KR0177820B1 - 비전통적 바이러스에 의해 오염되지 않은 글라이코스핑고리피드 혼합물의 제조 및 정제방법 - Google Patents
비전통적 바이러스에 의해 오염되지 않은 글라이코스핑고리피드 혼합물의 제조 및 정제방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 중추 및 말초 신경계에 대한 강글리오사이드 혼합물의 생물학적 및 약리학적 특성을 변경하지 않으면서 비전통적이며 생명을 위협하는 바이러스와 관련된 오염물질을 함유하지 않는 강글리오사이드 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
[발명의 명칭]
비전통적 바이러스에 의해 오염되지 않은 글라이코스핑고리피드 혼합물의 제조 및 정제 방법
[발명의 분야]
본 발명은 강글리오사이드의 특정 혼합물의 제조방법, 및 상기 방법으로 제조된, 즉 중추 및 말초 신경게에 대한 효과와 관련된 강글리오사이드 혼합물의 생물학적 및 약리학적 특성을 변경하지 않으면서, 비전통적이며 생명을 위협하는 바이러스와 관련된 오염물질들을 선택적으로 제거하는 방법에 의해 수득된 생성물에 관한 것이다.
[발명의 배경]
강글리오사이드, 즉 시알산을 함유하는 글라이코스핑고리피드는 포유동물에서 모든 세포막의 정상 성분이며 신경조직에 풍부하다(Ando S. : Neurochem. Int. 5 : 507, 1983). 4종류의 강글리오사이드, 즉 GM1, GD1a, GD1b및 GT1b(Svennerholm L., J. Neurocchem, 10 : 613, 1963 에 따른 명명법)가 포유동물 뇌의 강글리오사이드 총함량의 80 내지 90%를 구성한다. 강글리오사이드는 원형질 막의 외층에 특히 집중되어 있는데, 이는 그들이 여러 가지 생물학적 활동에 있어서 예를들면 다양한 분자에 대한 감각기 및/또는 수용체로서 중요한 역할을 행하고, 세포막을 통한 정보의 전달에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다(Fishman et al. : Science 194 : 906, 1976). 따라서 그들은 중추 및 말초 신경에서 신경원의 성장 및 복구의 조절에 있어서 핵심적 역할를 한다.
강글리오사이드가 특정한 막 기전의 관여에 의해서, 및 신경원 배양물에 대한 시험관내 연구에 의해 밝혀진 바와 같이 신경원영양 인자와의 상호 작용에 의해서, 말초 신경계(PNS) 및 중추 신경게(CNS)에서 병변 후의 기능 회복에 유리하게 영향을 미칠 수 있다는 것에 관하여는 저알로 풍부한 문헌이 있다(Doherty P. et al., J. Neurochem. 44 : 1259, 1985 : Skaper S. et al., Molecular Neurobiology, 3 : 173, 1989).
특히, 생체내에서 강글리오사이드의 투여가 병리학적 상태하의 PNS 에 있어서, 신경 재생 및 기능 회복을 촉진시킨다는 것이 보고되었다 : 외상성 신경병(Ceccarelli B. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 71 : 275, Plenum Press, New York, 1976 ; Gorio A. et al., Brain Res. 7 : 236, 1980 : Gario A. et al., Neuroscience 8 : 417, 1983), 대사성 신경병(Norido F. et al., Exp. Neurol. 83 : 211, 1984) 및 독성 신경병(Di Gregorio F. et al., Cancer Chemother., Pharmacol. 26 : 31, 1990)의 모델에서 양성 효과가 기록되었다.
CNS 에 관하여는, 상이한 동물 종들의 다양한 신경원계에 있어서 국소빈혈(Cuello A.C. et al., Brain Res. 376 : 373, 1986 ; Karpiak S. E. et al., CRC Critical Rev. in Neurobiology, Vol. 5, Issue 3, 1990), 외상성 병변(Toffano G. et al., Brain Res. 296 : 233, 1984) 및 신경독성 병변(Johnsson J., Dev. Brain Res., 16 : 171, 1984)의 모델에서 모노시알로강글리오사이드 GM1에 의해 유도된 회복의 양성 효과가 널리 보고되었다. 최근에는 강글리오사이드가 글루타메이트에 의해 유도된 단백질 키나아제 C의 전위 및 활성화를 억제할 수 있다는 것이 발견되었다(Vaccarino F. et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 84 : 8707, 1987). 이 작용은 신경원 사멸에 이르는 일련의 사건들을 일으키는 플루타메이트와 같은 흥분성 아미노산이 결정적인 역할을 하는 것으로 보고되어 있는 국소빈혈 손상의 상태에 있어서 매우 중요하다. 이 기전은 병변 주변 지역에서 신경원의 생존을 돕고, 퇴행변성을 방지하며 국소 영양 인자에 대한 치유적 성장 반응을 촉진할 수 있다.
실험 연구의 결과는 강글리오사이드의 임상적 사용에 의해 얻은 결과로부터 충분히 확인되었다. 10여년 이상동안, 강글리오사이드는 기계적 손상에 의해 야기된 형태로부터 독성 인자 또는 결핍에 의해 야기된 형태에 이르기까지, 감염성 및 염증성 질환으로부터 대사성 기능 장해에 이르기까지, 거의 모든 형태의 말초신경병변에 치료 약제로서 사용되어 왔다. 이 약제들은 단발성 및 다발성 신경장애, 감각-운동 장애, 및 두개 신경(cranial nerves)에 침투하는 많은 신경병, 예를 들면 안면 신경 마비(Bell's palsy), 삼차 신경통, 및 대상 포진에 의해 야기되는 신경통과 같은 자율 신경계에 침투하는 질병에 똑같이 효과적인 것으로 입증되었다. 강글리오사이드, 특히 모노시알로강글리오사이드는 CNS에 있어서 혈관형 또는 외상형의급성 병변과 관련된 모든 질병 및 그러한 질병의 후유증(대뇌 국소 빈혈, 두개 및 척수 손상)에 널리 사용될 수 있다.
CNS에 있어서의 그들의 입증된 복구 활성은 또한 파킨슨병 및 알쯔하이머병과 같은 만성 신경퇴행서 병변에 있어서의 그들이 사용을 입증한다. 그들이 신경원 막의 천연 성분으로서 본래 엔도코이드(냉인성 약제)라는 사실은 그들의 우수한 내성 및, 고용량을 사용하는 장기간의 치료에서조차도, 말초 신경병변에 대한 몇몇 전통적인 요법에서는 매우 빈번한 부작용이 나타나지 않는 것에 대한 설명이 된다.
일반적으로, 적합한 강글리오사이드 혼합물, 예를 들면 18% 내지 24%의 GM1, 36%SO내지 44%의 GD1a, 12% 내지 18%의 GD1b 및 16% 내지 22%의 GT1b의 제제를 함유하는 강글리오사이드 혼합물, 또는 단일 강글리오사이드 분획, 특히 모노시알로강글리오사이드 GM1은 상술한 것들과 같은 생물학적 활성을 나타낸다. 이 강글리오사이드들은 적합한 혼합물 또는 단일 분획, 특히 모노시알로강글리오사이드 GM1으로서 포유동물 뇌로부터 추출되고, 따라서 말초 및 중추신경계와 관련하여 전술한 그들의 특정한 생물학적 기능 및 그들의 치료적 응용을 고려하면, 완전히 순수하고 생물학적 및 화학적 오염물질을 함유하지 않는 최종 생성물을 보장하는 정제방법을 사용하는 것이 필요하다.
강글리오사이드의 혼합물을 추출할 수 있다는 것은 연구 수준으로는 오랫동안 알려져 왔지만(Tettamanti et al., Biochim. e Biophys. Acta, 296 : 160, 1973 ; Trams et al., Biochim. e Biophys. Acta 60 : 350, 1962 ; Bogoch et al., British J. Pharm., 18 : 625, 1962 ; Wiegandt et al., Angew Chem. 80 : 89, 1968 ; 미합중국 특허 제3,436,413호 ; 및 C. A. 61, 9851c,9895d), 전술한 방법들 중 어느 하나도 비-전통적 바이러스와 과련된 성분들의 제거 및 파괴를 증명하려는 관점에서 개발 되지는 않았다. 그의 한가지 이유는, 그 당시에는 추출에 사용되는 뇌를 가지고 있는 포유동물 종에 침투하는 그러한 질병들이 아직 알려져 있지 않았다는 것이다. 다른 한 이유는 잠재적 위험 성분들의 특정한 확인을 위해 사용 할 수 있는 시약이 없었다는 것인데, 그 반면에 오늘날에는 분자 생물학 기술의 과학적 발전으로부터 수집된 새로-획득된 지식의 토대위에 개발된 특정한 방법들에 의해 그러한 시약들을 사용할 수 있게 되었다.
