·· ·· • · · ·

-3Frakce s nižší průměrnou molekulovou hmotností (640 Da) nebo vyšší molekulovou hmotností (4800 Da) vykazují podstatně nižší nebo zanedbatelnou účinnost.

Proto lze frakci glykosaminoglykanů s průměrnou molekulovou hmotností 2400 Da použít pro přípravu farmaceutických přípravků vhodných pro léčbu senilní demence, zejména pro léčbu Alzheimerovy choroby nebo senilní demence Alzheimerova typu (SDAT), a při léčení mozkových neurologických poranění způsobených iktem a traumaty.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 představuje test glykosaminoglykanů s průměrnou molekulovou hmotností 2400 Da (± 200 Da) získaných popsaným příkladem pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografíe (HPLC).

Obr. 2 představuje test glykosaminoglykanů s průměrnou molekulární hmotností 2400 Da (± 200 Da) získaných popsaným příkladem pomocí nukleární magnetické rezonance.

Příklady provedení vynálezu

Tento vynález pojednává o použití frakce glykosaminoglykanů s průměrnou molekulovou hmotností 2400 Da pro přípravu farmaceutických přípravků vhodných pro léčbu senilní demence, zvláště Alzheimerovy choroby nebo senilní demence Alzheimerova typu a mozkových neurologických poranění způsobených iktem a traumaty.

Uvedené frakce glykosaminoglykanů jsou získány depolymerizací heparinu, s výhodou prováděnou způsobem obsahujícím následující kroky:

a) vodný roztok heparinu se vystaví gama záření ⁶⁰Co v souladu s US patentem č. 4,987,222,

b) takto získaný roztok je frakcionován gelovou permeační chromatografií na Sephadexu G/50 Medium,

c) směs z frakcí o molekulové hmotnosti od 1000 do 3000 Da je ultrafiltrována na membráně s propustností 600 Da, promyta a lyofilizována,

d) lyofilizovaný produkt je rozpuštěn a frakcionován gelovou permeační chromatografií na Sephadexu G/25 Medium,

e) frakce o molekulové hmotnosti v rozmezí 1920 až 2560 Da odpovídající průměrné molekulové hmotnosti 2400 Da jsou sebrány a smíšeny.

Pro přípravu frakce glykosaminoglykanů s průměrnou molekulovou hmotností 2400 Da se výhodným způsobem podle vynálezu 10 % vodný roztok heparinu nejprve vystaví gama záření ⁶⁰Co o intenzitě v rozmezí 120 kJ/kg (kGy) až 150 kJ/kg (kGy), v následných dávkách 25 kJ/kg (kGy) s ohledem na molekulovou hmotnost heparinu.

Ozářený roztok je ultrafiltrován na membráně s propustností 300 Da, purifikován, sterilně zfiltrován a lyofilizován, čímž je získán matečný depolymerizovaný heparin.

f) Tento matečný depolymerizovaný heparin je rozpuštěn v 0,3M roztoku NaCl a pak frakcionován gelovou permeační chromatografií na Sephadexu G/50 Medium.

Frakce o molekulové hmotnosti menší než 3000 Da (tj. cca 10 hmotn. % celkové hmotnosti) tvoří surový materiál podle tohoto vynálezu.

První úprava této směsi sestává z ultrafiltrace na membráně s propustností 600 Da pro odstranění molekulových fragmentů vzniklých depolymerizačním procesem.

Ultrafiltrovaná směs se promývá 0,3M roztokem NaCl až do vymizení reakce na karbazol ve filtrátu.

Konečná směs zakoncentrovaná na 8% v destilované vodě je sterilně zfiltrována na membráně o velikosti pórů 0,2 μηι a lyofilozována.

Lyofilizovaný produkt je rozpuštěn v 0,3M roztoku NaCl na koncentraci v rozmezí 10 hmotn. % až 15 hmotn. %.

Aby se získaly frakce s průměrnou molekulovou hmotností 2400 Da, aplikuje se druhá úprava gelovou permeační chromatografií se stejnými parametry jako při první gelové permeační chromatografií, nicméně s využitím specifických charakteristik Sephadexu G/25 Medium.

Použitá pokusná kolona může být typu BP 252/15 s následujícími charakteristikami:

• výška............................ 105 cm • objem pryskyřice............. 5 200 ml • průtok .......................... 1000 ml/h

Dále jsou uvedeny použité parametry:

• Ve..............................= 17 000 ml • V_t/V₀.........................= 1/R=1,26 • R ..............................= 0,79 • K ..............................= 0,09= (Ve-Vo): (V_t-Vo) kde • V_e = eluční objem • V_t = celkový objem pryskyřice • V_o = mrtvý objem (roztok proteklý na počátku chromatografie) • R = rozlišení (amplituda píku)

Z druhé gelové permeační chromatografie se získá od 10 do 12 frakcí látek o molekulové hmotnosti v rozmezí od 3000 Da do cca. 1500 Da. Pro přípravu frakce glykosaminoglykanů podle vynálezu se sbírají a spojují pouze frakce s molekulovou hmotností v rozmezí od 1920 až 2560 Da.

