CN112426434A - 硫酸乙酰肝素在防治阿尔兹海默症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供硫酸乙酰肝素在防治阿尔兹海默症中的应用，属于医药研发技术领域。本发明通过体外和体内试验均证明HS具有预防和治疗AD活性，具体的，HS在体外AD模型中能够增强神经细胞的活力，抑制Aβ_1–42对神经细胞带来的损伤，如降低神经炎症因子水平，减少细胞凋亡。同时还发现HS与Aβ_1–42共同孵育能够改变减少寡聚体的状态，将寡聚体转变为毒性较弱的纤维体；体内试验亦证实HS在小鼠体内能够发挥改善小鼠认知损伤的作用，从而为进一步药物研发奠定基础，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

硫酸乙酰肝素在防治阿尔兹海默症中的应用

技术领域

本发明属于医药研发技术领域，具体涉及硫酸乙酰肝素在防治阿尔兹海默症中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

糖胺聚糖(GAGs)是存在于细胞表面、细胞外基质(ECMs)和基底膜中的线性多糖。GAGs与许多核心蛋白结合形成蛋白聚糖(PGs)，介导多种生理功能，如细胞粘附、细胞增殖、抗凝等。

硫酸乙酰肝素(HS)是一类由糖醛酸和D-葡糖胺二糖重复单位以1-4糖苷键连接形成的线性多糖。二糖单位的N-硫酸基、O-硫酸基、N-乙酰基等多种可变取代形成了复杂的序列。HS由于其具有高度硫酸化区域，故在体内其常常与一些蛋白质结合形成蛋白聚糖。HS-蛋白质结合形成的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)具有多种生物功能，包括调节胚胎发育、炎症反应、凝血、病毒/细菌感染、肿瘤转移等。

但是发明人发现，由于HS结构的复杂性与多样性，目前对HS的生理功能并没有完全清楚。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供硫酸乙酰肝素在防治阿尔兹海默症(AD)中的应用。本发明通过体外和体内试验均证明HS具有预防和治疗AD活性，从而为进一步药物研发奠定基础，因此具有良好的实际应用之价值。基于上述研究结果，从而完成本发明。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供硫酸乙酰肝素在制备预防/或治疗阿尔兹海默症产品中的应用。

其中，所述硫酸乙酰肝素其二糖组成比例为D2S6:D0S6/D2S0:D2A6:D0A6/D2A0:D0S0:D0A0＝5:2:85:1:6:9。

根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗阿尔兹海默症相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的进一步发展，例如在结束了治疗时间段之后的疾病的进一步发展或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

本发明的第二个方面，提供一种产品，所述产品活性成分包括硫酸乙酰肝素，所述产品具有预防和/或治疗阿尔兹海默症的作用，具体的，其具有如下任意一种或多种用途：

(a)提高神经细胞活力；

(b)预防Aβ_1-42对神经细胞的细胞形态造成的损伤；

(c)抑制Aβ_1-42对神经细胞产生的细胞凋亡；

(d)降低神经细胞炎症因子水平；

(e)将Aβ_1-42由毒性较强的寡聚体转变为毒性较小的纤维体，进而减小Aβ_1-42在体内的毒性；

(f)改善因Aβ_1-42导致的施用对象学习认知障碍；

(g)降低因Aβ_1-42导致的施用对象海马区炎症因子水平的升高；

(h)减少外周Aβ_1-42水平；

(i)增加外周中性粒细胞对外周循环中Aβ_1-42的吞噬作用；

(j)保护施用对象大脑。

其中，所述应用(d)中，所述炎症因子包括但不限于TNF-α,IL-6；

所述应用(g)中，所述炎症因子包括但不限于TNF-α,IL-6；

所述施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。

本发明的又一具体实施方式中，所述产品可以为药物。所述药物的活性成分包含硫酸乙酰肝素；或者包含其它至少一种用于具有预防和/或治疗阿尔兹海默症作用的物质；

其中，所述硫酸乙酰肝素其二糖组成比例为D2S6:D0S6/D2S0:D2A6:D0A6/D2A0:D0S0:D0A0＝5:2:85:1:6:9。

所述药物进一步还包含药学上可接受的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送、局部注射递送或口服递送到体内。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、黏膜、口服或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

