CN1027895C - 没有被非常规病毒污染的糖神经鞘脂混合物的制备与纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于一种神经节苷脂混合物的制备方法，不含有非常规的、有生命危险的病毒污染物，不改变混合物对中枢和外周神经系统的生物和药理特性。
Description
本发明是关于一种特异性神经节苷脂混合物的制备方法和通过这样一种方法制得的产品，即是通过选择性地消除含有非常规的、有生命危险的病毒污染物，而不改变混合物对于中枢和外周神经系统作用的生物和药理特性。
含唾液酸的神经节苷脂、糖神经鞘脂是哺乳动物所有细胞膜的正常组分，并且在神经组织中较丰富（Ando S.：Neurochem.Int.5∶507，1983）。四种神经节苷脂，GM1、GD1a、GD1b和GT1b（根据Svennerholml.，J.Neurochem，10：613，1963命名）构成了哺乳动物脑的神经节苷脂总含量的80-90%。尤其神经节苷脂存在于血浆膜的外层，这就告诉我们它们在许多生物活性上和在通过细胞膜传递信息上（Fishman et al.：Science 194∶906，1976）起着重要作用，例如作为“传感器”和/或各种分子的受体。因此，它们在调节神经元的形成和中枢及外周神经系统修复方面起着关键性作用。
的确，有充分的文献证明，如通过神经元培养基体外研究所揭示的，通过特异性膜机理和通过与神经营养因子相互作用神经节苷脂较好地影响外周神经系统（PNS）和中枢神经系统（CNS）因损害而引起的功能性修复（Doherty P.et al.，J.Neuroohem.44∶1259，1985;skaper S.et al.，Molecular Neurobiology，3∶173，1989）。
特别是，如已经报导的在体内服用神经节苷脂可促进PNS在病
理条件下神经再生和功能性修复：如所描述的，对于创伤型神经病（Ceccarelli B.et al.，Adv.Exp.Med.Biol.71∶275，Plenum Press，New York，1976;Gorio A.et al.，Brain Res.7∶236，1980;Gario A.et al.，Neuroscience 8∶417，1983）、代谢型神经病（Norido F.et al.，Exp.Neurol.83：221，1984）和中毒型神经病（Di Gregorio F.et al.，Cancer Chemother.，Pharmacol.26∶31，1990）有积极的作用。
对于CNS，已大量报导了通过单涎神经节苷脂对于不同动物品种的各种神经元系统的局部缺血型（Cuello A.C.et al.，Brain Res.376∶373，1986;Karpiak S.E.et al.，CRC Critical Rev.in Neurobiology，vol.5，Issue 3，1990），创伤型损害（Tof-fano G.et al，Brain J.，Dev.Brain RES.，296∶233，1984）和神经元中毒型损害（JOhns son J.Dev.Brain Res.，16∶171，1984）所诱导的修复有积极作用。最近发现神经节苷脂可以抑制由谷氨酸盐诱导的蛋白激酶C的易位和激活（Vaccarino F.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，84∶8707，1987）。这种作用在局部缺血损伤情况下十分重要，有报导兴奋性氨基酸，如谷氨酸盐，起着决定性作用，这种氨基酸可触发导致神经元坏死的连锁反应（Cascade of events）。这一机理对损害周围地区存活的神经元较为有利，其可阻止退化变性并可响应局部营养因子来加速修复生长。
通过神经节苷脂的临床应用已充分证实了试验研究的结果。十多年来，神经节苷脂作为治疗剂已在几乎所有类型的外周神经病上使用，这些包括从因机械损伤引起的到由于毒素和缺损引起的，以及从感染和炎症的疾病到代谢的机能障碍等引起的各种外围神经病。已经证实
这些药物在单一一种和多种神经病、感觉运动原紊乱和影响自主神经系统疾病，例如许多神经病影响颅神经，例如Bell′s麻庳，三叉神经痛和带状疱疹引起的神经痛有同等的效应。神经节苷脂，特别是单涎神经节苷脂可广泛应用于CNS脉管或创伤型和这种疾病的后遗症（大脑的局部缺血、颅和脊柱外伤）中与急性损伤有关的所有疾病。
它们已证实CNS的修复活性还支持了它们用于慢性神经变性疾病，如帕金森氏症（Parkinson′s diseas）和阿尔茨海默氏病（Alz-heimer′s diseae）。它们天生是内源性药物（endocoids）、是神经元膜的天然组分，这一事实说明它们是极好的，以及即使在大剂量的延长治疗中，也没有出现在一些常规治疗外周神经病经常发生的副作用。
