IT9041716A1 - Metodo per la preparazione e purificazione di una miscela di glicosfingolipidi priva di contaminanti da virus non convenzionali - Google Patents
Metodo per la preparazione e purificazione di una miscela di glicosfingolipidi priva di contaminanti da virus non convenzionali Download PDFInfo
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Description
BACKGROUND DELL'INVENZIONE
I gangliosidi, glicosfingolipidi contenenti acido sialico, sono normali costituenti di tutte le membrane cellulari dei mammiferi e si trovano ad alta concentrazione nel tessuto nervoso (Ando S.: Neurochem. Int. 5: 507, 1983). Quattro gangliosidi GM1, GDla, GDlb e GTlb (nomenclatura secondo Svennerholm L., J. Neurochem, 10:613, 1963), costituiscono l'80-90% dei gangliosidi totali in un cervello di mammifero. La particolare localizzazione dei gangliosidi nello strato esterno della membrana piasmatica suggerisce che essi abbiano un ruolo importante in molte attività biologiche quali sensori e/o recettori di molte molecole e nel trasferimento delle informazioni attraverso le membrane cellulari (Fishman et al.:Science 194: 906, 1976) Ne deriva quindi un ruolo preminente nella regolazione sia dello sviluppo che della riparazione neuronaie a livello del sistema nervoso periferico e centrale.
E' infatti stato ampiamente documentato che i gangliosidi sono in grado di influenzare favorevolmente il recupero funzionale del sistema nervoso periferico (SNP) e del sistema nervoso centrale (SNC) lesionati, mediante il coinvolgimento di specifici meccanismi di membrana e l'interazione con fattori neurotrofici come evidenziato da studi in vitro su colture neuronali (Doherty P. et al. J. Neurochem. 44, 1259, 1985; Skaper S. et al. Molecular Neurobiology, 3, 173, 1989).
In particolare, è stato riportato che la somministrazione dei gangliosidi in vivo facilita la rigenerazione nervosa ed il recupero funzionale del SNP in condizioni patologiche: sono stati descritti positivi effetti in modelli di neuropatie traumatiche (Ceccarelli B. et al. Adv. Exp. Med. Biol.
71:275, Plenum Press, New York, 1976; Gorio A. et al. Brain Res. 7, 236, 1980; Gorio A. et al. Neuroscienze 8, 417, 1983), metaboliche (Norido F. et al. Exp. Neurol. 83, 221, 1984) e tossiche (Di Gregorio F. et al. Cancer Chemoter. Pharmacol. 26, 31, 1990).
Relativamente al SNC sono stati ampiamente descritti i positivi effetti di recupero indotti dal monosialoganglioside GM1 in modelli di ischemia (Cuello A. C. et al. Brain Res. 376: 373, 1986; Karpiak S. E. et al. CRC Criticai Rev. in Neurobiology, voi. 5 issue 3, 1990), di lesioni traumatiche (Toffano G. et al. Brain Res. 296: 233, 1984) e neuronotossiche (Johnsson j. Dev. Brain Res ., 16: 171, 1984) a livello di diversi sistemi neuronali in diverse specie animali. E' stato recentemente trovato che i gangliosidi possono inibire la traslocazione e l'attivazione della protein kinase C mediata dal glutammato (Vaccarino F. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8707, 1987). Tale azione sarebbe molto importante in condizioni di danno ischemico ove è descritto il ruolo cruciale degli aminoacidi eccitatori, quali glutammato, che innescano una cascata di eventi che portano alla morte neuronaie. Questo meccanismo potrebbe favorire la sopravvivenza dei neuroni nell'area perilesionale, prevenire la degenerazione retrograda, ed accelerare la risposta di crescita riparativa a fattori trofici locali.
I risultati delle ricerche sperimentali hanno trovato ampio riscontro in quelli dell'impiego clinico dei gangliosidi. Da oltre dieci anni i gangliosidi sono utilizzati come agenti terapeutici in pressoché tutte le forme di neuropatia periferica, da quelle meccaniche a quelle tossicocarenziali, da quelle infettive e infiammatorie a quelle dismetaboliche. Questi farmaci si sono rivelati egualmente efficaci nelle mono e nelle polineuropatie, nelle forme sensitivo-motorie e in quelle del sistema autonomo, così come in'molte neuropatie a carico di nervi cranici, ad esempio nelle paralisi di Bell del nervo facciale, nelle nevralgie trigeminali, nelle nevralgie conseguenti ad herpes zoster. I gangliosidi, ed in particolare il monosialoganglioside, trovano inoltre vasta applicazione in tutte le patologie connesse alle lesioni acute del SNC su base vascolare o traumatica e nelle sequele di queste patologie (ischemia cerebrale, trauma cranico e spinale).
La loro dimostrata azione riparativa nel SNC porta inoltre la loro applicazione anche in patologie croniche neurodegenerative, quali il morbo di Parkinson e la demenza di Alzheimer.
La loro natura di "endocoidi" (farmaci endogeni), in quanto naturali componenti delle membrane neuronali, spiega inoltre la loro ottima tollerabilità e l'assenza, anche per trattamenti prolungati con dosi elevate, di effetti collaterali, così frequenti invece in alcune terapie convenzionali delle neuropatie periferiche.
In generale, miscele opportune di gangliosidi, ad esempio in una formulazione particolare del tipo GM1 dal 18% al 24%, GDla dal 36% al 44%, GDlb dal 12% al 18%, GTlb dal 16% al 22%, o le singole frazioni gangliosidiche, in particolare il monosialoganglioside GM1, presentano attività biologiche analoghe a quelle descritte. Questi gangliosidi, come opportune miscele o singole frazioni, in particolare il monosialoganglioside GM1, sono estratti da cervelli di mammiferi e quindi, data la loro particolare funzione biologica e la loro applicazione terapeutica sopra descritta a livello del sistema nervoso periferico e sistema nervoso centrale, è necessario disporre di metodi di purificazione che ne garantiscano per uso farmaceutico la purezza estrema da contaminanti biologici e chimici .
