PT95917B - Processo para a preparacao e purificacao de uma mistura de glicoesfingolopidos isentos de contaminacao por virus nao convencionais e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents
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Description
Descrição referente à patente de invenção de FIDIA S.p.A., italiana, in dustrial e comercial, com sede em Via Ponte delia Fabbrica 3/A, 35031 Abano Terme, Itália, (inventores:
Dr. Francesco Delia Valle, Silvana Lorenzi e Dr. Lanfranco Callegaro, residentes na Itália), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE UMA MISTURA DE GUCOESFINGOLÍPIDOS ISENTOS DE CONTAMINAÇÃO POR VÍRUS NÃO CONVENCIONAIS E DE COMPOSIÇÕES FARMACfiUTICAS QUE OS CONTÊM:
S Âmbito da Invenção
I
A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma mistura específica de gangliósidos, e o produto obtido por esse processo por meio de um processo que elimina selectivamente os contaminantes associados com vírus não convencionais, e que ameaçam a vida, sem alterar as características biológicas e farmacológicas da mistura em relação aos seus efeitos nos sistemas nervoso central e periférico .
Antecedentes da Invenção
Os gangliósidos, que são glicoesfingolípidos contendo ácido siálico, são os constituintes normais de todas as membranas das células nos mamíferos e são abundantes nos tecidos nervosos (Ando S.: Neurochem. Int. 5:507, 1983). Quatro gangliósidos, GMp GDra/ CDlb e GTlb (nomenclatura de acordo com Svennerholm L., J. Neurochem, 10:613, 1963), constituem 80-90 % do teor total de gangliósidos no cérebro dos mamíferos. Os gangliósidos estão específicamente localizados na camada exterior da membrana do plasma, sugerindo que eles jogam um papel importante em muitas actividades biológicas, por exemplo como sensores e/ou receptores para várias moléculas, e na transferência de informação através das membranas das células (Fishman e col. : Science 194:906, 1976). Eles jogam assim um papel chave na regulação do desenvolvimento neurónico e tratamento nos sistema nervoso central e periférico .
Existe portanto muita documentação que prova que os gangliósidos são susceptíveis de influenciar favoravelmente a recuperação funcional após lesões no sistema nervoso periférico (PNS) e no sistema nervoso central (CNS). pelo envolvimento de mecanismos específicos de membranas e por interacção com factores neurotróficos tal como é revelado pelo estudo in vitro em culturas de neurónios (Doherty P. e col., J. Neurochem, 44:1259, 1985; Skaper S. e col., Molecular Neurobiology, 3:173, 1989).
Foi em particular referido que a administração de gangliósidos in vivo facilita a regeneração dos nervos e a regeneração dos nervos e a recuperação funcional na PNS em condições patológicas: foram descritos efeitos positivos em modelos de neuropatias traumáticas.
(Ceccarelli B. e col., Adv. Exp. Med. Biol. 71:275,
Plenum Press, Nova Iorque, 1976; Gorio A. e col., Brain Res. 7:236, 1980; Gario A. e col., Neuroscience 8:417, 1983) neuropatias metabólicas (Norido F. e col., Exp. Neurol. 83:221 1984) e neuropatias tóxicas (Di Gregorio F. e col., Câncer Chemomother., Pharmacol. 26:31, 1990).
Em relação ao CNS, foram muito referidos efeitos positivos de recuperação induzida pelo monosialogangliósido GMi em modelos de isquémia (Cuello A,C. e col., Brain Res 376:373, 1986; Karpiak S.E. e col CRC Criticai Rev. in Neurobiology, Vol. 5, Issue 3, 1990), lesão traumática (Toffano G. e col., Brain Res. 296:233, 1984) e lesão neurotóxica (Johnsson J., Dev. Brain Res., 16:171, 1984) em vários sistemas de neurónio de diferentes espécies animais. Foi recentemente descoberj to que os gangliósidos podem inibir a translocação e a activação da proteína quinase C induzida por glutamato (Vaccarino F. e col., Proc. Nat. Acad. Sei, USA, 84:8707, 1987). Este acção é muito importante em condições de dano isquémico, em que foi referido o papel crucial que é jogado pelos aminoácidos de excitação, como por exemplo o glutamato, que provocam uma cascada de acontecimentos que levam à morte dos neurónios. Este mecanis mo podia favorecer a sobrevivência de neurões na área em torno da lesão, evitar a degereração retrógada, e acelerar a resposta de crescimento reparativo de factores tróficos locais.
Os resultados da investigação experimental foram amplamente confirmados com os obtidos de utilização clínica de gangliósidos. Durante mais de dez anos têm sido utilizados os gangliósidos como agentes terapêuticos em quase todas as formas de neuropatia periférica, desde as formas que resultam de dano mecânico até aos causados por factores ou por deficiências tóxicos, desde doenças infecciosas e inflamatórias até problemas do metabolismo. Estes medicamentos têm provado sem igualmente eficazes em mono e polineuropatias, em deficiências sensórias motores e em patologias que efectam o sistema nervoso autónomo, como por exemplo em muitas neuropatias que efectam os nervos cranianos por exemplo a paralisia de Bell, neuralgia trigeminal, e neurologia provocada pelo herpes zóster Os gangliósidos, e particularmente o monosialogangliósido, pode ser muito utilizado em todas as patologias ligadas com as lesões agudas no CNS do tipo vascular ou traumático e nos problemas destas patologias (isquémia cerebral, traumamisto craniano • I • e espinal).
A sua actividade comprovada no tratamento do CNS também suporta a sua utilização em patologias neurodegenerativas crónicas, como por exemplo a doença de Parkinson e a doença de Alzheimzer.0 facto de eles serem endocóides me dicamentos do tipo endógeno) por natureza, sendo componentes naturais das membranas dos neurónios, explica a sua excelente tolerabilidade e a ausência, mesmo em tratamentos prolongados com doses elevadas, de efeitos laterais que são frequentes nalgumas terapias convencionais para as neuropatias periféricas.
Em geral, as misturas adequadas de gangliósidos, por exemplo uma formulação do tipo seguinte: GMq de 18% a 24 %, GDla de 36 % a 44 %, GDib de 12% a 18%, GTlb de 16% a 22%, ou as fracções simples de gangliósidos, particularmente o monosialogangliÓsido GMq, apresentam actividades biológicas como as acima descritas. Estes gangliósidos, como misturas adequa das ou emfracções simples, em particular o monosialogangliÓsido GMq , são extraídos de cérebros de mamíferos e é assim neces sário, dado a sua função biológoca particular e a sua aplicação terapêutica acima descrita em relação dos sistemas nervoso periférico e central, utilizar processos de purificação que garantam um produto final que seja absolutamente puro e isento de contaminantes biológicos e químicos.
Sabe-se que há muito tempo que é possível extrair,numa base de investimento, misturas de gangliósidos, (Tettamanti et al., Biochim. e Biophys, Acta, 296:160, 1973; Trams et al., Biochim. e Biophys. Acta, 60:350, 1962: Bogoch et al., British J. Pharm., 18:625, 1962; Wiegandt et al., Angev Chem. 80:89, 1968; U.S. Patente No. 3,436,413; and C.A. 61, 9851C, 9895d) mas nenhum dos processo acima mencionados foi desenvolvido com o objectivo de demonstrar a eliminação e a destruição dos componentes associados com vírus não convencionais. Uma razão para este facto, é de que, na altura, essas doenças que afectavam os mamíferos cujos cérebros eram utilizados para extracção, eram ainda desconhecidos. Outra razão reside no facto de não existirem reagentes para a identificação específica '‘Tííτί— ** «*«βαΚϊΛ3»ίί£ΐώ·»ίΐ!1ί*31,<
de componentes potencialmente perigosos, enquanto que hoje em dia esses reagentes já existem em metodologias específicas desenvolvidas com base em conhecimentos recentemente adquiridos relacionados com a evolução científica de técnicas de biologia molecular.
Por vezes podem aparecer situações de tipo patológico em que o agente ou agentes patogénicos não podem ser identificados. Uma destas situações patológicas é a designada por encefalopatia espongiforme de bovino (BSE), que foi referida pela primeira vez em Inglaterra em 1986 (Wells G. e col., Vet. Record, 419, 1986). Este nome deriva da aparência esponjosa do tecido do cérebro dos animais afectados. Quando são anali sadas secções do tecido por microscopia, as lesões principais são constituídas por vacúolos extensos de neurónios.