어떤 경우에는 병원성 인자나 인자들이 확인될 수 없는 질병형의 상태가 일어날 수 있다. 그러한 질병 상태는 영국에서 19686년에 최초로 보고되었고, 소해면양뇌증(bovine spongiform encephalopathy : BSE)으로 불리운다(Wells G. et al., Vet. Record, 419, 1986). 이 명칭은 병든 동물로부터 얻은 뇌조직의 해면상의 외양으로부터 유래된 것이다. 조직의 단편을 현미경으로 분석하면, 주병변은 광범위한 신경원성 소포로 구성되어 있다.
모든 입수가능한 증거들은 BSE가, 그 결과에 있어서 변함없이 치명적이고 일군의 비-전통적인 감염성 인자에 의해 발생하는, 중추신경게의 일군의 퇴행성 뇌병변에 속한다는 사실을 가리키고 있다(Fraser et al., Ver Record 123 : 472, 1988 : Hope et al., Nature 336 : 390, 1988). 이러한 병변군은 또한 양 및 염소의 스크라피(scrapie), 생포된 사슴을 괴롭히던 만성 쇠약증, 밍크 농장에서 밍크의 가염성 뇌병변 및 인간의 두 가지 질병, 즉 쿠루 및 크로이츠펠트-야콥병(Kuru and Creutzfeldt-Jacob)을 포함한다. 이 질병들에 의해 뇌에서 야기된 조직 병리학적 병변은 모든 경우에 유사하며 BSE에 의해 야기된 것들과 동등하다. 박테리아도 바이러스도 아니고 어떠한 다른 공지된 유기체와도 같지않으며 따라서 비전통적 바이러스로 알려진 이들 병인학적 인자들의 성질에 대해서는 많은 학설들이 주장되어 왔다. 감염 순간으로부터 증상의 발현에까지 계속되는 그들의 긴 잠복기 때문에, 이 바이러스들은 또한 슬로우(slow)바이러스로서 알려져 있다.
1986년에 관찰된 몇 안되는 사례들 이후로, 질병은 영국에서는 만연되어 유행병 정도에 달하였으며, 약 14,000마리의 가축을 감염시키고 매주 약 250~300건씩 꾸준히 증가하고 있다. 감염된 가축들은 수년(잠복기가 4~5년임)동안 아무런 질병의 징후도 나타내지 않지만, 일단 증상이 나타나면 동물들은 급속히 건강이 악화되어 사망한다.
영국 농무성의 중앙 수의 실험실(Central Veterinary Laboratory of the British Ministry of Agriculture)에 의한 유행병학적 연구(Wilesmith et al., Vet. Record. 123 : 638, 1988)는 감염의 근원이 분말화된 고기 또는 뼈의 형태로 시판되는, 다른 반추동물들의 가공된 사체로 만들어진 동물 사료임을 증명하였다. 뇌병변은 광범위한 동물종에게 전염될 수 있으므로, BSE가 이들 오염된 사료에 의해 양으로부터 전염된, 스크라피를 일으키는 병인학적 인자에 의한 감염의 결과라도 추측하는 것은 당연한 것으로 보인다(Morgan KL, Vet. Record 122 : 445, 1988).
이 연구 결과를 토대로 하여, 영국 정부는 1988년 7월 18일자로 발효된 령에 의하여, 반추동물로부터 유래된 동물 단백질을 함유하는 동물 사료의 판매 및 공급을 금지시켰다.
영국에서 BSE의 돌발적인 출현에는 많은 요소들이 함께 작용했다는 것이 일반적인 견해이다(Cherfas J., Science, Feb. 1990, 523).
먼저, 영국에서 양의 수는 70년대 후반과 80년대 초반에 급속이 증가하였고, 이와 함께 유럽에서 250여년이상 동안 양의 유행병이었던 스크라피의 발생도 증가하였다(Pattison et al., Ver Record 90 : 465, 1972). 동시에, 가솔린 공황의 결과로, 동물 사료를 제조하는 공장들은 그들의 사체 가공방법을 저온 시스템으로 바꾸었으며 이는 아마도 고도로 저항력이 있는 스크라피 인자를 파괴하기에는 덜 효과적이었을 것이다.
한 업체를 제외하고 이들 사료 제조업체들 모두는 대두 및 뼈 가루로부터 과량의지방을 제거하기위한 벤젠, 헥산 및 트리클로로에틸렌과 같은 용매들의 사용을 포기했다. 무엇보다도 가장 중요한 것은 아마도 용맬르 제거하기 위한 생성물의 가열이라는 최종단계가 결과적으로 생략된 것이다: 사실 이 단계는 매우 높은 온도를 필요로 했다.
더 나아가, 정부는 정책적으로 사육자들이 보다 많은 우유를 생산하고 단백질이 풍부한 사료를 먹임으로써 송아지들이 빨리 젖을 떼게하도록 장려했다. 사료들은 종종 저질이었는데, 그 이유는 고기와 뼈로 만든 사료들은 대두로 만든 제품들보다 싸고 생선은 보다 확실한 단백질원이기 때문이다. 질병의 전염 경로를 밝히기 위한 연구들은 BSE 연구에 기본적인 것이다. 이 실험들의 가장 중요한 태양은, 병원성 인자의 전달에 대한 종간 장벽의 한계를 확인함으로써, 어떤 한종에 대한 BSE 감염의 위험을 평가할 수 있다는 것이다. 프레이서 등(Fraser et al., Ver Record, 123 : 472, 1988)은 질병이 소로부터 마우스로 옮아갈 수 있음을 밝혔다. 그들은 BSE로 죽은 소의 뇌로부터 얻은 추출물을 마우스의 뇌에 접종했고, 그 후 마우스는 질병을 일으켰다. 그 후, 발로우 등(Barlow et al., Vet. Re-cord, 3 Feb. 1990)은 마우스에게 감염된 뇌를 먹임으로써 질병을 마우스에게 전염시켰다. 이는 감염된 물질을 먹음으로써 BSE에 걸릴 수 있다는 최초의 증거였다. 감염된 동물로부터 얻은 어떤 한 다른 조직들(비장, 척수, 임파조직, 우유 등)에 의해서는 마우스에서 질벼을 일으킬 수 없었다.
스크라피가 어미로부터 새끼양에게 전염될 수 있다는 증거는 있으나, 지금까지 소에서 BSE의 병인학적 인자의 가능한 수직적 또는 수평적 전염의 증거는 나타나지 않았다.
아급성 전염성 뇌병변을 일으키는 인자들은 표준 오염 제거 공정에 대해 극히 내성이 크다. 이 상황에 대해 입수 가능한 데이터는 대부분 스크라피 및 크로이츠펠트-야콥병의 인자의 불활성화에 대한 연구로부터 유래한 것이다. 스크라피의 병인학적 인자는 온도 변화에 내성이 크다. 80℃이하의온도에 노출되었을 때 그들의 감염성은 단지 약간 감소될 뿐이다; 그렇지만 더 높은 온도는 감염성을 현저히 감소시킨다(Hunter et al., J. Gen. Microbiol. 37 : 251, 1964). 감염된 물질의 현탁액을 100℃로 1시간동안 또는 118℃로 10분동안 가열할 때 소량의 감염성 바이러스가 때로는 잔존하기도 한다.