通常，合适的神经节苷脂混合物，例如下列一种配方：GM1从18%到24%，GD1a从36%到44%，GD1b从12%到18%，GT1b从16%到22%，或单一一种神经节苷脂成分，特别是单涎神经节苷脂GM1具有如所描述的那些生物活性。这些神经节苷脂，如合适混合物或单一成分，特别是单涎神经节苷脂GM1是从哺乳动物脑中提取出来的，因此有必要给出它们特殊的生物功能和它们先前描述的对于外周和中枢神经系统治疗上的应用，使用纯化方法保证最终产品绝对纯，并且没有生物和化学污染物。
很久以来，人们了解到在研究水平提取神经节苷脂是可能的（Tettamanti et al.，Biochim.e Biophys.Acta，296∶160，1973;Trams et al.，Biochim.e Biophys.Acta，60∶350，1962;Bogoch et al.，British J.Pharm.，18∶625，1962;Wiegandt et al.，Angew Chem.80∶89，1968;U.S.Patent No.3，436，413;和C.A.60，9851C，9895d），但以前的方法还没有开发一种能消除和破坏与
非常规病毒有关的成分的方法。当时之所以这样的一个原因，是这种影响用来提取脑所属的哺乳动物种属的这些疾病尚不知道。另一个原因是没有获得用作特异性识别潜在危险成分的试剂，而今，通过由分子生物技术的科学革命中，发现的最新获得的知识为基础发展起来的特殊方法，可以制备出这种有用试剂。
有时可以产生一种疾病的情况，其中致病因子或多种因子无法被识别。一种这种疾病情况是被称作牛的海绵状脑病（BSE），在1986年在英国首次报导（Wells G.et al.，Vet.Record，419，1986）。此名称是由于有病的动物脑组织出现海绵状而得名的。当用显微镜对组织切片分析发现，主要损伤包含大量的神经元液泡。
所有迹象表明这样一个事实，即BSE属于一组中枢神经系统变性脑病，该病结果总是致死，并由一组非常规传染因子引起的（Fraser et al.，Vet.Record 123∶472，1988;Hope et al.，Nature 336∶390，1988）。这一组还包括羊和山羊的瘙痒病，折磨被捕获的鹿的慢性消瘦病，养貂场中貂传染的脑病，和二种人的疾病（two human diseases）;库鲁病（Kuru）和克罗伊茨费尔特-雅各布病（Creutzfeldt-Jacob）。这些疾病引起的脑组织病理损伤在所有情况下是相似的以及可与BSE引起病相比较。许多理论提出了这些病原学因子的性质，这些病原学因子既不是细菌也不是病毒，又不象其它已知生物体，因此被认为是一种非常规病毒。由于它们有长的潜伏期（从传染到症状发作所用时间）的缘故，它们还被称作是“慢性病毒”（slow viruses）。
由于在1986年发现了几个病例，这种疾病在英国蔓延并已达到流行病的程度，感染的牲口有14000头牛，并以每周大约250-300个病例的速度稳步增长。这些感染的牲口几年内没有得病的
迹象（潜伏期是4-5年），但一旦症状出现，这些动物会迅速衰弱并死亡。
通过英国农业部中心兽医试验室（the Central Veterinary La-boratory of the British Ministry of Agriculture）的流行病学研究（Wilesmith et al.，Vet.Record.123∶638，1988）发现感染的来源是用含反刍动物尸体制成的，以粉状肉或骨头形式出售的动物饲料。由于这种脑病可在许多动物种属中传播，因此这种假设看来是合理的：BSE是传染的结果，这种传染通过引起瘙痒病的病原学因子，由这些能传染食物从羊身上传播开。（Morgan KL，Vet.Record 122∶445，1988）。
在这些研究结果的基础上，英国政府于1988年7月18日通过一条法令禁止出售和使用含有从反刍动物获得的动物蛋白的动物食料。
总的来看，许多因素结合在一起，使得英国BSE突然出现（Cherfas J.，Science，Feb.1990，523）。
首先，英国在70年代末和80年代初，羊的数量迅速增长，瘙痒病的发病率增加，与此同时，这种羊在欧洲流行已有250多年了（Pattison et al.，Vet.Record 90∶465，1972）。当时，继石油危机之后，生产动物饲料的工厂把它们加工动物尸体的方法改成低温系统，可能会使杀死抵抗力较强的瘙痒病因子的效率下降。除一家外，所有饲料生产厂家皆放弃使用苯、己烷和三氯乙烯溶剂以去除大豆、骨粉中过量脂粉。其中最重要的是：对这些产品加热以去掉溶剂这个最后的步骤因而被取消了：实际上这个阶段需要极高的温度。
此外，政府的政策鼓励饲养者生产更多的奶，并通过喂养丰富蛋
白食物，使小牛早点断奶。由于从肉和骨头制得的食物较比更为可靠蛋白质来的大豆和鱼制的食物更便宜，因此食物经常质量很差。寻找疾病是如何传播的研究，是BSE研究的基础。这些实验的最重要的方面在于：通过对这种致病因子传播的、识别内部种属障碍的限定，就有可能估计对任一种属BSE传染的危险性。