Toda a evidência disponível aponta para o facto de BSE pertencer a um grupo de encefalopatias degenerativas do sistema nervoso central que são invariavelmente fatais e que são causadas por um grupo de agentes não convencionais e infecciosos (Fraser e col., Vet. Record 123-472, 1988; Hope e col., Nature 336:390, 1988). Este grupo inclui também resíduos de ovelhas e cabras, a doença emaciante crónica que atinge veados de cativeiro, encefalopatia infecciosa de matas em quintas de macacos, e duas doenças no homem; Kuru e doença de Creutzfeldt-Jacob. As lesões histopatológicas causadas no cérebro por estas doenças são semelhantes em todos os casos e são comparáveis causadas por BSE. Foram avançadas muitas teorias sobre a natureza desses agentes etiológicos, que não são nem bactérias em vírus, são diferentes de outros organismos conhecidos e são assim designados como vírus não convencionais. Tendo em conta os seus longos períodos áe incubação, partindo do momento da in fecção até ao aparecimento destes sintomas, estes vírus são tam bém designados como virus lentos.
Desde o aparecimento de alguns casos obser vados em a986, a doença dessiminou-se e atingiu proporções epidémicas na Gra-Bretanha, afectando cerca de 14 000 cabeças de
gado e aumentando rapidamente para 250-300 casos por semana. 0 gado infectado não apresentava sinais de doença durante vários anos (sendo o período de incubação de 4-5 anos), mas logo que apareciam os sintomas os animais rapidamente adoeciam e morriam
Um estudo epidemiológico feito pelo Central Veterinary Laboratory do Ministério Britânico de Agricultura (Uilesmith e col., Vet. Record. 123:638, 1988) revelou que fonte da infecção era a alimentação animal feita a partir de carcaças processadas de outros ruminantes, vendidos sob a forma de carne ou ossos em pó. Dado que a encefalopatia pode ser transmitida por um grande número de espécies animais, parece razoável admitir que a BSE é o resultado de uma infecção pelo agente etiológico responsável pelo scrapie transmitido das ovelhas por meio destes alimentos contaminados (Morgan KL, Vet. Record 122:445, 1988).
Com base nos resultados deste estudo, o Governo Britânico proibiu, por lei de 18 de Julho de 1988, e venda e fornecimento de produtos animais alimentares contendo proteínas animais derivados de ruminantes.
A opinião geral é de que muitos factores contribuíram em conjunto para o aparecimento repentino de BSE na Grã-Bretanha (Cherfas J., Sciense, Feb. 1990, 523).
Em primeiro lugar, o número de ovelhas na Gre-Bertanha aumentou rapidamente na parte final dos anos 70 e no princípio de década de 80, e com ele e incidência da Scrapie que é uma doença endémica das ovelhas na E ropa durante há mais de 250 anos (Pattison e col, Vet. Record 90:465, 1972). Ao mesmo tempo, com o aparecimento da crise do petróleo, as fábricas que produziam alimentos para animais alteraram os seus processos de produção de carcaças para um sistema de baixas temperatu ras que era provavelmente menos eficaz na destruição de age tes de Scrapie altamente resistentes. Com a excepcção de um todos os produtores destes produtos alimentares abandonaram a utili6 zação de solventes como o benzeno, hexano, e tricloroetileno, para remover as gorduras em excesso do farelo da soja e dos ossos. Talvez o factor mais significativo de todos tenha sido o facto de a fase final do aquecimento dos produtos para remover os solventes ter sido assim abandonada: de facto esta fase necessitava de temperaturas muito elevadas.
Além disso, a política do governo encorajou os agricultores a produzirem mais leite, e a desmamar os vitelos meis cedo alimentando-o com dietas ricas em proteínas. Estas eram muitas vezes de fraca qualidade, dado que o farelo feito de carne e de ossos era mais barato do que os produtos feitos de soja e de peixe e são fontes mais seguras de proteínas. Os estudos para saber como se transmite a doença são fundamentais para a investigação de BSE. 0 aspecto mais importante destas experiências é de que, por identificação dos limites das barreiras inter-espécies para a transmissão do agente patogénico, é possível avaliar o risco de infecção por BSE em qualquer das espécies. Fraser e col. (Vet. Record, 123:472, 1988) demons traram que a doença podia ser transmitida de gado para ratos. Eles inocularam extractos de cérebros de gado que tinham morrido devidoa BSE em cérebros de ratos que posteriormente desenvolveram a doença. Mais tarde, Barlow e col. (Vet. Record, 3 Fev. 1990) transmitiu a doença a ratos alimentando-os com cérebros infectados. Isto constituiu a primeira prova de que a BSE podia ser contraída ingerindo material infectado. Nenhum outro tecido de animais infectados (baço, espinal medula, tecidos linfáticos, leite, etc.) era susceptível de produzir a doença em ratos.
Existe a prova de que a Scrapie pode ser transmitida a cordeiros pelas suas mães, mas até agora não apareceu nenhuma evidência de transmissão hprizontal ou vertical do agente etiológico de BSE em gado.
Os agentes que provocam as encefalopatias infecciosas sub-agudas são extremamente resistentes a processos
convencionais de descontaminação. Os dados disponíveis neste aspecto são na sua maior parte originários de estudos da desactivação de agentes da Scrapie e da doença de Creutzfeldt-Jacob. 0 agente etiológico da Scrapie é muito resistente a alterações de temperatura. Quando exposto a temperatura até 80eC o seu perigo de infecção é apenas ligeiramente reduzido; temperaturas superiores reduzem notavelmente a possibilidade de infecção (Hunter e col., J. Gen. Microbiol. 37:251, 1964).
Uma pequena quantidade de vírus infecciosos persiste por vezes quando as suspensões de material infectado são aquecidas a 100aC durante 1 hora ou a 118aC durante 10 minutos.
Recentemente, foi sentida uma necessidade de renovar os padrões de esterilização destes agentes infecciosos sob pressão de vapor elevada em autoclave. Os padrões actuais que governam a autoclavagem nos Estados Unidos para a descontaminaçao da doença de Creutzfeldt-Jacob envolvem o tratamento a 132a C durante 1 hora (Rosenberg e col., Annals of Neurology 19:75. 1986). E é baseado nos estudos efectuados em homogeneizados de cérebro contendo a Scrapie ou os agentes de Dreutzfeldt-Jacob (Brown e col., J. of Infectious Diseases 153: :1145, 1986). Na Grã-Bretanha os padrões correntes de autoclavagem para a descontaminação da doença de Creutzfeldt-Jacob envolvem o tratamento numa autoclave a 134-138aC durante 18 minutos, com base em algun estudos incluindo o estudo de Kimberlin (Kimberlin e col., Journal of Neurological Sciences 59:355,1983). Infelizmente, os agentes da encefalopatia espongiforme de bovinos são muito resistentes, mesmo aos tratamentos químicos vulgares, bem como nos tratamentos físicos. Têm sido utilizados solventes tais como, por exemplo benzeno, hexano, gasolina e tricloroetileno como solventes de extracção, mas sabe-se pouco dos seus efeitos na infecciosidade. Apenas uma pequena quantidade de dados está disponível sobre a desactivaçao química de agentes infecciosos, principalmente por que os estudos necessitam de um grande número de animais e longos tempos de observação. As concentrações de 0,3% - 2,5% de hipoclorito de sódio reduzem muito a infecciosidade nos ensaios biologicos uti8
lizados, mas muitas vezes não a eliminavam completamente (Walker e col., Am. J. Publ. Health 73:661, 1983). Os dados que se referem ao tratamento com até 0,25 N de hidróxido de sódio são muitos variáveis; para concentrações acima de 1 N parece contudo ser o agente químico mais eficaz de todos os que foram estudados. O tratamento com ureia 6M-8M também foi referido como sendo muito variável.
Os resultados dos estudos de descontaminação mostram assim, que embora a maior parte da infecciosidade seja rapidamente destruída por muito dos diferentes processos físicos e químicos a existência de pequenas subpopulações de agentes resistentes a infecções torna a esterilização de materiais contaminados muito difícil de conseguir na prática.
