CN101863962B - 抑制beta分泌酶酶切作用的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种多肽，其氨基酸序列为：His-Asp-Pro-Ala-Pro-Rrg-Thr。本发明还提供所述多肽作为β分泌酶抑制剂、Aβ聚集抑制剂及在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。实验表明，本发明所述多肽可特异性结合APP上β分泌酶酶切位点，抑制β分泌酶酶切作用，抑制Aβ40和Aβ42的产生，抑制Aβ42的聚集和细胞毒性。将该多肽注射到AD转基因小鼠进行动物记忆实验，结果表明，可以明显改善小鼠的空间记忆能力，减少脑内老年斑的数量。本发明所述多肽分子量小，易穿过血脑屏障，并且相比抗体，抗原性较差，副作用较小，具有广泛的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多肽及其在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
背景技术
阿兹海默病Alzheimer’s Disease，以下简称AD，俗称老年性痴呆，是由无毒性的β-淀粉样蛋白单体分子(β-Amyloid(Aβ40/42以下简称Aβ))聚集形成具毒性作用的寡聚体引起的老年人主要以记忆力下降和脑部形成老年斑为特征的神经退行性疾病。医学统计表明，我国和欧美国家中60岁以上老年人有5～6％患有阿兹海默病。该病已被列为导致死亡的第四大疾病，仅次于心脏病、癌症和中风。我国现有60岁以上人口约一亿，按照60岁以上人口中老年性痴呆患病率为5％估算，全国可能有老年性痴呆患者约500万。该病已给家庭和社会带来巨大的负担。研究人员估计，如果防治措施得不到改善，原处于死亡病因第4位的老年性痴呆症将成为21世纪老年人健康的头号杀手，将会有三分之一的65岁以上老人患老年性痴呆症。目前，对AD的临床治疗只是应用一些神经营养和消炎类药物进行对症治疗，尚没有任何特异性治疗AD的药物面世。
基于Aβ的致病机理，目前对AD治疗制剂的研究主要从三个方面入手：通过抑制酶促反应降低Aβ产生、抑制Aβ的凝聚和加快Aβ的清除。Aβ主要由39-42个氨基酸残基组成，其中Aβ42聚集较快、细胞毒性较大，为主要的AD致病因素。它来自于分子量为110-135KD的前体蛋白(Amyloid Precursor Protein，APP)。APP经β分泌酶的作用产生Aβ的氨基端，经胞膜内γ分泌酶作用产生Aβ的羧基端。在正常情况下，在β分泌酶作用之前，α分泌酶在Aβ中间的Lys16-Leu17处将APP裂解为APPsα和嵌在膜上较短的羧基片段C83(如图1所示)。APPsα具有生长调节和神经营养的作用，能延长神经元的存活，稳定和加强突触的结构，增强神经元的功能等。在机体异常的情况下，β、γ分泌酶活性增强，或α分泌酶活性降低，将会产生较多量的Aβ，而引起AD的发生。于是，降低β或γ分泌酶酶切作用或增强α分泌酶酶切作用的研究成为近十余年来AD研究领域的热点之一。目前，人们对这三类酶的分子生物学特性、作用机理和组成成分等的认识研究有了较大突破。γ分泌酶是由多个组分组成的多酶复合体，除能裂解APP产生Aβ外，还参与产生其他30余种具有重要生理功能的I型膜蛋白的产生。因此，单纯抑制这类酶的活性来减少Aβ的产生必将会影响其它许多相关蛋白的正常功能。同样地，抑制β分泌酶的抑制剂的有效性和副作用问题也一直没有得到解决。人们至今尚未找到可应用于临床的抑制β或γ分泌酶酶切作用的有效药物。
研究表明，β分泌酶酶切位点氨基酸保守性很强。2005年Arbel等人以APP肽链中β分泌酶酶切位点作为靶点，制备出抗该酶切位点的特异性抗体。该抗体可以与APP有效结合，阻止β分泌酶的酶切作用，从而降低细胞A β的产生。这表明某些物质与APP肽链中β分泌酶酶切位点的结合，可以阻遏β分泌酶的酶促作用，这将成为降低Aβ产生的有效途径之一。然而，抗体分子较大，不易通过血脑屏障，并且抗体本身具有较好的抗原性，易引起变态反应等副作用。
