JP2021131228A - 難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングする方法、及び難治性喘息の予防又は治療剤 - Google Patents

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Abstract

【課題】難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングする方法、及び難治性喘息の予防又は治療剤を提供すること。【解決手段】ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性の阻害、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現の抑制、及びＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現の抑制よりなる群から選択される少なくとも１つを指標として、難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングする方法。【選択図】図１

Description

本発明は、難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングする方法、及び難治性喘息の予防又は治療剤に関する。
喘息による死亡者数はステロイド治療薬の普及により顕著に減少した。
しかし、ステロイド治療薬の効果が十分に発揮されない難治性喘息患者は喘息患者の５〜１０％程度存在する。
これら難治性喘息の死亡率は喘息全体の約４０％を占め、治療に必要な医療費は喘息全体の約４０％を占める。
したがって、難治性喘息に対する有効な治療薬の開発は喫緊の重要課題である。
難治性喘息には、好酸球優勢の難治性喘息、好中球優勢の難治性喘息等種々の病態が存在することが知られている。好酸球優勢の難治性喘息に対しては抗ＩＬ−５抗体、抗ＩｇＥ抗体などの分子標的薬が開発され、すでに医療の現場で使用されている。一方で、好中球浸潤を伴う難治性喘息に対する薬剤は現時点で存在していない。好中球の産生するエステラーゼなどに対する阻害剤などが開発されてはいるが、十分な治療効果は得られていない。
一方、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５は炎症性ケモカインＣＸＣサブファミリーに属する。炎症性シグナルは各種血液細胞、繊維芽細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、肺胞上皮細胞などからのＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５分泌を活性化する（例えば、非特許文献１、２）。
また、特許文献１には、各種ケモカインに結合する抗体が開示されている。
ＣＸＣＲ２は好中球上で発現していることが報告されているケモカインレセプターである。ヒトでは主にＣＸＣＬ８、マウスではＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２がリガンドとしてＣＸＣＲ２に結合し、好中球の遊走を促進する。ＣＸＣＲ２を介した好中球の遊走は種々の疾患に関与していることが報告されているが、例えばマウスの炎症性腸疾患モデルにおいてＣＸＣＲ２抗体を投与すると、腸粘膜層の好中球数が減少し、病態が緩和されることが報告されている（例えば、非特許文献３）。
特許第６１０５１４６号公報
Ｔｈｏｒａｘ．２００７ Ｊｕｎ；６２（６）：４７５−８２． Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１ Ｏｃｔ；３２（１０）：４５２−６０． ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ：Ｖｏｌ．３２９，Ｎｏ．１；３２９：１２３−１２９，２００９
近年、難治性喘息の患者の肺には好中球の浸潤が認められるケースが多く、蓄積した好中球が難治性喘息の病態に寄与していることが明らかになりつつある。好中球の浸潤に関わる分子はすでに複数種同定されているが、どの分子が難治性喘息の病態に深く関与しているか未だ明らかになっておらず、分子標的薬の開発には至っていない。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングする方法、及び難治性喘息の予防又は治療剤の提供を目的とする。
本発明者らは、好中球遊走因子の１つであるＣＸＣＬ２若しくはＣＸＣＲ２の阻害物質（例えば、ＣＸＣＬ２若しくはＣＸＣＲ２に対するモノクローナル抗体）を投与することにより、難治性喘息モデルマウスの気管支周辺への好中球浸潤及び炎症を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的には、本発明は以下の通りである。
本発明の第１の態様は、
ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性の阻害、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現の抑制、及びＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現の抑制よりなる群から選択される少なくとも１つを指標として、難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングする方法である。
本発明の第２の態様は、
ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性の阻害物質、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現の抑制物質、又はＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現の抑制物質を含む、難治性耐性喘息の予防又は治療剤である。
第１の態様に係る難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングする方法は、難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングすることができる。
また、ＣＸＣＬ２及びＣＸＣＲ２はシグナル伝達経路の下流に位置していること、及び免疫細胞のうち好中球を選択的に減少させることができることから副作用の少ない難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングすることができる。
第２の態様に係る難治性喘息の予防又は治療剤は、難治性喘息を予防又は治療することができる。
第２の態様に係る難治性喘息の予防又は治療剤は、ＣＸＣＬ２及びＣＸＣＲ２がシグナル伝達経路の下流に位置していること、及び免疫細胞のうち好中球の浸潤を選択的に抑制できることから副作用が少ない。
難治性喘息誘発モデルを用いた抗ＣＸＣＬ２抗体投与試験における各種免疫細胞数の測定結果を示す図である。 （ａ）はコントロール抗体を投与したマウス群、（ｂ）は抗ＣＸＣＬ２抗体を投与したマウス群における肺組織の病理組織画像を示す図である。
以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
＜難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングする方法＞
第１の態様に係るスクリーニング方法は、ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性の阻害、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現の抑制、及びＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現の抑制よりなる群から選択される少なくとも１つを指標とすることにより、難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングすることができる。
難治性喘息の予防又は治療は肺における好中球浸潤の抑制に基づく難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングすることが好ましい。
上記難治性喘息は、ステロイド耐性の難治性喘息が挙げられ、免疫細胞のうち好中球を選択的に減少させ得る観点から、好中球優勢を伴う難治性喘息が好ましく、好中球優勢に起因する難治性喘息がより好ましい。
ここで、「好中球優勢」とは、好中球が顕性であることを意味し、例えば、他の免疫細胞よりも細胞数が多いこと等が挙げられる。
また、第１の態様に係るスクリーニング方法は、上記を指標とすることにより、肺における好中球浸潤の抑制剤のスクリーニング方法に関するものでもある。
ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性としては、炎症部位への好中球の遊走、誘引ないし浸潤、癌（例えば、肝癌）転移促進（Ｏｔｔｏ Ｋｏｌｌｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４５，２９５−３０２（２００８））等が挙げられる。