Logo que se tenha identificado o BSE como a doença de o tipo Scrapie, começam a ser perguntadas questões importantes sob os níveis epidemiológicos e analíticos, i! sendo em particular o último dirigido para a identificação do agente que está associado com a infecção. Contudo, todos os esforços até agora feitos para identificar os ácidos nucleicos ; associados com o agente etiológico têm sido infrutíferas. 0 úni· ; co componente isolado, que está inequivocamente associado com J a acção de infecção, é uma sialoglicoproteína designada por pro·
I í| teína de prion Scrapie (PrpSc).
I i ' Os estudos geneticos conduzidos nasta pro!i teína proporcionaram posteriormente alguma informação surpreen( dente. Algumas sondas de ADN sintetizadas de acordo com a se; quênciaN-terminal da proteína tornara possível mostrar a presen j ça de umgene de cromossomas em cópia individual que apresenta j| o mesmo padrão de restrição quer nos cérebros de animais saui dáveis quer nos cérebros de animais infectados. Este gene, que ! é conservado mesmo em espécies diferentes codifica uma proteína designada por proteína prion celular (Prpc) com um peso moleI cularaparente de 33-35,0 quilodaltons (Kd), que mostra diferenças particularmente evidentes em relação ao PrpSc:
1) 0 PrPc é susceptivel à protease. enquan ! to que o PrPSc é resistente. Em particular, enquanto o PrPc se ί degrada completamente pela enzima proteínase K, o PrP^c θ hil drolisado a um nível no terminal N para um fragmento de cerca j de 5Kd e dá a uma proteína designada por PrP27_30· Esta forma efectua a co-purificação com a infecção e é o componente mais j abundante que é obtido nas preparações de material de infecção.
h 2) Quer o PrPc quer o PrPSc são proteínas : de membranas, mas enquanto o primeiro é solubilizado pelo tra' tamento com detergentes, o segundo tende a polimerizar para esI truturas amiloides fibrosas. Foram encontradas estruturas semei lhantes fibrilos associados a Scrapie SAF) em cerebros infecta dos e são peculiares deste tipo de infecção. A resistência desta proteína infecciosa à desactivaçao é pouco comum; ela é sensível, por exemplo, a tratamentos com soluções alcalinas concen
I
H tradas ou a exposição a temperaturas acima de 120eC e as suas Ί combinações ou a combinação com agentes desnaturantes diferentes. Consequentemente, os únicos métodos de diagnóstico disponí
I veis para a identificação inequívoca destas encefalopatias esí
I pongiformes são a verificação da presença do SAF nos tecidos í cerebrais infectados, extracção e identificação imunoquímica da proteína PrP27_30 < que são metodologias aplicáveis apenas durante a anatomia patológica.
H í 0 SAF foi identificado em cérebros de bovinos infectados, e em seguida o homólogo do PrpSc foi isolado e revelou reactividade com um soro obtido contra SAF de rato. Além disso, a sequência N-terminal dos primeiros 12 amino ácidos apresentava uma homologia de 100% com o PrP^c de ovelha e uma diferença da do rato, hamster e do homem por uma simples j inserção de glicina. Logo que foi estabelecido que o BSE é uma I doença do tipoScrapie foram levantadas questões importantes no nível epidemiológico e analítico, sendo o último particularmente devotado à identificação da proteína associável com a infecção.
ι n
A colheita inesperada de BSE e todos os aspectos ainda para serem explicados para estas doenças neuroj lógicas provocaram uma consideração necessária para este proí blema, especialmente nas pessoas envolvidas na preparação de
I ! produtos que derivam de material de bovino.
ί· r
Podia de facto não ser suficiente utilizar, ii para se obterem compostos ou as suas misturas de interesse farj macêutico, matéria prima certificada para utilização alimentar.
Consequentemente, é necessário desenvolver o processo da produção dos produtos em questão utilizando metodologias de extrac! I IV , 1 ~ Z | 1 çao que garantem a elimmaçao da proteína associada com a mfec' ção e a própria infecção. É obvio que o processo de extracção da fracção que está infecciosamente activa deve, ao mesmo tempo, conservar a actividade biológica dos princípios activos desejai dos no produto final.
ί j
A outra proteína potencialmente perigosa ao nível destas preparações para o homem é a proteína mielínica básica (MBP).
J Ela é uma proteína que no homem e na maior parte dos vertebrados tem um peso molecular (PM) de cerca de [ 19,5 kd. Ela está presente em três formas moleculares na milelina humana e em seis nas do rato, codificando para um único ' gene localizado no cromossoma 18 e ela constitui cerca de 30% da proteína mielínica total. A sua localização topográfica exacta não está ainda correctamente definida.Ela foi observada no citoplasma dos oligodendrócitos apenas no momento da mielinização. Está presente uma proteína consierada idêntica no sistema nervoso periférico (proteína Pl), e a capacidade da Mielina periférica para induzir a encefalomielitica alérgica experimental l (EAE) em animais de laboratórios é devido a ela.
! Nem toda a molécula de NBP é encefalitogéí nica mas apenas uma parte que varia de espécie para espécie;
i ' no coelho a parte encefalitogénica é o fragmento de amino ácido
64-73. no rato de Lewis é de 71-85, na cobaia 113-121, no rato SJL/J 89-169. 0 EAE é uma doença típica autoimune dependendo da)s células; de facto, ela é transferível de um animal para outro por infusão de linfócitos T sensibilizado e não por infusão do soro. Neste caso, a doença é suportada por linfócitos transfundidos e não os do recipiente. Outra forma autoimune dependente de células é a neurite experimental alérgica (ΕΆΝ). Ela também pode ser induzida em todas as espécies de verterbrados superiores por inoculação de homogeneizado bruto da mielina periférica em adjuvante completo de Freund. É considerado que o antige ne principalmente responsável por esta autoimunização é a proteína P2, com um valor de PM de cerca de 12,0 kd, presente no sistema nervoso periférico.
Outro contaminante que deve ser considerado nestas preparações é o ADN genómico de bovino. A possibilidade de ser susceptível de produzir, por tecnologia de ADN recombi nante, de proteínas biologivamente activas, que podem ser utilizadas como agentes farmacêuticos, tornou necessário analizar os produtos finais para determinar a presença de resíduos de ADN, que pertençam às células em que é expressa a proteína pretendida. A presença de fragmentos de ADN nas preparações far macêuticas a utilizar no homem o problema do perigo de incorporação no genoma destes fragmentos com uma transferência incontrolada possível da informação de tipo genético. Mesmo que não seja ainda possível obter gangliósldos por tecnologia de ADN recombinante, é necessário aplicar este tipo de tecnologia de controle analítico para extração dos produtos que utilizam mate ria prima de origem animal.
Finalmente, os gangliósldos a utilizar em estudos in vitro e in vivo devem ser isentos de outros compostos como por exemplo a sialogangliósidos e glicorcerebrósidos. Estas substâncias, se estiverem presentes em concentrações elevadas, podem também ter implicações imunológicas importantes e podem também conduzir a considerações esperimentais erróneas.
estabelecimento repentino de BSE e todos os outros aspectos que ainda têm de ser clarificados mestas doenças neurológicas levaram a uma consideração necessária a este problema, especialmente pelas entidades envolvidas na preparação de produtos que derivam de material bovino.