Fraser等（Vet.Record，123∶472，1988）证明该疾病可以通过牛传给鼠。他们从死于BSE的牛的脑中的提取物给小鼠接种，结果这小鼠也得了这种病。后来，Barlow等（Vet.Record，3.Feb.1990）通过喂小鼠感染的脑而使小鼠传染上了这种病。吃感染物会得BSE这是第一个证据。得病动物的其它组织（脾、脊髓、淋巴组织、奶等）不能使小鼠得此病。
有证据表明瘙痒病可以通过羊羔的母亲传给羊羔，但到目前为止，没有迹象说明BSE的病原因子有可能在牛中垂直或水平传播。
可引起亚急性感染脑病因子对标准的去污染方法有极强的抵抗力。在这方面获得的数据，大部分来自对瘙痒病和克罗茨费尔特-雅各布病因子灭活研究。瘙痒病的病原因子对温度变化有较强的抵抗力。当接触温度高达80℃对它们的感染力只有轻度减低;而较高温度时感染力明显降低（Hunter et al.，J.Gen.Microbiol.37∶251，1964）。当悬浮的感染物加热100℃1小时或118℃10分钟时，有时仍有少量感染“病毒”存活。
最近，感到需要重新修定在高压釜中于高蒸汽压条件下对这些感染因子的灭菌标准。基于含瘙痒病或克罗伊茨费尔特-雅各布病因子的的脑匀浆进行的研究（Brown et al.，J.of Infectious Disea-ses 153∶1145，1986），在美国，控制高压釜消除克罗伊茨费尔特--
雅各布病的通常标准是于132℃进行处理1小时（Rosenberg et al.，Annals of Neurology 19∶75，1986）。在包括Kimberlin的一些研究基础上（Kimberlin et al.，Journal of Neurological Sciences 59∶355，1983），在英国消除克罗伊茨费尔特-雅各布病的高压釜的通常标准是于134-138℃进行处理18分钟。不幸的是，牛的海绵状脑病因子对通常的化学和物理处理方法有很强的抵抗力。溶剂如苯、己烷、挥发油和三氯乙烯已作为提取溶剂加以使用，但对它们传染的作用了解尚少。主要由于研究需要大量动物和长时间观察，所以只得到关于传染因子化学灭活的少量数据。在用生物检测法检测时，浓度为0.3%-2.5%的次氯酸钠可极大地减低传染力，但常常不能完全消除传染力（Walker et al.，Am.J.publ.Health 73∶661，1983）。用高达0.25N氢氧化钠处理得到的数据易变动;但当浓度大于1N时，它成为所有研究中最有效的化学试剂。有报导用6M-8M的尿素处理，也有较大的变动。
上述消除污染的研究结果表明，虽然利用许多不同的物理和化学方法，可以很快地消灭大部分传染力，但是实际上少量有抵抗力传染因子的存在，使得对污染物的灭菌变得极其困难。
BSE曾被认为是“瘙痒病状”疾病，开始对流行病学和分析水平上提出重要的问题，特别在分析水平上旨在识别与传染力有关的因子。但是，到目前为止，所有识别与病原在子有关的核酸的努力没有结果。唯一一个与传染作用有明确关系的分离出的成分，是被称作瘙痒病朊病毒蛋白（prpSC）的涎糖蛋白。
对这种蛋白进行的遗传学研究，从而提供一些令人吃惊的资料。根据蛋白质末端氮的序列合成的DNA探针，使得有可能显示在个别
复制中的染色体基因的存在，这种基因在健康动物脑和被传染的动物脑中具有相同的限制模式。这种基因在差别很大的动物种属中都存在，把一种具有表观分子量为33-35.0千道尔顿（kd）的称之为细胞朊病毒蛋白（prpC）编译成蛋白密码，并对于prpSC表现出特别明显的不同：
1）当prpSC是抵抗时，prpC对蛋白酶敏感。特别是，当prpC被酶蛋白酶K完全降解时，prpSC在末端氮的水平被水解成的5Kd的片段，并生成一种称作prp27-30的蛋白。这种形式共纯化了传染力，并在传染物制剂中获得的最丰富的成分。
2）prpC和prpSC两者都是膜蛋白，但当prpC用去污剂处理而被溶解时，prpSC倾向于聚合成淀粉样纤维性的结构。在被传染的脑中，类似的结构（瘙痒病状原纤维，SAF）已经被发现，并且是独特的这种传染类型。这种传染的蛋白对于灭活的抵抗力是非寻常的;例如，它对用浓碱溶液处理或大于120℃的温度照射和对它们的结合或具有不同变性剂的结合剂是敏感的。因此，对这些海绵状脑病的明确认识的唯一诊断方法，是对传染的大脑组织的SAF的存在进行检验、提取、并对prp27-30蛋白进行免疫化学鉴定，一些仅用于病理解剖学的方法。
对于传染的牛脑中的SAF已经被确定，然后分离prpSC的同系物，并表明获得的抗小鼠SAF血清活化。并且，最初的12个氨基酸末端氮的序列与羊的prpSC是100%的同系物，并与被甘氨酸单插入的鼠、仓鼠和人的prpSC不同。一旦确定BSE是“瘙痒病状”疾病，就会出现有关流行病学和分析水平的重要问题，分析水平特别致力于与传染力有关的蛋白质的鉴定。
BSE的意想不到的出现和尚待解释的关于这些神经病的所有方面，已经引起了对此问题必要思考，特别是涉及到从牛身上获得的产品制备过程中的那些问题。