また、上記阻害の程度としては統計的に有意な阻害であれば特に制限はないが、被験物質の非存在下（例えば、被験物質の投与前の系（例えば、野生型）、又は陰性対照（ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性に影響しない物質を投与した対照、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現に影響しない物質を投与した対照、又はＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現に影響しない物質を投与した対照）の系）におけるＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現、又はＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現に対して、３／４以下であることが好ましく、２／３以下であることがより好ましく、１／２以下であることがさらに好ましく、活性又は発現がなくなることが特に好ましい。
投与法としては、鼻腔内投与、経気道投与、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などの当業者に公知の方法により行うことができ、鼻腔内投与又は経気道投与であることが好ましく、鼻腔内投与であることがより好ましい。
スクリーニング方法としては、上記を指標とする限り、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）等の任意のスクリーニング方法であってもよい。
スクリーニング方法の好ましい一例としては、難治性喘息誘発動物を用いて、上記被験物質の非投与下に対する投与下のＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性の阻害、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現の抑制、又はＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現の抑制を指標として、難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングすることが挙げられる。
上記難治性喘息誘発動物としては、免疫賦活剤として完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を用いた難治性喘息誘発モデルマウス（Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＡｍＪ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１１）が挙げられる。
また、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子を発現する細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、上記被験物質の有無に応じたＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性の阻害、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現の抑制、又はＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現の抑制を指標として、難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングすることもできる。
ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性の阻害の分析としては、例えば、上記被験物質の非投与下における肺組織における好中球の細胞数に対する上記被験物質の投与下における好中球の細胞数の減少を測定することにより分析することができる。
ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質のｍＲＮＡレベルでの発現量の測定は、ノザンブロット、サザンブロット又はＲＴ−ＰＣＲ等の常法により行うことができる。具体的には、モレキュラークローニング第２版又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことができる。
また、ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現量の測定は、抗体を用いたウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡ等の通常の免疫分析により行なうことができる。具体的には、モレキュラークローニング第２版又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことができる。
また、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の塩基配列情報を基にすれば、インシリコでも各種のヒト組織におけるＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現を検出することができる。また、インビボ、インビトロでも、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を有するプローブまたはプライマーを利用することにより、各種のヒト組織におけるＣＸＣＬ２遺伝子の発現を検出することができる。ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現の検出は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット、サザンブロット等の常法により行うことができる。
ＰＣＲを行なう場合、プライマーは、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子のみを特異的に増幅できるものであれば特に限定されず、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の配列情報に基づき適宜設定することができる。例えば、ＣＸＣＬ２遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子又は上記各遺伝子の発現制御領域の塩基配列中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして使用することができる。より具体的には、ＣＸＣＬ２遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子又は上記各遺伝子の発現制御領域の塩基配列中の連続した１０〜６０残基、好ましくは１０〜４０残基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。
上記したオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機を用いて常法により製造することができる。該オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、例えば、検出したいｍＲＮＡの一部の塩基配列において、５’末端側の塩基配列に相当するセンスプライマー、３’末端側の塩基配列に相当するアンチセンスプライマー等を挙げることができる。センスプライマー及びアンチセンスプライマーとしては、それぞれの融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのないオリゴヌクレオチドであって、１０〜６０塩基程度のものが挙げられる、１０〜４０塩基程度のものが好ましい。また、本発明においては、上記したオリゴヌクレオチドの誘導体を用いることも可能であり、例えば、該オリゴヌクレオチドのメチル体やホスホロチオエート体等を用いることもできる。
本発明の第１の態様に係るスクリーニング方法に供される被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、抗体でもよいし、核酸分子でもよいし、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。後述するゲノム編集用の人工ヌクレアーゼであってもよい。あるいは、被験化合物はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
被験物質は、好ましくは、抗体、低分子化合物（例えば、化合物ライブラリー）、核酸分子、又はゲノム編集用の人工ヌクレアーゼであり、ＣＸＣＬ２若しくはＣＸＣＲ２タンパク質、又はＣＸＣＬ２若しくはＣＸＣＲ２遺伝子に対して特異性が高い観点から、抗体、低分子化合物又は核酸分子がより好ましく、ＣＸＣＬ２若しくはＣＸＣＲ２タンパク質に選択的に結合する抗体若しくはアプタマー、又はＣＸＣＬ２若しくはＣＸＣＲ２遺伝子（エクソン中のコーディング領域（ＣＤＳ）若しくは非翻訳領域（ＵＴＲ）又はイントロン）中又は上記遺伝子の発現制御領域中に含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸分子であることが更に好ましく、ＣＸＣＬ２若しくはＣＸＣＲ２タンパク質に選択的に結合する抗体若しくはアプタマーが特に好ましい。
（ＣＸＣＬ２タンパク質）
ＣＸＣＬ２タンパク質は、以下の何れかのタンパク質である。
（ａ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ炎症部位への好中球の誘引ないし浸潤活性又は癌転移促進活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ炎症部位への好中球の誘引ないし浸潤活性又は癌転移促進活性を有するタンパク質