Os processos anteriores para a preparação i j jl de gangliósidos, como os acima referidos, requerem que o produi to seja farmaceuticamente aceitável, livre dos contaminantes j niológicos que eram na altura conhecidos como potencialmente | prejudiciais para a saude. Mas óbviamente, e estabelecimento j posterior da patologia acima referida em gado adulto tornou-se | necessária para obter um princípio activo que, sem perder as jj propriedades terapêuticas acima mencionadas, é caracterizado ; I j pela ausência segura de agentes virais não convencionais, o que se consegue pela utilização de processo específicos para garantir a desactivação destes agentes virais não convencionais e a eliminação completa da infecciosidade, e a utilização de metodologias específicas para a identificação desses agentes. De facto, pode não ser suficiente utilizar uma matéria prima que tenha sido certificada como adequada para consumo, para se obí terem compostos ou misturas dos mesmos para fins farmacêuticos, ι 0 estabelecimento de BSE deve, obviamente, ser avaliado tendo em consideração a sua acção biológica in vivo que deve ser coní siderada como um exemplo de verificação das várias fases do processo, mas não como um resumo do mesmo. Esta análise de acção biológica in vivo é nacessária dado que os cientistas não estão i ainda de acordo com a associação da infecção com certas proteí-j nas como por exemplo PrP27_30· 0 processo de extraeção que elij mina as infecções deve, obviamente, ser ao mesmo tempo capaz de deixar intacta a actividade biológica do principio activo, dado que isto é essencial para a sua utilização terapêutica. (Grupo de trabalho Ad hoc em biotecnologia/farmácia: Validação
I da remoção do vírus e processo de desactivação. Comissão das I Comunidades Europeias Março 1990). A investigação cientifica produziu, por um lado, processos que garantem misturas adequa• das de gangliósidos ou as suas fracções simples que são obti13
das em forma isenta de radicais a partir de contamínantes de proteínas, químicos e biológicos, e por outro lado, a processos que demonstram eficácia na destruição da infecção associada com os vírus lentosz mas não se conhece qualquer processo em que seja possível obter, também à escala industrial, o resultado ’ também desconhecido de um produto na forma pretendida, puro e farmacologicamente activo, isento de infecticidade que possa j ser associada com agentes patogénicos que se podem definir coi mo vírus lentos.
í! Breve Descrição dos Desenhos
II
ί) il A Figura 1 é um diagrama esquemático do ii processo da invenção.
! z
I A Figura 2 e uma fotografia que mostra os j resultados obtidos pela utilização de anti-corpos anti-PrP27_3o ! pela técnica de Revelação de Western para analisar algumas ! amostras tomadas de passagens intermédias do processos da ini ι venção.
I A figura 3 é uma fotografia que mostra os ι
resultados da análise do ADN genómico de bovino em algumas amos tras tomadas de várias passagens do processo de invenção.
ι j A figura 4 é uma fotografia dos resultades obtidos pela utilização de anti-corpos anti-MBP na técnica da Revelação de Western para analisar alguma amostra tomadas de passagens intermédias do processo da invenção.
ι A figura 5 é uma fotografia dos resultados da análise por cromatografia em gel de sílica da mistura de gan gliósidos preparada de acordo com o processo da invenção.
ι
A Figura 6 é uma fotografia que mostra a actividade biológica da mistura de gangliósidos preparada de acordo com a invenção.
Ά figura 7 é uma fotografia que mostra os resultados da análise imunoquímica com anti-corpos anti-PrP27_30 de amostras tomadas de passagens intermédias do processo da invenção.
Descrição Detalhada da Invenção objectivo da presente invenção é proporcionar um produto caracterizado pela ausência de vírus lentos obtidos por um processo vantajoso que pode ser aplicado à produção industrial, e um processo, cuja novidade se encontra na sequência adequada das suas várias fases de extracção. Este processo que elimina durante as suas várias fases, os contaminantes infecciosos que estão associados com vírus lentos como por exemplo a encefalopatia espongiforme de bovino, permite a actividade de mistura, que representa a actividade terapêutica do próprio produto, que permanece inalterada. 0 produto que deriva deste processo é constituído por uma mistura definida de gangliósidos ou de fracções simples obtidas a partir do cérebro de bovino ou partes dele, o processo de acordo com a presente invenção é constituído, pelas razões acima mencionadas, pelas seguintes fases principais :
a) submeter-se o tecido do cerébro de bovino a uma eliminação de lípidos em acetona;
b) suspensão de um precipitado de acetona numa mistura de cloreto de metileno/metanol/hidróxido de sódio a uma tem peratura compreendida entre 30QC e 359 C pelo menos durante 3 horas para repartição hidrofílica e substâncias hidrofílicas.
c) solubilização do precipitado com água/clorofórmio/metanol e hidróxido de sódio (pH 12) por aquecimento a temperaturas compreendidas entre 38^ C e 43e C durante 4 a 8 horas ;
d) solubilização do precipitado com hidróxido de sódio 1 N á temperatura ambiente durante pelo menos 1 hora e
)»**·✓ «%* neutralizaçao e dialise da solução contendo a mistura de gangliósidos através de uma membrana com um PM de corte de 10 kd.
Em seguida, como ilustração e não limitação, são descritos exemplos de preparações feitas a partir de cérebros de bovinos infectados em que a forma de encefalopatia espongiforme foi encontrada ou a partir de matérias primas de proteínas obtidas de cérebros de bovinos não infectados ás quais foram adicionadas quantidades constantes de material infectado da estirpie 263 K de Scrapie.
Materiais e Processos
Os cérebros de bovino utilizados no processo de extracção da mistura de gangliósidos revelou, por análise histológica, fibrilos típicos de tecidos que pertencem a substâncias provenientes de animais com a infecção.
Exemplos de Preparação
Exemplo 1
É apresentado na Figura 1 um diagrama do processo de preparação.
Foram colocados 1.000 gramas de cérebro de bovino infectado, moídos e suspensos água destilada, em con tacto com 300 a 600 ml de acetona (proporção 1:5 peso/volume) durante cerca de 3 horas à temperatura ambiente com agitação.
A solução foi em seguida centrifugada a 6000 x g a uma tempera tura compreendida entre 7e C a 49 C até a precipitação estar completa. 0 solvente foi em seguida eliminado e foram adicionados 180-350 ml de uma mistura de cloreto de metileno/metanol /hidróxido de sódio ao pó húmido colocado num recipiente de vidro adequado e foi deixado de novo com agitação magnética durante pelo menos três horas a uma tamperatura compreendida entre 309 C e 359 C. Deixou-se finalmente arrefecer e em segui fi
da cen.trifugou-se durante 20 minutos a 6 000 x g a + 10e C. Filtrou-se a fase líquida através de um funil de filtração a uma temperatura de + 42 c. Adicionou-se ao líquido uma quantidade adequadade cloreto de cálcio e de acetona, deixou-se a agitar durante cerca de 30 minutos e em seguida centrifugou-se a 6 000 x g a + 10- C. 0 precipitado (matéria prima 1) foi finalmente deixado secar durante toda a noite e em seguida durante 5 horas em alto vazio. A matéria prima recuperada 1 foi re-suspendida am 10 a 18 ml de uma mistura de água/clorofórmio/metanol. Ajustou-se o valor do pH a um valor de cerca de 12 com NaOH 5N. Aqueceu-se o conjunto a uma temperatura com preendida entre cerca de 382 C e 43e C durante 4 a 8 horas e deixou-se em agitaçao. No final, após se ter deixado arrefecer foi neutralizado com HCq 6 N e adicionou-se a quantidade necessária de água/n-butanol/clorofórmio. Agitou-se durante 15 a 30 minutos e deixou-se em repouso durante entre 2 e 4 horas. Finalmente, foi desprezada a fase orgânica inferior, foram adi cionados acetona e cloreto de sódio às fases aquosas restantes foi agitado durante cerca de 30 minutos e centrifugou-se duran te 20 minutos a 6000 x g a + 152 C. (matéria prima 2).
produto foi seco em alto vazio, ressuspendido em 6 a 15 ml de metanol absoluto e em seguida mantido quente durante cerca de 2 horas enquanto se agitava algumas vezes a solução. A suspensão foi em seguida rapidamente centrifugada a 6000 x g e o sobrenadante foi colocado num congelador durante cerca de 2 horas. A solução branca translúcida foi em seguida centrifugada a 02 c a 600 x g e o precipitado foi seco em alto vazio. Meteu-se o produto numa solução 1 N de hidróxido de sódio e deixou-se em contacto com a solução durante pelo menos 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, levou-se o pH da suspensão a um valor aproximado de 9 e efectuou-se a diálise com uma membrana que possuía um PM de corte de 10 kd contra um volume adequado de água destilada. Foi adicionada uma quantidade adequada de cloreto de sódio e de acetona e centrifugou-se a + 59 c a 6000 x g, e em seguida secou-se em alto vazio (produto acabado). A Amostra foi retomada
em 10 mM de tampão de fosfato pH 7,2 e esterilizada a + 1212C durante 30 minutos (produto acabado esterilizado).