최근에, 이들 감염성 인자드를 오토클레이브내에서 높은 증기압하에 멸균 시키는 기준을 갱신할 피료가 있다고 생각되었다. 미합중국에서, 크로이츠펠트-야콥병의 오염 제거를 위한 오토클레이브법을 규제하는 현재의 기준은 132℃에서 1시간 동안의 처리(Rosenberg et al., Annals of Neurology 19 : 75, 1986)를 포함하며, 이는 스크라피 또는 크로이츠펠트-야콥 인자를 함유하는 뇌 균질물에 대해 수행된 실험을 기초로 한 것이다(Brown et al., J. of Infectious Diseases 153 : 1145, 1986). 영국에서, 크로이츠벨트-야콥병의 오염제거를 위한 오토클레이브법의 현재의 기준은 킴벌린(Kimberlin)에 의한 연구를 포함하는 몇몇 연구들을 기초로하여 정해진 것으로, 오토클레이브내의 134~138℃에서 18분 동안의 처리를 포함한다(Kimberlin et al., Journal of Neurlolgical Sciences 59 : 355, 1983).
불행하게도, 소의 해면양뇌병변 인자들은 물리적인 처리 뿐만 아니라 통상적인 화학적 처리에 대해서 까지도 매우 내성이 있다. 벤젠, 헥산, 가솔린 및 트리클로로에틸렌과 같은 용매들이 추출용매로서 사용되어 왔지만, 감염성에 대한 그들의 효과에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.
감염성 인자의 화학적 불활성화에 대해서는 단지 소량의 데이터만이 입수될 수 있는데, 그 이유는 주로, 연구들이 다수의 동물들과 긴 관찰기간을 필요로 하기 때문이다. 0.3%~2.5% 농도의 차아염소산 나트륨은 사용된 생물학적 분석법에서 감염성을 크게 감소시키기는 하지만, 종종 그것을 완전히 제거하지는 못한다(Walker et al., Am. J. Publ. Health 73 : 661, 1983). 0.25 N 이하의 수산화나트륨을 사용한 처리에 관한 데이타는 매우 다양하다; 그렇지만 1N이상의 농도에서는 그것이 연구된 모든 것들중 가장 효과적인 화학 약품인 것으로 여겨진다. 6 M~8M의 우레아를 사용한 처리 역시 매우 다양한 것으로 보고되었다.
이렇게 오염 제거에 대한 연구 결과들은, 비록 다수의 상이한 물리적 및 화학적 방법에 의해 대부분의 감염성이 빠르게 파괴되기는 하지만, 실제로는 내성있는 감염성 인자의 소량의 아군집의 존재가 오염된 물질의멸균을 극히 어렵게 만든다는 것을 보여준다.
이전에 BSE 는 스크라피-유사 질환으로서 확인된 적이 있는데, 유행병학적 수준 및 분석적 수준에서 중요한 문제들이 제기되기 시작했고, 후자는 특히 감염성과 관련될 수 있는 인자를 확인하는 것을 목표로 한다. 그렇지만, 병인학적 인자와 관련된 핵산을 확인하기 위해 지금까지 기울였던 모든 노력들은 헛된 것이었다. 감염 작용과 명백히 관련된 것으로서 단리된 유일한 성분은 스크라피프리온 단백질(scrapie prion protein, PrPsc)로 불리우는 시알로당단백질이다.
이 단백질에 대해 수행된 유전학적 연구들은 계속해서 몇가지 놀라운 정보를 제공하였다. 단백질의 N 말단 서열에 따라 합성된 몇몇 DNA프로브들은 건강한 동물의 뇌에서 감염된 동물의 뇌에서와 동일한 제한양식을 나타내는 각 카피(copy)내의 염색체 유전자의 존재에 대한 증명을 가능하게 하였다. 매우 상이한 종들에서 조차도 보존되는 이 유전자는 33내지 35.0 킬로달톤(kd)의 겉보기 분자량을 가진 세포 프리온 단백질(PrPsc)로 불리우는 단백질을 코딩하는데, 이는 PrPsc에 대하여 특히 분명한 차이점들을 나타낸다.
1) PrPC는 프로테아제(protease)에 대해 감수성인 반면, PrPsc는 내성이 있다. 특히 PrPc가 효소 프로테이나제(proteinase) K에 의해 완전히 분해되는 반면. PrPsc는 N 말단에서 약 5kd의 단편 정도가 가수분해되어 PrP27-30으로 불리우는 단백질을 만든다. 이 형태는 감염성과 함께 공동 정제되고 감염성 물질의 제제에서 수득되는 가장 풍부한 성분이다.
2) PrPc와 PrP sc 는 모두 막 단백질이지만, 전자는 세제로 처리함으로써 용해되는 반면, 후자는 아밀로이드 섬유상 구조로 중합하는 경향이 있다. 유사한 구조들(스크라피-관련 원섬유, SAF)이 감염된 뇌에서 발견되었고 이러한 구조는 이런 유형의 감염의 특성이다. 이 감염성 단백질의 불활성화에 대한 내성은 유별나다; 이는 예를들면, 진한 알카리 용액을 사용한 처리 또는 120℃이상의 온도에 대한 노출 및 그들의 조합 또는 상이한 변성제와의 조합에 대하여 민감하다. 결과적으로, 이들 해면양뇌증의 분명한 확인을 위해 이용할 수 있는 유일한 진단 방법은 감염된 대뇌 조직내에서 SAF의 존재의 입증, 단백질 PrP27-30의 추출 및 면역화학적 확인, 병리학적 해부동안에만 사용할 수 있는 방법들이다.
SAF 는 감염된 소의 뇌에서 확인되었고, 그후 PrPsc의 동족체가 단리되고 마우스 SAF에 대하여 수득된 혈청과의 반응성을 나타내었다. 또한, 최초 12 아미노산의 N 말단 서열은 양의 PrPSC와 100% 상동성을 나타내고 마우스, 햄스터 및 사람의 것과는 글리신의 단일 삽입에 의한 차이를 나타낸다. BSE가 스크라피-유사질환이라는 것이 입증되자마자, 유행병학적 및 분석적 수준에서 몇몇 중요한 문제들이 제기되었는데, 후자는 특히 감염성과 관련된 단백질을 확인하기 위한 것이다.
BSE의 예기치 않은 출현 및 이 신경학적 질병에 대하여 여전히 설명되어야 할 모든 관점들은, 특히 소의 물질로부터 유래된 생성물의 제조에 관련된 사람들에 의해, 그 문제에 기울어져야 할 필수적인 고찰을 야기시켰다.
사실, 약학적으로 흥미가 있는 화합물 또는 그들의 혼합물을 수득하기 위해서, 식품용으로 보증된 조물질을 사용하는 것은 충분치 못하다. 따라서, 감염성과 관련된 단백질 및 감염성 그 자체의 제거를 보장하는 추출방법을 사용하여 문제의 생성물의 제조하는 방법을 개발하는 것이 필요하다. 감염 활성을 가진 분획의 추출방법이 동시에, 최종 생성물로서 목적되는 유효 성분의 생물학적 활성을 보존해야만 한다는 것은 분명하다.
사람에 대하여 이러한 제조 수준에서 잠적적으로 위험한 또다른 단백질은 마이엘린의 염기성 단백질(MBP)이다.
이는 사람 및 대부분의 척추동물에 존재하며 약 19.5kd 의 분자량(MW)을 가진 단백질이다. 이는 염색체 18 상에 위치한 단일 유전자에 의해 코딩되어 사람 마이엘린 내에서는 세가지 분자 형태로 그리고 마우스의 마이엘린 내에서는 6가지 형태로 존재하고 총 마이엘린 단백질의 약 30%를 구성한다. 그의 정확한 국소해부적 위치는 아직 확실하지 않다. 이는 오직 수초형성(myelinization) 순간에만 희소돌기 아교세포(oligodendrocytes)의 원형질에서 관찰되었다. 동일하다고 간주되는 단백질이 말초 신경계에 존재하며(단백질 P1), 실험동물에서 실험적 알러지성 뇌척수염(EAE)을 야기하는 말초 마이엘린의능력은 그에 기인한 것이다.
