CN1178667C - 适用于治疗老年性痴呆的平均分子量为2400d的糖胺聚糖 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用平均分子量为2400 D的糖胺聚糖制备适用于治疗老年性痴呆，特别是治疗早老性痴呆或SDAT(老年性痴呆阿尔茨海默型)以及猝发和创伤造成的脑神经损伤的药物组合物的用途。

Description

适用于治疗老年性痴呆的平均分子量 为2400 D的糖胺聚糖
本发明领域
本发明涉及适用于治疗老年性痴呆以及猝发和创伤造成的脑神经损伤的低分子量的糖胺聚糖。
先前文献
老年性痴呆，特别是阿尔茨海默型，主要特征是在斑中有淀粉样物质脑沉积，或者在脑血管中(血管淀粉样蛋白)或者在脑实质中(脑淀粉样蛋白)，都定义为β淀粉样蛋白或Aβ。老年性痴呆在病理生理水平的另一典型特征是在神经元中存在纤维状缠结，称为NFT(神经纤维缠结)。
已知蛋白聚糖(PGs)特别是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)参与Aβ多聚化或NFTs的聚合，也与涉及早老性痴呆或一般意义的老年性痴呆的其它病理过程有关(Snow AD；Sekiguchi R；Nicholin D等“硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Perlaken)在大鼠脑中的纤维β淀粉样蛋白的沉积和保持的模型系统中的重要作用”。Neuron 1994；12：219-234)和(Perry G；Sieslak SL；Richey P，Kawai M等“硫酸乙酰肝素蛋白聚糖与神经纤维缠结的联系”。J.Neurosci.1991；11：3679-3683)。
此外，Snow的原始文献(Willmer JP；Snow AD；Kisilevski R.“硫酸乙酰肝素蛋白聚糖与早老性痴呆的淀粉状蛋白产生性损伤的关系的证实”。J.Neuropath.Exp.Neurol.1986；45：340-346)揭示患有老年性痴呆的病人的脑淀粉样蛋白斑中含有Pgs和糖胺聚糖(GAGs)。
多项研究显示(Kalaria RN；Kroon SN；Grahovak I；Perry G.“在早老性痴呆的皮层淀粉状蛋白沉积中的乙酰胆碱酯酶及其与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的联系”。Neuroscience 1992；51：177-184)PGs和淀粉样蛋白之间的联系可能是与β淀粉样蛋白(AβPP)的前体直接联接或通过与包括Aβ的神经毒素序列的Aβ1-41或Aβ1-43联接造成的。
Pgs证实还可增加Tau-2蛋白质的多聚化(Perry G；Sieslak SL；Richey P，Kawai M等“硫酸乙酰肝素蛋白聚糖与神经纤维缠结的联系”。J.Neurosci.1991；11：3679-3683)，Tau-2是形成神经纤维缠结(NFT)的原因。
另外，在Lorens等进行的研究中(Lorens SA；Gushawan BS；VanDe Kar L；Walegnga JM；Fareed J.“硫酸粘多糖治疗在老年Fischer344雄性大鼠中的行为，内分泌和神经化学作用”。SeminThromb.Haemost.17 Suppl.1993；2：164-173)显示出老年鼠在口服高分子量糖胺聚糖(GAP or glycosaminoglycans polysulfated orAteroid)后行为缺陷有改善。
Conti等(Conti L；Placidi GF；Cassano GB；“Ateroid 治疗痴呆：老年痴呆的临床试验(Eds.Ban E；Lehmann HE)诊断和治疗的结果”Mod.Probl.Pharmacopsychiatry.Basel，Larger 1989 vol.2，pp76-84)表明患老年性痴呆的病人在使用Ateroid治疗后比使用安慰剂处理的病人有精神病理参数特征的改善和显著较高的社会行为方式。
Parnetti等(Parnetti；Ban TA；Senin U.“GlycosaminoglycanPolysulfate在原发性变性性痴呆中”。Neuropsychobiology 1995；31：76-80)表明Ateroid可能显著改善老年性痴呆中改变的某些生化参数，诸如血斑的单胺氧化酶和脑脊髓流质中的多巴胺和5-羟色胺水平。
这些观察暗示Ateroid可能有助于治疗老年性痴呆，并且U.Cornelli和T.Bann已经在1988年获得使用这种产物治疗老年性痴呆的专利(EP293974)。
概述
现在我们令人惊讶的发现在体内实验中从肝素解聚获得的平均分子量为2,400 D的糖胺聚糖级分显示对β淀粉样蛋白形成的抑制以及促进神经元生长特别有效。
有较低平均分子量(640 D)或较高分子量(4800 D)的级分有明确较低或可以忽略的效果。