本发明的第三个方面，提供上述硫酸乙酰肝素在制备如下任意一种或多种产品中的应用：

(1)MMP2抑制剂；

(2)MMP9抑制剂；

(3)TLR4抑制剂；

(4)pNF-κB抑制剂；

(5)PJUN抑制剂；

(6)TNF-α抑制剂；

(7)IL-6抑制剂；

(8)Caspase 3抑制剂；

(9)Caspase8抑制剂；

(10)Bax抑制剂；

(11)GSK3α/β蛋白抑制剂；

(12)Tau蛋白抑制剂。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次报道了HS在防治AD中的应用。通过体外和体内试验均证明HS具有预防和治疗AD活性，具体的，HS在体外AD模型中能够增强神经细胞的活力，抑制Aβ_1–42对神经细胞带来的损伤，如降低神经炎症因子水平、减少细胞凋亡。同时还发现HS与Aβ_1–42共同孵育能够改变减少寡聚体的状态，将寡聚体转变为毒性较弱的纤维体；体内试验亦证实HS在小鼠体内能够发挥改善小鼠认知损伤的作用，从而为进一步药物研发奠定基础，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中HS对SH-SY5Y细胞毒性和细胞活性的影响。

图2为本发明实施例1中HS对SH-SY5Y细胞形态的影响；其中，A为对照组，B为模型组，C为HS-25μg/mL；D为50μg/mL；E为100μg/mL；放大倍数为40×；

图3为本发明实施例1中HS对SH-SY5Y细胞凋亡的影响；其中，A为对照组，B为模型组，C为HS-25μg/mL；D为50μg/mL；E为100μg/mL；F为柱状统计图；^**p<0.001,^#p<0.05；

图4为本发明实施例1中HS对SH-SY5Y细胞炎症因子水平的影响。^*p<0.05,^**p<0.001,^#p<0.05,^##p<0.001,^###p<0.0001；

图5为本发明实施例1中HS对MMP2,MMP9，TLR4和phosphorylated JNK水平的影响。^*p<0.05,^**p<0.001,^#p<0.05,^##p<0.001；

图6为本发明实施例1中HS对凋亡因子水平的影响；其中，A为Caspase 8的相对表达水平，B为Caspase 9的相对表达水平，C为Bax的相对表达水平，D为Bcl-2的相对表达水平；

图7为本发明实施例1中HS对Aβ_1-42寡聚体形态的影响；其中，A为孵育1天后的Aβ_1-42寡聚体形态；B为添加25μg/mL HS孵育1天后的Aβ_1-42寡聚体形态；C为孵育3天后的Aβ_1-42寡聚体形态；D为添加25μg/mL HS孵育3天后的Aβ_1-42寡聚体形态；E为孵育5天后的Aβ_1-42寡聚体形态；F为添加25μg/mL HS孵育5天后的Aβ_1-42寡聚体形态；

图8为本发明实施例2中给药及实验过程时间表；

图9为本发明实施例2中给药及实验过程时间表1*，4*，7*，10*，13*，16*，20*，22*，24*，26*，28*，30*表示在给药的第1，4，7，10，13，16，20，22，24，26，28，30天进行断尾取血16#表示在实验的第16天进行造模；

图10为本发明实施例2中HS对Aβ_1–42模型小鼠水迷宫实验的影响；其中，A为各组逃脱潜伏期统计图；B为各组在目标象限的时间统计图；C为定向航行试验和空间探索实验各组小鼠的游泳轨迹图；其中，C中，a为对照组，b为模型组，c为假手术组，d为HS-25mg/kg，e为HS-100mg/kg；f为HS-400mg/kg；^*p<0.05,^**p<0.001；

图11为本发明实施例2中HS对Aβ模型小鼠旷场实验中自主活动的影响；^#p<0.05,^*p<0.05；

图12为本发明实施例2中HS对Aβ模型小鼠大脑皮质海马CA1区形态的改变；其中，a为皮质区，b为海马CA1区；a和b中，A为对照组，B为模型组，C为假手术组，D为HS-25mg/kg，E为HS-100mg/kg；F为HS-400mg/kg；比例尺为100μm；

图13为本发明实施例2中HS对小鼠海马区细胞结构影响；其中，A为对照组，B为模型组，C为假手术组，D为HS-25mg/kg，E为HS-100mg/kg；F为HS-400mg/kg；比例尺为1.2μm；

图14为本发明实施例2中HS对小鼠海马区IL-6和TNF-α的影响；

图15为本发明实施例2中HS对小鼠海马区炎症因子的影响；其中，A为TLR4；B为PNF-KB；C为PJNK；

图16为本发明实施例2中HS对小鼠海马区凋亡因子的影响；其中，A为Caspase 3，B为Caspase 8，C为Bax；

图17为本发明实施例2中HS对小鼠海马区PGSK和Ptau蛋白水平的变化；

图18为本发明实施例2中HS在小鼠体内的组织分布；

图19为本发明实施例2中一月内外周血浆中Aβ_1-42水平的变化及各组脑内Aβ_1-42水平的变化；

图20为本发明实施例2中HS对小鼠外周循环中单核细胞和中性粒细胞各亚群的比例的影响；

图21为本发明实施例2中HS对外周循环中Aβ_1-42清除的影响。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