MBP 의 모든 분자가 뇌염을 발생시키는 것은 아니고 단지 종마다 다른 일부만의 뇌염을 발생시킨다: 토끼에서 뇌염을 발생시키는 부분은 아미노산 단편 64-73이고, 루이스(Lewis) 래트에서는 71-85, 기니아 피그에서는 113-121, SJL/J 마우스에서는 89-169이다. EAE는 전형적인 세포-의존성 자가면역 질환이다; 사실, 이는 혈청의 주입에 의해서가 아니라 감작화된 T 임파구의 주입에 의해 한 동물에서 다른 동물로 감염될 수 있다. 이 경우에, 질환은 수용체의 임파구가 아니라 주입된 임파구에 의해 유지된다. 다른 세포-의존성 자가면역 형태를 알러지성 실험적 신경염(EAN)이다. 이것도 역시 완전 프로인트 보조액 중의 말초 마이엘린의 조 균질물의 접종에 의해 고등 척추동물의 모든 종에서 유발될 수 있다.
이 자가 면역화를 주로 담당하는 항원은 말초신경계에 존재하며 12.0 kd 의 MW를 가진 단백질 P2라고 생각한다.
이들 제제에서 고려되어야 할 또 다른 오염물질은 소의 게놈 DNA이다. 제조합 DNA 기술에 의해, 약제로서 사용될 수 있는 생물학적 활성 단백질을 제조할 수 있다는 가능성은 목적 단백질이 발현될 세포에 속한 DNA 잔기의 존재를 확인하기 위해 최종 생성물을 분석하는 것이 필요하다록 만들었다. 인간에게 사용될 약학 제제내의 DNA 단편의 존재는 유전형 정보의 가능한 조절되지 않는 이동과 함께 게놈에 상기 단편들이 혼입되는 위험성의 문제를 제기한다. 비록 재조합 DNA 기술에 의해 강글리오사이드를 수득하는 것은 아직 불가능하지만, 이런 형태의 조절 분석적 기술을 동물 기원의 조불질을 사용하는 추출 생성물에 적용하는 것은 필요하다.
결국, 시험관내 및 생체내 연구에서 사용될 강글리오사이드들은 아시알로강글리오사이드 및 글아이코세레브로사이드와 같은 다른 화합물을 함유하지 않아야만 한다. 이 물질들이 고농도로 존재한다면, 이들은 중요한 면역학적 의미를 가질 수 있고, 또한 잘못된 실험적 고찰에 이르게 할 수도 있다.
BSE의 돌발적인 발생 및 이 신경학적 질병에 대해 여전히 명확해져야 할 모든 다른 관점들은, 특히 소의 물질로부터 유래되는 생성물의 제조에 관련된 사람들에 의해, 그 문제에 기울어져야 할 필수적인 고찰을 야기시켰다.
상기에 인용된 바와 같이, 강글리오사이드 제조를 위한 초기 방법은, 생성물이 그 당시에 건강에 잠재적으로 해로운 것으로 알려져 있던 생물학적 오염물질들을 함유하지 않으며 약학적으로 허용가능한 생성물일 것을 필요로 한다. 그렇지만 분명히, 어른 소에서 전술한 질병의 그 후의 개시는 전술한 치료적 특성을 잃지 않고, 비-전통적 바이러스성 인자의 불활성화 및 감염성의 완전한 제거를 보장하기 위해, 그리고 그러한 인자를 확인하기 위한 특정한 방법을 사용하기 위해 특정한 방법을 사용함으로써 성취되는, 상기 비-전통적 바이러스성 인자의 확실한 부재를 특징으로 하는 유효성분을 수득하는 것을 필요하게 했다. 사실, 약학적 용도의 화합물 또는 그의 혼합물을 수득하기 위해 소모용으로 적당한 것으로서 확인된 조물질을 사용하는 것은 충분하지 못할 수도 있다. 분명히, BSE의 개시는 방법의 다양한 단계를 요약한 것이 아니라 이를 입증하는 일레로서 간주되어야 할, 그의 생체내에서의 생물학적 작용을 고려하여 평가되어야 한다. 과학자들이 감염을 PrP27-30과 같은 특정한 단백질과 연관시키는 것에 아직 동의하고 있지 않기 때문에 이러한 생체내에서의 생물학적 작용의 분석은 필요하다. 물론 감염 활성을 제거하는 추출 방법은 동시에 유효성분의 생물학적 활성을 완전하게 유지시켜야 하는데, 그 이유는 이 활성이 그의 치료적 용도에 필수적이기 때문이다(Ad hoc wrking party on biotechnology/pharmacy : Validation of virus removal and ina-ctivation process. Commission of the European Communities, March 1990). 과학적 연구는, 한편으로는, 단백질, 화학적 및 생물학적 오염물질을 함유하지 않는 형태로 수득되는 강글리오사이드류의적당한 혼합물 또는 그들의 단일 분획을 보장하는 방법을, 다른 한편으로는, 슬로우 바이러스와 연관된 감염성을 피괴하는데 있어서 입증된 효능을 갖는 방법들을 제공하였지만, 어느 방법도 그에 의해서, 공업적 규모로, 원하는 바대로, 슬로우 바이러스로서 규정될 수 잇는 병원성 인자와 관련되 감염성이 없는 생성물, 바림직하게는 순수한 약학적 활성 생성물의유사하게 비공지된 결과를 수득할 수 있는 것으로는 알려져 있지 않다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 반 발명의 방법의 구성도이다.
제2도는 본 발명의 방법의 중간 단계로부터 취한 몇몇 시료를 분석하기위해 웨스턴 블롯 기술(Wsetern Blot technique)에 의해 안티-PrP27-30항체를 사용함으로써 얻은 결과를나타내는 사진이다.
제3도는 본 발명의 방법의 여러단계로부터 취한 몇몇 시료에 대한 소의 게놈 DNA 의 분석 결과를 나타내는 사진이다.
제4도는 본 발명의 방법의 중간 단계로부터 취한 몇몇 시료를 분석하기 위해 웨스턴 블롯 기술에 의해 안티-MBP 항체를 시용함으로써 얻은 결과의 사진이다.
제5도는 본 발명의 방법에 따라 제조된 강글리오사이드 혼합물의 실리카겔 크로마토그래피 분석 결과의 사진이다.
제6도는 본 발명에 따라 제조된 강글리오사이드 혼합물의 생물학적 활성을 나타내는 사진이다.
제7도는 본 발명의 방법의 중간 단계로부터 취한 시료들의 안티-PrP27-30항체를 상요한 면역화학적 분석 결과를 나타내는 사진이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 목적은 공업적 제조에 적용될 수 있는 유리한 방법에 의해 수득된, 슬로우 바이러스의 부재를 특징으로 하는 생성물, 및 다양한 추출단계의 적합한 서열화에 혁신성의 근거를 둔 방법을 제공하는 것이다. 다양한 단계동안에 소 해면양뇌병변과 같은 슬로우 바이러스와 관련된 감염성 오염물질을 제거하는 본 발명의 방법은, 생성물 그 자체의 치료적 활성을 나타내는 혼합물의활성은 변하지 않고 유지되도록 한다. 이 방법으로부터 얻어지는 생성물은 소의 뇌 또는 그의 일부로부터 수득된 강글리오사이드의 일정한 혼합물 또는 단일 분획으로 구성된다.
상기 이유들로 인해, 본 발명의 방법은 하기의 주요 단계들로 이루어진다:
a) 소의 뇌 조직을 아세톤내에서 지질 제거시키고;
b) 아세톤 침전물을 30℃ 내지 35℃의온도에서 적어도 3시간 동안 메틸렌클로라이드/메탄올/수산화나트륨의 혼합물내에 현탁시켜 소수성 및 친수성 물질로 분배하고;
c) 침전물을 물/클로로포름/메탄올 및 수산화나트륨(pH 12) 과 함께 38℃ 내지 43℃로 4내지 8시간 동안 가열하여 용해시키고;
d) 침전물을 1 N 수산화나트륨을 사용하여 실온에서 적어도 1시간 동안 용해시키고;
e) 강글리오사이드 혼합물을 함유하는 용액을 10 kd 의 분자량 제한을 갖는 막을 통해 중화 및 투석시킨다.