Avaliação do Processo :
Tal como se explicou acima, um aspecto importante da presente invenção é proporcionar um produto ganglósido que é isento de contaminantes indesejáveis, particular· mente isento de vírus não convencionais. Para avaliar o processo, foram ensaiadas amostras em várias fases do procedimento para a determinação da possível contaminação.
Os procedimentos e resultados obtidos nos ensaios biológicos/clínicos foram os seguintes:
Ensaio Biológico para a Scrapie”:
Os animais utilizados nestas experiências foram os hamster Golden Syrian (LVG/Lak). Os ensaios para a determinação da infecção foram efectuados em grupos de quatro animais desmamados, fêmeas, que tinham recebido inoculação intracerebral (i.c) com 0,05 ml de amostras diluídas des vezes em PBS estéril. As inoculações intracerebrais foram efectua! das por pessoal treinado utilizando seringas de vidro descartaveis com agulhas de mjecçao esterilizadas 26G, de 9,5 mm.
i i 0 produto final, esterilizada, concentrai j do 20 vezes, foi utilizado completamente, da forma seguinte:
4,0 ml injectados intracerebralmente em 40 animais.
]
I
I
3,0 ml diluídos 1:20 e injectados, não diluídos, intracerebralmente em 50 animais e i.p. em 22 animais. 0 volume injectado i.p. foi de 2,5 ml.
Os animais foram examinados duas vezes por ι
semana ou mais, durante um periodo de 12 mêses, para verificar o estabelecimento dos sintomas neurológicos, clínicos carac18
teristicos. 0 estabelecimento dos primeiros sintomas em cada animal foi registado, e os animais foram sacrificados quando a doença se tinha bem declarado. Os seus cérebros foram divididos em duas metades, uma delas foi fixada em formalina a 10% e a outra metade foi conservada a -70sC. Foi feita a diagnose patológica, em todos os animais que morreram da causas suspeitas e os que mostravam sinais de doenças neurológicas. No final do período de observação, todos os animais sobreviventes i foram sacrificados e a avaliação patológica foi feita a partir dos seus cérebros.
!
!
j Foi calculado o valor da infecção no poní to final de acordo com o método de Reed e Munch, e foi expres!j so comolog LDsq/hiI.
As amostras ensaiadas foram as seguintes, utilizando nomes para os produtos como é designado na Figura 1:
Todas as amostras foram ressuspendidas em PBS esterilizado nos seguintes volumes, calculados para assegurar um valor homogéneo por volume quando comparado com o ho-
| mogeneizado de 16,7 % p/v | como | material de partida: | ||
| cérebro em pó | ml | 2,0 | homogeneizado | de cérobro |
| Matéria prima 1 | ml | 5.4 | 16.7% w/v não Λ» e ' | diluido |
| nao diluído | ||||
| Matéria prima 2 | ml | 9.7 | não diluída | |
| Produto acabado | ml | 14.4 | não diluído | |
| Produto acabado | ||||
| esterilizado | ml | 7.0 | concentrado 20 | vezes |
Os resultados dos ensaios biológicos/clí nicos são apresentados na Tabela 1.
15/19 24 1/15 20 0/15 20 0/18 90 0/63
| 4S. 1 | JS. 1 | 4S. 1 | 4^ 1 | 4^ 1 |
| to | to | to | to | to |
| o | o | o | o | o |
| to | to | to | to | to |
| to | to | to | to | to |
| tn | (Jl | 4^ | co | to |
| A 1 | A 1 | A I | 4^ 1 | 4^ 1 |
| to | to | to | to | to |
| o | o | o | o | o |
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| 1-* | o | IO | co | -o |
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BIOLÓGICO E AVALIAÇÃO CLINICA (experiência de desactivação)
Todos os animais que tinham apresentado sinais clínicos de Scrapie e todos os animais que ainda sobre viviam no final do período de monitoração de um ano foram incluídos no estudo. Os animais que tinham sido colocados de parte devido a acidentes e/ou fraca saúde, e os que tinham morrido de causas não relacionadas com a Scrapie ou que tinham sido mortos para fornecimento de carne, e que não tinham apresentado quaisquer sinais clínicos da doença, não foram incluídos.
ί A coluna de amostra refere o número de i
] animais injectados no início da experiência e o número de gaioI la, que distingue as diferentes amostras e diluições. A coluna i doentes refere o número de animais que apresentavam sinais ! clínicos de doença/número de animais injectados menos o número j de animais que morreram de causas não relacionadas com Scrapie
Avaliações Adicionais;
A determinação da proteína de Scarpie í PrP é feita por anticorpos policlonais específicos para o análogo de proteína purificado do cérebro de murina e que reage cruzadamente como PrP de Scrapie de origem de bovinos. Foi utilizado o método de Revelação de Western para a determinação. A presença de PrP de Scrapie foi determinada por comparação
I com os padrões para proteínas com vários pesos moleculares.
A determinação da proteína MBP foi feita por anticorpos policionais específicos para o análogo de proteí na purificada a partir de tecido cerebral de bovino. 0 processo utilizado para a determinação é o de Revelação de Western.
A presença de MBP foi determinada por comparação com o padrão de proteínas com vários pesos moleculares.
A determinação do ADN genómico de bovino foi efectuada pela técnica de Revelação de Pontos em amostras tomadas em fases diferentes do processamento de acordo com o método conhecido dos especialistas. Para considerar a amostra
válida, não deve ser notada presença de manchas nas deposições do ADN heterólogo. A ausência de manchas nas amostras examinadas na autorradiografia mostra a ausência de ADN genómico de bovino.
A figura 2 mostra os resultados determina dos por análise imunoquímica com anticorpos anti-PrP27-30 de amostras provenientes de fases intermédias da preparação de gangliósidos e do processo de purificação. 0 número de código das amostras analisadas correspondem aos números entre parênte ses dados no diagrama de purificação da Figura 1.
Linha 1: amostra com o código 1
Linha 2: amostra com o código 2
Linha 3: amostra com o código 3
Linha 4: amostra com o código 4
Linha 5; amostra com o código 5
Linha 6: Produto acabado
Linha 7: Proteína com PM convencional (abaixo dos Ked encontram-se os seguintes: 97.4, 66.2, 45.0,
31.0, 21.5)
As bandas com asterico referem-se a reacções cruzadas não específicas que se podem atribuir ao sistema de amplificação do ensaio.
A figura 3 mostra a análise de ADN genómi co de bovino pela técnica da revelação de Pontos em amostras tomadas de várias passagens do processo.
A intersecção das letras com os números indicam;
Curvas Padrão
| 1A-7A | ADN de bovino (1 mg) |
| 1B-7B | ADN de bovino (1 ng) |
| 1C-7C | ADN de bovino (100 pg) |
| 1D-7D | ADN de bovino (10 pg) |
| 1E-7E | ADN de bovino | d pg) |
| 1F-7F | ADN de bovino | (0 pg) |
| Amostras | examinadas | |
| 2A-2F | Amostra com o | código 1 |
| 2B | Amostra com o | código 2 |
| 2C | Amostra com o | código 3 |
| 2D | Amostra com o | código 5 |
| 2E | Amostra com o | código 6 |
| 3A | Amostra bruta | 3 |
| 3B | Produto acabado | |
| 3C | Produto acabado, esterilizado |
í Os pontos de curva padrão e das amostras analisadas são dadas em duplicado.
A figura 4 refere resultados obtidos com a análise imunoquímica com anticorpos anti-MBP de amostras provenientes de algumas passagens intermédias do processo de preparação e de purificação. 0 código das amostras corresponde aos números indicados, no diagrama de purificação da Figura 1.
| Linha | 1: | Amostra | com o | código | 1 |
| Linha | 2: | Amostra | com o | código | 2 |
| Linha | 3: | Amostra | com o | código | 3 |
| Linha | 4: | Amostra | com o | código | 4 |
| Linha | 5: | Amostra | com o | código | 5 (matéria |
| Linha | 6: | Amostra | bruta | 2 | |
| Linha | 7: | Amostra | com ι | código | 6 |
| Linha | 8: | Amostra | bruta | com ο ι | código 3 |
| Linha | 9: | Produto | acabado | ||
| Linha | 10: | Produto | acabado esterilizado |
As várias formas de MBP reconhecido pelos anticorpos policlonais utilizados são apresentados entre parênteses .