Da tempo è nota la possibilità a livello di ricerca, di estrarre miscele (non ancora caratterizzabili definitivamente) di gangliosidi (Tettamanti et al, Biochim. e Biophys. Acta, 296:160, 1973; Trams et al, Biochim. e Biophys. Acta, 60:350, 1962; Bogoch et al, British J. Pharm., 18:625, 1962; Wiegandt et al, Angew Chem. 80:89, 1968; brevetto USA n. 3436413; C.A. 61, 9851C, 9895d e il brevetto Fidia n. 1046051), ma nessuno dei sopracitati metodi è stato sviluppato nell’ottica di dimostrare l’eliminazione e l’abbattimento di componenti associati a virus non convenzionali, sia perchè a suo tempo non erano ancora comparse alcune malattie, proprie della specie animale mammifera alla quale appartengono i cervelli utilizzati come materia prima per l'estrazione, sia perchè non erano disponibili reattivi per poter identificare specificatamente i componenti potenzialmente pericolosi, resi ad oggi disponibili con metodologie specifiche sviluppate dalle conoscenze acquisite in questi ultimi anni dall'evoluzione scientifica delle tecniche di biologia molecolare Recentemente è stato riportato un metodo di purificazione da cervello bovino per ottenere miscele opportune di gangliosidi o loro singole forme, valutando la scomparsa durante alcune fasi del processo di componenti biologici potenzialmente pericolosi mediante metodi immunochimici, che impiegano anticorpi specifici o metodi biotecnologici che impiegano opportune sonde di DNA. (Domanda di brevetto 41747A/89). Evidentemente questi metodi, analitici sono da considerare estremamente avanzati e specifici, ma permettono di identificare esclusivamente il componente biologico ricercato. Alcune volte si possono presentare situazioni di tipo patologico per le quali non è identificato l'agente o gli agenti patogeni. Fra tali situazioni pateologiche è da includere una patologia, chiamate encefalopatia spongiforme bovina, che è stata segnalata per la prima volta in Inghilterra nel 1986 (Wells G. et al. Vet. Record, 419, 1986).
Il nome della malattia deriva dall'apparenza spugnosa del tessuto cerebrale degli animali colpiti, quando le sezioni vengono analizzate al microscopio; le lesioni principali sono costituite da estese vacuolazioni neuronali.
Tutte le evidenze disponibili suggeriscono che la BSE appartiene a un gruppo di encefalopatie degenerative del sistema nervoso centrale, con esito invariabilmente fatale, causate da un gruppo di agenti trasmissibili non convenzionali (Fraser et al., Vet. Record 123: 472, 1988; Hope et al., Nature 336: 390, 1988). Tra queste si annoverano lo scrapie nelle pecore e capre, la malattia del dimagrimento cronico del cervo in cattività, l'encefalopatia trasmissibile del visone nei visoni d'allevamento, e due malattie umane: il kuru e la malattia di Creutzfeldt-Jacob. Le lesioni istopatologiche riscontrate a livello cerebrale dovute a queste malattie sono analoghe tra loro e sovrapponibili a quelle causate dalla BSE.
Molte teorie sono state avanzate riguardo la natura di questi agenti eziologici, che non sono nè batteri nè virus, nè simili ad alcun altro organismo conosciuto per cui vengono definiti virus nor convenzionali. A causa del lungo periodo di incubazione che trascorre dal momento dell'infezione alla comparsa dei sintomi, questi agenti vengono anche definiti "virus lenti".
Dai pochi casi del 1986, in Inghilterra la malat tia è sfociata in una vera e propria epidemia che ha colpito circa 14000 bovini e aumenta a un ritmo attuale di circa 250-300 casi la settimana. I bovini infetti non mostrano segni di malattia per parecchi anni (il periodo di incubazione è infatti di 4-5 anni), ma una volta che i sintomi appaiono, il corso della malattia è rapido e fatale.
I risultati di una ricerca epidemiologica condotta dal Central Veterinary Laboratory del Ministero dell'Agricoltura inglese (Wilesmith et al, Vet. Record, 123: 638, 1988) hanno individuato la fonte dell'infezione negli alimenti concentrati per il bestiame a base di carcasse processate di altri ruminanti, venduti come farina di carne e di ossa. Dato l'ampio spettro di specie animali nelle quali l'encefalopatia si può trasmettere, sembra plausibile che la BSE sia il risultato dell'infezione con l'agente eziologico responsabile dello scrapie acquisito dagli ovini tramite questi aliment contaminati {Morgan KL, Vet. Record 122: 445 1988) .
Sulla base dei risultati di questi studi il governo inglese ha bandito, con un ordine diventato effettivo dal 18 luglio 1988, la vendita e l'approvvigionamento di alimenti per bestiame contenenti proteine animali derivate da ruminanti.
L'opinione generale è che parecchi fattori hanno contribuito insieme all'improvvisa comparsa della BSE in Inghilterra (Cherfas J., Science Feb.
1990, 523).
In primo luogo, il numero di ovini in Gran Bretagna è aumentato rapidamente nei tardi anni '70 e inizi '80, e con questo l'incidenza dello scrapie, che è una malattia degli ovini endemica in Europa da più di 250 anni (Pattison et al, Vet. Record 90: 465, 1972). Nello stesso periodo, sulla scia della crisi petrolifera, gli stabilimenti di produzione di alimenti per il bestiame cambiarono il modo di processare le carcasse adottando un sistema a bassa temperatura, probabilmente meno efficiente nel distruggere l'agente altamente resistente dello scrapie. Tutti i produttori di questi mangimi, eccetto uno, abbandonarono l'uso di solventi, come il benzene, l'esano e il tricloroetilene, per rimuovere l’eccesso di grassi dalle farine di soia e di ossa. Forse più significativa è stata la mancanza dello stadio finale di riscaldamento per rimuovere i solventi: questo passaggio infatti prevedeva temperature molto alte.