发明内容
本发明的目的在于针对抗APP上β分泌酶酶切位点的特异性抗体分子较大，不易通过血脑屏障，且抗体具有抗原性，易引起变态反应的缺陷，提供一种多肽，其氨基酸序列为：His-Asp-Pro-Ala-Pro-Rrg-Thr，或由上述的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸，且具有抑制β分泌酶酶切作用、抑制Aβ聚集以及抑制Aβ细胞毒性作用的多肽。
在本发明的具体实施例中，将本发明所述多肽的N端乙酰化、缺失丙氨酸(序列为：His-Asp-Pro-Pro-Rrg-Thr)、丙氨酸置换成甘氨酸(序列为：His-Asp-Pro-Gly-Pro-Rrg-Thr)或插入组氨酸且在C末端连接亮氨酸(序列为：His-Asp-Pro-Ala-His-Pro-Rrg-Thr-Leu)，检测其与APP的β分泌酶酶切位点及Aβ42的特异性结合，结果显示，本发明所述多肽经过置换、缺失或插入氨基酸后仍保留与APP上的β分泌酶酶切位点和Aβ42同时结合的能力。
体外试验表明，本发明所述多肽可特异性结合APP上β分泌酶酶切位点，其氨基酸序列为：Glu-val-Lys-Met-Asp-Gla-Glu-Phe，抑制β分泌酶酶切作用，可明显抑制Aβ40和Aβ42的产生，并且可通过结合Aβ的N端多肽片段(结合的N端多肽序列为：Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser)来抑制Aβ42的聚集，保护SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞免受Aβ42毒性的影响。将该多肽注射到AD转基因小鼠(APP和PS1双转基因)的脑侧室进行动物记忆实验，结果表明，本发明所述多肽可以明显改善小鼠的空间记忆能力，减少脑内老年斑的数量及Aβ40和Aβ42的产量。
本发明还提供所述任一项多肽作为β分泌酶抑制剂的应用。
本发明还提供所述任一项多肽作为Aβ聚集抑制剂的应用。
本发明还提供所述任一项多肽在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
本发明所述多肽分子量小，易穿过血脑屏障，并且相比其它大蛋白分子如抗体等抗原性较差，副作用较小，在阿尔茨海默病的预防和治疗方面具有广泛的应用前景。
附图说明：
图1.Pbss1与APP上的β分泌酶酶切位点及Aβ结合的ELISA测定；
图2.经置换、缺失或插入氨基酸了的Pbss1与APP上的β分泌酶酶切位点及Aβ结合的ELISA测定；
Pbss1-ΔA为缺失丙氨酸的多肽(序列为：His-Asp-Pro-Pro-Rrg-Thr)；
Pbss1-Ac为N端乙酰化的多肽；
Pbss1-A4G为丙氨酸置换成甘氨酸的多肽(序列为：His-Asp-Pro-Gly-Pro-Rrg-Thr)；
Pbss1-HL为插入组氨酸且在C端连接亮氨酸的多肽(序列为：His-Asp-Pro-Ala-His-Pro-Rrg-Thr-Leu)；
图3.ThT荧光测定Pbss1抑制Aβ42的聚集；
图4.Pbss1抑制Aβ42聚集的显微镜观察；
图5.Pbss1抑制Aβ42的细胞毒性；
图6.Pbss1抑制Aβ40的细胞外产生；
图7.Pbss1抑制Aβ42的细胞外产生；
图8.注射Pbss1多肽的AD转基因小鼠的水迷宫实验；
图9.注射Pbss1多肽的AD转基因小鼠在目标象限的时间；
图10.注射Pbss1多肽的AD转基因小鼠穿台次数；
图11.注射Pbss1多肽的AD小鼠脑组织内老年斑定量测定。
具体实施方式：
本发明公开了一种可特异性结合APP上β分泌酶酶切位点的多肽及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