因而，可以使用平均分子量为2400 D的糖胺聚糖级分制备适用于治疗老年性痴呆，特别是治疗早老性痴呆或SDAT(老年性痴呆阿尔茨海默型)以及治疗猝发和创伤造成的脑神经损伤的药物组合物。
附图的简要说明
图1是如实施例所述获得的平均分子量为2,400(±200)的糖胺聚糖级分的HPLC检测。
图2是如实施例所述获得的平均分子量为2,400(±200)的糖胺聚糖级分的NMR检测。
本发明的详细描述
本发明涉及使用平均分子量为2400 D的糖胺聚糖级分制备适用于治疗老年性痴呆，特别是治疗早老性痴呆或SDAT(老年性痴呆阿尔茨海默型)以及治疗猝发和创伤造成的脑神经损伤的药物组合物的用途。
上述糖胺聚糖级分是通过肝素的解聚获得的，优选的按照包括下列步骤的方法进行：
a)根据U.S.P.4,987,222专利使用来自Co 60的γ射线处理肝素水溶液；
b)在Sephadex G/50介质树脂上通过凝胶渗透分级分离步骤a)获得的溶液；
c)将分子量1,000到3,000的级分的混合物在截断值为600 D下超滤，清洗并冷冻-干燥；
d)将冷冻-干燥的产物溶解并在Sephadex G/25介质树脂上通过凝胶渗透分级分离；
e)收集对应于平均分子量2,400 D的分子量1,920 D至2,560 D的级分并混合。
为了使用本发明的优选方法制备平均分子量2,400 D的糖胺聚糖级分，首先使用强度范围120 KGy至150KGy，随后根据肝素分子量使用25 KGy的剂量的Co 60γ射线处理10％肝素水溶液。
将照射的溶液在300 D截断值超滤，纯化，无菌过滤并冷冻-干燥，获得“解聚母液”肝素。
将“解聚母液”肝素溶于0.3M NaCl溶液然后在Sephadex G/50介质树脂上通过凝胶渗透分级分离。分子量＜3,000 D(大约10％)的级分形成本发明的粗原料。
对该混合物的第一步处理包括在600 D截断值超滤，以除掉解聚过程产生的分子片段。
用0.3M NaCl冲洗超滤混合物直到透过物不再出现对咔唑的反应。
将终混合物用蒸馏水调节至大约8％的浓度，用0.2μ膜过滤除菌并冷冻-干燥。
将冷冻-干燥的产物溶于0.3M NaCl溶液，浓度为10％至15％(w/v)。
为了获得平均分子量为2,400 D的级分，进行第二次凝胶渗透处理，保持与第一次凝胶渗透大致相同的参数，但使用特定特征的Sephadex G/25介质。
使用的预实验柱可以是BP 252/15型的，有下列特征：
·高度.................................：105厘米
·树脂体积：...........................：5,200毫升
·流速.................................：1,000毫升/小时
采用的参数是：
·Ve...................................＝17,000毫升
·Ve/Vo................................＝1/R＝1.26
·R....................................＝0.79
·K....................................＝0.09＝(Ve-Vo)∶(Vt-Vo)
其中：
·Ve＝洗脱体积
·Vt＝树脂总体积
·Vo＝死体积(输出的初始溶液)
·R＝分辨率(峰振幅)
收集的第二次凝胶渗透的10至12级分含有的一系列分子的分子量范围从3,000 D到大约1,500 D。为了制备本发明的糖胺聚糖级分，只收集分子量范围1,920 D至2,560 D的级分并混合。
将获取的溶液在300 D截断值超滤以除去氯化钠。
将溶液浓度调节为大约10％，0.2μ过滤并冷冻-干燥。
这种级分构成分子量＜3,000 D的级分总量的大约80％。
依据本发明的方法，无论对于工艺产率还是对于分子组成的稳定性而言获得的所需糖胺聚糖级分都具有显著的重复性指数。
下面报告了本发明的糖胺聚糖级分的特征。
化学-物理特征
外观...............................：淡黄色粉末
平均分子量.........................：2,400 D(±200)
分子量分布.........................：95％＜2,560 D-＞1,920 D
多分散指数.........................：＜1.20
有机硫.............................：9.5-11.5％
SO3/COOH比例.......................：2.3-2.6
比旋光.............................：＞+35°
HPLC...............................：图1
NMR................................：图2
平均分子量是使用排阻层析通过HPLC与分子量＝3,700的LMW肝素参照标准物质no.la批次(PH.EUR)做比较测定的。