Inoltre, la politica del governo ha incoraggiato gli allevatori a produrre più latte, e a svezzare così precocemente i vitelli alimentandoli con razioni ricche in proteine, spesso di bassa qualità in quanto costituite da farine di carne e ossa, a causa del minor costo rispetto ad alimenti a base di soia e farina di pesce, che sono fonti proteiche più garantite.
Gli studi sulle vie di trasmissione della malattia costituiscono un aspetto fondamentale della ricerca sulla BSE, Il punto importante di questi esperimenti è che, individuando l'entità delle barriere inter-specie alla trasmissione dell'agente patogeno, diventa possibile stimare il rischio di una particolare specie a contrarre la BSE. Fraser et al (Vet. Record, 123:472, 1988) hanno dimostrato la trasmissibilità della malattia dai bovini ai topi, inoculando estratti di cervello di bovini morti a causa della BSE nel cervello di topi, che in seguito svilupparono la malattia. Successivamente Barlow et al (Vet. Record, 3 Feb. 1990) hanno trasmesso la malattia ai topi alimentandoli con cervelli bovini infetti. Era la prima evidenza che la BSE può essere contratta ingerendo materiale infetto. Nessun altro tessuto proveniente da animali colpiti (milza, midollo spinale, tessuti linfatici, latte, ecc) è stato in grado di produrre la malattia nel topo. Mentre è dimostrata la trasmissione materna dello scrapie negli ovini, a tutt'oggi non esistono evidenze di un'eventuale trasmissione verticale nè orizzontale dell'agente eziologico della BSE nei bovini.
Gli agenti causali delle encefalopatie subacute trasmissibili sono estremamente resistenti all'inattivazione mediante le procedure standard di decontaminazione. I dati a disposizione derivano per la maggior parte da studi di inattivazione degli agenti dello scrapie e della malattia di Creutzfeldt-Jacob .
L'agente eziologico dello scrapie è altamente termostabile. Dopo esposizione prolungata a temperature fino a 80 °C si ha una perdita molto piccola di infettività; tuttavia temperature superiori riducono marcatamente l'infettività (Hunter et al, J.Gen.Microbiol . 37: 251,1964). Una piccola quantità di "virus" infettivo rimane talvolta dopo trattamento di sospensioni di materiale infetto a 100°C per 1 ora o a 118°C per 10 minuti. Recentemente è stato necessario rivedere gli standards per la sterilizzazione a vapore in autoclave di questi agenti trasmissibili. Negli Stati Uniti gli attuali standards di autoclavaggio per la decontaminazione dalla malattia di Creutzfeldt-Jacob prevedono il trattamento a 132°C per 1 ora (Rosenberg et al, Annals of Neurology 19: 75, 1986), e si basa su studi effettuati su omogenati di cervello contenenti gli agenti dello scrapie e della malattia di Creutzfeldt-Jacob (Brown et al, J. of infectious diseases 153: 1145, 1986). Sulla base di alcuni studi, fra cui quello di Kimberlin (Kimberlin et al, Journal of Neurological Sciences 59: 355, 1983), in Inghilterra lo standard corrente di inattivazione per la decontaminazione da malattia di Creutzfeldt-Jacob è il trattamento in autoclave a 134-138°C per 18 minuti.
Sfortunatamente gli agenti delle encefalopatie spongiformi sono molto resistenti anche ai comuni trattamenti chimici, oltre a quelli fisici. Solventi come il benzene, l'esano, il petrolio e il tricloroetilene sono stati tutti usati come solventi di estrazione, ma esiste scarsa informazione sui loro effetti sull'infettività. Solo pochi dati sono disponibili sull’inattivazione chimica degli agenti infettivi, dovuto soprattutto al fatto che i saggi richiedono un gran numero di animali e lunghi periodi di osservazione.
Concentrazioni di 0.3% -2.5% di ipoclorito di sodio hanno prodotto grosse perdite di infettività nei saggi biologici usati, spesso però non complete (Walker et al., AM.J.Pubi.Health 73:661, 1983) I dati riguardanti il trattamento con idrossido di sodio fino a 0.25 N sono molto variabili; a concentrazioni superiori a 1 N esso appare però essere il reagente chimico più efficace tra quelli studiati. Una grande variabilità è stata riportata anche relativamente al trattamento con urea 6M-8M. I risultati degli studi sulla decontaminazione evidenziano così che, sebbene la gran parte dell'infettività sia rapidamente distrutta da molte delle diverse procedure fisiche e chimiche, l'esistenza di piccole sottopopolazioni di agenti infettivi resistenti rende estremamente difficile in pratica la sterilizzazione dei materiali contaminati.
Non appena è stato accertato che la BSE è una ma lattia "scrapie-like", sono subito state sollevate alcune importanti questioni a livello epidemiologico ed analitico, quest'ultimo in particolare volte ad identificare l’agente associabile all’infettività .
L'insorgenza improvvisa della BSE e tutti i lati ancora da chiarire su questi disordini neurologici hanno suscitato una necessaria considerazione so prattutto da parte di chi è coinvolto nella preparazione di prodotti che derivano da materiale bovino .