1.实验方法

1.1 HS的二糖组成鉴别及分析

1.1.1重组肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的制备

重组肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ菌液的活化：取在-80℃保存的三种菌液30μL分别加入30mLLB液体培养基(肝素酶Ⅰ的培养基中加入50μg/mL的氨苄、15μg/mL的卡那、12.5μg/mL的四环素、20μg/mL的氯霉素；肝素酶Ⅱ和Ⅲ则加入50μg/mL的氨苄)中，在37℃、225r/min培养过夜。

重组肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ菌液的放大培养：次日分别取5mL活化后的菌液转至500mL LB液体培养基中进行放大培养，培养基中同样需要加入相应浓度的抗生素，37℃、225r/min培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，降至室温后进行诱导，诱导方法为，肝素酶Ⅰ加入终浓度为1mg/mL的L-阿拉伯糖，15min后加入终浓度为0.2mM的IPTG。肝素酶Ⅱ和Ⅲ加入终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，将培养温度调整为22℃继续培养，培养18～24h。取出菌液，8000r/min离心25min，倒掉上清。

重组肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ菌液的提取：将菌液溶于缓冲溶液A(25mMTris、0.5M氯化钠、30mmol/L咪唑，pH 7.5)中，4℃下超声波破碎仪破碎至菌液变成澄清，12000r/min、4℃条件下离心35min，收集上清并用0.22μm滤头过滤后备用。

重组肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的纯化：用Ni Sepharose 6B亲和柱进行纯化，层析柱用缓冲溶液A充分平衡，滴入样品，用缓冲液A继续冲洗至流出液的OD₂₈₀<0.1，用缓冲液B(25mmol/LTris、0.5mol/L氯化钠、250mmol/L咪唑，pH 7.5)洗脱，用EP管收集洗脱液，合并OD₂₈₀>0.6的洗脱液，加入15％～20％的甘油后，分装，-80℃保存备用。

1.1.2 HS多糖降解

1.1.3二糖的分析

1.2细胞毒性测定

将SH-SY5Y细胞冻存的冻存管在37℃水浴中快速融化，1000r/min离心5min，弃去上清液。沉淀的细胞用含10％FBS的DMEM培养基进行重悬并轻轻吹打混匀，形成细胞悬液，通过细胞计数板进行细胞计数，计数后将细胞悬液接种于培养瓶中，置于CO₂恒温培养箱中(5％CO₂，37℃)培养24h，此后每2～3d换液一次，细胞贴壁生长占细胞培养瓶80％左右时，将其取出，倒掉原有的细胞培养液，用PBS冲洗细胞一遍，倒掉PBS，加入0.25％胰酶液1mL消化，倒置显微镜观察细胞状态，待到细胞间隙变大，细胞变圆变亮时，加入含10％FBS的DMEM培养基4mL终止消化，反复吹打培养瓶壁上的细胞。使细胞形成细胞悬液，在倒置显微镜上进行计数，以10⁵cell/mL的密度将细胞接种于新的无菌96孔板上，CO₂恒温培养箱中进行培养。24h后给药孔弃去上清液，加入HS溶液(12.5,25,50,100,200,400μg/mL，用DMEM培养基稀释，每个浓度设3个平行孔)，空白组孔进行换液处理，再培养24h，小心吸取上清，离心，弃去上清液，加入新鲜的DMEM培养基200μL，每孔加入MTT溶液5μL，37℃继续培养4h后终止培养，加入DMSO 150μL振荡混匀后，用酶标仪测定每孔吸光度值(测定波长为570nm，参比波长为630nm)，测定细胞的存活率。

1.3细胞活力测定

未做任何处理的细胞作为空白对照，Aβ_1-42处理的孔为模型组，采用MTT方法考察HS抑制Aβ_1-42诱导SH-SY5Y细胞产生的细胞损伤，具体实验步骤如下；

24h后给予药物处理，给药组将Aβ_1-42与HS溶液混匀(12.5,25,50,100,200,400μg/mL，用DMEM培养基稀释，每个浓度设3个平行孔)，再培养24h，小心吸取上清，离心，弃去上清液，加入新鲜的DMEM培养基200μL，每孔加入MTT溶液5μL，37℃继续培养4h后终止培养，加入DMSO 150μL振荡混匀后，用酶标仪测定每孔吸光度值(测定波长为570nm，参比波长为630nm)，测定细胞的存活率。

1.4细胞形态的变化

细胞以10⁵cell/mL的密度将细胞接种于96孔板，细胞贴壁后进行给药处理，给药组加入HS(25,50,100μg/mL，用DMEM培养基稀释，每个浓度设3个平行孔)用作12h，空白组和模型组孔进行换液，12h后再加入模型组给予30μmol/L Aβ_1-42，继续培养24h，在倒置显微镜下对细胞形态进行观察并拍照。