Výsledný roztok se ultrafiltruje na membráně s propustností 300 Da k odstranění chloridu sodného.

Roztok je zakoncentrován na 10 %, zfiltrován na membráně o velikosti pórů 0,2 pm a lyofilizován.

Tato frakce tvoří kolem 80% celkového množství frakcí s molekulovou hmotností menší než 3000 Da.

Způsobem podle tohoto vynálezu se získají požadované frakce glykosaminoglykanů s pozoruhodným indexem reprodukovatelnosti ať s ohledem na výtěžek nebo s ohledem na stálost molekulového složení.

Dále je uvedena charakteristika frakce glykosaminoglykanů podle tohoto vynálezu.

Fyzikálně-chemické vlastnosti vzhled.....................................

průměrná molekulová hmotnost... distribuce molekulových hmotností polydisperzní index....................

organická síra...........................

: prášek světle žluté barvy : 2400 Da (± 200 Da) : 95 % < 2560 Da > 1920 Da .: < 1,20 : 9,5 až 11,5% ·· *·

-6poměr SO₃/COOH.........................: 2,3 až 2,6 specifická rotace............................: > + 35°

HPLC..........................................: obr. 1

NMR ..........................................: obr. 2

Průměrná molekulová hmotnost byla určena pomocí HPLC s použitím kolony pro vylučovací chromatografií ve srovnání s hepariny s nízkou molekulovou hmotností pro kalibraci referenční látkovou šarží č. 1a (PH.EUR.) o molekulové hmotnosti 3700 Da.

Procentuální poměry sulfatace

Byly zkoumány tři příklady s výsledky uvedenými v tabulce 1.

TABULKA 1

Odsířené uranové kyseliny %	GlcNSO₃.6SO₃ %	GIcNAc %	GIcNSO₃.3,6SO₃ %
34	85	13	7
33	85	13	6
31	85	14	7

Procentuální hodnoty jsou přepočítány na součet dvou specifických oblastí uvažovaných podle NMR analýzy.

Odsířené uronické kyseliny: oblast signálů při 102,2 a 106 ppm s ohledem na celkové uranové kyseliny v oblasti 100,5 a 106 ppm.

Glukosoamin.NSO3.6SO3 : oblast signálu při 62,5 ppm s ohledem na oblast glukosamin.6S0₃ v oblasti 68 ppm.

GIcNAc: oblast signálu při 55,5 ppm s ohledem na oblast signálu 61 až 54 ppm.

GlcNSO₃.3,6SO₃: oblast signálu při 59 ppm s ohledem na oblast signálu 61 až 54 ppm.

Hodnoty sulfatace na 6. uhlíku glukosaminu se ukázaly jako nižší než hodnoty ve frakcích o molekulové hmotnosti 4500 Da (průměrná molekulová hmotnost 84).

• *4	4· ·	• 4	4 4
• 4 · • 4··	♦ 4 · 4 4 4 4	4 4 4 4	* 4 •
• 4 4 • 4 · 44	• 4 4 4 4 4 4 4	4 4 4 ·	4 4 4 4··

Toto je v důsledku skutečnosti, že se při snižování molekulární hmotnosti zvyšují signály sekundárních alkoholových skupin přítomných v redukovaných terminálních jednotkách, jejich signály padají do oblasti 6. uhlíku desulfatovaného glukosaminu.

Strukturální charakteristiky

Na obr. 1 jsou znázorněn záznam frakce glykosaminoglykanů získaný z HPLC s distribucí molekulových hmotností z 95% v rozmezí od 2560 Da do 1920 Da odpovídající 4 až 5 konstitutivním disacharidům.

Na obr. 2 je znázorněn záznam uvedené frakce z NMR, na kterých je patrná absence signálů od 84 do 85 ppm charakteristických pro vazebné místo, které je odstraněno depolymerizací gama zářením. Odtržení galaktosového řetězce a jeho dusíkových složek představuje specifickou charakteristiku této sacharidové frakce, což umožňuje měření bez interferencí, které jsou obvykle patologického charakteru a jsou dány přítomností peptidových struktur s rozdílným aminokyselinovým složením.

NMR analýzou bylo dále zjištěno, že v koncových zónách jsou jen intaktní cykly nebo se tyto zóny případně skládají z alifatických zbytků.

Cykly na redukujících koncích nejsou nikdy desulfatované.

Glukuronové struktury desulfatované na redukujících koncích nejsou znázorněny, protože jsou zničeny gama zářením.

V cyklech na neredukujících koncích je obtížné odlišit koncové C₄ od nekoncových C₄, protože všechny spadají do shodné oblasti; jediné, které lze jednoznačně identifikovat, jsou C₄ N-sulfatovaných glukosaminů nebo glukosaminů.3SO₃ bezprostředně připojených ke glukouronové kyselině aktivního pentameru.

Strukturální jádra odpovídají původnímu heparinu s prakticky nezměněným indexem sulfatace.

Anomerní signály odvozené z redukujících skupin GlcNSO₃.SO₃ a ldoA2S0₃ kvalifikují frakci glykosaminoglykanů podle vynálezu jako látku s koncovými jednotkami podobnými jednotkám fragmentů přírodního heparinu.