E’ evidente quindi che mentre in base allo stato dell'arte al tempo del deposito della domanda di brevetto (n. 26323A75 del 13.8.1975) era necessario ottenere un prodotto farmaceuticamente accettabile, privo quindi delle contaminazioni biologiche allora ritenute potenzialmente dannose per l'uomo, la comparsa, ad un determinato tempo, della sopradescritta patologia del bovino adulto rende necessario l'ottenimento di principio attivo che senza perdere le precedenti proprietà terapeutiche, si caratterizzi per la sicura assenza di agenti virali non convenzionali, ciò cui si perviene attraverso l'impiego di specifici processi che garantiscano l'inattivazione di questi agenti virali non-convenzionali e la completa eliminazione dell’ infettività e di specifiche metodologie atte alla loro identificazione.
Potrebbe infatti non essere sufficiente impiegare per l'ottenimento di composti o loro miscele di interesse farmaceutico, materia prima certificata per uso alimentare. Evidentemente la scomparsa dell 'infettività, nel caso specifico della BSE, deve essere valutata anche analizzando la sua azione biologica in vivo, che deve essere considerata come esempio di verifica delle diverse fasi del processo, ma non di riscontro dello stesso. Tale analisi dell'azione biologica in vivo si rende necessaria in quanto non vi è ancora accordo, a livello scientifico, nell 'associare l’infettività con la presenza di determinate proteine quali la PrP27-30. E' evidente che il processo di estrazione che elimina l'attività infettivamente attiva deve contemporaneamente preservare l'attività biologica del principio attivo desiderato come prodotto finale ai fini della sua applicazione terapeutica. (Ad hoc working party on biotechnology/-pharmacy: Validation of virus removai and inactivation procedure. Commission of thè European Communities, March 1990).
Dalle conoscenze scientifiche sono noti da un 1 metodi che garantiscono l'ottenimento di opportune miscele di gangliosidi o singole frazioni in forme prive di contaminanti proteici, chimici e biologici, dall'altro metodi che dimostrano la loro efficacia nell'abbattimento del1’infettività associata a virus lenti, ma non è noto un metodo, applicabile anche a livello industriale, che contemporaneamente permetta di ottenere il risultato egualmente non noto di un prodotto, desiderato puro, farmaco logicamente attivo e privo di infettività associabile ad agenti patogeni definibili come virus lenti.
Scopo della presente invenzione è quello di fornire un prodotto, caratterizzato dalla sua indennità da virus lenti, ottenuto mediante un procedimento vantaggioso ed applicabile alla produzione industriale, procedimento che fonda la sua innovatività sull'opportuno sequenziamento di diverse fasi di estrazione. Tale processo, che elimina nelle sue diverse fasi contaminanti infettivi associabili a virus lenti come la encefalopatia spongiforme bovina, consente di mantenere inalterata l'attività della miscela che rappresenta l'attività terapeutica del prodotto stesso.
Il prodotto, derivante da tale procedimento, è costituito da una determinata miscela di gangliosidi o singole frazioni ottenute a partire da cervello bovino o sue parti.
Il procedimento secondo la presente invenzione si caratterizza, per le ragioni sopra descritte, specificamente per le seguenti principali fasi:
a) sospensione del precipitato acetonico in una miscela di metilene cloruro/metanolo/sodio idrossido ad una temperatura compresa fra 30°C e 35°C per almeno 3 ore;
b) solubilizzazione del precipitato con acqua/ cloroformio/metanolo e sodio idrossido pH 12 riscaldando fra i 38°C e i 43°C fra le 4 e le 8 ore;
c) solubilizzazione del precipitato con sodio idrossido IN a temperatura ambiente per almeno un'ora;
d) neutralizzazione e dialisi della soluzione contenente la miscela gangliosidica con una membrana avente un taglio di PM di 10 kd.
Di seguito, per scopo illustrativo e non limitativo, si descrivono esempi di preparazioni effettuate a partire da cervelli bovini infetti dove era stata riscontrata la forma di encefalopatia spongiforme o da grezzi proteici ottenuti da cervelli bovini non infetti ai quali sono aggiunte quantità costanti di materiale infetto proveniente dal ceppo 263K dello scrapie. Essendo l'invenzione così descritta, è chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dalle spirito e dalle prospettive dell'invenzione e tutte quelle modificazioni che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell'ambito delle successive rivendicazioni.
MATERIALI E METODI
I cervelli bovini impiegati nel processo di estrazione della miscela gangliosidica dimostravano, attraverso un'analisi istologica, le fibrille tipiche nei tessuti appartenenti a materiale proveniente da animali con l'infezione.
SAGGIO BIOLOGICO DI INFETTIVITÀ
Gli animali utilizzati per questi esperimenti erano criceti Golden Syrian (LVG/Lak). I saggi di infettività sono stati condotti in gruppi di quattro femmine svezzate inoculate ic con 0.05 mi dei campioni diluiti serialmente dieci volte in PBS sterile. Le inoculazioni ic sono state effettuate da personale esperto usando siringhe di vetro usa e getta dotate di una ago sterile 26G di 3/8 pollici. Il prodotto finale e sterilizzato, concentrato 2C volte, è stato utilizzato integralmente secondo il seguente schema:
mi 4.0 iniettati ic in 40 animali,
mi 3.0 diluiti 1:20 e iniettati non diluiti ic in 50 animali e ip in 22 animali. Il volume iniettato ip era di mi 2.5.
Gli animali sono stati esaminati due o più volte alla settimana, per un periodo di 12 mesi, per la comparsa di caratteristici sintomi clinici neurologici. La comparsa di sintomi precoci in ogni animale è stata registrata, e gli animali sono stati sacrificati quando la malattia era in stato avanzato. I loro cervelli sono stati sezionati in due metà, una è stata fissata in 10% formalina e l'altra è stata conservata a -70°C. La diagnosi patologica è stata effettuata in tutti quegli animali che erano morti per cause sospette e quelli che avevano mostrato segni di malattia neurologica. Alla fine del tempo di osservazione, tutti gli animali sopravvissuti sono stati sacrificati e i loro cervelli sottoposti a valutazione patologica. Il titolo infettivo è stato calcolato al "final end point" secondo il metodo di Reed e Munch, e viene espresso come log LD50g/ml.