根据阿兹海默病AD的发病原理，治疗AD的根本方法应是减少β淀粉样蛋白(Aβ)的产生、抑制Aβ的聚集或加快Aβ的清除。本发明的发明人应用噬菌体显示技术，以含有APP上β分泌酶酶切位点和Aβ部分氨基端序列为一筛选底物，将1×108种七肽进行了四轮淘选，应用噬菌体ELISA从中筛选出了一条可同时与APP上的β分泌酶酶切位点和Aβ42明显结合的多肽Pbss1。Pbss1的序列为：His-Asp-Pro-Ala-Pro-Rrg-Thr。
研究显示，Pbss1在体外可以明显降低Aβ产生，且可以抑制Aβ的聚集及细胞毒性。应用AD转基因动物进行的体内实验结果表明，Pbss1可以明显改善小鼠的空间记忆能力，减少脑内老年斑的数量及Aβ40和Aβ42的产生。Aβ分子量很小，易穿过血脑屏障发挥疗效，并且抗原性较差，副作用较小，是一条极具AD治疗潜力的多肽。
本发明所述多肽Pbss1为一七肽，可由按常规方法合成制备。我们用以实验的Pbss1多肽纯度为大于或等于95％。Pbss1保存于-20℃，避免反复冻融。
本发明所有的实验数据都是通过至少3次独立的实验获得的，实验数据表示为平均数加减标准差。数据的统计分析是应用One-wayANOVA软件进行，多组比较分析则应用Duncan’s test。
以下结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1.Pbss1与APP上的β分泌酶酶切位点及Aβ42的特异性结合
分别将PBS缓冲液配制的APP上的β分泌酶酶切位点多肽(上海吉尔多肽公司)、Aβ42(American Peptide Co.)及阴性对照多肽以1μg/孔包被96孔高亲和力酶标板，4℃过夜。以BSA封闭酶标板上未与多肽结合的空白位点，然后加入连接有6个组氨酸作为标签的Pbss11μg/孔，室温作用2h。洗涤后，加入能与组氨酸标签结合的偶联HRP的抗体，室温作用1h。洗涤后，加入底物TMB，显色15分钟后，以多功能酶标仪测定450nm处的吸光度。
在相同的条件下重复三次，结果见图1，图中数据为三次的平均值，error bar为SD，与阴性对照相比，＊，P＜0.01，表明Pbss1可与APP上的β分泌酶酶切位点和Aβ42同时结合。
实施例2.Pbss1的氨基酸经置换、缺失或插入仍与APP的β分泌酶酶切位点及Aβ42的特异性结合
将本发明所述多肽Pbss1的N端乙酰化、缺失丙氨酸(序列为：His-Asp-Pro-Pro-Rrg-Thr)、丙氨酸置换成甘氨酸(序列为：His-Asp-Pro-Gly-Pro-Rrg-Thr)或插入组氨酸且在末端连接亮氨酸(序列为：His-Asp-Pro-Ala-His-Pro-Rrg-Thr-Leu)，然后按照实施例1所述试验方法检测与APP的β分泌酶酶切位点及Aβ42的特异性结合，用ELISA方法测定OD值，结果见图2。表明Pbss1经过某些修饰、某个氨基酸经置换、缺失或在多肽中增加氨基酸后仍保留与APP上的β分泌酶酶切位点和Aβ42同时结合的能力(与阴性对照相比，P＜0.01)。
实施例3.Pbss1体外抑制Aβ42的聚集
1)将国外购买的Aβ42(American Peptide Conpany，USA)六氟异丙醇(HFIP)溶解至1mg/ml，室温超声波处理10min，分装到epidorf管中，于真空中挥发HFIP，然后于-20℃保存。用前将HFIP处理过的Aβ42在室温放置20min，然后加入二甲基亚砜(DMSO)，使Aβ42的浓度为1mg/ml，然后以0.02M pH 7.4的PBS缓冲液进行稀释至所需浓度。
2)将Pbss1溶解于0.02M pH 7.4的PBS缓冲液中，然后加入到Aβ42溶液，使Aβ42终浓度为10μM和Pbss1的终浓度为10μM和100μM。并以不加Pbss1的Aβ42溶液做为对照。将所有样品于37℃放置24小时。
3)将硫黄素(ThT)溶解在pH 6.5、50mM的磷酸盐缓冲液使其浓度为5μM。取放置37℃24小时后的样品20μl加入到含有180μl ThT溶液的黑色酶标板中。混匀后在多功能酶标仪上以450nm激发波长和482nm的发射波长测定ThT的荧光强度。该实验重复三次，将各样品的荧光强度减去ThT本身的背景荧光，并分析样品之间的差异显著情况，结果见图3。与单独的Aβ42样品相比，＊，P＜0.05；＊＊，P＜0.01，结果显示加入Pbss1后的Aβ42荧光强度显著低于单独Aβ42的样品。由于ThT与Aβ42聚集后的聚集物中的β-片层结合后才可激发出荧光，荧光越强，表明Aβ42聚集越多。