硫酸化百分比率
检测了三个样品，结果如表1。
表1
脱硫酸化       GlcNSO3·6SO3    GlcNac      GlcNSO3·3，6SO3
糖醛酸         ％                  ％           ％
％
34             85                  13           7
33             85                  13           6
31             85                  14           7
百分数值是考虑NMR测定的两个特定区域的和经计算机计算获得。
脱硫酸化糖醛酸：相对于在100.5至106ppm总糖醛酸，它在信号102.2至106ppm的区域。
葡糖胺.NSO3-6-硫酸化的：相对于葡糖胺-6-硫酸68ppm，它在信号62.5ppm的区域。
葡糖胺.N乙酰化的：相对于从信号61至54ppm的区域，它在信号55.5ppm的区域。
葡糖胺.N，3硫酸化的：相对于从信号61至54ppm的区域，它在信号59ppm的区域。
葡糖胺C.6的硫酸化数值证实比分子量4,500 D(84个平均)的级分低。
这是由于随着分子量的降低，信号落在葡糖胺6脱硫酸化的C6区域的还原末端单位上的仲醇基团增加。
结构特征
图1报告了HPLC的95％分子量分布在2,560 D至1,920 D范围的级分糖胺聚糖的图谱，对应于4-5构成的二糖。
图2报告了同一级分的NMR图谱，其中注意到缺失了在γ照射的解聚中被去掉的连接部位的特征性的84至85ppm的信号。半乳糖苷链和它的含氮的组分的分离代表了这种糖级分的特定特征，使其没有干扰地起作用，通常是病理的特征，该特征来源于具有不同氨基酸组成的肽结构的存在。
NMR分析还揭示在末端区域只有完整的环或最终由脂肪族“残余”构成。
还原末端的环从不脱硫酸化。
没有指出还原末端脱硫酸化的葡糖醛(glucuronic)结构，因为γ射线破坏了它们。
非还原端的环中的末端C4s难以与非末端C4s区分，因为它们处于相同区域；唯一明确确定的是与活性五聚体的葡糖醛酸紧邻的NS，3S葡糖胺。
结构核心对应于实际未改变硫酸化指数的初始肝素。
来自GlcNSO36SO3和IdoA2SO3还原基团的异头信号证实本发明的糖胺聚糖级分是末端单位与来自天然肝素的片段的那些类似的物质。
特别适于本发明应用的是平均分子量为2,400 D，多分散指数低于1.20，完全没有肽成分并且在还原末端没有脱硫酸化单位，未进行再硫酸化处理并且没有催化剂下获得的糖胺聚糖级分。
生物学特征
Ph.E.肝素活性＝无
USP肝素活性＝无
抗Xa活性     ＝＜50U aXa/mg
抗IIa活性    ＝＜10U aIIa/mg
从以上报告的特征，表明本发明的糖胺聚糖级分证实从凝结参数来说没有肝素活性，虽然保留了肝素分子的结构特征，明显地有远低于肝素的分子量。
实施例
将分子量14,000 D和活性为190U/mg的来自猪肠黏膜的100g肝素钠溶于1L蒸馏并除气的水中。将溶液倒入派热克斯玻璃(Pyrex)容器中，容器在氩沸腾后用玻璃塞封闭。
将溶液用Co 60的γ射线全部在130kGy并随后在25kGy的剂量处理，获得解聚的肝素。
将照射的溶液在300 D截断值超滤，随后通过3％NaCl纯化并冷冻-干燥，在浓缩至大约10％后。
将这种“解聚母液”肝素以10％溶于0.3M NaCl溶液并通过含有Sephadex G 50介质的凝胶渗透柱分级分离。
在分离了分子量＞8,000 D的组分和相当于4,500 D的肝素的等份后，回收到分子量＜3,000 D的级分。
将这些级分在600 D截断值超滤纯化除去解聚处理后的分子片段。
在0.3M NaCl系列冲洗后达到渗透液不再出现对咔唑的反应，将溶液浓缩到大约8％并将透过0.2微米过滤的溶液冷冻-干燥。
将冷冻-干燥的产物以终浓度10％(x/v)的量溶于0.3M NaCl。将这一溶液在含有Sephadex G 25介质的柱上凝胶渗透分级分离。收集分子量范围1,920 D至2,560 D的级分。
将获得的溶液在300 D截断值超滤纯化以除去氯化钠。将溶液浓缩到大约10％并冷冻干燥。
产量：大约9克淡黄色粉末。检测：平均分子量＝2,400(±200)；有机硫＝9.9％。
硫酸盐(sulfates)/羧基比率＝2.5；抗Xa活性＝45U antiXa/mg。HPLC检测，图1。NMR检测，图2。
为了比较，还用相同的方法制备了下列糖胺聚糖级分：
◆平均分子量640 D的级分(从320到1,600 D)；
◆平均分子量4,800 D的级分(从3,350到6,060 D)；
由于来自下面报告的实验的药物学特征，可以将平均分子量2,400D的糖胺聚糖用于制备适于治疗老年性痴呆，特别是治疗早老性痴呆或SDAT(老年性痴呆阿尔茨海默型)，以及治疗猝发和创伤造成的脑神经损伤和治疗神经退化等药物组合物。