難治性喘息に対する予防又は治療剤をスクリーニングする観点、及びヒト由来のタンパク質をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、上記（ａ）のタンパク質であることが好ましい。
配列番号１は、ヒトＣＸＣＬ２タンパク質のアミノ酸配列を表す。配列番号２は、マウスＣＸＣＬ２タンパク質のアミノ酸配列を表す。
本明細書で言う「アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から５個、さらに好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、アミノ酸の相同性が９５％以上であることを意味し、相同性は好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上である。
配列表の配列番号５又は６に記載の塩基配列を有する遺伝子と相同性の高い変異体遺伝子にコードされるタンパク質であって、炎症部位への好中球の誘引ないし浸潤活性又は癌転移促進活性を有するタンパク質は全て本発明の範囲内のものである。
タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。
従って、配列表の配列番号１又は２に記載したＣＸＣＬ２のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異タンパク質であっても、その変異がＣＸＣＬ２の３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異タンパク質がＣＸＣＬ２と同様に、炎症部位への好中球の誘引ないし浸潤活性又は癌転移促進活性を有するタンパク質であれば、これらは全てＣＸＣＬ２の範囲内に属する。
ＣＸＣＬ２タンパク質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、生体試料又は培養細胞などから単離した天然由来のタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換えタンパク質でもよい。
（ＣＸＣＬ２遺伝子）
ＣＸＣＬ２遺伝子は、エクソン１、イントロン１、エクソン２、イントロン２、エクソン３、イントロン３及びエクソン４を含み、この構成はヒト、マウス、その他の哺乳類において高度に保存されている。
配列番号３は、スプライシング前のヒトＣＸＣＬ２のプレｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をコードする塩基配列を示す。
また、配列番号４は、スプライシング前のマウスＣＸＣＬ２のプレｍＲＮＡのｃＤＮＡをコードする塩基配列を示す。
配列番号３で表されるヒトＣＸＣＬ２のプレｍＲＮＡのｃＤＮＡ、配列番号４で表されるマウスＣＸＣＬ２のプレｍＲＮＡのｃＤＮＡのそれぞれにおけるエクソン１〜４及びイントロン１〜３の各領域を下記表１にまとめる。
Figure 2021131228
また、エクソン１〜４にはアミノ酸をコードするコーディング領域（ＣＤＳ）及びアミノ酸をコードしない非翻訳領域（ＵＴＲ）が含まれる。
エクソン中のＵＴＲとしては、開始コドンより上流に５’ＵＴＲが存在し、終始コドンより下流に３’ＵＴＲが存在する。
ヒトＣＸＣＬ２のｍＲＮＡをコードするヒトＣＸＣＬ２遺伝子は後記の配列番号５で表される配列を有する。
配列番号５において、１７４〜４９７番目の塩基配列がＣＤＳであり、１〜１７３番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、４９８〜１２１８番目の塩基配列が３’ＵＴＲである。
マウスＣＸＣＬ２のｍＲＮＡをコードするマウスＣＸＣＬ２遺伝子は後記の配列番号６で表される配列を有する。
配列番号６において、７３〜３７５番目の塩基配列がＣＤＳであり、１〜７２番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、３７６〜１１０９番目の塩基配列が３’ＵＴＲである。
また、ＣＸＣＬ２タンパク質（例えば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードする遺伝子は全てＣＸＣＬ２遺伝子に属する。
ＣＸＣＬ２遺伝子の具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）の何れかに記載の遺伝子が挙げられ、難治性喘息に対する予防又は治療剤をスクリーニングする観点、及びヒト由来の遺伝子をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、下記（ａ）の遺伝子であることが好ましい。
（ａ）配列表の配列番号５又は６に記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号５又は６に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ炎症部位への好中球の誘引ないし浸潤活性又は癌転移促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
本明細書で言う「塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列」における「１もしくは数個」の範囲は特には限定されないが、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、更に好ましくは１から５個程度を意味する。
上記のＤＮＡ変異の程度としては、例えば、配列表の配列番号５又は６に記載したＣＸＣＬ２遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有するものが挙げられ、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
（ＣＸＣＲ２タンパク質）
ＣＸＣＲ２タンパク質は、以下の何れかのタンパク質である。
（ａ）配列表の配列番号７又は８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号７又は８に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ炎症部位への好中球の遊走促進活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）配列表の配列番号７又は８に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ炎症部位への好中球の遊走促進活性を有するタンパク質
難治性喘息に対する予防又は治療剤をスクリーニングする観点、及びヒト由来のタンパク質をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、上記（ａ）のタンパク質であることが好ましい。
配列番号７は、ヒトＣＸＣＲ２タンパク質のアミノ酸配列を表す。配列番号８は、マウスＣＸＣＲ２タンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列表の配列番号１１又は１２に記載の塩基配列を有する遺伝子と相同性の高い変異体遺伝子にコードされるタンパク質であって、炎症部位への好中球の遊走促進活性を有するタンパク質は全て本発明の範囲内のものである。
配列表の配列番号７又は８に記載したＣＸＣＲ２のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異タンパク質であっても、その変異がＣＸＣＲ２の３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異タンパク質がＣＸＣＲ２と同様に、炎症部位への好中球の誘引ないし浸潤活性又は癌転移促進活性を有するタンパク質であれば、これらは全てＣＸＣＲ２の範囲内に属する。
ＣＸＣＲ２タンパク質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、生体試料又は培養細胞などから単離した天然由来のタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換えタンパク質でもよい。
（ＣＸＣＲ２遺伝子）
ヒトＣＸＣＲ２遺伝子は、エクソン１、イントロン１、エクソン２、イントロン２及びエクソン３を含み、マウスＣＸＣＲ２遺伝子は、エクソン１、イントロン１及びエクソン２を含む。
配列番号９は、スプライシング前のヒトＣＸＣＲ２のプレｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をコードする塩基配列を示す。
また、配列番号１０は、スプライシング前のマウスＣＸＣＲ２のプレｍＲＮＡのｃＤＮＡをコードする塩基配列を示す。
配列番号９で表されるヒトＣＸＣＲ２のプレｍＲＮＡのｃＤＮＡ、配列番号１０で表されるマウスＣＸＣＲ２のプレｍＲＮＡのｃＤＮＡのそれぞれにおけるエクソン１〜３並びにイントロン１及び２の各領域を下記表２にまとめる。
Figure 2021131228
ヒトＣＸＣＲ２のｍＲＮＡをコードするヒトＣＸＣＲ２遺伝子は後記の配列番号１１で表される配列を有する。
マウスＣＸＣＲ２のｍＲＮＡをコードするマウスＣＸＣＲ２遺伝子は後記の配列番号１２で表される配列を有する。
また、ＣＸＣＲ２タンパク質（例えば、配列番号７又は８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードする遺伝子は全てＣＸＣＲ２遺伝子に属する。