이하에서, 제한이 아닌 설명의 목적으로, 해면양뇌병변 형태가 발견되는 감염된 소 뇌로부터 제조되거나, 또는 263 K 스크라피 균주로부터 수득한 감염된 물질을 일정량 첨가한, 감염되지 않은 소의 뇌로부터 수득된 단백질 조물질로부터 제조된 제제의 예들이 기술되어 있다.
[재료 및 방법]
강글리오사이드 혼합물의 추출을 위한 방법에 사용된 소의 뇌는, 조직학적 분석에서, 감염된 동물들로부터 얻은 재료에 속한 조직에서 전형적인 원섬유를 나타낸다.
[제조 실시예]
[실시예1]
제조방법의 도식은 제1도에 나타나 있다.
분쇄하여 증류수에 현탁시킨 1000g의 감염된 소의 뇌를 실온에서 교반하면서 약 3시간동안 300 내지 600㎖의 아세톤(비율 1:5 중량/부피)과 접촉시킨다. 그후 용액을 침전이 완료될 때까지 7℃ 내지 4℃의 온도에서 6000 x g로 원심분리한다. 그 후 용매를 제거하고 180 내지 350 ㎖의 메틸렌 클로라이드/메탄올/수산회나트륨의 혼합물을 적합한 유리 용기에 들어 있는 습윤 분말에 가하고, 다시 30℃ 내지 35℃의온도에서 적어도 3시간 동안 자기 교반하에서 유지 시킨다. 최종적으로 냉각시킨 후 +10℃에서 6000 x g 로 20분동안 원심분리한다. 액상을 +4℃에서 여과 깔대기를 통해 여과한다. 적당량의 염화 칼슘 및 아세톤을 액체에 가하고, 이를 약 30분 동안 교반한 후, +10℃에서 6000 x g 로 원심분리한다. 침전물(조물질1)을 최종적으로 밤새 건조시킨 후 고진공하에서 5시간 동안 건조시킨다. 회수된 조물을 1을 10 내지 18㎖의 물/클로로포름/메탄올의 혼합물에 재현탁시킨다. 5 N NAOH를 사용하여 pH를 대략 12로 조정한다. 전체를 38℃ 내지 43℃에서 4내지 8시간동안 가열하고 교반하에서 유지한다. 냉각되도록 방치한 후, 이를 6 N HCI로 중화시키고 필요량의 물/n-부탄올/클로로포름을 가한다. 이를 15 내지 30분동안 교반하고 2 내지 4시간동안 방치한다. 최종적으로, 하부의 유기상을 버리고, 잔류 수성상에 아세톤 및 염화 나트륨을 가하여, 이들을 약 30분동안 교반하고 +15℃에서 6000 x g 로 20분동안 원심분리한다(조 물질 2).
생성물을 고 진공하에서 건조시키고, 6 내지 15㎖의 무수 메탄올에 재현탁시킨 후, 용액을 때때로 교반하면서 약 2시간동안 뜨거운 상태로 유지시킨다. 그 후 현탁액을 6000 x g 로 재빨리 원심분리하고 상등액을 약 2시간동안 냉동기에 둔다. 그 후 유백색 용액을 0℃에서 6000 x g로 원심분리하고 침전물을 고진공하에서 건조시킨다. 생성물을 1 N 수산화나트륨 중에서 수거하고 실온에서 적어도 1시간동안 용액과 접촉한 상태로 유지시킨다. 최종적으로, 현탁액의 pH를 대략 pH 9로 만들고 10kd의 분자량 제한을 갖는 막을 사용하여 적정 용량의 증류수에 대해 투석한다. 적당량의 염화나트륨 및 아세톤을 가하고 +5℃에서 6000 x g 로 원심분리한후, 고진공하에서 건조시킨다(완성된 생성물). 시료를 10 mM의 인산염 완충액(pH 7.2)에 용해 시키고, +121℃에서 30분 동안 멸균한다(완성된 멸균 생성물).
[방법의 평가]
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법의 중요한 관점은 원치 않는 오염 물질을 함유하지 않는, 특히 비-전통적 바이러스를 함유하지 않는 강글리오사이드 생성물의 제공에 있다. 방법을 평가하기 위하여, 방법의 각종 단계에서 얻은 시료를 존재 가능한 오염에 대하여 시험한다.
생물학적/임상적 시험의 방법 및 결과는 하기와 같다:
[스크라피에 대한 생물학적 시험]
이 실험에 사용된 동물은 골든 시안 햄스터(Golden Syrian hamsters: LVG/Lak)이다. 감염에 대한 시험은 멸균된 PBS 내에 10배 희석된 0.05㎖의 시료를 대뇌내 접종한 4 마리의 젖을 뗀 암텃 동물의 군에 애해 수행된다. 대뇌 내 접종은 26G, 3/8-인치 멸균 바늘을 가진 1회용 유리 주사기를 사용하여 숙련된 직원에 의해 행해졌다.
20배 농축된 최종적인 멸균 생성물은 전적으로 하기와 같이 사용된다.:
4.0㎖는 40 마리의 동물에게 대뇌 주사된다.
3.0㎖는 1:20으로 희석한 희석액 및 원액으로 50 마리의 동물에게 대뇌 내 주사되고 22 마리의동물에게 복강내 주사된다.
복강내 주사된 용적은 2.5㎖이다.
동물들을 특징적인 신경학적, 임상적 증상의 발현에 대하여 12 개월의 기간동안 1 주에 2 회 또는 그 이상 검사한다. 각 동물에서 초기 증상의 발현을 기록하고 질병이 잘 확립되면 동물들을 죽인다. 동물의 뇌를 반분하여 하나는 10% 포르말린에 고정시키고 다른 하나는 -70℃D서 보존한다. 의심가는 원인으로 죽은 동물들 및 신경학적 질병의 징후를 나타낸 동물들 모두에게 병리학적 진단을 실행한다. 관찰시간이 끝나면, 모든 생존한 동물들을 죽이로 그들의 뇌에 대해 병리학적 평가를 실행한다.
감염 역가는 리드와 문취(Reed and Munch)의 방법에 따라 최종 종말점에서 계산되어 log LD50/㎖로서 표현된다.
시험된 시료들은 하기와 같으며 제1도에 표시된 것과 같이 생성물에 대한 명칭을 사용한다:
모든 시료들은 출발물질로서 16.7% w/v 균질물과 비교하여 용적당 균일한 역가를 보장하기를 계산된 하기 용적의 멸균 PBS에 재현탁된다:
분말화된 뇌 2.0㎖ 뇌 균질물 16.7% w/v, 원액
조 물질 1 5.4㎖ 원액
조 물질 2 9.7㎖ 원액
완성된 생성물 14.4㎖ 원액
완성된 멸균 생성물 7.0㎖ 20배 농축
생물학적/임상적 시험의 결과는 표 1에 나타내었다.
[추가의평가]
스크라피 단백질 PrP의 측정은 뮤린의 뇌로부터 얻은 정제된 단백질 유사체에 대해 특이적이고, 소 유래의 스크라피 PrP와 교차 반응하는 폴리클로날 항체에 의해 이루어진다. 측정을 위해 웨스턴 블롯 방법이 사용된다. 스크라피 PrP의 존재는 다양한 분자량을 가진 단백질용 표준 물질과 비교함으로써 평가한다.
MBP 단백질의 측정은 소의 뇌 조직으로부터 얻은 정제된 단백질 유사체에 대해 특이적인 폴리클로날 항체에 의해 이루어진다. 측정을 위해 사용된 방법은 웨스턴 블롯 방법이다. MBP 의 존재는 다양한 분자량을 가진 단백질의 표준물질과 비교함으로써 평가한다.
소 게놈 DNA의 측정은 당 분야의 전문가들에게 공지된 방법에 따라 가공된 서로 다른 단계에서 취한 시료에 대한 도트 블롯(DOT BLOT)기술에 의해 실행된다. 시료가 유효한 것을 간주되기 위해서는, 이형 DNA의 침착에서 반점이 나타나지 않아야 한다. 방사선 자가 기록법(radioautography)에 의해 검사된 시료에 반점이 존재하지않는 것은 소 게놈 DNA가 존재하지 않음을 나타낸다.