Zvláště výhodná pro použití podle tohoto vynálezu je frakce glykosaminoglykanů s průměrnou molekulovou hmotností 2400 Da s polydisperzním indexem nižším než 1,20 s úplnou absencí peptidových složek a bez desulfatovaných jednotek na redukujícím konci, která byla získána bez resulfatace a bez katalyzátorů.

♦ «© © © • · · ·	·· • •	• •	• • · •	• •	©· © ♦
• ♦ ·	©	©	•	•	©
• · © ·	··		**♦		• ©

Biologické charakteristiky

Ph.E heparinová aktivita = není přítomna

USP heparinová aktivita = není přítomna

Anti Xa aktivita =< 50 U/mg

Anti lla aktivita =<10 U/mg

Z výše uvedených charakteristik vyplývá, že ve frakci glykosaminoglykanů podle tohoto vynálezu není přítomna heparinová aktivita týkající se parametrů koagulace, která nevydržela udržení strukturálních charakteristik heparinové molekuly, jež má evidentně mnohem nižší molekulární hmotnost.

Příklad 1

100 g natriumheparinu z prasečí střevní mukozní sliznice, s molekulovou hmotností 14 000 Da a aktivitou 190 U/mg je rozpuštěno v 11 destilované vody zbavené vzduchu. Tento roztok je nalit do pyrexových nádob, které jsou po probublání argonem uzavřeny skleněnou zátkou.

Roztok je vystaven působení 130 kJ/kg (kGy) v následných dávkách 25 kJ/kg (kGy) gama záření ⁶⁰Co, čímž je dosaženo depolymerizace heparinu.

Ozářený roztok je ultrafiltrován na membráně s velikostí pórů 300 Da, pak purifikován promytím v 3% NaCI a po dosažení koncentrace 10 % lyofilizován.

Matečný depolymerizovaný heparin je rozpuštěn v 10% koncentraci v 0,3M roztoku NaCI a frakcionován gelovou permeační chromatografií na Sephadexu G/50 Medium.

Po odloučení složek s molekulovou hmotností nad 8000 Da a podílů vztahujících se k heparinu s molekulovou hmotností 4500 Da se získají frakce s molekulovou hmotností menší než 3000 Da. Tyto frakce jsou purifikovány ultrafiltrací na membráně s propustností 600 Da pro odstranění molekulových fragmentů po depolymerizačním procesu.

Po sérii tří promývání v 0,3M NaCI za účelem vymizení reakce karbazolu ve filtrátu je směs zakoncentrována na cca 8 %, roztok je zfiltrován na membráně o velikosti pórů 0,2 μιυ a je lyofilizován.

Lyofilizovaný produkt je rozpuštěn v 0,3M roztoku NaCI v množství, kterým se získá výsledná koncentrace 10 % (x/v). Tento roztok je frakcionován gelovou permeační chromatografií na Sephadexu G/25 Medium.

Spojí se frakce s molekulovou hmotností v rozmezí od 1920 Da do 2560 Da.

Získaný roztok se čistí utrafiltrací na membráně s propustností 300Da pro odstranění chloridu sodného.

Roztok je dále zakoncentrován na koncentraci cca 10% a pak je lyofilizován.

Výtěžek: cca 9 g prášku světle žluté barvy.

Analýza: průměrná molekulová hmotnost = 2400 Da (+ 200 Da), organická síra = 9,9%.

Poměr sulfáty/karboxyly = 2,5 , anti Xa aktivita = 45 U/mg.

HPLC test - obr. 1 NMR test -obr.2

Pro účely porovnání byly připraveny stejným způsobem následující frakce glykosaminoglykanů:

• frakce s průměrnou molekulovou hmotností 640 Da (od 320 Da do 1600 Da), • frakce s průměrnou molekulovou hmotností 4800 Da (od 3 950 Da do 6 060 Da).

Díky farmaceutickým charakteristikám získaným z níže uvedených experimentů mohou být glykosaminoglykany s průměrnou molekulovou hmotností 2400 Da použity pro přípravu farmaceutických přípravků vhodných k léčení senilní demence a zejména Alzheimerovy choroby nebo senilní demence Alzheimerova typu (SDAT), dále mozkových neurologických poranění způsobených iktem a traumaty a forem nervové degenerace.

Uvedené přípravky obsahují farmaceuticky účinné množství glykosaminoglykanů smíchané s farmaceuticky přijatelnými rozpouštědly nebo excipienty a mohou být připraveny ve formě vhodné pro podkožní, nitrosvalové, intravenózní nebo orální podávání.

Uvedené přípravky obsahují množství glykosaminoglykanů v rozmezí od 50 do 200 mg na jednotlivou dávku.