ＣＸＣＲ２遺伝子の具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）の何れかに記載の遺伝子が挙げられ、難治性喘息に対する予防又は治療剤をスクリーニングする観点、及びヒト由来の遺伝子をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、下記（ａ）の遺伝子であることが好ましい。
（ａ）配列表の配列番号１１又は１２に記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号１１又は１２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ炎症部位への好中球の遊走促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の取得）
ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号１〜１２に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子が発現される適当な細胞より常法に従い調製したもの）から所望クローンを選択することにより、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子を単離することができる。
ＰＣＲ法によりＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子を取得することもできる。例えば、ヒト培養細胞由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号５若しくは６又は１１若しくは１２に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。
ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
上記したブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。
本明細書中上記した、配列表の配列番号５若しくは６又は１１若しくは１２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、炎症部位への好中球の誘引ないし浸潤活性又は癌転移促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（変異遺伝子）は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。例えば、配列番号５若しくは６又は１１若しくは１２に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。具体的には、配列番号５若しくは６又は１１若しくは１２に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
上述の通り、配列表の配列番号５若しくは６又は１１若しくは１２に記載したＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の塩基配列において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が、炎症部位への好中球の誘引ないし浸潤活性又は癌転移促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、配列番号５若しくは６又は１１若しくは１２に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の範囲内のものである。
＜難治性喘息の予防又は治療剤＞
第２の態様に係る難治性喘息の予防又は治療剤（以下、単に「第２の態様に係る予防又は治療剤」ともいう。）は、ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性の阻害物質、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現の抑制物質、又はＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現の抑制物質を含む。
難治性喘息の予防又は治療は肺における好中球浸潤の抑制に基づくものであることが好ましい。
上記難治性喘息は、ステロイド耐性の難治性喘息が挙げられ、免疫細胞のうち好中球を選択的に減少させ得る観点から、好中球優勢を伴う難治性喘息が好ましく、好中球優勢に起因する難治性喘息がより好ましい。
第２の態様に係る予防又は治療剤は、肺における好中球浸潤の抑制剤に関するものでもある。
（ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質に選択的に結合する抗体又はアプタマー）
ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性の阻害物質としては、ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性を阻害する限り、抗体、高分子化合物（核酸等）、低分子化合物等任意の物質であってもよい。
ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性の阻害物質の好ましい態様の１つとして、ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質に選択的に結合する抗体を用いた難治性喘息の予防又は治療剤が挙げられる。上記ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質に特異的に結合できるものであれば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。
ポリクローナル抗体は、抗原を免疫した動物から得られる血清を分離、精製することにより調製することができる。モノクローナル抗体は、抗原を免疫した動物から得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、上記の培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
抗原は、各種ヒト培養細胞からＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質を精製するか、ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質のアミノ酸配列またはその変異配列またはそれらの一部を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを大腸菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などの宿主に導入して、該ＤＮＡを発現させて得られるタンパク質を分離、精製することにより調製できる。また、抗原は、ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドをアミノ酸合成機を用いて合成することによって調製することもできる。
免疫方法としては、抗原をウサギ、ヤギ、ラット、マウスまたはハムスター等などの非ヒト哺乳動物の皮下、静脈内または腹腔内にそのまま投与してもよいが、抗原をスカシガイヘモシアニン、キーホールリンペットヘモシアニン、牛血清アルブミン、牛チログロブリン等の抗原性の高いキャリアタンパク質と結合して投与したり、完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン等の適当なアジュバントとともに投与することも好ましい。
抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行うことができる。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応するか否かを酵素免疫測定法等に従い、抗体価を測定することにより調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示す非ヒト哺乳動物を、血清または抗体産生細胞の供給源として使用することができる。ポリクローナル抗体は、上記の血清を分離、精製することにより調製することができる。
モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。抗体産生細胞としては、脾細胞、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を使用することができ、特に好ましくは脾細胞を使用することができる。
骨髄腫細胞としては、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株であるＰ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）株［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１−７（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）株［Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１−５１９（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）株［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）株［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８−１５５０（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）株［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）］等のマウス由来の株化細胞を用いることができる。