上述组合物在与药物学可接受的稀释剂或赋形剂的混合物中包含药学有效量的上述糖胺聚糖，并且可以将它们制备成适于皮下、肌肉内、静脉内和口服给药的形式。
上述组合物在单位剂量中含有50mg至200mg的上述糖胺聚糖。
本发明还包括一种治疗老年性痴呆，特别是早老性痴呆或SDAT，以及猝发和创伤造成的脑神经损伤病人的治疗方法，包括将平均分子量2,400 D的糖胺聚糖以每天10至400mg的量给药。特别地，对于皮下、肌肉内和静脉内给药预期量为每天10至200mg，对于口服给药预期量为每天25至400mg。
药理学实验
为了研究本发明的糖胺聚糖级分的药物学活性，使用大鼠再造某些老年性痴呆的典型损伤作为实验模型(Sigurdsson EM；Lorens SA；Hejna MJ；Dong WX；Lee JM.“Local and Distal HistopathologicalEffects of Unilateral Amyloid-β25-35 Injections into theAmygdala of Young F344 Rats”.Neuro Biol Aging 1996；17：893-901)。
特别是研究了下列参数：
◆Tau-2蛋白质，与β淀粉样蛋白物质反应的实体相关(间接反应性)；
◆GFAP蛋白(胶质原纤维酸性蛋白)，与星形细胞对β淀粉样蛋白的反应性有关(直接反应性)。
实验中使用的材料
·β淀粉样蛋白：
在三氟乙酸(TFA)Aβ25-35钠盐(VEH1)，肽含量82-89％(BACHEM，Torrance，CA)。
在就要使用前将有各自的赋形剂(VEH1)的β淀粉样蛋白用Nanopure的水稀释到浓度为5nmol/3.0ml并保存在4℃。
·糖胺聚糖，TGSS：
使用了三种如上制备的，有如下表中的不同分子量的TGSS(定制糖胺聚糖)：
    TGSS类型   平均分子量(D)     平均单糖数目
    C8    640(320-1600)     2
    C3    2400(1920-2560)     8
    C7    4800(3520-6060)     15
这些产物由可溶于水的淡黄色粉末构成，在室温下储藏在干燥器中。
为了注射大鼠制备了在生理溶液中浓度为1mg/ml的溶液(VEH2)。
将溶液在4℃保存，不超过两个星期。
·VEH1：三氟乙酸(TFA)(10nmol溶于3μl蒸馏水)，β淀粉样蛋白的赋形剂。
·VEH2：生理溶液，TGSS的赋形剂。
实验方法
实验使用的模型基于注射Aβ25-35到脑扁桃体中心-大脑区域(centro-cerebral region of the amygdala)的作用。
Aβ25-35的氨基酸序列认为是神经毒性的(Yankner BA；Duffy LK；Kirscner DA；“Neurotrophic and Neurotoxic Effects of Amyloid-βProtein.Reversal by Tachykini Neuropeptides”.Science 1990：250-282)，因为它产生典型的为Aβ1-41或Aβ1-43的损伤。
实验中使用年轻(3-4个月)雄性大鼠，Fischer 344品系，使其在右扁桃体部位接受脑内注射，使用5nmol/3.0μl Aβ25-35或相应的赋形剂(VEH1)。
从脑内注射Aβ前两天开始到上述注射后32天，按下面给出的剂量将TGSS或相应的VEH2赋形剂每天皮下给药两次。
对于组织学检测，将动物用戊巴比妥钠麻醉并经主动脉方式灌注4％甲醛。
以0.2mm间隔切5片冠状切片(coronal section)(40μm)。
将切片与抗Tau-2蛋白质抗体和抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体接触。
Fischer 344大鼠来自Harlan Sprague-Dawley Inc.(Indianapolis In)
到达时它们重250-300g，3到4个月龄。
按照AAALAC(American Association Animal Laboratory andCare)批准的饲养条件将动物置于亮-暗循环为12小时(早晨7点开始亮)单独的笼子中。
它们可随意摄取食物和水并且将它们在实验前置于这种环境条件下2-3星期。
脑内注射Aβ25-35是在用戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.；Butler，Columbus，OH)麻醉后进行的。
在麻醉动物时，同时肌肉内注射阿托品硫酸盐(0.4mg/kg；Sigma，St.Louis，MO)和氨苄青霉素钠盐(50mg/kg；Sigma，St.Loise，MO)。使用立体定位(Kopf)装置设置为深度在耳间(interaural)线下不超过3.3mm，进行脑内注射到右扁桃体。