1.5细胞凋亡测定

细胞以10⁵cell/mL的密度将细胞接种于6孔板，细胞贴壁后加入25、50、100μg/mLHS作用12h，12h后再加入模型组给予30μmol/L Aβ_1-42，继续培养24h，用不含乙二胺四乙酸的胰酶进行消化，消化后1000r/min离心5min，弃去上清，用冷的PBS漂洗细胞2次，按照AnnexinV-FITC凋亡试剂盒进行检测，加入适量的1ⅹAnnexinV-FITC结合液重悬计数，调节细胞浓度为10⁶cells/mL，细胞悬液中加入20μg/mL AnnexinV-FITC染色液5μL，轻轻混匀后，于4℃避光孵育15min，再加入5μg/ml碘化丙啶(PI)染色液10μL，轻轻混匀，在于4℃避光孵育5min，用BD流式细胞仪进行测定，测定波长488nm，每个样品计算10⁴cells。通过流式细胞仪测出正常细胞、凋亡细胞以及凋亡晚期和坏死的细胞占所有细胞总数的比例。

1.6总蛋白的提取及定量

1.7 Western-blot分析

(1)SDS-PAGE电泳

(2)转膜

(3)封闭

(4)一抗结合

(5)二抗结合

(6)洗膜显影

(7)数据分析

1.8酶联免疫吸附试剂盒分析测定肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)

1.9 HS对Aβ_1-42体外寡聚体的形成的影响

精密称取Aβ_1-42 5mg，溶于无菌的PBS溶液中，混匀后过无菌0.22μm滤膜。将过滤的Aβ_1-42溶液分装于6支无菌离心管内，其中三支加入无菌HS溶液37℃孵育，分别在孵育的第1，3，5天取出两支离心管透射电镜下拍照观察。

负染色制样：以铜网正面吸附样品1min，吸除载网上过量的样品，将载网正面贴附于2％磷钨酸(pH 6.8)2min，然后吸去载网上多余的染料，室温干燥。在透射电镜下观察拍照记录。

1.10统计学分析

用SPSS Statistics软件进行one-way anova统计学进行统计，p<0.05视为显著性差异。

2.实验结果

2.1 HS二糖组成及比例

表1 HS结构式及其二糖组成

根据表中的结果可以得出其二糖比例为：

D2S6:D0S6/D2S0:D2A6:D0A6/D2A0:D0S0:D0A0为5:2:85:1:6:9。

2.2细胞毒性的测定

图1MTT结果显示，12.5,25,50,100,200,400μg/mL的HS给药组与空白组细胞凋亡率无显著性差异，这表明HS对神经细胞SH-SY5Y没有毒性作用。

2.3细胞活力测定

如图1所示，单独对神经细胞SH-SY5Y细胞给予Aβ_1-42刺激，细胞的存活率明显的下降，模型组的存活率仅达到72％，HS给药组依次从高浓度400μg/mL低浓度12.5μg/mL的存活率分别为83％±0.06，88％±0.02，91％±0.03，85％±0.03，91％±0.03，72％±0.06。其中，200，100，25μg/mL均有显著的(P<0.05)提高细胞的活力作用。

2.4细胞形态的变化

从图2中可以看出，空白组的SH-SY5Y细胞呈梭形，细胞有细丝；模型组细胞形态多呈圆形，无细丝。提前给予HS后，细胞形态没有显著性的变化。这说明，HS能够预防Aβ_1-42对神经细胞SH-SY5Y的细胞形态造成的损伤。

2.5细胞凋亡测定

细胞凋亡是Aβ诱导神经细胞损伤的主要方式之一。为了研究HS是否能够抑制Aβ对神经细胞诱导的凋亡，本实施例采用AnnexinV-FITC凋亡试剂盒进行检测。由图3可以看出，30μmol/LAβ_1-42能够诱导细胞的凋亡，凋亡率为12.24％±0.62。提前给予HS处理，能够显著性的抑制凋亡现象的发生，由图可以看出，50，100μg/mL的HS的凋亡率下降到4.52±1.28％，5.77±0.95％(P<0.05)。由以上结果可以推测出HS可以明显的抑制Aβ_1-42对神经细胞SH-SY5Y产生的细胞凋亡。