事实上，为获得药物上感兴趣的化合物或其混合物，用这种确保为食品使用的原料可能是不够的。因而，有必要通过用确保消除有传染力和本身有传染力有关的蛋白质的提取方法，开发一种涉及产物的生产方法。与此同时，很明显地这种传染活性成分的提取方法，应当能够保存所述的最终产物的有效成分的生物活性。
在这种制剂水平上，另一种对人的潜在危险蛋白质是髓鞘质碱性蛋白（MBP）。
在人和大部分脊椎动物中的蛋白质分子量（MW）有约19.5kd。在人的髓鞘质中以三种分子形式存在，在小鼠的髓鞘质中以六种分子形式存在，通过染色体1.8上的一种基因译成密码，并且构成了全部髓鞘质蛋白的约30%。它们精确的局部解剖的位置至今尚未确定。只是在髓鞘形成时于少突神经胶质细胞的细胞质中观察到了它。认为同一种蛋白质存在于外周神经系统（蛋白质P1），并且在试验动物中，外周髓鞘质诱导的试验变应性脑脊髓炎（EAE）的能力，是归因于这种蛋白。
并非MBP全部的分子都可致脑炎，而仅是一部分，随着种属不同而变动：兔中致脑炎的部分是氨基酸片段64-73，在Lewis鼠中是71-85，在豚鼠中是113-121，在SJL/J鼠中是89-169。EAE是一种典型依赖于细胞自身免疫性疾病，其实，它是由敏感的T淋巴细胞输入，而不是通过由血浆输入从一种动物可转移到另一种动物的。在这种情况，输入的淋巴细胞支持了这种疾病，
而不是受血者的那些淋巴细胞。另一种依赖于细胞的自身免疫性疾病，是试验变应性神经炎（EAN）。它可以在所有高级脊椎动物种属中，通过在弗氏完全佐剂（Complete Freund's Adjuvant）中外周髓鞘质的粗匀浆接种而被诱导。自身免疫作用的抗原，被认为是存在于外周神经系统中的具有12.0kd MW的蛋白质P2。
在这些制剂中另一种需要考虑的污染物，是牛的基因组DNA。用重组DNA技术，能够生产可用作药物制剂的生物活性蛋白质，这种可能性使得有必要分析最终产物以检测DNA残基的存在，这些DNA残基属于其中所要蛋白质得到表示的细胞。可用于人的药物制剂中DNA片段的存在，提出了这些片段的染色体组与可能未控制遗传类型的信息传递相掺合的危险问题。即使通过DNA重组技术还不可能获得神经节苷脂，但有必要应用这类控制的分析技术，用到动物基原为原料的提取产品上。
最后，用于体外和体内的神经节苷脂的研究，应该没有其它化合物，如涎神经节苷脂和糖脑苷脂类。这些物质，若以高浓度存在，会有重要的免疫学含意，并还可引起错误的试验结果。
BSE的突然出现和仍然有待阐明的关于这些神经病的所有其它的方面，已经引起了对些问题要给以必要的思考，特别是那些在制备从牛身上制得的产品中涉及的那些问题。
早先的神经节苷脂的制备方法，例如上述的方法，都要求产品是药学上可接受的，不含有当时已知的对健康有潜在危害的生物污染物。但是很明显，随后在成年牛中出现的上述疾病的侵袭使得有必要得到一种活性成份（principle），这种活性成分没有丧失上面提及的治疗性能，而且同时其特征在于，确保不存在非常规病毒因子，并且通过特殊方法确保这些非常规因子的失活以及传染力的完全清除，并用特殊的方法来鉴别这些因子的存在与否。的确，使用一直被认为是合适的可使用的原料，以获得具有相同的药学目的的
化合物或混合物看来是不够的。显然，BSE的出现进行评估，必须通过考虑它的体内生物活性，必须考虑这种方法各个阶段的检验实例，而不是看作是相对相同情况的总结，由于科学家们对关于这种蛋白如prp27-30与传染有关的问题至今未取得一致的意见，因此这种体内生物活性的分析是有必要的。显然，消除传染活性的提取方法，必须同时保留活性原理的生物活性的完整性，因为这是必不可少的治疗应用。（特别是研究生物技术/药剂学的工作小组：证实了病毒消除和灭活的方法，欧共体，1990，三月）。一方面，科学研究已经提出多种方法，这些方法确保在要获得的神经节苷脂的合适的混合物或其单一的成分形式中，没有蛋白质，化学和生物污染物，另一方面，这些方法对消除与慢性病毒有关的传染力证明有效的，然而，现在不知有这种方法，在工业规模上也可能获得这种产品的类似的未知结果，如所欲的那种纯的、药物上的活性产品，没有与定义为慢性病毒的病原因子相关的传染力。
图1是本发明方法的简图。
图2是用抗prp27-30抗体通过Western Blot技术对取自本发明方法中间阶段的一些样品进行分析得到结果的照片。
图3是对自本发明方法不同阶段一些样品的牛基因DNA进行分析结果的照片。
图4是用抗-MBP抗体通过Western Blot技术对取自本发明方法中间阶段的一些样品进行分析得到结果的照片。
图5是按本发明方法制备的神经节苷脂混合物硅胶层析分析结果的照片。
图6是按本发明制备的神经节苷脂混合物生物活性的照片。
图7是用抗-prp27-30抗体对取自本发明中间阶段的样品进行免疫化学分析结果的照片。
本发明的目的在于提供了一种产品，该产品的特征在于不含慢