A figura 5 mostra os resultados obtidos com a cromatografia em gel de sílica das seguintes amostras (também de acordo com o processo descrito na Figura 1):
Linha 1: produto acabado esterilizado ]
Linha 2: produto acabado
Linha 3: padrão de trisialogliósido GT^b
Linha 4: padrão de disialogangliósido GDib ; Linha 5: padrão de disialogangliósido GD^a ί
Linha 6: padrão de monosialogangliÓsido GMq
I j
; I
A figura 6 é um exemplo de fotografia para mostrar a actividade biológica da mistura de gangliósidos preparada de acordo com a invenção (as setas indicam a dispersão) num nervo periférico.
A figura 7 mostra os resultados obtidos com as análises imunoquímicas de anticorpos anti-PrP27-30 ã® amostras tomadas de algumas passagens intermédias de processos da preparação e purificação de gangliósidos. 0 código das amostras analisadas corresponde aos números indicados no diagrama de purificação da Figura 1.
Linha 1: Solução de matéria prima 1 a que foram adicionados 1,5 microgramas/ml de PrP27-30
Linha 2: amostra com o código de matéria prima 2
Linha 3: amostra com o código 6 i
Linha 4: amostra com o código de matéria prima 3
Linha 5: produto acabado
Linha 6: produto acabado esterilizado
Exemplo 2:
Preparação de um homogeneizado clarificado de cérebros infectados
Foram homogeneizados quatro cérebros de hamsters, infectados com a estirpe de Scrapie 263 K, correspondente a um peso líquido de 3,9 g. em 10 ml de água destilada. 0 volume foi em seguida levado para 15,5 ml de modo a se | obter um homogeneizado de 25% p/v. A suspensão foi centrífugai ! da durante 40 minutos a 1800 x g a 42 C: recuperaram-se 7,5 ml de sobrenadante, dividiram-se em alíquotas e mantiveram-se a 1 | -70s C ate utilização.
| Preparação das amostras ! Foram adicionados 5 ml do homogeneizado
I infectado, 120 ml de metanol/cloreto de metileno e 0,71 ml de
I ί uma solução 5,7N de hidróxido de sódio a 10 g de pó de céreI | bros de bovino em acetona. Esta adição foi efectuada de modo
I ' a manter constante o volume total da fase aquosa no solvente e para se obter as condições operativas mais adequadas. 0 título final da solução da partida era de 1% p/v. A suspensão foi magneticamente agitada durante 3 horas a uma temperatura de 332C. Ela foi em seguida arrefecida e centrifugada durante 20 minutos e 6000 x g a 102 c. A fase líquida foi filtrada através de um funil de Gooch (tamanho de poros No. 3) a uma temperatura de + 42C de modo a evitar a evaporação dos solventes? no final desta faseforam recuperados 78 ml de fase líquida. Foi retida uma alíquota de 2 ml para ensaios biológicos. A ambas as aliquo· tas foi adicionado um volume de cloreto de cálcio e acetona, e após ter sido magneticamente agitada durante cerca de 30 minutos à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas durante 10 minutos a 6000 x g a 102 C. 0 precipitado (matéria prima 1) foi seco com cobertura quente durante toda a noite e em seguida durante 2 horas em alto vazio. Uma das alíquotas foi l mantida -702C para o ensaio biológico.
A massa de 925 mg de matéria prima 1 recu perada a partir do recipiente de reacção foi ressuspendida em 18,5 ml de uma mistura de clorofórmio/metanol/água e 0,74 ml • de homogeneizado de forma a obter-se um título de 1% p/v. 0 va25
Ior do pH foi ajustado a um valor aproximado de 12 (estimado com o auxílio de papel de litmus) adicionando NaOH 5N, e a mistura foi magneticamente agitada a 402C durante 6 horas. Após arrefecimento para a temperatura ambiente, a solução foi neutra lizada com ΗΟχ 6N e foi retida uma alíquota de 250 jil para se efectuar um ensaio biológico.
Ambas as alíquotas foram tratadas com um volume adequado de uma mistura de n-butanol/clorofórmio/água e depois de se agitar durante 15 minutos elas foram deixadas em repouso durante 4 horas. Finalmente, foram desprezadas as fases orgânicas inferiores, às fases aquosas restantes foram adicionados cloreto de sódio e acetona e, após agitação magnética à temperatura ambiente durante cerca de §0 minutos, foram centrifugados durante 10 minutos a 6000 x g a 152c (matéria pri ma 2).
Este produto foi seco em alto vazio e a alíquota colocada de parte para um ensaio biológico foi mantida a -702c. 0 material restante foi ressuspendido em 6,5 ml de metanol absoluto e deixado a 509C durante cerca de 2 horas e agitado de tempos a tempos. A suspensão foi rapidamente centrifugada a 6000 x g e o sobrenadante foi colocado num congelador a -202c durante cerca de 2 horas. A solução fria, branca, trans lúcida foi então centrifugada a 02c a 6000 x g durante 5 minutos e o precipitado foi seco em alto vazio. 0 rendimento nesta altura foi de 6 mg do produto. Em seguida este produto foi ressuspendido em 500 JUl de hidróxido de sódio, 460 jil de água destilada e 40 ^il de homogeneizado e deixado em contacto com esta solução durante 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, o valor o pH da suspensão foi ajustado para aproximadamente o valor de 9 (estimado com o auxílio de papel de litmus) e dialisado com uma membrana que possui um PM de corte de 10 kd durante 4 horas contra 20000 volumes de água destilada. 0 volume final após diálise era de 980 ^ui. Este volume foi dividido em duas alíquotas com respectivamente 500 JLlI e 480 /al ? à primeira foi adicionado o volume pretendido de cloreto de sódio e de ace tona e foi centrifugado durante 10 minutos a 6000 x g a 5eC.
Esta amostra foi seca em alto vazio (produto final).
À segunda aliquota foram adicionados 20 _pl de homogeneizado e 50 jal de PBS 10 x e ela foi esterilizada a 121SC durante 30 minutos (produto esterilizado, final).
Avaliaçao do Processo:
Tal como descrito no Exemplo 1 foram tomadas amostras das várias fases do processo ensaiadas para a determinação da presença potencial minantes.
anterior, e foram dos contaAs amostras foram ensaiadas e os resultados obtidos foram os seguintes:
Todas as amostras foram combinadas em PBS estéril nos volumes seguintes, calculados de modo a assegurar um título homogéneo por volume quando comparada com o homogeneizado a 1% p/v como material de partida:
| Homogeneizado de | cérebro | Suspensão não diluída | ||
| 25% p/v diluído ; | a 1% | |||
| Matéria prima 1 | ml | 3.2 | não | diluída |
| Matéria prima 2 | ml | 1.0 | não | diluída |
| Produto acabado | ml | 0.5 | não | diluída |
| Produto acabado | ||||
| esterilizado | ml | 0.5 | não | diluída |
| A Tabela 2 | apresenta < | os resultados obti- |
dos no ensaio biológico.
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| o 1 | O I | O E | o | | o I | O 1 | o I | O 1 |
| 1 CD | 1 | 1 σι | 1 cn | 1 4^ | I ω | I N) | 1 |
| 45 | 45 | 45 | 45 | 45 | 45 |
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Todos os animais que tinham apresentado sinais clínicos de Scrapie e todos os animais que ainda sobreviviam no final do período de monitoração de um ano foram incluídos no estudo. Os animais que tinham sido colocados de
I parte devido a acidentes e/ou fraca saúde, e os que tinham I morrido de causas nao relacionadas com a Scrapie ou que tinham sido mortos para fornecimento de carne e que não tinham ! apresentado quaisquer sinais clínicos da doença, não foram incluídos.
A coluna de amostra refere o número de j animais injectados no início da experiência e o número de gai! ola, que distingue as diferentes amostras e diluições. A coluna doentes refere o número de animais que apresentavam sinais clínicos de doença/número de animais injectados menos o
I número de animais que morreram de causas não relacionadas com Scrapie.