将放置37℃24小时后的样品应用透射显微镜进行形态观察。样品各10μl滴加到200目的铜网格中，20min后用滤纸吸干样品，再各取10μl 2.5％的戊二醛滴在网孔中作用5min，用滤纸吸干戊二醛后，再用双氧铀染料10μl滴在铜网上作用30s，吸干后，晾干。在透射电镜下观察样品，电压80kV，放大倍数为40K。单独孵育的Aβ42可聚集成许多长纤维，如图4A所示，而加入100μM Pbss1的Aβ42不能够聚集成纤维状体，只形成了一些寡聚体，如图4B所示，标尺为1微米。
实施例4.Pbss1体外抑制Aβ42的细胞毒性
用含10％胎牛血清的培养基(MEM，Invotrigen)将SH-SY5Y细胞配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔体积100μL。细胞于37℃培养24小时，培养箱CO2浓度为5％。每孔加入样品后(Aβ42与Pbss1的混合物，AB 42alone及PBS对照)，Aβ42蛋白的终浓度是1μM，Pbss1的终浓度是4μM和10μM。细胞继续培养48小时后，每孔加MTT溶液(5mg/mL)10μL，37℃孵育3小时，终止培养，每孔加100μL晶体溶解液(10％SDS和5％异丁醇溶解在0.01M HCL中)，37℃孵育过夜，使结晶物充分溶解。在多功能酶联免疫检测仪上以570nm波长测定各孔光吸收值。减去本底后，以样品的吸光度除以不加样品的细胞的吸光度作为细胞的活性指标，并分析样品之间的差异显著情况，与单独的Aβ42样品相比，＊，P＜0.05；＊＊，P＜0.01，结果如图5所示。
实施例5.Pbss1体外抑制Aβ42的产生
应用Aβ42和Aβ42试剂盒(Invotrigen，USA)测定细胞培养液中Aβ40和Aβ42的量，按照厂家说明书进行实验测试。简述如下：1)将转染APP基因的人胚肾细胞(7PA2，由美国哈佛大学医学院馈赠)在6孔板上培养至丰度为90％时，更换无血清培养基，加入PBS和终浓度为3μM、100μM的Pbss1，继续培养15小时。
2)收集培养液，离心除细胞碎片。
3)应用200μl 2％脱脂奶粉封闭ELISA微孔板，置37℃2小时。
4)加入100μl(1μg/ml)各细胞培养液，置37℃1小时。
5)甩去样品溶液，以含0.05％的Tween-20PBS洗涤微孔板3次。
6)加入100μl(1∶2000稀释)特异结合Aβ42的鼠源单抗，置37℃1小时。
7)洗涤同步骤5)。
8)加入100μl(1∶1000稀释)HRP标记的羊抗鼠二抗，置37℃1小时。
9)洗涤同步骤5)。
10)加入100μl TMB显色，以1N的硫酸终止显色反应。
11)应用酶标检测仪测定450nm处的光吸收值。
结果显示，加入Pbss1多肽后细胞培养液中，Aβ40(见图6)和Aβ42(见图7)的水平都明显降低，与加入PBS对照相比，＊，P＜0.01。
实施例6.Pbss1改善AD转基因小鼠的记忆能力
实验方法：
1)脑侧室注射：将12月龄大的转APP和PS1基因的小鼠随机分为注射多肽Pbss1和PBS组，每组7只。同时以7只年龄相似的野生型小鼠(为非AD型)做为对照。脑内注射前12h对小鼠禁食不禁水。首先将小鼠麻醉，麻醉剂量为：25g小鼠腹腔注射0.1mL浓度为10％的水合氯醛。将小鼠固定在立体定位仪上，参照标准图谱(AcademicPublish)进行脑立体定位侧室注射给药。小鼠右侧脑室注射定位参数为：前囱后0.8mm，中线旁开0.8mm，硬膜下2.5mm。用无菌水溶解Pbss1至1mg/ml，注射剂量为5μL。每只动物注射时间为5min，留针10min。注射14天后，对小鼠进行水迷宫记忆能力检测。