Tento vynález také předkládá způsob léčení pacientů, trpících senilní demencí a zejména Alzheimerovou chorobou nebo senilní chorobou Alzheimerova typu (SDAT) a po neurologickém poranění mozku způsobeném iktem nebo traumaty, který spočívá v podávání dávek glykosaminoglykanů s průměrnou molekulovou hmotností 2400 Da

94 9 94 44 • · 4 · · 4444

94 9 4 4 4 9 4

4 9 4 9 4 4 4 9 • 44 44 49 ··· ·· ··♦·

- 10v množství 10 až 400 mg denně. Pro podkožní, nitrosvalové a intravenózní podávání je zejména předpokládána dávka v rozmezí 10 až 200 mg denně a pro orální podávání se předpokládá dávka v rozmezí 25 až 400 mg denně.

Farmakologický experiment

Pro studii farmakologické aktivity frakce glykosaminoglykanů podle tohoto vynálezu byl aplikován experimentální model na krysu, při kterém byla reprodukována některá poranění typická pro senilní demenci (Sigurdsson EM, Lorens SA, Hejna MJ, Dong WX, LEE JM: „Local and Distal Histopathological Effects of Unilateral Amyloid-β 25-35 Injections into the Amygdala of Young F344 Rats“, Neuro Biol Aging 1996, 17:893-901).

Byly studovány zejména následující parametry:

• Tau-2 protein, vztažený na jednotku reakce na β-amyloidovou substanci (nepřímá reaktivita), • GFAP protein (gliový fibrilární kyselý protein), vztažený na reaktivitu astrocytů na βamyloid (nepřímá reaktivita).

Materiál použitý při experimentu • β-amyloid:

Sodná sůl Αβ 25-35 v roztoku kyseliny trifluoroctové (TFA) a (VEH1) s obsahem peptidu 82 až 89 % (BACHEM, Torrance, CA).

β-amyloid s příslušným nosičem (VEH1) byl okamžitě před použitím rozpuštěn s nanoH₂O v množství postačujícím na dosažení koncentrace 5 nmol/ 3,0 ml a udržován při 4 °C.

• Glykosaminoglykany, TGSS:

Tři typy TGSS přizpůsobených glykosoaminoglykanů byly připraveny v souladu s výše uvedenou přípravou; jejich rozdílná molekulová hmotnost je udána v následující tabulce:

Typ TGSS	Prům. molekul, hmotnost (Da)	Prům. počet monosacharidů
C8	640 (320-1600)	2
C3	2400 (1920-2560)	8
C7	4800 (3520 - 6060)	15

Tyto výrobky sestávaly z prášku světle žluté barvy rozpustného ve vodě, který byl uchováván v sušičce za pokojové teploty.

• Α· AA • A A »9 • «9· · ·

9 A A A A • A A A 9 • A A · A A A

A A « 9 A

9

A 9 • A 9 A · A

- 11 Pro vstříknutí krysám byly připraveny roztoky s koncentrací 1 mg/ml ve fyziologickém roztoku (VEH2).

Tyto roztoky byly udržovány při teplotě 4 °C po dobu ne delší než dva týdny.

• VEH 1

Trifluoroctové kyselina (TFA) (10 nmol/ 3μΙ destilované H₂O), nosič β amyloidů.

• VEH 2:

fyziologický roztok, nosič TGSS.

Experimentální metody

Model použitý pro experimenty je založen na efektu vstříknutí Αβ 25-35 do centrální oblasti mozkové struktury.

Aminokyselinová sekvence Αβ 25-35 je považována za neurotoxickou sekvenci (Yankner BA, Duffy LK, Kirschner DA, „Neurotrophic and Neurotoxic Effects of Amyloid-β Protein. Reversal by Tachykinin Neuropeptides“, Science 1990, 250-282), protože produkuje poranění typická pro Αβ 1-41 nebo Αβ 1-43.

Pro experimety byl využit mladý samec (3-4 měsíce) krysy Fischer 344, který obdržel nitromozkovou injekci do pravé části mozku s 5nmol/3 μΙ Αβ 25-35 nebo příslušného nosiče (VEH 1).

TGSS nebo příslušný VEH2 nosič byl podán dvakrát denně podkožní cestou dva dny před nitromozkovou injekcí Αβ a 32 dnů po této injekci ve výše uvedeném dávkování.

Pro histologický rozbor byla zvířata uspána pentobarbitalem sodným a perfundována arteriální (transaortální) cestou roztokem 4% formaldehydu.

Bylo provedeno pět koronálních sekcí (40μιυ) oddělených 0,2mm intervaly.

Tyto sekce byly kontaktovány s protilátkami proti proteinu Tau-2 a gliovému fibrilárnímu kyselému proteinu (GFAP).

Samec krysy Fischer 344 byl získán od Harlan-Sprague-Dawley lne. (Indianopolis, Indiana)

V čase příchodu do laboratoře vážila zvířata 250-300 g a byla držena individuálně v samostatných klecích s cyklem světlo-tma odpovídajícím 12 hodinám (světlo v 7,00) při podmínkách pro chov schválených Americkou asociací laboratoří se zkušebními zvířaty a pro péči o ně (AAALC).

Tato zvířata měla zajištěn přístup kvodě i k potravě podle své chuti a byla držena v uvedených podmínkách dva až tři týdny před experimentem.