제2도는 강글리오사이드 제조 및 정제 방법의 몇몇 중간 단계로부터 얻은 시료들을 안티-Prp항체를 사용하여 면역 화학적 분석함으로써 측정된 결과를 나타낸 것이다. 분석된 시료의 숫자 기호는 제1도의 정제 도표에 주어진 괄호안의 숫자가 해당한다.
제1레인 : 기호1시료
제2레인 : 기호2시료
제3레인 : 기호3시료
제4레인 : 기호4시료
제5레인 : 기호5시료
제6레인 : 완성된 생성물
제7레인 : 표준 MW을 가진 단백질(아래쪽으로 97.4, 66.2 ,45.0 ,31.0 ,21.5 kd임)
별표된 밴드들은 분석의 증폭 시스템에 기인한 비특이적 교차-반응을 의미한다.
제3도는 본 방법의 다양한 단계로부터 취한 시료에 대한 도트블롯 기술에 의한 소 게놈 DNA의 분석을 나타낸다.
문자와 숫자의 교차점은 다음을 나타낸다:
[표준곡선]
1A - 7A 소 DNA (1 mg)
1B - 7B 소 DNA (1 ng)
1C - 7C 소 DNA (100 pg)
1D - 7D 소 DNA (10 pg)
1E - 7E 소 DNA (1 pg)
1F - 7F 소 DNA (0 pg)
[검사된 자료]
2A -2F 기호 1 시료
2B 기호 2 시료
2C 기호 3 시료
2D 기호 5 시료
2E 기호 6 시료
3A 조 3 시료
3B 완성된 생성물
3C 완성된 멸균 생성물
표준 곡선 및 분석된 시료의 점들은 중복되어 있다.
제4도는 제조 및 정제 방법의 몇명 중간 단계들로부터 얻은 시료들에 대한 안티-MBP 항체를 사용한 며역화학적 분석의결과를 나타낸다.
시료들의 기호는 제1도의 정제 도표에 지시된 숫자들에 해당한다.
제1레인 : 기호 1 시료
제2레인 : 기호 2 시료
제3레인 : 기호 3 시료
제4레인 : 기호 4 시료
제5레인 : 기호 5 시료(조물질 1)
제6레인 : 조 2 시료
제7레인 : 기호 6 시료
제8레인 : 조 3 기호 시료
제9레인 : 완성된 생성물
제10레인 : 완성된 멸균 생성물
사용된 폴리클로날 항체에 의해 인지된 다양한 형태의 MBP 는 괄호안에 표시하였다.
제5도는 하기 시료들(역시 제1도에 개략된 방법에 따른 것)의 실리카겔 상에서의 크로마토그래피의 결과를나타낸 것이다:
제1레인 : 완성된 멸균 생성물
제2레인 : 완성된 생성물
제3레인 : 트리시알로강글리오사이드 GT의 표준 물질
제4레인 : 디시알로강글이오사이드 GD의 표준 물질
제5레인 : 디시알로강글이오사이드 GD의 표준 물질
제6레인 : 모노시알로강글리오사이드 GM의 표준 물질
제6도는 본 발명에 따라 제조된 강글리오사이드 혼합물의 말초신경에 대한 생물학적 활성(화살표는 싹을 나타냄)을 보여주는 예시적 사진아다.
제7도는 강글리오사이드 정제 및 제조 방법의 몇몇 중간 단계들로 부터 얻은 시료들에 대한 안티-PrP을 사용한 면역화학적 분석의 결과를 나타낸 것이다. 분석된 시료들의 기호는 제1도의 정제 도표에 표시된 숫자들에 해당한다.
제1레인 : 1.5㎕/㎖ 의 PrP이 첨가된 조물질 1의 용액
제2레인 : 조 물질 2기호 시료
제3레인 : 기호 6시료
제4레인 : 조 물질 3기호 시료
제5레인 : 완성된 생성물
제6레인 : 완성된 멸균 생성물
[실시예2]
[감염된 뇌로부터 정제된 균질물의 제조]
3.9g의 순 중량에 해당하는, 263 K 스크라피 균주로 감염된 4 개의 햄스터 뇌를 10㎖의 증류수내에 균질화 시킨다. 그후 25% w/v의 균질물을 수득하기위해 용적을 15.5㎖로 만든다. 현탁액을 4℃에서 1800 x g 로 40분동안 원심분리한다: 7.5㎖의 상등액을 회수하고, 분취량으로 나누어 사용시까지 -70℃에서 보관한다.
[시료의 제조]
5㎖의 감염된 균질물, 120㎖의 메탄올/ 메틸렌 클로라이드 및 0.71㎖의 5.7 N 수산화 나트륨을 소 뇌의 아세톤 분말 10 g 에 가한다. 상기 첨가는 용매중 수성상의 총 용적을 일장하게 유지하고 가장 적합한 실시 조건을 얻기 위한 것이다. 출발 용액의 최종 역가는 1% w/v이다. 현탄액을 33℃의온도에서 3시간동안 자기 교반한다. 그 후 이를 냉각시키고 10℃에서 6000 x g로 20분 동안 원심분리한다. 용매의 증발을 피하기 위해 +4℃의 온도에서 액상을 구우치 깔대기(구멍크기 3호)를 통해 여과 한다; 이 단계가 끝나면 78㎖의 액상을 회수한다. 2㎖ 분취량을 생물학적 분석을 위해 보유한다. 2개의 분취량에 적합한 용적의 염화 칼슘 및 아세톤을 가하고, 실온에서 약 30분 동안 자기 교반한 후, 시료를 10℃에서 6000 x g로 10분도안 원심분리한다. 침전물(조물질 1)을 후드 내에서 밤새 건조시킨 후 고진공하에서 2 시간동안 건조시킨다. 하나의 분취량을 생물학적 분석을 위해 -70℃에서 보관한다.
반응 용기로부터 회수된 925mg 의 조물질 1을 18.5㎖의 클로로포름/메탄올/물의 혼합물 및 0.75㎖의 군질물에 재현탁시켜 1%w/v의 역가를 수득한다. 5N NaOH를 가하여 pH를 대략 12(리트머스 종이로 평가)로 조정하고, 혼합물을 40℃에서 6시간동안 자기 교반한다. 실온으로 냉각시킨 후, 용액을 6N HCI로 중화시키고 250㎕의 분취량을 생물학적 분석을 위해 보유한다.
2개의 분취량을 적합한 용적의 n-부탄올/클로로포름/물로 처리하고 15분 동안 교반한 후 4시간동안 방치한다. 최종적으로 하부의 유기상은 버린다. 잔류 수성상에 염화 나트륨 및 아세톤을 가하고, 실온에서 약 30분 동안 자기 교반한 후, 15℃에서 6000 x g로 10분동안 원시문리한다(조물질2).
이 생성물을 고진공하에서 건조시키고 생물학적 분석을 위해 분리해 놓은 분취량은 -70℃에서 보존한다. 잔여 물질을 6.5㎖의 무수 메탄올에 재현탁 시키고 50℃에서 2시간동안 유지시키면서 때때로 교반한다. 현탁액을 6000 x g에서 재빨리 원심분리하고 상등액을 -20℃에서 2시간동안 냉동기에 둔다. 그후 냉각된 유백색 용액을 0℃에서 6000 x g로 5분 동안 원심분리하고 침전물을 고진공하에서 건조시킨다. 이 시점에서의수율은 생성물 6mg 이다. 그 후 이를 500㎕의 수산화나트륨, 460㎕의 증류수 및 40㎕의 균질물에 재현탁시켜 실온에서 1시간동안 용액과 접촉상태로 유지시킨다. 최종적으로, 현탁액의 pH를 대략 9로 조정하고(리트머스 종이로 평가), 10kd 의 MW 제한을 갖는 막을 사용하여 4 시간동안 2000 용적의 증류수에 대해 투석한다. 투석후 최종 부피는 980㎕ 이다. 이를 각각 500㎕와 480㎕의 두 개의 분취량으로 나눈다; 전자의 분취량에 필요 용적의 염화 나트륨 몇 아세톤을 가하고 이를 5℃에서 6000 x g 로 10분 동안 원심분리한다. 이 시료를 고진공하에서 건조시킨다(최종 생성물).