ESEMPIO 1
1000 grammi di cervello bovino infetto, macinati e sospesi in acqua distillata, sono stati lasciati ir contatto con acetone (rapporto 1:5 peso/volume) per circa 3 h a temperatura ambiente sotto agitazione; la soluzione è stata quindi centrifugata a 6000 x g ad una temperatura compresa fra i 7°C e i 4°C fino a precipitazione completa. Il solvente è stato eliminato ed alla polvere umida, posta in un opportuno contenitore di vetro, è stata aggiunta una miscela di metilene cloruro/metanolo/sodio idrossido e si è lasciato ancora sotto agitazione magnetica per almeno 3 h a una temperatura compresa tra 30°C e 35°C. Al termine si è lasciato raffreddare e quindi si è centrifugato per 20 min a 6000 x g a 10°C. La fase liquida è stata filtrata attraverso un imbuto filtrante a una temperatura di 4,C. Il liquido è stato addizionato della quantità opportuna di calcio cloruro e acetone, si è lasciato in agitazione per circa 30 min e si è centrifugato a 6000 x g a +10°C. Il precipitato (grezzo 1) è stato infine lasciato essicare per una notte e successivamente ir alto vuoto per 5 ore.
Il grezzo 1 recuperato è stato risospeso nella miscela di acqua/cloroformio/metanolo. Il pH è stato regolato intorno ad un valore di 12 con NaOH 5N. Il tutto è stato messo a caldo fra 38° e 43°C da 4 a 8 h e lasciato sotto agitazione. Al termine, dopo avere lasciato raffreddare, si è neutralizzato con HC1 6N ed è stata aggiunta la quantità richiesta di acqua/n-butanolo/cloroformio. Si è agitato fra 15 e 30 min e si è lasciato riposare fra 2 e 4 h. Al termine è stata scartata la fase organica inferiore, si è aggiunto l'acetone e il sodio cloruro nelle restanti fasi acquose, si è lasciato ad agitare per circa 30 min e si è centrifugato per 20 min a 6000 x g a 15°C (grezzo 2).
Il prodotto è stato essicato in alto vuoto, ed è stato risospeso in metanolo assoluto e lasciato per circa 2 h a caldo agitando la soluzione di tanto in tanto. La sospensione è stata quindi rapidamente centrifugata a 6000 x g e il surnatante è stato posto in congelatore per circa 2 h. La soluzione color bianco opalescente è stata poi centrifugata a 0°C a 6000 x g e il precipitato è stato essiccato in alto vuoto. Il prodotto è stato ripreso in sodic idrossido IN e lasciato in contatto con la soluzione per almeno 1 h a temperatura ambiente. Al termine il pH della sospensione è stato portato a circa un valore di 9 e si è dializzato con una membrana avente un taglio di PM di 10 kd contro un opportuno volume di acqua distillata. E' stata aggiunta una quantità opportuna di sodio cloruro e acetone e si è centrifugato a 5°C a 6000 x g, e quindi essiccato il prodotto in alto vuoto (prodotto finito). Il campione è stato risospeso in tampone fosfato 10 mM pH 7.2 e sterilizzato a 121°C per 30 min (prodotto finito e sterilizzato) .
Tutti i campioni sono stati risospesi in PBS sterile nei seguenti volumi, che sono stati calcolati in modo da avere un titolo omogeneo per volume comparato all ‘omogenato 16.7% p/v come il materiale di partenza:
Nella Figura 1 è riportato un esempio della composizione della miscela di gangliosidi purificata secondo il procedimento riportato.
FIGURA 1
Esempio di cromatografia su gel di silice dei seguent i campioni :
Nella Tabella 1 e ripo tato un esempio risu tati ottenuti medi ante saggio
ESEMPIO 2
Preparazione di un omogenato chiarificato di cervello infetto
Quattro cervelli di criceti infettati con il ceppo 263 K dello scrapie, corrispondenti a un peso netto di 3.9 g, sono stato omogeneizzati in 10 ml di acqua distillata. Il volume è stato quindi portato a 15.5 mi in modo da ottenere un omogenato 25% p/v. La sospensione è stata centrifugata per 40 minuti a 1800 x g a 4°C: sono stati recuperati 7.5 mi di supernatante, che è stato aliquotato e conservato a -70°C fino al momento dell’uso.
Preparazione dei campioni
A 10 g di polvere acetonica di cervello bovino sono stati aggiunti 5 mi dell'omogenato infetto, 120 mi di metanolo/cloruro di metilene e 0.71 mi di idrossido di sodio 5.7 N. L'aggiunta è stata fatta con queste modalità per mantenere costante il volume totale della fase acquosa nel solvente e ottenere condizioni operative il più vicino possibile a quelle reali di processo. Il titolo finale della soluzione di partenza era 1% p/v. La sospensione è stata posta sotto agitazione magnetica per 3 ore alla temperatura di 33°C. Quindi è stata lasciata raffreddare ed è stata centrifugata per 20 minuti a 6000 x g a 10°C. La fase liquida è stata filtrata attraverso un imbuto Gooch (porosità n 3) alla temperatura di 4°C per evitare l'evaporazione dei solventi; alla fine di questo passaggio sono stati recuperati 78 mi di fase liquida. Un'aliquota di 2 mi è stata conservata per i saggi biologici. Entrambe le aliquote sono state addizionate di un appropriato volume di calcio cloruro e acetone, e dopo agitazione magnetica a temperatura ambiente per circa 30 minuti, i campioni sono stati centrifugati per 10 minuti a 6000 x g a 10°C. Il precipitato (Grezzo 1) è stato essiccato sotto cappa "overnight" e successivamente per 2 ore in alto vuoto. Un'aliquota è stata conservata a -70° per il saggio biologico.