2.6 HS对Aβ_1-42诱导SH-SY5Y神经细胞内炎症通路相关因子的水平变化的影响

神经炎症在AD的发生发展过程中起着至关重要的作用。炎症因子过表达会导致神经退行性变，炎症因子表达的上调也可促进AD的进展。

模型组中TNF-α和IL-6的含量与空白组相比显著性差异性升高((19.6±0.91vs3.2±0.49和7.98±0.01vs 2.78±0.008,p<0.0001)，这表明对给予Aβ_1-42处理能够对SH-SY5Y细胞造成损伤。给予HS能够明显降低炎症因子TNF-α、IL-6的水平(6.7±0.18和2.96±0.019,1.73±0.024，p<0.0001)。

根据灰度值分析，可以看出模型组的MMP2、MMP9、TLR4和PJUN的水平均显著升高(1.43±0.120vs 0.56±0.109、0.47±0.036vs 0.31±0.032、1.12±0.121vs 0.63±0.059和1.26±0.116vs 0.80±0.042)，HS处理能够降低MMP2、MMP9、TLR4和PJUN的水平。

2.7 HS对Aβ_1-42诱导SH-SY5Y神经细胞凋亡相关蛋白表达量变化的影响。

Aβ_1-42能够诱导SH-SY5Y神经细胞Caspase 8,9、Bax水平的升高(0.45±0.041vs0.28±0.012和1.18±0.220vs 0.39±0.049)，降低Bcl-2(0.69±0.047vs 1.03±0.088)的水平。此结果与流式细胞术检测凋亡结果一致。表明Aβ_1-42能够诱导细胞的凋亡。给予SH-SY5Y神经细胞HS处理，能够改善凋亡相关因子水平的异常，进而抑制细胞的凋亡。

2.8 HS对Aβ_1-42体外寡聚体的形成的影响。

从透射电镜结果可以看出，Aβ_1-42单独孵育5天内其形态并没有太大的差异，均为结构较为疏松的细丝状的寡聚体结构，然而Aβ_1-42与HS(25μg/mL)共同孵育则发现在第三天其结构转变为结构较为致密的聚集沉淀，此时其状态不再是寡聚体，而是转变成纤维体。寡聚体在脑内具有较强的神经毒性，能够影响神经突触的传导，阻止离子通道的形成，破坏细胞的膜结构，促进神经细胞的凋亡等。将HS与Aβ_1-42共同孵育能够将Aβ_1-42由毒性较强的寡聚体转变为毒性较小的纤维体，进而减小Aβ_1-42在体内的毒性。

Aβ_1-42在体外能够诱导SH-SY5Y细胞发生一些病变，包括影响神经细胞轴突的延长，细胞活力降低，同时也能升高细胞胞体发生炎性发应，进而诱导神经细胞的凋亡。从以上的研究结果在体外的AD模型中，HS能够抑制Aβ_1-42对神经细胞形态的损伤，增强细胞的活力，降低细胞的凋亡。为了研究HS是如何发挥作用的，从细胞因子水平上研究发现HS能够降低细胞的炎性因子TNF-α和IL-6水平，调节炎症相关通路的MMP2，MMP9，TLR4，PJUK的水平。同时调节凋亡因子Caspase 9，Bax，Bcl-2的水平。为了研究HS是否能够影响Aβ_1-42寡聚体的形成，将两者溶于PBS,37℃条件下共同孵育，发现，硫酸乙酰肝素能够促进Aβ_1-42由毒性较强的寡聚体转变为毒性较弱的纤维体。因此推测HS能够将Aβ_1-42寡聚体转变为纤维体，通过改变Aβ_1-42的聚集形态来降低Aβ_1-42的神经毒性，降低了Aβ_1-42诱导产生的炎症反应，抑制了神经细胞的凋亡。

本实施例证明了HS在体外模型中能够抑制Aβ_1-42对SH-SY5Y诱导产生的神经毒性，HS能增强神经细胞的活力，降低神经细胞的炎症反应，进而降低SY5Y细胞的凋亡。

实施例2

1.实验方法

1.1动物分组与给药方法

实验小鼠购得后适应五天后，根据水迷宫实验结果进行分组。此次水迷宫不撤掉平台，根据小鼠找到平台得时间长短进行分组，确保每个实验组组内小鼠寻找平台时间的均值一致。分为空白组、假手术组、模型组、低剂量组(25m/kg)、中剂量组(100m/kg)和高剂量组(400m/kg)每组八只。每天灌胃1次，给药组分别按照0.1mL/10g体重灌胃，实验流程见图8。