性病毒并可以应用于工业生产的先进方法得到，及它的制备方法，该方法的革新之处在于将其不同提取阶段进行合适的排列。这种制备方法能在其各阶段将与慢性病毒（如引起牛海绵状脑病的慢性病毒）有关的感染污染物去除，并且使代表产品自身治疗活性的混合物的活性保持不变。这种方法制得的产品是由得自牛脑或其组成部分的多种神经节苷脂的特定混合物或单一神经节苷脂组份构成的。
鉴于上述理由，本发明方法包括以下主要步骤：
a）牛脑组织在丙酮中除酯，
b）丙酮中沉淀物悬浮于二氯甲烷/甲醇/氢氧化钠混合物，在30℃到35℃之间保持至少3小时以分开疏水性和亲水性物质，
c）加热至38℃至43℃之间并保持4至8小时使沉淀溶解在水/氯仿/甲醇和氢氧化钠（pH12）中，
d）用1N氢氧化钠溶解沉淀在室温下保持至少1小时，
e）中和和渗析含神经节苷脂混合物的溶液通过截断10Kd MW的膜。
此后，为了进行说明且不局限于此，给出了制备方法的例子，这些例子描述了从对抗海绵状脑病形状传染牛脑或加入了一定量的选自263k瘙痒病侏传染物的未感染牛脑制得的蛋白质原料进行制备的情况。
物质和方法
本方法中用于提取神经节苷酯混合物的牛脑，按组织学的分析，说明属于传染动物材料的组织十分典型的原纤维。
制备实施例
实施例1
制备方法如图1所示。
1000克粉碎过的悬浮于蒸馏水中的传染牛脑置于300到600ml丙酮（比率1∶5重量/体积）中，并在室温下搅拌约3小时。之后溶液在7℃至4℃之间以6000xg速度离心至沉淀完全。除去溶剂，并往置于一合适玻璃容器中的湿粉中，加入180-350ml的二氯甲烷/甲醇/氢氧化钠混合物。然后再在30℃至35℃之间磁力搅拌至少3小时。最后放置冷却，再在+10℃下以6000xg速度离心20分钟。液相用过滤漏斗在+4℃下过滤。在液相中加入适量的氯化钙及丙酮，搅拌约30分钟，并在+10℃以6000xg离心。最后沉淀物（原料物质1）干燥过夜，然后再高真空干燥5小时。收集到的原料物质1再悬浮于10至18ml水/氯仿/甲醇混合物中。用5N NaOH调pH至12左右。在4至8小时内将其加热至38℃至43℃之间并搅拌放置。最后，冷却后，用6N HCl中和并加入所需量的水/正丁醇/氯仿。搅拌15至30分钟并放置2到4小时。最后，弃去较低级有机相，在残留的水相中加入丙酮及氯化钠，搅拌约30分钟，并在+15℃下以6000xg速度离心20分钟（原料物质2）。
产品在高真空下干燥，重新悬浮于6到15ml无水甲醇中，并在不时搅拌下保持热溶液约2小时。然后悬浮液以6000xg速度迅
速离心，并将上清液置于泠冻器中约2小时。再在0℃下以6000xg速度离心乳白色溶液，并将沉淀在高真空下干燥。产品收集于1N氢氧化钠中，并将溶液在室温下放置至少1小时。最后，悬浮液的pH调至最恰当的pH值9，并用一个具有截断10kd MW的膜相对于适合体积的蒸馏水渗析。加入适量氯化钠及丙酮，并在+5℃下，以6000xg速度离心，然后在高真空下干燥（成品）。产品溶于pH为7.2的10mM磷酸盐缓冲液中并在+121℃下灭菌30分钟（灭菌成品）。
方法的评价
如上所述，本发明方法重要的一面在于提供了一种神经节苷酯产品，该产品不含不希望的污染物尤其是不含非常规病毒。为了评价该方法，对本方法不同阶段的样品进行可能的污染物试验。
生物/临床实验的方法及结果如下：
瘙痒病的生物实验：
用于这些实验的动物是Golden Syrian仓鼠（LVG/LaK），传染实验在四只一组已断奶的，雌性动物中进行，这些动物接受了0.05ml10倍稀释于灭菌PBS中的样品的大脑内（i.c）接种。大脑内接种由受过训练的人员用灭菌针头为26G，3/8英寸的可处理的玻璃注射器进行。
最后，灭菌产品，浓缩20倍全部用于以下实验：
4.0ml脑内注射给40只动物。
3.0ml以1∶20稀释，脑内注射（未经稀释的）给50只动物，腹腔注射给22只动物。腹腔注射的体积为2.5ml。
在12个月的期限内，每周两次或更多次检查动物特征性神经病
学及临术症状的发作。记录每只动物早期症状的发作，且当证实动物患病后将其处死，将其脑分成两半，一半置于10%福尔马林中，另一半在-70℃下保存，对所有死于可疑原因的动物及那些已表现出神经紊乱症状的动物进行病理学诊断。在观察的最后时期，处死所有存活动物，并对其脑进行病理学评价。
按Reed和Munch的方法在“最后点”计算传染滴度，并表示为LogLD50/ml。
试验样品是下列产品，其名称列于表1中。
所有样品重新悬浮于下列体积的灭菌PBS中，这样计算以保证与16.7%W/V的起始物匀浆比较每单位体积的均匀滴度。
脑的粉状物 ml2.0 脑匀浆 16.7%W/V 未稀释
原料物1 ml5.4 未稀释
原料物2 ml9.7 未稀释
成品 ml14.4 未稀释
灭菌成品 ml7.0 浓缩20倍
生物学/临床试验结果列于表1
[注]：所有显示瘙痒病临床现象的动物及在一年控制时间的最后仍活着的动物均在研究范围之列。那些由于意外事故和/或健康不好而死的动物，死于与瘙痒病无关的原因或肉食了的动物，未显示疾病临床现象的动物不包括。