ハイブリドーマ細胞は、以下の方法により作製できる。先ず、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、ＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを加えた培地］に懸濁したのち、７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、抗原に反応し、抗原を含まないタンパク質には反応しないものを選択する。次いで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞として選択する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を培養して得られる培養液、またはハイブリドーマ細胞を動物の腹腔内に投与して該動物を腹水癌化させて得られる腹水から分離、精製することにより調製できる。
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、硫安沈殿、カプリル酸沈殿、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡ若しくはＧ−カラム、若しくはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等による方法を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
本明細書で抗体と言う場合、全長の抗体だけではなく抗体の断片も包含するものとする。抗体の断片とは、機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられる。Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’とは、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）で処理することにより製造されるもので、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体断片である。
抗体をヒトに投与する目的で使用する場合は、免疫原性を低下させるために、ヒト型化抗体あるいはヒト化抗体を用いることが好ましい。これらのヒト型化抗体やヒト化抗体は、トランスジェニックマウスなどの哺乳動物を用いて作製することができる。ヒト型化抗体については、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）〕、野口浩〔医学のあゆみ １６７：４５７−４６２（１９９３）〕に記載されている。ヒト化キメラ抗体は、マウス抗体のＶ領域とヒト抗体のＣ領域を遺伝子組換えにより結合し、作製することができる。ヒト化抗体は、マウスのモノクローナル抗体から相補性決定部位（ＣＤＲ）以外の領域をヒト抗体由来の配列に置換することによって作製できる。
また、抗体は、固相担体などの不溶性担体上に固定された固定化抗体として使用したり、標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体も全て本発明の範囲内である。
上記した抗体のうち、ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質に特異的に結合してその活性を阻害できる抗体については、難治性喘息の予防又は治療剤として使用することができる。
抗体を難治性喘息の予防又は治療剤として医薬組成物の形態で使用する場合には、上記抗体を有効成分として使用し、さらに薬学的に許容可能な担体、希釈剤（例えば、免疫原性アジュバントなど）、安定化剤または賦形剤などを用いて医薬組成物を調製することができる。抗体を含む難治性喘息の予防又は治療剤は、濾過滅菌および凍結乾燥し、投薬バイアルまたは安定化水性調製物中に投薬形態に製剤化することができる。
ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の阻害物質のもう１つの好ましい態様としては、ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質に選択的に結合するアプタマーを用いた難治性喘息の予防又は治療剤が挙げられる。
アプタマーとは、一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡで構成され、その立体構造により標的タンパク質と結合して機能を阻害する核酸医薬品をいう。
アプタマーは標的タンパク質に対する結合性及び特異性が高く、免疫原性が低く、化学合成により製造することができ、保存安定性も高い。
ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質に選択的に結合するアプタマーの塩基長としては、ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質に特異的に結合する限り特に制限はないが、１５〜６０塩基であることが好ましく、２０〜５０塩基であることがより好ましく、２５〜４７塩基であることが更に好ましく、２６〜４５塩基であることが特に好ましい。
ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質に選択的に結合するアプタマーはＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法により取得することができる。
第２の態様に係る難治性喘息の予防又は治療剤の患者への投与は、例えば、鼻腔内投与、経気道投与、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などの当業者に公知の方法により行うことができ、鼻腔内投与又は経気道投与であることが好ましく、鼻腔内投与であることがより好ましい。
投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。有効成分である抗体又はアプタマーの投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ程度の範囲である。
（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現の抑制物質、ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現の抑制物質としては、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子（エクソン中のＣＤＳ若しくはＵＴＲ又はイントロン）中又は上記各遺伝子の発現制御領域中に含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入することによりＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の転写又は翻訳を抑制することにより難治性喘息を予防又は治療することができる。
例えば、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子（エクソン中のＣＤＳ若しくはＵＴＲ又はイントロン）中又は上記各遺伝子の発現制御領域中に含まれるオリゴヌクレオチドと、それと相補的な上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとが、細胞に導入した後にハイブリッド形成することにより、生じたハイブリッド二本鎖に特異的なヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ）によりＣＸＣＬ２若しくはＣＸＣＲ２のｍＲＮＡが分解されＣＸＣＬ２若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の転写又は翻訳を抑制することができる。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の塩基配列（エクソン中のＣＤＳ若しくはＵＴＲ又はイントロン）中又は上記各遺伝子の発現制御領域中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましく、少なくとも１１ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、少なくとも１２ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが更に好ましく、少なくとも１３ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが特に好ましく、少なくとも１４ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが最も好ましい。