1.2模型制作

小鼠灌胃两周后，进行侧脑室注射进行造模手术。给药组和模型组小鼠进行侧脑室注射Aβ_1-42进行造模。用瑞沃德麻醉机对小鼠进行麻醉后将其固定在脑室定位仪上，对小鼠进行剃毛，剪开小鼠头顶皮肤，消毒后将前卤暴露，根据脑室定位仪进行定位，找到注射位点：前卤后侧0.5mm，左右两侧1.0mm，深度为颅骨表面向下2.5mm处(AP-0.5mm；ML±1.0mm；DV-2.5mm),每只小鼠注射5μL，恒速注射3min，留针5min后将注射器缓缓拔出，消毒后缝合皮肤。假手术实验组操作与模型组一致，仅仅注射同样体积的无菌生理盐水。术后小鼠休息三天后，继续给药一周，进行水迷宫实验和旷场实验。测试实验结束后，将小鼠断头取脑，分离出皮质和海马区，称量重量，-80℃冻存样品。

1.3行为学检测：Morris水迷宫实验(MWM)和旷场实验(OFT)

1.4 Aβ_1-42、TNF-α、IL-6酶联免疫吸附试剂盒检测

1.5免疫组织化学

1.6小鼠海马超微结构的改变

1.7总蛋白的提取定量

1.8 Western blot分析

1.9 HS小鼠体内组织分布

取空白小鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑组织，分别称取。

通过将连接荧光探针FITC的HS灌胃给予小鼠，分别在给药后的0、0.5、1、2、4、6、8、12h分别将小鼠脱臼处死，避光情况下取心肝脾肺肾胃肠脑组织及血。匀浆后在测荧光吸收。根据标准曲线算出各组织的荧光吸收值。

1.10小鼠外周Aβ_1-42水平的变化

为了研究小鼠在给药期间外周Aβ_1-42水平的变化，实验设计如图9，实验分为空白组，假手术组，模型组和给药组(HS-25mg/kg)四组。每组8只。给药组给药两周(0天-14天)，分别在给药第1、4、7、10、13天对小鼠进行断尾取血。在第16天进行造模手术。手术后小鼠休息3天，在第20天到27天继续灌胃HS，并且在20、22、24、26、28、30天进行断尾缺血。第30天取血后脱臼处死，取全脑。具体断尾取血的操作方法是：将小鼠方法小鼠固定器中，用手将小鼠尾巴捂热，用手术剪刀剪掉小鼠尾巴10mm，用EDTA-2Na封闭的离心管收集血液。

将所取得的血液4℃ 12000r/min离心15min。取上清血浆，用试剂盒检测小鼠外周血浆中Aβ_1-42的含量。

1.11统计学处理

实验结果采用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析，组间比较采用LSD进行组内两两比较，数据以mean±S.D表示，p<0.05或p<0.01时表示差异有统计学意义。

2.实验结果

2.1行为学检测结果

2.1.1水迷宫实验

实验结果如10所示：在定向航行实验，与空白组相比，模型组从第二天开始逃避潜伏期明显延长；与模型组相比，HS中、高剂量能显著缩短到逃避潜伏期，在定向航行试验的第五天低剂量组与模型组相比，逃避潜伏期有显著性差异。模型组与空白组与假手术组相比，在目标象限的时间明显减少，HS-100mg/kg与模型组相比有显著性差异。定向航行试验和空间探索实验各组小鼠的游泳轨迹可以看出，空间探索实验中，模型组小鼠在目标象限所占的比例相对于空白组有很明显的减小，而给药组相对于空白组无显著性差异。

2.1.2旷场实验

由旷场实验的实验结果可以看出，各组之间的小鼠行走的总路程并没有显著性差异，这说明小鼠侧脑室注射并没由对小鼠的运动机能造成影响。

2.2皮质和海马区HE染色实验结果

图12显示，空白组和假手术组小鼠皮质区神经细胞形态完整，细胞染色均匀。模型组小鼠大脑皮质区细胞出现大量细胞核固缩且染色不均匀的现象，低剂量组与高剂量组细胞形态正常。海马CA1区空白组和假手术组细胞排列整齐且较为紧密，模型组细胞排列疏松，排列较为紊乱，大量的细胞出现细胞核固缩的现象且有棕褐色色素沉淀。给予HS处理的小鼠，海马CA1区细胞较为正常，并没有出现细胞形态异常的现象。

2.3小鼠海马超微结构的改变

由图13可以看出空白组和假手术组细胞核膜完整，胞质致密，内质网，线粒体能细胞器结构正常。模型组细胞开始出现核变化，核膜内陷，胞质稀疏，胞浆空泡化。给药组HS-100mg/kg和HS-400mg/kg细胞未见任何异常现象。

2.4炎症因子水平的影响

经ELISA分析，可以看出小鼠侧脑室注射Aβ_1–42后小鼠海马区的TNF-α和IL-6均与空白组和假手术组有显著性增加。给予HS后能够降低小鼠海马区的TNF-α和IL-6的水平。