I 925 mg di Grezzo 1 recuperati dal recipiente di reazione sono stati risospesi in 18.5 mi di una miscela cloroformio/ metanolo/acqua e 0.74 mi dell'omogenato per ripristinare il titolo a 1% p/v. II pH è stato regolato intorno a un valore di 12 (valutato con la cartina tornasole) aggiungendo NaOH 5N, e la miscela è stata posta sotto agitazione magnetica a 40°C per 6 ore. Alla fine, dopo aver lasciato raffreddare a temperatura ambiente, la soluzione è stata neutralizzata con HC16N e ne è stata prelevata un'aliquota di 250 ul per il saggio biologico.
Entrambe le aliquote sono state trattate con l'opportuno volume di n-butanolo/cloroformio/acqua e dopo agitazione per 15 minuti si è lasciato riposare per 4 ore. Al termine, le fasi organiche inferiori sono state scartate; le rimanenti fasi acquose sono state addizionate di sodio cloruro e acetone e, dopo agitazione magnetica a temperatura ambiente per circa 30 minuti, sono state centrifugate per 10 minuti a 6000 x g e 15° C (Grezzo 2). Questo prodotto è stato essiccato in alto vuoto e l'aliquota per il saggio biologico è stata conservata a -70°C. Il materiale rimanente è stato risospeso in 6.5 mi di metanolo assoluto e lasciato per 2 ore a 50°C agitando di tanto in tanto. La sospensione è stata rapidamente centrifugata a 6000xg e il supernatante è stato posto in congelatore a -20°C per 2 ore. La soluzione fredda color bianco opalescente è stata quindi centrifugata a 0°C a 6000 x g per 5 minuti e il precipitato è stato essiccato in alto vuoto. La resa a questo punto è stata di 6 mg di prodotto; questo è stato poi risospeso in 500 μl di idrossido di sodio, 460 ul di acqua distillata e 40 μl di omogenato e lasciato in contatto con questa soluzione per 1 ora a temperatura ambiente. Al termine il pH della sospensione è stato portato a un valore attorno a 9 (valutato con la cartina) e si è dializzato per 4 ore contro 20000 volumi di acqua distillata. Il volume finale dopo la dialisi era di 980 pi. Esso è stato diviso in due aliquote di 500 μl e 480 μl rispettivamente; la prima è stata addizionata del richiesto volume di sodio cloruro e acetone ed è stata centrifugata per 10 minuti a 6000 x g a 5°C. Questo campione è stato essiccato sotto alto vuoto (Prodotto finito).
La seconda aliquota è stata addizionata di 20 μl di omogenato e 50 pi di PBS lOx ed è stata sterilizzata a 121°C per 30 minuti (Prodotto finito e sterilizzato)
Tutti i campioni sono stati ripresi in PBS sterile nei seguenti volumi, che sono stati calcolati in modo da avere un titolo omogeneo per volume comparato all'omogenato 16.7% p/v come il materiale di partenza :
Nella Tabella 2 è riportato un esempio dei risul tati ottenuti mediante saggio di attività biologi ca
ESEMPIO 3
Attività biologica della miscela gangliosidici Sono stati effettuati una serie di esperimenti ir vitro al fine di verificare se la miscela gangliosidica (ottenuta secondo il procedimento sopradescritto) è' dotata di attività biologica predittiva di una applicazione terapeutica nel trattamento di patologie a livello del sistema nervoso periferico (SNP) e del sistema nervoso centrale (SNC). In particolare, l'attività dei gangliosidi è stata testata in vitro per la valutazione della formazione neuritica in colture cellulari di neuroblastoma (N2A).
Tali cellule, come descritto in letteratura (Denis - Donini et al. Neuronal Development, part II, 323:348 - Academic Press, NY 1980; Leon et al. Dev. Neurosci 5:108, 1982) potrebbero indurre, in particolari condizioni, l'espressione di varie funzioni caratteristiche dei neuroni maturi, così permettendo analisi qualitative e quantitative di parametri biochimici correlati con le singole fasi dello sviluppo.
Pertanto le valutazioni effettuate su tale modello (% di cellule in cui si ha formazione di neuriti, lunghezza neuritica e relativa arborizzazione) sono validi strumenti di indagine sull'attività di un farmaco la cui applicazione terapeutica è proposta nel recupero funzionale del sistema nervoso.
MATERIALI E METODI
Colture cellulari
Sono state usate cellule C 1300 di topo, clone N2A, fornite da America Celi Type Culture Collection (Bethesda, Md).
Le cellule sono state piastrate alla concentrazione di 10.000 cellule per pozzetto (24-castor) in presenza di Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) contenente P/G (100 U.penicillina/ml) e siero bovino fetale (FCS da Seromed, lotto 4-C04) al 10%.
Il giorno seguente il mezzo di coltura è stato cambiato con lo stesso volume di mezzo di coltura fresco, contenente i gangliosidi (vedi sotto).
Le colture sono state mantenute a 37°C in CO2 al 5% in ambiente umidificato (Incubatore Haerus).
Le colture sono state fissate al tempo prestabilito (dopo 24 ore) con glutaraldeide al 2%.