また、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長の上限値としては、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の塩基配列（エクソン中のＣＤＳ若しくはＵＴＲ又はイントロン）中又は上記遺伝子の発現制御領域中の連続する４０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましく、連続する３０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、連続する２５ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが更に好ましく、連続する２０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが特に好ましく、連続する１７ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが最も好ましい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有するヌクレオチドを少なくとも１つ含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。
例えば、ヌクレオチド同士をつなぐリン酸ジエステル結合部がホスホロチオエート構造を有することにより、ヌクレアーゼ耐性を獲得することができ、また、疎水性が向上することから細胞内又は核内への取り込みも向上することができる。
また、ヌクレオチドの糖部が、２’，４’−ＢＮＡ（２’，４’−Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ；別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ））、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の架橋構造、２’−Ｏ−メチル化、２’−Ｏ−メトキシエチル化（２’−ＭＯＥ）等のアルコキシ構造を有することにより、ヌクレアーゼ耐性獲得及びｍＲＮＡの結合能を向上することができる。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオチド同士をつなぐ少なくとも１つのリン酸ジエステル結合部がホスホロチオエート構造を有することが好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のうちの５０％以上がホスホロチオエート構造を有することがより好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のうちの７０％以上がホスホロチオエート構造を有することが更に好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のうちの９０％以上がホスホロチオエート構造を有することが特に好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中の全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート構造を有することが最も好ましい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、少なくともいずれか一方の末端のヌクレオチドが架橋構造又はアルコキシ構造を有することが好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端のヌクレオチドが架橋構造又はアルコキシ構造を有することがより好ましく（いわゆるギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）型アンチセンスオリゴヌクレオチド）、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端において、独立して、末端から４塩基までが架橋構造又はアルコキシ構造を有することが更に好ましく、末端から２又は３塩基が架橋構造又はアルコキシ構造を有することが特に好ましい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への導入方法の１つの実施態様としては、適当なベクター中に挿入し、更に適当な宿主細胞に導入する実施態様が挙げられる。
上記適当なベクターの種類は特に限定されず、例えば、自律的に複製するベクター（例えば、プラスミド等）でもよいが、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであることが好ましい。
上記適当なベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテリオファージやレトロウイルスやワクシニアウイルス等の動物ウイルス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを付加することも可能である。
また、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネーター又は真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネーター若しくはＡＤＨ３ターミネーターのような適切なターミネーターに機能的に結合されていてもよい。組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）及び翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウイルスＶＡＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含むベクターを導入される宿主細胞は、高等真核細胞、細菌、酵母、真菌等が挙げられるが、哺乳類細胞であることが好ましい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞など）、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／ｃマウス細胞（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス胎児繊維芽細胞）等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入された遺伝子を発現させる方法も公知であり、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
第２の態様に係る予防又は治療剤は、細胞内への取り込みを向上させる観点から、リポフェクション用担体を更に含んでいてもよいが含んでいなくてもよい。
リポフェクション用担体としては、細胞膜との親和性の高い担体（例えばリポソーム、コレステロール等）が挙げられ、リポフェクトアミン又はリポフェクチンが好ましく、リポフェクトアミンがより好ましい。
例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポフェクション用担体と一緒に患者の患部又は全身に注射などにより投与し、患者の細胞に取り込ませてＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現を抑制することにより、難治性喘息を予防又は治療することができる。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有することと、上記リポフェクション用担体とを組み合わせて用いることにより患者の細胞内又は核内への取り込みを向上させることができる。
有効成分であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ程度の範囲である。
（ｓｉＲＮＡ）
ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現の抑制物質、又はＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現の抑制物質としては、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ））又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡも挙げられる。
ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する少なくとも２１ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましい。
ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する３０ヌクレオチド以下を含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましく、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する２５ヌクレオチド以下を含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることがより好ましい。
ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、ある標的遺伝子の一部をコードするｍＲＮＡの一部を二本鎖にしたＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を細胞へ導入すると、標的遺伝子の発現が抑制される現象を言う。
