JP5749651B2 - 多形核細胞の動員および/または遊走を減少させる化合物および方法 - Google Patents
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Description
材料および方法
動物
B&K Sollentuna社、ストックホルム、スウェーデンから入手したメスのBalb/cマウス(8週)を実験に使用した。マウスに完全ペレットげっ歯類食、R36(Laktamin AB社、ストックホルム、スウェーデン)および家庭飲用品質の水を適宜給餌した。動物は、動物飼育室で21℃、±3℃および55%±15%の相対湿度で飼育した。換気システムは1時間当たり10換気を与えるように設計した。部屋は、12時間の明サイクルおよび12時間の暗サイクルを与えるように照明した。明かりは07:00から19:00まで点灯した。マウスは、透明なポリカーボネート(Macrolone型III)ケージ(床面積:820cm2)で各ケージに5匹ずつ飼育した。ケージの床敷は4HVアスペン床敷(Tapvei社、フィンランド)であった。各ケージは、試験番号、群番号、性別および動物番号がマークされたケージカードにより識別した。
マウスは、0および12日目に200μL OVA/水酸化アルミニウムゲル(1:3)で腹腔内感作した(図1a)。OVA(鶏卵アルブミングレードV、Sigma社、セントルイス、MO)を生理食塩水で溶解し、および4℃で3時間回転させて50μg/mLの濃度まで水酸化アルミニウムゲルと混合した。23、26、30および33日目(図1a参照)に、マウスにBatelle曝露チャンバーを用いて30分間エアロゾル化OVAを吸入して肺で曝露した。エアロゾルは、PBSに溶解した10mg/mL OVA(Sigma社、セントルイス、MO、USA)のネブライザー濃度を用いて気流7.4L/分で圧縮空気ネブライザー(Collison 6ジェット)により生成した。非感作動物による対照群は、23、26、30および33日目のエアロゾル化OVA以外の処理は受けなかった。エアロゾルチャレンジを受けなかった感作マウスの対照群もあった。
このOVAモデル(図1a)では、選択したオリゴヌクレオチド、IDX9059、(配列番号8、表1)を試験した。オリゴヌクレオチドはbiomers.net GmbH社(ウルム、ドイツ)により合成され、および−20℃で冷凍保存された。
免疫調節オリゴヌクレオチドを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、Fluka Biochemika Ultra、Sigma Aldrich社、セントルイス、USA)に溶解した。
この実験では、予防的設定で(図1a)16および21日目にIDX9059(1,247μg/μL)の鼻腔内注入を与えた。物質は、約50μg/マウス(49.88μg/マウス)の用量を与える40μL PBSで投与した。2つの感作偽治療群は、16および21日目に試験化合物と同じ合計容積をPBSで注入した。
マウスを、最終OVAエアロゾルチャレンジの42時間後に頸椎脱臼により屠殺した。気管にポリエチレン管(Becton Dickinson社、スパークス、MD、USA)によるカニューレを挿入し、4×1mLアリコートの氷冷ハンクス平衡塩液(HBSS)(Sigma社、セントルイス、MO、USA)を用いて気管支肺胞洗浄(BAL)を行った。BAL液を遠心分離し(400g、10分、4℃)、上清を回収、および後の分析用に冷凍した。細胞を0.4mL PBSに再懸濁し、白血球総数をBuerkerチャンバーでトリパンブルー除外を用いてカウントした。BAL液細胞の二重のサイトスピン(サイトスピン3、Shandon社、ランコーン、UK)調製物を、標準の形態学的基準を用いた白血球画分のためMay Gruenewaldギムザ染色で染色した。
統計比較は、感作PBS処理した対照マウスと比較するため、Dunnettの事後補正を用いて一元配置分散分析(ANOVA)を用いて行った(GraphPad Prism4)。データは平均±標準偏差として示した。0.05より低いP値を有意と見なした。
オボアルブミン誘発アレルギー性喘息モデルは、喘息中に見出される気道好酸球、肺内炎症およびIgEレベルの上昇を再現するのに広範に使用されるモデルである。このモデル分析は、浸潤炎症細胞の種類および量がそれぞれ特定およびカウントされるBAL分析などの喘息の一般的指標に依存している。