“样品”栏报道了试验开始时注射动物的数目及笼数，它随样品及稀释度的不同而有区别，“病”栏报道了显示瘙痒病临床现象的动物数/已注射的动物数减去死于与瘙痒病无关的动物数。
附加评价：
用取自鼠脑纯化蛋白质相类似，且能与牛基原瘙痒病prp起交叉反应的特异多克隆抗体，测定瘙痒病蛋白prp。测定采用Western Blot方法。可通过与具有不同分子量的标准旦白比较来评价瘙痒病Prp的存在。
用取自牛脑组织的纯化旦白质相类似的特异多克隆抗体测定MBP旦白。测定采用Western Blot方法。MBP的存在可通过与具有不同分子量的标准旦白比较来评价。
牛基因组DNA测定是按对本领域技术人员公知的方法，对取自本方法不同阶段的样品，采用DOT/BLOT技术进行的。考虑到样品的有效性，斑点的存在不应记在异种DNA沉积物中。在放射自显影术中被检样品斑点的消失表明牛基因组DNA的消失。
图2显示了对制备和纯化神经节苷酯过程中间阶段的样品的抗Prp27-30抗体进行免疫化学分析的结果。分析样品数目代号相应于图1的纯化表中给出的园括号中的号。
第1行：1号样品
第2行：2号样品
第3行：3号样品
第4行：4号样品
第5行：5号样品
第6行：成品
第7行：标准MW的旦白质（下面的kd′s如下：97.4，66.2，45.0，31.0，21.5）。
带星号的那范围是指非特异性交叉反应，该交叉反应属于扩大的分析体系。
图3显示了通过DOT BLOT技术取自方法不同阶段样品所进行的牛基因组DNA分析。
带数字的交叉字母表明：
标准曲线
1A-7A 牛DNA（1mg）
1B-7B 牛DNA（1ng）
1C-7C 牛DNA（100pg）
1D-7D 牛DNA（10pg）
1E-7E 牛DNA（1pg）
1F-7F 牛DNA（0pg）
受检样品
2A-2F 1号样品
2B 2号样品
2C 3号样品
2D 5号样品
2E 6号样品
3A 3号粗品
3B 成品
3C 来菌成品
标准曲线和受检样品的点是在重复后给出的。
图4报导了来源于制备和纯化过程中间阶段样品的抗-MBP抗体进行免疫化学分析的结果。样品的代号对应于表1中纯化表指示的数字。
第1行：1号样品
第2行：2号样品
第3行：3号样品
第4行：4号样品
第5行：5号样品（原料物质1）
第6行：2号粗品
第7行：6号样品
第8行：3号粗品
第9行：成品
第10行：灭菌成品
被所用的多克隆抗体识别MBP的各种形状在园括号中。
图5显示了下列样品的硅胶层析结果（也是按图1列出的方法）：
第1行：灭菌成品
第2行：成品
第3行：标准三涎神经节苷酯GT1b
第4行：标准二涎神经节苷酯GD1b
第5行：标准二涎神经节苷酯GD1a
第6行：标准单涎神经节苷酯GM1
图6是一个例子的照片，它表示了按本发明方法从外周神经制得的神经节苷酯混合物的生物活性（箭头表示生长）。
图7是对取自神经节苷酯纯化及制备过程一些中间阶段样品的抗-Prp27-30抗体进行免疫化学分析的结果。分析样品的代号相应于图1的纯化表中表明的数字
第1行：加入1.5微克/ml Prp27-30的原料1的溶液，
第2行：2号原料样品
第3行：6号样品
第4行：3号原料样品
第5行：成品
第6行：灭菌成品
实施例2
从传染脑制备澄清的匀浆
被263K瘙痒病株传染，净重3.9g的四只仓鼠脑均匀在10ml蒸馏水中。然后将体积加至15.5ml，以得到25%W/V匀浆。在4℃以1800xg速度离心悬浮液40分钟。收集7.5ml上清液，分成若干份并在-70℃下保存待用。
样品的制备
将5ml感染匀浆，120ml甲醇/二氯甲烷和0.71ml5.7N氢氧化钠加入10g牛脑丙酮粉中。这样加法使水相溶于溶剂的总体积保持常数;并得到最合适的操作条件。超始溶液的最后滴度是1%W/V。悬浮液在33℃下磁力搅拌3小时。然后冷却并在10℃以6000xg速度离心20分钟。在温度+4℃液相用Gooch
漏斗（3号孔径）过滤以避免溶剂挥发;最后又收集78ml液相。2ml的等分试样保留用于生物学试验。对其中两个等分试样加入适量体积的氯化钙和丙酮，室温下磁力搅拌约30分钟后，样品在10℃以6000xg速度离心10分钟。沉淀（原料物质1）在通风橱中干燥过夜，然后高真空干燥2小时。一个等分试样在-70℃下保存用于生物学试验。
将反应容器中收集的925mg原料物质1重新悬浮于18.5ml氯仿/甲醇/水混合物及0.74ml匀浆中得到1%W/V滴度。加5N NaOH调pH至最恰当值12（石蕊试纸测定）。混合物在40℃磁力搅拌6小时。冷至室温后，溶液用6N HCl中和且保留一个250μl的等分试样用于生物学试验。
两个等分试样用一适当体积的正丁醇/氯仿/水处理，搅拌15分钟后，静置4小时。最后，弃去较低级有机相。向残留的水相中加入氯化钠和丙酮且在室温下磁力搅拌约30分钟后，将其在15℃以6000xg速度离心10分钟（原料物质2）。