9 9 · « 949 9 9 « · · · · • t · » · • · · 99 «9

Μ « 9 • · • ·

9

- 12Nitromozková injekce Αβ 25-35 byla provedena pod anestetikem pentobarbitalu sodného (50 mg/kg, i.p. Butler, Columbus, Ohio).

Při anestezii zvířat byly dále podávány nitrosvalovou cestou atropinsulfát (0,4 mg/kg., Sigma, St.Louis, MO) a sodná sůl ampicillinu (50 mg/kg, Sigma, St.Louis, MO). Nitromozková injekce do pravé mozkové polokoule za použití stereotaxického přístroje (Kopf), přičemž byl použit takový způsob, že hloubka nebyla větší než 3,3 mm pod vnitroaurální linii.

Souřadnice pro injekci byly určeny na základě Paxinosova-Watsonova atlasu, měřeno od kraniálního bregmatu se souřadnicemi AP-3,0 , ML- 4,6 a DV 8,8.

Anteroposteriorní (AP) souřadnice byly umístěny tam, kde struktura mozku je větší.

Mediální laterální (ML) souřadnice byly vystředěny ve vztahu k mediálnímu a bazolaterálnímu jádru mozkové struktury a konečně dorsoventrální (DV) souřadnice byly vystředěny na dorsoventrální linii mozkové struktury.

Infuze vstříknutého objemu 3 μΙ trvala 6 minut při použití pumpy pro injekční mikrostříkačky typu CMA/100 (Carnegie Medici AD, Soln - Švédsko). Kanyla byla ponechána na místě ještě 2 minuty po vstříknutí a potom byla opatrně odstraněna.

Po ukončení operace byla zvířata držena na zahřívané desce do doby, než znovu získala vzpřimovací reflex.

Po 35 dnech léčby byla zvířata uspána pentobarbitalem sodným (100 mg/kg I.P.) a poté byla transaortální cestou perfundována 250 ml 0,1 M fosfátu sodno-draselného v pufru o pH 7,4 (fosfátový pufr).

Následně byla zvířata perfundována 500 ml 4% formaldehydu ve fosfátovém pufru rychlostí 500ml/hod při teplotě místnosti.

Okamžitě po zahájení perfúze bylo transaortální cestou vstříknuto 1 U/g heparinu (Upjohn Kalamazoo, Ml).

Po perfúzi byl mozek izolován a fixován v roztoku 20% sacharosy po dobu 1 hodiny a potom byl rozdělen na 6mm bloky kolem místa vpichu a uchováván při teplotě 4 °C ve 20% sacharóze, 0,1% roztoku azidu sodného a 0,01% bacitracinu ve fosfátovém pufru po dobu 24 hodin.

Bloky tkáně byly přesunuty do roztoku 20% glycerolu a 2% dimethylsulfoxidu v0,1M fosfátovém pufru a tam byly uchovány na teplotě 4 °C až do okamžiku dělení.

Byla nařezána řada pěti koronálních sekcí o 40μηι ve vzdálenosti 0,2 mm jedna od druhé a ty byly histologicky analyzovány na analýzu proteinů Tau-2 a GFAP.

- 13• ft· «ftft ·· *» ftft ft ft ft ftft ftftftft ftft ftft ftft* ftft ft • ftftft·· ««ftft ♦ ftftft ftft ft ftftft ft·· ·· ftft Μ» · ft ftft ftft··

Histologická analýza

Kresolová violeť

Sekce byly čištěny xylenem a hydratovány alkoholem a H₂0. Barvení bylo provedeno ponořením sekce do roztoku, obsahujícího 200 ml 0,2M kyseliny octové, 133 ml 0,2M octanu sodného a 67 ml 0,1%. octanu kresolové violeti. Poté byly sekce dehydratovány následným promýváním ethanolem a čištěny xylenem. Takto obarvené sekce byly pokryty vhodným podložním sklíčkem pro mikroskopování.

Kongo červená

Sekce byly čištěny a hydratovány sérií promývání ethanolem a vodou.

Barvení bylo provedeno ponořením sekcí do roztoku obsahujícího 1% kongo červené a 50 % ethanolu na dobu 1 hodiny.

Sekce byly ponořeny do roztoku saturovaného uhličitanem lithným a promývány pod tekoucí vodou po dobu 15 minut. Reverzní barvení bylo provedeno v Harrisově hematoxylinu po dobu 2 minut; poté byla přidána voda a 1% alkoholový kyselý roztok. Sekce byly promyty vodou, ponořeny do vodného roztoku síranu amonného a znovu promyty tekoucí vodou. Nakonec byly sekce dehydratovány v ethanolu a čištěny xylenem. Takto obarvené sekce byly pokryty vhodným podložním sklíčkem pro mikroskopování.

Tau-2 protein

40gm sekce byly očištěny od kryoprotektoru a byly přes noc ponechány ve fosfátovém pufru při teplotě 4°C.

Ráno byly sekce na dobu 30 minut ponořeny do 0,3% roztoku H₂0₂ v Tris-pufru o pH 7,6 (fosfátový pufr) a později třikrát promyty po dobu 10 minut roztokem 0,3% tritonu X-100 ve fosfátovém pufru. Sekce byly poté inkubovány při teplotě místnosti po dobu 24 hodin s protilátkami proti proteinu Tau-2 (Sigma) zředěnými 1:500.