二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、例えば、ＣＸＣＬ２若しくはＣＸＣＲ２遺伝子またはそれらの部分配列の逆向き反復配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
このような逆向き反復配列を有するＤＮＡを哺乳動物の細胞に導入することにより、細胞内で標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることができ、これによりＲＮＡｉ効果により標的遺伝子（ＣＸＣＬ２若しくはＣＸＣＲ２）の発現を抑制することが可能になる。
逆向き反復配列とは、標的遺伝子並びにその逆向きの配列が適当な配列を介して並列している配列を言う。具体的には、標的遺伝子が、以下に示すｎ個の塩基配列から成る２本鎖を有する場合、
５’−Ｘ１Ｘ２．．．．．．Ｘｎ−１Ｘｎ−３’
３’−Ｙ１Ｙ２．．．．．．Ｙｎ−１Ｙｎ−５’
その逆向き配列は以下の配列を有する。
５’−ＹｎＹｎ−１．．．．．．Ｙ２Ｙ１−３’
３’−ＸｎＸｎ−１．．．．．．Ｘ２Ｘ１−５’
（ここで、Ｘで表される塩基とＹで表される塩基において、添え字の数字が同じものは互いに相補的な塩基である）
逆向き反復配列は上記２種の配列が適当な配列を介した配列である。逆向き反復配列としては、標的遺伝子の配列が逆向き配列の上流にある場合と、逆向き配列が標的遺伝子の配列の上流にある場合の２つの場合が考えられる。本発明で用いる逆向き反復配列は上記の何れでもよいが、好ましくは、逆向き配列が標的遺伝子の配列の上流に存在する。
標的遺伝子の配列とその逆向き配列の間に存在する配列は、ＲＮＡに転写された際にヘアピンループを形成する領域である（ｓｈＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）。この領域の長さは、ヘアピンループを形成できる限り特には限定されないが、好ましくは０〜３００ｂｐ程度、より好ましくは０〜１００ｂｐ程度である。この配列の中には制限酵素部位が存在していてもよい。
本発明では、哺乳動物で作動可能なプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆向き反復配列を組み込むことにより、哺乳動物の細胞内において標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることができる。本発明で用いるプロモーター配列は、哺乳動物で作動可能であれば特に限定されない。
例えば、上記した二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡは、細胞への取り込みを助けるために使用される、上記リポフェクション用担体と一緒に患者の患部又は全身に注射などにより投与し、患者の細胞に取り込ませて重症喘息を抑制することができる。有効成分である二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡの投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１０ｍｇ程度の範囲である。
（人工ヌクレアーゼ）
ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＬ２タンパク質の発現の抑制物質としては、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓヌクレアーゼ等のゲノム編集用の人工ヌクレアーゼも挙げられ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いた人工制限酵素（人工ヌクレアーゼ）であってもよい。
ＴＡＬＥＮは４種類の塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣ）のいずれかを認識して結合する４種類のユニットを重合させてなるドメインであるＴＡＬＥｓ及びＤＮＡ切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼであり、ＴＡＬＥｓがＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子中の少なくとも部分配列を認識し結合し得る。
ＺＦＮはジンクフィンガードメイン及びＤＮＡ切断ドメインを含むキメラタンパク質の形態の人工ヌクレアーゼである。ジンクフィンガードメインは、特異的な３塩基配列を認識するジンクフィンガーユニットを、複数重合した構造を有し、３の倍数のＤＮＡ配列を認識し結合するドメインであり、ジンクフィンガードメインがＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子中の少なくとも部分配列を認識し結合し得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼ（好ましくはＣａｓ９）を含む。
ガイドＲＮＡとは、ＤＮＡ切断酵素であるＣａｓヌクレアーゼと結合して、Ｃａｓヌクレアーゼを標的ＤＮＡ（ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子中の少なくとも部分配列）に導く機能を有するＲＮＡを意味する。ガイドＲＮＡは、その５’末端に標的ＤＮＡ（ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子中の少なくとも部分配列）に相補的な配列を有し、該相補的な配列を介して標的ＤＮＡに結合することにより、Ｃａｓヌクレアーゼを標的ＤＮＡに導く。Ｃａｓヌクレアーゼは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能し、標的ＤＮＡが存在する部位でＤＮＡを切断し、例えば、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現を特異的に低下させることができる。
標的となるＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子中の少なくとも部分配列は、１５〜２５塩基であることが好ましく、１７〜２２塩基がより好ましく、１８〜２１塩基がさらに好ましく、２０塩基であることが特に好ましい。
ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子に特異的なガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸もしくはＣａｓヌクレアーゼを含有する組成物を、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子を含む真核細胞又は真核生物にトランスフェクトすることによりＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現を低下させることができる。
Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸又はＣａｓヌクレアーゼ、及びガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、当技術分野において公知の様々な方法、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、ナノ粒子媒介性トランスフェクション、タンパク質形質導入ドメイン媒介性形質導入、ウイルス媒介性遺伝子送達、およびプロトプラストへのＰＥＧ媒介性トランスフェクションなどによって、細胞内に移入されうるが、これらに限定されない。また、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸又はＣａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡは、注入などの遺伝子もしくはタンパク質を投与するための、当技術分野において公知の様々な方法によって、生物内に移入されうる。Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸又はＣａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡとの複合体の形態で、もしくは別々に、細胞内に移入されうる。Ｔａｔなどのタンパク質形質導入ドメインと融合されたＣａｓヌクレアーゼもまた、細胞内に効率的に送達され得る。
好ましくは、真核細胞又は真核生物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが同時トランスフェクトまたは連続トランスフェクトされる。
連続トランスフェクションは、最初にＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸によるトランスフェクション、続いて裸のガイドＲＮＡによる第二のトランスフェクションによって行われうる。好ましくは、第二のトランスフェクションは、３、６、１２、１８、２４時間後であるが、それらに限定されない。