注射的坐标基于Paxions和Watson图(Paxion and Watson atals)确定为从颅前卤(cranial bregma)坐标为AP-3.0，ML4.6和DV8.8。
将前后(AP)坐标定位在扁桃体结构较宽处。
将中间侧面(medium lateral)(ML)坐标定位在扁桃体的中间和基侧核心并在最后将背腹(DV)坐标置于扁桃体背腹阈限中心。
6分钟内灌注3μl注射体积，利用使用CMA/100型微量注射器(Carnegie Medici AD，Soln，Sweden)的泵。注射完成后将插管保留在原位2分钟然后小心取下。
手术后将动物置于加热盘中直到它们恢复适当的反射(rightingreflex)。
治疗35天后将动物用戊巴比妥钠(100mg/kg I.P.)麻醉并用250ml pH7.4的0.1M磷酸钠/钾缓冲液(PB)经主动脉灌注
随后灌注500ml PB中的4％甲醛，室温下速度为500ml/hour。
刚开始灌注后即通过主动脉方式注射1U/g肝素(Upjohn Kalamzoo.MI)。
灌注后分离脑并使用20％的蔗糖溶液固定1个小时，在注射部位附近切成6mm的块，保存在4℃下和20％蔗糖及0.1％叠氮钠溶液的0.01％杆菌肽的PB中24小时。
最后将组织块转移到20％甘油和2％二甲基亚砜的0.1M磷酸钠缓冲液然后保存在4℃，直到切片时。
40μm的冠状切片以0.2mm的间距顺次切5片，并进行组织学检测其Tau-2和GFAP蛋白质。
组织学检测
甲苯基紫(Cresyl violet)
将切片用二甲苯冲洗并用乙醇和水进行水化。将切片与含有200ml0.2M乙酸，133ml 0.2M乙酸钠和67ml 0.1％甲苯基乙酸盐的溶液接触进行染色。然后将切片通过随后的乙醇冲洗脱水并用二甲苯洗净。用合适的载玻片覆盖这样着色的切片，用于显微镜观察。
刚果红
将切片洗净并用乙醇和水通过一系列处理水化。
将切片与含有1％刚果红和50％乙醇的溶液接触1个小时进行染色。
然后将切片浸入碳酸锂饱和的溶液并用流水洗15分钟。在哈里斯苏木精中复染色2分钟然后用水并加入1％醇酸溶液。将切片在水中清洗，浸入硫酸铵水溶液并再次流水冲洗。最后将切片在乙醇中脱水并用二甲苯洗净。用合适的载玻片覆盖这样染色的切片用于显微镜观察。
Tau-2蛋白质
洗净40μm切片的冷冻保护液并在4℃下PBS缓冲液中保持过夜。
早晨将切片与tris缓冲溶液pH7.6(PBS)中0.3％的H2O2溶液接触30分钟，随后用PBS中0.3％的triton X-100溶液洗3次10分钟。然后将切片与Tau-2(Sigma)抗体以1∶500稀释在室温温育24小时。
抗体稀释液在PBS中含有2％的triton X-100，0.1％的叠氮钠，0.01％杆菌肽，2％血清白蛋白以及10％的正常马血清。最后将组织用含有0.3％triton X-100的PBS溶液洗3次，10分钟，随后与免疫球蛋白的抗体(Vectastain ABC Elite Kit，Vector LaboratoriesBurlinggame CA)在0.3％ triton X-100的PBS溶液中稀释1∶200温育1小时。使用0.3％triton X-100的PBS溶液冲洗2次共15分钟后，将组织与辣根抗生物素过氧化物酶(Vector)在0.3％ triton X-100的PBS溶液中稀释1∶200温育1小时。
然后将切片在PBS中洗1小时并且随后再用乙酸钠缓冲液(0.2MpH6.0)洗15分钟。将切片与3-3二氨基联苯胺4盐酸(DAB)和硫酸镍铵(35mg DAB，2.5g硫酸镍铵在100ml的0.3％ H2O2的乙酸钠缓冲液中)反应。
然后将切片置于乙酸钠缓冲液中并随后置于4℃的PBS中，保存过夜。
这样的操作后将切片干燥并用载玻片覆盖用于显微镜观察。
GFAP蛋白质
用Tau-2的方法染色，但抗体是稀释于羊血清而不是马血清中。
以1∶500稀释使用GFAP(DAKO，Denmark)初级抗体。
测量Aβ沉积物的大小检测甲苯基紫染色的切片。
以0.2mm的间隔测量Aβ沉积物的面积。还使用刚果红染色的载玻片的偏振光检测了Aβ沉积物的苹果绿折射率(apple greenrefractivity)。
这些组织化学内容表明与Tau-2反应的细胞在所有的冠状切片中都存在并且将星型细胞增多(astrocytosis)的值估计为0到2。
如果显示从1到2的阳性着色则认为动物是阳性的。
实验流程和结果
对每一个实验使用了不同的4组大鼠：
1.VEH1+VEH2组：向大鼠扁桃体注射VEH1(TFA)赋形剂并皮下注射VEH2(生理溶液)；
2.Aβ+VEH2组：向大鼠扁桃体注射Aβ25-35并皮下注射VEH2(生理溶液)；
3.Aβ+TGSS组：向大鼠扁桃体注射Aβ25-35并皮下注射TGSS；
4.VEH1+TGSS组：向大鼠扁桃体注射VEH1(TFA)赋形剂并皮下注射TGSS。
每一批的实验设计用于每组至少6只动物。
这样处理后使用了如下3种类型分子量不同的TGSS：