Ředidlo pro protilátky obsahovalo 2 % tritonu X-100, 0,1 % azidu sodného, 0,01 % bacitracinu, 2 % sérového albuminu a 10 % normálního koňského séra ve fosfátovém pufru.

4 fc*	♦ fc	s	fc*		*·
• fc ί	•		··	fc	•	fc ·
1 fcfcfc	•	•	1	fc	•	•
• · ·	• ě	•	•	>	•
• fcfc ··		fcfcfc	• fc		• fcfcfc

Na konci byly sekce třikrát promyty po dobu 10 minut roztokem 0,3% tritonu X-100 ve fosfátovém pufru a následně inkubovány po dobu 1 hodiny s protilátkami proti imunoglobulinu (Vectastain ABC Elitě Kit, Vector Laboratories Burlingame, Kalifornie), které byly zředěny v poměru 1:200 v 0,3% tritonu X-100 ve fosfátovém pufru. Po dvou promytích roztokem 0,3% tritonu X-100 ve fosfátovém pufru, celkem na 15 minut, byla tkáň inkubována na 1 hodinu křenovou peroxidasou značenou avidinem /Vector/ zředěnou v poměru 1:2000 roztokem 0,3% tritonu X-100 ve fosfátovém pufru.

Sekce byly promyty fosfátovým pufrem po dobu 1 hodiny a poté znovu po dobu 15 minut v pufru s octanem sodným (0,2M o pH 6,0). Sekce poté zreagovaly s tetrahydrochloridem 3,3-diaminobenzidinu (DAB) a se síranem amonno-nikelnatým, a to v množství 35 mg DAB, 2,5 g síranu amonno-nikelnatého na 100 ml pufru s octanem sodným s 0,3 % H₂0₂).

Sekce byly poté ponořeny do pufru s octanem sodným a následně do fosfátového pufru při teplotě 4°C a tak byly udržovány přes noc.

Po této operaci byly sekce vysušeny a pokryty vhodným podložním sklíčkem pro mikroskopování.

GFAP protein

Barvení bylo provedeno způsobem použitým pro Tau-2 s výjimkou, že protilátky byly raději rozpuštěny v ovčím seru než v koňském seru.

Primární protilátka proti GFAP (DAKO, Dánsko) byla použita ve zředění 1:500.

Sekce zbarvené kresolovou violetí byly analyzovány měřením velikosti Αβ depozitů.

Oblast Αβ depozitů byla měřena v 0,2mm intervalech. Tyto Αβ depozity byly také analyzovány na jablečně zelenou lámavost zeleného světla s použitím polarizovaného světla podkladových sklíček zbarvených kongo červenou.

V kontextu těchto histochemických pokusů byly spočítány buňky reaktivní na Tau-2 ve všech koronálních sekcích a byla stanovena reaktivní astrocytosa s výsledkem od 0 do 2.

Zvířata byla považována za pozitivní, jestliže vykazovala pozitivní barvení od 1 do 2.

Experimentální postup a výsledky

Pro každý experiment byly použity odlišné skupiny krys:

. ., ... ·· ·· ... .... · · · ;

• ... · · · · ϊ . ······ ·.·· · .····· ...

... ·· ·· ··· ·· ····

- 151. Skupina VEH1 + VEH2: krysám byl vstříknut nosič VEH1 (TFA) do mozkové struktury a nosič VEH2 (fyziologický roztok) podkožně.

2. Skupina Αβ + VEH 2: krysám byl vstříknut Αβ 25-35 do mozkové struktury a nosič

VEH2 (fyziologický roztok) podkožně.

3. Skupina Αβ + TGSS: krysám byl vstříknut Αβ 25-35 do mozkové struktury a TGSS podkožně.

4. Skupina VEH1 + TGSS : krysám byl vstříknut nosič VEH1 (TFA) do mozkové struktury a TGSS podkožně.

Každý blok experimentů byl určen nejméně pro 6 zvířat na skupinu.

Následovně po tomto léčebném schématu byly použity tři typy TGSS o třech různých průměrných molekulových hmotnostech, jak je uvedeno dále:

C3 - 2400 Da, 2,5mg/kg podkožní dávka

C8 - 640 Da, 2,5mg/kg podkožní dávka

C7 - 4800 Da, 2,5mg/kg podkožní dávka

Každý typ TGSS byl studován dvěma různými experimenty pro potvrzení výsledků.

Pro každý typ léčby byl analyzován následující počet zvířat:

Typ léčby	Počet zvířat
1. VEH 1 +VEH2	30
2. Αβ + VEH 2	36
3a. Αβ + C3	23
3b. Αβ + C8	17
3c. Αβ + C7	21
4. VEH 1 + TGSS (C3 nebo C7 nebo C8)	30

Zvířata ošetřená pomocí VEH 1 injekcí do mozkové struktury (kontrola bez amyloidů) a kterýmkoliv typem TGSS (C3 nebo C7 nebo C8) vždy vykázala výsledky prakticky identické s kontrolami skupiny 1, léčenými pouze nosiči VEH 1 + VEH 2.