Exemplo 3
Actividade biológica da mistura de gangliósidos
Foi efectuada uma série de experiências in vitro de modo a verificar se a mistura de gangliósidos (obtida de acordo com o processo acima mencionado) possuia qual, quer actividade biológica preditiva da aplicação terapêutica para o tratamento de patologias do sistema nervoso periférico (PNS) e do sistema nervoso central (CNS). Em particular, a actividade dos gangliósidos foi ensaiada in vitro para determinar a formação de neurites em culturas de células de neuroblastoma (N2A). Estas células, tal como se descreve na literatura (Denis - Donini e col., Neuronal Development, parte II, 323:348 - Academic Press, NY 1980; Leon e col., Dev. Neurosci.
5:108, 1982) podem induzir, em certas condições, a expressão de várias funções características de neurões maduros, permitindo assim uma análise qualitativa e quantitativa dos parâmetros bioquímicos correlacionados com cada estado de desenvolvimení
Assim, as determinações foram feitas neste modelo ( % de células com formação de neurites, comprimento de neurites e remificações relativas) que são instrumentos válidos quando se investiga a aplicação terapêutica possível de um medicamento na recuperação funcional do sistema nervoso.
Materiais e Processos
Culturas de células
Utilizaram-se células de rato C 1300, clone N2A, fornecidas por America Cell Type Collection (Bethesda) Maryland), e elas foram colocadas numa placa a uma concentração de 10 000 células por furo (24-castor) na presença de um meio de Engle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo P/G (100 C de penicilina/ml) e 10 % de Soro de vitela fetal (FCS de Seromed, lote 4-CO4).
No dia seguinte o meio de cultura foi alterado com o mesmo volume de meio fresco contendo gangliósidos (ver adiante). As culturas foram mantidas a 37ac em 5% de CO2 numa atmosfera humidificada (incubador de Haerus). As culturas foram então fixadas com % de glutaraldeído no tempo determinado (passadas 24 horas).
Preparação das soluções de ensaio do produto
A mistura de gangliósidos (três lotes diferentes, N2s, 1*2-3) foi dissolvido em clorofórmio/metanol 2:1, seco num fluxo de azoto, resuspendido em DMEM + P/G 10% FCS até se terem conseguido as concentrações prtendidas.
Concentrações examinadas lxlO”^, 5x10”^ e ΐχΐθ5^.
Foram efectuadas quatro experiências diferentes da forma seguinte:
-3 experiências para determinar o efeito da mistura de gangliósidos (lotes Nos. 1 e 2) a uma concentração lxlO-^M
- 1 experiência para determinar o efeito de dose-resposta para concentrações diferentes (1x10_4m, 5x10~5m θ 1x10~5M da mistura de gangliósidos em observação (lote No. 3)
Processo meio foi retirado dos furos e substituído com 350 yil de DMEM + P/G + 10% FCS +. produto em observação (nas concentrações acima referidas).
As culturas de controlo foram tratadas do mesmo modo, sem a adição da mistura de gangliósidos. As culturas foram em seguida mantidas num incubador durante cerca de 24 horas, após o que as células foram fixadas com solução a 2% de glutaraldeído e foram observadas num microscópio.
Parâmetros
Foram feitas observações morfológicas para determinar
- a percentagem (%) de células com neurites
- o comprimento das neurites e ramificação relativa.
Resultados obtidos
Tal como é referido na Tabela 3, é evidente que os produtos em observação são eficazes (1 x 10”^M) na indução da formação de neurites em células N£A.
Os efeitos da mistura de gangliósidos é dependente da dose com uma eficácia máxima na dose de 1x10”4M (Tabela 4).
TABELA 3
Efeito da mistura de gangliósidos (lotes 1,2) na formaçao de neurites nas células de neuroblastoma do rato N2A.
Todos os produtos foram adicionados às células a uma concentração final de 1 x 10“4M, e as avaliações formológicas foram feitas passadas 24 horas.
| Produto | % de células com | neurites | |
| is exp. 2ã | exp. | 3 ã exp. | |
| Controlo | 2+1 1 | + 1 | 2+2 |
| GA (1) | 29 + 6 27 | ± 6 | 24+5 |
| GA (2) | 25+4 25 | + 2 | 25+5 |
(No do lote entre parênteses
TABELA 4
Efeitos das concentrações diferentes de mistura de gangliósidos (lote 3) na formação de neurites nas células de neuroblastoma N£A de rato; resposta dose-efeito.
| Produto | Concentração | % de < | Délulas com neurites |
| Controlo | 3 | ± 2 | |
| GA (3) | 1 x IO4 | 35 | + 6 |
| GA (3) | 5 x IO5 | 17 | + 5 |
| GA (3) | 1 x 10-5 | 4 | + 2 |
(No do lote entre parênteses
A avaliação estatística dos dados de actividade biológica in vitro indica que não existe diferença signi ficativa entre os vários lotes da mistura de gangliósidos (Tabela 5).
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0)
-μ rl §
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C rH
S
Ό
TABELA 5
Amostra
Avaliação estatística global dos dados ι obtidos com os lotes 1 e 2. Os valores referidos são as médias
I
I i de 9 ensaios independentes +, D.P.
í
Além disso, a avaliação morfológica das neurites mostra que as células tratadas com a mistura de gangliósios apresenta neurites compridas, muito ramificadas (isto é, uma ramificação elevada).
I ί
i Conclusões !
S As observações acima referidas confirmam, portanto, que a mistura de gangliósidos em observação tinha uma actividade biológica; de facto, o produto obtido, por um ? processo que garante as suas características particulares, pode induzir a formação de neurites em células N2A. Este facto • indica que o produto é eficaz no tratamento de fenómeno dos • sistemas nervoso central e periférico. A mistura de gangliósi33
dos, obtida de forma descrita e isenta de contaminantes associados com vírus não convencionais potencialmente perigosos, pode também ser utilizada para a preparação dos componentes individuais ou da mistura de gangliosidos, como por exemplo monosialogangliósido GM]_.
Tendo em atenção as propriedades farmacológicas acima referidas, a mistura de gangliosidos pode ser geralmente utilizada como medicamento em várias patologias (com várias causas etiopatogénicas) nos sistemas nervosos central e periférico. As condições específicas que podem ser tratadas são: a neurite óptica retrobulbar, paralisia dos nervos oculomotores, neuralgia trigeminal, paralisia do nervo facial e paralisia de Bell, sindroma de Garcin, radiculite, lesões traumáticas dos nervos periféricos, polineurite diabética e alcoólica, paralisia obstrética, doenças paralíticas siáticas doenças dos neurões motores, esclorose lateral amiotrófica, atrofia muscular mielopática, paralisia bulbar progressiva, miastenia grave e síndroma de Lambert Eaton, distrofia muscular, dificuldade na transmissão dos nervos sinápticos nos sistemaCNS e PNS, deficiências conscientes como por exemplo confusão, choque, trombose, embolias cerebrais e traumatismo espi nal e cerebral.
A administração é geralmente feita por injecção, intramuscular, subcutânea ou intravenosa, ou por via transdérmica, pulmonar ou oral, preferivelmente em soluções aquosas adequadamente tamponadas. A armazenagem segura da composição farmacêutica pode ser assegurada preparando essa composição soba forma de frascos contendo soluções do produto, possivelmente em conjunto com outros ingredientes auxiliares, tal como os indicados nos exemplos de composições farmacêuticas a seguir referidas. Para a aplicação terapêutica, ou possivelmente também preventiva pela via parentérica acima meneio nada, a dosagem varia preferivelmente entre 10 mg e 100 mg/dia de substância activa.
Para fins meramente descritivos e não limitativos apresentam-se em seguida exemplos de composições farmacêuticas preparadas de acordo com a invenção.