ガイドＲＮＡの発現は、ガイドＲＮＡ発現ユニットを用いてもよい。ガイドＲＮＡ発現ユニットとしては、標的配列（ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の部分配列）とガイドＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の転写ユニットとすることが好ましく、ガイドＲＮＡを発現するためのプロモーター領域（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーターから選択されるプロモーター））、標的配列（ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子）及びガイドＲＮＡを有することが好ましく、プロモーター、標的配列（ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の少なくとも部分配列）に相補的な配列及びガイドＲＮＡがシームレスに連結していることがより好ましい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、オフターゲットを防ぐために、ニッカーゼとして二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを切断するＣａｓ９変異体を用いることもできる。一本鎖切断型Ｃａｓ９変異体としては、例えば、Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）が挙げられる。一本鎖切断型Ｃａｓ９変異体は例えば、標的ＤＮＡの一方の鎖に相補的な標的配列を有するガイドＲＮＡと、そのごく近傍の他方の鎖に相補的な標的配列を有するガイドＲＮＡとを組み合わせて用いると、一方の鎖を２０塩基の特異性で切断し、他方の鎖をさらに２０塩基の特異性で切断するため、併せて４０塩基の特異性でＤＮＡを切断することになり、標的の特異性を大幅に向上させることが可能となる。
有効成分である上記人工ヌクレアーゼ又は上記人工ヌクレアーゼをコードする核酸の投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１０ｍｇ程度の範囲である。
第２の態様に係る難治性喘息の予防又は治療剤は、経口または非経口的に全身又は局所的に投与することができる。非経口的な投与方法としては、鼻腔内投与、経気道投与、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などを挙げることができ、鼻腔内投与又は経気道投与であることが好ましく、鼻腔内投与であることがより好ましい。患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。その投与量は、年齢、投与経路、投与回数により異なり、当業者であれば適宜選択できる。
非経口投与に適した製剤形態として、例えば安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有したものは挙げられ、さらに薬学的に許容される担体や添加物を含むものでもよい。このような担体及び添加物の例として、水、有機溶剤、高分子化合物（コラーゲン、ポリビニルアルコールなど）、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ツルビトール、ラクトース、界面活性剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
以下、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。
≪難治性喘息モデルにおける抗ＣＸＣＬ２抗体投与試験≫
７〜８週齢の野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスの雌を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）５０μｌ及びＰＢＳ５０μｌ中に乳化した卵白アルブミン（ＯＶＡ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）２０μｇで０日目に皮下感作した。
２１日目に、ラット抗マウスＣＸＣＬ２抗体（Ｒ＆Ｄ社製）５０μｇ又はアイソタイプコントロール抗体（ラットＩｇＧ２ｂ：Ｒ＆Ｄ社製）５０μｇを合計容量１００μｌで少し麻酔したマウスに点鼻投与した（８マウス／群）。
１時間後、全てのマウス（８マウス／群）をＰＢＳ中３％ＯＶＡからなるエアロゾルを２０分間吸入させた。また、コントロール群（対照群）として、ＰＢＳからなるエアロゾルを２０分間吸入させた（１マウス／群）。
上記吸入から６時間後に気管支肺胞洗浄液及び肺のサンプル回収を行った。
得られた肺は後述する＜肺組織の病理組織解析＞に用いた。
＜気管支肺胞洗浄液内の各種免疫細胞数の測定＞
上記得られた気管支肺胞洗浄液内の各種免疫細胞（マクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球）数を測定した。
結果を図１に示す。
図１中、ＰＢＳ群は対照としてＰＢＳを吸入させたマウスにおける細胞数を示し、ＯＶＡ／コントロールＩｇＧ群は、コントロール抗体をあらかじめ吸入させた後にＯＶＡを吸入させたマウスにおける細胞数を示し、ＯＶＡ／α−ＣＸＣＬ２群は抗ＣＸＣＬ２抗体をあらかじめ吸入させた後にＯＶＡを吸入させたマウスにおける細胞数を示す。
図１に示した結果から明らかなように、難治性喘息モデルにおいて、ＯＶＡを吸入させたマウス群はいずれも好中球数がＰＢＳ吸入群に対して増加しており、ＯＶＡに対して感作されていることがわかる。
また、コントロール抗体をあらかじめ吸入させたマウス群では好中球数が増加していて難治性喘息が誘発されていることが示唆される。
これに対し、抗ＣＸＣＬ２抗体を吸入させたマウス群では好中球数が有意に低下しており、難治性喘息を緩和することが示唆される。
また、マクロファージ、リンパ球等については有意な細胞数の低下は見られず、好中球のみ選択的に有意に低下していることがわかる。
ＣＸＣＬ２がシグナル伝達経路の下流に位置していることから、好中球のみを選択的に減少させることができ、副作用が少ないことが予想される。
＜肺組織の病理組織解析＞
上記採取した肺から得たマウス肺組織は１０％ホルマリン溶液（ナカライテスク社製）にて固定後にパラフィンに包埋した。切片はＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）を行った。
結果を図２に示す。
図２（ａ）はコントロール抗体を投与したマウス群、（ｂ）は抗ＣＸＣＬ２抗体を投与したマウス群における肺組織の病理組織画像を示す図であり、肺組織における難治性喘息発症度合いが分かる図である。図中、スケールバーは１０μｍである。
図２（ａ）中、矢印（▽）は、好中球を示す。
図２（ａ）に示した結果から明らかなように、コントロール抗体を投与したマウス群では、好中球が気道へ顕著に浸潤しており、また、赤血球も観察され、出血していることが分かり炎症が進行していることが分かる。
一方、図２（ｂ）に示した結果から明らかなように、抗ＣＸＣＬ２抗体を投与したマウス群では好中球の浸潤も、赤血球も観察されず炎症が起こっていないことがわかる。
この結果から抗ＣＸＣＬ２抗体投与により難治性喘息の発症が劇的に抑制されたことが示唆される。
以上の＜気管支肺胞洗浄液内の各種免疫細胞数の測定＞及び＜肺組織の病理組織解析＞の結果から、抗ＣＸＣＬ２抗体は、難治性喘息の予防又は治療剤として機能することが分かる。
また、複数存在する好中球に対するケモカインのうち、ＣＸＣＬ２のみを選択的に抑制するだけで好中球の浸潤も炎症も抑制できるという驚くべき結果が得られた。
また、上述のように、抗ＣＸＣＬ２抗体が難治性喘息の予防又は治療剤として機能することが分かることから、ＣＸＣＬ２をリガンドとするレセプターであるＣＸＣＲ２に選択的に結合する抗体（抗ＣＸＣＲ２抗体）についても難治性喘息の予防又は治療剤として機能することが示唆される。

Claims (6)

  1. ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性の阻害、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現の抑制、及びＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現の抑制よりなる群から選択される少なくとも１つを指標として、難治性喘息の予防又は治療剤をスクリーニングする方法。
  2. 前記指標が、難治性喘息誘発動物を用いて、前記被験物質の非投与下に対する投与下のＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性の抑制、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現の抑制、又はＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現の抑制である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記難治性喘息が好中球優勢の難治性喘息である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の活性の阻害物質、ＣＸＣＬ２遺伝子若しくはＣＸＣＲ２遺伝子の発現の抑制物質、又はＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質の発現の抑制物質を含む、難治性喘息の予防又は治療剤。
  5. 前記阻害物質がＣＸＣＬ２タンパク質若しくはＣＸＣＲ２タンパク質に選択的に結合する抗体又はアプタマーである、請求項４に記載の剤。
  6. 前記難治性喘息が好中球優勢の難治性喘息である、請求項４又は５に記載の剤。
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