-16a) Reaktivita Tau-2 proteinu (počet reaktivních buněk): průměrná hodnota ± standardní odchylka.

Typ léčby	Počet případů	Počet reaktivních sekcí buňka/tkáň
1. VEH 1 +VEH2	30	11 ±5
2. Αβ + VEH 2	36	66 ±12
3a. Αβ + C3	23	25 ±16 ρ<0,05νεΑβ +VEH 2 (Newman -Keulseův test)
3b. Αβ + C8	17	60 ±14
3c. Αβ + C7	21	22 ± 17 p < 0,05 Vs Αβ + VEH 2 (Newman - Keulsův test)
4. VEH 1+TGSS (C3 nebo C8 nebo C7)	30	10 ± 3

Z této série experimentů vyplývá, že jak C3, tak C7 jsou oba aktivní v redukování reaktivity Tau-2 proteinu, zatímco C8, který má nejnižší molekulární hmotnost odpovídající disacharidům, nevykazuje aktivitu.

Kontroly, které nebyly ošetřeny Αβ, se chovaly identicky, když byly ošetřeny buď podkožní injekcí fyziologického roztoku (skupina 1), nebo TGSS (skupina 4).

Silný pokles reaktivity Tau-2 proteinu při použití sloučeniny C3 bylo potvrzeno také testy, při kterých byla sloučenina C3 podávána krysám orálně.

Experimentální model a způsob screaningu byly identické s výše uvedenými s tím rozdílem, že sloučenina C3 byla podávána orálně v množství 20 mg/kg a ne podkožně.

-17Podávání C3 bylo provedeno jednou denně počínaje třetím dnem před zahájením injekcí Αβ 25-35 až do čtrnáctého dne po injekcích.

Krysy byly usmrceny čtrnáctého dne od injekci Αβ 25-35.

Dosažené výsledky jsou popsány v následující tabulce, ze které zcela jasně vyplývá, že C3 silně snižuje reaktivitu Tau-2 proteinu v krysách ošetřených Αβ 25-35.

Typ léčení	Počet případů	Počet reaktivních sekci buňka/tkáň
Αβ + VEH 2	6	52
Αβ + C3	6	9 ± 2 p< 0,01 (Studentův T test)

b) Reaktivita astrocytů ( % zvířat, která vykazovala reaktivitu +1 nebo + 2): průměrné hodnoty.

Typ léčby	Počet případů	% zvířat, vykazujících reaktivitu + 1 nebo + 2
1. VEH 1 +VEH2	30	37
2. Αβ + VEH 2	36	87
3a. Αβ + C3	23	35 p < 0,05 vs Αβ + VEH 2 (χ₂ sec. Fisher)
3b. Αβ + C8	17	88
3c. Αβ + C7	21	67
4. VEH 1 + TGSS (C3 nebo C7 nebo C8)	30	26

Pokud se týká reaktivity astrocytů, jediný výrobek, který prokázal zřetelnou aktivitu, byla sloučenina C3 ze skupiny 3a. Výrobky C8 a C7 ze skupin 3b a 3c neměly žádnou aktivitu.

Z prozkoumání těchto výsledků se překvapivě vynořuje fakt, že C3 TGSS, který má průměrnou molekulovou hmotnost 2400 Da, má mnohem vyšší aktivitu , než TGSS, který • · · · • · ·

- 18měl vyšší a nižší molekulovou hmotnost. Průměrná molekulová hmotnost 2400 Da je optimální zejména pro snížení reaktivity Tau-2 proteinu a také astroocytů.

V dalším experimentu na krysách byla studována schopnost výrobku C3 překonat hematoencefalickou bariéru následně po jeho intravenózním podávání.

Pro tento účel byl použit výrobek označený ³H. Označení odpovídalo množství 700 000 DPM/mg ³H-C3.

Po intravenózním podání 2,5 mg/kg byly krysy usmrceny anestezií pentobarbitalem sodným v pevném čase 45 minut. Byly analyzovány úrovně značení v mozkomíšní tekutině (CSF) a v mozku po pomalé infuzi pro odstranění krve z cév. Mozkomíšní tekutina byla odebrána skleněnou kapilárou ze čtvrté komory v množství vždy větším než 200 μΙ, a to až po úplném odkrvení zvířete.

Množství radioaktivity bylo odhadnuto scintilací rozpuštěním 20 μΙ homogenátu (mozku) v 5 ml fyziologického roztoku.

Výsledky popsané v následující tabulce ukazují, že ³H-C3 je schopen překonat hematoencefalickou bariéru v znatelném množství.

Tkáň	Počet případů	DPM/ml
Sérum	5	404 ± 138,3
Mozkomíšní tekutina	5	85 ± 13,0
Mozek	5	217 ±217,2

V kontrolních zvířatech byly úrovně DPM/ml vždy nižší než 41 pro všechny analyzované tkáně.

Následně po těchto výsledcích byla provedena kontrola přítomnosti anti Xa aktivity v seru, v mozkomíšní tekutině a v mozku.