후자의 분취량은 20㎕의 균질물 및 50㎕의 PBS 10x를 첨가하고 이를 121℃에서 30분동안 멸균시킨다(최종 멸균된 생성물).
[방법의 평가]
실시예 1에서 상술한 바와 같이, 방법의 다양한 단계들로부터 취한 시료들을 오염물질들의 잠재적인 존재에 대해 시험한다.
시험한 시료들 및 그 결과는 하기와 같다: 모든 시료들은 출발 물질로서의 1% w/v 균질물과 비교하여 용적당 균일한 역가를 보장하도록 계산된 하기 용적의 멸균 PBS 중에 수집된다:
1%로 희석된
25% w/v 뇌 균질물 원 현탁액
조 물질 1 3.2㎖ 원액
조 물질 2 1.0㎖ 원액
완성된 생성물 0.5㎖ 원액
완성된 멸균 생성물 0.5㎖ 원액
표 2는 생물학적 분석에 의해 수득된 결과를 나타낸다.
[실시예 3]
[강글리오사이드 혼합물의 생물학적 활성]
강글리오사이드 혼합물(전술한 방법에 따라 수득된 것)이 말초 신경계(PNS) 및 중추 신경계(CNS)의 질환들을 치료하기 위한 치료적 적용을 예상하게 하는 어떠한 생물학적 활성이라도 가지고 있는지의 여부를 입증하기 위하여 시험관 내에서 일련의 실험들을 수행한다. 특히, 강글리오사이드의 활성은 신경모세포종 세포(N2A)의 배양물내에서 신경돌기 형성을 평가하기 위해 시험관내에서 시험된다. 문헌(Denis-Donini et al., Neuronal Development. Part Ⅱ, 323 : 348-Academic Press, NY1980; Leon et al., Dev. Neurosci. 5 : 108, 1982)에 기술된 바와 같이, 이 세포들을, 특정 조건하에서, 성숙한 신경원이 특징적으로 나타내는 다양한 기능의 발현을 유도할 수 있으며, 따라서, 성장의 각 단계와 관련된 생화학적 변수들의 정성 및 정량 분석이 가능하다.
따라서, 이 모델에서 행해진 평가(신경돌기가 형성되는 세포의 %, 신경돌기 길이 및 상대적 분지)는 신경계의 기능적 회복에 있어서 약제의 치료적 적용 가능성을 조사할때 유효한 수단이다.
[재료 및 방법]
[세포 배양]
아메리카 셀 타입 콜렉션(America Cell Type Collection, Bethesda, Mar-yland)에 의해 제공된 마우스 C 1300 세포, 클론 N2A를 P/G(100U. 페니실린/㎖) 및 10% 송아지 태자 혈청(Seromed 사의 FCS, batch 4-CO4)을 함유하는 둘베코의 변형 이글 배지(Bulbecco's modified Eagle medium, DMEM)의 존재하에 웰(24-cator)당 10,000 세포의 농도로 플레이트에 도포한다.
그 다음날, 배양 배지를 강글리오사이드를 함유하는 동용적의 새로운 배지로 교체란다(이하 참조). 배양물을 가습된 대기하에 5% CO2 중, 37℃에서 보관한다(Haerus 배양기). 그 후 배양물을 예정된 시간(24시간후)에 2% 글루타르알데하이드로 고정시킨다.
[생성물의 시험용액의 제조]
강글리오사이드 혼합물(3개의상이한 뱃치, 번호1-2-3)을 클로로포름/메탄올 2:1에 용해시키고, 질소 스트림하에 건조시키고, 목적농도에 도달할때까지 DMMEM + P/G + 1-% FCS에 재현탁시킨다.
검사된 농도 : 1 x 10 M ; 5 x 10 M 및 1 x 10 M
하기와 같이 4가지의 상이한 실험들을 수행한다 :
-1 x 10 M의 농도에서 강글리오사이드 혼합물(뱃치번호 1 및 2)의 효과를 평가하기위한 3가지 실험-검사하의 강글리오사이드 혼합물(뱃치번호 3)의 상이한 농도
(1 x 10 , 5 x 10 및 1 x 10 M)의 용량-반응 효과를 평가하기 위한 1가지 실험
[방법]
배지를 웰로부터 빼내고 검사중인 350㎕의 DMEM+P/G+10% FCD±생성물(전술한 농도에서)로 대체시킨다.
대조 배양물을 강글리오사이드 혼합물의 첨가없이 동일한 방법으로 처리한다. 그후 배양물을 배양기내에 24시간동안 유지 시킨 후, 세포들을 2% 글루타르알데하이드로 고정시키고 현미경하에서 관찰한다.
[변수]
평가를 위한 형태학적 검사:
-신경돌기를 가진 세포의 백분율(%)
-신경돌기의 길이 및 상대적인 분지
[결과]
표 3에 보고된 것과 같이, 검사된 생성물들은 NA 세포에서 신경돌기의 형성을 유도하는데 있어서 효과적(1 x 10 M)임이 명백하다.
강글리오사이드 혼합물의 효과는 용량-의존적이며 1 x 10 M의 용량에서 최대 효율을 나타낸다(표 4).
[표 3]
마우스 신경모세포종 NA 세포에서 신경돌기 형성에 대한 강글리오사이드 혼합물(뱃치 1, 2)의 효과
모든 생성물들은 1 x 10 M의 최종 농도로 세포에 첨가되고, 형태학적 평가는 24시간후 이루어진다.
(괄호안은 뱃치번호)
마우스 신경모세포종 N2A 세포에서 신경돌기 형성에 대한 강글리오사이드 혼합물(뱃치 3)의 상이한 농도의 효과 ; 용량-효과 반응
(괄호안은 뱃치번호)
시험관 내에서 생물학적 활성에 대한 데이타의 통계적 평가는 강글리오사이드 혼합물의 다양한 뱃치들 사이에 큰 차이가 없음을 나타낸다(표 5).
[표 5]
뱃치 1 및 2를 사용하여 얻은 데이타의 전체적인 통계적 평가.
보고된 값들은 9회의 독립적인 시험의 평균 ± 표준 편차이다.
또한, 신경돌기의 형태학적 평가는 강글리오사이드 혼합물로 처리된 세포들이 길고 뚜렷하게 분지된 신경돌기들(즉, 뚜렷한 분지)을 나타냄을 보여준다.
[결론]
따라서, 전술한 관찰들은 검사된 강글리오사이드 혼합물이 생물학적 활성을 가지며, 실제로 그의 특별한 특성들을 보증하는 방법에 의해 수득된 생성물은 N2A 세포에서 신경돌기 형성을 유도할 수 있음을 입증하는 것이다. 이 사실은 생성물이 말초 및 중추 신경계의 복구 현상에 효과적임을 의미한다. 상술한 바와 같이 수득되고, 잠재적으로 위험한 비전통적 바이러스와 관련된 오염물질을 함유하지 않는 강글리오사이드의 혼합물은 모노시알로강글리오사이드 CM1과 같은 개별적인 성분 또는 강글리오사이드 혼합물의 제조를 위해서도 역시 사용될 수 있다.
상술한 약리학적 특성의 관점에서, 강글리오사이드 혼합물은 말초 및 중추 신경계 모두에 있어서 수많은 질병(다양한 병인 병원성 원인을 가짐)에 약제로서 통상적으로 사용될 수 있다. 치료될 수있는 특정한 상태는 구후시신경염, 동안 신경의 마비, 삼차 신경통, 안면 신경의 마비 및 벨 마비, 가르신 증후군, 척수 신경근염, 말초신경의 외상성 병변, 당뇨성 및 알코올성 다발성신경염, 분만마비 마비성 좌골 신경통 운동 신경원 질환, 근위축성측삭경화증, 척수장애성근위축, 진행성 구마비, 중증근무력증 및 람베르트-이튼 증후군, 근육 이영양증, CNS 및 PNS에서 시냅스의 신경전달에 있어서의 장애, 착란과 같은 의식 결함, 뇌진탕, 혈전증, 뇌색전증, 뇌 및 척수외상일 수 있다.