材料および方法
細胞遊走および血管透過性に対する本発明の実施形態によるオリゴヌクレオチドの効果を試験するため、動物モデルを設定した。
チオグリコレート誘発胸膜炎モデルは、開発中の新薬の実用的なスクリーニングのための最適モデルの一つであるが、該モデルは技術的に複雑であり、および時として個々の異なる値を示す場合がある。しかし、このモデルは、同時に試験できる動物の数が限られる。
マウスにおける白血球の血管外遊出に対するオリゴヌクレオチドIDX9059(配列番号8、表1)のin vivo、抗炎症効果を調べた。走化性刺激に反応して、炎症細胞は刺激勾配に向かって血管壁を遊出する。遊出には、細胞は先ず断続的に血管内壁に接着し(すなわちローリング(R))、この後よりしっかりと接着し始め(接着(A))、次いで周囲組織に移動し(遊出(T))なければならない。血小板活性化因子(PAF)を使用してこの炎症プロセスを誘発した。正常な非刺激血管では、これらのイベントの順序はR>A>Tであった。PAFへの曝露後、この順序はT>A>Rと逆転し、細胞が接着および遊出し始めたことを示した。
白血球動員は炎症反応の必要条件である。血管では、白血球細胞と内皮との間の一連のイベントが、損傷または炎症部位での炎症細胞の蓄積をもたらす(Lindbom、1983年)。このイベントカスケードにおける1つの重要な細胞は多形核細胞(PMN)である。PMNは血流で輸送される。血流は血管の中心でより高い速度を、周辺へ向かってより低いスピードを有し、PMNと血管壁との間の接触を可能にする。分子機構は内皮へのPMNの接着を促す(Penberthyら、1997年)。このような分子の1つの群はセレクチンと呼ばれる。最初は、この相互作用は部分的に過ぎず、内皮に沿ってPMNを回転させる。炎症誘発性分子により刺激され、この接着はより強固になり内皮へのPMNの接着(固着と呼ばれる現象)を引き起こす。固着は、PMNが内皮層を積極的に遊出および続いて結合組織へ進入できるようにし、さらに炎症因子の勾配により炎症の中心部に向けられる。
動物材料および条件:Scanbur AB社(ソレントゥナ、スウェーデン)製のC57BL/6 SPFマウスは、各12時間の明暗サイクルにより管理温度(21±2℃)で動物飼育室で飼育し、および食餌および水に自由にアクセスできるようにした。
遊出するには、細胞はローリングを開始し、この後、よりしっかりと接着し始め、次いで周囲組織に遊走する。血小板活性化因子(PAF)を用いてこの炎症プロセスを誘発し、正常な非刺激血管では、これらのイベントの順序はR>A>Tであった。化学誘引物質(PAF)の非存在下では、配列番号8[IDX9059]はローリングを81.4%および接着を41.9%減少させることができた(図3a)。
試験の目的は、脳虚血の実験ラットモデルにおいて、虚血性脳傷害に対する免疫調節オリゴヌクレオチドによる阻害効果を調べることであった。動物試験は、Facility for Division of Experimental Vascular Research、Department of Clinical Sciences、ルンド大学、ルンド、スウェーデンで行われた。
虚血損傷に対する耐性は、心臓、脳、および腎臓などのさまざまな器官でTLR4を介したLPSにより誘発され得ることが示されている(Heemannら 2000年、Rowlandら、1997年;Tasakiら、1997年)。保護機構は十分に理解されていないが、パラダイムは、LPS−プレコンディショニングによる小さな炎症反応が、より強力な続発性刺激を伴う炎症反応のこの後の損傷を軽減する、というものである。既知のTLRシグナル経路の間には類似点および違いの両方があり、免疫系および中枢神経系の幾つかの細胞によりTLR4およびTLR9の両方が発現される(McKimmie and Fazakerley 2005年;Tangら、2007年)。したがって、CpGオリゴデオキシヌクレオチドは、選択された細胞集団内でTLR9の活性化を引き起こして、先天性免疫を促しTh1偏向適応免疫を誘発すると考えられる。