Preparazione delle soluzioni del prodotto da testare
La miscela gangliosidica (3 diversi lotti siglati n° 1-2-3) è stata sciolta in cloroformio/metanolc 2:1, portata a secco in azoto, risospeso in DMEM P/G FCS 10% fino alle concentrazioni desiderate. Concentrazioni esaminate: 1 x 10<-4 >M; 5 x 10<-5>M e 1 x 10<-5>M
Sono stati effettuati 4 diversi esperimenti di cui:
3 esperimenti per valutare l’effetto della miscela gangliosidica (lotti siglati n° 1 e 2) alla concentrazione 1 x 10<-4>M
1 esperimento per valutare l’effetto dose-risposta di. diverse concentrazioni (1 x 10<-4>, 5 x 10<-5 >1 x 10<-5>M) della miscela gangliosidica in esame (lotto siglato n°3)
Procedimento
Il terreno è stato aspirato dai pozzetti e sostituito con 350 ul di DMEM P/G 10% FCS ± prodotto in esame (alle concentrazioni sopra riportate). Le colture di controllo sono state trattate in modo analogo, omettendo l'aggiunta della miscela gangliosidica .
Le colture sono state quindi tenute in incubatore per 24 hr, quindi le cellule sono state fissate con 2% glutaraldeide ed osservate al microscopie ottico .
Parametri esaminati
L'osservazione morfologica è stata finalizzata a valutare :
percentuale (%) di cellule con neuriti lunghezza neuritica e relativa erborizzazione.
Risultati
Come riportato nella Tab. 3, è evidente che i prodotti esaminati sono efficaci (1 x 10<-4>M) nell'-indurre la formazione di neuriti in cellule N2A. L'effetto della miscela gangliosidica è dose-dipen dente con efficacia massima alla dose 1 x 10<-4 >M (Tab. 4)
Tabella 3
Effetto della miscela gangliosidica (lotto 1, 2) sulla formazione neuritica in cellule di neuroblastoma di topo N2A.
Tutti i prodotti sono stati aggiunti alle cellule ad una concentrazione finale di 1 x 10-4M, le valutazioni morfologiche sono state effettuate dopo 24 ore.
Tabella 4
Effetto di differenti concentrazioni della miscela gangliosidica (lotto 3) sulla formazione neuritica in cellule di neuroblastoma di topo N2A: risposta dose-effetto.
La valutazione statistica dei dati ottenuti indica che per quanto concerne l'attività biologica in vitro, non esiste alcuna differenza significativa fra i diversi lotti di miscela gangliosidica (Fig. 2).
Figura 2
Valutazione statistica globale di dati ottenuti con i lotti 1 e 2. I valori riportati sono le medie di 9 prove indipendenti ± D.S.
Inoltre dall'osservazione morfologica dei neuriti risulta che le cellule trattate con la miscela gangliosidica presentano neuriti lunghi e notevolmente ramificati (ossia notevole arborizzazione).
Conclusioni
Le osservazioni soprariportate consentono pertanto di affermare che la miscela gangliosidica esaminata possiede una attività biologica; infatti il prodotto ottenuto, mediante un procedimento che garantisce peculiari caratteristiche del prodotto stesso, è in grado di indurre la formazione neuritica in cellule N2A. Tale dato è pertanto predittivo di una efficacia del prodotto in fenomeni riparativi del sistema nervoso periferico e del sistema nervoso centrale.
La miscela di gangliosidi, ottenuta come descritto ed indenne da contaminanti associati a virus non convenzionali potenzialmente pericolosi, può essere impiegata anche per la preparazione di singoli componenti della miscela di gangliosidi, come il monosialoganglioside GM1.
In virtù delle proprietà farmacologiche sopra descritte, la miscela gangliosidica oggetto dell'invenzione può venire in generale utilizzata come farmaco in numerose patologie (aventi cause etiopatogenetiche diverse) sia del sistema nervoso centrale che del sistema nervoso,periferico. Si possono citare le seguenti specifiche: neuriti ottiche retrobulbari , paralisi dei nervi oculomotori, nevralgie del trigemino, paralisi del nervo facciale e di Bell, sindrome di Garcin, radicoliti, lesioni traumatiche dei nervi periferici, polinevriti diabetiche ed alcoliche, paralisi ostetriche, sciatica paralitica, malattia dei motoneuroni, sclerosi laterale amiotrofica, atrofia muscolare mielopatica, paralisi bulbare progressiva, miastenia grave e sindrome di Lambert Eaton, distrofia muscolare, alterazioni della trasmissione nervosa sinaptica a livello del SNC e del SNP, disturbi della coscienza come stato confusionale, commozione cerebrale, trombosi, embolie cerebrali, traumi cranici e spinali.
La somministrazione avviene di regola per via iniettiva, intramuscolare, subcutanea, endovenosa, transdermica, polmonare o orale di preferenza in mezzo acquoso opportunamente tamponato. La forma farmaceutica di conservazione può in tal caso essere quella di fiale contenenti la soluzione del prodotto, eventualmente assieme ad altri ingredienti ausiliari, come riportato negli esempi di preparazioni farmaceutiche sottoriportati. Per l'applicazione terapeutica o eventualmente anche profilattica per la suddetta via parenterale, il dosaggio varia di preferenza da 10 mg 100 mg/di di sostanza attiva.
A scopo puramente descrittivo e non limitativ riportiamo alcuni esempi di composizioni farmaceu tiche realizzate secondo la presente invenzione:
ESEMPIO 1
ESEMPIO 2
Una fiala è composta come segue:
ESEMPIO 3
Una fiala è composta come segue:
Claims (32)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la preparazione di una definita miscela di gangliosidi a partire da cervelli bovini, la quale non presenti nella sua composizione contaminanti biologici pericolosi per la salute dell'uomo, mantenendo contemporaneamente le attività biologiche e farmacologiche note per la miscela gangliosidica ir oggetto, procedimento caratterizzato dalle seguenti fasi: a) trattamento della fase solida proveniente da precedenti processi di estrazione con miscele di solventi organici ed acquosi in presenza di alcali; b) trattamento della fase solida proveniente da precedenti processi di estrazione con miscele di solventi organici ed acquosi in presenza di alcali a temperatura moderatamente elevata con esposizione del prodotto per un tempo prolungato; c) trattamento della fase solida proveniente da precedenti processi di estrazione con alcali in soluzione acquosa a temperatura ambiente per un tempo di esposizione prolungato ; d) trattamento mediante filtrazione della fase liquida proveniente da precedenti processi di estrazione su membrane ad opportuno dimensionamento dei pori di filtrazione.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, che comprende la fase di cui al punto a) ed è caratterizzato dal fatto che la miscela di solventi è costituita da metilene cloruro/metanolo/sodio idrossido e che il processo avviene per almeno 3 ore ad una temperatura compresa fra i 30°C e 35°C.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, che comprende la fase di cui al punto b) ed è caratterizzato dal fatto che la miscela di solventi, costituita da acqua/metanolo/cloroformio, rimane a contatto con l'intermedio biologico a pH alcalino (pH 12.0) per un tempo fra le 4 e le 8 ore ad una temperatura compresa fra i 35°C e i 43°C.