Exemplo 1
Um frasco é constituído por:
Componente Activo
- Gangliósidos como sais de sódio 10.0 mg
- monosialotetrahexosilgangliósido (GM^)
X
- disialotetrahexosilgangliósido (GDia)
- disialotetrahexosilgangliósido (GD-^)
- trisialotetrahexosilgangliósido (GT^,)
Outros Componentes
- fosfato de sódio dibásico 12 H2O 6.0 mg
- fosfato de sódio monobásico 2 H2O 0.5 mg
- Cloreto de sódio 16.0 mg
- água para injecções até 2.0 ml
Exemplo 2
Um frasco é constituído por:
Componente Activo
- Gangliósidos como sais de sódio 20.0 mg
- monosialotetrahexosilgangliósido (GMj)
- disialotetrahexosilgangliósido (GDia)
- disialotetrahexosilgangliósido (GDib)
- trisialotetrahexosilgangliósido (GT^^)
Outros Componentes
| fosfato de sódio dibásico | 12 | h2o | 6.0 | mg |
| fosfato de sódio monobásico | 2 | h2o | 0.5 | mg |
| Cloreto de sódio | 16.0 | mg | ||
| Água para injecções até | 2.0 | ml |
Exemplo 3
Um frasco é constituído por:
Componente Activo
- Gangliósidos como sais de sódio 100.0 mg
- monosialotetrahexosilgangliósido (GMq)
- disialotetrahexosilgangliósido (Gf>la)
- disialotetrahexosilgangliósido (θΡίρ)
- trisialotetrahexosilgangliósido (GTifc)
Outros Componentes
| fosfato de | sódio dibásico | 12 H20 | 12.0 | mg |
| fosfato de | sódio monobásico | 2 H20 | 1.0 | mg |
| Cloreto de | sódio | 32.0 | mg | |
| água para | injecções até | 4.0 | ml |
1&· ,<y·
Tem sido que a mesma pode ser variada ções não devem ser encaradas descrito na invenção será óbvio de muitas formas. Estas variacomo um desvio do espírito e âmbito da invenção, e pretende-se que todas essas modificações óbvias para o especialista sejam incluídas dentro do âmbito das reivindicações anexas.
Claims (2)
- - 1- Processo para a preparaçao de uma mistura de gangliósidos, caracterizado por compreender a seguintes fases:a) submeter-se o tecido contendo gangliósidos a uma elimina cão de lípidos com acetona para se obter um precipitado de acetona,b) suspender-se o referido precipitado de acetona numa primeira mistura de solventes susceptível de separar substâncias hidrofóbicas de substâncias hidrofílicas,c) filtrar-se a referida mistura de separação para se obter uma primeira fase líquida,d) submeter-se a referida primeira fase líquida a precipita ção para se obter um primeiro material bruto,e) solubilizar-se o referido primeiro material bruto e submeter-se o primeiro material bruto solubilizado a aqueci mento a um valor de pH de cerca de 12,f) submeter-se o referido primeiro material bruto solubilizado e aquecido a uma segunda separaçao numa segunda mis tura de solventes susceptível de separar substâncias hidrofóbicas de substâncias hidrofílicas,g) separar-se a referida segunda mistura de separação para remover uma fase orgânica e reter uma fase aquosa,h) submeter-se a referida fase aquosa a precipitação para se obter um segundo material bruto,i) solubilizar-se o referido segundo material bruto que é submetido a arrefecimento para se obter um terceiro material bruto,j) solubilizar-se o referido terceiro material bruto numa base,k) neutralizar-se o referido terceiro material bruto solubilizado, el) submeter-se o referido terceiro material bruto solubilizado e neutralizado a diálise através de uma membrana com um peso molecular de corte de cerca de 10 kd para se obter uma mistura de gangliósidos.- 2- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida primeira mistura de solventes ser uma mistura de cloreto de metileno, metanol e hidróxido de sódio.- 3^ Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a referida primeira mistura de solventes contendo o referido precipitado de acetona ser aquecida a cerca de 30 a 35®c durante pelo menos 3 horas.- 4ã _Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, caracterizado por a referida precipitação do re• ferido primeiro material bruto ser efectuada por adição de cio• reto de cálcio e acetona.Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, caracterizado por o referido aquecimento do referido primeiro bruto ser efectuado a cerca de 38 a 43^0 durante cerca de 4 a 8 horas.- 6^ Processo de vindicações 1-5, caracterizado rial bruto ser solubilizado numa acordo com qualquer das reipor o referido primeiro matemistura de água# clorofórmio e metanol,e, após o referido aquecimento, se adicionar a referi da segunda mistura de solventes constituída por água, clorofórmio e n-butanol.Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 1- 6, caracterizado por a precipitação do referido segundo material bruto ser efectuada por adição de acetona e cloreto de sódio.- 8^ Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 1-7, caracterizado por a referida solubilização do referido segundo material bruto ser efectuada em metanol._ ga _Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 1-8, caracterizado por a referida solubilização do referido terceiro material bruto ser efectuada em hidróxido de sódio IN.- 10^ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-9, caracterizado por o referido tecido contendo gangliósidos ser tecido de cérebro de bovinos.- llâ Processo de acordo com qualquer das reivmdicaçoes 1-10, caracterizado por a referida mistura de gangliósidos ser submetida a secagem para se obter um produto acabado de mistura de gangliósidos.- 12^ Processo de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por o referido produto acabado de mistura de gan gliósidos ser suspenso num tampão e esterilizado para se obter um produto acabado, esterilizado, de mistura de gangliósidos.- 13- Processo para a preparação de uma mistura de gangliósidos, caracterizado por compreender as seguintes fases:a) submeter-se o tecido de cérebro de bovinos a uma eliminação de lípidos com acetona para se obter um precipitado de acetona,b) suspender-se o referido precipitado de acetona numa primeira mistura de solventes de cloreto de metileno, metanol e hidróxido de sódio,c) filtrar-se a referida primeira mistura de solventes contendo o referido precipitado de acetona para se obter uma primeira fase líquida,d) submeter-se a referida primeira fase líquida a precipitação por adição de cloreto de cálcio para se obter um primeiro material bruto,e) solubilizar-se o referido primeiro material bruto em água, clorofórmio e metanol, e submeter-se o primeiro material bruto solubilizado a aquecimento a um valor de pH de cerca de 12 e a uma temperatura de cerca de 38 a 43QC durante pelo menos 4 a 8 horas,f) submeter-se o referido primeiro material bruto solubilizado e aquecido a uma segunda separação numa mistura de água, n-butanol e clorofórmio,g) separar-se a referida segunda mistura de separação para remover uma fase orgânica e reter uma fase aquosa,h) submeter-se a referida fase aquosa a precipitação pela adição de acetona e cloreto de sódio e centrifugação para se obter um segundo material bruto,i) solubilizar-se e aquecer-se o referido segundo material bruto em metanol,j) centrifugar-se o referido segundo material bruto solubilizado e aquecido para se obter um sobrenadante,k) arrefecer-se o referido sobrenadante para se obter um terceiro material bruto,l) solubilizar-se o referido terceiro material bruto em hidróxido de sódio durante cerca de uma hora,m) neutralizar-se o referido terceiro material bruto solubilizado, en) submeter-se o referido terceiro material bruto solubilizado e neutralizado a diálise através de uma membrana com um peso molecular de corte de cerca de 10 kd para se obter uma mistura de gangliósidos.- 14ã Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a referida solubilização do referido terceiro material bruto ser efectuada em hidróxido de sódio IN.- 15a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 13 - 14, caracterizado por o referido tecido contendo gangliósidos ser tecido de cérebro de bovinos- 16® Processo de acordo com qualquer das reivindicações 13 - 15, caracterizado por a referida mistura de gangliósidos obtida ser submetida a secagem para se obter um produto acabado de mistura de gangliósidos.- 17® Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o referido produto acabado de mistura de gangliósidos ser suspenso num tampão e esterilizado para se obter um produto acabado, esterilizado, de mistura de gangliósidos .- 18® Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-17, caracterizado por compreender ainda separa^, -se a mistura de gangliósidos em componentes de gangliósidos individuais.- 19® Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por se separar o gangliósido Gm3 da mistura de gangliósidos.
- - 2® Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de patologias dos sistemas nervoso periférico e central, caracterizado por se incor42 porar como ingredientes activo uma quantidade eficaz de um produto de gangliósidos quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 - 19 em associação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.A requerente reivindica as prioridades dos pedidos italianos apresentados em 17 de Novembro de 1989 e em 18 de Outubro de 1990, sob os nes. 41747 A/89 e 41716 A/90, res pectivamente.Lisboa, 16 de Novembro de 1990
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