투여는 통상적으로 근육내, 피하 또는 정맥내 주사에 의해, 또는 경피적, 폐 또는 경구 경로에 의해, 바람직하게는 적절하게 완충된 수용액 형태로 이루어진다. 약제의 안전한 저장은 후술하는 약학 제제의 실시예들에서 지시된 바와 같이, 생성물의 용액을 가능한 한 다른 보조 성분과 함께 함유하는 바이알의 형태로 약제를 제조함으로써 보장될 수 있다. 전술한 비경구적 경로에 의한 치료적 또는 가능한한 또한 예방적 적용을 위해서는, 투여량은 바람직하게는 1 일당 10㎎ 내지 100㎎의 활성 물질로 변화될 수 있다.
제한적 목적이 아닌 순수한 서술적 목적으로, 하기에 본 발명에 따라 제조된 약제학적 조성물의 실시예를 나타낸다.
[실시예 1]
바이알 한개는 하기와 같이 구성된다 :
[활성 성분]
- 나트륨염으로서 강글리오사이드 10.0㎎
- 모노시알로테트라헥소실강글리오사이드(GM1)
- 디시알로테트라헥소실강글리오사이드(GM1a)
- 디시알로테트라헥소실강글리오사이드(GD1b)
- 트리시알로테트라헥소실강글리오사이드(GT1b)
[다른 성분들]
- 이염기성 인산 나트륨 12 H2O 6.0㎎
- 일염기성 인산 나트륨 2 H2O 0.5㎎
- 염화나트륨 16.0㎎
- 주사용수 총 2.0㎖가 되도록 적당량
[실시예 2]
바이알 한개는 하기와 같이 구성된다 :
[활성 성분]
- 나트륨염으로서 강글리오사이드 20.0㎎
- 모노시알로테트라헥소실강글리오사이드(GM1)
- 디시알로테트라헥소실강글리오사이드(GD1a)
- 디시알로테트라헥소실강글리오사이드(GD1b)
- 트리시알로테트라헥소실강글리오사이드(GT1b)
[다른 성분들]
- 이염기성 인산나트륨 12 H20 6.0㎎
- 일염기성 인산나트륨 2 H2O 0.5㎎
- 염화나트륨 16.0㎎
- 주사용수 총 2.0㎖가 되도록 적당량
[실시예 3]
바이알 한개는 하기와 같이 구성된다:
[활성 성분]
- 나트륨염으로서 강글리오사이드 100.0㎎
- 모노시알로테트라헥소실강글리오사이드(GM1)
- 디시알로테트라헥소실강글리오사이드(GD1a)
- 디시알로테트라헥소실강글리오사이드(GD1b)
- 트리시알로테트라헥소실강글리오사이드(GT1b)
[다른 성분들]
- 이염기성 인산나트륨 12 H2O 12.0㎎
- 일염기성 인산나트륨 2 H2O 1.0㎎
- 염화나트륨 32.0㎎
- 주사용수 총 4.0㎖가 되도록 적당량
지금까지 본 발명이 기술되었는데, 본 발명이 많은 방법으로 변화될 수 있다는 것은 분명하다. 그러한 변화는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나는 것으로 간주되지 않으며, 당분야의 전문가에게 자명한 그러한 변경은 하기 청구범위의 범위내에서 포함된다.
Claims (13)
- a) 강글리오사이드-함유 조직을 아세톤으로 지질 제거시켜 아세톤 침전물을 제조하고; b) 수득된 아세톤 침전물을, 수산화 나트륨을 함유하고 친수성 물질들로부터 소수성 물질을 분리시키는 메틸렌 클로라이드 및 메탄올의 제1용액 혼합물에 현탁시키고; c) 단계 (b)에서 수득된 혼합물을 여과하여 제1액상을 수득하고; d) 상기 제1액상을 염화칼슘 및 아세톤을 첨가함으로써 침전시켜 제1조물질을 수득하고; e) 상기 제1조물질을 수산화나트륨을 함유하는 물/클로로포름/메탄올에 용해시키고 용해된 제1조물질을 pH 약 12에서 38 내지 48℃의 온도에서 약 4 내지 8시간 동안 가열한 후에 혼합물을 실온에서 냉각시키고; f) 혼합물을 중화시키고 상기에서 용해된 제1조물질을, 친수성 물질들로부터 소수성 물질들을 분리시키는 제2용매 혼합물내에서 분배시키고; g) 상기 분배 혼합물을 분리하여 유기상은 제거하고 수성상을 수거하고; h) 상기 수성상을 아세톤 및 염화나트륨을 첨가함으로써 침전시켜 제2조 물질을 제조하고; I) 제2조물질을 뜨거운 메탄올에 용해시킨 후 냉각시켜 제3조물질을 제조하고; j) 수득된 제3조물질을 수산화나트륨에 용해시키고; k) 상기에서 용해된 제3조물질을 중화시키고; l) 상기에서 중화 및 용해된 제3조물질을 약 10kd의 분자량 제한을 갖는 막을 통해 투석하여 강글리오사이드 혼합물을 제조함을 특징으로하여, 강글리오사이드 혼합물을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 아세톤 침전물을 함유하는 제1용매 혼합물을 약 30 내지 35℃에서 약 3시간 이상 동안 가열함을 특징으로 하는 방법.
- 제2항에 있어서, 제2용매 혼합물이 물, 클로로포름 및 n-부탄올의 혼합물을 함유함을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 제3조물질을 1N 수산화 나트륨에 용해시킴을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 강글리오사이드 함유조직이 소의 뇌 조직임을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 제조된 강글리오사이드 혼합물을 건조시켜 완성된 생성물인 강글리오사이드 혼합물을 제조함을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 완성된 생성물인 강글리오사이드 생성물을 완충액에 현탁시키고 멸균시켜 완성된 멸균 강글리오사이드 혼합 생성물을 제조함을 특징으로 하는 방법.
- a) 소의 뇌 조직을 아세톤으로 지질 제거시켜 아세톤 침전물을 제조하고; b) 수득된 아세톤 침전물을 메틸렌 클로라이드, 메탄올 및 수산화 나트륨의 제1용매 혼합물에 현탁시키고; c) 상기에서 수득된 아세톤 침전물을 함유하는 제1용매 혼합물을 여과하여 제1액상을 수득하고; d) 제1액상에 염화 칼슘을 첨가하여 침전시켜 제1조물질을 수득하고; e) 수득된 제1조물질을 물, 클로로포름 및 메탄올에 용해시키고, 용해된 제1조물질을 수산화나트륨을 함유하는 용매 중에서, pH 약 12 및 약 38 내지 43℃의 온도에서 약 4 내지 8시간 이상 동안 가열하고; f) 가열 및 용해된 제1조물질을 물, n-부탄올 및 클로로포름의 혼합물에 2차로 분배시키고; g) 상기에서 수득된 2차 분배 혼합물을 분리하여 유기상은 제거하고 수성상을 수거하고; h) 상기에서 수거된 수성상에서 아세톤 및 염화 나트륨을 첨가하여 침전시키고 원심분리하여 제2조물질을 제조하고; i) 수득된 제2조물질을 메탄올에 용해시켜 가열하고; j) 용해 및 가열된 제2조물질을 원심분리하여 상층액을 제고하고; k) 수득된 상층액을 냉각시켜 제3조물질을 제조하고; l) 제3조물질을 수산화 나트륨에 약 1시간동안 용해시키고; m) 용해된 제3조물질을 중화시키고; n) 중화 및 용해된 제3조물질을 약 10kd 의 분자량 제한을 갖는 막을 통해 투석하여 강글리오사이드 혼합물을 제조함을 특징으로 하여, 강글리오사이드 혼합물을 제조하는 방법.
- 제8항에 있어서, 제3조물질을 1N 수산화나트륨에 용해시킴을 특징으로 하는 방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 제조된 강글리오사이드 혼합물을 건조시켜 완성된 생성물인 강글리오사이드 혼합물을 제조함을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 완성된 생성물인 강글리오사이드 생성물을 완충액에 현탁시키고 멸균시켜 완성된 멸균 강글리오사이드 혼합 생성물을 제조함을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 추가로 강글리오사이드 혼합물을 각각의 강글리오사이드 성분으로 분리시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 강글리오사이드 GM1을 강글리오사이드 혼합물로부터 분리함을 특징으로하는 방법.
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