動物材料および条件:使用したラットは、Harlan Horst社(オランダ)から入手した近交系ウィスターハノーバーラットであった。各ラットの体重は約350〜400グラムであった。ラットは、タイプMacrolon3の標準的なオープンケージで維持した。ケージは、プラスチックカーテンの後ろの連続気流下のオープンラックに収容した。標準的な床敷はScanbur−BK社(ソレントゥナ、スウェーデン)から購入した。床敷は週に1回交換した。動物飼育室の温度は18℃〜22℃であり、実験室の周囲換気システムにより管理した。明サイクルは12時間の暗および12時間の明(06:00に点灯)であった。
特定のオリゴヌクレオチドによる虚血性細胞死に対する耐性の誘発を、ウィスターハノーバーラットでの脳虚血in vivoモデルにおいて調べた。
この試験の目的は、単離、灌流されたラット心臓モデルにおける虚血性心臓傷害に対する免疫調節オリゴヌクレオチドの阻害効果の可能性を調べることであった。動物試験はUlleval大学病院動物部門(オスロ、ノルウェー)で行った。
冠再灌流の短時間のエピソードにより心筋再灌流を遮断して心筋梗塞サイズを減少させる能力は、虚血ポストコンディショニング(I Post)と呼ばれる現象である心臓保護の標的として再灌流段階での関心を集めている。虚血ポストコンディショニング−誘発保護機構は十分に理解されていないが、酸化ストレスの減少、細胞間Ca2+過負荷の減少、内皮機能の改善、およびアポトーシス心筋細胞死の軽減による、致死的再灌流傷害の重要なメディエーターを標的にする手順が示されている(Yellonにおけるレビュー)。
動物材料および条件:Scanbur AS社(ニッテダル、ノルウェー)から入手したオスのウィスターハノーバーラットをこの実験で使用した。ラットはUlleval大学病院の中央動物小屋で飼育した。適正に許可され教育を受けた人がラットを扱った。福祉に関して毎日記録を取った。各ラットの体重は約250〜350グラムであった。ラットは2つの実験群に無作為に割り付けた(試験および対照、各群n=8)。
IDX9059による虚血細胞死への耐性誘発を、単離ラット心臓のex vivoモデルで調べた。材料および方法に記載の通り、心臓を切除し、Longendorffモードで灌流し、虚血および再灌流エピソードにさらした。TTC染色後、心臓を切片化し、各切片を撮影し画像プログラムで分析した(方法参照)。左心室の梗塞損傷は、PBS(ビヒクル対照)で治療したラットと比べて、IDX9059で治療したラットで35%の減少を示した(図5)。再灌流中の心臓機能のさまざまな側面も調べたが、IDX9059治療動物対対照では機能データに有意な差は観察されなかった(データ不図示)。
要約
腸虚血は、腸間膜動脈閉塞によりマウスで誘発した。再灌流後、小および大腸、ならびに肺に対する傷害を評価した。
試験化合物
化合物はすべて貯蔵液として−20℃で保存し、および実験開始の2〜3日前に調製した。
オリゴヌクレオチドを、室温でPBS(Fluka Biochemika Ultra、Sigma Aldrich社、セントルイス、USA)にさらに希釈した。濃度は、所望の濃度に達するまで、95%精度でUV分光光度法(SmartSpec(商標)3000、BIO−RAD社、ハーキュリーズ、USA)を用いて調節した(InDex SOPB015)。
動物部門(Animal Department)
MTC動物部門はカロリンスカ研究所獣医学部により監視および監督されている。動物部門は質の高い動物施設を維持するため日常の仕事を定めている。動物試験は、非GLP認定学術研究所で実施された。
メスのBalb/cJ SPFマウス、10〜30週齢、(Jackson Laboratory(バーハーバー、メイン州、USA)由来はカロリンスカ研究所MTCのCFGR部門(ストックホルム)で飼育した)。動物をグループ化しおよび実験開始の少なくとも1週間前に順化を許可した。動物は、1年に最低2回、FELASA規則(5)による試験を受けた監視員とともに飼育した。
動物は、動物飼育室で21℃±3℃、および55%±15%の相対湿度で飼育した。換気システムは1時間当たり10換気を与えるように設計してあった。部屋は、12時間の明および12時間の暗のサイクルを与えるように照明した。明かりは06:00から18:00まで点灯した。
ケージの床敷はScanbur Bedding(Scanbur AB社、ソレントゥナ、スウェーデン)であった。
環境エンリッチメントのため、動物にSizzleネストまたはHappi−Mat、(Scanbur AB社、ソレントゥナ、スウェーデン)の供給を与えた。