经Western-blot分析，可以看出小鼠侧脑室注射Aβ_1–42后小鼠海马区的TLR4(p<0.01)，以及NF-kB(p<0.05)和JNK(p<0.001)的磷酸化水平均与空白组和假手术组有显著性差异。给予HS后能够降低TLR4、pNF-kB和pJNK的水平。

2.5凋亡因子水平的变化

经Western-blot分析，可以看出小鼠侧脑室注射Aβ_1–42后小鼠海马区的Caspase3、8和Bax均与空白组和假手术组有显著性增加。给予HS后能够降低Caspase 3、8和Bax的水平。

2.6 PGSK和Ptau蛋白水平的变化

小鼠侧脑室注射Aβ_1-42能够诱导小鼠海马区的GSK3α/β(216，279)磷酸化水平增加，激活tau蛋白的磷酸化，进而诱导小鼠脑部神经细胞的凋亡，引起神经紊乱。给予小鼠HS，能够抑制GSK3α/β的活性，减轻Aβ_1-42对小鼠脑部神经的损伤。

2.7 HS体内分布

根据行为学发现，HS能够改善Aβ_1–42对小鼠诱导的脑损伤，并且能够抑制小鼠海马组织凋亡相关因子及炎症因子水平的改变。故为了进一步探究HS是否能够跨过血脑屏障进入小鼠脑部发挥作用，将HS与FITC通过化学方法将其连接，灌胃，对不同时间点的小鼠各个器官的荧光值分析发现，HS并不能透过血脑屏障，而是经过胃一部分通过肠排泄，一部分通过肾脏排泄。在体内12h后主要分布于脾脏、肾脏和血液中。有文献曾经报道脑部的毒性较强的可溶的Aβ_1–42可以透过血脑屏障到达外周，结合本次实验结果，提出假设HS不能透过血脑屏障可能是其在外周循环中发挥药效。实施例1透射电镜结果也证明HS能够将毒性较强的Aβ_1–42寡聚体转变成为毒性较弱的纤维体。故推测HS在小鼠体内药物作用的部位是外周。

2.8 HS对小鼠外周Aβ_1–42水平的影响

在给药期间，为了研究在HS给药期间多小鼠外周Aβ_1–42水平的影响，对小鼠采用断尾取血的方式，采用ELISA实时监测Aβ_1–42含量。由图19折线图可以看出在给药的第一天，HS给药组小鼠外周的Aβ_1–42水平低于空白组，假手术组和模型组。造模后一周后，模型组Aβ_1–42水平明显高于其他三组，HS组外周Aβ_1–42水平仍然处于最低水平。这表明HS对外周的Aβ_1–42有一定的清除功能。在给药HS三周后，在月末对小鼠进行脱臼取脑。对小鼠脑部Aβ_1–42进行检测，发现与假手术组相比模型组小鼠脑部Aβ_1–42有显著性升高，给小鼠灌胃HS，外周血浆中Aβ_1–42水平减少。推测是HS虽然不能透过血脑屏障，但是在外周能通过减少外周Aβ_1–42水平，进而减少小鼠脑部的Aβ_1–42水平，减少脑部损伤，改善小鼠认知损伤。

2.9 HS对小鼠外周循环中单核细胞和中性粒细胞各亚群的比例的影响。

Aβ_1–42能够激活单核细胞，增加F4/80⁺/CD11b⁺亚型的比例，引起炎症反应。但是对中性粒细胞影响较小。给予HS后，能够降低Aβ_1–42对单核细胞的激活。并且可以看出不给予HS处理时，Aβ_1–42主要由单核细胞吞噬清除，给与HS后，Aβ_1–42主要被中性粒细胞清除。Aβ_1–42能够降低白细胞NO水平，增加TNF-α的水平。

2.10 HS对外周循环中Aβ_1-42清除的影响

流式结果显示，给予HS处理能够降低单核细胞F4/80⁺/CD11b⁺亚型和中性粒细胞CD11b⁺/LY6G⁺亚型的比例。这表明HS能够降低外周循环中的炎症反应。同时给予HS组对Aβ_1-42的吞噬清除能力相对于模型组多。

实施例1的实验结果证明HS在体外AD模型中能够增强神经细胞的活力，抑制Aβ_1–42对神经细胞带来的损伤，如降低神经炎症因子水平，减少细胞凋亡。同时还发现HS与Aβ_1–42共同孵育能够改变减少寡聚体的状态，将寡聚体转变为毒性较弱的纤维体。

为了进一步研究HS在小鼠体内的活性，本实施例采用小鼠侧脑室注射Aβ_1–42进行造模。通过水迷宫实验和旷场实验对小鼠的认知功能进行评估发现，小鼠侧脑室注射Aβ_1–42能够使小鼠产生认知障碍，表明此方法能够模拟阿尔兹海默症的病理过程。给小鼠灌胃HS后，在定向航行试验中，小鼠的逃避潜伏期明显缩短，在最后一天的空间探索实验中发现，与模型组相比，给药组小鼠在目标象限的时间也明显升高。证实了HS在小鼠体内能够发挥改善小鼠认知损伤的作用。