该产品在高真空下干燥，用于生物学试验的等分试样放在-70℃下保存。残余物质重新悬浮于6.5ml无水甲醇中，并在50℃不断搅拌下放置2小时。悬浮液以6000xg的速度迅速离心，上清液在-20℃冷冻器中放置2小时。冷的乳白色溶液在0℃以6000xg速度离心5分钟，在高真空下沉淀干燥。此时产率为6mg产品。将其重新悬浮于500μl氢氧化钠，460μl蒸馏水和40μl匀浆中，且在室温下将该溶液放置1小时。最后，悬浮液的pH值调至最恰当的值9（石蕊试纸测定）并用一个10kd MW截断的膜相对于20000体积蒸馏水渗析。渗析后的最后体积为980μl。
将其分别分为500μl和480μl的两个试样，在第一个试样中加入所需体积的氯化钠和丙酮，且在5℃下以6000xg速度离心10分钟。该样品在高真空下干燥（最终产品）。
在第二试样中加入20μl匀浆和50μlPBS10X，且在121℃灭菌30分钟（最终的灭菌产品）。
方法的评价：
如实施例1所描述，取自方法不同阶段的样品，进行试验可能存在的污染物。
试验的样品及结果如下：
所有样品收集于下列体积的灭菌PBS中，这样计算以保证与起始物质1%匀浆W/V滴度比较是单位体积的均匀滴度。
脑匀浆 未稀释悬浮液
25%W/V稀释到1%
原料物质1 ml 3.2 未稀释
原料物质2 ml 1.0 未稀释
成品 ml 0.5 未稀释
灭菌成品 ml 0.5 未稀释
表2报告生物学试验所得的结果。
[注]：所有显示瘙痒病临床现象的动物及在一年控制时间的最后仍活着的动物都在研究范围之列。那些由于意外事件和/或健康不好而死的动物，死于与瘙痒病无关因素或肉食而杀死的，未显示疾病临床现象的动物不包括。
“样品”栏报道了试验开始时注射动物数及笼数，它随不同样品及稀释度而不同。“病”栏报道了显示瘙痒病临床现象的动物数/已注射的动物数减去死于与瘙痒病无关因素的动物数。
实施例3
神经节苷酯混合物的生物活性
为了证实神经节苷酯混合物（按前面所说方法得到）是否具有能治疗用于周围神经系统（PNS）和中枢神经系统（CNS）病理学的某些生物学活性予言，而进行了一系列体外试验。特别是体外进行的神经节苷酯活性试验能分析成神经细胞瘤细胞（N2A）培养中轴突的形成。这些细胞，如文献（Denis-Donini等著的Neuronal Deve-lopment，PartⅡ，323∶348-Academic Press，NY1980;Leon等著的Dev.Neurosci.5∶108，1982）所描述，在某一条件下，能使成熟神经元各种功能特点得以表现，这样就能对与生长的每个阶段相关的生化参数进行定性及定量分析。
因此，当调查一种药物在神经系统功能恢复方面的能治疗应用时，本模型中所做的评价（轴突形成，轴突长度和相关分支的细胞%）是有效的手段。
物质和方法
细胞培养
在含P/G（100u.青霉素/ml）和10%胎儿腓肠血清
（自Seromed，batch 4-co4的FCS）的Dul becco′s的Eagle介质存在下按每井（24-Castor）10000个细胞的浓度种植由America Cell Type Collection（Bethesda，Maryland）提供的鼠C1300细胞，克隆N2A。
第二天，用含神经节苷酯的同样体积的新鲜介质替换培养介质（进一步观察）。培养物在37℃5%CO2增湿的气氛中（Haer us恒温箱）保存。然后在指定时间（24小时后）将培养物用2%戊二醛固定。
受检产品溶液的制备
将神经节苷酯混合物（不同的3批，号是1-2-3）溶解在氯仿/甲醇2∶1中，在氮气流中干燥，重新悬浮于DMEM+P/G+10%FCS中直至达到所需的浓度。
受检浓度：1×10-4M;5×10-5M和1×10-5M。
四个不同试验如下进行：
-3个实验在1×10-4M浓度下进行以评价神经节苷酯混合物（批号为1和2）的效果
-1个实验来评价检验过的神经节苷酯混合物在不同浓度（1×10-4，5×10-5和1×10-5M）下的剂量-响应效果（批号3）。
方法
介质从井中取出，并用350μlDMEM+P/G+10%FCS±检验过的产品（在前述浓度下）替代。
控制的培养物作同样处理，只是不加神经节苷酯混合物。培养物再在一恒温箱中保存24小时，之后细胞用2%戊二醛固定，并在显
微镜下观察。
参数
形态学检查可用于评价：
-具有轴突细胞的百分数（%）
-轴突的长度和相关的分支
结果
如表3报道，很清楚看出检验过的产品在诱导N2A细胞的轴突形成中是有效的（1×10-4M）。
神经节苷酯混合物的效果是与剂量有关的，在1×10-4M（表4）剂量下其效验最大。
表3
神经节苷酯混合物（批号1，2）对鼠成神经细胞瘤N2A细胞的轴突形成的效果。
所有产品均加入细胞中以达到最终浓度1×10-4M，24小时后进行形态学评价。
具有轴突的细胞的%
产品 第一次试验 第二次试验 第三次试验
控制 2±1 1±1 2±2
GA（1） 29±6 27±6 24±5
GA（2） 25±4 25±2 25±5
（批号在括号中）
表4
不同浓度的神经节苷酯混合物（批号3）对鼠成神经细胞瘤N2A
细胞轴突形成的效果：剂量-响应效果。
产品 浓度 轴突的细胞%
控制 3±2
GA（3） 1X10-435±6