C3-2,400道尔顿，2.5mg/kg s.c.剂量
C8-640道尔顿，2.5mg/kg s.c.剂量
C7-4,800道尔顿，2.5mg/kg s.c.剂量。
研究的各TGSS均使用两个不同的实验以确认结果。
对于各类型的处理检测了下列数目的动物：
 处理  动物数目
 1.VEH1+VEH2  30
 2.Aβ+VEH2  36
 3a.Aβ+C3  23
 3b.Aβ+C8  17
 3c.Aβ+C7  21
 4.VEH1+TGSS(C3或C7或C8)  30
扁桃体内VEH1(没有淀粉样蛋白的对照)和任一种TGSS(C3或C7或C8)处理的动物总是与只用VEH1+VEH2赋形剂的对照组1实际上相同。
a)对Tau-2蛋白质的反应性(反应性细胞数目)：平均±标准偏差
处理  例数  反应性细胞数/组织切片
1.VEH1+VEH2  30  11±5
2.Aβ+VEH2  36  66±12
3a.Aβ+C3  23  25±16 p＜0.05 Vs Aβ+VEH2(Newman-Keuls检验)
3b.Aβ+C8  17  60±14
3c.Aβ+C7  21  22±17 p＜0.05 Vs Aβ+VEH2(Newman-Keuls检验)
4.VEH1+TGSS(C3或C7或C8)  30  10±3
从这些系列实验证实C3和C7都具有降低对Tau-2蛋白质的反应性的活性，而具有最低分子量的对应于二糖的C8未显示活性。
未用Aβ处理的对照与皮下注射生理溶液(1组)或TGSS(4组)的完全相同。
还通过对大鼠口服给药C3的实验证实了通过C3化合物的作用强烈降低对Tau-2蛋白质的反应性。
实验模型和筛选方法与上述相同，差别是将C3以20mg/kg的剂量口服而不是皮下给药。
从注射Aβ25-35三天前开始至该注射十四天后为止，每天一次进行C3给药。
注射Aβ25-35十四天后杀死大鼠。
下面的表中报告了获得的结果，可以观察到C3在Aβ25-35处理的大鼠中强烈降低对Tau-2蛋白质的反应性。
处理  例数  反应的细胞数/组织切片
Aβ+VEH2  6  52±7
Aβ+C3  6  9±2 p＜0.01(Student T检验)
b)星型细胞的反应性(代表反应性+1或+2的动物的％)：平均值
处理  例数  代表反应性+1或+2的动物的％
1.VEH1+VEH2  30  37
 2.Aβ+VEH2  36  87
 3a.Aβ+C3  23  35 p＜0.05 Vs Aβ+VEH2(χ2sec.Fisher)
 3b.Aβ+C8  17  88
3c.Aβ+C7 21 67
 4.VEH1+TGSS(C3或C7或C8)  30  26
对于星形细胞反应性，只有产物C3(3a组)显示显著的活性。产物C8和C7(3b组和3c组)无活性。
检查这些结果令人惊奇的发现平均分子量为2,400 D的C3 TGSS比具有较高和较低分子量的TGSS有明显高的活性。特别是平均分子量为2,400道尔顿的能最优地降低指出的与Tau-2蛋白质的反应性以及指出的与星形细胞的反应性。
在对大鼠的另一个实验中研究了静脉内给药后C3产品克服血脑屏障的能力。
为此目的使用了用氚(3H)标记的产物。标记对应于700,000DPM/mg的3H-C3。
静脉内给药2.5mg/kg后，杀死大鼠，戊巴比妥钠盐麻醉，固定时间45分钟。
检测了血液，脑脊髓液(CSF)和最终脑中(缓慢灌注从血管除去血液后)的标记水平。
从第四室(the fourth ventricle)用玻璃毛细管取CSF(在完全放掉动物的血后，数量通常超过200μl)。DPM是将20μl(脑)匀浆稀释于5ml生理溶液后通过闪烁估计的。
下表报告的结果显示3H-C3能以显著的量透过血脑屏障。
组织 例数  DPM/ml
血清 5  404±138.3
CSF 5  85±13.0
脑 5  217±217.2
在对照动物中，所有检测的组织中DPM/ml值总是低于41。
得到这些结果后，进行了血清、CSF和脑中存在抗Xa活性的对照。
已知Xa因子(凝血X因子)只能被含有超过四个糖的硫寡糖级分抑制。
在如上处理的系列大鼠中观察到静脉内以2.5mg/kg剂量注射C345分钟后，在血浆、CSF和脑组织中存在显著的抗Xa活性。
这进一步证实透过血脑屏障的产物由C3而非无活性的降解产物诸如二糖或四糖构成。
还检测了C3处理或未进行活性处理的注射了Aβ25-35的大鼠的神经元生长。
为此目的使用了快速高尔基染色方法，由于其复杂性只将其用于有限量的动物。
如前面所述，将C3以2.5mg/kg的剂量皮下注射，从脑内注射Aβ25-35之前两天开始，每天两次，连续32天。
检测了大脑的扣带回的V层的脑神经元。
本实验意味着检测树突长度以及末端分支数目与初级分支数目的比率(T/B比率)。
T/B比率越高神经元和联接的复杂性数目越高。
结果列于下表中。
处理  例数  树突长度％  T/B比率
VEH1+VEH2  7  100±2.1  4.3±0.15