- 4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, che comprende la fase di cui al punto c) ed è caratterizzato dal fatto che l'esposizione all'intermedio biologico dissolto in soluzione acquosa avviene per almeno un'ora con sodio idrossido IN a temperatura ambiente.
- 5. Procedimento secondo la rivendicazione 1, che comprende la fase di cui al punto d) ed è caratterizzato dal fatto che il processo di filtrazione avviene impiegando una membrana che presenta dei pori di almeno 10 kd.
- 6. Procedimento secondo la rivendicazione 1, dove la miscela di gangliosidi non presenta attività infettiva associata a virus lenti.
- 7. Procedimento secondo la rivendicazione 1, dove l'attività infettiva da virus lenti è associata alla encefalopatia spongiforme bovina.
- 8. Procedimento secondo la rivendicazione 1, dove l'eliminazione di infettività associabile alla encefalopatia spongiforme bovina è stata valutata con studi in vivo.
- 9. Procedimento secondo la rivendicazione 1, dove l'eliminazione di infettività associabile alla encefalopatia spongiforme bovina è stata valutata anche mediante analisi di spiking di infettività .
- 10. Procedimento secondo la rivendicazione 1, dove l'analisi dèi 1'abbattimento degli spiking di infettività è stata eseguita in vivo.
- 11. Procedimento secondo la rivendicazione 1, dove la miscela di gangliosidi non presenta proteine o suoi frammenti riconducibili ai virus lenti quali la proteina PrP27 30 associata ad encefalopatia spongiforme bovina.
- 12. Procedimento secondo la rivendicazione 1, dove la miscela di gangliosidi non presenta proteine o suoi frammenti associabili alla proteina mielinica basica.
- 13. Procedimento secondo la rivendicazione 1, dove la miscela di gangliosidi non presenta frammenti di DNA associabili al DNA genomico bovino .
- 14. Procedimento secondo la rivendicazione 1, dove la miscela di gangliosidi non presenta altri contaminanti peptidici identificabili specificatamente con le tecniche immunochimiche.
- 15. Procedimento secondo la rivendicazione 1, dove tale procedimento è applicabile a livello di produzione industriale.
- 16. Procedimento secondo la rivendicazione 1, dove la miscela di gangliosidi ottenuta può essere impiegata per l'estrazione delle singole frazioni gangliosidiche, in particolare il monosialoganglioside GM1 .
- 17. Una miscela di gangliosidi secondo la rivendicazione 1# che mantiene le sue caratteristiche biologiche e farmacologiche a livello del sistema nervoso periferico. la.
- Una miscela di gangliosidi secondo la rivendicazione 1, che mantiene le sue caratteristiche biologiche e farmacologiche a livello del sisterna nervoso centrale.
- 19. Una miscela gangliosidica secondo la rivendi cazione 1, che presenta monosialogangliosid GM, (21%+15%) disialoganglioside GD1a (40%±15%) , disialoganglioside GD1b (16%±15%), trisialoganglioside GT1b (19%±15%), gangliosidi minori non identificati (2:5%) come GD3 e GQ1b/ glicolipidi minori (≤.0,2%) e la non determinabilità di asialogangliosidi .
- 20, Un prodotto secondo la rivendicazione 1, che presenta il 21% 15% di monosialoganglioside GM1.
- 21. Un prodotto secondo la rivendicazione 1, che presenta il 40% 15% di disialoganglioside GDla.
- 22. Un prodotto secondo la rivendicazione 1, che presenta il 16% 15% di disialoganglioside GDlb.
- 23. Un prodotto secondo la rivendicazione 1, che presenta i1 19% ± 15% di trisialoganglioside GTlb .
- 24. Un prodotto secondo la rivendicazione 1, che presenta il 2:5% di gangliosidi minori identificati come GD3 e GQlb.
- 25. Un prodotto secondo la rivendicazione 1, che presenta ≤ 0,2% di glicolipidi minori e la non determinabilità di asialogangliosidi .
- 26. Un prodotto secondo la rivendicazione 1, che è costituito dalla singola frazione gangliosidica monosialoganglioside GM1.
- 27. Un metodo terapeutico per il trattamento delle patologie del sistema nervoso periferico e del sistema nervoso centrale, in base alle rivendicazioni 17 e 18, consistente nella somministrazione di una quantità efficace di prodotto, secondo le rivendicazioni 19-26.
- 28. Una composizione farmaceutica, secondo la rivendicazione 27, costituita da un principio attivo, assieme ad un eccipiente farmaceuticamente accettabile per l'uomo.
- 29. Una composizione farmaceutica, secondo la rivendicazione 28, somministrabile per via parenterale .
- 30. Una composizione farmaceutica, secondo la rivendicazione 28, somministrabile per vis transdermica .
- 31. Una composizione farmaceutica, secondo la rivendicazione 28, somministrabile per via inalatoria.
- 32. Una composizione farmaceutica, secondo la rivendicazione 28, somministrabile per via orale.
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