2)记忆力训练：小鼠水迷宫训练之前放在室温25℃，湿度46％的环境适应3天。所有行为学检测试验中均采用随机双盲的方式。训练前，除去平台，在水槽中央轻轻放入，让其自由游动60s。测定每组小鼠游泳象限偏好，以选择将对面水槽的壁，作为该小鼠初始释放位置。第一次训练前让小鼠站在平台(平台直径10厘米)上15s，让它记忆一下池(直径1.1米)中台的空间位置。平台放在第二象限中部，并且平台的上表面距水面1.5厘米。池水中加入奶粉，以增加动物的视觉反差，利于图像记录。每天按指定投放点，训练小鼠4次。将小鼠面朝池壁，轻轻放入水中，让其在水槽中游泳60s。小鼠在台上站立2s就停止计时，认为上台，训练时间每次最长为60s。期间应用软件(购自中国医科院药物所)记录其轨迹以及从入水到爬上平台的时间，即潜伏期。如果小鼠在60s内找到平台则让其在平台上停留20s。如果小鼠在60s内找不到平台，则在60s后由实验人员引导其上平台，并让其在平台上停留20s。
3)记忆力测试：小鼠水迷宫训练8天，8天训练完后，撤掉水下平台。24h后，测定记忆保持力。将小鼠放入池中游泳60s，以录像和软件系统记录实验结果。一天内进行3次测定后，软件统计每组小鼠穿台次数、首次穿台所需时间及在各相限内的时间。
随着训练时间的增长，野生组小鼠找到台的潜伏期逐渐缩短，6天后即达平衡状态。注射Pbss1的小鼠找到台的潜伏期在训练到第6天时和8天时，与注射PBS的阴性对照相比具有显著差异(与注射PBS组相比，＊，P＜0.05；＊＊，P＜0.01)，结果见图8，表明注射Pbss1后的小鼠的空间记忆能力明显好于注射PBS的对照组。
撤台测试实验结果表明，注射Pbss1的小鼠在目标象限(即有平台的象限)的时间明显高于注射PBS对照组，与注射PBS组相比，＊，P＜0.05，结果见图9。并且注射Pbs s1的小鼠穿台次数也明显高于注射PBS的对照组，与注射PBS组相比，＊，P＜0.05，结果见图10。
实施例7.Pbss1降低AD转基因小鼠脑内老年斑的数量
免疫组化染色方法检测Pbss1降低AD转基因小鼠脑内老年斑的数量：
1)小鼠心脏灌流，取脑组织，进行石蜡包埋。切片后脱蜡处理，并修复切片。
2)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3％H2O2，室温封闭5～10min，用水洗3次。
3)滴加2％BSA，1h后甩去多余液体。
4)滴加一抗，6E10(1∶1000)37℃作用1h。然后以PBS洗三次，每次2min。
5)滴加含有1％BSA的生物素化羊抗鼠(1∶200)PBS溶液，37℃作用1h。PBC洗3次，每次2min。
6)滴加联接HRP的亲和素(1∶100)，37℃20min。PBS洗4次，每次5min。
7)加入DAB显色(DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度))。
8)蒸馏水冲洗。苏木素复染2min、盐酸酒精分化。
9)脱水、透明、封片、镜检。
检测结果：
注射缓冲液PBS的小鼠海马和皮层里的老年斑数量和面积明显多于注射多肽Pbss1的海马和皮层)里的老年斑。应用软件系统(visiopharm)测定注射多肽(n＝7)及对照小鼠(n＝7)海马和皮层(每只动物每个部位检测10-12张切片)的老年斑面积。统计学分析表明，注射多肽Pbss1的小鼠老年斑面积明显减少(与注射PBS组相比，＊，P＜0.01)，结果如图11所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.多肽，其氨基酸序列如(a)所示，(a)：His-Asp-Pro-Ala-Pro-Arg-Thr。
2.多肽，其为权利要求1所述多肽N端乙酰化。
3.根据权利要求1-2任一项所述多肽在制备β分泌酶抑制剂中的应用。
4.根据权利要求1-2任一项所述多肽在制备Aβ聚集抑制剂中的应用。
5.根据权利要求1-2任一项所述多肽在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
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