Aβ+VEH2  8  94±2.0  4.0±0.16*
Aβ+C3  6  110±3.0  4.7±0.19**
*p＜0.05 Aβ+VEH2 Vs VEH1+VEH2  **p＜0.05 Aβ+VEH2 Vs Aβ+C3
表中显示Aβ对神经元生长产生损伤并且C3能够补偿这种损伤。另外可注意到C3有神经营养型活性，这在意味着神经元损伤的神经退化或创伤情况中有作用。

Claims (10)

1.平均分子量为2,400道尔顿的糖胺聚糖在制备适用于治疗老年性痴呆以及治疗意味着神经元损伤的神经退化或创伤的药物组合物中的用途。
2.权利要求1的用途，特征是上述老年性痴呆包括阿尔茨海默病。
3.权利要求1的用途，特征在于所述糖胺聚糖的分子量多分散指数小于1.20，完全不含肽成分，和在还原末端没有脱硫单元。
4.适用于治疗老年性痴呆以及治疗意味着神经元损伤的神经退化或创伤的药物组合物，包括与药物学可接受稀释剂或赋形剂混合的有效量的平均分子量为2,400道尔顿的糖胺聚糖。
5.权利要求4的组合物，特征是上述糖胺聚糖的分子量的多分散指数低于1.20，完全不含肽成分并且在还原末端没有脱硫单元。
6.权利要求4的组合物，特征在于所述糖胺聚糖是通过γ射线处理将肝素解聚随后经凝胶渗透获得的。
7.权利要求4的组合物，制备成适于皮下、肌肉内、静脉内和口服给药的形式。
8.权利要求4的组合物，特征在于所述组合物含有上述糖胺聚糖的量为每单元剂量50-200毫克。
9.权利要求4的组合物，特征在于所述糖胺聚糖能够穿过血脑屏障并能造成Tau-2蛋白质和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的降低以及能够促进神经元生长。
10.权利要求4的组合物，特征在于所述糖胺聚糖具有2400±200道尔顿的分子量。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8766217B2 (en) 2008-05-22 2014-07-01 Vladimir Yegorovich Balakin Multi-field charged particle cancer therapy method and apparatus
US8791435B2 (en) 2009-03-04 2014-07-29 Vladimir Egorovich Balakin Multi-field charged particle cancer therapy method and apparatus
US8841866B2 (en) 2008-05-22 2014-09-23 Vladimir Yegorovich Balakin Charged particle beam extraction method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US8896239B2 (en) 2008-05-22 2014-11-25 Vladimir Yegorovich Balakin Charged particle beam injection method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US8901509B2 (en) 2008-05-22 2014-12-02 Vladimir Yegorovich Balakin Multi-axis charged particle cancer therapy method and apparatus
US9058910B2 (en) 2008-05-22 2015-06-16 Vladimir Yegorovich Balakin Charged particle beam acceleration method and apparatus as part of a charged particle cancer therapy system

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1344781A1 (en) 2002-03-12 2003-09-17 Laboratori Derivati Organici S.P.A. Process for the depolymerization of glycosaminoglycanes and products obtained therefrom
ITMI20031023A1 (it) * 2003-05-21 2004-11-22 Umberto Cornelli Glicosaminoglicani aventi peso molecolare medio 2400 d atti al trattamento delle disfunzioni emozionali.