本实施例中将HS与荧光素FITC连接，通过小鼠各组织的荧光值判断HS在小鼠的体内分布，发现HS并不能透过血脑屏障直接到达脑部发挥作用，而是在外周循环中发挥抗AD活性的。有文献报道，脑内的Aβ_1–42能够透过血脑屏障到达外周，实现脑部与外周的循环。通过荧光分布发现HS大部分位于肠部肾脏与外周血，通过ELISA检测方法，对灌胃HS期间对小鼠外周Aβ_1–42水平进行了实时检测，发现HS能够减少外周Aβ_1–42的含量，在减少外周Aβ_1–42含量的同时，小鼠脑部的Aβ_1–42的含量也有所减少。

结论如下：

(1)小鼠的行为学检测结果显示，侧脑室注射Aβ_1–42能够诱导小鼠的认知障碍，给予HS后，低、中、高三个剂量在一定程度上均有一定的改善小鼠学习认知障碍。

(2)侧脑室注射Aβ_1–42能够引起小鼠脑部炎症因子TNF-α、IL-6水平升高，引起凋亡因子Caspase 3、Bax水平升高。经HS干预后，能够降低小鼠脑部炎症因子TNF-α、IL-6的水平，同时降低凋亡因子Caspase 3、Bax水平。从而发挥着对小鼠大脑有一定保护作用。

(3)HS虽不能进入脑部直接发挥作用，但是其可以在外周通过减少外周Aβ_1–42水平间接减少脑部Aβ_1–42水平，进而发挥着改善小鼠认知损伤。

(4)HS能够增加外周中性粒细胞对外周循环中Aβ_1–42的吞噬作用。但是HS给药组的中性粒细胞对大肠杆菌的吞噬能力并没有明显的增强。故得出HS可能在外周循环中作为一种沉淀剂，促进Aβ_1–42寡聚体转变为纤维体，进而减少在外周的浓度，减弱其在外周循环中引起的炎症反应，进而减少脑部Aβ_1–42的浓度和炎症反应，间接对脑部神经起到保护作用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.硫酸乙酰肝素在制备预防/或治疗阿尔兹海默症产品中的应用。

2.一种产品，其特征在于，所述产品活性成分包括硫酸乙酰肝素。

3.如权利要求2所述产品，其特征在于，所述产品具有预防和/或治疗阿尔兹海默症的作用，具体的，其具有如下任意一种或多种用途：

(a)提高神经细胞活力；

(b)预防Aβ_1-42对神经细胞的细胞形态造成的损伤；

(c)抑制Aβ_1-42对神经细胞产生的细胞凋亡；

(d)降低神经细胞炎症因子水平；

(e)将Aβ_1-42由毒性较强的寡聚体转变为毒性较小的纤维体，进而减小Aβ_1-42在体内的毒性；

(f)改善因Aβ_1-42导致的施用对象学习认知障碍；

(g)降低因Aβ_1-42导致的施用对象海马区炎症因子水平的升高；

(h)减少外周Aβ_1-42水平；

(i)增加外周中性粒细胞对外周循环中Aβ_1-42的吞噬作用；

(j)保护施用对象大脑。

4.如权利要求3所述的产品，其特征在于，所述应用(d)中，所述炎症因子包括但不限于TNF-α,IL-6；

所述应用(g)中，所述炎症因子包括但不限于TNF-α,IL-6。

5.如权利要求3所述的产品，其特征在于，所述施用对象是人和非人哺乳动物。

6.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述非人哺乳动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴和猩猩。

7.如权利要求3所述的产品，其特征在于，产品为药物。

8.如权利要求7所述的产品，其特征在于，所述药物的活性成分包含硫酸乙酰肝素；或者包含其它至少一种用于具有预防和/或治疗阿尔兹海默症作用的物质。

9.如权利要求7所述的产品，其特征在于，所述药物进一步还包含药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂。

10.硫酸乙酰肝素在制备如下任意一种或多种产品中的应用：

(1)MMP2抑制剂；

(2)MMP9抑制剂；

(3)TLR4抑制剂；

(4)pNF-κB抑制剂；

(5)PJUN抑制剂；

(6)TNF-α抑制剂；

(7)IL-6抑制剂；

(8)Caspase 3抑制剂；

(9)Caspase8抑制剂；

(10)Bax抑制剂；

(11)GSK3α/β蛋白抑制剂；

(12)Tau蛋白抑制剂。

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