Je známo, že faktor Xa, tj. koagulační X faktor, je inhibován pouze frakcemi sulfatovaných oligosacharidů obsahujícími více než čtyři sacharidy.

V sérii krys ošetřených podle předchozího bodu bylo zpozorováno, že po 45 minutách po intravenózní aplikaci C3 v dávce 2,5 mg/kg byla anti Xa aktivita přítomna zcela zřetelně v plazmě, v mozkomíšní tekutině a v mozkové tkáni.

♦ ·

- 19To je dalším potvrzením, že výrobek, který prostoupil hematoencefalickou bariérou, obsahoval C3 a nikoliv neaktivní degradační produkty jako disacharidy nebo tetrasacharidy.

V krysách, podrobených injekci Αβ 25-35, ať již upravenou C3, nebo bez aktivní úpravy, byl rovněž analyzován růst neuronů.

Pro tento účel byla použita rychlá metoda Golgiho barvení, která byla díky své komplexnosti aplikována pouze na omezený počet zvířat.

Jak již bylo dříve uvedeno, sloučenina C3 byla podávána podkožně v množství 2,5 mg/kg, a to dvakrát denně počínaje dvěma dny před nitromozkovou injekcí Αβ 25-35 a dále po 32 následujících dnů.

Byly analyzovány mozkové neurony ve vrstvě V závitu patrového hrbolku mozku.

Test implikoval měření délky dendritů a poměru mezi počtem koncových větví a počtem primitivních větví, kterým je poměr T/B. Čím vyšší byl poměr T/B, tím větší je komplexnost a počet neuronových spojení.

Výsledky jsou znázorněny v následující tabulce.

Typ léčby	Počet případů	Délka dendritů %	Poměr T/B
VEH 1 + VEH 2	7	100 ±2,1	4,3 ±0,15
Αβ + VEH 2	8	94 ± 2,0	4,0 ±0,16*
Αβ + C3	6	110 ± 3,0	4,7 ± 0,19**

*) p < 0,05 Αβ + VEH 2 vs. VEH 1 + VEH 2 **) p < 0,05 Αβ + VEH 2 vs. VEH 1 + C3

Tato tabulka ukazuje, že Αβ způsobuje poškození růstu neuronů a že C3 napravuje toto poškození. Navíc je možné z uvedeného poznat, že C3 má aktivitu neurotropického typu užitečnou pro případy nervové degenerace nebo traumat způsobujících poškození neuronů.

• ··

-20Průmyslová využitelnost

Tento vynález pojednává o glykosaminoglykanech s nízkou molekulovou hmotností, vhodných pro léčbu Alzheimerovy choroby, senilní demence Alzheimerova typu (SDAT) a mozkových neurologických poranění způsobených iktem a traumaty.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití glykosaminoglykanů s průměrnou molekulovou hmotností 2400 Da pro přípravu farmaceutických přípravků vhodných k léčení senilní demence a neurologických mozkových poranění způsobených iktem a traumaty.
2. Farmaceutické přípravky vhodné k léčení senilní demence a neurologických mozkových poranění způsobených iktem a traumaty, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství glykosaminoglykanů s průměrnou molekulovou hmotností 2400 Da ve směsi s farmaceuticky přijatelnými ředidly nebo excipienty.
3. Farmaceutické přípravky podle nároku 2, vyznačující se tím, že glykosaminoglykany mají průměrnou molekulovou hmotnost 2400 Da s polydisperzním indexem nižším než 1,2 při totální absenci peptidických složek a bez desulfovaných jednotek na redukčních koncích.
4. Farmaceutické přípravky podle nároku 2, vyznačující se tím, že senilní demence zahrnuje Alzheimerovu chorobu nebo senilní demenci Alzheimerova typu.
5. Farmaceutické přípravky podle nároku 2, vyznačující se tím, že glykosaminoglykany jsou získány depolymerizací heparinu gama zářením a následnou gelovou permeační chromatografií.
6. Farmaceutické přípravky podle nároku 2, v y z n a č u j í c í se t í m, že jsou ve formě pro podkožní, nitrosvalové, intravenózní a orální podání.
7. Farmaceutické přípravky podle nároku 2, vyznačující se tím, že glykosaminoglykany jsou v množství 50 až 200 mg na jednotkovou dávku.
8. Farmaceutické přípravky podle nároku 2, vyznačující se tím, že glykosaminoglykany jsou schopny překonat hematoencefalickou bariéru, snížit reaktivitu Tau-2 proteinu a gliového fibrilárního kyselého proteinu a podpořit růst neuronů.

44 ··

It 4 · 4 » 4 4 » 4 · ► 4 4

4» 4444 • 4

444 ··

-229. Terapeutický způsob léčení pacientů trpících senilní demencí a neurologickými mozkovými poraněními, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání glykosaminoglykanů s průměrnou molekulovou hmotností 2400 Da v množství 10 až 400 mg denně.
10. Terapeutický způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že glykosaminoglykany jsou podávány podkožně, nitrosvalově nebo intravenózně v množství 10 až 200 mg denně.
11. Terapeutický způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že glykosaminoglykany jsou podávány orálně v množství 25 až 400 mg denně.