完全ペレットげっ歯類食、R36((Lantmaennen社、Kimstad、スウェーデン)を適宜供給した。動物は、家庭用品質の飲用水を備えた飲用ボトルに自由にアクセスした。
各ケージは、試験番号、群番号、および性別がマークされたケージカードにより識別した。動物は、パーマネントインクフェルトペンを用いて、動物番号に対応する横線で尾に個別にマークした。
虚血誘発および再灌流
マウスをイソフルラン(Forene(登録商標)、Abbott Scandinavia AB社、ソルナ、スウェーデン)で麻酔し、この後外科麻酔(Univentor400 麻酔ユニット、AgnTho’s AB社、Lidingoe、スウェーデン)で維持し、体温を37℃に維持する直腸サーミスタにより制御された熱電対温度計(Pharmacia AB社、ウプサラ、スウェーデン)に制御された加熱パッドの上に置いた。オペレーティング外科用実体顕微鏡(Leitz Wild社、ヴェッツラー、ドイツ)を用いて腹部に4〜5cm長の切り込みを作り、頭側(上)腸間膜動脈の位置を特定した。微小血管クランプ、Biemerクリップ、締めつけ力0.20〜0.25N、Aesculap−Werke AG社、チューリンゲン、ドイツ)を、血流を完全に閉塞(脈動の欠如および青白さにより示唆される)するように動脈の上に置いた。腹部を閉じ、生理食塩(0.9%(w/v-1 NaCl)溶液で浸したガーゼパッドを腹部の上に置いた。血流は15分後に回復した(血管での脈拍および赤みにより示唆される)。腹部を留め金または外科縫合で閉じた。マウスに2mL滅菌生理食塩水をs.c.に与えて生理学的状態を維持した。Buprenorphin(Temgesic(登録商標)、Schering−Plough Corp.社、ニュージャージ、USA)、0.05〜0.1mg/kgを鎮痛のため与えた。3時間後、動物を麻酔し、血液を眼窩神経叢から採取した。組織学的検査および他の検査のため、試料を腸および肝臓から採取した。
50μg/100μL IDX0150の皮下(s.c.)注射を、虚血誘発の20分前または再灌流の開始直後に動物の頸部に与えた。
各マウスは殺傷まで定期的に観察した。疾患、健康およびいずれかの挙動変化のすべての徴候を記録した。
炎症効果は炎症採点システムを用いて格付けした。腸の赤み:正常0、やや赤い1、赤い2、非常に赤い3;腸液:正常0、わずか1、多い2;動物の挙動:機敏0、不活発2。
肺および小腸(100〜200μg)は、腸虚血および再灌流傷害を施した、IDX0150およびPBS治療マウスから回収した。組織を、5mM EDTA(Sigma Aldrich社)およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma Aldrich社)を含有する1ml RIPA緩衝液(Sigma Aldrich社、セントルイス、MO、USA)中Disperser T10(IKA(登録商標)−Werke GMBH & Co.KG社、シュタウフェン、ドイツ)を用いて30秒間氷上でホモジナイズした。試料をこの後、氷上で30分間インキュベートした後、残屑は、2ラウンドの遠心分離、10,000×g、10分間、4℃によりホモジネートから除去した。上清を回収し、等分し、および後のミエロペルオキシダーゼ(MPO)測定用に−70℃で冷凍した。MPOは、MPO ELISAキット(Hycult biotechnology社、ウーデン、オランダ)を用いて製造者の指示に従いホモジネートにおいて分析した。
虚血は、不活発および毛がけば立っているように見える重度の炎症反応を誘発した。剖検すると腸は体液を含んで肥大化し、および炎症を起こしていた(図6a)。IDX0150治療動物では、腸は炎症が少なかった(図6b)。採点システムにより、炎症を起こした動物はスコアが6.5であり、IDX0150治療をi.pで受けた動物でのスコアの低さと対照的であった(図6c)。
序論
IL−8は、炎症中に好中球の動員および活性化に重要な役割を果たす強力な炎症誘発性サイトカインである。IL−8は、2つの異なる種類の受容体(CXCR1およびCXCR2)を介して好中球と反応する。IL−8への好中球の走化性は大部分がCXCR1(78%)により、残りがCXCR2により媒介される。好中球に対する別の強力な化学誘引物質は、好中球表面で発現した受容体BLT1に高親和性で結合するロイコトリエンB4(LTB4)である。この試験の目的は、本発明の化合物がCXCR1/2およびBLT1発現を減少できるか、およびこれによりPMN浸潤を減少させるかを調べることであった。