EP1524276A1 (en) * 2003-10-16 2005-04-20 Laboratori Derivati Organici S.P.A. Multistep process for the physical depolymerization of heparin and products obtained therefrom
US7939512B2 (en) 2004-10-13 2011-05-10 Laboratori Derivati Organici Spa Multistep process for the physical depolymerization of heparin and products obtained therefrom
ATE481094T1 (de) 2005-12-22 2010-10-15 Kiacta Sarl Behandlung von diabetischer nephropathie
WO2009007224A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Low molecular weight heparin derivatives having neuroprotective activity
US8609097B2 (en) * 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
EP2766495B1 (en) * 2011-10-14 2018-04-04 Centre National De La Recherche Scientifique Method of diagnosis, prognostic or treatment of neurodegenerative diseases
CN112426434A (zh) * 2020-11-04 2021-03-02 山东大学 硫酸乙酰肝素在防治阿尔兹海默症中的应用
CN114478816A (zh) * 2022-02-11 2022-05-13 上海兴糖生物技术有限公司 一种白玉蜗牛多糖及其制备方法和用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4351938A (en) * 1980-05-19 1982-09-28 Riker Laboratories, Inc. Anticoagulant substance
US4847338A (en) * 1985-03-28 1989-07-11 University Of Iowa Research Foundation Low molecular weight heparin fragments as inhibitors of complement activation
US4769696A (en) * 1986-05-01 1988-09-06 Toppan Printing Co., Ltd. Scanner set-up simulation apparatus
IT1213384B (it) * 1986-11-24 1989-12-20 Lab Derivati Organici Mediolan Processo per la preparazione controllata di gilcosaminoglicani a basso peso molecolare.
IT1205042B (it) 1987-05-28 1989-03-10 Crinos Industria Farmaco Composizione farmaceutica ad attivita' terapeutica per il trattamento della demenza senile di tipo alzheimer
EP0337327A1 (en) * 1988-04-09 1989-10-18 Bioiberica, S.A. Process for the preparation of new oligosaccharide fractions by controlled chemical depolimerization of heparin
IT1240615B (it) 1990-04-03 1993-12-17 Mediolanum Farmaceutici Spa Impiego del dermatan solfato nella prevenzione e terapia dell'invecchiamento cerebrale e degli stati di deficit funzionale del sistema nervoso centrale

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8766217B2 (en) 2008-05-22 2014-07-01 Vladimir Yegorovich Balakin Multi-field charged particle cancer therapy method and apparatus
US8841866B2 (en) 2008-05-22 2014-09-23 Vladimir Yegorovich Balakin Charged particle beam extraction method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US8896239B2 (en) 2008-05-22 2014-11-25 Vladimir Yegorovich Balakin Charged particle beam injection method and apparatus used in conjunction with a charged particle cancer therapy system
US8901509B2 (en) 2008-05-22 2014-12-02 Vladimir Yegorovich Balakin Multi-axis charged particle cancer therapy method and apparatus
US9058910B2 (en) 2008-05-22 2015-06-16 Vladimir Yegorovich Balakin Charged particle beam acceleration method and apparatus as part of a charged particle cancer therapy system
US8791435B2 (en) 2009-03-04 2014-07-29 Vladimir Egorovich Balakin Multi-field charged particle cancer therapy method and apparatus

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