GA（3） 5X10-517±5
GA（3） 1X10-54±2
（批号在括号中）
体外生物活性数据的统计评价，表明在不同批号的神经节苷酯混合物之间没有显著差别（表5）。
表5
由批号1和2得到的综合评价。报道的值是9个独立实验±S.D.的平均值。
进一步说，轴突的形态学评价表明用神经节苷酯混合物处理过的细胞表示出长的，显著分支的轴突（如显著分支）。
结论
因此，由前面的观察可以肯定检验过的神经节苷酯混合物具有一定的生物活性，实际上，能保证特殊特性的方法得到的产品可以诱导N2A细胞轴突的形成。这一事实表明本产品在恢复外周及中枢神经系统的一些现象方面是有效的。神经节苷酯混合物，由所描述的方法得到并且不含与潜在危险的非常规病毒有关的污染物，也能用于单一成份或神经节苷酯混合物制剂，如单涎神经节苷酯GM1。
考虑到上面描述的药理学性质，神经节苷酯混合物通常用作一种药物用于多种病理学以治疗外周神经及中枢神经系统（由于多种疾病引起的）。能治疗特殊的疾病有：眼球后视觉神经类，眼球运动神经麻庳，三叉神经痛，面神经麻庳和贝尔（Bell′s）麻庳，Garcin氏综合症，脊神经根炎，外周神经外伤性损害，糖尿病及酒精性多神经炎，产科麻庳，麻庳性坐骨神经痛，运动神经元疾病，肌萎缩性侧索硬化，脊髓病的肌萎缩，进行性延髓麻庳，重症肌无力和lambert Eaton′s综合症，肌营养不良，CNS和PNS突触神经传递的损伤，意识缺损如精神错乱，震伤，血栓形成，脑栓塞，大脑及脊柱创伤。
给药通常采用肌肉，皮下或静脉注射，或通过经皮肤，肺或口服途径施用，优选合适的缓冲水溶液。将含本产品的溶液也可以含有其它辅助的成份制成瓶装形式能保证其安全储存，如以后的药物制备实
施例中所表明的。在治疗或予防中，通过肠胃外给药，剂量优选10mg到100mg/天的活性物质。
以下是按本发明制得的药物组合物实施例。它仅是加以描述，而并不局限于此。
实施例1
1瓶中含有：
活性成份
-神经节苷酯如钠盐 10.0mg
-单涎四己糖基神经节苷酯（GM1）
-二涎四己糖基神经节苷酯（GD1a）
-二涎四己糖基神经节苷酯（GD1b）
-三涎四己糖基神经节苷酯（GT1b）
其它成份
-12H2O磷酸氢二钠 6.0mg
-2H2O磷酸二氢钠 0.5mg
-氯化钠 16.0mg
-注射用水 2.0ml
实施例2
1瓶中含有：
活性成份
-神经节苷酯如钠盐 20.0mg
-单涎四己糖基神经节苷酯（GM1）
-二涎四己糖基神经节苷酯（GD1a）
-二涎四己糖基神经节苷酯（GD1b）
-三涎四己糖基神经节苷酯（GT1b）
其它成份
-12H2O磷酸氢二钠 6.0mg
-2H2O磷酸二氢钠 0.5mg
-氯化钠 16.0mg
-注射用水 2.0ml
实施例3
1瓶中含有：
活性成份
-神经节苷酯如钠盐 100.0mg
-单涎四己糖基神经节苷酯（GM1）
-二涎四己糖基神经节苷酯（GD1a）
-二涎四己糖基神经节苷酯（GD1b）
-三涎四己糖基神经节苷酯（GT1b）
其它成份
-12H2O磷酸氢二钠 12.0mg
-2H2O磷酸二氢钠 1.0mg
-氯化钠 32.0mg
-注射用水 4.0ml
本发明即如此描述的这样，很明显同一方法可以以许多方式变化。这种变化并不能认为背离本发明精神和范围，并且所有那些对本领域技术人员显而易见的限定都包括在下列权利要求的范围内。
Claims (4)
1、一种神经节苷脂的制备方法，其特征在于，包括：
a)用丙酮将牛脑组织脱脂生成丙酮沉淀物；
b)将所述丙酮沉淀物悬浮于二氯甲烷、甲醇和氢氧化钠的混合物中；
c)将含有所述丙酮沉淀物的所述混合物过滤得液相；
d)通过加入氯化钙使所述液相进行沉淀反应得第一原料；
e)于水、氯仿和甲醇中溶解第一原料，并将溶解的第一原料于约12pH和约38至43℃的温度中搅拌加热约4至8小时；
f)于水、正丁醇和氯仿的混合液中将所述加热溶解的第一原料进行第二次分离；
g)将所述第二次分离的混合物分离，除去有机相并保留水相；
h)通过加入丙酮和氯化钠使所述水相进行沉淀并离心生成第二原料；
i)于纯甲醇中溶解并加热所述第二原料；
j)离心所述溶解并加热的第二原料生成上清液；
k)冷却所述上清液生成第三原料；
l)于氢氧化钠中溶解所述第三原料约1小时；
m)中和所述溶解的第三原料；和
n)将所述中和溶解的第三原料通过能截断约10kd分子量的膜进行透析，生成神经节苷脂混合物；和任选地，
o)将该产生的神经节苷脂混合物分离成单一的神经节苷脂成分，并从该混合物中分离出神经节苷脂GM1。
2、根据权利要求1的方法，其特征在于，所述第三原料的溶解作用是在1N氢氧化钠中。
3、根据权利要求1或2的方法，其特征在于，将所述生成的神经节苷脂混合物进行干燥，生成神经节苷脂混合物的最终产物。
4、根据权利要求3的方法，其特征在于，将神经节苷脂混合物的最终产物悬浮于缓冲液中并灭菌，生成灭菌的神经节苷脂混合物的最终产物。
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