試験化合物
IDX9005、IDX9010、IDX9022、IDX9030、IDX9031、IDX9045、IDX9052、IDX9054、IDX9059、IDX9074、IDX9092、IDX9095、IDX9096およびIDX0150(配列番号1〜14、表1)を、健康な多形核細胞(PMN)でのCXCR1およびCXCR2表面発現に対するこれらの効果について調べた。本発明の化合物IDX9022、IDX9052、IDX9054およびIDX9059(配列番号3、14、7および8、表1)はさらに、健康なボランティア由来のPMNにおけるBLT1表面発現に対するこれらの効果について調べた。Avecia社(マンチェスター、英国)から注文したIDX0150を除いて、オリゴヌクレオチドはすべてBiomers.net(ウルム、ドイツ)により合成された。
オリゴヌクレオチドは、500μMの貯蔵濃度に達するようUV分光光度法(SmartSpec(登録商標)3000、BIO−RAD社、ハーキュリーズ、USA)を用いてリン酸緩衝生理食塩水(PBS、Invitrogen社、カールスバッド、CA)で調整し、および使用まで−20℃で保存した。
健康な血液ドナー由来の全血をPMNの調製に使用した。PMNは、Polymorphprep(商標)(Axis−Schield社、オスロ、ノルウェー)を用いて密度遠心分離により単離した。細胞を次いでさらにPBSで洗浄し、生存率および細胞数はトリパンブルー(Sigma Aldrich社、ストックホルム、スウェーデン)で細胞をカウントして判定した。この後、細胞は、10%加熱不活性化ウシ胎仔血清(FCS、Invitrogen社)を追加したRPMI 1640(Sigma Aldrich社)、2mM L−グルタミン、100 U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、10mM HEPES(Sigma Aldrich社)および5μg/mLゲンタマイシン(Invitrogen社)から成る完全細胞培地に再懸濁した。PMNは、0.5、10μMもしくは25μMの本発明の化合物、または総容量200μl/ウェルの陰性対照として培地単独とともに、濃度2×106細胞/mLで96ウェル培養組織プレート(Becton Dickinson、フランクリンレイクス、NJ)に培養した。細胞は、特に記載のない場合、5%CO2を有する加湿細胞培養インキュベーター(Thermo Scientific社、ウォルサム、MA)で37℃、3時間インキュベートした後、細胞を、下記の通りフローサイトメトリーを用いてCXCR1、CXCR2およびBLT1発現について分析した。
健康な血液ドナー由来のヒトPMNを、さまざまな時点(15分、30分、1時間、2時間および3時間)に、10μMのIDX9059(配列番号8、表1)または培地単独で刺激した。細胞をこの後回収し、各時点で2%パラホルムアルデヒドで固定化した後、下記の通りフローサイトメトリーによりCXCR1発現について分析した。
本発明の化合物とともにインキュベートした細胞を回収し、PBSで洗浄し、2%FCSを追加したPBSに再懸濁した。細胞は、蛍光色素標識マウスモノクローナル抗体(Becton Dickinson社、サンノゼ、CA、USA)を用いて4℃、30分間、CXCR1またはCXCR2またはBLT1とともに顆粒球マーカーCD66bを染色した。使用した抗体をアイソタイプマッチ対照(Becton Dickinson社)と比較した。PBSでの洗浄後、細胞をFACSarrayフローサイトメーター(Becton Dickinson社)により分析し、データはFACSarrayソフトウェアシステム(Becton Dickinson社)を用いて分析した。試料当たり最低15000ゲートPMNを分析した。
健康な血液ドナーから単離したPMNは、さらに3時間10μMの試験物質で刺激する前に、0.5、5および10μg/mlのクロロキン(Sigma Aldrich社)で30分間、37℃で前処理した。CXCR1およびCXCR2の表面発現を、次いで上記の通りフローサイトメトリーにより分析した。
PMNの走化性は、QCM(商標)3μm 24ウェル比色分析走化性アッセイ(Millipore、テメキュラ、CA)を用いて製造者の指示に従い調べた。簡単には、上記の通りPMNは健康なドナー由来の全血から調製し完全細胞培地に再懸濁した。PMNは、5%CO2を有する加湿細胞培養インキュベーター(Thermo Scientific社)で37℃、1時間、0.5、10または25μMの本発明の化合物とともに、ウェル当たり250μl細胞懸濁液を用いて、濃度1×106細胞/mLで48ウェルプレート(Becton Dickinson社)でプレインキュベートした。細胞は次いで完全細胞培地で洗浄し、細孔径3μm(Millipore社)を有する24ウェル細胞遊走プレートプレートアセンブリのトップインサートに細胞を移した。より下のチャンバーには、100ng/mlの組換えヒトIL−8(Invitrogen社)または500nM LTB4(Sigma Aldrich社)含有完全細胞培地を添加した。IDX9045を試験する1つの実験では、細胞は走化性プレートのトップインサートに添加する前に洗浄せず、この場合IL−8をIDX9045とともに、トップインサートに使用したのと同じ濃度で、より下のチャンバーに添加した。これは化合物の勾配を作り出すリスクを排除するためであった。細胞は次いで、5%CO2を有する加湿細胞培養インキュベーター(Thermo Scientific社)で37℃、3時間、フィルターを通って化学誘引物質に向かって遊走できた。この後、より下のチャンバーからの細胞、すなわち遊走細胞を細胞生存性染色WST−1とともに1時間インキュベーションして検出し、続いてマイクロプレートリーダー(Tecan,Maennedorf社、スイス)を用いて450nmで吸光度を測定して定量した。
PMNは、虚血組織へ誘引される主な白血球である。ここで、好中球は、フリーラジカル、ミエロペルオキシダーゼなどのタンパク質分解酵素を遊離、および局所細胞からのサイトカイン放出を刺激して組織傷害を増大させ、炎症増加をもたらす。IL−8は、この受容体CXCR1およびCXCR2、およびLTB4は、PMN細胞表面のこの受容体BLT1に結合して、炎症部位への好中球の動員に重要な役割を果たす(Kobayashi、2008年;TagerおよびLuster、2003年)。
序論
PMNは、虚血だけでなく、多くの他の炎症性障害の病因にも関与し、したがってPMN機能を阻害することは、多くの炎症性疾患で有益となるであろう。PMN、すなわち好酸球および好中球による気道の細胞炎症は、喘息の特性である。PMNはまた、多発性硬化症(MS)の病因に関与することも記載されている。この試験の目的は、本発明の化合物が、健康な個人由来のPMNだけでなく、この場合では喘息およびMSに例示される炎症状態を有する患者由来のPMNでも、CXCR1/2およびBLT1発現を減少させることができるかを調べることであった。
試験化合物
IDX9022、IDX9052、IDX9054およびIDX9059(配列番号3、14、7および8、表1)を、喘息およびMS患者由来のPMNでのCXCR1、CXCR2およびBLT1表面発現に対する効果について調べた。オリゴヌクレオチドはすべて、Biomers.net社(ウルム、ドイツ)により合成された。
オリゴヌクレオチドは、UV分光光度法(SmartSpec(登録商標)3000、BIO−RAD社、ハーキュリーズ、USA)を用いて500μMの貯蔵濃度に達するようリン酸緩衝生理食塩水(PBS、Invitrogen社、カールスバッド、CA)で調整し、および使用まで−20℃で保存した。
喘息およびMS患者由来の全血をPMNの調製に使用した。PMNを単離し、カウントし、実施例7の材料および方法に記載した完全細胞培地に再懸濁した。PMNは、0.5、10μMもしくは25μMのオリゴヌクレオチド、または総容量200μl/ウェルでの陰性対照として培地単独とともに、濃度2×106細胞/mLで96ウェル培養組織プレート(Becton Dickinson社、フランクリンレイクス、NJ)に培養した。細胞は、5%CO2を有する加湿細胞培養インキュベーター(Thermo Scientific社、ウォルサム、MA)で37℃、3時間インキュベートした後、細胞を、フローサイトメトリーを用いてCXCR1、CXCR2およびBLT1発現について分析した。
オリゴヌクレオチドとともにインキュベートした細胞を回収し、PBSで洗浄し、2%FCSを追加したPBSに再懸濁した。細胞は、実施例7の材料および方法に記載した通りCXCR1もしくはCXCR2またはBLT1とともに顆粒球マーカーCD66bを染色した。細胞を次いでFACSarrayフローサイトメーター(Becton Dickinson社)により分析し、データはFACSarrayソフトウェアシステム(Becton Dickinson社)を用いて分析した。試料当たり最低15000ゲートPMNを分析した。
PMNは、炎症反応中の組織損傷を媒介する主な細胞の一つである。PMNは、血液から、局所産生された化学誘引物質に反応して炎症部位へ遊走する。PMN遊走の2つの主なメディエーターは、CXCケモカインIL−8およびロイコトリエンLTB4である。この試験では、本発明者らは、本発明の化合物が炎症性疾患患者由来のPMN表面のIL−8に対する受容体、すなわちCXCR1およびCXCR2、ならびにLTB4に対する受容体、すなわちBLT1をダウンレギュレートできるかを調べようと試みた。
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Claims (13)
- 配列番号8[IDX9059]の配列からなる単離および精製されたオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも1つのヌクレオチドがリン酸骨格修飾を有することを特徴とする請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1または2に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
- オリゴヌクレオチドが、
配列番号8[IDX9059]の配列からなるものである、炎症部位への多形核細胞の動員および/または遊走を減少させる医薬製剤を製造するためのオリゴヌクレオチド。 - 炎症部位への多形核細胞の前記減少した動員および/または遊走が、受容体CXCR1およびCXCR2からなる群から選択される少なくとも1つのダウンレギュレーションの結果であることを特徴とする請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 炎症部位への多形核細胞の前記減少した動員および/または遊走が、受容体BLT1のダウンレギュレーションの結果であることを特徴とする請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは以下の投与経路、すなわち皮下、腹腔内、粘膜、腸内、経口、静脈内、胃内、食道、口腔内、鼻腔内および肺内投与からなる群から選択される一つを介して与えられることを特徴とする請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは炎症性疾患の治療におけるステップとして投与されることを特徴とする請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは心筋梗塞に罹患している、または罹患していることが疑われる患者に投与されることを特徴とする請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、脳卒中に罹患している、または罹患していることが疑われる患者に投与されることを特徴とする請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、外傷もしくは熱傷を負っている、または手術を受ける予定の患者に投与されることを特徴とする請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、塞栓の除去の前、後もしくは実質的に同時に、または血栓溶解剤の投与の前もしくは後に塞栓症を有する患者に投与されることを特徴とする請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、ドナーからの摘出前のin situ、レシピエントへの移植前の輸送中、または血流回復前もしくは回復時のin vivoのどちらかで、移植用に指定された臓器に投与されることを特徴とする請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
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